ES2301236T3 - Xenoinjertos oseos. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar un xenoinjerto óseo para ser implantado en un humano, que comprende: a. extraer al menos una porción de un hueso de un animal no humano para proporcionar un xenoinjerto; b. lavar el xenoinjerto en agua y alcohol; c. someter al xenoinjerto a un tratamiento de alteración celular; y d. digerir el xenoinjerto con una glicosidasa para eliminar sustancialmente una multitud de primeras funciones de carbohidrato superficiales del xenoinjerto, en donde la glicosidasa tiene una concentración en el intervalo de 100 U/mL a 200 U/mL, y tras lo cual el xenoinjerto presenta sustancialmente las mismas propiedades mecánicas que una porción correspondiente de un hueso nativo, en donde el xenoinjerto no comprende un xenoinjerto de tejido blando sustancialmente no inmunogénico.

Description

Xenoinjertos óseos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo del transplante de huesos, y en particular, al transplante y reparación de hueso humano dañado o defectuoso usando un hueso sustancial e inmunológicamente compatible de un animal no humano.

Antecedentes de la invención

El hueso humano, un tejido conectivo duro que consiste en células embebidas en una matriz extracelular de sustancia molida mineralizada y fibras de colágeno, (Stedman's Medical Dictionary, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1995)), es el tejido más frecuentemente transplantado en humanos. J. M. Lane y col., Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America (2) 213 (1987). Sólo en los Estados Unidos cada año se realizan más de 100.000 procedimientos de injerto o de implante de hueso para reparar o para sustituir defectos óseos que resultan de traumas, infecciones, malformaciones congénitas o cáncer. Ver anterior.

Los injertos y los implantes de hueso a menudo están formados por hueso autólogo. Ver anterior. Sin embargo, a menudo no se dispone de tejido óseo autólogo transplantable para grandes defectos, particularmente en niños. Ver anterior. Adicionalmente, el transplante óseo autólogo puede dar como resultado morbosidad postoperatoria tal como dolor, hemorragia, problemas de heridas, minusvalía cosmética, infección o daño nervioso en la zona de donación. Ver anterior. Además, las dificultades a la hora de fabricar la forma funcional deseada a partir del tejido óseo autólogo transplantado pueden dar como resultado un llenado no óptimo del defecto óseo. Ver anterior.

Alternativamente, puede mantenerse gran parte de la estructura y muchas de las propiedades del tejido óseo original en los transplantes mediante el uso de materiales de heteroinjerto o xenoinjerto, es decir, tejido procedente de una especie diferente a la del receptor del injerto. En el área de los tejidos blandos, por ejemplo, los tendones o ligamentos de vacas u otros animales se cubren con una malla sintética y se transplantan en un anfitrión heterólogo en la Patente de EE.UU. Nº 4.400.833. Los tejidos planos, tales como el pericardio de cerdo, también son descritos como adecuados para el transplante heterólogo en la Patente de EE.UU. Nº 4.400.833. El peritoneo bovino fabricado en un biomaterial adecuado para válvulas cardiacas prostéticas, injertos vasculares, vendajes de quemaduras y otras heridas, se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.755.593. En el documento WO 84/03036 se describen xenoinjertos de vasos sanguíneos bovinos, ovinos o porcinos. Sin embargo, ninguno de dichos documentos describe el uso de un xenoinjerto para la sustitución de hueso.

Sin embargo, una vez implantado en un individuo, un xenoinjerto provoca reacciones inmunogénicas tales como el rechazo crónico e hiperagudo del xenoinjerto. En concreto, los xenoinjertos de hueso pueden resultar en un aumento de la tasa de fracturas, reabsorción y falta de unión como consecuencia de rechazo inmunológico.

El término "rechazo crónico", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una reacción inmunológica en un individuo frente a un xenoinjerto que se está implantando en el individuo. Habitualmente, el rechazo crónico está mediado por la interacción de anticuerpos IgG naturales del suero del individuo que recibe el xenoinjerto y por carbohidratos expresados en células, y/o por matrices celulares y/o extracelulares del xenoinjerto. Por ejemplo, el transplante de xenoinjertos de cartílagos de mamíferos no primates (por ejemplo, de origen porcino o bovino) a humanos se ve impedido principalmente por la interacción entre anticuerpo anti-Gal natural IgG presente en el suero humano con la estructura de carbohidrato Gal\alpha1-3Gal\beta1-4GcNAc-R (\alpha-galactosilo o epítopo \alpha-gal) expresada en el xenoinjerto. K. R. Stone y col., Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645 (1997); U. Galili y col., Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 646-651 (1997). En el rechazo
crónico, el sistema inmune responde habitualmente en una o dos semanas después de la implantación del xenoinjerto.

Al contrario que el "rechazo crónico", el "rechazo hiperagudo" tal como se usa en el presente documento se refiere a la reacción inmunológica en un individuo contra un xenoinjerto que está siendo implantado en dicho individuo, en donde el rechazo normalmente está mediado por la interacción de anticuerpos IgM naturales del suero del individuo que recibe el xenoinjerto y carbohidratos expresados en las células. Dicha interacción activa el sistema complementario causando la lisis del lecho vascular y la parada de flujo sanguíneo en el individuo receptor en un tiempo de entre unos minutos y dos o tres horas.

El término "matriz o matrices extracelulares", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una matriz ósea extracelular de sustancia molida mineralizada y fibras de colágeno. Stedman's Medical Dictionary, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1995).

Los materiales de xenoinjerto pueden tratarse químicamente para reducir la inmunogenicidad antes de la implantación en un receptor. Por ejemplo, se usa glutaraldehído para reticular o "curtir" tejido de xenoinjerto a fin de reducir su antigenicidad, tal como se describe en detalle en la Patente de EE.UU. Nº 4.755.593. Otros agentes, tales como los compuestos de diaminas alifáticas y aromáticas, pueden proporcionar un reticulado adicional a través de los grupos carboxilo de las cadenas laterales de los residuos de ácido aspártico y glutámico del polipéptido colágeno. El curtido con glutaraldehído y diamina también aumenta la estabilidad del tejido del xenoinjerto.

Los tejidos de xenoinjerto también pueden ser sometidos a diversos tratamientos físicos para la preparación del implante. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.755.593 describe el sometimiento de tejido de xenoinjerto a estrés mecánico por estiramiento para producir un biomaterial más delgado y rígido para el injerto. El tejido para transplante de aloinjerto normalmente se crioconserva para optimizar la viabilidad celular durante el almacenamiento, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.071.741; en la Patente de EE.UU. Nº 5.131.850; en la Patente de EE.UU. Nº 5.160.313; y en la Patente de EE.UU. Nº 5.171.660. La Patente de EE.UU. Nº 5.071.741 describe que la congelación de los tejidos produce lesiones mecánicas en las células debido a la formación intra y extracelular de cristales de hielo y a la deshidratación osmótica.

