ES2301533T3 - Procedimiento para la deteccion de la metilacion de citosina en muestras de adn. - Google Patents

Procedimiento para la deteccion de la metilacion de citosina en muestras de adn. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la detección de 5-metilcitosina o para la detección de 5-metilcitosina y de SNP''s en muestras de ADN genómico, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas: (a) se hace reaccionar químicamente un ADN genómico, procedente de una muestra de ADN, con un reactivo, reaccionando de manera diferente la 5-metilcitosina y la citosina, y por consiguiente éstas, después de la reacción, muestran un diferente comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN; (b) se amplifica un ADN tratado previamente mediando utilización de una polimerasa y de por lo menos un cebador oligonucleótido; (c) se hibrida el ADN genómico amplificado, en condiciones rigurosas, con por lo menos un oligonucleótido que tiene una secuencia conocida, llegándose o bien a un apareamiento erróneo o a ningún apareamiento erróneo por lo menos entre una base en la región de 3'' del oligonucleótido y la base que se ha de investigar en el ADN; (d) los oligonucleótidos, que en la región de 3'' no tienen ningún apareamiento erróneo con la base que se ha de investigar en el ADN, se prolongan mediante una polimerasa por lo menos por un nucleótido, llevando por lo menos un nucleótido una marcación detectable, mientras que los oligonucleótidos, que en la región de 3'' tienen un apareamiento erróneo con la base que se ha de investigar, no se prolongan; (e) los oligonucleótidos prolongados se investigan en cuanto a la presencia de la marcación.

Description

Procedimiento para la detección de la metilación de citosina en muestras de ADN.
El invento se refiere a un procedimiento para la detección de 5-metilcitosina en muestras de ADN genómico.
Los planos de observación bien estudiados en la biología molecular después de los desarrollos metodológicos de los últimos años son los genes propiamente dichos, la traducción de estos genes en ARN y las proteínas resultantes a partir de ésta. El momento en el transcurso del desarrollo de un individuo en que se conecta un determinado gen y la manera cómo se regulan la activación y la inhibición de determinados genes en diferentes células y tejidos, se pueden correlacionar con la magnitud y el carácter de la metilación de los genes o respectivamente del genoma.
El presente invento describe un procedimiento para la detección del estado de metilación de muestras de ADN genómico. El procedimiento se puede usar al mismo tiempo también para la detección de mutaciones puntuales y de polimorfismos de un único nucleótido (del inglés Single Nucleotide Polymorphisms = SNP's).
La 5-metilcitosina es la base modificada covalentemente más frecuente en el ADN de células eucarióticas. Ella desempeña por ejemplo un cierto cometido en la regulación de la transcripción, al realizar la impresión genética y en la génesis de tumores. La identificación de la 5-metilcitosina como componente de una información genética presenta por lo tanto un considerable interés. Las posiciones con 5-metilcitosina, sin embargo, no se pueden identificar por secuenciación, puesto que la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además de esto, en el caso de una amplificación por PCR, se pierde totalmente la información epigenética, que llevan las 5-metilcitosinas.
Un método relativamente nuevo y que entretanto se está utilizando con la máxima frecuencia para la investigación de un ADN en cuanto a la presencia de 5-metilcitosina, se basa en la reacción específica de un bisulfito con citosina, que después de una subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas es transformada en uracilo, que en su comportamiento de apareamiento de bases corresponde a la timidina. Por el contrario, la 5-metilcitosina no es modificada en estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original es transformado de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no se puede diferenciar de la citosina por medio de su comportamiento de hibridación, ahora se puede detectar mediante técnicas "normales" de biología molecular como la única citosina que ha quedado, por ejemplo por amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en un apareamiento de bases, que ahora se aprovecha totalmente. El estado de la técnica, en lo que concierne a la sensibilidad, es definido mediante un procedimiento que encierra al ADN que se ha de investigar dentro de una matriz de agarosa, de esta manera impide la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito reacciona solamente con un ADN monocatenario) y reemplaza a todas las etapas de precipitación y purificación por una rápida diálisis (Olek, A. y colaboradores, Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066). Con este método se pueden investigar células individuales, lo cual explica el potencial del método. No obstante, hasta ahora se investigan solamente regiones individuales con una longitud de aproximadamente 3.000 pares de bases, y no es posible una investigación global de células en millares de posibles análisis de metilación. No obstante, tampoco este procedimiento puede analizar de una manera confiable ningún fragmento que sea muy pequeño, a partir de pequeñas cantidades de muestras. Éstas se pierden, a pesar de una protección contra la difusión a través de la matriz.
Una recopilación acerca de las otras posibilidades conocidas de detectar 5-metilcitosinas puede tomarse del siguiente artículo de compendio: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
La técnica del bisulfito es utilizada hasta ahora, salvo unas pocas excepciones (p. ej. véase Zechnigk, M. y colaboradores, Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98), solamente en la investigación. Sin embargo, siempre unos cortos trozos específicos de un gen conocido son amplificados después de un tratamiento con un bisulfito y o bien son secuenciados completamente (Olek, A. y Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276), o se detectan posiciones individuales de citosinas mediante una "reacción de prolongación de cebadores" (Gonzalgo, M. L. y Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, documento de solicitud de patente internacional WO 9500669) o mediante un corte con enzimas (Xiong, Z. y Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534). Además, también se ha descrito la detección mediante una hibridación (Olek y colaboradores, documento WO 9928498).
