ES2301230T3

ES2301230T3 - Antigenos de erysipelothrix rhusiopathiae y composiciones de vacuna.

Info

Publication number: ES2301230T3
Application number: ES99309202T
Authority: ES
Inventors: David Stewart Roberts; Brian Thomas Suiter; Leroy Allen Swearingin
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2019-11-18
Also published as: PT1027895E; JP2007119499A; CN1210062C; BR9905853B1; JP4714167B2; DE69938168D1; TW546146B; JP2003160507A; ZA997138B; JP3535436B2; EP1027895A2; BR9905853A; CN1262129A; NZ501128A; EP1027895B1; AR020022A1; AU5944599A; JP2000219637A; ATE386540T1; AU776847B2

Abstract

Una composición de antígeno que comprende i)una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae que está desactivado con formalina o con beta-propiolactona; y ii) un agente estabilizador, cuyo agente estabilizador es un hidróxido de un metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio, o un alumbre, en la que dicha composición de antígeno está exenta de E. rhusiopathiae.

Description

Antígenos de Erysipelothrix rhusiopathiae y composiciones de vacunas.

Campo del invento

El invento se refiere a composiciones de antígenos y a formulaciones de vacunas para evitar o reprimir una infección por Erysipelothrix rhusiopathiae (erisipela), y a métodos para preparar y usar esas composiciones de antígenos y formulaciones de vacunas.

Antecedentes del invento

La erisipela tiene una distribución mundial y presenta una importancia económica en Europa, Asia, Australia así como en América del Norte y del Sur. Los cerdos de 3 meses a 3 años de edad son sumamente susceptibles a padecer erisipela. Los cerdos afectados tienen con frecuencia articulaciones hinchadas y rígidas y no ganan en peso eficientemente. También, sus carcasas se recortan o rechazan con frecuencia por los inspectores en las instalaciones de envasado.

Hace aproximadamente 10 años se demostró que era innecesaria la práctica convencional de preparar vacunas contra E. rhusiopathiae a partir de cultivos muertos enteros. Un material filtrado exento de bacterias producía un efecto igual de bueno para proteger tanto a cerdos como a ratones frente a un estímulo virulento. La subsiguiente investigación publicada por científicos del Japón y de los Estados Unidos de América (EE.UU.) ha confirmado este hallazgo y ha demostrado que la E. rhusiopathiae libera dentro del medio de cultivo un antígeno que es un inmunógeno universal, puesto que inmuniza a los cerdos frente a todas las cepas de E. rhusiopathiae (Sawada y Takahashi, 1987, Am. J. Vet. Res. 48:239-242; Groschup y colaboradores, 1991, Epidemiol. Infect. 107:637-649). Groschup y colaboradores demostraron que una proteína de 64 a 66 kDa presente en el cultivo protegía a ratones frente a un estímulo con E. rhusiopathiae virulenta. Habiéndose demostrado que dicha proteína protege también a los cerdos, la USDA proporciona a los fabri-
cantes de vacunas un anticuerpo monoclonal (mAb) para esta proteína, con el fin de utilizarlo para analizar la proteína.

Sato y colaboradores (1995) Veterinary Microbiology 43, 173-182 describen la preparación de una composición antigénica que comprende una fracción fluida del material filtrado de cultivo de Erysipelothrix rhusiopathiae.

Sato y colaboradores (1995) Veterinary Microbiology 37, 381-387 mencionan una composición de vacuna para proteger a cerdos, que comprende la fracción fluida del medio de cultivo de Erysipelothrix rhusiopathiae, adsorbida a alumbre, y bacterias formalinadas.

Aunque es muy deseable una vacuna eficaz para evitar la erisipela en cerdos, ninguna de las muchas vacunas tradicionales contra la erisipela proporciona una protección aceptable para cerdos destetados. El problema es la falta de duración de la inmunidad. La industria porcina requiere una vacuna que, administrada durante la lactancia, proteja a los cerdos contra esta enfermedad letal y devastadora hasta la edad oportuna para el sacrificio, es decir aproximadamente los 6 meses. La USDA ha especificado este requisito como una norma para otorgar licencias a nuevas vacunas.

Sumario del invento

Se proporciona por lo tanto una composición de antígeno, que comprende una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae y un agente estabilizador, en la que dicho cultivo de E. rhusiopathiae es desactivado con formalina o con beta-propiolactona y un agente estabilizador, cuyo agente estabilizador es un hidróxido de un metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio o un alumbre, en que dicha composición de antígeno está exenta de E. rhusiopathiae.

Se proporciona por lo tanto una composición de vacuna, que comprende: una composición de antígeno que comprende a su vez una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae y un agente estabilizador, en la que dicho cultivo de E. rhusiopathiae está desactivado; y una composición de adyuvante.

Se proporciona por lo tanto un método de producir una composición de antígeno, que comprende añadir un agente estabilizador a una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae, en la que dicho cultivo de E. rhusiopathiae está desactivado.

Se proporciona por lo tanto el uso de una composición de antígeno, que comprende una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae y un agente estabilizador, en la que dicho cultivo de E. rhusiopathiae está desactivado, para la preparación una vacuna destinada a proteger a un animal contra la erisipela, en que dicho animal es preferiblemente un mamífero o un pájaro, y de modo sumamente preferido un cerdo, un cordero, un perro, un caballo, una vaca o un ser humano.

Descripción detallada del invento

Cualquier cepa de E. rhusiopathiae puede ser la fuente de antígenos para el invento, por ejemplo las cepas descritas en la Patente de los EE.UU. Nº 5.625.038. El cultivo a partir del que se pueden aislar los antígenos puede ser proporcionado de una diversidad de maneras. Por ejemplo, el cultivo puede ser puro o sustancialmente puro. Más preferiblemente, los antígenos para el invento se obtienen a partir de un material sobrenadante o filtrado de un cultivo de E. rhusiopathiae. En una realización sumamente preferida, los antígenos para el invento se obtienen a partir del material sobrenadante o filtrado de un cultivo líquido puro o sustancialmente puro de E. rhusiopathiae.

Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar de una diversidad de maneras, como es conocido en la tecnología. Véanse las Patentes de los EE.UU. N^{os} 5.625.038; 5.616.328; 5.417.971; 5.225.194; 4.981.685, que debaten la cultivación de bacterias. Por ejemplo, las E. rhusiopathiae se pueden cultivar tal como se ha descrito en los Ejemplos ilustrativos que se presentan más adelante. Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar también como se describe en las citas de Sawada y Takahashi, 1 987, Am. J. Vet. Res. 48:239-242 y de Groschup y colaboradores, 1991, Epidemiol. Infect. 107:637-649. Los antecedentes generales acerca de la cultivación y del tratamiento de células procarióticas se proporcionan en las citas bibliográficas de Maniatis y colaboradores, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y colaboradores, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Qreene publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.

