ES2301169T3 - Anticuerpos anti-cd80. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE LA IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS DE MACACO FRENTE A B7.1 Y B7.2 HUMANOS MEDIANTE LA BUSQUEDA DE BANCOS DE IMAGEN DE FASE O DE HETEROHIBRIDOMAS DE MONO OBTENIDOS UTILIZANDO LINFOCITOS B PROCEDENTES DE MONOS INMUNIZADOS CON B7.1 Y B7.2 HUMANOS. DE FORMA MAS ESPECIFICA, LA INVENCION DESCRIBE CUATRO ANTICUERPOS MONOCLONALES DE MONO ,7B6, 16C10, 7C10 Y 20C9, QUE INHIBEN LA VIA B7:CD28 Y POR TANTO ACTUAN COMO INMUNOSUPRESORES EFICACES. LA INVENCION ADEMAS DESCRIBE EL ADN COMPLETO Y LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE LA CADENA LIGERA Y PESADA DE LOS TRES ANTICUERPOS PRIMATIZADOS DERIVADOS DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES DE MONO QUE UNEN B7.1 Y PROBABLEMENTE B7.2, 7C10 PRIMATIZADO, 7B6 PRIMATIZADO Y 16C10 PRIMATIZADO. ESTOS ANTICUERPOS PRIMATIZADOS Y DE MONO PUEDEN UTILIZARSE COMO INMUNOSUPRESORES ESPECIFICOS, POR EJEMPLO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES Y PARA EVITAR EL RECHAZO DE TRANSPLANTES DE ORGANOS.

Description

Anticuerpos anti-CD80.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la fabricación y a la identificación de nuevos anticuerpos monoclonales contra el B7 humano, es decir, las B7.1 humano y B7.2 humano, y las formas primatizadas de los mismos. Más específicamente, la presente invención se refiere a la producción y la identificación de anticuerpos de macacos contra el B7 humano, es decir, el B7.1 humano y el B7.2 humano, producidos mediante la detección selectiva de genotecas de presentación en fagos y heterohibridomas de mono utilizando linfocitos B obtenidos de monos inmunizados con B7.

La invención se refiere además a anticuerpos primatizados específicos que se unen al B7 humano, es decir, el B7.1 y el B7.2 humanos, así como a sus correspondientes secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico.

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen anticuerpos monoclonales de mono o anticuerpos primatizados específicos contra el B7.1 humano y/o el B7.2 humano, y su uso como inmunosupresores al modular la vía B7:CD28, por ejemplo, para el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios, y prevenir el rechazo de órganos.

Antecedentes de la invención

Hace mucho que se tiene conciencia de la conexión clínica entre inmunología, hematología y oncología. Muchas enfermedades tratadas por el hematólogo o el oncólogo tienen o bien un componente autoinmunitario o bien un componente inmunodeficiente en su fisiopatología, lo que ha conducido a que los hematólogos adopten de forma generalizada los medicamentos inmunosupresores, mientras que los oncólogos persiguen adyuvantes inmunitarios que pudieran mejorar la inmunidad endógena contra los tumores. Hasta la fecha, generalmente estas intervenciones han consistido en modos inespecíficos de inmunosupresión y estimulación inmunitaria. Además de la poca eficacia de estas intervenciones, la toxicidad debida a su inespecificidad también han limitado su éxito global. Por lo tanto, se han buscado estrategias alternativas.

El esclarecimiento de la función de un número, que crece con rapidez, de moléculas de la superficie celular ha contribuido enormemente a la integración de la inmunología con la hemotología y la oncología clínicas. Se han identificado cerca de 200 antígenos de la superficie celular en las células de los sistemas inmunitario y hematopoyético (Schlossman SF, Boumsell L, Gilks JM, Harlan T. Kishimoto, C. Morimoto C, Ritz J. Shaw S, Silverstein RL, Springer TA, Tedder TF, Todd RF: "CD antigens"(1993), Blood 83: 879, 1994). Estos antígenos constituyen tanto moléculas restringidas a una estirpe como moléculas distribuidas más ampliamente implicadas en diversos procesos, incluidos el reconocimiento celular, la adhesión, la inducción y el mantenimiento de la proliferación, la secreción de citocinas, la función efectora e incluso la muerte celular. El reconocimiento de los atributos funcionales de estas moléculas ha desencadenado nuevos intentos de manipular la respuesta inmunitaria. Aunque las moléculas implicadas en la adhesión celular y el reconocimiento específico de antígenos se han evaluado previamente como dianas para la intervención inmunológica terapéutica, recientemente se ha dirigido la atención a un subgrupo de moléculas de la superficie celular denominadas moléculas coestimuladoras [Bretscher P: "The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later". Inmunol. Today. 13: 73, (1992); Jenkins MK, Johnson JG: "Molecules involved in T-cell co-stimulation". Curr. Opin. Immunol. 5: 351, 1993; Geppert T, Davis L. Gur H. Wacholtz M. Lipsky P: "Accessory cell signals involved in T-cell activation", Inmunol. Rev. 117:5, (1990); Weaver CT, Unanue ER: "The co-stimulatory function of antigen-presenting cells". Inmunol. Today 11: 49, (1990); Stennam RM, Young JW: "Signals arising from antigen-presenting cells", Curr. Opin. Immunol. 3: 361, (1991)]. Las moléculas coestimuladoras no inician sino que más bien permiten la generación y la amplificación de las respuestas de linfocitos T específicas de antígenos y de la función efectora [Bretscher P: "The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later" Inmunol. Today (1992); Jenkins MK, Johnson JG: "Molecules involved in T-cell co-stimulation". Curr. Opin. Immunol. 5: 351 (1993); Geppert T, Davis L. Gur H. Wacholtz M, Lipsky P: "Accessory cell signals involved in T-cell activation", Inmunol. Rev. 117:5, (1990); Weaver CT, Unanue ER: "The co-stimulatory function of antigen-presenting cells", Immunol. Today, 11:49 (1990); Stennam RM, Young JW: "Signals arising from antigen-presenting cells", Curr. Opin. Immunol. 3: 361, (1991); June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation", Immunol. Today, 15: 321, (1994)].

Recientemente, diferentes grupos de investigación han estudiado una vía coestimuladora específica denominada B7:CD28 debido a su papel significativo en la activación de los linfocitos B y T [June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation". Inmunol. Today 15:321 (1994); June CH, Ledbetter JA: "The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen" Annu. Rev. Immunol. 11 191 (1993); Schwartz RH: "Costimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy" Cell. 71: 1065, 1992)]. Desde que se descubrió esta vía ligando:receptor hace cuatro años, se han recogido una gran cantidad de pruebas que apuntan a que las interacciones B7:CD28 representan una de las uniones decisivas a la hora de determinar la reactividad inmunitaria frente a la anergia [June CH, Bluestone JA, Linsley PS, Thompson CD: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation", Immunol. Today 15: 321, (1994); June CH, Ledbetter JA: "The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen". Annu. Rev. Immunol. 11: 191, (1993); Schwartz RH: "Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4 and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy", Cell 71: 1065 (1992); Cohen J: "Mounting a targeted strike on unwanted immune responses" (news; comment). Science 257:751 (1992); Cohen J: "New protein steals the show as ``co-stimulator'' of T-cells" (news; comment). Science 262: 844, (1993)].

En particular, la función de los antígenos B7 humanos, es decir, B7.1 y B7.2, se ha descrito que consiste en coestimular la activación de los linfocitos T.

1. Función coestimuladora de B7.1 y B7.2 en la activación de los linfocitos T

La elaboración de una respuesta inmunitaria exitosa depende de una serie de interacciones específicas entre un linfocito T y una célula presentadora de antígenos. Aunque la primera etapa esencial en este proceso depende de la unión de un antígeno al receptor del linfocito T, en el contexto de la molécula del MHC de clase II [Lane, P. J. L., F. M., McConnell, G. L. Schieven, E.A. Clark y J. A. Ledbetter, (1990), "The role of class II molecules in human B cell activation". The Journal of Immunology, 144: 3684-3692], esta interacción sola no es suficiente para inducir todos los acontecimientos necesarios para mantener una respuesta prolongada a un antígeno determinado [Schwartz, R.H. (1990), "A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy", Science, 248: 1349; Jenkins, M.K. (1992), "The role of cell division in the induction of clonal anergy", Immunology Today, 13: 69; Azuma, M., M. Catabyab, D. Buck, J. H. Phillips y L. L. Lanier, (1992). "Involvement of CD28 in MHC-unrestricted cytotoxicity mediated by a human natural killer leukemia cell line". The Journal of Immunology, 149: 1556-1561; Azuma, M., M. Catabyab, D. Buck, J. H. Phillips y L. L. Lanier, (1992). "CD28 interaction with B7 costimulates primary allogeneic proliferative responses and cytotoxicity mediated by small resting T lymphocytes". J. Exp. Med., 175: 353-360].

Es necesaria la implicación de algunas otras moléculas coestimuladoras [Norton, S. D., L. Zuckerman, K.B. Urdahl, R. Shefner, J. Miller y M. K. Jenkins (1992). "The CD28 ligand, B7, enhances IL-2 production by providing a costimulatory signal to T cells". The Journal of Immunology, 149: 1556-1561). "The homodimers CD28 and CTLA-4 expressed on T-cells" (June, C. H., J. A. Ledbetter, P. S. Linsley y C. B. Thompson, (1990), "Role of the CD28 receptor in T-cell activation". Immunology Today, 11: 211-216; Linsley, P. S., W. Brady, M. Urnes, L. S. Grosmaire, N.K. Damie y J. A. Ledbetter, (1991), "CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7", J. Exp. Med., 174: 561)], junto con la expresión de B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) en las células presentadoras de antígenos, y son los principales pares de las moléculas coestimuladoras necesarias para una respuesta inmunitaria prolongada (Azuma, M., H. Yssel, J. H. Phillips, H. Spits y L.L. Lanier, (1993), "Functional expression of B7/BB1 on activated T lymphocytes". J. Exp. Med., 177: 845-850; Freeman, G. J., A. S. Freedman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman y LM. Nadler, (1989), "B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells". The Journal of Immunology, 143: 2714-2722; Hathcock, K. S., G. Laslo, H. B. Dickler, J. Bradshaw, P. Linsley y R. J. Hodes, (1993), "Identification of an alternative CTLA-4 ligand costimulatory for T cell activation". Science, 262: 905-911; Hart, D.N.J., G.C. Starling, V.L. Calder y N. S. Fernando, (1993). "B7/BB-1 is la leucocyte differentiation antigen of human dendritic cells induced by activation". Immunology, 79: 616-620). Se puede demostrar in vitro que la ausencia de estas señales coestimuladoras conduce a abortar una vía de activación de los linfocitos T y al desarrollo de una falta de respuesta al antígeno específico, o anergia. [Véase, por ejemplo, Harding, F. A., J. G. McArthur, J. A. Gross, D. M. Raulet y J. P. Allison, (1992). "CD28 mediated signalling co-stimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T cell clones". Nature, 356: 607-609; Gimmi, C.D., G.J., Freeman, J.G. Gribben, G. Gray y L. M. Nadler (1993). "Human T-cell clonal anergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimulation". Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6586-6590; Tan, P., C Anasefti, J. A. Hansen, J. Melrose, M. Brunvand, J. Bradshaw, J. A. Ledbetter y P. S. Linsley, (1993), "Induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness in human T lymphocytes by blocking interaction of CD28 with its natural ligand B7/BB1"., J. Exp. Med., 177: 165-173]. El logro de la tolerancia in vivo constituye un mecanismo de inmunosupresión y un tratamiento viable para el rechazo en el trasplante de órganos y para el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias. Esto se ha conseguido en modelos experimentales después de administrar CTLA4-Ig [Lenschow, D. J., Y. Zeng, R. J. Thistlethwaite, A. Montag, W. Brady, M. G. Gibson, P. S. Linsley y J. A. Bluestone, (1992), "Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA-4Ig"., Science, 257: 789-795].

Las moléculas B7.1 y B7.2 se pueden unir a CD28 o CTLA-4, aunque B7.1 se une a CD28 con una Kd de 200 Nm y a CTLA-4 con una afinidad 20 veces mayor [Linsley, P. S., E. A. Clark y J. A. Ledbetter, (1990), "T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1". Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 5031-5035; Linsley et al., (1993), "The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen", Annu. Rev. Immunol., 11: 191-192; Linesley et al., (1993), "CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28 signaling", The Journal of Immunology, 150: 3151-3169]. B7.2 se expresa en los linfocitos B activados y en los monocitos inducidos por un interferón, pero no en los linfocitos B en reposo [Freeman, G. J., G. S. Gray, C. D. Gimmi, D. B. Lomarrd, L-J. Zhou, M. White, J. D. Fingeroth, J. G. Gribben y L. M. Nadler, (1991). "Structure, expression and T cell costimulatory activity of the murine homologue of the human B lymphocyte activation antigen B7", J. Exp. Med., 174: 625-631]. Por otra parte, la B7.2 se expresa constitutivamente a niveles muy bajos en los monocitos, células dendríticas y linfocitos B en reposo, y su expresión se activa en los linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos B activados [Azuma, M. D. Ito, H. Yagita, K. Okumura, J. H. Phillips, L. L. Lanier y C. Somoza, (1993), "B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28", Nature, 366:76-79]. Aunque B7.1 y B7.2 se pueden expresar en el mismo tipo de célula, su expresión en los linfocitos B se produce con una cinética diferente [Lenschow, D.J., G. H. Su, L. A. Zuckerman, N. Nabavi, C. L. Jellis, G. S. Gray, J. Miller y J. A. Bluestone, (1993), "Expression and functional significance of an additional ligand for CTLA-4", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11054-11058; Boussiotis, V. A., G. J. Freeman, J. G. Gribben, J. Daley, G. Gray y L. M. Nadler, (1993), "Activated human B lymphocytes express three CTLA-4 counter-receptors that co-stimulate T-cell activation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11059-11063]. Un análisis adicional a nivel del ARN ha demostrado que el ARNm de B7.2 se expresa constitutivamente, mientras que el ARNm de B7.1 se detecta 4 horas después de la activación y los niveles bajos iniciales de la proteína B7.1 no son detectables hasta 24 horas después de la estimulación [Boussiotis, V. A., G. J. Freeman, J. G. Gribben, J. Daley, G. Gray y L. M. Nadler (1993), "Activated human B lymphocytes express three CTLA-4 counter-receptors that Co-stimulate T-cell activation", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11059-11063]. Por lo tanto, los contrareceptores CTLA-4/CD28 se pueden expresar en distintos momentos después de la activación de los linfocitos B.

