ES2301539T3 - Control de la dehiscencia de la fruta en arabidopsis por genes indehiscentes 1. - Google Patents

Control de la dehiscencia de la fruta en arabidopsis por genes indehiscentes 1. Download PDF

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Abstract

Cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos IND1, o un complemento de la misma, que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a la SEC ID No: 2.

Description

Control de la dehiscencia de la fruta en Arabidopsis por genes indehiscentes 1.
Declaración con respecto a los derechos de las invenciones realizadas bajo la investigación y el desarrollo con apoyo federal.
La presente invención se realizó con el apoyo del Gobierno bajo el número de la National Science Foundation Grant IBN-9985530. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la presente invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la ingeniería genética de plantas. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos y composiciones que modulan la dehiscencia de los frutos en plantas.
Antecedentes de la invención
La semilla de colza es uno de los cultivos de semillas oleaginosas después de la soja y la semilla del algodón, representando el 10% de la producción mundial de semillas oleaginosas en 1990. La semilla de colza contiene un 40% de aceite, que se prensa a partir de la semilla, dejando una masa de semilla elevada en proteínas de valor para la alimentación de animales y fertilizante con nitrógeno. El aceite de la semilla de colza, también conocido como aceite de canola, es un producto valioso, que representa el cuarto aceite vegetal más habitualmente comercializado en el mundo.
Desafortunadamente, el rendimiento de la semilla del aceite de colza y plantas relacionadas está limitado por la dehiscencia de las vainas, que es un proceso que aparece de forma tardía en el desarrollo del fruto, mediante el cual la vaina se abre y se liberan las semillas encerradas. La degradación y la separación de las paredes celulares a lo largo de una capa discreta de células dividiendo las dos mitades de la vaina, denominadas la "zona de dehiscencia", dan lugar a la separación de las dos mitades de la vaina y la liberación de las semillas contenidas. La zona de dehiscencia es una región de sólo una a tres células de anchura que se extiende a lo largo a la longitud completa del límite válvula/replum (Meakin y Roberts, J. Exp. Botany 41: 995-1002 (1990)). A medida que las células en la zona de dehiscencia se separan entre sí, las válvulas se separan del replum, permitiendo la dispersión de las semillas. El "desgrane" de las semillas, mediante el cual las semillas son despojadas prematuramente a través de la dehiscencia antes de poder recoger la cosecha, es un problema significativo afrontado por los productores de semillas comerciales y representa una pérdida de ingresos en la industria. Las condiciones climatológicas adversas exacerban el proceso de dehiscencia, dando lugar a más de un 50% en la pérdida de rendimiento de las semillas.
El fruto, una estructura compleja única de las plantas que florecen, media en la maduración y dispersión de las semillas. En la mayoría de las plantas que florecen el fruto consiste en el pericarpio, que deriva de la pared del ovario, y las semillas, que se desarrollan a partir de óvulos fertilizados. La Arabidopsis, que es la habitual de más de 3000 especies de Brasssicaceae, produce un fruto en el que las dos válculas de carpelo (paredes del ovario) se unen al replum, una sutura visible que divide los dos carpelos.
La hormona etileno de las plantas se produce mediante el desarrollo de semillas y parece ser un importante regulador del proceso de dehiscencia. Una línea de evidencia que soporta un papel para el etileno en la regulación de la dehiscencia proviene de estudios de maduración de los frutos, que, como la dehiscencia de los frutos, es un proceso que implica la rotura de la materia de la pared celular. En la maduración del fruto, el etileno actúa en parte mediante la activación de las enzimas que degradan la pared celular, tales como poligalacturonasa (Theologis et al., Develop. Genetics 14: 282-295 (1993)). Además, en plantas de tomate modificadas genéticamente en que se bloquea la respuesta del etileno, tales como plantas transgénicas de tomate que expresan poligalacturonasa antisentido, existe un retraso significativo en la maduración del fruto (Lanahan et al., The Plant Cell 6: 521-530 (1994); Smith et al., Nature 334: 724-726 (1988)).