Galili y col proporcionan un artículo de revisión en Xenotransplantation 1997; 4: 127-131, titulado "High-affinity anti-Gal immunoglobulin G in chronic rejection of xenografts". Galili y col describen "Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey" en Transplantation, volumen 63, 646-651, Nº 5; 15 de marzo de 1997.

La Patente de EE.UU. Nº 5.333.626 describe la preparación de hueso para transplante.

El documento WO 99/44533 es una solicitud de patente internacional disponible para el propósito de novedad bajo el Artículo 54(3) EPC titulado "Soft Tissue Xenografts".

El documento WO 99/47080 es una solicitud de patente internacional disponible para el propósito de novedad bajo el Artículo 54(3) EPC titulado "Bone Xenografts".

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un xenoinjerto óseo sustancialmente no inmunogénico para el implante en un humano que necesite una reparación o sustitución ósea. La invención proporciona además métodos para procesar hueso xenogénico con inmunogenicidad reducida pero con elasticidad y capacidad de soportar carga sustancialmente nativas para realizar xenoinjertos en humanos.

Tal como se describe en la presente memoria, el término "xenoinjerto" es sinónimo al término "heteroinjerto" y se refiere a un injerto transferido desde una animal de una especie a uno de otra especie. Stedman's Medical Dictionary, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1995).

Tal como se describe en la presente memoria, el término "xenogénico", como en injerto, hueso, etc., xenogénico, se refiere a un injerto, hueso, etc., transferido desde una animal de una especie a otro de otra especie. Ver anterior.

Los métodos de la invención se definen en las reivindicaciones 1 a 6. Los métodos de la invención pueden incluir además el tratamiento con radiación, uno o más ciclos de congelación y descongelación, el tratamiento con un agente químico reticulante, el tratamiento con alcohol o la ozonización. Además de o en lugar de estos tratamientos, los métodos de la invención incluyen un tratamiento de alteración celular. Los métodos de la invención incluyen la etapa de digestión de las funciones carbohidrato del xenoinjerto con una glicosidasa en un intervalo de concentraciones de 100 U/mL a 200 U/mL o digestión con glicosidasa. Ésta puede ir seguida del tratamiento de las funciones carbohidrato del xenoinjerto con una molécula protectora de ácido siálico. Después de una o más de las etapas de procesado descritas anteriormente, los métodos de la invención proporcionan un xenoinjerto que tiene sustancialmente las mismas propiedades mecánicas que un hueso nativo.

Tal como se describe en el presente documento, el término "alteración celular" como en, por ejemplo, tratamiento de alteración celular, se refiere a un tratamiento para matar células.

Tal como se describe en el presente documento, el término "molécula(s) protectora(s)" se refiere a moléculas que se unen a las cadenas de carbohidrato de tal modo que el xenoinjerto ya no es reconocido como un elemento extraño por el sistema inmune del sujeto.

En una realización, la invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un xenoinjerto óseo sustancialmente no inmunogénico para implante en un humano.

En otra realización, la invención proporciona un método para preparar un xenoinjerto óseo para implante en un humano, que incluye eliminar al menos una porción de un hueso de un animal no humano para proporcionar un xenoinjerto, lavar el xenoinjerto en agua y alcohol; y someter el xenoinjerto a al menos un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en exposición a radicación ultravioleta, inmersión en alcohol, ozonización, y ciclos de congelación/descongelación, en donde el xenoinjerto presenta sustancialmente las mismas propiedades mecánicas que una porción correspondiente de un hueso nativo.

Tal como se describe en la presente memoria, el término "porción", como en, por ejemplo, una porción de hueso o segundas funciones de carbohidrato superficiales, se refiere al total o a menos del total de respectivo hueso o segundas funciones de carbohidrato superficiales.

La invención proporciona un método para preparar un xenoinjerto óseo para implante en un humano, que incluye retirar al menos una porción de un hueso de un animal no humano para proporcionar un xenoinjerto; lavar el xenoinjerto en agua y alcohol; someter el xenoinjerto a un tratamiento de alteración celular; y digerir el xenoinjerto con una glicosidasa en un intervalo de concentración de aproximadamente 100 U/mL a aproximadamente 200 U/mL para eliminar sustancialmente las primeras funciones carbohidrato superficiales de un xenoinjerto, en donde el xenoinjerto tiene sustancialmente las mismas propiedades mecánicas que una porción correspondiente de un hueso nativo, en donde el xenoinjerto no comprende un xenoinjerto de tejido blando sustancialmente no inmunogénico.

En una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar un xenoinjerto óseo para implante en un humano, que incluye retirar al menos una porción de un hueso de un animal no humano para proporcionar un xenoinjerto; lavar el xenoinjerto en agua y alcohol; someter el xenoinjerto a un tratamiento de alteración celular; digerir el xenoinjerto con una glicosidasa para eliminar sustancialmente las primeras funciones de carbohidrato superficiales del xenoinjerto; y tratar las segundas funciones de carbohidrato del xenoinjerto con ácido siálico para proteger al menos una porción de las segundas funciones de carbohidrato superficiales, en donde el xenoinjerto es sustancialmente no inmunogénico y tiene sustancialmente las mismas propiedades mecánicas que una porción correspondiente de un hueso nativo.

Tal como se describe en la presente memoria, los términos "proteger" ó "protección", se refieren a la unión de una molécula protectora tal como una unidad de carbohidrato al final de una cadena de carbohidratos, tal como, por ejemplo, ácido siálico ligado covalentemente a funciones de carbohidrato superficiales en el xenoinjerto.

En otras realizaciones adicionales, la invención proporciona artículos de fabricación que incluyen xenoinjertos sustancialmente no inmunogénicos para implante en humanos producidos mediante los métodos de la invención anteriormente mencionados.

Breve descripción de las figuras

Las diversas características de la invención pueden comprenderse mejor en su totalidad a partir de la siguiente descripción y figuras anexas.

La Figura 1 muestra una porción de un hueso que tiene un defecto;

La Figura 2 muestra la porción de hueso de la Figura 1 con un xenoinjerto de la invención en el defecto; y

La Figura 3 es una representación gráfica de la especificidad de anticuerpos monoclonales anti-Gal hacia epítopos \alpha-galactosilo en albúmina de suero bovino (BSA, del inglés "bovine serum albúmina"), tiroglobulina bovina, laminina de ratón, Gal\beta1-4 G1cNAc-BSA (N-acetillactosamina-BSA), Gal\alpha1-4Gal\beta1-4G1cNAc-BSA (antígeno P1 ligado a BSA), y tiroglobulina humana o laminina humana.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención está dirigida contra el rechazo crónico de xenoinjertos para implante en humanos. Por consiguiente, el xenoinjerto óseo producido de acuerdo con el método de la invención es sustancialmente no inmunogénico, a la vez que mantiene las propiedades mecánicas de un hueso nativo.