La expresión temporal diferencial de B7.1 y B7.2 sugiere que la interacción de estas dos moléculas con CTLA-4 y/o CD28 comunican señales distintas, pero relacionadas, al linfocito T [LaSalle, J. M., P. J. Tolentino, G. J. Freeman, L. M. Nadler y D. A. Hafler, (1992), "CD28 and T cell antigen receptor signal transduction coordinately regulate inteleukin 2 gene expression in response to superantigen stimulation", J. Exp. Med., 176: 177-186; Vandenberghe, P., G. J. Freeman, L. M. Nadler, M. C. Fletcher, M. Kamoun, L. A. Turka, J. A. Ledbetter, C.B. Thompson y C. H. June (1992), "Antibody and B7/BB1-mediated ligation of the CD28 receptor induces tyrosine phosphorylation in human T cells", The Journal of Experimental Medicine, 175: 951-960]. Actualmente se desconocen las funciones de señalización exactas de CTLA-4 y CD28 sobre los linfocitos T [Janeway, C. A., Jr. y K. Bottomly, (1994), "Signals and signs for lymphocyte responses", Cell, 76: 275-285]. Sin embargo, es posible que un conjunto de receptores pudiera proporcionar el estímulo inicial para la activación de los linfocitos T y el segundo proporcionaría una señal prolongada para permitir la elaboración posterior de la vía y para que se produzca la expansión clonal [Linsley, P. S., J. L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J. A. Ledbetter, C. Anasetti y N. K. Damle, (1992), "Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 y CD28 on activated T lymphocytes", J. Exp. Med., 176: 1595-1604]. Los datos actuales apoyan la hipótesis de dos señales propuesta por Jenkins y Schwartz [Schwartz, R. H., (1990), "A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy", Science, 248: 1349; Jenkins, M. K., (1992), "The role of cell division in the induction of clonal anergy", Immunology Today, 13:69] de que se necesitan tanto un TCR como una señal coestimuladora para la expansión de los linfocitos T, la secreción de linfocinas y el desarrollo completo de la función efectora [Greenan, V. y G. Kromer, (1993), "Multiple ways to cellular immune tolerance", Immunology Today, 14: 573]. Cuando no se comunica la segunda señal, se da lugar a que los linfocitos T sean incapaces de secretar la IL-2, y se traduce en que la célula no responde al antígeno.

Estructuralmente, tanto B7.1 como B7.2 contienen dominios de tipo C y V de la superfamilia de las inmunoglobulinas extracelulares, una región transmembranaria hidrófoba y una cola citoplasmática [Freeman, G. J., J. G. Gribben, V. A. Boussiotis, J. W. Ng, V. Restivo, Jr., L. A. Lombard, G. S. Gray y L. M. Nadler, (1993), "Cloning of B7-2: a CTLA-4 counter-receptor that co-stimulates human T cell proliferation", Science, 262: 909]. Tanto B7.1 como B7.2 están muy glucosliladas. B7.1 es una glucoproteína de 44 a 54 kDa que comprende un dominio extracelular de 223 aminoácidos, un dominio transmembranario de 23 aminoácidos y una cola citoplasmática de 61 aminoácidos. B7.1 contiene 3 posibles sitios de fosforilación de proteína cinasas. [Azuma, M., H. Yssel, J. H. Phillips, H. Spits y L. L. Lanier, (1993), "Functional expression of B7/BB1 on activated T lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850]. B7.2 es una glucoproteína membranaria de 306 aminoácidos. Consiste en una región extracelular de 220 aminoácidos, un dominio transmembranario hidrófobo de 23 aminoácidos y una cola citoplasmática de 60 aminoácidos [Freeman, G. J., A. S. Freedman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman; y L. M. Nadler, (1989), "B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells", The Journal of Immunology, 143: 2714-2722]. Aunque los genes de B7.1 y B7.2 están localizados en la misma región cromosómica [Freeman, G. J., D. B. Lombard, C. D. Gimmi, S. A. Brod, L. L. Lee, J. C. Laning, D. A. Hafler, M. E. Dorf, G. S. Gray, H. Reiser, C. H. June, C. B. Thompson y L. M. Nadler, (1992), "CTLA-4 y CD28 mRNA are coexpressed in most T cells after activation", The Journal of Immunology, 149: 3795-3801; Schwartz, R. H., (1992), "Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4 y B7/BB1" en Selvakumar, A., B. K. Mohanraj, R. L. Eddy, T. B. Shows, P. C. White, C. Perrin y B. Dupont, (1992), "Genomic organization and chromosomal location of the human gene encoding the B-lymphocyte activation antigen B7", Immunogenetics, 36: 175-181], estos antígenos no comparten mucha homología. La homología global entre B7.1 y B7.2 es del 26% y entre la B7.1 murina y la S7 humana es del 27% [Azuma, M., H. Yssel, J. H. Phillips, H. Spits y L. L. Lanier, (1993), "Functional expression of B7/BB1 on activated T lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850; Freeman, G. J., A. S. Freedman, J. M. Segil, G. Lee, J. F. Whitman y L. M. Nadler (1989), "B7, a new member of the Ig superfamily with unique expression on activated and neoplastic B cells", The Journal of Immunology, 143: 2714-2722]. Aunque el alineamiento de la secuencia de la B7.1 humana, la B7.2 humana y la B.1 murina muestra pocos fragmentos de homología largas, se sabe que las tres moléculas se unen a las CTLA-4 y CD28 humanas. Así, lo más probable es que se trate de una región común o de homología cercana compartida por las tres moléculas que puede ser tanto contigua como conformacional. Esta región puede constituir el sitio de unión de las moléculas B7.1 y B7.2 a sus contrarreceptores. Los anticuerpos dirigidos contra estos epítopos podrían inhibir posiblemente la interacción de B7 con su contrarreceptor en los linfocitos T. Además, los anticuerpos que reaccionan cruzadamente con esta región en las moléculas B7.1 y B7.2 tendrían probablemente ventajas prácticas sobre los anticuerpos dirigidos contra la B7.1 o la B7.2 por separado.

B. Bloqueo de la interacción B7/CD28

El bloqueo de la interacción B7/CD28 ofrece la posibilidad de inducir una inmunosupresión específica, con la posibilidad de generar efectos terapéuticos específicos del antígeno de larga duración. Se ha demostrado que los anticuerpos contra la B7.1 o la B7.2 bloquean la activación de los linfocitos T, lo que se mide mediante la inhibición de la producción de la IL-2 in vitro [DeBoer, M., P. Parren, J. Dove, F. Ossendorp, G. van der Horst y J. Reeder, (1992), "Functional characterization of a novel anti-B7 monoclonal antibody", Eur. Journal of Immunology, 22: 3071-3075; Azuma, M., H. Yssel, J. H. Phillips, H. Spits y L. L. Lanier, (1993), "Functional expression of B7/BB1 on activated T lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850]. Sin embargo, varios anticuerpos han demostrado cambiar en su potencia inmunosupresora, lo que puede reflejar o bien su afinidad o bien la especificidad de epítopo. La proteína de fusión CTLA-4/Ig y los Fab anti-CD28 demostraron tener efectos similares sobre la inhibición de la producción de la IL-2.

Se ha demostrado que la administración in vivo de una proteína de fusión CTLA-4/Ig soluble suprime las respuestas de anticuerpos dependientes de los linfocitos T en los ratones [Linsley, P. S., J. L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J. A. Ledbetter, C. Anasetti y N. K. Damle, (1992), "Coexpression and functional cooperation of CTLA-4 y CD28 on activated T lymphocytes", J. Exp. Med., 176: 1595-1604; Lin, H., S.F. Builing, P. S. Linsley, R. O. Wei, C. D. Thompson y L. A. Turka (1993), "Long-ter acceptance of major histocompatibility complex mismatched cardiac allografts induced by CTLA-4-Ig plus donor specific transfusion", J. Exp. Med., 178: 1801] y, es más, las dosis mayores también eran capaces de suprimir las respuestas a una segunda inmunización, lo que demuestra la viabilidad de este método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en la que intervienen los anticuerpos. Además, CTLA-4/Ig fue capaz de prevenir el rechazo de las células de los islotes pancreáticos en los ratones al inhibir directamente la interacción de los linfocitos T y las células presentadoras del antígeno B7.1./B7.2 [Lenschow, D. J., G. H. Su, L. A. Zuckerman, N. Nabavi, C. L. Jellis, G. S. Gray, J. Miller y J. A. Bluestone, (1993), "Expression and functional significance of an andditional ligand for CTLA-4", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11054-11058]. En este caso, se consiguió la tolerancia específica del donante a largo plazo.

3. Tecnología de presentación en fagos recombinantes para seleccionar los anticuerpos

Hasta la fecha, no se han descrito anticuerpos monoclonales que reaccionen de manera cruzada tanto con B7.1 como con B7.2. Tal y como se ha destacado, tales anticuerpos serían posiblemente muy deseables como inmunosupresores. La tecnología de presentación en fagos está comenzando a reemplazar los métodos tradicionales para aislar anticuerpos generados durante la respuesta inmunitaria, porque se puede evaluar un mayor porcentaje del repertorio inmunitario de lo que es posible utilizando los métodos tradicionales. En parte, esto se debe a la ineficacia de la fusión con PEG, a la inestabilidad cromosómica y a la gran cantidad de cultivo de tejidos y de detección selectiva asociada a la producción de los heterohibridomas. En cambio, la tecnología de presentación en fagos depende de las técnicas moleculares para capturar posiblemente todo el repertorio de genes de inmunoglobulinas asociados a la respuesta a un antígeno determinado.

Esta técnica se describe en Barber et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 7978-7982, (1991). Esencialmente, los genes de cadena pesada de la inmunoglobulina se amplifican por PCR y se clonan en un vector que contiene el gen que codifica la proteína menor de cubierta del fago filamentoso M13 de tal forma que se crea una proteína de fusión con la cadena pesada. La proteína de fusión con la cadena pesada se incorpora en la partícula de fago M13 junto con los genes de cadena ligera para que se ensamblen. Cada fago recombinante contiene, dentro de su genoma, los genes para una molécula Fab de anticuerpos diferente que se presenta en su superficie. Dentro de estas genotecas, se pueden clonar y presentar más de 10^{6} anticuerpos diferentes. Se criba la genoteca de fagos sobre pocillos de microtitulación recubiertos de antígeno, se retiran por lavado los fagos inespecíficos y se eluyen los fagos que se unen a los antígenos. Se aísla el genoma de los clones específicos de antígeno y se escinde el gen III para que se pueda expresar el anticuerpo en la forma Fab soluble para la caracterización posterior. Una vez que se ha seleccionado un solo Fab como un posible candidato terapéutico, se puede convertir fácilmente en un anticuerpo completo. Un sistema de expresión descrito previamente para convertir las secuencias Fab en anticuerpos completos es el vector de expresión en los mamíferos NEOSPLA de IDEC. Este vector contiene tanto genes de las regiones constantes humanas gamma 1 como la gamma 4. Se transfectan las células CHO con los vectores NEOSPLA y, después de la amplificación, se ha descrito que con este sistema de vector se pueden conseguir unos niveles de expresión muy elevados (> 30 pg/célula y día).

4. Anticuerpos primatizados

Otro medio muy eficaz para generar anticuerpos recombinantes se describe en Newman (1992), Biotecnology, 10, 1455-1460. Más particularmente, esta técnica da lugar a la generación de anticuerpos primatizados que contienen dominios variables de mono y secuencias constantes humanas. Además, esta técnica también se describe en la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 08/379.072, registrada el 25 de enero de 1995, que es una continuación de la patente de n.º de serie de los EE.UU. 07/912.292, registrada el 10 de julio de 1992, que es una continuación en parte de la patente de n.º de serie de los EE.UU. 07/856.281, registrada el 23 de marzo de 1992, que es finalmente una continuación en parte de la patente de n.º de serie de los EE.UU. 07/735.064, registrada el 25 de julio de 1991. El n.º de serie 08/379.072 y la solicitud original de la misma.

Esta técnica modifica los anticuerpos de tal forma que no sean rechazados antigénicamente durante la administración a los humanos. Esta técnica depende de la inmunización de macacos cangrejeros (o macaco de cola larga: Macaca fascicularis) con antígenos o receptores humanos. Esta técnica se desarrolló para crear anticuerpos monoclonales de gran afinidad dirigidos contra los antígenos de la superficie de las células humanas.

Previamente se ha descrito que los anticuerpos generados de este modo presentan la función efectora humana, han reducido la inmunogenia y tienen una semivida más larga en el suero. La tecnología se apoya en el hecho de que, a pesar del hecho de que los macacos cangrejeros son filogenéticamente similares a los humanos, todavía reconocen muchas proteínas humanas como extrañas y, por lo tanto, arman una respuesta inmunitaria. Además, dado que los macacos cangrejeros están cercanos a los humanos desde el punto de vista filogenético, se ha descubierto que los anticuerpos generados en estos macacos tienen bastante homología de aminoácidos con los producidos en los humanos. De hecho, después de secuenciar los genes de la región variable de la cadena ligera y la cadena pesada de la inmunoglobulina de los macacos, se encontró que la secuencia de cada familia de genes era entre el 85 y el 98% homóloga a su equivalente humano [Newman et al, (1992), Id]. El primer anticuerpo generado de este modo, un anticuerpo anti-CD4, era homólogo al 91-92% con la secuencia consenso de las regiones del marco de lectura de la inmunoglobulina humana. Newman et al., Biotechnology, 10: 1458-1460, (1992).