En una realización preferida, el cultivo es desactivado añadiendo formalina (en una concentración final de aproximadamente 0,5% v/v). En otra realización preferida, los antígenos para el invento se obtienen a partir del material sobrenadante o filtrado de un cultivo de E. rhusiopathiae. Un material sobrenadante o filtrado de cultivo, en una realización preferida, es concentrado aproximadamente en 3 a 10 veces (preferiblemente 10 veces) y se añade un gel de hidróxido de aluminio (preferiblemente REHYDRAGEL®) al material sobrenadante o filtrado concentrado en una concentración final de aproximadamente 30% v/v para estabilizar al antígeno. En otra realización preferida, se formula una composición de vacuna que comprende el antígeno y un adyuvante, constituyendo el adyuvante, por ejemplo, aproximadamente 25% v/v de la composición de vacuna. En otra realización preferida, se añaden a los antígenos timerosal (en una concentración final de aproximadamente 0,01% v/v) junto con EDTA (en una concentración final de aproximadamente 0,07% v/v) como conservantes. Un adyuvante preferido, aquí citado como "Adyuvante Nº 1" comprende aproximadamente 2% v/v de lecitina, aproximadamente 18% v/v de un aceite mineral y aproximadamente 8% v/v de un agente tensioactivo (p.ej. alrededor de 5,6% v/v de Tween 80 y alrededor de 2,4% v/v de Span 80), siendo el volumen remanente de una solución salina (p.ej. PBS de Dulbecco). Este adyuvante se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 6572861, presentada el 24 de Enero de 2000, intitulada "Adyuvantes para Uso en Vacunas".

Desactivación de E. rhusiopathiae

Los antígenos para el invento se obtienen a partir de E. rhusiopathiae que se pueden proporcionar de maneras conocidas en la tecnología, por ejemplo en un cultivo líquido. En una realización preferida del invento, un cultivo de E. rhusiopathiae a partir del cual se aisla un antígeno es desactivado antes de usar el antígeno en una formulación de vacuna. En una realización sumamente preferida, el cultivo de E. rhusiopathiae es desactivado antes de separar la fracción líquida con respecto de las bacterias. La desactivación del cultivo de E. rhusiopathiae se lleva a cabo para una diversidad de finalidades, por ejemplo para matar o aniquilar las bacterias o para desactivar las proteasas, o con el fin de preservar y conservar el antígeno.

Un cultivo que contiene los antígenos para el invento puede ser desactivado de una diversidad de maneras conocidas en la tecnología. Por ejemplo, el cultivo se puede exponer a un agente desactivador, es decir a un agente que es capaz de aniquilar a las E. rhusiopathiae. Un agente desactivador útil en la práctica del invento permite que el antígeno para el invento provoque una respuesta inmunitaria en un animal para proteger a dicho animal con respecto de la erisipela. Se pueden utilizar agentes desactivadores conocidos en la tecnología, por ejemplo formalina (formaldehído), beta-propiolactona u otros agentes químicos que tienen propiedades similares a las de estos agentes. Los agentes químicos apropiados para la desactivación de bacterias se pueden determinar por una persona que tenga experiencia ordinaria en la tecnología, por ejemplo poniendo en contacto las bacterias con un producto químico particular, y determinando si las bacterias han sido aniquiladas y los antígenos obtenidos con ello están todavía activos en su capacidad para producir un anticuerpo protector por ejemplo, vacunando ratones con las bacterias tratadas. También, véase la Patente de los EE.UU. Nº 5.225.1 94, que debate la desactivación de bacterias.

Separación y concentración de un fluido de cultivo de E. rhusiopathiae

Los antígenos para el invento se obtienen a partir de la fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae. Las E. rhusiopathiae se pueden cultivar y las bacterias se pueden separar con respecto del caldo de cultivo, por ejemplo centrifugando o filtrando un cultivo líquido. Un cultivo de E. rhusiopathiae útil para el aislamiento de un antígeno para el invento se puede proporcionar de cualquier manera conocida en la tecnología. Por ejemplo, las E. rhusiopathiae se pueden hacer crecer en un caldo o medio de manera tal que las bacterias se multipliquen rápidamente, es decir, en fase logarítmica. En una realización preferida, el cultivo utilizado para preparar un antígeno para el invento está en fase logarítmica, más preferiblemente en fase logarítmica tardía, en el momento en el que se inicia el tratamiento del cultivo.

En una realización preferida, un cultivo de E. rhusiopathiae es tratado para separar la totalidad o sustancialmente la totalidad de las bacterias con respecto del caldo o medio en el que éstas estaban creciendo. Por ejemplo, aproximadamente 90% de las bacterias se pueden retirar desde el caldo o medio, más preferiblemente se retiran aproximadamente 95% de las bacterias, lo más preferiblemente se retiran aproximadamente 98% de las bacterias. Las E. rhusiopathiae se pueden separar con respecto del caldo o medio de cultivo de cualquier manera conocida en la tecnología. Por ejemplo, un cultivo de E. rhusiopathiae se puede centrifugar a fin de separar las bacterias con respecto del caldo o medio. Cualquier centrífuga conocida en la tecnología, que sea capaz de sedimentar las bacterias E. rhusiopathiae es apropiada para separar las células con respecto del caldo o medio. Por ejemplo, se puede utilizar una centrífuga de circulación continua. Los antecedentes acerca de cómo retirar bacterias desde un medio de cultivo se proporcionan en la obra de Maniatis y colaboradores, 1982, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel y colaboradores, 1 989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley Interscience, NY; Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.

En otro aspecto, las E. rhusiopathiae se pueden retirar desde el medio o caldo de cultivo por filtración a través de un filtro que retiene a las bacterias pero no retiene al antígeno para el invento. Se conocen en la tecnología muchos filtros que son apropiados para separar las bacterias con respecto del antígeno en el caldo o medio. Por ejemplo, un filtro útil para separar las bacterias con respecto de la fracción fluida tiene un diámetro medio de poros de aproximadamente 0,1 micrómetros a aproximadamente 0,5 micrómetros, más preferiblemente alrededor de 0,2 micrómetros.