Otras publicaciones, que se ocupan de la utilización de la técnica del bisulfito para la detección de las metilaciones en el caso de genes individuales, son: Xiong, Z. y Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. y Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. y Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. y colaboradores, (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. y colaboradores, (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. y colaboradores (1995), Gene 157, 261; documentos WO 9746705 y WO 9515373.
Un compendio acerca del estado de la técnica en la producción de conjuntos de oligómeros (en inglés Oligomer Arrays) se puede tomar a partir de una edición especial de Nature Genetics, que ha aparecido en Enero de 1999 (suplemento de Nature Genetics, volumen 21, Enero de 1999) y de la bibliografía allí citada.
Existen diferentes procedimientos para inmovilizar a un ADN. El procedimiento más conocido es la unión firme de un ADN, que está funcionalizado con biotina, a una superficie revestida con estreptavidina (Uhlen, M. y colaboradores 1988, Nucleic Acids Res. 16, 3025-3038). La fuerza de unión de este sistema corresponde a la de un enlace químico covalente, sin ser tal enlace. Con el fin de poder unir un ADN diana por enlaces covalentes a una superficie previamente preparada por medios químicos, se necesita una correspondiente funcionalidad del ADN diana. Un ADN propiamente dicho no posee ninguna funcionalización, que sea apropiada. Existen diferentes variantes, para introducir una apropiada funcionalización en un ADN diana. Dos funcionalizaciones fáciles de manipular son aminas y tioles alifáticas/os primarias/os. Tales aminas se hacen reaccionar cuantitativamente con ésteres de N-hidroxi-succinimida, y tales tioles reaccionan cuantitativamente con yoduros de alquilo en condiciones apropiadas. Una dificultad consiste en la introducción de una de tales funcionalizaciones en un ADN. La variante más sencilla es la introducción mediante un cebador de una PCR. Las variantes mostradas usan unos cebadores modificados en 5' (NH_{2} y SH) y un engarzador bifuncional.
Un componente esencial de la inmovilización sobre una superficie es su condición o constitución. Los sistemas hasta ahora descritos están constituidos principalmente a base de silicio o de un metal. Un método adicional para la unión de un ADN diana se basa en utilizar una corta secuencia de reconocimiento (p. ej. de 20 bases) en el ADN diana para la hibridación con un oligonucleótido inmovilizado en su superficie. Se han descrito también unas variantes enzimáticas para la introducción de posiciones activadas químicamente en un ADN diana. Aquí, en un ADN diana se lleva a cabo enzimáticamente una funcionalización con NH_{2} en 5'.
Para la exploración de un conjunto de ADN inmovilizado se han utilizado en muchos casos unas sondas marcadas fluorescentemente. Es especialmente apropiada para marcaciones fluorescentes la simple colocación de colorantes Cy3 y Cy5 junto al OH en 5' de la respectiva sonda. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas se efectúa por ejemplo por medio de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5 son obtenibles comercialmente, junto a muchos otros.
Unos procedimientos muy recientes para la detección de mutaciones se exponen en lo sucesivo:
Como un caso especial de la secuenciación es digna de mencionarse la ampliación de cebadores de una sola base (Genetic Bit Analysis = análisis de bitios genéticos) (Head, SR., Rogers, YH., Parikh K., Lan, G., Anderson, S., Goelet, P., Boycejacino MT., Nucleic Acids Research. 25(24): 5065-5071, 1997; Picoult-Newberg, L., Genome Res. 9(2): 167-174, 1999). Una amplificación y una secuenciación combinadas se describen en el documento de patente de los EE.UU. US-A1 5.928.906, donde se emplea una terminación específica para una cierta base sobre unas moléculas de matriz. Un procedimiento adicional emplea una reacción con una ligasa/polimerasa para la identificación de nucleótidos (documento US-A1 5.952.174).
La espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser, asistida por una matriz (MALDI, de Matrix Assistierte Laser Desorption/Ionisation), es un nuevo desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas, M., Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons [Ionización y desorción por láser de proteínas con unas masas moleculares que superan los 10.000 dalton]. Anal Chem. 60: 2299-2301). Un analito es embebido en una matriz absorbente de la luz. Mediante un corto impulso de láser, la matriz es evaporada y la molécula del analito es transportada de esta manera sin fragmentar a la fase gaseosa. Mediante choques con moléculas de la matriz se alcanza la ionización del analito. Una tensión eléctrica aplicada acelera a los iones en un tubo de vuelo exento de campo. A causa de sus diferentes masas, los iones se aceleran con diversa intensidad. Los iones más pequeños llegan al detector antes que los mayores.