En la bibliografía se han descrito previamente anticuerpos monoclonales específicos del antígeno B7 humano. Por ejemplo, en Weyl et al., Hum Immunol, 31 (4), 271-176, (1991) se describe la cartografía de epítopos de los anticuerpos monoclonales humanos contra la HLA-B-27 utilizando variantes antigénicas naturales y mutadas. También, en Toubert et al., Clin. Exp. Immunol. 82 (1), 16-20, (1990) se describe la cartografía de epítopos de un anticuerpo monoclonal HLA-B27 que también reacciona con una proteína de 35 kDa de la membrana externa bacteriana. También, en Valle et al, Immunol, 69 (4), 531-535, (1990) se describe un anticuerpo monoclonal de la subclase de la IgG1 que reconoce el antígeno B7 expresado en los linfocitos B activados y los linfoticos T transformados con el HTLV-1. Además, en Toubert et al., J. Immunol., 141(7), 2503-9, (1988) se describe la cartografía de epítopos de los antígenos HLA-B27 y HLA-B7 utilizando recombinantes intradominio construidos al fabricar genes híbridos entre estos dos alelos en
E. coli.

Algunos investigadores han correlacionado la expresión elevada del antígeno B7 con enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, en Ionesco-Tirgoviste et al., Med. Interre, 24(1), 11-17, (1986) se describe un aumento de la expresión del antígeno B7 en la diabetes de tipo 1 dependiente de insulina. También se ha descrito la implicación de la expresión del antígeno B7 en las células dendríticas dérmicas obtenidas de los pacientes con psoriasis [Nestle et al., J. Clin. Invest., 94(1), 202-209, (1994)].

Adicionalmente, se ha descrito en la bibliografía la inhibición de los CTL aloreactivos anti-HLA-B7 utilizando el HLA-B7 soluble purificado por afinidad. [Zavazava et al., Transplantation, 51(4), 838-42, (1991)]. Adicionalmente, se ha descrito la utilización del ligando soluble del receptor B7, CTLA-4-Ig, para bloquear la actividad de B7 [véase, por ejemplo, Lenschow et al., Science, 257, 789, 7955 (1992)] en modelos animales y una proteína de fusión B7-1-Ig capaz de inhibir a B7.

Compendio y objetos de la invención

Un objeto de la invención es producir e identificar nuevos anticuerpos de macaco contra el antígeno B7 humano, más específicamente contra el antígeno B7.1 humano y/o el antígeno B7.2 humano.

Más específicamente, es un objeto de la presente invención producir e identificar nuevos anticuerpos de macaco contra el antígeno B7 humano, es decir, el antígeno B7.1 humano y el antígeno B7.2 humano, mediante la detección selectiva de genotecas de presentación en fagos y/o heterohibridomas de mono utilizando linfocitos B obtenidos del antígeno B7 humano, es decir, monos inmunizados con el antígeno B7.1 o B7.2 humano.

Otro objeto específico de la invención es proporcionar anticuerpos monoclonales de mono anti-B7 y formas primatizadas de los mismos que se unen específicamente al antígeno B7.1 y/o B7.2 humano, que inhiben la vía B7/CD86 y la estimulación de B7 en los linfocitos T activados, lo que de este modo inhibe la producción de la IL-2 y la proliferación de los linfocitos T, y que funcionan como inmunosupresores eficaces.

Otro objeto de la invención es proporcionar anticuerpos monoclonales de mono anti-B7.1 humano y anti-B7.2 humano y las formas primatizadas de los mismos, que inhiben las respuestas dirigidas contra el antígeno en los cultivos de esplenocitos de donantes, por ejemplo, respuestas de IgG específicas de los antígenos, la producción de la IL-2 y la proliferación celular.

Otro objeto específico de la invención es identificar determinados anticuerpos monoclonales de mono específicos contra los antígenos B7.1 humano y B7.2 humano y las formas primatizadas de los mismos que tienen propiedades ventajosas, es decir, afinidad, actividad inmunosupresora, que son útiles como fármacos. Más específicamente, estos anticuerpos de mono y las formas primatizadas de los mismos hay que utilizarlos, por ejemplo, como inmunosupresores, es decir, para bloquear las respuestas dirigidas contra los antígenos, para tratar enfermedades autoinmunitarias tales como psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes sacarina de tipo 1, púrpura trombicitopénica idiopática (ITP), y para prevenir el rechazo de órganos.

Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones farmacéuticas que contienen uno o más anticuerpos monoclonales de mono específicos contra el antígeno B7 humano, es decir, el antígeno B7.1 humano y/o el antígeno B7.2 humano, o las formas primatizadas de los mismos, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se utilizarán, por ejemplo, como inmunosupresores para tratar enfermedades autoinmunitarias, es decir, púrpura trombocitopénica idiopática y lupus eritematoso sistémico (LES), para bloquear las respuestas inmunitarias dirigidas contra el antígeno y para prevenir el rechazo de órganos en los destinatarios de los trasplantes.

La invención es útil por los nuevos métodos de tratamiento mediante la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de uno o más anticuerpos monoclonales de mono o primatizados que se unen específicamente al antígeno B7, es decir, los antígenos B7.1 y/o B7.2 humanos. Tales métodos terapéuticos son útiles para el tratamiento de enfermedades tratables mediante la inhibición de la vía B7:CD28, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias tales como púrpura trombicitopénica idiopática (ITP), lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes sacarina de tipo 1, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, anemia aplásica, así como para prevenir el rechazo en los sujetos con trasplantes.

Otro objeto más de la invención es proporcionar transfectantes, por ejemplo, células CHO, que expresan al menos los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales de mono específicos contra los antígenos B7.1 y/o B7.2 humanos.

Otro objeto de la invención es proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos monoclonales de mono específicos contra el antígeno B7.1 human y/o el antígeno B7.2 humano, y vectores de expresión que aseguran la expresión de los anticuerpos primatizados que contienen estas secuencias de ácido nucleico.

Definiciones

Los términos siguientes se definen para que la invención se pueda comprender con más claridad.

Anticuerpo agotador: un anticuerpo que destruye los linfocitos B activados u otras células presentadoras de antígenos.

Anticuerpo no agotador: un anticuerpo que bloquea la acción coestimuladora de B7 y de los ligandos CD28 y CTLA-4 activadores de los linfocitos T. Así, no se responde al antígeno pero no se elimina la célula presentadora de antígeno.

Anticuerpo primatizado: un anticuerpo recombinante que se ha modificado genéticamente para que contenga los dominios variables pesados y ligeros de un anticuerpo de mono, en particular, un anticuerpo de mono cangrejero, y que contiene secuencias de dominios constantes humanos, preferiblemente, el dominio constante gamma 1 o gamma 2 de la inmunoglobulina humana (o la variante PE). La preparación de tales anticuerpos se describe en Newman et al., (1992), "Primatization of recombinant antibodies for immunotherapy of human diseases: a macaque/human chimeric antibody against human CDH", Biotechnology, 10: 1458-1460; también citada con frecuencia como 08/379.072. Se ha descrito que estos anticuerpos muestran un nivel elevado de homología con los anticuerpos humanos, es decir, del 85 al 98%, que presentan funciones efectoras humanas, que tienen una inmunogenia reducida y que pueden mostrar una gran afinidad por los antígenos humanos.

Antígenos B7: los antígenos B7 en esta solicitud incluyen, por ejemplo, los antígenos B7, B7.1 y B7.2 humanos. Estos antígenos se unen a CD28 y/o CTLA-4. Estos antígenos tienen una función coestimuladora en la activación de los linfocitos T. Igualmente, estos antígenos B7 pueden contener dominios de tipo C y V de la superfamilia de las inmunoglobulinas extracelulares, una región transmembranaria hidrófoba y una cola citoplasmática [véase, Freeman et al., Science, 262: 909, (1993)] y están muy glucosilados.

Anticuerpos anti-B7: Anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales de mono o las formas primatizadas de los mismos, que se unen específicamente a los antígenos B7 humanos, por ejemplo, los antígenos B7.1 y/o B7.2 humanos, con una afinidad suficiente para bloquear la interacción B7:CD28 y, de esta manera, inducir la inmunosupresión.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa un vector pMS utilizado para detectar selectivamente las genotecas de inmunoglobulinas recombinantes producidas contra los B7 presentadas en la superficie del fago filamentoso que contiene cebadores basados en secuencias de las inmunoglobulinas de macaco.

La figura 2 representa el vector de expresión NEOSPLA utilizado para expresar los anticuerpos primatizados de la invención específicos contra el antígeno B7.1 humano.

La figura 3 representa los títulos séricos del anti-B7.1 de mono dirigidos contra el B7.1 de la superficie celular en las células CHO transfectadas.

La figura 4 representa la inhibición de la unión del SB7.1 radiomarcado mediante anticuerpos de mono purificados por afinidad contra el SB7.1 en presencia del SB7 sin marcar y del anticuerpo monoclonal murino L307.4 anti-B7.1.

La figura 5 representa la inhibición de la unión entre los anticuerpos 135 y L3707.4 de mono radiomarcados anti-B7.1 y las células SB humanas que expresan B7 mediante la competición con el SB7.1 purificado por afinidad.

La figura 6 representa la inhibición de la unión entre el B7-Ig radiomarcado y los linfocitos T de la sangre periférica humanos activados al competir con el SB7.1 sin marcar los anticuerpos purificados por afinidad del suero anti-B7.1 murino (L307.4) y 1127 de mono.

La figura 7 representa la inhibición de la proteína IL-2 en cultivos de linfocitos mezclados mediante anticuerpos anti-B7.1 de suero de mono purificados por afinidad.

La figura 8a representa la secuencia de aminoácidos y del ácido nucleico de una forma primatizada de cadena ligera de 7C10.

La figura 8b representa la secuencia de aminoácidos y del ácido nucleico de una forma primatizada de la cadena pesada de 7C10.

La figura 9a representa la secuencia de aminoácidos y del ácido nucleico de una forma primatizada de la cadena ligera de 7B6.

La figura 9b representa la secuencia de aminoácidos y del ácido nucleico de una forma primatizada de la cadena pesada de 7B6.

La figura 10a representa la secuencia de aminoácidos y del ácido nucleico de una cadena ligera primatizada 16C10.

La figura 10b representa la secuencia de aminoácidos y del ácido nucleico de una cadena pesada primatizada 16C10.

Descripción detallada de la invención

Tal y como se describió anteriormente, la presente invención se refiere a la fabricación de nuevos anticuerpos monoclonales de mono que se unen específicamente al antígeno B7.1 humano y/o al antígeno B7.2 humano así como a los anticuerpos primatizados derivados de los mismos. Estos anticuerpos poseen una gran afinidad por el B7.1 y/o el B7.2 humanos y, por lo tanto, se pueden utilizar como inmunosupresores que inhiben la vía de B7:CD86.

La preparación de los anticuerpos monoclonales de mono se realizará preferiblemente mediante la detección selectiva de genotecas de presentación en fagos o mediante la preparación de heterohibridomas de mono utilizando los linfocitos B que se obtienen de los monos inmunizados con el B7 (por ejemplo, el B7.1 y/o el B7.2 humano).

Tal y como se destacó, el primer método para generar anticuerpos anti-B7 implica la tecnología de presentación en fagos recombinantes. Esta técnica se describe más arriba en líneas generales.

Esencialmente, comprenderá la síntesis de genotecas de inmunoglobulinas recombinantes contra el antígeno B7 presentadas en la superficie de fagos filamentosos y la selección de los fagos que secretan anticuerpos que tienen gran afinidad por los antígenos B7.1 y B7.2 humanos. Tal y como se observóanteriormente, se seleccionarán preferiblemente los anticuerpos que se unen al B7.1 y al B7.2 humanos. Para llevar a cabo tal metodología, los presentes inventores han creado una única genoteca para las genotecas de mono que reduce la posibilidad de recombinación y mejora la estabilidad. Este vector, el pMS, se describe en detalle más adelante, y se muestra en la figura 1.

Esencialmente, para utilizar la presentación en fagos con genotecas de macacos, este vector contiene cebadores específicos para la amplificación por PCR de los genes de la inmunoglobulina de mono. Estos cebadores se basan en secuencias de macaco obtenidas mientras se desarrollaba la tecnología primatizada y las bases de datos que contienen secuencias humanas.

Se describen los cebadores adecuados en la 08/379.072 citada con frecuencia.

El segundo método implica la inmunización de monos, es decir, macacos, contra el antígeno B7 humano, preferiblemente contra los antígenos B7.1 y B7.2 humanos. La ventaja inherente de los macacos en relación con la generación de anticuerpos monoclonales se discutió anteriormente. En particular, tales monos, es decir, los macacos cangrejeros, se pueden inmunizar contra antígenos o receptores humanos. Además, los anticuerpos resultantes se pueden utilizar para construir anticuerpos primatizados de acuerdo con la metodología de Newman et al, Biotechnology, 10, 1455-1460, (1992) y de Newman et al., citada con frecuencia como n.º de serie de los EE.UU. 08/379.072, registrada el 25 de enero de 1995.