El xenoinjerto óseo puede cortarse en segmentos y cada uno de ellos puede implantarse en el receptor como se establece a continuación.

La invención proporciona, en una realización, un método para preparar o procesar un hueso xenogénico para injerto en humanos. El hueso puede extraerse de un animal no humano para preparar los xenoinjertos de la invención. También puede usarse hueso procedente de animales no humanos transgénicos o de animales no humanos alterados genéticamente como xenoinjertos de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, se toman fuentes óseas bovinas, ovinas o porcinas para preparar los xenoinjertos. Más preferiblemente, las fuentes de huesos son cerdos inmaduros, terneros o corderos, ya que el hueso de animales jóvenes tiene un hueso más canceloso y puede ser menos quebradizo que el de animales de mayor edad. En el caso más preferible, la edad del animal fuente está entre seis y dieciocho meses en el momento del sacrificio.

En la primera etapa del método de la invención, se extrae una porción de hueso intacto de un hueso de un animal no humano. La fuente del hueso debería extraerse de animales recién sacrificados y preferiblemente ser colocado inmediatamente en una disolución isotónica esterilizada adecuada o en otro tipo de disolución conservante de tejidos. La extracción de las porciones de hueso debería producirse tan pronto como sea posible después de la muerte del animal, y preferiblemente debería llevarse a cabo en frío, es decir, en el intervalo aproximado de 5ºC a 20ºC, para minimizar la degradación enzimática del tejido óseo.

Las porciones de hueso se extraen en frío, en condiciones estrictamente estériles y siguiendo procedimientos quirúrgicos conocidos. La porción de hueso extraída se corta en tiras o bloques y se provee con y sin hueso canceloso unido al hueso cortical.

El xenoinjerto resultante se lava en aproximadamente diez volúmenes de agua fría esterilizada para eliminar las proteínas sanguíneas residuales y los materiales solubles en agua. A continuación el xenoinjerto se sumerge en alcohol a temperatura ambiente durante aproximadamente cinco minutos para esterilizar el hueso y eliminar materiales no colagenosos.

Tras una inmersión en alcohol, el xenoinjerto puede ser sometido a al menos uno de los siguientes tratamientos: tratamiento con radiación, tratamiento con alcohol, ozonización, uno o más ciclos de congelación y descongelación, y/o tratamiento con un agente químico reticulante. Cuando se aplica más de uno de estos tratamientos al xenoinjerto, los tratamientos pueden realizarse en cualquier orden.

En una realización del método de la invención, el xenoinjerto puede ser tratado mediante exposición a radiación ultravioleta durante aproximadamente quince minutos o a radiación gamma en una cantidad de aproximadamente 0,5 a 3 MegaRad.

En otra realización, el xenoinjerto puede tratarse colocándolo de nuevo en una disolución de alcohol. Se puede usar cualquier disolución de alcohol para llevar a cabo este tratamiento. Preferiblemente, el xenoinjerto se coloca en una disolución al 70% de isopropanol a temperatura ambiente.

En otra realización adicional, el xenoinjerto puede someterse a ozonización.

En otra realización adicional del método de la invención, el xenoinjerto puede tratarse mediante ciclos de congelación/descongelación. Por ejemplo, el xenoinjerto puede congelarse usando cualquier método de congelación, siempre que el xenoinjerto se congele completamente, es decir, que no queden puntos interiores calientes que contengan tejido sin congelar. Preferiblemente, el xenoinjerto se sumerge en nitrógeno líquido durante aproximadamente cinco minutos para llevar a cabo esta etapa del método. Más preferiblemente, el xenoinjerto se congela lentamente colocándolo en un congelador. En la siguiente etapa del tratamiento de ciclo de congelación/descongelación, el xenoinjerto se descongela por inmersión en un baño salino isotónico a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) durante aproximadamente diez minutos.

En otra realización adicional, el xenoinjerto puede ser expuesto opcionalmente a un agente químico para curtir o reticular las proteínas de la matriz extracelular, para disminuir o reducir aún más los determinantes inmunogénicos presentes en el xenoinjerto. Se puede usar cualquier agente de curtido o reticulado para dicho tratamiento, y se puede llevar a cabo más de una etapa de reticulado o se puede usar más de un agente reticulante a fin de asegurar un completo reticulado y reducir por tanto la inmunogenicidad del xenoinjerto. Por ejemplo, se pueden usar aldehídos como el glutaraldehído, el formaldehído, el dialdehído adípico, y otros similares, para reticular el colágeno de la matriz extracelular del xenoinjerto de acuerdo con el método de la invención. Otros agentes de reticulado adecuados incluyen las diaminas alifáticas y aromáticas, las carbodiimidas, los diisocianatos, y otros similares.

Cuando se usa glutaraldehído como agente reticulante, por ejemplo, el xenoinjerto puede llevarse a una disolución tamponada que contiene aproximadamente de 0,05 a aproximadamente 5,0% de glutaraldehído y que tiene un pH de aproximadamente 7,4. Se puede usar cualquier tampón adecuado, tal como disolución salina tamponada de fosfato o trishidroximetilaminometano, y otros similares, siempre que sea posible mantener el control del pH de la disolución durante la duración de la reacción de reticulación, lo que puede suponer de uno a catorce días, y preferiblemente de tres a cinco días.

Alternativamente, el xenoinjerto se puede exponer a un agente reticulante en forma de vapor, que incluye, aunque sin limitación, un agente reticulante de aldehído vaporizado, tal como, por ejemplo, formaldehído vaporizado. El agente reticulante vaporizado puede tener una concentración y un pH y el xenoinjerto puede ser expuesto al agente reticulante vaporizado durante un periodo de tiempo adecuado para permitir que se produzca la reacción de reticulación. Por ejemplo, el xenoinjerto puede ser expuesto a agente reticulante vaporizado que tenga una concentración de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5,0% y un pH de aproximadamente 7,4, durante un periodo de tiempo que puede variar entre uno y catorce días, y preferiblemente de tres a cinco días. La exposición a agente reticulante vaporizado puede dar lugar a productos químicos residuales reducidos en el xenoinjerto procedentes de la exposición al agente reticulante.

La reacción de reticulación debería continuar hasta que los determinantes inmunogénicos sean eliminados sustancialmente del tejido xenogénico, pero la reacción debería acabar antes de producir alteraciones significativas en las propiedades mecánicas del xenoinjerto. Si también se usan diaminas como agentes reticulantes, la reticulación del glutaraldehído debería producirse después de la reticulación de las diaminas, de tal modo que cualquier diamina no reaccionada sea protegida. Después de que se hayan completado las reacciones de reticulación como se ha indicado anteriormente, el xenoinjerto debería ser enjuagado para eliminar los productos químicos residuales, y puede añadirse glicina 0,01-0,05 M para proteger cualquier grupo aldehído no reaccionado que pueda quedar.