La fracción fluida obtenida a partir de un cultivo de E. Rhusiopathiae ("fracción fluida") como se describe anteriormente, puede ser concentrada. En una realización, la fracción fluida puede ser concentrada a 3 veces hasta 30 veces, por ejemplo a aproximadamente 3 veces, o a aproximadamente 6 veces, o a aproximadamente 10 veces, o a aproximadamente 15 veces, o a aproximadamente 20 veces, o a aproximadamente 30 veces. La fracción fluida puede ser concentrada de cualquier manera conocida en la tecnología. En una realización preferida, la fracción fluida puede ser concentrada utilizando una filtración con fibras huecas. En un aspecto, la filtración con fibras huecas se lleva a cabo con un corte de peso molecular de aproximadamente 5.000 kilodalton a aproximadamente 50.000 kilodalton, más preferiblemente de alrededor de 10.000 kilodalton a alrededor de 30.000 kilodalton. Véase también la Patente de los EE.UU. Nº 5.225.1 94, que debate la concentración de una fracción fluida de un cultivo bacteriano.

La fracción fluida puede también ser concentrada mediante secado por congelación o liofilización. En otro aspecto, la fracción fluida puede ser concentrada por precipitación de las proteínas y de los polipéptidos en la fracción fluida, seguida por resuspensión del material precipitado. Las proteínas se pueden precipitar desde la fracción fluida utilizando cualquier método conocido en la tecnología, por ejemplo mediante una precipitación por polietilenglicol, etanol o sulfato de amonio. Después de la precipitación, el sedimento puede ser vuelto a suspender en cualquier solución que sea apropiada para la preparación de una formulación de vacuna, por ejemplo en una solución salina.

Estabilización de un antígeno de E. rhusiopathiae

Los antígenos obtenidos a partir de una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae son inmunógenos eficaces para evitar o reprimir la erisipela en un animal. Por ejemplo, la carencia de estabilidad de esos antígenos a continuación de la retirada de las bacterias constituye un grave problema cuando se utilizan estos antígenos en una composición de vacuna. El invento resuelve el problema y está basado, en parte, en el descubrimiento de que los antígenos existentes en una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae se pueden estabilizar añadiendo un agente estabilizador.

Se puede utilizar cualquier agente estabilizador conocido en la tecnología para estabilizar a los antígenos para el invento. En una realización preferida, un agente estabilizador es capaz de adsorber a un antígeno desde una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae. Un apropiado agente estabilizador puede mantener el potencial antigénico de una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae o puede decelerar de otra manera la degradación de su potencial antigénico después de haberse retirado las bacterias. Tal efecto estabilizador de un agente se puede determinar con experimentación. Por ejemplo, se pueden incubar dos muestras de una fracción fluida de un cultivo de E. rhusiopathiae desactivado a 37ºC durante un cierto período de tiempo, por ejemplo de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 días, ensayándose una muestra con un agente químico y otra sin ningún agente químico para su uso como un agente estabilizador. Las muestras se ensayan luego en una vacunación de ratones de acuerdo con el ensayo normalizado de potencia de ratones (9 CFR 113.119(c)) utilizando un adyuvante, por ejemplo el Adyuvante Nº 1. Una proporción de animales protegidos en el grupo al que se ha administrado la vacuna tratada con el agente químico, mayor que en el grupo al que se ha administrado la vacuna sin tratar o que en los animales testigos sin vacunar, indica que ha sido estabilizado el antígeno en la vacuna tratada químicamente.

El experimento antes descrito ilustra un ensayo de estabilidad acelerada a una temperatura (37ºC) más alta que la que se utiliza normalmente para el almacenamiento. Normalmente, las preparaciones de antígenos se almacenan a temperaturas frías, por ejemplo de aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC. Una estabilidad durante 28 días a 37ºC indica una estabilidad por un período de tiempo más largo en almacenamiento en frío normal, es decir por un período de tiempo de varios años. En una realización, el antígeno es estabilizado a temperaturas frías durante hasta aproximadamente 5 años de acuerdo con el presente invento, más específicamente durante hasta aproximadamente 3 años a temperaturas frías. En otra realización, el antígeno es estabilizado durante al menos un año a temperaturas frías de acuerdo con el presente invento.

Se conocen en la tecnología una diversidad de agentes que son capaces de adsorber a un antígeno, por ejemplo son útiles como agentes estabilizadores un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio y un alumbre (p.ej. un alumbre de potasa). En una realización preferida, se utiliza un gel de hidróxido de aluminio, por ejemplo, REHYDRAGEL® como agente estabilizador. (Véanse las Patentes de los EE.UU. N^{os} 5.61 6.328 y 5.232.690, que debaten geles metálicos y sus usos).

En una realización, un gel de hidróxido de un metal, por ejemplo un gel de hidróxido de aluminio (p.ej.
REHYDRAQEL®) es añadido hasta una concentración final de desde aproximadamente 10% v/v hasta aproximadamente 40% v/v, por ejemplo de aproximadamente 10% de v/v, o de aproximadamente 20% v/v, o de aproximadamente 30% v/v, o de aproximadamente 40% v/v en la preparación de antígeno. En una realización preferida, el gel de hidróxido de aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®) es añadido hasta una concentración final de aproximadamente 30% v/v en la preparación de antígeno.

Una preparación de antígeno, que contiene el agente estabilizador, se puede utilizar para formular una composición de vacuna, por ejemplo añadiendo un adyuvante y un diluyente tal como una solución salina, de manera tal que se diluyan la preparación de antígeno y el agente estabilizador. Dicha dilución puede ser útil para evitar, o evitar sustancialmente, efectos colaterales indeseados de la formulación de vacuna en el animal. Por ejemplo, una formulación de antígeno que contiene un gel de un hidróxido de metal, por ejemplo un gel de hidróxido de aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®), es diluida después de la adición a una formulación de vacuna en aproximadamente 5 veces, o en aproximadamente 10 veces, o en aproximada-mente 15 veces, o en aproximadamente 20 veces, o en aproximadamente 25 veces, o en aproximadamente 30 veces. En una realización preferida, una formulación de antígeno que contiene un gel de hidróxido de aluminio (p.ej. REHYDRAGEL®) en una concentración final de aproximadamente 30% v/v, es diluida mediante adición a la formulación de vacuna en aproximadamente 20 veces, dando una concentración final del gel de hidróxido de aluminio de aproximadamente 1,5%.