La ventaja importante de los anticuerpos obtenidos de los monos cangrejeros es que estos monos reconocen muchas proteínas humanas como extrañas y, por lo tanto, seguran la formación de anticuerpos, algunos con gran afinidad por los antígenos humanos deseados, por ejemplo, las proteínas de superficie y los receptores de células de humanos. Además, ya que están filogenéticamente cercanos a los humanos, los anticuerpos resultantes exhiben mucha homología de aminoácidos con los producidos en los humanos. Tal y como se observó anteriormente, después de secuenciar los genes de la región variable de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina de los macacos, se encontró que la secuencia de cada familia de genes tenía una homología del 85 al 88% con su equivalente humano [Newman et al., (1992), Id].

Esencialmente, a los monos macacos cangrejeros se les administra el antígeno B7 humano, por ejemplo, el antígeno B7.1 y/o el B7.2 humanos, se aíslan los linfocitos B de ellos, por ejemplo, se realizan biopsias de los ganglios linfáticos de los animales, y luego se fusionan los linfocitos B con células de heteromieloma (ratón x humano) KH6/B5 utilizando polietilenglicol (PEG). A continuación, se identifican los heterohibridomas que secretan anticuerpos que se unen al antígeno B7 humano, por ejemplo, el antígeno B7.1 humano y/o el antígeno B7.2 humano.

Los anticuerpos que se unen tanto a B7.1 como a B7.2 son los deseables porque posiblemente tales anticuerpos se pueden utilizar para inhibir la interacción de B7.1 y B7.2 así como B7 con sus contrarreceptores, es decir, CTL-A y CD28 humanos. Los anticuerpos contra estos epítopos pueden inhibir la interacción tanto del B7.1 humano como del B7.2 humano con sus contrarreceptores sobre el linfocito T. Esto puede proporcionar posiblemente efectos sinérgicos.

Sin embargo, los anticuerpos que se unen sólo a uno entre el antígeno B7, el antígeno B7.1 o el antígeno B7.2 humanos, también son muy deseables debido a la coimplicación de estas moléculas en la activación de los linfocitos T, la secreción de la linfocina de la expansión clonal (IL-2) y el grado de respuesta al antígeno. Dado que tanto el B7.1 como el B7.2 humano se unen al CTLA-4 y al CD28 humanos, es probable que haya al menos una región común u homóloga [quizás un epítopo o epítopos conformacional(es) compartido(s)] a la que se pueden dirigir potencialmente los anticuerpos de macaco.

Los presentes inventores eligieron inmunizar los macacos contra el antígeno B7.1 humano utilizando el antígeno B7.1 soluble recombinante producido en las células CHO y purificado por cromatografía de afinidad utilizando una columna de afinidad de sefarosa-L307.4. Sin embargo, la fuente particular del antígeno B7 humano, el antígeno B7.1 humano o el antígeno B7.2 humano, no es decisiva, siempre y cuando sea de suficiente pureza para dar lugar a una respuesta de anticuerpos específicos contra el antígeno B7 concreto administrado y posiblemente contra otros antígenos B7.

Se han clonado y secuenciado genes del antígeno B7 humano, el antígeno B7.1 humano (también llamado CD80) y el antígeno B7.2 humano (también llamado CD86) y, por lo tanto, se pueden fabricar fácilmente mediante métodos recombinantes.

Preferiblemente, el antígeno B7 humano, el antígeno B7.1 humano y/o el antígeno B7.2 humano administrados se administrarán en forma soluble, por ejemplo, mediante la expresión de un gen de B7, de B7.1 o de B7.2 al que se le han retirado sus dominios transmembranario y citoplasmático, por lo que se deja solamente la porción extracelular, es decir, los dominios de tipo V y C de la superfamilia extracelular (véase, por ejemplo, Grumet et al, Hum. Immunol., 40(3), p. 228-234, 1994, que cuenta la expresión de una forma soluble del B7 humano).

Los macacos se inmunizarán con los antígenos B7, B7.1 y/o B7.2, preferiblemente una forma soluble de los mismos, en unas condiciones que dan lugar a la producción de anticuerpos específicos contra ellos. Preferiblemente, el antígeno humano soluble B7, el B7.1 o el B7.2, se administrará en combinación con un adyuvante, por ejemplo, el adyuvante completo de Freund (CFA), alumbre, saponina u otros adyuvantes conocidos así como combinaciones de los mismos. En general, esto requerirá repetir la inmunización, por ejemplo, repitiendo la inyección, durante varios meses. Por ejemplo, la administración del antígeno B7.1 soluble se efectuó con adyuvante, con inmunizaciones de refuerzo, durante un periodo de 3 a 4 meses, dando lugar a la producción de suero que contiene anticuerpos que se unen al antígeno B7.1 humano.

Después de la inmunización, se recogen los linfocitos B, por ejemplo, mediante biopsias de nódulos linfáticos tomadas de los animales inmunizados y los linfocitos B fusionados con células de heteromieloma (ratón x humano) KH6/B5 utilizando polietilenglicol. Los métodos para preparar tales heteromielomas se conocen y se pueden encontrar en la patente de n.º de serie de los EE.UU. 08/379.079 de Newman et al., registrada el 25 de enero de 1995.

A continuación, se identifican los heterohibridomas que secretan anticuerpos que se unen a B7, B7.1 y/o B7.2 humanos. Esto se puede realizar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede determinar mediante ELISA o radioimunoensayo utilizando el antígeno de B7, B7.1 y/o B7.2 humanos marcados enzimáticamente o con radionúclidos.

Después, las estirpes celulares que secretan anticuerpos que tienen la especificidad deseada contra el antígeno de B7, B7.1 y/o B7.2 humanos se subclonan para conseguir que sean monoclonales.

En la presente invención, los inventores detectaron selectivamente los anticuerpos purificados por su capacidad para unirse a las placas recubiertas con el antígeno B7.1 soluble en un ensayo ELISA, los linfocitos B que expresan el antígeno y los transfectomas de CHO que expresan el antígeno B7.1 humano en su superficie celular. Además, se detectaron selectivamente los anticuerpos por su capacidad para bloquear las interacciones linfocito B/linfocito T, que se mide mediante la producción de la IL-2 y la captación de la timidina tritiada en una reacción de linfocitos mezclados (RLM), detectándose la unión de B7 mediante el B7.1 soluble (SB7.1) radiomarcado con ^{125}I.

También se analizaron los anticuerpos de macaco purificados por afinidad por su reactividad contra los transfectantes de CHO que expresaban proteínas de fusión Ig/B7.1, y contra las células CHO que producían el antígeno B7.2 humano. Estos resultados indicaron que el suero inmunitario anti B7.1 se unía a los transfectomas de B7.2. La unión de los anticuerpos al antígeno B7.2 se puede confirmar utilizando los reactivos con la B7.2-Ig soluble. Tal y como se expone en los ejemplos, esto se puede efectuar produciendo y purificando la B7.2-Ig a partir de los transfectomas de CHO en cantidades suficientes para preparar una columna de afinidad de sefarosa con B7.2-Ig. Los anticuerpos que reaccionan cruzadamente con B7.2 se unirán a la columna de B7.2-Ig-sefarosa.

Las estirpes celulares que expresan anticuerpos que se unen específicamente al antígeno B7 humano, al antígeno B7.1 y/o al antígeno B7.2 humanos, se utilizan posteriormente para clonar secuencias del dominio variable para la fabricación de anticuerpos primatizados esencialmente como se describe en Newman et al., (1992), Id y Newman et al., la patente de número de serie de los EE.UU. 379.072, registrada el 25 de enero de 1995.

Esencialmente, esto supone la extracción de ARN del mismo, la conversión a ADNc y la amplificación del mismo mediante PCR utilizando los cebadores específicos de la Ig. Los cebadores adecuados se describen en Newman et al., 1992, Id y en la patente de n.º de serie de los EE.UU. 379.072 (véase, en particular, la figura 1 del n.º de serie de los EE.UU. 379.072).

Luego, los genes clonados de mono de la región variable se introducen en un vector de expresión que contiene los genes de la región de la cadena pesada y de la cadena ligera humanas. Preferiblemente, esto se efectúa utilizando un vector de expresión propiedad de IDEC, Inc. citado como NEOSPLA. Este vector se muestra en la figura 2 y contiene el promotor/potenciador del citomegalovirus, el promotor principal de la \beta-globina de ratón, el origen de replicación del SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, el exón 1 y el exón 2 de la neomicina fosfotransferasa, la región constante kappa o lamba de la inmunoglobulina humana, el gen de la dihidrofolato reductasa, la región constante gamma 1 o gamma 4 PE de la inmunoglobulina humana y la secuencia líder. Se ha encontrado que este vector da lugar a un gran nivel de expresión de los anticuerpos primatizados una vez que se incorporan los genes de la región variable de mono, se transfectan en las células CHO, y después se selecciona en un medio que contiene G418 y se amplifica con metotrexato.

Por ejemplo, se ha descrito previamente que este sistema de expresión da lugar a anticuerpos primatizados que tienen una gran avidez (Kd \leq 10^{-10} M) frente a CD4 y otros receptores de superficie de las células humanas. Además, se ha encontrado que los anticuerpos exhiben la misma afinidad, especificidad y actividad funcional que el anticuerpo de mono original. Este sistema de vector se describe esencialmente en la patente de n.º de serie de los EE.UU. 379.072 así como la n.º de serie de los EE.UU. 08/149.099, registrada el 3 de noviembre de 1993. Este sistema proporciona unos niveles de expresión elevados, es decir, >30 pg/célula y día.

Tal y como se expone más adelante, los inventores han seleccionado cuatro anticuerpos monoclonales de mono candidatos destacables que se unen específicamente al antígeno B7.1, y que también se puede unir al antígeno de B7.2. Estos anticuerpos monoclonales de mono se citan en la presente memoria como 7B6, 16C10, 7C10 y 20C9.

Tal y como se expone con mayor detalle más adelante, se evaluó la capacidad para bloquear las interacciones entre los linfocitos B y los linfocitos T que tenían estos anticuerpos, que se midió por la producción de IL-2 y la captación de timidina tritiada en una reacción de linfocitos mezclados para experimentos de unión de linfocitos T. Para la unión de los linfocitos T, se cultivaron linfocitos de la sangre periférica de la túnica del cuerpo humano durante 3 a 6 días en presencia de un estimulador de PHA. Se analizó por radiactividad la unión de B7 utilizando B7.1 soluble radiomarcado con ^{125}I. Los resultados observados indican que todos estos anticuerpos se unen al antígeno B7.1 con gran afinidad y que bloquean de manera eficaz las interacciones entre los linfocitos B y los linfocitos T tal y como se pone de manifiesto mediante la reducción de la producción de IL-2 y la reducción de la proliferación de los cultivos de linfocitos mezclados.

Las propiedades de estos anticuerpos monoclonales de mono en particular se resumen a continuación:

1. Para demostrar que los anticuerpos de mono son capaces de bloquear la interacción física entre CTLA4-Ig, se incubaron concentraciones diferentes de los anticuerpos anti-B7.1 de mono y CTLA4-Ig sin marcar con CTLA4-Ig radiomarcados con I^{125}. Los resultados del análisis de inhibición mostraron que las CI50 (la concentración del inhibidor que da lugar a una inhibición del 50%) para los anticuerpos de mono son:

a: 7C10: 0,39 \mug/MI

b. 16C10: 1,60 \mug/MI

c: 20C9: 3,90 \mug/MI

d: 7B6: 39,0 \mug/MI

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2. El análisis de Scatchard demostró que las constantes de afinidad aparentes (Kd) de los anticuerpos de mono que se unen a las placas recubiertas con B7-Ig tenían que ser aproximadamente:

a: 7C10: 6,2 x 10^{-9} M

b: 16C10: 8,1 x 10^{-9} M

c: 7B6: 10,7 x 10^{-9} M

d: 20C9: 16,8 x 10^{-9} M

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3. Los anticuerpos se analizaron in vitro en un ensayo de reacción de linfocitos mezclados (RLM). La RLM demostró que los 4 anticuerpos anti-B7.1 inhiben la producción de IL-2 con diferente intensidad tal y como se muestra mediante los siguientes valores de lbgo:

a: 7B6: 5,0 \mug/M

b: 16C10: <0,1 \mug/M

c 20C9: 2,0 \mug/M

d: 7C10: 5,0 \mug/M

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4. Se analizó la capacidad que tenían los anticuerpos anti-B7.1 de mono para unirse al B7 en los linfocitos de sangre periférica humana (LSP). El análisis FACS mostró que los 4 anticuerpos de mono probados daban positivo.

5. Se comprobó la capacidad que tienen los anticuerpos de mono 18C10, 7B6, 7C10 y 20C9 para unirse a C1q mediante el análisis FACS. Los resultados demostraron que la Ig de mono 7C10 se unía con fuerza al C1q humano después de incubarlos con células CHO transfectadas con B7.1. El 16C10 fue positivo, mientras que los anticuerpos de mono 20C9 y 7B6 dieron negativo.

6. Para seleccionar un modelo animal para los estudios de Path-Tox, se analizaron los anticuerpos de mono con sangre de animales de diferentes especies. Se determinó que los anticuerpos anti-B7.1 de mono reaccionan cruzadamente con humano, chimpancé y posiblemente mandril.

Basándose en estas propiedades, parecería que tres anticuerpos monoclonales de mono poseen las propiedades más ventajosas, 16C10, 7C10 y 20C9, siendo 16C10 y 7C10 un poco mejores que 20C9.

Utilizando las técnicas descritas anteriormente, y en la patente de los EE.UU n.º de serie 08/379.072, los presentes inventores han clonado los dominios variables de 7C10, 7B6 y 16C10, y dan a conocer las secuencias de aminoácidos y del ácido nucleico de las formas primatizadas de la cadena ligera de 7C10, de la cadena pesada de 7C10, de la cadena ligera de 7B6, de la cadena pesada de 7B6, de la cadena ligera de 16C10 y de la cadena pesada de 16C10. Estas secuencias de aminoácidos y del ácido nucleico se pueden encontrar en las figuras 8a y 8b, 9a y 9b, y 10a y 10b. El ADN y la secuencia de los aminoácidos del dominio constante gamma 1 humano se pueden encontrar en la patente 08/379.072.