Además de los anteriores tratamientos, el xenoinjerto es sometido a un tratamiento de alteración celular para matar células del xenoinjerto, que precede o sucede a la digestión del xenoinjerto con glicosidasas para eliminar funciones de carbohidrato superficiales del xenoinjerto. La concentración de glicosidasa se encuentra en el intervalo de 100 U/mL a 200 U/mL. La digestión con glicosidasa puede continuarse a su vez con la unión de moléculas protectoras tales como ácido siálico para proteger los extremos de N-acetillactosamina superficiales de las cadenas de carbohidratos del xenoinjerto.

En una realización de este método de la invención, el xenoinjerto se somete a un tratamiento de alteración celular para matar las células del hueso antes de una digestión in vitro del xenoinjerto con glicosidasa. Normalmente después de que las funciones de carbohidrato superficiales han sido eliminadas de las células nucleadas y de la matriz extracelular, las células nucleadas, es decir, las células vivas re-expresan las funciones de carbohidrato superficiales. La re-expresión de funciones antigénicas de un xenoinjerto puede provocar un rechazo inmunogénico continuado del xenoinjerto. Por el contrario, las células no nucleadas, es decir, muertas, son incapaces de re-expresar funciones de carbohidrato superficiales. La eliminación de funciones de carbohidrato superficiales antigénicas de las células no nucleadas y de la matriz extracelular de un xenoinjerto elimina de forma sustancialmente permanente las funciones de carbohidrato superficiales antigénicas como fuente de rechazo inmunogénico del xenoinjerto.

Por consiguiente, en la anterior realización, el xenoinjerto obtenido de acuerdo con la presente invención se somete a ciclos de congelación/descongelación tal como se ha discutido anteriormente para alterar, es decir, para matar las células del hueso. Alternativamente, el xenoinjerto de la presente invención se trata con radiación gamma que tiene una cantidad de entre 0,2 MegaRad y aproximadamente 3 MegaRad. Dicha radiación mata las células óseas y esteriliza el xenoinjerto. Una vez muertas, las células óseas ya no son capaces de re-expresar funciones de carbohidrato superficiales antigénicas tales como epítopos \alpha-gal, que son factores en el rechazo inmunogénico de los xenoinjertos transplantados.

Ya sea antes o después de que las células óseas hayan muerto, el xenoinjerto es sometido a una digestión in vitro con glicosidasas, y específicamente con galactosidasas, tales como \alpha-galactosidasa, para eliminar enzimáticamente las funciones de carbohidrato superficiales antigénicas. En concreto, se eliminan los epítopos \alpha-gal mediante tratamiento enzimático con \alpha-galactosidasas, tal como se muestra en la siguiente reacción:

1

Los residuos de N-acetillactosamina son epítopos que normalmente se expresan en células humanas y de mamíferos y, por tanto, no son inmunogénicos. La digestión in vitro del xenoinjerto con glicosidasas se lleva a cabo empleando diversos métodos. Por ejemplo, el xenoinjerto se puede empapar o se puede incubar en una disolución tampón que contenga glicosidasa. Adicionalmente, el xenoinjerto puede ser perforado para aumentar la permeabilidad, tal como se describe más detalladamente más adelante. Alternativamente, se puede hacer pasar a presión una disolución tampón que contenga la glicosidasa a través del xenoinjerto empleando un proceso de lavado por pulsos.

La eliminación de los epítopos \alpha-gal del xenoinjerto disminuye la respuesta inmune contra el xenoinjerto. El epítopo \alpha-gal se expresa en mamíferos no primates y en monos del Nuevo Mundo (monos de Sudamérica) como 1x10^{6} - 35x10^{6} epítopos por célula, así como en macromoléculas tales como los proteoglicanos de la matriz extracelular. U. Galili y col., Man, apes, and Old World monkeys differ from other mammals in the expression of \alpha-galactosyl epitopes on nucleated cells, 263 J. Biol. Chem. 17755 (1988). Sin embargo, este epítopo no está presente en los primates del Viejo Mundo (monos de Asia y África y simios) ni en humanos. Ver anterior. El Anti-Gal se produce en humanos y en primates como resultado de una respuesta inmune a estructuras de carbohidrato de epítopo \alpha-gal de las bacterias gastrointestinales. U. Galili y col., Interaction between human natural anti-\alpha-galactosyl immunoglobulin G and bacteria of the human flora, 56 Infect. Immun. 1730 (1988); R. M. Hamadeh y col., Human natural anti-Gal IgG regulates alternative complement pathway activation on bacterial surfaces, 89 J. Clin. Invest. 1223 (1992). Puesto que los mamíferos no primates producen epítopos \alpha-gal, el xenotransplante de xenoinjertos procedentes de dichos animales en primates da como resultado un rechazo debido a la unión del anti-Gal de los primates con dichos epítopos del xenoinjerto. La unión resulta en la destrucción del xenoinjerto por fijación complementaria y por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. U. Galili y col., Interaction of the natural anti-Gal antibody with \alpha-galactosyl epitopes: A major obstacle for xenotransplantation in humans, 14 Immunology Today 480 (1993); M. Sandrin y col., Anti-pig IgM antibodies in human serum react predominantly with Gal\alpha1-3Gal epitopes, 90 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11391 (1993); H. Good y col., Identification of carbohydrate structures which bind human anti-porcine antibodies: implications for discordant grafting in man, 24 Transplant. Proc. 559 (1992); B. H. Collins y col., Cardiac xenografts between primate species provide evidence for the importance of the \alpha-galactosyl determinant in hyperacute rejection, 154 J. Immunol. 5500 (1995). Además, el xenotransplante da como resultado una activación primaria del sistema inmune para producir grandes cantidades de anti-Gal de alta afinidad. Por consiguiente, la eliminación sustancial de epítopos \alpha-gal de las células óseas y de la matriz extracelular, y la prevención de la re-expresión de epítopos \alpha-gal celulares pueden
disminuir la respuesta inmune contra el xenoinjerto asociada a la unión de anticuerpos anti-Gal con epítopos \alpha-gal.

Después del tratamiento con glicosidasa, las cadenas de carbohidrato restantes (por ejemplo, glicosaminoglicanos) del xenoinjerto son tratadas opcionalmente con moléculas protectoras para proteger al menos una porción de las cadenas de carbohidrato restantes. Este tratamiento de protección implica proteger moléculas que tienen un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM, y preferiblemente, una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, y aún más preferiblemente, una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM. El tratamiento con moléculas protectoras es aplicable a xenoinjertos tratados con glicosidasa y a xenoinjertos no tratados con glicosidasa. Por ejemplo, los injertos de animales sacrificados que puedan carecer de epítopos \alpha-gal pueden ser tratados con moléculas protectoras para proteger las funciones de carbohidrato del xenoinjerto, reduciendo con ello la inmunogenicidad del xenoinjerto. Los ejemplos de moléculas protectoras usadas en la presente invención incluyen la glucosamina de fucosilo y de n-acetilo y el ácido siálico.