Composiciones de vacunas que comprenden antígenos de E. rhusiopathiae

Una composición de antígeno del invento se puede utilizar en una composición de vacuna para inmunizar a un animal. En una realización, la composición de vacuna contiene una composición de antígeno del invento y un adyuvante. En una realización preferida, un adyuvante útil para una composición de vacuna del invento comprende una lecitina, un aceite y un agente tensioactivo. Una composición de vacuna formulada con un adyuvante preferido contiene una lecitina en una concentración de 0,25% a 12,5% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 0,5% hasta alrededor de 5% y lo más preferiblemente desde alrededor de 0,5% hasta alrededor de 1,25% v/v, un aceite en una concentración de 1% a 23% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 3,5% hasta alrededor de 10% y lo más preferiblemente de alrededor de 4,5%, y un agente tensioactivo anfífilo en una proporción de 1,5% a 8% v/v, más preferiblemente desde alrededor de 1,5% hasta alrededor de 4% y lo más preferiblemente de alrededor de 2% v/v. Preferiblemente, el adyuvante tiene 2 agentes tensioactivos anfífilos, por ejemplo agentes tensioactivos Tween y Span, de los cuales uno está predominantemente en la fase acuosa (p.ej., el Tween 80) de la composición de vacuna y el otro está en la fase oleosa (p.ej., Span 80). Preferiblemente, cuando se utilizan como agentes tensioactivos Tween 80 y Span 80, la concentración de Tween 80 es desde aproximadamente 1½ hasta aproximadamente 3 veces más alta que la concentración de Span 80, preferiblemente alrededor de 2 veces. Un adyuvante preferido contiene una solución acuosa de un vehículo, por ejemplo una solución salina tamponada con fosfato (PBS, de Phosphate Buffered Saline) (p.ej. PBS de Dulbecco). Una lecitina y un aceite apropiados para un adyuvante para las composiciones de vacunas son una mezcla de lecitina en el aceite mineral DRAKEOL® 5 Lt Mineral Oil. La lecitina se puede obtener de Central Soya, Fort Wayne, Indiana. Véase también la Patente de los EE.UU. Nº 5.084.269, que debate composiciones de adyuvantes. Los agentes tensioactivos Tween y Span se pueden obtener de Van Waters and Rogers, Omaha, Nebraska.

En otra realización, adyuvantes conocidos en la tecnología, por ejemplo, emulsiones en aceites, hidróxido de aluminio, dipéptidos muramílicos, hidróxido de zinc y calcio, avridina, hidróxido de aluminio, aceites y saponinas se pueden utilizar en una formulación de vacuna del invento, como se ha descrito en las Patentes de los EE.UU. N^{os} 5.846.527; 5.41 7.971; 5.232.690, que debaten adyuvantes.

Se formula una composición de vacuna preferida, en la que desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 50% de su volumen es una composición de adyuvante, más preferiblemente desde alrededor de 15% hasta alrededor de 35%, más preferiblemente desde alrededor de 20% hasta 30% y lo más preferiblemente de alrededor de 25%.

Una formulación de vacuna se puede administrar a un individuo por sí sola o en la forma de una composición farmacéutica o terapéutica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los antígenos se pueden producir por medio de procesos convencionales de mezclamiento, disolución, granulación, producción de grageas, levigación, emulsionamiento, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de una manera convencional utilizando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o agentes auxiliares fisiológicamente aceptables, que facilitan el tratamiento de los antígenos para el invento y su transformación en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la vía de administración que se escoja.

Las formulaciones sistémicas incluyen las destinadas a su administración por inyección, p.ej. por inyección subcutánea, intradérmica, intramuscular o intraperitoneal.

Para su inyección, los antígenos se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como una solución de Hanks, una solución de Ringer, una solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otra solución salina fisiológica. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes suspendedores, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, las proteínas pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo apropiado, p.ej. agua estéril exenta de pirógenos, antes del uso.

Además de las formulaciones que se han descrito con anterioridad, los antígenos se pueden formular también como una preparación de liberación retardada (de depósito). Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por. implantación (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los antígenos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos apropiados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas intercambiadoras de iones, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo como una sal escasamente soluble.

Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de suministro de agentes farmacéuticos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro que se pueden utilizar para suministrar un antígeno. Se pueden emplear también ciertos disolventes orgánicos tales como dimetil-sulfóxido, aunque usualmente a costa de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los antígenos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación prolongada, tales como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico o de vacunación. Se han consagrado diversos materiales de liberación prolongada y son bien conocidos por los expertos en la tecnología. Las cápsulas de liberación prolongada, dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los antígenos durante un período desde unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del agente, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de los antígenos.

La determinación de una cantidad eficaz del antígeno para su administración está bien dentro de las aptitudes de los expertos en la tecnología, especialmente a la vista de la descripción detallada que aquí se proporciona.

Una dosis eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de análisis in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos con animales para conseguir una inducción de una respuesta inmunitaria utilizando técnicas que son bien conocidas en la tecnología. Una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica podría optimizar con facilidad la administración a todas las especies de animales basándose en los resultados que aquí se describen. La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente. Por ejemplo, cuando se utilizan como una vacuna, los antígenos para el invento se pueden administrar en aproximadamente 1 a aproximadamente 3 dosis durante un período de tiempo de 2-36 semanas. Se pueden administrar periódicamente después de ello revacunaciones. Protocolos alternativos pueden ser apropiados para animales individuales. Una dosis apropiada es una cantidad de antígeno que, cuando se administra como antes se describe, es capaz de incitar una respuesta inmunitaria en un animal inmunizado suficiente para proteger al animal con respecto de una infección por E. rhusiopathiae durante al menos 4 hasta 12 meses.

La cantidad de antígeno en una dosis es especificada en términos de la densidad óptica (E_{625}) del cultivo en desactivación, como unidades de opacidad. Si están en desactivación, la densidad óptica es de 4,0, p.ej. un mililitro de material sobrenadante o filtrado de cultivo, preparado a partir del cultivo, contendrá cuatro unidades de opacidad, 0,5 ml contendrán 2 unidades de opacidad, etc., incluso aunque se haya eliminado la fuente de opacidad, es decir las células bacterianas. Si un fluido sobrenadante que contiene, p.ej., 5 unidades de opacidad por ml es concentrada a 12 veces, por filtración molecular, el fluido concentrado tendrá un valor de 60 unidades de opacidad por ml. En general, la cantidad de antígeno en una dosis de vacuna puede fluctuar entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 unidades de opacidad, preferiblemente entre alrededor de 2 y alrededor de 4 unidades de opacidad. El apropiado volumen de una dosis variará con la vía de inyección y el tamaño del hospedante, típicamente desde 0,1 a alrededor de 5 ml. Preferiblemente, cuando el hospedante es un cerdo, el cerdo tiene una edad de al menos dos semanas.

Ejemplos

El estudio de vacunación presentado seguidamente ha demostrado que una vacuna como aquí se describe con el Adyuvante Nº 1, cuando se administra a cochinillos en un régimen de 2 dosis a aproximadamente las 3 y 6 semanas de edad, proporcionaba una protección significativa contra un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación. El antígeno con el Adyuvante Nº 1 inducía también sustanciales respuestas a anticuerpos, como se muestra mediante los títulos según ELISA en sueros a las dos semanas después de la vacunación, pero, en el momento del estímulo, estos títulos habían menguado y los títulos individuales no se correlacionan estrechamente con una protección. El mismo antígeno en un adyuvante de saponina y administrado por la misma vía inducía menores títulos según ELISA y demostraba ser inadecuado para proteger a cerdos con respecto de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación.