Tal y como se discutió anteriormente, estos anticuerpos primatizados se expresan preferiblemente utilizando el vector de expresión NEOSPLA mostrado en la figura 2 que se describe esencialmente en las patentes 08/379.072 y 08/149.099 citadas con frecuencia.

Tal y como se observó con anterioridad, los anticuerpos primatizados en cuestión preferiblemente contendrán o bien la región constante gamma 1 o gamma 4 de la inmunoglobulina humana, con gamma 4 mutada preferiblemente en dos posiciones para crear gamma 4 PE. El mutante gamma 4 PE contiene dos mutaciones, un ácido glutámico en la región CH2 introducido para eliminar la unión residual a FCR, y una sustitución de prolina en la región bisagra, con el objeto de mejorar la estabilidad de la interacción del enlace disulfuro de cadena pesada (véase, Alegre et al., J. Immunol., 148, 3461-3468, (1992); y Angel et al, Mol. Immunol., 30, 105-158, (1993).

Si los anticuerpos primatizados en cuestión contienen la región constante gamma 1, gamma 4 o gamma 4 PE depende sobre todo de la enfermedad concreta sobre la que se actúa selectivamente. Preferiblemente, se crean los anticuerpos IgG1 e IgG4 primatizados agotadores y no agotadores, y se ensayan contra dianas de enfermedades específicas.

Dadas las propiedades funcionales y de unión descritas de los anticuerpos monoclonales de mono en cuestión, estos anticuerpos monoclonales anti-B7.1 y las formas primatizadas de los mismos son idóneos como agentes terapéuticos para bloquear la interacción B7:CD28, proporcionando así la inmunosupresión. En particular, dada su gran afinidad por el antígeno B7.1 y su capacidad para bloquear las interacciones entre linfocito B y linfocito T, que se mide mediante la producción de IL-2 y la captación de timidina tritiada en los cultivos de linfocitos mezclados así como su capacidad para inhibir de manera eficaz las respuestas conducidas por el antígeno en los cultivos de esplenocitos del donante tal y como se muestra mediante la reducción de las respuestas de IgG específicas del antígeno, la producción de IL-2 y la proliferación celular, estos anticuerpos monoclonales de mono y formas primatizadas de los mismos deben funcionar como inmunosupresores eficaces que modulan la vía B7:CD28. Esto es importante para el tratamiento de muchas enfermedades en las que la inmunosupresión era terapéuticamente deseable, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, para inhibir las respuestas indeseables de IgG específicas del antígeno, y también para prevenir el rechazo de órganos y la enfermedad de injerto contra huésped. Esencialmente, los anticuerpos en cuestión serán útiles para tratar cualquier enfermedad en la que la supresión de la vía B7:CD28 es terapéuticamente deseable.

Las indicaciones terapéuticas clave para los anticuerpos anti-B7.1 en cuestión incluyen, a modo de ejemplo, enfermedades autoinmunitarias tales como púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), lupus eritematoso sistémico (LES), diabetes sacarina de tipo 1, esclerosis múltiple, anemia aplásica, psoriasis y artritis reumatoide.

Otra indicación terapéutica importante de los anticuerpos anti-B7.1 en cuestión es para la prevención de la enfermedad injerto contra huésped (EICH) durante el trasplante de órganos y el trasplante de médula ósea (TMO). Los anticuerpos en cuestión se pueden utilizar para inducir la tolerancia del hospedador a los aloantígenos específicos del donante y, por lo tanto, facilitar el injerto y reducir la incidencia del rechazo al injerto. Se ha demostrado en un modelo murino de alotrasplante cardíaco que la administración por vía intravenosa de CTLA-4-Ig puede dar lugar a la inmunosupresión o incluso a la inducción de la tolerancia al aloantígeno (Lin et al., J. Exp. Med. 178: 1801, 1993; Torka et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 1102, 1992). Se espera que los anticuerpos anti-B7.1 primatizados en cuestión muestren una actividad similar o mayor.

Los anticuerpos producidos de la forma descrita anteriormente, o mediante técnicas equivalentes, se pueden purificar mediante una combinación de cromatografía de afinidad o cromatografía por exclusión de tamaños para caracterizarlos en ensayos biológicos funcionales. Estos ensayos incluyen la determinación de la especificidad y la afinidad de unión así como una función efectora asociada con el isotipo expresado, por ejemplo, ADCC o fijación del complemento. Tales anticuerpos se pueden utilizar como agentes terapéuticos pasivos o activos contra numerosas enfermedades humanas, incluidas el linfoma de linfocitos B, enfermedades infecciosas incluido el SIDA, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, y trasplante. Los anticuerpos se pueden utilizar bien en su forma original o como parte de un complejo anticuerpo/quelato, anticuerpo/fármaco o anticuerpo/toxina. Adicionalmente, se pueden utilizar anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpos (Fab_{2}, Fab, Fv) como reactivos de diagnóstico por imagen o como posibles vacunas o inmunógenos en la inmunoterapia activa para generar respuestas anti-idiopáticas.

La cantidad del anticuerpo útil para producir un efecto terapéutico se puede determinar mediante técnicas estándares bien conocidas por los expertos en la técnica. Los anticuerpos generalmente se abastecen mediante técnicas estándares dentro de un tampón farmacéuticamente aceptable, y se puede administrar mediante cualquier vía deseada. Debido a la eficacia de los anticuerpos que se reivindican en esta memoria y a su tolerancia en los humanos, es posible administrar estos anticuerpos repetitivamente para combatir diferentes enfermedades o estados de enfermedad en un humano.

Los anticuerpos anti-B7.1 (o fragmentos de los mismos) de esta invención son útiles para inducir la inmunosupresión, esto es, para inducir una supresión de un sistema inmunitario en un humano o un animal. Por lo tanto, esta invención se refiere a un método para inducir por medios profilácticos o terapéuticos la inmunosupresión en un humano u otro animal que lo necesite, administrando una cantidad eficaz y no tóxica de tal anticuerpo de esta invención a tal humano u otro animal.

Se ha demostrado la capacidad de los compuestos de esta invención para inducir la inmunosupresión mediante ensayos estándares utilizados para este propósito, por ejemplo, un ensayo de reacción de linfocitos mezclados o un ensayo para medir la inhibición de la proliferación de los linfocitos T medida por la captación de timidina.

El hecho de que los anticuerpos de esta invención sean útiles para inducir la inmunosupresión indica que deben ser útiles para el tratamiento o la prevención de la resistencia a, o el rechazo de, órganos o tejidos trasplantados (por ejemplo, riñón, corazón, pulmón, médula ósea, piel, córnea, etc.,); el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunitarias, inflamatorias, proliferativas e hiperproliferativas, y de manifestaciones cutáneas de las enfermedades inmunológicamente medicadas (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia grave, diabetes de tipo 1, uveítis, síndrome nefrítico, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis de contacto y otras dermatitis eccematosas, dermatitis seborréica, liquen plano (Liquen planus), Pemplugus, pénfigo vesicular, epidermólisis ampollosa, urticaria, angioedemas, vasculitis, eritema, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, etc.,); el tratamiento de la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias reversible, inflamaciones y alergias intestinales (por ejemplo: enfermedad celíaca, rectitis, gastroenteritis eosinófila, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) y alergias relacionadas con la comida (por ejemplo, migraña, rinitis y eccema).

El experto en la técnica será capaz, mediante la experimentación habitual, de determinar cuán eficaz sería una cantidad no tóxica del anticuerpo para el propósito de inducir la inmunosupresión. Sin embargo, por lo general, una dosis eficaz se encontrará en el intervalo de unos 0,05 a 100 mg/kg de peso corporal al día.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de esta invención también deben ser útiles para tratar tumores en un mamífero. Más específicamente, deben ser útiles para reducir el tamaño del tumor, inhibir el crecimiento del tumor y/o prolongar el tiempo de supervivencia de los animales portadores del tumor. De acuerdo con esto, esta invención también se refiere a un método para tratar tumores en un humano o en otro animal administrando a tal animal o humano una cantidad eficaz y no tóxica de un anticuerpo. El experto en la técnica será capaz, mediante la experimentación habitual, de determinar cuán eficaz sería una cantidad no tóxica de un anticuerpo anti-B7 para el propósito de tratar tumores carcinógenos. Sin embargo, generalmente se espera que una dosis eficaz se encuentre en el intervalo de aproximadamente 0,05 a 100 mg/kg de peso corporal al día.

Los anticuerpos de la invención se pueden administrar a un humano u otro animal de acuerdo con los métodos de tratamiento antes mencionados en una cantidad suficiente para producir tal efecto en un grado terapéutico o profiláctico. Tales anticuerpos de la invención se pueden administrar a tal humano u otro animal en una forma farmacéutica convencional preparada combinando el anticuerpo de la invención con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional de acuerdo con las técnicas conocidas. El experto en la técnica reconocerá que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable están dictados por la cantidad del ingrediente activo con el que se debe combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

La vía de administración del anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica. La terminología parenteral tal y como se utiliza en la presente memoria incluye la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Generalmente se prefieren las formas subcutánea e intramuscular de la administración parenteral.

Las posologías parenteral u oral diarias para utilizar compuestos de la invención para inducir la inmunosupresión por medios profilácticos o terapéuticos, o con el fin de tratar terapéuticamente los tumores carcinógenos se encontrarán por lo general en el intervalo de unos 0,05 a 100, pero preferiblemente de unos 0,5 a 10, mg/kg de masa corporal al día.

Los anticuerpos de la invención también se pueden administrar por inhalación. "Inhalación" se refiere a la administración de la inhalación por vía intranasal y oral. Las formas farmacéuticas adecuadas para tal administración, tales como una formulación en aerosol o un inhalador de dosis medida, se pueden preparar mediante técnicas convencionales. La cantidad de dosis preferida de un compuesto de la invención a emplear generalmente se encuentra dentro del intervalo de unos 10 a 100 mg.

Los anticuerpos de la invención también se pueden preparar por vía tópica. La administración por vía tópica se refiere a la administración no sistémica e incluye la aplicación de un compuesto anticuerpo (o un fragmento del mismo) de la invención por vía externa en la epidermis, en la cavidad bucal y la instilación de tal anticuerpo en el oído, el ojo y la nariz, y en la que no entra en el torrente circulatorio. La administración sistémica se refiere a la administración por vía oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. La cantidad de anticuerpo requerida para que se produzca el efecto terapéutico o profiláctico evidentemente variará según el anticuerpo elegido, la naturaleza y la gravedad de la afección a tratar, y del animal que se somete al tratamiento, y finalmente se encuentra a discreción del médico. Una dosis tópica adecuada de un anticuerpo de la invención por lo general se encontrará dentro del intervalo de aproximadamente 1 a 100 mg/kg de masa corporal por día.

Formulaciones

Aunque es posible administrar sólo un anticuerpo o fragmento del mismo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. El ingrediente activo puede comprender, para la administración por vía tópica, del 0,001% al 10% p/p, por ejemplo, del 1% al 2% en peso de la formulación, aunque puede comprender hasta el 10% p/p, pero preferiblemente no exceder del 5% p/p y más preferiblemente del 0,1% al 1% p/p de la formulación.

Las formulaciones tópicas de la presente invención comprenden un ingrediente activo junto con uno o más vehículo(s) aceptable(s) para ello y, opcionalmente, cualquier(cualesquiera) otro(s) ingrediente(s) terapéutico(s). El(los) vehículo(s) puede(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible(s) con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial(es) para el receptor del(de los) mismo(s).

Las formulaciones adecuadas para la administración por vía tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel hasta el sitio en el que se requiere el tratamiento, como linimentos, lociones, cremas, ungüentos o pastas, y gotas adecuadas para la administración en el ojo, en el oído o en la
nariz.

Las gotas de acuerdo con la presente invención pueden comprender disoluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles y se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una disolución acuosa adecuada de un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, y que incluya preferiblemente un tensioactivo. La disolución resultante se puede hacer transparente por filtración y transferir a un contenedor adecuado que luego se sella y se esteriliza en el autoclave o que se mantiene a 90ºC-100ºC durante media hora. Alternativamente, se puede esterilizar la disolución mediante filtración y transferirla al contenedor mediante una técnica aséptica. Ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para incluirlos en las gotas son el acetato o el nitrato fenilmercúrico (0,002%), el cloruro de benzalconio (0,01%) y el acetato de clorhexidina (0,01%). Disolventes adecuados para la preparación de una disolución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen aquellas que son adecuadas para su aplicación en la piel o en el ojo. Una loción ocular puede comprender una disolución acuosa estéril que contenga opcionalmente un bactericida y se puede preparar mediante métodos similares a los de la preparación de las gotas. Las lociones o los linimentos para aplicación en la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tal como alcohol o acetona, y/o un humectante tal como glicerol o un aceite tal como aceite de ricino o aceite de cacahuete.

Las cremas, ungüentos o pastas de acuerdo con la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para la aplicación externa. Se pueden fabricar mezclando el ingrediente activo en forma de partículas divididas finamente o en forma de polvo, solo o en una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, con ayuda de una maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abeja, un jabón metálico; un mucílago, un aceite de origen natural tal como aceite de almendra, maíz, de cacahuete, de ricino o de oliva; grasa de lana o sus derivados, o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol o los macrogoles. La formulación puede incorporar cualquier tensioactivo adecuado tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tales como ésteres de sorbitán o derivados de polioxietileno de los mismos. También se pueden incluir agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o sustancias inorgánicas tales como sílices de roca y otros ingredientes tales como lanolina.