La Maldi es apropiada excelentemente para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends [ADN y espectrometría de masas con ionización y desorción por láser asistida por la matriz. Biología molecular: actuales innovaciones y tendencias futuras] 1: 147-157). Para los ácidos nucleicos la sensibilidad es aproximadamente 100 veces peor que para los péptidos y disminuye por encima de la razón proporcional al crecer el tamaño de los fragmentos. Para los ácidos nucleicos, que tienen un entramado cargado negativamente múltiples veces, el proceso de ionización mediante la matriz es esencialmente más ineficaz. Para una MALDI la elección de la matriz desempeña un cometido eminente. Para la desorción de péptidos se han encontrado algunas matrices muy eficientes, que proporcionan una cristalización muy fina. Para los ADN han habido ciertamente entretanto algunas matrices correspondientes, pero con ello no se disminuía la diferencia de sensibilidades. La diferencia de sensibilidades puede ser disminuida modificando químicamente el ADN, de tal manera que éste sea similar a un péptido. Los fosforotioato - ácidos nucleicos, en los cuales los fosfatos habituales del entramado han sido sustituidos por tiofosfatos, se pueden transformar mediante una sencilla química de alquilación en un ADN que es neutro en cuanto a las cargas eléctricas (Gut, I. G. y Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry [Un procedimiento para una alquilación selectiva de ADN y detección mediante espectrometría de masas]. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). El acoplamiento de una marca de cargas [en inglés charge tag] a este ADN modificado da como resultado el aumento de la sensibilidad por la misma magnitud que se encontró para los péptidos. Una ventaja adicional de la marcación con cargas (en inglés "charge tagging") es la estabilidad aumentada de los análisis frente a unas impurezas, que dificultan en gran manera la detección de substratos no modificados.
Un ADN genómico se obtiene mediante métodos clásicos a partir del ADN de muestras de células, de tejidos o de otras de ensayo. Esta metodología clásica se encuentra en citas de referencia tales como las de Fritsch y Maniatis, coordinadores de edición, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [clonación molecular: un manual de Laboratorio], 1989.
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Las particularidades en común entre promotores consisten no solamente en la presencia de cajas de TATA o GC, sino también en los factores de transcripción para los que ellos poseen sitios de unión y en la distancia en que se encuentran éstos entre sí. Los sitios de unión existentes para una determinada proteína no coinciden totalmente en su secuencia, pero se encuentran secuencias conservadas de por lo menos 4 bases, que mediante la introducción de "bamboleos (en inglés wobbles)", es decir unas posiciones junto a las cuales se encuentran en cada caso diferentes bases, pueden
ser prolongadas todavía más. Además, estos sitios de unión se encuentran a determinadas distancias entre ellos.
La distribución de los ADN en la cromatina entre fases, que ocupa la mayor parte del volumen nuclear, está sujeta sin embargo a una ordenación muy especial. Así, el ADN es adherido en varios sitios a la matriz nuclear, que es una estructura filamentosa junto al lado interno de la membrana nuclear. Estas regiones se designan como regiones de unión a una matriz (del inglés matrix attachment regions = MAR) o regiones de unión a un andamio (del inglés scaffold attachment regions = SAR). La adhesión tiene una influencia esencial sobre la transcripción o respectivamente la replicación. Estos fragmentos de MAR no tienen ninguna secuencia conservativa, pero no obstante se componen en un 70% a base de A o respectivamente T, y están situados en la proximidad de regiones que actúan en cis, las cuales regulan generalmente la transcripción, y en sitios de reconocimiento por la topoisomerasa II.
Junto a promotores e intensificadores (en inglés enhancers) existen otros elementos reguladores para diferentes genes, los denominados aisladores (en inglés insulators). Estos aisladores pueden inhibir p. ej. el efecto del intensificador sobre el promotor, cuando ellos están situados entre el intensificador y el promotor, o sino están situados entre una heterocromatina y un gen, protegen al gen activo contra la influencia de la heterocromatina. Ejemplos de tales aisladores son: 1º las denominadas LCR (de locus control regions = regiones de control de locus), que se componen de varios sitios hipersensibles frente a la DNAsa (desoxirribonucleasa) I; 2º determinadas secuencias, tales como las SCS (specialized chromatin structures = estructuras de cromatina especializadaa) o respectivamente SCS', con una longitud de 350 o respectivamente 200 pb (pares de bases) y muy resistentes frente a la degradación por la DNAsa I, y flanqueadas por ambos lados por sitios hipersensibles (con una distancia en cada caso de 100 pb). Un SCS' se une a la proteína BE-AF-32. Estos aisladores pueden estar situados a ambos lados del gen.
En el documento WO 98 56952 A (de la Universidad de California del Sur) se describe un procedimiento para el diagnóstico del cáncer, que se basa en una prolongación de cebadores y en diferentes metilaciones del ADN.
Cheryl L. Paul y Susan J. Clark ("Cytosine Methylation: Quantitation by Automated Genomic Sequencing and GENESCAN^{TM} Analysis" [Metilación de citosina: cuantificación por secuenciación genómica automática y análisis con GENESCAN^{TM}], BioTechniques, 1996, volumen 21, nº 1, páginas 126-133) describen el tratamiento con un bisulfito, la amplificación por una PCR y la secuenciación de un ADN genómico.