En la dehiscencia, cambios estructurales que culminan en la degradación de la lamela media de las paredes celulares de la zona de dehiscencia debilitan las vainas de las semillas de colza y finalmente conducen al desgrane de la vaina. Como en la maduración del fruto, las enzimas hidrolíticas incluyendo las poligalacturonasas juegan un papel en esta rotura programada. Por ejemplo, en la colza oleaginosa, una endopoligalacturonasa específica, RDPG1, se sobrerregula y se expresa exclusivamente en la zona de dehiscencia de forma tardía en el desarrolla de las vaínas (Petersen et al., Plant Mol. Biol. 31: 517-527 (1996), que se incorpora en la presente por referencia). El etileno puede regular la actividad de enzimas hidrolíticas implicadas en el proceso de dehiscencia al igual que en la maduración del fruto (Meakin y Roberts, J. Exp. Botany 41: 1003-1011 (1990), que se incorpora en la presente por referencia). Sin embargo, hasta ahora, las proteínas que controlan el proceso de dehiscencia, tales como las que regulan las enzimas hidrolíticas pertinentes, no han sido identificadas.
Los intentos para resolver el problema del desgrane de la vaina y la dehiscencia prematura del fruto durante los últimos 20 años se han centrado en la reproducción de variedades resistentes al desgrane. Sin embargo, estos híbridos de plantas son frecuentemente estériles y pierden las características favorables que se deben recuperar mediante retrocruzamiento, que consume tiempo y es laborioso. Otras estrategias para paliar el desgrane de las vainas incluyen el uso de productos químicos, tales como sellantes de vainas o técnicas mecánicas, tales como la envoltura para reducir el desgrane estimulado por el viento. Hasta la fecha, sin embargo, no se ha descrito un procedimiento sencillo para producir plantas modificadas genéticamente que no se abran y liberen sus semillas de manera prematura.
De este modo, existe la necesidad para identificar genes que regulen el proceso de dehiscencia y para desarrollar genéticamente variedades de plantas modificadas en las que se retrasa el proceso natural de dispersión de las semillas. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también ventajas relacionadas.
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Descripción resumida de la invención
La presente invención proporciona una cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos IND1, o complemento de la misma, que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a la SEC ID No: 1. El cassette de expresión, por ejemplo, puede comprender un polinucleótido que codifica la SEC ID No: 2. En otra realización, el cassette de expresión, por ejemplo, puede comprender las posiciones desde aproximadamente 2765 hasta aproximadamente 3361 de la SEC ID No: 1. Por ejemplo, el cassette de expresión puede comprender la SEC ID No: 1. En algunas realizaciones, el cassette de expresión comprende un promotor. El promotor, por ejemplo, puede ser constitutivo o específico de tejido. En un aspecto de la presente invención, el promotor es un promotor específico de la zona de dehiscencia. En otro aspecto, el promotor puede comprender las posiciones desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2764 o las posiciones desde aproximadamente 3362 hasta aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1.
La presente invención también proporciona una planta que comprende un cassette de expresión recombinante que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a la SEC ID No: 1. En un aspecto, la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1 está unida operativamente al promotor en la orientación antisentido. En otro aspecto, la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1 está unida operativamente al promotor en la orientación de sentido. La secuencia de polinucleótidos puede comprender además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1, donde la segunda secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a un segundo promotor en la orientación antisentido. En algunas realizaciones, la planta de la invención ha reducido la lignificación en células del margen de las válvulas. En otras realizaciones, el promotor es un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia. En algunas de estas realizaciones, el elemento regulador comprende las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1.
La presente invención también proporciona un procedimiento de retraso de la dehiscencia del fruto en una planta que comprende la supresión de la expresión de un ácido nucleico de IND1 en la planta mediante la introducción en la planta de un cassette de expresión recombinante que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos en un 70% a la SEC ID No: 2. En algunas realizaciones, el polipéptido IND1 es la SEC ID No: 2. En otras realizaciones, el polinucleótido IND1 comprende las posiciones desde aproximadamente 2765 hasta aproximadamente 3361 de la SEC ID No: 1. En un aspecto de la presente invención, el polinucleótido IND1 comprende la SEC ID No: 1. El procedimiento puede incluir una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1 unido operativamente al promotor en la orientación antisentido. En otra realización, el promotor está unido al promotor en la orientación de sentido. La secuencia de polinucleótidos puede comprender además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1, donde la segunda secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a un segundo promotor en la orientación antisentida. En algunas realizaciones, el procedimiento da lugar a una planta con una lignificación reducida en las células del margen de las válvulas. En otras realizaciones, el promotor es un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia. En algunas de estas realizaciones, el elemento regulador comprende las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1. En un aspecto, el cassette de expresión recombinante se introduce en la planta con Agrobacterium.