Los anticuerpos anti-N7.1 en cuestión o los fragmentos de los mismos también se pueden administrar junto con otros restos que modulan la vía B7:CD28. Tales restos incluyen, a modo de ejemplo, citocinas tales como IL-7 e IL-10, CTLA-4-Ig, CTLA-4 soluble y anticuerpos anti-CD28 y fragmentos de los mismos.

El experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciado de las dosis individuales de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se determinarán según la naturaleza y la extensión de la afección a tratar, la forma, la vía y el sitio de administración, y el animal a tratar en particular, y que tales óptimos se pueden determinar mediante técnicas convencionales. El experto en la técnica también apreciará que el ciclo óptimo del tratamiento, es decir, el número de dosis de un anticuerpo o un fragmento del mismo de la invención administrado por día durante un número determinado de días, puede ser determinado por los expertos en la técnica utilizando las pruebas convencionales de determinación del ciclo de tratamiento.

Sin más elaboración, se cree que el experto en la técnica puede, utilizando la descripción anterior, utilizar la presente invención en su máximo alcance. Por lo tanto, las siguientes formulaciones se deben considerar como realizaciones simplemente ilustrativas y de ningún modo como una limitación del alcance de la presente invención.

Composición de la cápsula

Una composición farmacéutica de esta invención en la forma de una cápsula se prepara rellenando una cápsula de gelatina dura de dos piezas estándar con 50 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, en forma de polvo, 100 mg de lactosa, 32 mg de talco y 8 mg de estearato de magnesio.

Composición parenteral inyectable

Una composición farmacéutica de esta invención en la forma adecuada para la administración mediante inyección se prepara agitando un 1,5% en peso de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en propilenglicol y agua al 10% en volumen. La disolución se esteriliza por filtración.

Composición del ungüento

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención: 1,0 g.

Parafina blanda blanca hasta 100,0 g.

El anticuerpo o fragmento del mismo de la invención se dispersa en un volumen pequeño del vehículo para producir un producto suave y homogéneo. Luego, los tubos de metal colapsables se llenan con la dispersión.

Composición de la crema tópica

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención: 1,0 g.

Polawax GP 200: 20,0 g.

Lanolina anhidra: 2,0 g.

Cera de abeja blanca: 2,5 g

Hidroxibenzoato de metilo: 0,1 g.

Agua destilada a 100,0 g.

La Polawax (cera autoemulsificable), la cera de abeja y la lanolina se calientan juntas a 60ºC. Se añade una disolución de hidroxibenzoato de metilo y se consigue la homogeneización mediante agitación a gran velocidad. Luego, se baja la temperatura hasta los 50ºC. A continuación, se añade el anticuerpo o fragmento del mismo de la invención y se dispersa completamente, y se deja enfriar la composición con agitación a baja velocidad.

Composición de la loción tópica

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención: 1,0 g.

Monolaurato de sorbitán: 0,6 g.

Polisorbato 20: 0,6 g.

Alcohol cetoestearílico: 1,2 g.

Glicerina: 6,0 g.

Hidroxibenzoato de metilo: 0,2 g.

Agua purificada B. P. hasta 100-00 ml (British Pharmacopeia).

Se disuelven el hidroxibenzoato de metilo y la glicerina en 70 ml del agua a 75ºC. Se funden juntos a 75ºC el monolaurato de sorbitán, el polisorbato 20 y el alcohol cetoestearílico y se añaden a la solución acuosa. La emulsión resultante se homogeneiza, se deja enfriar en agitación continua y se añade el anticuerpo o el fragmento del mismo de la invención como una suspensión en el agua restante. Se agita toda la suspensión hasta homogeneizarla.

Composición del colirio

Anticuerpo o fragmento del mismo de la invención: 0,5 g.

Hidroxibenzoato de metilo: 0,01 g.

Hidroxibenzoato de propilo: 0,04 g.

Agua purificada B.P. a 100-00 ml.

Se disuelven los hidroxibenzoatos de metilo y propilo en 70 ml de agua purificada a 75ºC y la disolución resultante se deja enfriar. Luego se añade el anticuerpo o el fragmento del mismo de la invención, y se esteriliza la disolución por filtración a través de un filtro de membrana (tamaño de poro de 0,022 \mum) y se empaqueta asépticamente en los contenedores estériles adecuados.

Composición para la administración por inhalación

Para un contenedor de aerosoles con una capacidad de 15 a 20 ml: mézclense 10 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención con 0,2 a 0,5% de un agente lubricante, tal como polisorbato 85 o ácido oleico, y dispérsese tal mezcla en un gas propelente, tal como freón, preferiblemente en una combinación de (1,2-diclorotetrafluoroetano) y difluorocloro-metano y colóquese en un contenedor de aerosoles adecuado para administración por inhalación intranasal u oral.

Composición para la administración por inhalación

Para un contenedor de aerosoles con una capacidad de 15 a 20 ml: disuélvanse 10 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención en etanol (de 6 a 8 ml), añádase de 0,1 a 0,2% de un agente lubricante, tal como polisorbato 85 o ácido oleico; y dispérsese en un gas propelente, tal como freón, preferiblemente en una combinación de (1,2-diclorotetrafluoroetano) y difluoroclorometano, y colóquese en un contenedor de aerosoles adecuado adaptado para la administración por inhalación intranasal u oral.

Los anticuerpos y las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, subcutánea, intramuscular o intravenosa. Las composiciones para la administración parenteral comprenderán por lo general una disolución de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención o un cóctel del mismo disuelto en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se pueden emplear numerosos vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas disoluciones están estériles y por lo general sin la materia particulada. Estas disoluciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización bien conocidas y convencionales. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal y como se requiere para acercarse a las condiciones fisiológicas tales como ajustar el pH y agentes tamponantes, etc. La concentración del anticuerpo o del fragmento del mismo de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de unos 0,5% normalmente a, o al menos, un 1% o incluso hasta el 20% en peso, y se seleccionará principalmente sobre la base de los volúmenes del líquido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración
elegido.

Así, una composición farmacéutica de la invención para la inyección intramuscular se podría preparar para que contenga agua tamponada estéril a 1 M1, y 50 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención. De igual forma, se podría fabricar una composición farmacéutica de la invención para la infusión intravenosa que contuviera 250 ml de una disolución de Ringer estéril, y 150 mg de un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral se conocen bien y serán evidentes para los expertos en la técnica, y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remigton's Pharmaceutical Science, 15ª edición, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de la invención se pueden liofilizar para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes del uso. Se ha demostrado que esta técnica es eficaz con las globulinas inmunitarias convencionales y se pueden emplear las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la
técnica.

Dependiendo del resultado buscado, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En la aplicación terapéutica, las composiciones se administran a un paciente que ya padece una enfermedad, en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, la enfermedad y sus complicaciones. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos presentes o un cóctel de los mismos se administran a un paciente que todavía no se encuentra en un estado de enfermedad para potenciar la resistencia del paciente.

Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones farmacéuticas se pueden llevar a cabo con niveles de dosis y una posología que selecciona el médico responsable del tratamiento. En cualquier circunstancia, la composición farmacéutica de la invención debe proporcionar una cantidad de los anticuerpos alterados (o fragmentos de los mismos) de la invención suficiente para tratar con eficacia al paciente.

Se debe destacar también que los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar para el diseño y la síntesis tanto de compuestos peptídicos como no peptídicos (miméticos) que serían útiles para la misma terapia como lo es el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Saragovi et al., Science, 253, 792-795 (1991).

Para ilustrar adicionalmente la invención, se proporcionan los ejemplos siguientes. Estos ejemplos no pretenden, ni se deben interpretar, como limitaciones adicionales de la invención.

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Ejemplo 1

Las genotecas de inmunoglobulinas recombinantes mostradas sobre la superficie de fagos filamentosos se describieron por primera vez en McCafferty et al., Nature, 348: 552-554, 1990 y en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 7978-7982, 1991. Utilizando esta tecnología, se han aislado anticuerpos de gran afinidad de genotecas recombinantes humanas inmunitarias (Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 589: 10164-10168, 1992). Aunque el concepto de presentación en fagos utilizado es esencialmente similar al descrito por Barbas, 1991, Id, se ha modificado esta técnica mediante la sustitución de un vector único para genotecas de mono para reducir la posibilidad de la recombinación y mejorar la estabilidad. Este vector, pMS, figura 1, contiene un solo promotor/operador lac para la transcripción y la traducción eficaces de un ADN policistrónico de mono con la cadena pesada y la cadena ligera. Este vector contiene dos secuencias líder diferentes, la ompA [Movva et al., J. Biol. Chem., 255: 27-29, (1980)], para la cadena ligera, y pelB [Lei, J. Bact, 4379-109: 4383 (1987)] para la Fd de la cadena pesada. Las dos secuencias líder se traducen en péptidos señal hidrófobos que dirigen la secreción de los productos clonados de la cadena pesada y la cadena ligera al espacio periplásmico. En el entorno oxidativo del peliplasma, se pliegan las dos cadenas y se forman los enlaces disulfuro para crear fragmentos Fab estables. Obtuvimos el esqueleto del vector a partir del fagémido Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Éste contiene el gen de la enzima \beta-lactamasa, que confiere resistencia a la ampicilina (carbenicilina) a las bacterias que albergan el ADN de pMS. También obtuvimos, a partir de Bluescript, el origen de replicación del plásmido multicopia CoIEI y el origen de replicación del bacteriófago filamentoso f1. El origen de replicación del fago f1 (la también llamada región intragénica) señala el inicio de síntesis del ADN monocatenario de pMS, el inicio de la formación de la cápsida y la terminación de la síntesis del ARN mediante las enzimas víricas. La replicación y el ensamblaje de las cadenas de ADN de pMS en partículas de fagos requiere proteínas víricas que se tienen que proporcionar mediante un fago auxiliar. Hemos utilizado el fago cooperador VCSM13 que se ajusta particularmente a esto, ya que también contiene un gen que codifica la resistencia a la kanamicina. Las bacterias infectadas con VCSM13 y pMS se pueden seleccionar añadiendo kanamicina y carbenicilina al medio de desarrollo. Las bacterias finamente producirán las partículas de fagos filamentosos que contienen el genoma de pMS o el de VCSM13. El empaquetamiento del fago auxiliar es menos eficaz que el de pMS, lo que da lugar a una población mixta de fagos que contienen predominantemente fagos pMS recombinantes. Los extremos del fago recogen proteínas de cubierta específicas en cada extremo. Aquí es de interés particular el producto del gen III que se encuentra presente en tres a cinco copias en un extremo del fago. El producto del gen III son 406 restos de aminoácidos y es necesario para la infección de E. coli a través del pelo F. Los dos primeros dominios de la cadena pesada, el dominio variable y el dominio CH1, se fusionan con la mitad carboxi-terminal de la proteína del gen III. Esta proteína recombinante del pelo, dirigida por el líder de pelB, se secreta al periplasma donde se acumula y forma enlaces disulfuro con la cadena ligera antes de incorporarse a la cubierta del fago. También, otro vector contiene una secuencia FLAG introducida artificialmente secuencia abajo del gen III. FLAG es un péptido de 8 aminoácidos que se expresa en el extremo carboxilo de la proteína Fd. Estamos utilizando el anti-FLAG M2 monoclonal disponible comercialmente para la purificación y la detección del Fab en el fago mediante ELISA [Brizzard, BioTechniques, 16(4): 730-731,
(1994)].

Después de construir el vector pMS, probamos su capacidad para producir Fab unidos a fagos utilizando genes del anticuerpo de control. Clonamos un anticuerpo contra el toxoide del tétanos (obtenido del Dr. Carlos Barbas) en pMS y transformamos XL1-blue. Coinfectamos nuestras células con VCSM13 y generamos fagos que mostraban el anticuerpo contra el toxoide del tétanos. Realizamos los experimentos de eficacia en los que los fagos con el anti-toxoide del tétanos se combinaron con fagos que llevaban un anticuerpo irrelevante a 1:100.000. Realizamos tres ciclos de criba aplicando 50 \mul del fago mixto a pocillos de poliestireno recubiertos con el antígeno (toxoide del tétanos). Se retiraron con lavados los fagos que no se habían adherido y se eluyeron los fagos adheridos con ácido. Se utilizaron los fagos eluidos para infectar una alícuota nueva de bacterias de XL1-Blue y se añadió el fago auxiliar. Después de la amplificación durante una noche, se prepararon de nuevo los fagos y de nuevo se cribaron sobre placas recubiertas de antígeno. Después de 3 ciclos de criba, pudimos demostrar que habíamos enriquecido con éxito el fago con el anti-toxoide del tétanos. El éxito de esta tecnología también depende de la capacidad para preparar Fab solubles para la caracterización del producto cribado final. Esto se consiguió escindiendo el gen III del ADN de pMS utilizando la enzima de restricción NheI y luego religando. Después de haber escindido el gen III, el Fab ya no estuvo presente en la superficie del fago sino que se acumuló en el espacio periplásmico. Se prepararon lisados a partir de bacterias que expresan el Fab soluble y se comprobó la especificidad del antígeno utilizando un ELISA. Se detectaron niveles elevados de Fab soluble.

A fin de adaptar la tecnología de presentación en fagos para utilizarla con las genotecas de macacos, desarrollamos cebadores específicos para amplificar por PCR los genes de la inmunoglobulina de mono. Estos se basaban en secuencias de macaco que obtuvimos mientras estábamos desarrollando la tecnología de anticuerpo primatizado PRIMATIZED^{TM} (véase, 08/379.072) y las bases de datos que contienen secuencias humanas. [Kabat et al (1991), "Sequences of proteins of immunological interest", Department of Health and Human Services de los EE.UU., Instituto Nacional de Salud de los EE.UU].