Además, Christof M. Niemeyer y Dietmar Blohm ("DNA Microarrays" [Microconjuntos de ADN], Angewandte Chemie [Química aplicada] edición internacional, Wiley-VCH Verlag GmbH, 1999, tomo 38, nº 19, páginas 2865-2869) describen unos métodos de detección por espectrometría de masas de SNP's mediando utilización de la MALDI-MS.
El documento US 5.605.798 se describen unos procedimientos basados en una espectrometría de masas para la detección de secuencias de ácidos nucleicos.
Una misión del presente invento es la de poner a disposición un procedimiento, que sea apropiado para la simultánea detección de metilaciones de citosina y de SNP's en muestras de ADN genómico. En este caso se debe preferiblemente poder investigar al mismo tiempo un gran número de fragmentos.
El problema planteado por esta misión se resuelve conforme al invento mediante un procedimiento para la detección de 5-metilcitosina en muestras de ADN genómico, en el que se realizan las siguientes etapas:
(a)
se hace reaccionar químicamente un ADN genómico, procedente de una muestra de ADN, con un reactivo, reaccionando de manera diferente la 5-metilcitosina y la citosina, y por consiguiente éstas después de la reacción muestran un diferente comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN;
(b)
se amplifica un ADN tratado previamente, mediando utilización de una polimerasa y de por lo menos un oligonucleótido (del tipo A) como un cebador;
(c)
el ADN genómico amplificado se hibrida junto a por lo menos un oligonucleótido (del tipo B) que tiene una secuencia conocida de n nucleótidos mediando formación de un dúplex, en que los mencionados oligonucleótidos hibridados (del tipo B) se hibridan parcial o totalmente con su extremo 3' en las posiciones que han de ser investigadas en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico;
(d)
el oligonucleótido (del tipo B), siempre y cuando que se hubiera hibridado previamente con su extremo terminal en 3' sin apareamientos erróneos de bases junto a la posición que se ha de investigar, se prolonga mediante una polimerasa por lo menos por un nucleótido, llevando por lo menos un nucleótido una marcación detectable y dependiendo la prolongación del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico;
(e)
los oligonucleótidos prolongados se investigan en cuanto a la presencia de la marcación.
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Se prefiere conforme al invento que los oligonucleótidos (del tipo B) se unan a sitios definidos en una fase sólida o que los materiales amplificados se unan a sitios definidos en una fase sólida.
Se prefiere además que diferentes secuencias de oligonucleótidos se dispongan sobre una fase sólida plana en forma de un retículo rectangular o hexagonal.
Además, se prefiere conforme al invento que la superficie de la fase sólida se componga de silicio, un vidrio, un poliestireno, aluminio, un acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro.
Se prefiere también que las marcaciones colocadas junto a los nucleótidos prolongados sean identificables en cada una de las posiciones de la fase sólida, junto a las que se encuentra una secuencia de oligonucleótidos.
Se prefiere conforme al invento que, en el caso de la amplificación, por lo menos un cebador (del tipo A) esté unido a una fase sólida.
Además, se puede preferir conforme al invento que se dispongan diferentes materiales amplificados sobre la fase sólida en forma de un retículo rectangular o hexagonal.
Se prefiere muy especialmente que el tratamiento del ADN antes de la amplificación se lleve a cabo con una solución de un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito).
En particular, se prefiere conforme al invento que la amplificación se efectúe mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de Polymerase Chain Reaction).
Además, se prefiere especialmente conforme al invento que los oligonucleótidos utilizados del tipo A, o bien contengan solamente las bases T, A y C o sino las T, A y G.
Se prefiere además que las marcaciones de los nucleótidos sean marcaciones fluorescentes.
Además se prefiere conforme al invento que las marcaciones de los nucleótidos sean radionúclidos.
Se prefiere especialmente que las marcaciones de los nucleótidos sean marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas.
Además se prefiere, conforme al invento, que los oligonucleótidos prolongados se detecten en su totalidad en el espectrómetro de masas y por consiguiente estén marcados inequívocamente mediante su masa. Se prefiere especialmente también que se detecte en el espectrómetro de masas en cada caso un fragmento de los oligonucleótidos prolongados.
Se prefiere conforme al invento además que el fragmento del oligonucleótido prolongado se produzca mediante digestión con una o varias exo- o endonucleasas.
Se prefiere conforme al invento además que para la mejor capacidad de detección en el espectrómetro de masas, los fragmentos positivos tengan una carga neta individual, positiva o negativa.
Se prefiere muy especialmente, conforme al invento, que la detección de los oligonucleótidos prolongados se lleve a cabo y visualice mediante una espectrometría de masas de desorción/ionización asistida por una matriz (MALDI) o mediante una espectrometría de masas con proyección de electrones (ESI).
Además se prefiere conforme al invento un procedimiento, en el que las polimerasas son unas polimerasas de ADN estables frente al calor.
Se prefiere conforme al invento también un procedimiento, en el que además de la metilación de ADN se detecten y visualicen también los SNP's.
Se prefiere además un procedimiento, en el que los nucleótidos empleados son nucleótidos terminadores (del tipo C2) y/o prolongadores de las cadenas (del tipo C1).