La presente invención también proporciona un procedimiento de retraso de la dehiscencia del fruto en una planta que comprende la supresión de la expresión de un gen de IND1 en la planta mediante la introducción en la planta de un cassette de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% con las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1. En un aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótidos comprende las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1. En algunos aspectos, la lignificación se reduce en las células del margen de las válvulas.
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Definiciones
La expresión "ácido nucleico" se refiere a un polímero de cadena única o doble cadena de bases de desoxiribonucleótido o ribonucleótido leído desde el extremo 5' al extremo 3'. Los ácidos nucleicos también pueden incluir nucleótidos modificados que permiten la lectura correcta a través de una polimerasa y no alteran la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico.
La expresión "secuencia de polinucleótidos" o "secuencia de ácidos nucleicos" incluye las cadenas de sentido y antisentido de un ácido nucleico como cadenas únicas individuales o en dobles cadenas. Incluye, pero no se limita a, plásmidos autoreplicantes, secuencias cromosómicas y polímeros infecciosos de ADN o ARN.
La expresión "secuencia de ácido nucleico que codifica" se refiere a un ácido nucleico que dirige la expresión de una proteína o péptido específico. Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen tanto la secuencia de cadena de ADN que se transcribe en ARN y la secuencia de ARN que se traduce en proteína. Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen las secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa, así como las secuencias que no son de longitud completa derivadas de las secuencias de longitud completa. Debería entenderse además que la secuencia incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas que se pueden introducir para proporcionar una preferencia de codón en una célula huésped específica.
El término "promotor" o "elemento regulador" se refiere a una región o secuencia determinantes localizadas en dirección 5' o dirección 3' desde el inicio de la transcripción y que están implicadas en el reconocimiento y unión de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Dichos promotores no necesitan tener un origen vegetal, por ejemplo, se pueden utilizar en la presente invención promotores derivados de virus de plantas, tales como el promotor CaMV35S.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está unida operativamente a una molécula de ácido nucleico, confiere una expresión selectiva sobre la molécula de ácido nucleico unida operativamente en un número limitado de tejidos vegetales, incluyendo el margen de las válvulas o zona de dehiscencia. El margen de las válvulas es el futuro sitio de la zona de dehiscencia y comprende los márgenes del replum externo, así como las células de las válvulas adyacentes al replum externo. La zona de dehiscencia, que se desarrolla en la región del margen de las válvulas, se refiere al grupo de células que se separan durante el proceso de dehiscencia, permitiendo que las válvulas se separen del replum y las semillas atrapadas se liberen. De este modo, un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia, tal como se define en la presente invención, confiere una expresión selectiva en la zona de dehiscencia madura, o confiere una expresión selectiva en el margen de las válvulas, que marca el futuro sitio de la zona de dehiscen-
cia.
Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia puede conferir una expresión específica exclusivamente en células del margen de las válvulas o zona de dehiscencia o puede conferir una expresión selectiva en un número limitado de células vegetales tipos incluyendo las células del margen de las válvulas o zona de dehiscencia. Un elemento regulador SHATTERPROOF1 o SHATTERPROOF2 (SHP1 y SHP2, también denominados como AGL1 y AGL5, respectivamente), por ejemplo, que confiere una expresión selectiva en óvulos y la placenta, así como en la zona de dehiscencia, es un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia tal como se define en la presente invención. De manera similar, un elemento regulador de IND1 también confiere una expresión selectiva en la zona de dehiscencia. Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia generalmente se distingue de otros elementos reguladores confiriendo una expresión selectiva en el margen de las válvulas o la zona de dehiscencia sin conferir expresión a través de las válvulas de carpelo adyacentes.
Se entiende que se pueden realizar modificaciones limitadas sin destruir la función biológica de un elemento regulador y que dichas modificaciones limitadas pueden dar lugar a elementos reguladores selectivos de la zona de dehiscencia que tienen una función sustancialmente equivalente o mejorada en comparación con un elemento regulador de IND1 de tipo natural. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida de sitio, o pueden ser accidentales, como a través de la mutación en huéspedes que albergan el elemento regulador. Todas estas secuencias de nucleótidos modificadas están incluidas en la definición de un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia siempre y cuando la capacidad para conferir una expresión selectiva en el margen de las válvulas o la zona de dehiscencia se mantenga sustancialmente.