Desarrollamos tres conjuntos de cebadores para cubrir la amplificación del repertorio de macacos. Nuestro primer conjunto de cebadores se diseñó para amplificar los dominios VH y CH1 (Fd) de la cadena pesada. Consistió en el cebador del dominio CH1 en 3' y seis cebadores específicos de la familia VH en 5' que se unen en la región del marco 1. Nuestro segundo conjunto de cebadores, para amplificar toda la cadena lamda, cubre los muchos subgrupos de la cadena lambda. Consiste en un cebador en 3' y en tres cebadores degenerados en 5' que se unen a la región VL del marco 1. Nuestro tercer conjunto de cebadores se diseñó para la amplificación de los subgrupos de la cadena kappa. Consiste en un cebador en 3' y en cinco cebadores del marco de VK. Utilizando cada uno de estos conjuntos, se optimizaron los parámetros de la PCR para obtener señales suficientemente fuertes de cada par de cebadores para que estuviera disponible bastante material para clonar la genoteca. Recientemente, los autores de la invención creamos genotecas combinatorias de macaco en nuestro vector pMS utilizando estas condiciones optimizadas de PCR. Se tomaron biopsias de médula ósea de monos inmunes CD4 como la fuente del ARN de inmunoglobulinas. Las genotecas contenían aproximadamente 10^{6} miembros y actualmente se están cribando en busca de moléculas que se unan específicamente a los pocillos recubiertos del antígeno.

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Ejemplo 2 Desarrollo de reactivos de B7/CTLA-4

Hemos generado una serie de reactivos con el objetivo de inmunizar monos, desarrollar ensayos de unión y de funcionalidad in vitro, detectar selectivamente heterohibridomas y cribar genotecas de fagos. La tabla 1 enumera cada reactivo y su propósito previsto. En el caso de B7.1, el ARN se extrajo de las células SB y se convirtió en ADNc mediante la transcriptasa inversa. La primera cadena del ADNc se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos de B7.1 y se clonaron en vectores de expresión de mamíferos NEOSPLA de IDEC. Se transfectaron las células CHO con ADN de NEOSPLA con B7.1 y se identificaron los clones que expresan B7.1 asociado a la membrana. Se generó de forma similar la proteína de fusión de B7.1, salvo que se clonó el gen de B7.1 amplificado por PCR en un vector con casete de NEOSPLA que contiene los genes de la inmunoglobulina CH2 y CH3 humanos. Se transformaron las células CHO con el ADN de NEOSPLA conB7.1/Ig y se amplificaron los clones estables que secretan la proteína de fusión B7.1/Ig. En general, se generaron reactivos de B7.2 y CTLA4 del mismo modo, salvo que para B7.2 se aisló el ARN de los esplenocitos humanos que se habían estimulado durante 24 horas con anti-Ig e IL-4 y, para las construcciones de CTLA-4, la fuente del gen fueron los linfocitos T humanos activados con
PHA.

TABLA 1

1

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La capacidad de estos reactivos, junto con los anticuerpos monoclonales para B7.1 (L3074) (Becton Dickinson, 1994) y B7.2 [Fun-1 (Engel et al., Blood, 84, 1402-1407, (1994)] y antisueros de cabra y conejo purificados, desarrollados específicamente para detectar fragmentos Fab de mono, facilita la identificación de los anticuerpos que tienen las propiedades deseadas.

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Ejemplo 3 Investigación de la respuesta inmunitaria en macacos de cola larga al B7.1 humano asociado a las células y soluble

Para evaluar la viabilidad de producir anticuerpos de mono contra el antígeno B7.1 humano, primero purificamos SB7.1 recombinante del medio de las células CHO mediante cromatografía de afinidad con una columna de afinidad de sefarosa-L307.4. Luego, se inyectó SB7.1, con adyuvante, en cinco macacos de cola larga maduros. Después de un periodo de 3 a 4 meses de inmunizaciones de refuerzo, se analizó la capacidad de unión al antígeno de los sueros de los monos inmunizados con SB7.1 o células SB humanas.

A las muestras de suero de los cinco monos inmunizados con SB7.1 y tres animales más inmunizados con células SB humanas que expresaban B7.1 se les analizó la titulación de anticuerpo contra B7.1 asociado a la membrana expresado en las células CHO transfectadas. Los resultados compendiados en la figura 3 demostraron que cuatro de los cinco monos inmunizados con SB7.1 purificado por afinidad producían títulos de anticuerpo en un exceso de 1:5000. Los tres animales inmunizados con las células SB que contenían el B7.1 asociado a la célula expresaron unos títulos más bajos de anticuerpos, que oscilaban de 1:1400 a 1:2800.

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Ejemplo 4

Los autores de la invención purificamos anticuerpos de sueros de los ocho monos inmunizados utilizando SB7.1-sefarosa y, luego, comprobamos su capacidad para unirse a 1) placas recubiertas de SB7.1 en ELISA; 2) linfocitos B que expresan el antígeno y 3) transfectomas de CHO con B7.1. Además, se evaluó su capacidad para bloquear las interacciones de los linfocitos B que se mide mediante la producción de IL-2 y la captación de timidina tritiada en una reacción de linfocitos mezclados (RLM). Para los experimentos de unión de linfocitos T, se cultivaron los linfocitos de la sangre periférica de la capa leucocítica humana durante 3 a 6 días en presencia del estimulador PHA. Se detectó la unión de B7 mediante inmunoensayo utilizando B7.1 soluble (SB7.1) radiomarcado con ^{125}I.

Ejemplo 5 Unión directa de los anticuerpos de mono a SB7 radiomarcado

Se analizó la unión del SB7.1 radiomarcado con ^{125}I a anticuerpos anti-B7.1 a 4, 1 y 0,25 \mug/ml en disolución. Los resultados mostrados en la tabla 2 apuntan a que la mayoría de los anticuerpos producidos por los monos inmunizados con SB7.1 fueron capaces de unir el ^{125}I-SB7.1 purificado por afinidad de un modo dependiente de la concentración. Para evaluar la especificidad de unión a SB7.1 marcada, se realizaron experimentos de competición con SB7.1 sin marcar con anticuerpos de dos animales. Con los anticuerpos purificados por afinidad de los monos 1133 y 1144 se cubrieron las placas de micropocillos a 400 ng/pocillo. Se utilizó SB7.1 sin marcar purificado por afinidad (500 y 100 ng/pocillo) como competidor. Los resultados mostrados en la figura 4 demostraron que las preparaciones de SB7.1 son eficaces a la hora de inhibir que ^{125}I-SB7.1 se una a los anticuerpos.

TABLA 2 Unión de SB7-1^{125} a anticuerpos de mono purificados por afinidad en una columna de afinidad de SB7-sefarosa

2

Los datos son valores medios de ensayos por duplicado y representan la unión de ^{125}I-SB7 en cpm.

Ejemplo 6 Unión directa de los anticuerpos de mono purificados por afinidad radiomarcados a las células B7^{+} e inhibición mediante SB7.1

Los anticuerpos anti-B7.1 de mono radiomarcados purificados por afinidad del mono PRI135 se compararon con el Acm L307.4 radiomarcado por su capacidad de unión directa a células SB humanas que expresan B7. Como control de especificidad, se añadió SB7.1 sin marcar (0,002-20 \mug/ml) para competir con ambos anticuerpos radiomarcados. Demostramos que los anticuerpos de mono pueden unirse al B7.1 asociado a las células y que se inhiben con el SB7.1, tal y como se muestra en la figura 5. Se observó una inhibición de hasta el 90% con el SB7.1.

Ejemplo 7 Unión directa de la proteína de fusión B7-Ig radiomarcada a los linfocitos T activados e inhibición por anticuerpos de mono purificados por afinidad

Se activaron linfocitos T de sangre periférica humana durante 3 a 6 días y se les analizó su capacidad de unirse directamente a ^{125}I-B7.1-Ig. Debido a la inducción del receptor Fc sobre los linfocitos T humanos activados, fue necesario incubar previamente los linfocitos con inmunoglobulina preinmunitaria agregada por calor para bloquear los sitios de unión a Fc antes de añadir la B7.1-Ig a los linfocitos. Se incluyó un control del fondo utilizando células del mieloma murino SP2/0 para permitir la corrección de la unión de fondo. La figura 6 muestra que la inhibición de la unión de la proteína de fusión ^{125}I-B7.1-Ig a los linfocitos T activados se logró con anticuerpos de mono purificados por afinidad a unas concentraciones de 200 a 8 \mug/ml. El SB7.1 sin marcar y los Acm L307.4 usados como controles también fueron eficaces a la hora de inhibir la unión de la proteína de fusión B7.1-Ig a las células.

Ejemplo 8 Inhibición de la producción de la IL-2 mediante anticuerpos de mono anti-B7 en reacciones de linfocitos mezclados

El bloqueo de la interacción de CD28/B7 conduce a la inhibición de la producción de la IL-2 por los linfocitos T. En el experimento mostrado en la figura 7, a los anticuerpos de mono purificados por afinidad de dos monos inmunizados con SB7.1 (monos 1137 y 1135) y de un mono inmunizado con células SB que expresan el B7 (mono 1146) se les evaluó su capacidad para inhibir la activación de los linfocitos T humanos en una reacción de linfocitos mezclados (RLM), que se midió mediante la inhibición de la producción de la IL-2. Los resultados de este experimento demuestran que los anticuerpos anti-B7.1 purificados por afinidad de los monos 1146 y 1137 inhibieron la producción de la IL-2 cuando se añadieron a concentraciones de 50 \mug/ml. No se pudieron evaluar los anticuerpos de mono 1135 a las dos concentraciones más elevadas debido a la falta de material, aun cuando dieron una inhibición importante a bajas concentraciones. El Acm murino L307.4 fue inhibidor a concentraciones de 10 \mug/ml. Otros sueros de mono ensayados a estas concentraciones fueron negativos (no se muestran los datos). Estos resultados demuestran que al menos tres de los monos inmunizados con ambas formas, la asociada a la membrana y la soluble, del antígeno B7 producen anticuerpos con potencial inmunosupresor que bloquean el B7.

Ejemplo 9 Investigación de la reactividad cruzada al antígeno B7.2 en el suero de mono inmunizado con B7.1

A los anticuerpos generados contra B7.1 hay que analizarles la reactividad cruzada con B7.2. Los resultados preliminares que utilizan los anticuerpos purificados por afinidad contra B7.1 de sueros inmunitarios de B7.1 proporcionaron una prueba indicadora de la unión a las células CHO transfectadas con B7.2 (no se muestran los datos). También se deben confirmar estos datos utilizando reactivos B7.2-Ig solubles. Primero purificaremos más anticuerpos de mono de los animales inmunizados con B7.1 mediante cromatografía de afinidad en B7.1-Ig-sefarosa. Luego, produciremos y purificaremos la B7.2-Ig a partir de las células CHO en cantidades suficientes para preparar una columna de afinidad de B7.2-Ig-sefarosa. Seleccionaremos de la población de anticuerpos específicos contra B7.1 aquellos anticuerpos que reaccionan cruzadamente con B7.2 mediante la unión a la columna de B7.2-Ig-sefarosa. Se caracterizará adicionalmente cualquier anticuerpo que reaccione cruzadamente mediante la unión directa a las células CHO transfectadas con B7.1 y con B7.2, y la inhibición de la unión a células transfectadas con B7.2 provocada por B7.1-Ig.

Ejemplo 10 Generación de una genoteca de presentación en fagos

Se generan genotecas de presentación en fagos recombinantes de monos inmunizados con B7.1 y B7.2. Se realizan biopsias de los ganglios linfáticos y de la médula ósea 7 a 12 días después de la inmunización para recoger linfocitos B ricos en ARN y células plasmáticas. Se aísla el ARN de los linfocitos utilizando el método descrito en Chomczynski Anal. Biochem.., 162(1), 156-159, (1987). Se convierte el ARN en ADNc utilizando un cebador oligo-dT y la transcriptasa inversa. Se divide la primera cadena del ADNc en alícuotas y se amplifica por PCR utilizando los conjuntos de cebadores de la región Fd de kappa, lambda y la cadena pesada descritos anteriormente y bien Pfu polimerasa (Stratagene, San Diego) o Taq polimerasa (Promega, Madison). Se agrupan los productos de la cadena pesada amplificados por PCR, se cortan con las enzimas de restricción XhoI y SpeI y se clonan en el vector pMS. Posteriormente, se agrupan los productos de PCR de la cadena ligera, se cortan con las enzimas de restricción SacI y XbaI y se clonan para crear la genoteca recombinante. E. coli de XLI-Blue se transforma con el ADN de la genoteca y se superinfectó con VCSM13 para producir los anticuerpos que se presentan en los fagos. Se criba la genoteca durante cuatro ciclos en pocillos de poliestireno recubiertos con el antígeno B7.1 o B7.2. Se analizan los clones de fagos individuales de cada ciclo de criba. Se aísla el ADN del vector pMS y se escinde el gen III. Se generan los fragmentos Fab solubles y se ensaya su unión a B7.1 y B7.2 mediante ELISA.

Ejemplo 11 Caracterización de los fragmentos Fab en los fagos

A los fragmentos Fab de mono en fagos se les caracteriza su especificidad y la capacidad para bloquear la unión de B7.1-Ig y B7.2-Ig a las células transfectadas con CTLA-4-Ig o CTLA-4. A los fragmentos en fagos también se les caracteriza la reactividad cruzada después de la primera criba de cuatro ciclos en las especies de B7 utilizadas para la inmunización con el fin de seleccionar los fragmentos de gran afinidad. Los fragmentos Fab identificados después de cuatro ciclos de criba sobre superficies recubiertas con el antígeno B7.1 o bien el B7.2 se amplían mediante la infección y el cultivo en cultivos de fermentación de 24 horas de E. coli. Se purifican los fragmentos mediante la unión del FLAG de Kodak a una columna de afinidad anti-FLAG. A los Fab en fagos purificados se les analizó la afinidad mediante un análisis de Scatchard modificado de unión directa basado en ELISA [Katoh et al., J. Chem. BioEng., 76: 451-454, (1993)] utilizando anticuerpos de cabra anti-Fab de mono o Acm anti-FLAG conjugados con la peroxidasa del rábano picante. Los reactivos anti-Fab de mono se adsorberán sobre la región constante de cadena pesada humana de las Ig para eliminar cualquier reactividad cruzada a B7-Ig. Se calculan los valores Kd para cada fragmento después de las mediciones de la unión directa en placas recubiertas con B7.1-Ig o B7.2-Ig.