El modelo de estímulo funcionaba muy bien puesto que la totalidad de los 10 cerdos testigos desarrollaron signos clínicos de erisipela después de un estímulo (Tabla 2). Tres cerdos cumplieron el criterio de temperatura elevada y otros cinco eran positivos para un cultivo de E. rhusiopathiae. Los restantes dos cerdos testigos no cumplieron ninguno de los anteriores criterios; sin embargo, estuvieron deprimidos durante varios días y tenían lesiones metastásicas en la piel, características de la enfermedad, y por lo tanto fueron sacrificados eutanásicamente. En contraste, en el grupo vacunado con la vacuna que contenía el Adyuvante Nº 1, 15 de los 20 cerdos fueron protegidos por completo
(Tabla 3).

Una vacuna experimental que contenía un antígeno de E. rhusiopathiae del invento con el Adyuvante Nº 1, cuando se administró a cochinillos en un régimen de 2 dosis a aproximadamente las 3 y 6 semanas de edad, proporcionó una significativa protección contra el desarrollo de erisipela clínica procedente de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación, véase la Tabla 3, infra. Además, una vacuna experimental similar con un adyuvante de saponina, cuando se administra a cochinillos de acuerdo con el mismo régimen, no protege frente al desarrollo de erisipela clínica procedente de un estímulo virulento a las 20 semanas después de una segunda vacunación. Finalmente, una vacunación que contiene un antígeno para el invento, independientemente del adyuvante utilizado, inducía una sustancial respuesta serológica que presentaba un pico (valor máximo) a las dos semanas después de la segunda vacunación.

Ejemplo 1

Cultivo de E. rhusiopathiae

La cepa de E. rhusiopathiae, CN 3342, se cultiva en un medio que contiene Peptona Difco Proteose en una concentración de 2,75%, Extracto de Levadura Difco (0,55%), Tween 80 (0,2%), K_{2}HPO_{4} (0,217%) y KH_{2}PO_{4} (0,061%) en agua desionizada. El pH del medio se ajusta a 7,2 con NaOH 5 N. El medio se esteriliza con valor de agua a un mínimo de 122ºC durante 30 a 90 minutos. Después de tratar en autoclave, se añade una solución de dextrosa al 50% estéril hasta una concentración final de 3% p/v (peso/volumen).

Se preparan cultivos de siembra en trabajo retirando un criotubo del lote de siembra madre procedente de un almacenamiento congelado (a menos 70ºC), descongelándolo rápidamente, y transfiriendo asépticamente su contenido a un matraz de medio. El matraz se incuba a 37ºC durante 12 a 36 horas, con agitación, y se comprueba en cuanto a pureza mediante tinción Gram. Cuando se encontró que era puro, el cultivo se mezcló con glicerol estéril (al 10%), se distribuyó dentro de criotubos en cantidades de 1 ml, y se almacenó en estado congelado.

Recipientes de siembra que contienen medio de producción se inoculan con 0,01 a 2% de material de siembra madre o en trabajo. Fermentadores de siembra, cuando se usan, que contienen de 10 a 100 litros del medio de producción, se inoculan con 1 a 5% de un cultivo procedente de un matraz de siembra. Un termentador de producción que contiene de 200 a 10.000 litros del medio de producción, se inocula con 0,5 a 5% de un cultivo procedente del termentador de siembra.

Los cultivos de producción se incuban a un punto de ajuste de 37 + 2ºC con agitación. Los tiempos de incubación varían desde 4 hasta 24 horas. Una solución estéril 10 N de hidróxido de sodio se añade al cultivo a lo largo del período de tiempo de incubación para mantener un pH de 7,2 \pm 0,1. Durante la fase de crecimiento, se efectúan adiciones periódicas de dextrosa.

Antes de cosechar, el cultivo se examina en microscopio en cuanto a pureza, morfología de las células y reacción a Gram. El crecimiento se vigila midiendo la densidad óptica del cultivo a 625 nm. Los cultivos se cosechan cuando tienen una densidad óptica de 4,0 o mayor a 625 nm.

Ejemplo 2

Preparación de una vacuna de E. rhusiopathiae

Una solución de formalina se añadió a cultivos hasta una concentración final de 0,5% (v/v) para desactivar el cultivo. El cultivo se transfirió a un depósito estéril y se colocó en una incubadora a 37 \pm 2ºC durante un mínimo de 24 horas (y un máximo de 60 horas) con agitación constante. Los cultivos que no fueron tratados inmediatamente se almacenaron a 2 hasta 8ºC durante hasta 7 días. El cultivo desactivado se clarificó por paso a través de una centrífuga de circulación continua. La fracción fluida se retuvo para tratamiento adicional, y las bacterias se desecharon.

En un experimento, se produjeron concentrados a 10x (10 veces) en un material filtrado de cultivos de E. rhusiopathiae desactivados o bien con beta-propiolactona ("BPL"), a una concentración final de 0,1% v/v, o formalina, a una concentración final de 0,2% v/v (a 37ºC durante al menos 24 horas). Un análisis de inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA de enzyme linked immunosorbent assay) específico para la proteína de 64 a 66 kDa encontrada en un material filtrado de cultivo de E. rhusiopathiae (Groschup y colaboradores, 1991, Epidemiol. Infect. 107:637-649 y Patente de los EE.UU. Nº 5.625.038) se llevó a cabo para determinar el efecto de desactivación y estabilización en la presencia de la proteína de 64 a 66 kDa. De modo coherente con hallazgos anteriores, de que la desactivación con formalina del cultivo disminuía el valor según el análisis ELISA de la proteína, el concentrado con BPL tenía un valor según análisis aproximadamente de 4 veces el del concentrado de formalina. Después de incubación a 37ºC, durante 14 días, el concentrado con BPL había perdido aproximadamente un 80% de su valor, comparado con aproximadamente un 40% para el concentrado con formalina. En ambos casos, sin embargo, la previa adición de REHYDRAGEL®, al 30% v/v, como agente estabilizador, véase seguidamente, impidió la mayor parte de la pérdida y virtualmente la totalidad de ésta en el caso de la preparación con formalina. Un pequeño estudio en cerdos indicó que la fracción fluida de cultivos desactivados con formalina era más eficaz que la de cultivos desactivados con BPL para proteger a cerdos frente al estímulo con E. rhusiopathiae virulentas.