El término "planta" incluye plantas completas, órganos/estructuras vegetativas de un brote (por ejemplo, hojas, tallos, y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semilla (incluyendo embriones, endospermas y recubrimiento de semilla) y fruto (el ovario maduro), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental y similares) y células (por ejemplo, células de guarda, óvulos, tricomas y similares), y la progenie de los mismos. La clase de plantas que se pueden utilizar en procedimiento de la presente invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores e inferiores susceptibles para técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocoltilédoneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos y algas multicelulares. Incluye plantas de una variedad de niveles de ploidía, incluyendo aneuploide, poliploide, diploide, haploide y hemicigótico.
El término "planta con semilla" significa angiosperma o gimnosperma. Una angiosperma es una planta portadora de semillas, las cuales se transportan en un ovario maduro (fruto). Una angiosperma se reconoce habitualmente como una planta que florece. Las angiospermas se dividen en dos clases ampliar en base al número de cotiledóneas, que son las hojas de semilla que generalmente almacenan o absorben comida. De este modo, una angiosperma monocotiledónea es una angiosperma que tiene una única cotiledónea, mientras que una angiosperma dicotiledónea es una angiosperma que tiene dos cotiledóneas. Se conoce una serie de angiospermas que incluyen, por ejemplo, plantas de colza, plantas leguminosas, plantas con fruto, flores ornamentales, plantas de cereales y árboles de madera noble, cuyas clases generales no son necesariamente exclusivas. El técnico en la materia entenderá que los procedimientos de la presente invención se pueden poner en práctica estas u otras angiospermas, según se desee. Una gimnosperma es una planta portadora de semillas con semillas no incluidas en un ovario.
La expresión "célula huésped" se refiere a una célula de cualquier organismo. Las células huésped preferidas derivan de plantas, bacterias, levaduras, hongos, insectos u otros animales. Los procedimientos para introducir secuencias de polinucleótidos en varios tipos de células huésped son bien conocidos en la técnica.
El término "retrasado", tal y como se utiliza en la presente invención en referencia al tiempo para la dispersión de las semillas en un fruto producido por una planta no natural de la invención, significa un tiempo significativamente posterior de la dispersión de las semillas en comparación con el tiempo en que las semillas se dispersan normalmente de una planta correspondiente en la misma etapa de desarrollo que expresa niveles naturales de IND1. De este modo, el término "retrasado" se utiliza ampliamente para comprender tanto la dispersión de las semillas que se postpone significativamente en comparación con la dispersión de las semillas en una planta correspondiente, como cuando la dispersión de las semillas está totalmente descartada, de manera que los frutos nunca liberan sus semillas a menos que exista intervención humana o cualquier otro tipo de intervención.
Se entiende que puede haber una variación natural del tiempo de dispersión de las semillas en una especie o variedad de planta. Sin embargo, un "retraso" en el tiempo de la dispersión de las semillas en una planta no natural de la presente invención se puede identificar fácilmente mediante el muestreo de una población de las plantas no naturales y la determinación de que la distribución normal de los tiempos de dispersión de las semillas son significativamente posteriores, de promedio, que la distribución normal de los tiempos de dispersión de las semillas en una población de la especie o variedad de planta correspondiente que no contiene un polinucleótido IND1 exógeno. De este modo, la producción de plantas no naturales de la presente invención proporciona un medio para variar la distribución normal del tiempo de dispersión de las semillas de la polinización, de manera que las semillas se dispersan, de promedio, por lo menos aproximadamente un 1%, 2%, 5%, 10%, 30%, 50%, 100%, 200% ó 500% más tarde que la especie de planta correspondiente que no contiene una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un producto génico de IND1.