Se prefiere conforme al invento además un procedimiento, en el que los nucleótidos (de los tipos C1 y C2) se escojan entre un conjunto que contiene o bien las nucleobases A, T y C o sino las bases G y A y T.
Además, se prefiere conforme al invento que la amplificación de varios tramos de ADN se lleve a cabo en un solo recipiente de reacción.
Se prefiere muy especialmente un procedimiento conforme al invento, en el que el ADN genómico se había obtenido a partir de una muestra de ADN, comprendiendo las fuentes para el ADN, p. ej., linajes celulares, sangre, un esputo, una defecación, una orina, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, portaobjetos histológicos y todas las combinaciones posibles de los mismos.
Finalmente, se prefiere conforme al invento que en un solo experimento se lleven a cabo análisis de metilaciones de las cadenas superior e inferior del ADN. La realización de los análisis se efectúa de manera preferida al mismo tiempo.
Se describe por lo tanto un procedimiento para la detección de metilcitosina en muestras de ADN genómico:
El método implica la amplificación, la hibridación y la reacción de prolongación de un ADN completo o de un fragmento del mismo. El método se puede usar para la detección de metilcitosinas y también al mismo tiempo de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP's) y mutaciones.
El ADN genómico que se ha de analizar es obtenido preferiblemente a partir de fuentes usuales para un ADN, tales como p. ej. linajes celulares, sangre, un esputo, una defecación, una orina, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, portaobjetos histológicos y todas las combinaciones posibles de los mismos.
En una primera etapa del procedimiento, el ADN empleado se trata de manera preferente con un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito) o sino con otro compuesto químico, de tal manera que todas las bases de citosina, que no están metiladas en la posición 5 de la respectiva base, sean modificadas de tal manera que resulte una base distinta en lo que se refiere al comportamiento de apareamiento de bases, mientras que las citosinas, que están metiladas en la posición 5, permanecen inalteradas. Si se utiliza un bisulfito, junto a las bases de citosina que no están metiladas tiene lugar una reacción por adición. La subsiguiente hidrólisis en condiciones alcalinas conduce entonces a la transformación en uracilo de las nucleobases de citosina que no están metiladas.
En la segunda etapa del procedimiento, el ADN previamente tratado es amplificado de manera preferida mediando utilización de una polimerasa estable frente al calor y de por lo menos un cebador (del tipo A).
En una variante especialmente preferida del procedimiento, la amplificación se lleva a cabo con cebadores del tipo A mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En una variante preferida del procedimiento, la amplificación de varios fragmentos de ADN se lleva a cabo en un solo recipiente de reacción. Ésta puede ser o bien una denominada PCR múltiplex, en la que diferentes cebadores generan en cada caso fragmentos definidos. Se llevan a cabo diferentes amplificaciones definidas en un solo recipiente de reacción. En otra variante especialmente preferida del procedimiento, unos cebadores amplifican de una manera deliberada y reproducible en cada caso a varios fragmentos. Esto se puede conseguir o bien mediante el recurso de que ellos se unen por ejemplo a elementos repetitivos en el genoma. En una variante especialmente preferida del procedimiento, los cebadores se unen a unos sitios de unión a factores de transcripción (del inglés transcription factor binding sites), a unos promotores o a otros elementos reguladores en genes. En una variante especialmente preferida del procedimiento, la amplificación tiene lugar mediante una prolongación de cebadores, que están unidos a una fase sólida. Una PCR múltiplex en su sentido más amplio se puede realizar mediante el hecho de que diferentes cebadores están unidos a diferentes sitios definidos de una fase sólida.
En una variante a su vez preferida de la segunda etapa del procedimiento, la fase sólida es plana, estando dispuestas las diferentes secuencias de oligonucleótidos en forma de un retículo rectangular o hexagonal. Esto tiene como consecuencia la de que también los diferentes materiales amplificados están dispuestos sobre la fase sólida en forma de un retículo rectangular o hexagonal. Como ya se ha descrito más arriba, en este caso varios materiales amplificados se producen directamente sobre la fase sólida.
La superficie de la fase sólida se compone de manera preferente de silicio, un vidrio, un poliestireno, aluminio, un acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro.
En una variante especialmente preferida del procedimiento, los oligonucleótidos del tipo A contienen o bien solamente las bases T, A y C, o solamente las bases T, A y G.
En la tercera etapa del procedimiento, el ADN genómico amplificado es hibridado con por lo menos un cebador (del tipo B) mediando formación de un dúplex. Los oligonucleótidos hibridados del tipo B se unen en cada caso en su extremo 3' a las posiciones, que se han de investigar en lo que se refiere a su metilación en la muestra de ADN genómico. En este caso se puede diferenciar entre dos casos: o bien la secuencia que se ha de investigar es totalmente complementaria también en su extremo 3' con respecto al cebador, en este caso es posible una prolongación del cebador en la siguiente etapa en una reacción de polimerasa, o sino la secuencia no es totalmente complementaria con respecto a la del cebador en el extremo 3', en este caso no puede efectuarse ninguna prolongación del cebador. Si se ha de investigar una determinada posición CpG en cuanto a su metilación, existen entonces dos estados posibles. Después del tratamiento químico previo, preferiblemente con un bisulfito, resulta en el caso de una metilación una CG, en el caso de la presencia de una citosina no metilada una UG, o respectivamente después de la amplificación una TG. De manera preferida, el experimento se lleva a cabo en este caso con dos diferentes cebadores, los cuales en cada caso proporcionan una complementariedad total para uno de los estados y por consiguiente la posibilidad de la prolongación de la cadena cada vez en uno de los dos casos posibles.