Los fluidos se concentraron, a 6x hasta 20x (usualmente a alrededor de 10x) mediante filtración con fibras huecas (corte nominal de pesos moleculares x 10.000 kilodalton) después de una centrifugación. Los fluidos se estabilizaron después de la operación de concentración mediante la adición de un gel de hidróxido de aluminio.

Con el fin de estabilizar al inmunógeno, un gel de hidróxido de aluminio se añadió lentamente con agitación a los fluidos concentrados hasta un valor final de 30% (v/v) (30 volúmenes de gel por 70 volúmenes de concentrado). Después de una dilución a 20 veces del concentrado, el contenido del gel de Al en la vacuna era sólo de aproximadamente 1,5%, no suficiente para causar reacciones negativas en el sitio de la inyección. Una valoración para determinar la cantidad del gel de Al que se requería para adsorber la totalidad de la proteína protectora en una fracción fluida de cultivo de E. rhusiopathiae concentrada en 10 veces, puso de manifiesto que más de un 95% había sido adsorbido por REHYDRAGEL® al 32% v/v (Reheis, Berkeley Heights, Nueva Jersey). Se añadió timerosal (es decir, MERTHIOLATE®) (Dimportex, España, importado por Flavine Inc., Klosters, Nueva Jersey) como conservante al producto en una concentración final de aproximadamente 0,01% (p/v). La concentración de timerosal se mantuvo en aproximadamente 0,01% p/v en la composición de antígeno y en una composición de vacuna que contenía el antígeno para el invento. Se añadió EDTA hasta una concentración final de aproximadamente 0,07% (p/v) (Sigma, St. Louis, Missouri).

El adyuvante utilizado fue el Adyuvante Nº 1. Se prepararon 1.000 mi del Adyuvante Nº 1 a partir de 200 mi de una solución de lecitina en aceite, esterilizada en filtro (lecitina al 10% en el aceite mineral DRAKEOL®), Tween 80 (56 mi) y Span 80 (24 mi) tratados en autoclave y solución salina tamponada con fosfato (PBS de Dulbecco) (720 mi). La solución de lecitina en aceite y el Span 80 se combinaron y mezclaron dentro de un depósito estéril durante al menos 1 hora a la temperatura ambiente, hasta que estuviera completa la emulsificación. La solución salina y el Tween 80 se combinaron y mezclaron dentro de un depósito estéril durante al menos 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla de aceite se emulsionó con la mezcla acuosa utilizando un emulsificador de Ross. El emulsionamiento se continuó por recirculación hasta que se hubiera añadido la totalidad del adyuvante a la solución salina. Luego la emulsión se hizo pasar dos veces a través de una prensa Gaulin a la temperatura ambiente. El adyuvante se almacenó a 2 hasta 8ºC.

5 l de la vacuna se prepararon añadiendo 1 l del adyuvante a 3 l de la fase acuosa. La fase acuosa se componía de suficiente cantidad de concentrado, estabilizado para dar un contenido final de antígeno de 3,2 unidades de opacidad por dosis de 2 ml de vacuna, más una suficiente cantidad de solución salina para completar el volumen a 5 l. Las unidades de opacidad se definen como la densidad óptica (E_{625}) al cosechar multiplicada por el factor de concentración.

Ejemplo 3

Vacunación contra E. rhusiopathiae y estimulación de cerdos

El octavo subcultivo (MS+8) de E. rhusiopathiae, cepa CN3342, se utilizó para producir las vacunas. Se utilizó un nivel de dosis de antígeno de E. rhusiopathiae clarificado y estabilizado (3,2 unidades de opacidad ["UO"]), tal como se calculó a partir de la densidad óptica (DO) del cultivo en desactivación. Una UO era equivalente a 1 mi de fluido con una DO (determinada a 625 nm) de uno. Se utilizó como adyuvante el Adyuvante Nº 1 o saponina (al 0,05% p/v, obtenida a partir de Berghausen Chemical Company, Cincinnati, Ohio). Específicamente, un cultivo de E. rhusiopathiae, cepa CN3342, se hizo crecer hasta una DO de 5,28. El cultivo se desactivó durante 24 horas con formalina al 0,5%. Después de la desactivación, las bacterias se retiraron por centrifugación. Luego la fracción fluida se concentró utilizando una unidad de ultrafiltración con un corte nominal de pesos moleculares de 10.000 kDa. La fracción fluida se concentró a aproximadamente 13,4 veces. El antígeno se estabilizó añadiendo REHYDRAGEL® (al 30% v/v) al material concentrado. El concentrado adsorbido se almacenó a 4ºC hasta que se realizase la formulación de la vacuna. Las vacunas se formularon con el Adyuvante Nº 1 o con saponina al 0,05% como adyuvante. El antígeno estabilizado se diluyó en solución salina (cloruro de sodio 150 mM y fosfato 4 mM) hasta llegar a la concentración final. Se añadieron etilendiamina-tetraacetato (EDTA, 0,07%) y timerosal (0,01%) a las formulaciones finales de vacunas. Una solución salina tamponada con fosfato se utilizó como placebo. La Tabla 1 recopila los grupos en tratamiento, los tratamientos con vacunas y los números de cochinillos vacunados y estimulados.

TABLA 1 Cochinillos vacunados y estimulados por cada grupo en tratamiento (con vacuna)

1

Una estimulación satisfactoria se evidenció en animales testigos por una alta temperatura corporal (40,9ºC [105,6ºF] o mayor en por lo menos dos días consecutivos), por cultivo a la autopsia, y/o por los signos clínicos característicos de una infección con E. rhusiopathiae. Los signos clínicos considerados característicos de la enfermedad incluían muerte súbita, depresión, hiperemia del abdomen y de los oídos, lesiones cutáneas metastásicas, y rigidez o complicación en articulaciones. Los cerdos que tenían signos clínicos pero no cumplían el criterio de temperatura se sacrificaron y la sangre, el bazo y el hígado se cultivaron en intentos de aislar las E. rhusiopathiae.

El ensayo exacto de Fisher se utilizó para determinar si había alguna diferencia en el porcentaje de animales protegidos con diferentes vacunas (P <0,05). Se construyeron contrastes a priori para comparar cada grupo de dosis con testigos y para comparar cada grupo con el promedio de todos los otros grupos de dosis. Las relaciones entre el tipo de vacuna administrada y las respuestas serológicas de cada grupo de cochinillos se comprobaron para los 2 meses de edad, los 3 meses de edad, los 4 meses de edad, los 5 meses de edad, y extracciones de sangre previas a la estimulación utilizando una regresión logística. La relación existente entre los títulos, inducidos por vacunas en el momento de una estimulación, con el estado de enfermedad (protegidos/no protegidos) se determinó utilizando una regresión logística. El nivel de significancia de 5% se utilizó para declarar la relación real.