Adicionalmente, las moléculas protectoras seleccionadas, tales como el ácido siálico, están cargadas negativamente. La sustitución de epítopos \alpha-gal con moléculas cargadas negativamente puede disminuir aún más el rechazo inmunogénico del xenoinjerto. Existe la teoría de que se produce un descenso en la inmunogenicidad del xenoinjerto debido a que las cargas negativas conferidas por las moléculas protectoras repelen moléculas de anticuerpos cargadas negativamente y/o células del sistema inmune, enmascarando de este modo las regiones inmunogénicas del xenoinjerto.

En general, la repulsión electrostática denomina "potencial zeta" evita la interacción entre moléculas, diferentes a los ligandos y a sus correspondientes receptores, en el cuerpo, y sirve como barrera contra interacciones no específicas. Por ejemplo, el ácido siálico de las cadenas de carbohidrato de glicoproteínas de sobre ayuda a los virus infecciosos a evadir el reconocimiento efectivo por anticuerpos y por células que presentan antígenos. T.W. Rademacher y col., Glycobiology, Ann. Rev. Biochem., 57: 785 (1988). Bacterias tales como Neisseria gonorrhea pueden evitar su destrucción inmune recubriéndose a sí mismas con ácido siálico usando una sialiltransferasa bacteriana. R. F. Rest y col., Neisseria sialyltransferases and their role in pathogenesis, Microbial Pathogenesis, 19: 379 (1995). De forma similar, el protozoo Trypanosoma cruzi puede infectar humanos y provocar la enfermedad de Chagas debido a una sialización efectiva de las glicoproteínas de su superficie celular con ácido siálico mediante el uso de la enzima transialidasa que transfiere ácido siálico desde las glicoproteínas del anfitrión hasta las cadenas de carbohidrato de la membrana del parásito. O. Previato y col., Incorporation of sialic acid into Trypanosoma cruzi macromolecules, A proposal for new metabolic route, Mol. Biochem. Parasitol., 16: 85 (1985); B. Zingales y col., Direct sialic acid transfer from a protein donor to glycolipids of trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi, Mol. Biochem. Parasitol., 26: 1335 (1987). Disminuir la inmunogenicidad mediante ácido siálico es un método usado también por las células de mamíferos. Las células normales que presentan antígenos evitan la adhesión no específica con linfocitos T mediante la expresión de una proteína altamente sialilada denominada sialoforina (también llamada CD43). E. Famole-Belasio y col., Antibodies against sialophorin (CD43) enhance the capacity of dendritic cells to cluster and activate T lymphocytes, J. Immunol., 159: 2203 (1997). Multitud de tipos de células malignas que adquieren propiedades metastáticas aumentan la expresión de ácido siálico sobre las glicoproteínas de su superficie celular y por tanto enmascaran sus antígenos tumorales y disminuyen la posibilidad de ser detectadas y destruidas por el sistema inmune. G. Yogeswarren y col., Metastatic potential is positively correlated with cell surface sialylation of cultural murine cells, Science, 212: 1514 (1981); J. W. Dennis, Changes in glycosylation associated with malignant transformation and tumor progression, en Cell surface carbohydrates and cell development, M. Fukuda, Ed. CRC Press, páginas 161-213 (1992).

Se puede implementar la misma estrategia para la prevención del reconocimiento inmune mediante el tratamiento de xenoinjertos tratados con \alpha-galactosidasa con moléculas cargadas negativamente. La adición de moléculas cargadas negativamente a los extremos de las cadenas de carbohidrato de las células y/o de las moléculas de la matriz extracelular de los injertos tratados con \alpha-galactosidasa puede enmascarar los antígenos del xenoinjerto que no son \alpha-Gal y disminuir el rechazo inmunogénico del xenoinjerto.

El ácido siálico es un ejemplo no limitante de una molécula protectora cargada negativamente usada para proteger las cadenas de carbohidrato del xenoinjerto de la presente invención. El ácido siálico puede unirse in vitro a las cadenas de carbohidrato del xenoinjerto mediante sialiltransferasa (ST), preferiblemente en una concentración de aproximadamente 1 mU/mL a aproximadamente 1.000 U/mL, y más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 10 U/mL a aproximadamente 200 U/mL, en el siguiente ejemplo de reacción:

2

El ácido siálico también puede ligarse in vitro a las cadenas de carbohidrato del xenoinjerto mediante trans-sialidasa (TS) recombinante, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 1 mU/mL a aproximadamente 1.000 U/mL, y más preferiblemente en una concentración de aproximadamente 10 U/mL a aproximadamente 200 U/mL, en el siguiente ejemplo de reacción:

3

Antes del tratamiento, la superficie exterior lateral del xenoinjerto puede ser perforada opcionalmente para aumentar la permeabilidad de los agentes usados para hacer que el xenoinjerto sea sustancialmente inmunogénico. Se puede usar una aguja esterilizada tal como una aguja del número 18 para realizar dicha etapa de perforación, o, alternativamente se puede usar un aparato tipo peine que contenga una pluralidad de agujas. La perforación se puede llevar a cabo siguiendo diferentes modelos, y con varios espaciados entre perforación y perforación, a fin de establecer el acceso deseado al interior del xenoinjerto. También se puede realizar la perforación con láser. En una forma de la invención, se establecen una o más líneas rectas de perforaciones separadas unos tres milímetros en circunferencia en la superficie lateral exterior del xenoinjerto.

Antes del implante, el hueso del xenoinjerto puede tratarse con una digestión limitada mediante enzimas proteolíticas tales como la ficina o la tripsina para aumentar la flexibilidad, o pueden recubrirse con agentes anticalcificación, con recubrimientos antitrombóticos, con antibióticos, con factores de crecimiento o con otros fármacos que puedan mejorar la incorporación del xenoinjerto en el receptor. El xenoinjerto óseo de la invención además puede esterilizarse usando métodos conocidos, por ejemplo, con un tratamiento adicional con glutaraldehído o con formaldehído, mediante esterilización con óxido de etileno, esterilización con óxido de propileno u otros similares. El xenoinjerto se puede almacenar congelado hasta que sea requerido para uso.

Además, el xenoinjerto óseo de la invención puede tratarse con un factor osteoinductivo en una cantidad efectiva para estimular la conversión de las células de tejido blando en formados de tejido óseo. Por ejemplo, el factor osteoinductivo puede añadirse a los espacios subcutáneos del xenoinjerto de la invención en concentraciones predeterminadas. Tal como se describe en la presente memoria, la expresión "factor osteoinductivo" se refiere a una proteína que estimula la diferenciación de células de tejido conectivo no comprometidas en células formadoras de hueso. J. M. Lane y col., Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of Norht America (2) 214 (1987). Los ejemplos de factores osteoinductivos que pueden usarse en la presente invención incluyen la proteína morfogénica ósea (BMP, del inglés "bone morphogenic protein"). Dichos factores osteoinductivos se encuentran disponibles comercialmente.