Si los materiales amplificados no están ya unidos a una fase sólida, entonces los oligonucleótidos hibridados con los materiales amplificados pueden estar unidos con su extremo 5' o junto a otra base distinta o a través de su entramado con una fase sólida, pero no a través de su extremo 3'. De manera preferida una unión se efectúa a través del extremo 5'. En una variante preferida, la fase sólida es plana, estando dispuestas las diferentes secuencias de oligonucleótidos (del tipo B) en forma de un retículo rectangular o hexagonal.
La superficie de la fase sólida se compone preferiblemente de silicio, un vidrio, un poliestireno, aluminio, un acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro.
En la cuarta etapa del procedimiento, el oligonucleótido resultante es prolongado con una polimerasa estable frente al calor en por lo menos uno hasta como máximo diez nucleótidos, llevando por lo menos uno de los nucleótidos una marcación detectable. El modo de realizarse la prolongación depende en tal caso del estado de metilación de la respectiva citosina en la muestra de ADN genómico, o sino también de los SNP's, de las mutaciones puntuales, o de las supresiones, inserciones e inversiones eventualmente presente.
En principio, se necesitan solamente unos oligonucleótidos terminadores (del tipo C2). Según sea la secuencia, sin embargo, se pueden utilizar también oligonucleótidos prolongadores de las cadenas, siempre y cuando que esto sea posible en el respectivo contexto de la secuencia.
En una variante preferida del procedimiento, los nucleótidos empleados son nucleótidos terminadores (del tipo C2) y/o prolongadores de las cadenas (del tipo C1). En una variante especialmente preferida del procedimiento, las nucleobases del tipo C1 y/o del tipo C2 se seleccionan entre un conjunto, que contiene las bases T, A y C o sino las bases T, A, y G.
La marcación de los oligonucleótidos prolongados del tipo B se efectúa de manera preferente a través de colorantes absorbentes y/o a través de una quimioluminiscencia y/o a través de isótopos radiactivos y/o a través de marcaciones fluorescentes, que se introducen a través de los nucleótidos añadidos en la cuarta etapa del procedimiento. Se prefiere asimismo la marcación a través de la masa molecular del oligonucleótido prolongado. Preferiblemente, el marcador fluorescente es introducido por medio de un nucleótido marcado con fluorescencia, tal como p. ej. un Cy5-dCTP.
En la quinta etapa del procedimiento, los oligonucleótidos prolongados son investigados en cuanto a la presencia de una marcación. Si se utiliza una fase sólida plana, entonces se efectúa un análisis en cada uno de los sitios sobre la fase sólida, junto a la que originalmente se había inmovilizado un oligonucleótido.
En una variante especialmente preferida del procedimiento, la detección de los oligonucleótidos prolongados se efectúa por medio de su fluorescencia.
En una variante preferida del procedimiento, se producen fragmentos del oligonucleótido prolongado mediante una digestión con una o varias exo- o endonucleasas.
En una variante especialmente preferida del procedimiento, las marcaciones de los nucleótidos son marcaciones de masas desprendibles, que son detectables en un espectrómetro de masas.
Las marcaciones de masas desprendibles, los oligonucleótidos prolongados en su totalidad, o fragmentos de los mismos, se detectan y visualizan, en una variante especialmente preferida del procedimiento, mediante una espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI-MS) o mediante una espectrometría de masas con proyección de electrones (ESI), con ayuda de su masa inequívoca.
De manera preferida, los fragmentos detectados en el espectrómetro de masas tienen una carga neta individual, positiva o negativa.
En una variante especialmente preferida del procedimiento, se analizan los SNP's (del inglés Single Nucleotide Polymorphisms = polimorfismos de nucleótidos únicos) y las metilaciones de citosina en un solo experimento.
En una variante especialmente preferida del procedimiento, las cadenas superior e inferior de la muestra de ADN se analizan, después del tratamiento químico previo, en un solo experimento, con el fin de asegurar un control experimental interno.
Otro objeto del invento es un estuche, que contiene los productos químicos y los agentes auxiliares para la realización de la reacción del bisulfito y/o de la amplificación, de la hibridación, de la reacción de prolongación y/o de las polimerasas, y/o que contiene la documentación para realizar el procedimiento.
Los siguientes Ejemplos explican el invento:
Ejemplo 1
El siguiente Ejemplo se refiere a un fragmento del exón 23 del gen del factor VIII, en el que se ha de investigar una determinada posición CG en cuanto a la metilación.