El término "suprimido" o "disminuido" comprende la ausencia de proteína IND1 en una planta, así como la expresión de la proteína que está presente, pero reducida, en comparación con el nivel de expresión de proteína IND1 en una planta de tipo natural. Además, el término "suprimido" se refiere a la expresión de la proteína IND1 que se reduce a través del dominio completo de la expresión de IND1 o a la expresión que se reduce en alguna parte del dominio de expresión de IND1, con la condición de que la plamta resultante esté caracterizada por una dispersión de las semillas retardada. El término "suprimido" también comprende una cantidad de proteína IND1 que es equivalente a la expresión de IND1 de tipo natural, pero donde la proteína IND1 tiene un nivel de actividad reducido. Tal como se ha descrito anteriormente, cada IND1 contiene un dominio HLH conservado y básico; mutaciones puntuales o deleciones masivas con el dominio HLH que reducen la actividad de unión a ADN de IND1 pueden reducir o destruir la actividad de IND y, por lo tanto, "suprimir" la expresión de IND1 tal como se define en la presente invención. Un experto en la materia entenderá que, preferiblemente, la expresión de IND1 está esencialmente ausente en el margen de las válvulas de una planta o la proteína IND1 es esencialmente no funcional.
Una actividad o expresión de IND1 "incrementada" o "aumentada" de un gen IND1 se refiere a un cambio por aumento en la actividad de IND1. Entre los ejemplos de dicha actividad o expresión incrementada se incluyen los siguientes: actividad o expresión de IND1 del gen IND1 se incrementa por encima del nivel plantas de control no transgénicas de tipo natural (es decir, aumenta la cantidad de actividad o expresión de IND1 del gen IND1). La actividad o expresión de IND1 del gen IND1 es un órgano, tejido o célula donde no se detecta normalmente en plantas de control no transgénicas de tipo natural (es decir, aumenta la distribución espacial de la actividad o expresión de IND1 del gen IND1. La actividad o expresión de IND1 se incrementa cuando la actividad o expresión de IND1 del gen IND1 está presente en un órgano, tejido o célula durante un periodo már largo que en plantas de control no transgénicas de tipo natural (es decir, aumenta la duración de la actividad o expresión de IND1 del gen IND1).
Una secuencia de polinucleótidos es "heteróloga a" una segunda secuencia de polinucleótidos si se origina a partir de una especie foránea, o, si se origina a partir de la misma especie, es modificada por la acción humana a partir de su forma original. Por ejemplo, un promotor unido operativamente a una secuencia codificante heteróloga se refiere a una secuencia codificante de una especie diferente de aquella de la que deriva el promotor, o, si se origina de la misma especie, una secuencia codificante que es diferente de cualquier variante alélica natural.
Un polinucleótido "exógeno a" una planta individual es un polinucleótido que se introduce en la planta, o una generación predecesora de la planta, mediante cualquier medio diferente del cruzamiento sexual. Una molécula de ácido nucleico exógena puede tener una secuencia de nucleótidos natural o no natural y puede ser una molécula de ácido nucleico heteróloga derivada de especies de plantas diferentes de la planta en la que se introduce la molécula de ácido nucleico o puede ser una molécula de ácido nucleico derivada de la misma especie de planta que la planta en la que se introduce. A continuación se describen ejemplos de medios mediante los cuales esto se puede llevar a cabo e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, métodos biolísticos, electroporación, técnicas en plantas, y similares.
Un "polinucleótido IND1" es una secuencia de ácidos nucleicos que comprende (o consiste en) una región codificante de aproximadamente 50 a aproximadamente 4000 nucleótidos, algunas veces de aproximadamente 100 a aproximadamente 3000 nucleótidos y algunas veces de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 nucleótidos, que se hibrida la SEC ID No: 1 en condiciones astringentes (tal como se definen a continuación), o que codifica un polipéptido IND1 o fragmento de por lo menos 15 aminoácidos del mismo. Los polinucleótidos IND1 también se pueden identificar por su capacidad para hibridarse en condiciones de baja astringencia (por ejemplo, Tm \sim 40ºC) a sondas de ácidos nucleicos que tienen la secuencia de SEC ID No: 1. La SEC ID No: 1 es un ejemplo de un polinucleótido IND1.
Un "promotor de un gen IND1" o "promotor IND1" tendrá habitualmente de aproximadamente 500 a aproximadamente 3000 nucleótidos de longitud, normalmente de aproximadamente 750 a 2750. Las secuencias de promotores de ejemplo se muestran como SEC ID No: 3 y SEC ID No: 4. La SEC ID No: 3 representa la región no traducida 5' del IND1 y la SEC ID No: 3 representa la región no traducida 3' de IND1. Un promotor IND1 también se puede identificar por su capacidad para dirigir la expresión en el margen de las válvulas del fruto. En particular el promotor IND1 dirige la expresión en el margen de las válvulas del gineceo en desarrollo justo antes de la fertilización (etapa 13) a través de la maduración del fruto (etapa 17). El promotor no proporciona una expresión significativa en el tejido de la hoja.