El xenoinjerto óseo de la invención también puede tratarse con un agente de desmineralización en una cantidad eficaz para eliminar sustancialmente minerales tales como, por ejemplo, el calcio de la matriz extracelular del xenoinjerto. Por ejemplo, el xenoinjerto de la invención puede empaparse en una disolución que contenga agentes de desmineralización tal como ácido clorhídrico y otros agentes de desmineralización conocidos por los especialistas en la técnica, en concentraciones predeterminadas, para desmineralizar sustancialmente el xenoinjerto de la invención. Una vez que se han eliminado los minerales del xenoinjerto, se forma una matriz de volumen poroso con poros cuyo tamaño oscila entre aproximadamente 50 \mum y aproximadamente 500 \mum. Existe la teoría de que el colágeno de la matriz ósea extracelular desmineralizada sirve como andamio osteoconductivo y facilita la migración de componentes formadores del hueso una vez que se ha implantado el injerto óseo. J. M. Lane y col., Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America (2) 220 (1987). También existe la teoría de que el hueso desmineralizado posee una mayor actividad osteoinductora que, por ejemplo, el hueso autólogo, debido a que el mineral óseo impide la liberación de proteínas osteoinductoras desde la matriz ósea extracelular. Ver anterior en 218. De acuerdo con esta teoría, la desmineralización aumenta el acceso de células respuesta del entorno a proteínas osteoinductoras y aumenta el potencial de las proteínas osteoinductoras.

Adicionalmente, se puede añadir un agente de unión al xenoinjerto óseo de la presente invención. El agente de unión se implanta en una cantidad eficaz para facilitar la unión de células mesenquimales y otras células formadoras de hueso con la matriz extracelular del xenoinjerto óseo. Por ejemplo, se puede añadir el agente de unión en concentraciones predeterminadas. Los ejemplos de agentes de unión útiles en la presente invención incluyen proteína de fibronectina y péptido RGD, y además incluyen otros agentes de unión conocidos por los especialistas en la técnica.

El xenoinjerto óseo de la invención, o un segmento del mismo, puede ser implantado en huesos humanos dañados por los especialistas en la técnica usando técnicas quirúrgicas artroscópicas conocidas. Los agujeros en los huesos se rellenan manualmente con hueso siguiendo técnicas quirúrgicas estándares. Los especialistas en la técnica conocen los instrumentos específicos para llevar a cabo las técnicas quirúrgicas, que aseguran una colocación precisa y reproducible de los implantes óseos.

Esta invención se ilustra con mayor detalle mediante los siguientes Ejemplos que no deberían ser considerados limitantes.

Ejemplo 1 Ensayo para la Eliminación de Epítopos \alpha-Gal del Hueso mediante \alpha-Galactosidasa

En este ejemplo, se lleva a cabo un ensayo ELISA para determinar la eliminación de epítopos \alpha-gal del hueso.

Se produce un anticuerpo anti-Gal monoclonal (designado M86) que es altamente específico para los epítopos \alpha-gal de las glicoproteínas mediante fusión de esplenocitos procedentes de ratones sacrificados productores de anti-Gal para \alpha 1,3 galactosiltransferasa, y un compañero de fusión de hibridoma de ratón.

La especificidad de M86 para epítopos \alpha-gal sobre glicoproteínas se ilustra en la Figura 3. M86 se une a epítopos \alpha-gal sintéticos ligados a \bullet-albúmina de suero bovino (BSA), a \ding{115}-tiroglobulina bovina que tiene 11 epítopos \alpha-gal, R. G. Spiro y col., Ocurrence of \alpha-D-galactosyl residues in the thyroglobulin from several species. Localization in the saccharide chains of complex carbohydrates, 259 J. Biol. Chem. 9858 (1984); o a \sqbullet-laminina de ratón que tiene 50 epítopos \alpha-gal, R. G. Arumugham y col., Structure of the asparagine-linked sugar chains of laminin, 883 Biochem. Biophys. Acta 112 (1986); pero no a \Box-tiroglobulina humana o laminina humana, O-Gal\beta1-4G1cNAc-BSA (N-acetillactosamina-BSA) y Gal\alpha1-4Gal\beta1-4G1cNAc-BSA (antígeno P1 ligado a BSA), todos los cuales carecen completamente de epítopos \alpha-gal. La unión se mide a diferentes diluciones del medio de cultivo de tejido de M86.

Una vez que el anticuerpo M86 es aislado, el anticuerpo monoclonal se diluye desde aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:160, y preferiblemente se diluye desde aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:130. El anticuerpo se incuba durante un periodo de tiempo predeterminado que oscila entre aproximadamente 5 h y aproximadamente 24 h, a una temperatura predeterminada que oscila entre aproximadamente 3ºC y aproximadamente 8ºC. El anticuerpo se mantiene en constante rotación con fragmentos de hueso de aproximadamente 5 \mum a aproximadamente 100 \mum de tamaño, y más preferiblemente con fragmentos de hueso que oscilan entre aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 50 \mum de tamaño, a diversas concentraciones de hueso que oscilan entre 200 mg/mL y aproximadamente 1,5 mg/mL. Posteriormente, se eliminan los fragmentos de hueso mediante centrifugación a una velocidad de centrifugación que oscila entre aproximadamente 20.000 x g y aproximadamente 50.000 x g. La proporción de M86 ligado al hueso se determina midiendo la actividad residual de M86 en el sobrenadante, en ELISA con \alpha-gal-BSA, tal como se describe en la técnica anterior en, por ejemplo, U. Galili y col., Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651 (1997). La extensión de la unión de M86 al hueso se define como un porcentaje de inhibición de la posterior unión a \alpha-gal-BSA. Existe una relación directa entre la cantidad de epítopos \alpha-gal en el hueso y la proporción de M86 acomplejado con los fragmentos de huso, por tanto eliminado del sobrenadante (es decir, porcentaje de inhibición).

Ejemplo 2 Determinación de la Respuesta de Primates a Hueso Implantado Tratado con \alpha-Galactosidasa

En este ejemplo, se tratan implantes óseos porcinos con \alpha-galactosidasa para eliminar epítopos de \alpha-galactosilo, los implantes se transplantan a monos cynomolgus, y se determina la respuesta del primate a los implantes. En la Figura 1 se muestra un ejemplo de porción de hueso 10 con un defecto D.