En la primera etapa, el fragmento es amplificado mediante cebadores del tipo A y ciertamente mediante AT
TATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No.: 1) y ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No.: 2). El ADN amplificado es hibridado con un oligonucleótido del tipo B (por ejemplo el GTTG
GATGTTGTTGAGAAACG (SEQ-ID No.: 3)) y en una reacción de polimerasa es prolongado con un 2',3'-didesoxitimidina-trifosfato marcado (del tipo C2). Solamente cuando se ha presentado una CG, es decir, en la muestra de ADN genómico original, una citosina metilada, puede efectuarse esta prolongación, puesto que en caso contrario un apareamiento erróneo junto al extremo 3' del cebador impide la reacción de la polimerasa. Por consiguiente, el estado de metilación de la respectiva citosina que se ha de investigar decide acerca de la prolongación del cebador.
Para el control, se puede llevar a cabo la reacción con el cebador GTTGGATGTTGTTGAGAAATG (SEQ-ID No.: 4). En este caso, la prolongación tiene lugar solamente cuando en la muestra de ADN que se ha de investigar se ha dispuesto previamente en la posición mencionada una citosina sin metilar. Las marcas pueden ser por ejemplo colorantes absorbentes, tales como Megaprime^{TM} para el ddTTP o Rediprime 11^{TM}.
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Ejemplo 2
El siguiente Ejemplo se refiere a un fragmento del exón 23 del gen del factor VIII, en el que se ha de investigar una determinada posición CG en cuanto a la metilación.
En la primera etapa, el fragmento es amplificado mediante cebadores del tipo A y ciertamente mediante AT
TATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No.: 1) y ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No.: 2). El ADN amplificado es hibridado con un oligonucleótido del tipo B (por ejemplo el GTTG
GATGTTGTTGAGAAACG (SEQ-ID No.: 3)), que está inmovilizado con su extremo 5' junto a una superficie de fase sólida, y en una reacción de polimerasa es prolongado con un 2',3'-didesoxitimidina-trifosfato marcado (del tipo C2). Solamente cuando se ha presentado una CG, es decir, en la muestra de ADN genómico original, una citosina metilada, puede efectuarse esta prolongación, puesto que en caso contrario un apareamiento erróneo junto al extremo 3' del cebador impide la reacción de la polimerasa. Por consiguiente, el estado de metilación de la respectiva citosina que se ha de investigar decide acerca de la prolongación del cebador.
Para el control, se puede llevar a cabo la reacción con el cebador GTTGGATGTTGTTGAGAAATG (SEQ-ID No.: 4). En este caso, la prolongación tiene lugar solamente cuando en la muestra de ADN que se ha de investigar se ha dispuesto previamente en la posición mencionada una citosina sin metilar. Las marcas pueden ser por ejemplo colorantes absorbentes, tales como Megaprime^{TM} para el ddTTP o Rediprime 11^{TM}.
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Ejemplo 3
El siguiente Ejemplo se refiere a un fragmento del exón 23 del gen del factor VIII, en el que se ha de investigar una determinada posición CG en cuanto a la metilación.
En la primera etapa, el fragmento es amplificado mediante cebadores del tipo A y ciertamente mediante AT
TATGTTGGAGTAGTAGAGTTTAAATGGTT (SEQ-ID No.: 1) y ACTTAACACTTACTATTTAAATCACAACCCAT (SEQ-ID No.: 2). Para esta amplificación, un ADN tratado con un bisulfito se incubó durante 5 min a 96ºC y luego se desnaturalizó en 40 ciclos en cada caso durante 55 segundos (s) a 96ºC, se incubó durante 75 s a 61,7ºC (reanillamiento) y se incubó durante 100 s a 72ºC (elongación). En una subsiguiente reacción (prolongación final), la tanda de reacción se incuba durante 15 min a 72ºC. El ADN amplificado es hibridado con los oligonucleótidos AAAAACTA
CAAAAACTCT (SEQ-ID No.: 5) (mancha 1 en la Fig. 1) y AAAAACTACGAAAACTCT (SEQ-ID No.: 6) (mancha 2 en la Fig. 1), que están inmovilizados junto a una fase sólida. Para la reacción de prolongación se necesitan un 2'-desoxitimidina-trifosfato (dTTP, como tipo C1), un 2'-desoxiguanosina-trifosfato (dGTP, como tipo C1), un 2'-desoxiadenosina-trifosfato (dATP, como tipo C1), y un 2'-desoxicitidina-trifosfato (dCTP, como tipo C1), añadiéndose adicionalmente un 2'-desoxicitidina- trifosfato marcado con fluorescencia en la relación de 3:1 (referida al 2'-desoxicitidina-trifosfato no marcado). La tanda de reacción, que se compone del material amplificado, de la mezcla de desoxinucleótidos y de un 10xtampón, se incuba durante 15 min a 96ºC. Para la subsiguiente reacción de prolongación con cebadores, se añade una polimerasa de ADN, aquí un fragmento de Klenow, y la mezcla de reacción se incuba durante una noche a 37ºC sobre la fase sólida. Tal como se puede reconocer en la siguiente figura, la prolongación de cebadores que se ha realizado, permite sacar conclusiones acerca del estado de metilación del ADN. Una comparación de la mancha 1 y de la mancha 2, como se representa en la Fig. 1, permite dar una información acerca del estado de metilación: en el presente caso, mediante la intensidad de la señal de la mancha 1, se detecta una CpG no metilada.