Veinte cerdas o lechonas embarazadas, que tenían bajos títulos serológicos según ELISA (Nº 800) para E. rhusiopathiae se obtuvieron de Riddell Farms, Albert City, IA y se alojaron en habitaciones para aislamiento en el Departamento de Ciencias Veterinarias y Biológicas de la Universidad de Nebraska.

Los títulos serológicos según ELISA se determinaron en un ELISA de fijación directa de antígenos a células enteras, de la siguiente manera. Véase la Patente de los EE.UU. Nº 4.918.163, que describe la preparación de placas revestidas con antígenos y un ELISA que usa dichas placas. En primer lugar, se hicieron crecer las E. rhusiopathiae tal como se describe en el Ejemplo 1 y se cosecharon a partir de un cultivo en fase logarítmica. Se registró la densidad óptica a 640 nm y se convirtió en células/ml utilizando una tabla establecida mediante recuentos de bacterias a partir de soluciones con diferentes densidades ópticas. Las bacterias vivas fueron diluidas en PBS (PBS de Dulbecco, Sigma, St. Louis, Missouri) hasta una densidad de aproximadamente 1,1 x 10^{9} células/ml. Las bacterias vivas diluidas en PBS fueron fijadas a placas para el ELISA. Con el fin de preparar las placas, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de glutaraldehído al 0,1% v/v (Sigma, St. Louis, Missouri), los pocillos fueron cubiertos y las placas se incubaron a 37ºC durante 1 hora. El glutaraldehído en se retiró de cada pocillo y los pocillos se secaron con paños absorbentes. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de las bacterias vivas en PBS a una densidad de aproximadamente 1,1 x 10^{9} células/ml. Las placas se centrifugaron a 2.000 rpm durante 5 minutos a 22ºC. Se añadieron a cada pocillo luego 200 \mul de un poli(alcohol vinílico) (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) al 1% en PBS (PVA/ PBS) los pocillos se cubrieron y las placas se mantuvieron durante una noche a 4ºC. El contenido de los pocilios de las placas se transfirió a una solución de bactericida y los pocillos se lavaron con PBS. Los pocillos se cubrieron con gasa y se secaron a la temperatura ambiente (durante alrededor de 1 hora).

El proceso de ELISA se llevó a cabo de la siguiente manera usando las placas con antígeno fijado de células enteras de bacterias. En primer lugar, los sueros de cerdos se diluyeron, incluyendo un testigo positivo, en PVA/PBS al 1%. Todos los sueros desconocidos se diluyeron a 1:50 y el testigo positivo se utilizó a razón de 1:200. 200 \mul de cada muestra se añadieron a un pocillo en una columna de la fila A. Se añadieron a los pocillos remanentes 100 \mul de PVA/PBS al 1%. Se realizaron diluciones en serie a 2 veces con cada muestra en las filas B-H. Los pocillos se cubrieron e incubaron durante 1 hora a 37ºC. Luego, los pocillos se lavaron 3 veces con PBST. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una dilución a 1:2.000 de IgG de cabra anti-cerdo (H & L) de un conjugado con peroxidasa (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) preparada en PVA al 1% en PBS. Los pocillos se cubrieron de nuevo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Los pocillos se lavaron 3 veces con. PBST. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul del substrato ABTS (2,2'-azino-di-(ácido 3-etil-benzotiazolina-sulfónico) obtenido a partir de Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, Maryland) y las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Las placas se agitaron durante 10 segundos sobre un agitador de microplacas antes de leer la absorbancia de cada pocillo a 405-490 nm utilizando un lector de placas dejado como vacío. El título en el punto final de cada suero desconocido fue la dilución del suero en la que la absorbancia era mayor que la absorbancia de una dilución a 1:3.200 del testigo positivo.

Se extrajo sangre de las cerdas a los 0 hasta 10 días antes de parir, con el fin de determinar sus títulos de anticuerpos de E. rhusiopathiae. Los cochinillos fueron distribuidos aleatoriamente basándose en los títulos serológicos de las cerdas* y las fechas de los partos. Se extrajo sangre de cincuenta y ocho (58) cochinillos procedentes de estas cerdas o lechonas y éstos se vacunaron aproximadamente a las 3 semanas de edad con una de las dos vacunas experimentales de E. rhusiopathiae o con el placebo (grupos enumerados en la Tabla 1). Aproximadamente a las 4 semanas de edad, los cochinillos se destetaron. Aproximadamente a las 6 semanas de edad se extrajo sangre de los cochinillos y éstos se volvieron a vacunar con la misma vacuna. Aproximadamente a los 2 meses, 3 meses, 4 meses y 5 meses de edad se extrajo sangre de todos los cerdos. Aproximadamente a los 5½ de meses de edad, todos los cerdos sobrantes se retiraron del estudio. Aproximadamente a los 6 meses de edad (a las 20 semanas después de la segunda vacunación) se extrajo sangre de los cerdos y 40 cerdos fueron estimulados intramuscularmente con 2 ml de un cultivo virulento de E. rhusiopathiae (DL_{50} de 237 ratones, 1,74 x 10^ unidades formadoras de colonias/ml) que habían crecido a partir de un cultivo proporcionado por el National Veterinary Services Laboratory. Los animales se vigilaron en cuanto a signos de enfermedad clínica y por la temperatura rectal durante 2 días antes de la estimulación, en el día de la estimulación y a los 7 días a continuación de la estimulación. Cualquier animal testigo que cumpliese el criterio de una temperatura rectal elevada (40,9ºC) se sacó del estudio y se trató con penicilina inyectable. Cualquier animal testigo que tuviera signos clínicos de enfermedad, pero que no cumpliese el criterio de elevada temperatura rectal, se sacrificó eutanásicamente, se le hizo la autopsia y se cultivaron muestras de sangre entera, bazo e hígado en cuanto a E. rhusiopathiae. Cualquier animal testigo que muriese fue sometido a autopsia y muestras de bazo e hígado se cultivaron en cuanto a E. rhusiopathiae. Cualquier animal vacunado que cumpliese el criterio de elevada temperatura rectal (a 40,9ºC) y/o signos clínicos de enfermedad, se sacó del estudio y se trató con penicilina inyectable. Cualquier animal vacunado que muriese después de la estimulación fue sometido a autopsia y las muestras de bazo e hígado se cultivaron en cuanto a E. rhusiopathiae. Los títulos de anticuerpos para E. rhusiopathiae se determinaron por el ELISA antes descrito y se hizo una correlación de los títulos de anticuerpos con la protección clínica.