Los especimenes de hueso porcino se preparan de forma estéril y se eliminan quirúrgicamente los tejidos blandos acompañantes. Los especimenes de hueso se lavan durante al menos cinco minutos con un alcohol, tal como etanol o isopropanol, para eliminar el fluido sinovial y los contaminantes lípidos solubles.

Los especimenes de hueso se congelan a una temperatura que oscila entre aproximadamente -35ºC y aproximadamente -90ºC, y preferiblemente a una temperatura de hasta aproximadamente -70ºC, para alterar, es decir, para matar, las células óseas del espécimen.

Cada espécimen de hueso se corta en dos porciones. La primera porción de hueso se sumerge en un tampón, tal como una disolución tampón de citrato, con un pH que oscila entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6. El tampón contiene \alpha-galactosidasa en una concentración que oscila entre aproximadamente 50 U/mL y aproximadamente 300 U/mL y un aditivo, tal como polietilénglicol (PEG), que oscila en una concentración de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 6%. La disolución tampón hueso/\alpha-galactosidasa se incuba a una temperatura que oscila entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente 32ºC durante un determinado periodo de tiempo que oscila entre aproximadamente una hora y aproximadamente seis horas.

La segunda porción de hueso se incuba en condiciones similares a las de la primera porción de hueso en una disolución tampón pero en ausencia de \alpha-galactosidasa, y sirve como control.

Al final de la incubación, las porciones de hueso se lavan en condiciones que permitan a la enzima difundir hacia el exterior. Por ejemplo, en el presente ejemplo, las porciones de hueso se lavan dos veces con tampón de citrato y tres veces con disolución salina de fosfato tamponada (PBS) pH 7,5. Cada lavado puede incluir una incubación en 50 mL de disolución tampón durante 10 minutos con una agitación suave a 24ºC. También se pueden usar otros procedimientos de lavado conocidos por los expertos en la técnica.

La confirmación de la completa eliminación de epítopos \alpha-gal se lleva a cabo usando el ensayo de inhibición ELISA con el anticuerpo monoclonal anti-Gal M86, tal como se describe en el anterior Ejemplo 1. La \alpha-galactosidasa se produce siguiendo métodos conocidos en la técnica anterior, tal como, por ejemplo, los métodos descritos en A. Zhu y col., Characterization of recombinant \alpha-galactosidase for use in seroconversion from blood group B to O human erythrocytes, 827 Arch. Biochem. Biophysics. 324 (1996); A. Zhu y col., High-level expression and purification of coffee bean \alpha-galactosidase produced in the yeast Pichia pastoris, 827 Arch. Biochem. Biophysics 324 (1996).

Las muestras óseas se implantan en seis monos cynomolgus bajo anestesia general por inhalación siguiendo procedimientos quirúrgicos conocidos. El hueso se implanta en tejidos subcutáneos para evaluar las propiedades osteoinductivas del hueso. Cualquier hueso formado es una evidencia de propiedades osteoinductivas. Las propiedades osteoinductivas del xenoinjerto óseo se evalúan después de que el xenoinjerto sea implantado usando modelos óseos defectuosos tal como el modelo calveria (modelo de agujero de cráneo) y el modelo de agujero de taladro de hueso largo. El procedimiento de implantación se lleva a cabo usando técnicas quirúrgicas con esterilización, y las heridas se cierran con suturas vieryl 3-0 ó con un equivalente adecuado conocido por el especialista en la técnica. La Figura 2 muestra la porción de hueso 10 con el xenoinjerto X (mostrado tachado) en lugar del defecto D. Se permite que los animales tengan una actividad en jaula no restringida y se monitoriza cualquier signo de incomodidad, hinchamiento, infección o rechazo. Se toman muestras sanguíneas (por ejemplo 2 mL) periódicamente (por ejemplo, cada dos semanas) para realizar un seguimiento de los anticuerpos.

La presencia de una respuesta inmune contra el xenoinjerto se establece mediante la determinación de anticuerpos anti-xenoinjerto óseo anti-Gal y no anti-Gal (es decir, anticuerpos que se unen a antígenos que no son epítopos \alpha-gal) en muestras de suero procedentes de monos transplantados. Se extraen al menos dos mL de muestras sanguíneas de los monos transplantado en el día de la cirugía del implante y a intervalos periódicos (por ejemplo, dos semanas) después del transplante. Las muestras sanguíneas se centrifugan y se las muestras de suero se congelan y se evalúan para determinar la actividad de anticuerpos anti-xenoinjerto óseo anti-Gal y no anti-Gal.

Se determina la actividad anti-Gal en las muestras de suero en ELISA con un \alpha-gal-BSA como antígeno de fase sólida, según métodos descritos en la técnica anterior, tal como, por ejemplo, los métodos descritos en Galili y col., Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651 (1997). Por ejemplo, el antígeno \alpha-gal-BSA se usa para recubrir pocillos de microtitulación ELISA. Después de bloquear los pocillos con BSA al 1% en PBS, se añaden los sueros a los pocillos en dos diluciones 1:2 en serie, y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavan las placas, y se incuban con anticuerpos secundarios anti-IgG conjugados con peroxidasa. Se lleva a cabo una reacción de color con o-fenilendiamina. Se compara la actividad anti-Gal a las diferentes diluciones de suero post-transplante con el suero pre-transplante de línea base.

Los ensayos se llevan a cabo para determinar si los xenoinjertos tratados con \alpha-galactosidasa inducen la formación de anticuerpos anti-xenoinjerto óseo. Para medir la actividad de anticuerpos anti-xenoinjerto óseo, se lleva a cabo un ensayo ELISA de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica anterior, tal como, por ejemplo, los métodos descritos en K. R. Stone y col., Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645 (1997). Por ejemplo, se usa una disolución de homogenato de hueso a 100 \mug/mL en tampón de carbonato como antígeno de fase sólida. También pueden usarse otros tampones conocidos por los especialistas en la técnica. Se secan aproximadamente 5 \mug de antígenos de hueso por pocillo y se bloquean los pocillos con BSA. Las muestras de suero usadas para este ensayo se agotan en anti-Gal mediante adsorción sobre células rojas de conejo durante 30 minutos a 4ºC (en una relación 3:1 vol/vol). En estas condiciones, todos los anticuerpos anti-Gal son adsorbidos sobre la multitud de epítopos \alpha-gal expresados en células rojas de conejo. U. Galili y col., Evolutionary relationship between the anti-Gal antibody and the Gal\alpha163Gal epitope in primates, 84 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1369 (1987); U. Galili y col., Contribution of anti-Gal to primate and human IgG binding to porcine endothelial cells, 60 Transplantation 210 (1995). Los sueros adsorbidos a diversas diluciones se analizan para determinar anticuerpos anti-cartílago mediante ELISA, y se determina la producción post-transplante de dichos anticuerpos comparando dicha actividad de anticuerpos con la observada en el suero pre-transplante.