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<110> Epigenomics AG
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<120> Procedimiento para la detección de la metilación de citosina en muestras de ADN
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<130> E01-1179-WO
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<140>
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<141>
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<160> 6
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<170> versión PatentIn 2.1
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<210> 1
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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<400> 1
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attatgttgg agtagtagag tttaaatggt t 
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31 
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<210> 2
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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acttaacact tactatttaa atcacaaccc at 
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32 
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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gttggatgtt gttgagaaac g 
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21 
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<210> 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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gttggatgtt gttgagaaat g 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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aaaaactaca aaaactct 
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido
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aaaaactacg aaaactct 
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18

Claims (24)

1. Procedimiento para la detección de 5-metilcitosina o para la detección de 5-metilcitosina y de SNP's en muestras de ADN genómico, caracterizado porque se realizan las siguientes etapas:
(a)
se hace reaccionar químicamente un ADN genómico, procedente de una muestra de ADN, con un reactivo, reaccionando de manera diferente la 5-metilcitosina y la citosina, y por consiguiente éstas, después de la reacción, muestran un diferente comportamiento de apareamiento de bases en el dúplex de ADN;
(b)
se amplifica un ADN tratado previamente mediando utilización de una polimerasa y de por lo menos un cebador oligonucleótido;
(c)
se hibrida el ADN genómico amplificado, en condiciones rigurosas, con por lo menos un oligonucleótido que tiene una secuencia conocida, llegándose o bien a un apareamiento erróneo o a ningún apareamiento erróneo por lo menos entre una base en la región de 3' del oligonucleótido y la base que se ha de investigar en el ADN;
(d)
los oligonucleótidos, que en la región de 3' no tienen ningún apareamiento erróneo con la base que se ha de investigar en el ADN, se prolongan mediante una polimerasa por lo menos por un nucleótido, llevando por lo menos un nucleótido una marcación detectable, mientras que los oligonucleótidos, que en la región de 3' tienen un apareamiento erróneo con la base que se ha de investigar, no se prolongan;
(e)
los oligonucleótidos prolongados se investigan en cuanto a la presencia de la marcación.
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2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido o los oligonucleótidos de acuerdo con la reivindicación 1 c se unen en sitios definidos a una fase sólida.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los materiales amplificados se unen en sitios definidos a una fase sólida.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque diferentes oligonucleótidos se disponen sobre una fase sólida plana en forma de un retículo rectangular o hexagonal.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque la superficie de la fase sólida se compone de silicio, un vidrio, un poliestireno, aluminio, un acero, hierro, cobre, níquel, plata u oro.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque las marcaciones colocadas junto a los oligonucleótidos prolongados son identificables en cada una de las posiciones de la fase sólida, junto a las que se encuentra una secuencia de oligonucleótidos.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en el caso de la amplificación, un cebador, que no es idéntico al oligonucleótido de la reivindicación 1 b, se une en sitios definidos a una fase sólida.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, 3 o 7, caracterizado porque diferentes materiales amplificados se disponen sobre la fase sólida en forma de un retículo rectangular o hexagonal.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el tratamiento del ADN antes de la amplificación se lleva a cabo con una solución de un bisulfito (= disulfito, hidrógeno-sulfito).
10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la amplificación se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los oligonucleótidos utilizados en la reivindicación 1, y especificados en la reivindicación 7, contienen o bien solamente las bases T, A y C o sino las bases T, A, G.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las marcaciones de los nucleótidos son marcaciones fluorescentes.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las marcaciones de los nucleótidos son radionúclidos.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las marcaciones de los nucleótidos son marcaciones de masas desprendibles, que se detectan en un espectrómetro de masas.
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15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque los oligonucleótidos prolongados en su totalidad se detectan en el espectrómetro de masas y por consiguiente están marcados inequívocamente por su masa.
16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque en cada caso un fragmento de los oligonucleótidos prolongados se detecta en el espectrómetro de masas.
17. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque para la mejor capacidad de detección en un espectrómetro de masas, los fragmentos producidos tienen una carga neta individual, positiva o negativa.
18. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la detección de los oligonucleótidos prolongados se efectúa mediante una espectrometría de masas de desorción/ ionización asistida por una matriz (MALDI) o mediante una espectrometría de masas con proyección de electrones (ESI).
19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que las polimerasas son unas polimerasas de ADN estables frente al calor.
20. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que detectan y visualizan, además de la metilación de ADN, también los SNP's.
21. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que los nucleótidos empleados son unos nucleótidos terminadores y/o prolongadores de las cadenas.
22. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que los nucleótidos se seleccionan a partir de un conjunto que contiene o bien las nucleobases A, T y C o sino las bases G y A y T.
23. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ADN genómico se había obtenido a partir de una muestra de ADN, comprendiendo las fuentes para los ADN p. ej. linajes celulares, sangre, un esputo, una defecación, una orina, un líquido cefalorraquídeo, un tejido embebido en parafina, portaobjetos histológicos y todas las posibles combinaciones de ellos.
24. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se llevan a cabo de una manera simultánea unos análisis de la metilación de ambas cadenas de ADN en un solo experimento.
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