Un "polipéptido IND1" es una secuencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, algunas veces de 100 a 190, y preferiblemente 198 residuos de aminoácidos codificados por un polinucleótido IND1. Los polipéptidos IND1 se caracterizan por la presencia de un dominio básico hélice-bucle-hélice (HLH) que se une a secuencias de polinucleótidos específicas. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos ISDDPQTVVARRRRERISEKIRILKRIVPG
GAKMDTASMLDEAIRY TKFLK representan el dominio HLH del polipéptido mostrado en la SEC ID No: 2. El dominio HLH es conocido en la técnica y es compartido por otros factores de transcripción incluyendo secuencias no caracterizadas representadas por el número de acceso del Banco de Genes E1283552 y 2262147 y el producto génico PIF3 (Ni et al. Cell 95: 657 (1998)). El dominio HLH de IND1 es por tanto un dominio de unión a ADN.
Tal como se utiliza en la presente invención, un homólogo de un gen IND1 particular (por ejemplo, la SEC ID No: 1) es un segundo gen en el mismo tipo de planta o en un tipo de planta diferente, que tiene una secuencia de polinucleótidos de por lo menos 50 nucleótidos contiguos que son sustancialmente idénticos (determinada tal y como se describe a continuación) a una secuencia en el primer gen. Se cree que, en general, los homólogos comparten un pasado evolutivo común.
Una "secuencia de polinucleótidos de" un gen particular es una subsecuencia o secuencia de polinucleótidos de longitud completa de un gen IND1 que, cuando está presente en una planta transgénica, tiene el efecto deseado. Por ejemplo, un efecto es la inhibición de la expresión del gen endógeno que conduce la expresión de un polinucleótido heterólogo. Una secuencia de longitud completa de un gen particular descrito en la presente invención puede contener aproximadamente un 95%, habitualmente por lo menos aproximadamente un 98% de una secuencia completa mostrada en el Listado de Secuencias posterior.
El término "tejidos reproductores" tal como se utiliza en la presente invención incluye fruto, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores o cualquier tejido embrionario.
Un "cassette de expresión" se refiere a una construcción de ácidos nucleicos que, cuando se introduce en una célula huésped, da lugar a la transcripción y/o traducción de un ARN o polipéptido, respectivamente. Las construcciones antisentido o de sentido que no se traducen o no se pueden traducir están inluidos expresamente en esta definición.
En el caso de tanto la expresión de transgenes como la inhibición de genes endógenos (por ejemplo, por supresión antisentido o de sentido), un experto entenderá que la secuencia de polinucleótidos insertada no necesita ser idéntica y puede ser "sustancialmente idéntica" a una secuencia del gen del que deriva. Tal como se explica a continuación, estas variantes están específicamente cubiertas por este término.
En el caso en el que la secuencia de polinucleótidos insertada se transcribe y traduce para producir un polipéptido funcional, un experto entenderá que debido a la degeneración de codones una serie de secuencias de polinucleótidos codificarán el mismo polipéptido. Estas variantes están específicamente cubiertas por el término "secuencia de polinucleótidos de" un gen particular del margen de las válvulas, tal como IND1. Además, el término incluye específicamente las secuencias (por ejemplo, las secuencias de longitud completa) sustancialmente idénticas (determinadas tal como se describe a continuación) con una secuencia del gen IND1 y que codifican proteínas que retienen la función de un polinucleótido IND1.
En el caso de polinucleótidos utilizados para inhibir la expresión de un gen endógeno, la secuencia introducida no necesita ser perfectamente idéntica a una secuencia del gen endógeno diana. La secuencia de polinucleótidos introducida habitualmente será por lo menos sustancialmente idéntica (tal como se determina a continuación) a la secuencia endógena diana.
Dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos se dice que son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o residuos de aminoácidos, respectivamente, en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para la máxima correspondencia tal como se describe a continuación. El término "complementaria a" se utiliza en la presente invención para indicar que la secuencia es complementaria a toda o parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia.
La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Add. APL. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needle man y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete Informático de Genética de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección.