Los xenoinjertos óseos son extraídos opcionalmente uno o dos meses después del transplante, se seccionan y se tiñen para realizar una evaluación histológica de infiltrados inflamatorios. Los cambios post-transplante en las actividades de anticuerpos anti-Gal y de otros anticuerpos anti-xenoinjerto óseo son correlacionadas con las características histológicas inflamatorias (es decir, granulocitos o infiltrados celulares mononucleares) del hueso extraído, de uno a dos meses después del transplante, usando métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los métodos descritos en K. R. Stone y col., Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645 (1997).

Cuando se extrae el xenoinjerto óseo, se recoge asépticamente usando un procedimiento anestésico, una exposición quirúrgica del hueso, una extracción del implante y el cierre del tejido blando. Las muestras de xenoinjerto se extraen, se procesan y se examinan al microscopio. Se congela una porción del implante y del tejido anexo en un medio de inmersión para especimenes de tejido congelados en moldes de inmersión para la evaluación inmunohistoquímica de acuerdo con métodos conocidos en la técnica anterior. El compuesto "TISSUE-TEK®" O.C.T., que incluye un 10,24% p/p de alcohol polivinílico, un 4,26% p/p de polietilénglicol y un 86,60% p/p de ingredientes inertes, y que es fabricado por Sakura FinTek, Torrence, California, es un ejemplo no limitante de un posible medio de inmersión para uso en la presente invención. También se pueden usar otros medios de inmersión conocidos por los especialistas en la técnica. El implante y el tejido anexo restantes puede llevarse a una disolución tamponada en pH neutro de formalina al 10% para realizar un examen histopatológico.

Ejemplo 3 Determinación de la Respuesta de Primates a Hueso Implantado Tratado con \alpha-Galactosidasa, Ácido Siálico-Monofosfato de Citosina y Sialiltransferasa

En este ejemplo, se tratan implantes óseos porcinos con \alpha-galactosidasa para eliminar epítopos \alpha-gal, tal como se describe en el Ejemplo 2. Los implantes son tratados adicionalmente con ácido siálico - monofosfato de citosina (SA-CMP) y con sialiltransferasa para proteger las cadenas de carbohidratos con ácido siálico. La sialiltransferasa facilita la transferencia del ácido siálico desde el compuesto SA-CMP hasta el xenoinjerto. El ácido siálico se une a las cadenas de carbohidratos protegiéndolas. El monofosfato de citosina proporciona el nivel energético necesario al ácido siálico para dicha unión y protección. La protección con ácido siálico interfiere con la capacidad del sistema inmune del sujeto para reconocer el xenoinjerto como un elemento extraño. La carga negativa del ácido siálico interfiere además con la capacidad de los antígenos del hueso para unirse con anticuerpos anti-hueso y no anti-Gal (es decir, anticuerpos que se unen a antígenos óseos diferentes de los epítopos \alpha-gal). Los implantes se transplantan en monos cynomolgus y se determina la respuesta del primate a los implantes óseos.

Se preparan especimenes óseos porcinos tal como se describe en el Ejemplo 2, incluyendo el tratamiento con \alpha-galactosidasa. Sin embargo, antes de implantarlos en los monos, se trata a los implantes con una cantidad predeterminada de SA-CMP y de sialiltransferasa, en concentraciones especificadas durante un tiempo predeterminado y a una temperatura predeterminada, para proteger las cadenas de carbohidratos con ácido siálico. Por ejemplo, la muestra se sumerge en 10 mL de una disolución tampón a un pH de aproximadamente 5,5 a 7,0, y preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,0-6,5, y aún más preferiblemente a un pH de aproximadamente 6,2, que contiene SA-CMP en una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM, y sialiltransferasa en una concentración de aproximadamente 100 U/mL. La muestra se incuba en un intervalo de temperatura de aproximadamente 26ºC a aproximadamente 37ºC durante un periodo de tiempo predeterminado de aproximadamente una hora a aproximadamente cuatro horas.

Se pueden usar otras enzimas tales como la transialidasa recombinante para facilitar la transferencia de ácido siálico desde compuestos tales como lactosa sialilada hasta el xenoinjerto.

Además, también se pueden usar otras moléculas tales como fucosilo en combinación con la correspondiente fucosilo transferasa y n-acetil glucosamina en combinación con la correspondiente glicosiltransferasa, para proteger las cadenas de carbohidratos de los implantes.

Posteriormente, las muestras se lavan para eliminar la enzima y se implantan en los monos, y se determina la aparición de una respuesta inmune contra el xenoinjerto tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2.

Claims (7)

1. Un método para preparar un xenoinjerto óseo para ser implantado en un humano, que comprende:

a. extraer al menos una porción de un hueso de un animal no humano para proporcionar un xenoinjerto;

b. lavar el xenoinjerto en agua y alcohol;

c. someter al xenoinjerto a un tratamiento de alteración celular; y

d. digerir el xenoinjerto con una glicosidasa para eliminar sustancialmente una multitud de primeras funciones de carbohidrato superficiales del xenoinjerto, en donde la glicosidasa tiene una concentración en el intervalo de 100 U/mL a 200 U/mL, y tras lo cual el xenoinjerto presenta sustancialmente las mismas propiedades mecánicas que una porción correspondiente de un hueso nativo, en donde el xenoinjerto no comprende un xenoinjerto de tejido blando sustancialmente no inmunogénico.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende la etapa de:

después de la etapa de digestión con glicosidasa, tratar una multitud de segundas funciones de carbohidrato superficiales del xenoinjerto con una multitud de moléculas protectoras para proteger al menos una porción de las segundas funciones de carbohidrato superficiales, tras lo cual el xenoinjerto es sustancialmente no inmunogénico.

3. El método de la reivindicación 2, en el que la etapa de protección comprende tratar las segundas funciones de carbohidrato superficiales del xenoinjerto con moléculas protectoras que tienen una concentración en un intervalo de 0,1 mM a 100 mM, y/o al menos una porción de las moléculas protectoras son moléculas de ácido siálico.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la glicosidasa es una galactosidasa; opcionalmente en donde la galactosidasa es una \alpha-galactosidasa.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el tratamiento de alteración celular comprende:

(i) ciclos de congelación/descongelación; o

(ii) exposición a radiación gamma.

6. El método de la reivindicación 1 que además comprende la siguiente etapa después de la etapa c:

(i) exponer el xenoinjerto a un agente reticulante en forma vapor; o

(ii) tratar el xenoinjerto con un agente desmineralizante para eliminar sustancialmente los minerales de una matriz extracelular; o

(iii) añadir un factor osteoinductivo al xenoinjerto; o

(iv) añadir un agente de unión al xenoinjerto.

7. Un artículo de fabricación que comprende un xenoinjerto óseo de rodilla sustancialmente no inmunogénico para implante en un humano, que puede obtenerse mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.