Ejemplo 12 Bloqueo de la unión CTLA-4/B7 mediante el fragmento Fab de los fagos

Se seleccionan como candidatos destacados los fragmentos Fab que bloquean de manera más eficaz la unión de la B7-Ig a las concentraciones más bajas. Se realizan selecciones mediante la competición de la unión de ^{125}I-B7-Ig a las células transfectadas con CTLA-4-Ig o CTLA-4. Los criterios de selección adicionales incluyen el bloqueo de la reacción de linfocitos mezclados (RLM), que se mide inhibiendo la captación de ^{3}H-timidina en las células que responden [Azuma et al., J. Exp. Med., 177: 845-850; Azuma et al., Nature, 301: 76-79, (1993)], y el análisis directo de la producción de IL-2 utilizando kits de análisis de la IL-2. Los tres o cuatro candidatos que son más eficaces a la hora de inhibir la RLM y los análisis de unión a CTLA-4 se eligen para la clonación en el vector de expresión de mamíferos descritos anteriormente para la transfección en células CHO y la expresión de los anticuerpos quiméricos mono/humanos.

Ejemplo 13 Generación de heterohibridomas de mono

Los heterohibridomas de mono que secretan anticuerpos monoclonales se generan a partir de animales inmunizados existentes cuyos sueros dieron positivo para B7.1 y/o B7.2. Se toman biopsias de los ganglios linfáticos de los animales positivos a cualquiera, o a ambos, antígenos. El método de la producción de los hibridomas es similar al método establecido utilizado para la generación de anticuerpos anti-CD4 de mono [Newman, 1992, (Id)]. A los monos con títulos elevados en suero se les retirarán secciones de los ganglios linfáticos inguinales con anestesia. Se lavan los linfocitos del tejido y se fusionan con las células del heteromieloma KH6/B5 [Carrol et al., J. Immunol. Meth., 89: 61-72, (1986)] utilizando polietilenglicol (PEG). Se seleccionan los hibridomas en medio H.A.T. y se estabilizan mediante la subclonación repetida en placas de 96 pocillos.

A los anticuerpos monoclonales de mono específicos del antígeno B7.1 se les detecta la reactividad cruzada con B7.2. Los anticuerpos anti-B7 de mono se caracterizarán bloqueando la unión de B7/CTLA-4 utilizando el análisis de unión a ^{125}I-B7-Ig. La inhibición de la RLM mediante la captación de ^{3}H-timidina y la medición directa de la producción de IL-2 se utiliza para seleccionar tres candidatos. Se propondrán dos candidatos para los estudios de fase II y se expresarán en las células CHO mientras se repiten todos los estudios funcionales. Con vistas a desarrollar un modelo animal para la farmacología in vivo, se comprobarán los anticuerpos anti-B7 en las células de varias especies animales. El establecimiento de un modelo animal permitirá realizar estudios preclínicos para la indicación clínica seleccionada.

Ejemplo 14

Tal y como se expuso previamente, utilizando los métodos de heterohibridoma anteriores, se han identificado 4 anticuerpos anti-B7.1 de mono: 16C10, 7B6, 7C10 y 20C9. Estos anticuerpos se caracterizaron como sigue:

Para demostrar la capacidad que los anticuerpos de mono tienen para bloquear la interacción física entre CTLA-4-Ig, varias concentraciones de los anticuerpos anti-B7.1 de mono y CTLA-4-Ig sin marcar se incubaron con CTLA-4-Ig^{125} radiomarcado. Los resultados del análisis de inhibición demostraron que la CI50 (la concentración del inhibidor que da lugar a una inhibición del 50%) para los anticuerpos de mono son:

a: 7C10: 0,39 \mug/MI

b: 16C10: 1,60 \mug/MI

c: 20C9: 3,90 \mug/MI

d: 7B6: 39,0 \mug/MI

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Los análisis de Scatchard demostraron que las constantes de afinidad aparentes (Kd) para la unión de los anticuerpos de mono a las placas recubiertas de B7-Ig eran aproximadamente:

a: 7C10: 6,2 x 10^{-9} M

b: 16C10: 8,1 x 10^{-9} M

c: 7 B6: 10,7 X 10^{-9}M

d: 20C9: 16,8 x 10^{-9}M

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Los anticuerpos se analizaron in vitro en un ensayo de reacción de linfocitos mezclados (RLM). La RLM demostró que los 4 anticuerpos anti-B7.1 inhiben la producción de IL-2 con diferente intensidad:

a: 7B6: 5,0 \mug/MI

b: 16C10: 0,1 \mug/MI

c: 20C9: 2,0 \mug/MI

d: 7C10: 5,0 \mug/MI

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Se comprobó la capacidad de los anticuerpos anti-B7.1 de mono para unirse al B7 en los linfocitos de la sangre periférica humana (LSP). El análisis FACS demostró que los 4 anticuerpos de mono ensayados daban positivo.

Se comprobó la unión de los anticuerpos de mono 16C10, 7B6, 7C10 y 20C9 a C1q mediante el análisis FACS. Los resultados demostraron que la Ig de mono 7C10 se unía con fuerza al C1q humano después incubar con células CHO transfectadas con B7.1. El anticuerpo de mono 16C10 fue negativo, al igual que los 20C9 y 7B6.

Ejemplo 15

Utilizando la metodología de los anticuerpos primatizados descrita en la patente de los EE.UU. n.º 08/379.072 y utilizando el sistema de vector NEOSPLA mostrado en la figura 2, se clonaron los dominios variables de la cadena pesada y la ligera de 7C10, 7B6 y 16C10 y se han sintetizado formas primatizadas de los mismos en las células CHO utilizando el sistema de vector NEOSPLA. Las secuencias de aminoácidos y del ácido nucleico de las cadenas ligera y pesada del 7C10, de las cadenas ligeras y pesada de 7B6, y de las cadenas ligera y pesada de 16C10 todas ellas primatizadas se muestran respectivamente en las figuras 8a, 8b, 9a, 9b, 10a y 10b.

Se espera que estos anticuerpos primatizados, dada su probable baja antigenicidad y su función efectora humana, sean idóneos como fármacos terapéuticos. De hecho, recientemente se ha demostrado que el 16C10 primatizado muestra unión al CI_{9} humano mientras que 16C10 no.

Los expertos en la técnica reconocerán o podrán determinar utilizando simplemente la experimentación habitual, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Tales equivalentes pretenden abarcar las reivindicaciones que siguen.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: IDEC PHARMACEUTICALS CORPORATION

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: IDENTIFICACIÓN DE INTERACCIONES DE UNIÓN ÚNICAS ENTRE CIERTOS ANTICUERPOS Y LOS ANTÍGENOS COESTIMULADORES HUMANOS B7.1 Y B7.2

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: PAGE WHITE & FARRER

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 54 Doughty Street

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(C)

CIUDAD: Londres

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PAÍS: Inglaterra

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

CÓDIGO POSTAL: WC1N 2LS

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn lanzamiento n.º 1.0, versión n.º 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/487.550

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO: 07-junio-1995

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 705 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..705

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N.º 1:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1431 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1...1431

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 720 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1...720

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 3

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1437 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1...1437

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 711 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1...711

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 5:

10

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID N.º 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1431 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1...1431

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N.º 6

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12

13

Claims (24)

1. Un anticuerpo monoclonal de mono, una forma primatizada del mismo, o un fragmento del anticuerpo monoclonal de mono o forma primatizada del mismo, que se une al antígeno CD80 humano y que comprende secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada seleccionadas del grupo que consiste
en:

a) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 7C10 expuestas como SEQ ID n.º 1 y SEQ ID n.º 2, respectivamente.

b) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 7B6 expuestas como SEQ ID n.º 3 y SEQ ID n.º 4, respectivamente; y

c) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 expuestas como SEQ ID n.º 5 y SEQ ID n.º 6, respectivamente.

2. Un anticuerpo monoclonal de mono, una forma primatizada del mismo, o un fragmento del anticuerpo monoclonal o forma primatizada del mismo, que se une a un epítopo del antígeno CD80 humano al que también se une un anticuerpo que comprende secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada seleccionadas del grupo que consiste en:

a) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 7C10 expuestas como SEQ ID n.º 1 y SEQ ID n.º 2, respectivamente;

b) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 7B6 expuestas como SEQ ID n.º 3 y SEQ ID n.º 4, respectivamente; y

c) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 expuestas como SEQ ID n.º 5 y SEQ ID n.º 6, respectivamente.

3. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una región constante de cadena ligera de una cadena ligera de anticuerpo humano, y una región constante de cadena pesada de una cadena pesada de anticuerpo humano.

4. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende una región constante de cadena pesada que se selecciona de la región constante gamma 1 humana, de la región constante gamma 4 humana y de la región constante gamma 4 PE humana.

5. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo agotador.

6. El anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo no agotador.

7. Un fragmento de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que es un fragmento (Fab')_{2}, Fab o Fv.

8. Un ácido nucleico aislado que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

9. Ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en:

a) las secuencias de nucleótidos presentadas en la SEQ ID n.º 1 y en la SEQ ID n.º 2;

b) las secuencias de nucleótidos presentadas en la SEQ ID n.º 3 y en la SEQ ID n.º 4; y

c) las secuencias de nucleótidos presentadas en la SEQ ID n.º 5 y en la SEQ ID n.º 6.

10. Una célula cultivada que produce un anticuerpo o fragmento del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

11. La célula cultivada de la reivindicación 10, que es un transfectoma de CHO.

12. La célula cultivada de la reivindicación 10, que produce un anticuerpo quimérico que se une al antígeno CD80 humano y que comprende una región constante de cadena ligera de una cadena ligera de anticuerpo humano y una región constante de cadena pesada de una cadena pesada de anticuerpo humano, y que además comprende secuencias de polipéptidos de la región variable seleccionadas del grupo que consiste en:

a) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 7C10 expuestas como SEQ ID n.º 1 y SEQ ID n.º 2, respectivamente;

b) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 7B6 expuestas como SEQ ID n.º 3 y SEQ ID n.º 4, respectivamente; y

c) las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 expuestas como SEQ ID n.º 5 y SEQ ID n.º 6, respectivamente.

13. Una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une al antígeno CD80 humano, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, para usarla como un inmunosupresor.

15. Utilización de una composición que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo que se une al antígeno CD80 humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en trastorno autoinmunitario, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de un órgano o tejido trasplantado, enfermedad infecciosa, enfermedad inflamatoria y linfoma de linfocitos B.

16. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedad de injerto contra huésped o el rechazo de un órgano o tejido trasplantado, en la que el injerto o el órgano o el tejido trasplantado se selecciona de riñón, corazón, pulmón, médula ósea, piel y
córnea.

17. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la enfermedad o el trastorno se selecciona del grupo que consiste en SIDA, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, uveítis, síndrome nefrítico, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, dermatitis seborréica, dermatitis eccematosa, liquen plano, pénfigo, pénfigo ampolloso, epidermólisis ampollosa, urticaria, angioedemas, vasculitis, eritema, eosinofilias cutáneas, alopecia areata, enfermedad obstructiva de las vías respiratorias reversible, migraña, eccema, rinitis, otras afecciones alérgicas, enfermedad proliferativa, enfermedad hiperproliferativa y enfermedades asociadas con la inflamación intestinal, incluidas enfermedad celíaca, rectitis, gastroenteritis eosinófila, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

18. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el trastorno autoinmunitario se selecciona de púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eeritematoso, lupus eritematoso sistémico, diabetes sacarina de tipo 1, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple y anemia aplásica.

19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicha composición farmacéutica contiene un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la reivindicación 2, y dicho anticuerpo o fragmento se une a un epítopo del antígeno CD80 humano al que también se une un anticuerpo que comprende las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 que se exponen en la SEQ ID n.º 5 y en la SEQ ID N.º 6, respectivamente.

20. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13, en la que dicha composición farmacéutica contiene un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, y dicho anticuerpo es una forma primatizada de un anticuerpo monoclonal de mono que se une a un epítopo del antígeno CD80 humano al que también se une un anticuerpo que comprende las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 que se exponen en la SEQ ID n.º 5 y en la SEQ ID n.º 6, respectivamente.

21. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo es una forma primatizada de un anticuerpo monoclonal de mono que se une a un epítopo del antígeno CD80 humano al que también se une un anticuerpo que comprende las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 que se exponen en la SEQ ID n.º 5 y en la SEQ ID n.º 6, respectivamente.

22. Utilización de una composición que comprende al menos un anticuerpo o fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un linfoma de linfocitos B.

23. La utilización de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la composición comprende al menos un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la reivindicación 2, y dicho anticuerpo o fragmento se une a un epítopo del antígeno CD80 humano al que también se une un anticuerpo que comprende las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 que se presentan en la SEQ ID n.º 5 y en la SEQ ID n.º 6, respectivamente.

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24. La utilización de acuerdo con la reivindicación 22, en la que la composición comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, y dicho anticuerpo es una forma primatizada de un anticuerpo monoclonal de mono que se une a un epítopo del antígeno CD80 humano al que también se une un anticuerpo que comprende las secuencias de polipéptidos de la región variable de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo 16C10 que se presentan en la SEQ ID n.º 5 y en la SEQ ID n.º 6, respectivamente.