Se determinaron los títulos según ELISA en los sueros a partir de la única muestra de sangre obtenida de las cerdas y de todas las muestras de sangre procedentes de los 7 períodos de extracción de muestras a partir de los cochinillos. Se realizaron cultivos bacterianos aerobios (durante 48 horas, a 37ºC, agar con sangre) en muestras de sangre y/o en bazos e hígados obtenidos de cerdos que habían muerto o que fueron sacrificados por inyección letal.

Resultados: Los resultados de una estimulación con E. rhusiopathiae de cerdos testigos, se recopilan en la Tabla 2. Los 10 cerdos eran positivos en cuanto a erisipela.

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TABLA 2 Cerdos testigos (T01) estimulados con E. rhusiopathiae

2

Los resultados de la estimulación por E. rhusiopathiae de cerdos a los que se administró la vacuna con el Adyuvante Nº 1 (T02) se recopilan en la Tabla 3. 15 de los 20 cerdos (75%) estaban totalmente protegidos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Resultados de una estimulación por E. rhusiopathiae de cerdos a los que se administró vacuna con el adyuvante Nº 1 (T02)

3

Los resultados de la estimulación por E. rhusiopathiae de cerdos a los que se había administrado la vacuna con adyuvante de saponina (T03) se recopilan en la Tabla 4. Solamente fue protegido uno de los cerdos.

TABLA 4 Resultados de una estimulación por E. rhusiopathiae de cerdos a los que se administró vacuna con un adyuvante de saponina (T03)

4

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Los títulos medios geométricos ("GMT"s) según ELISA de grupos de cochinillos se enumeran en la Tabla 5.

TABLA 5 Títulos ELISA medios geométricos de todos los grupos en tratamiento

5

Los cochinillos tenían títulos muy bajos de anticuerpos, específicos para E. rhusiopathiae en el momento de su primera vacunación. Estos títulos fluctuaban entre menos de 50 y 200. En cochinillos testigos. Los GMT subieron ligeramente en el curso del estudio, indicando que el ELISA era menos específico en cerdos más viejos.

Las vacunas con el Adyuvante Nº 1 o con saponina como adyuvante indujeron una respuesta serológica significativa estadísticamente (P = 0,0001) que tenía un máximo (pico) a las dos semanas después de la segunda vacunación (aproximadamente a los 2 meses de edad). Los títulos en ambos grupos disminuyeron constantemente en el curso del tiempo (hasta aproximadamente los 5 meses de edad) siendo los GMT de cochinillos que recibieron antígeno en el Adyuvante Nº 1 observablemente mayores que los GMT de los cochinillos que recibieron antígeno en el adyuvante de saponina en todos los momentos. En el momento de la estimulación, los GMT de los cerdos que recibieron el antígeno en el Adyuvante Nº 1 eran ligeramente más de 2 veces mayores que los GMT de los testigos, mientras que los GMT de los cerdos que recibieron antígeno en un adyuvante de saponina eran ligeramente menos de 2 veces mayores que los de los testigos. La protección con respecto de una enfermedad clínica después de la estimulación no se correlaciona con el título según ELISA individual (P >0,05). No obstante, una observación interesante fue un título de pico observado a las dos semanas después de la segunda vacunación en cerdos a los que se administró antígeno en el Adyuvante Nº 1. De los 20 cochinillos vacunados con antígenos en el Adyuvante Nº 1, ocho tenían unos títulos de pico mayores que o iguales a 2.800 (8 de 8 estaban protegidos de la estimulación), ocho tenían unos títulos de pico de 6.400 (6 de 8 estaban protegidos de la estimulación), y 4 tenían unos títulos de pico de 3.200 (1 de 4 estaban protegidos de la estimulación) sugiriendo que un título que fuese de 6.400 o mayor era un indicador de una protección prolongada.

En resumen, todos los 10 testigos sin vacunar resultaron infectados. En el grupo de cerdos a los que se administró la vacuna con el Adyuvante Nº 1, fueron protegidos 15 de 20. En el grupo de cerdos a los que se administró la vacuna con saponina como adyuvante, se protegió sólo uno entre 10.

Ejemplo 4

Estabilización de antígenos con un gel de Al

Se preparó una vacuna de acuerdo con los Ejemplos 1-3, lo que incluía tratar el antígeno con un gel de Al tal como se ha descrito. La vacuna se ensayó en cuanto a eficacia en cerdos. Los cerdos fueron vacunados con dos dosis de 2 mi administradas por vía intramuscular (IM) una dosis a aproximadamente las 3 semanas (desde el destete) y la segunda dosis 3 semanas más tarde. Los testigos recibieron una solución salina tamponada con fosfato como un placebo. La inmunidad fue estimulada por la inyección IM de E. rhusiopathiae virulentas a una edad de aproximadamente 9 semanas. Como se muestra en la Tabla 6, la protección debida a la vacunación era de 100% a las 9 semanas. Esta vacuna ya tenía 12 meses de antigüedad en el momento en que los cerdos fueron vacunados. El resultado confirma que el antígeno protector había sido estabilizado satisfactoriamente.

TABLA 6 Protección de cerdos contra la erisipela

6

Nota:: El vigésimo cerdo fue excluido. Un animal muy díscolo, que forcejeaba tan violentamente cuando se le manipulaba, del que no se pudo determinar su temperatura en reposo. Después de la estimulación, este cerdo permaneció completamente sano.

Claims

1. Una composición de antígeno que comprende

i): una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae que está desactivado con formalina o con beta-propiolactona; y

ii): un agente estabilizador, cuyo agente estabilizador es un hidróxido de un metal, un fosfato de un metal, un gel de hidróxido de aluminio, un gel de fosfato de aluminio, un gel de fosfato de calcio, un gel de hidróxido de zinc e hidróxido de calcio, o un alumbre,

en la que dicha composición de antígeno está exenta de E. rhusiopathiae.

2. La composición de antígeno de la reivindicación 1, en la que dicha fracción fluida está concentrada a 3 veces hasta 30 veces.

3. La composición de vacuna que comprende la composición de antígeno de la reivindicación 1 y una composición de adyuvante.

4. La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la composición de adyuvante comprende de 0,25% a 12,5% v/v de una lecitina, de 1% a 23% v/v de un aceite y de 1,5% a 8% v/v un de agente tensioactivo anfífilo en dicha composición de vacuna.

5. Un método de producir una composición de antígeno, que comprende añadir un agente estabilizador a una fracción fluida procedente de un cultivo de E. rhusiopathiae, en la que dicho cultivo de E. rhusiopathiae está desactivado, y las bacterias se separan con respecto del caldo o medio, y la fracción fluida se retiene y las bacterias se desechan.

6. Uso de la composición de antígeno de la reivindicación 1 para la preparación de una composición de vacuna para proteger a un animal contra la erisipela.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6 en el que el animal es un cerdo.