El "porcentaje de identidad en la secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre una ventana de comparación, donde la parte de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en que la base del ácido nucleico o el residuo de aminoácido idénticos aparecen en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad en la secuencia.
El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos una identidad en la secuencia del 25%. Alternativamente, el porcentaje de identidad puede ser cualquier número entero desde el 25% al 100%. Las realizaciones más preferidas incluyen por lo menos: 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, en comparación con una secuencia de referencia utilizando los programas descritos en la presente invención; preferiblemente BLAST utilizando parámetros estándar, tal como se describe a continuación. Por consiguiente, las secuencias de IND1 de la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que tienen una identidad sustancial con la SEC ID No: 1. Las secuencias de IND1 de la presente invención también incluyen secuencias de polipéptidos que tienen una identidad sustancial con la SEC ID No: 2. Un experto entenderá que estos valores se pueden ajustar de manera apropiada para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, la posición del marco de lectura y similares. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos objetivos significa normalmente la identidad en la secuencia de por lo menos un 40%. El porcentaje preferido de identidad de polipéptidos puede ser cualquier número entero desde el 40% al 100%. Las realizaciones más preferidas incluyen por lo menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%. Las realizaciones aún más preferidas incluyen por lo menos un 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% y 75%. Los polipéptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias tal como se ha indicado anteriormente a excepción de que las posiciones de los residuos que no son idénticos pueden diferir por cambios de aminoácidos conservativos. Las sustituciones de aminoácidos conservativos se refieren a la posibilidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilalifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanita-valina, ácido aspártico-ácido glutámico, y asparagina-glutamina.
Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí, o a un tercer ácido nucleico, en condiciones astringentes. Las condiciones astringentes son dependientes de las secuencias y serán diferentes en circunstancias diferentes. En general, las condiciones astringentes se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferior al punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tf es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente coincidente. Habitualmente, las condiciones astringentes serán aquellas en las que la concentración de sal es de aproximadamente 0,01 molar a pH 7 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 60ºC.
En la presente invención, el ARNm codificado por genes IND1 de la presente invención se pueden identificar en transferencias Northern en condiciones astringentes utilizando ADNc de la presente invención o fragmentos de por los menos aproximadamente 100 nucleótidos. Para los objetivos de esta descripción, las condiciones astringentes para dichas hibridaciones ARN-ADN son aquellas que incluyen por lo menos un lavado en 0,2xSSC a 63ºC durante 20 minutos, o condiciones equivalentes. El ADN genómico o ADNc que comprende genes de la presente invención se pueden identificar utilizando los mismos ADNc (o fragmentos de por los menos aproximadamente 100 nucleótidos) en condiciones astringentes, que para los objetivos de esta descripción, incluyen por lo menos un lavado (habitualmente dos) en 0,2xSSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 50ºC, normalmente aproximadamente 55ºC, durante 20 minutos, o condiciones equivalentes.
Breve descripción de los dibujos
La figura I ilustra los tipos de células del fruto de Arabidopsis en la madurez.
Descripción detallada I. Introducción
La presente invención proporciona procedimientos de modulación del desarrollo del fruto en plantas. En particular, la presente invención proporciona procedimientos para el retraso o prevención de la dehiscencia del fruto mediante la supresión de la expresión de un gen bHLH, tal como IND1 en una planta. La presente invención también proporciona plantas transgénicas que comprenden varios polinucleótidos que codifican un polipéptidos bHLH, tal como IND1.
La presente invención se refiere al descubrimiento previo de que una planta con el doble mutante agl1 aglj tiene fenotipo de la dispersión de semillas retardada (Liljegren et al., Nature 404: 766-770 (2000). Las mutaciones con pérdida de función en los genes SHP1 y SHP2 se produjeron mediante la inserción disruptiva de ADN-T y la recombinación homóloga. En las plantas resultantes con doble mutante shp1 y shp2, la zona de dehiscencia no consiguió desarrollarse con normalidad y los frutos maduros no experimentaron dehiscencia. De este modo, se requiere la expresión de los genes SHP1 o SHP2 para el desarrollo de la zona de dehiscencia. Estos resultados indican que SHP1 y SHP2 regulan la dehiscencia de la vaina y que la manipulación de la expresión de SHP1 y SHP2 puede permitir el proceso de desgrane de la vaina a controlar.
La presente invención proporciona evidencia de que IND1 está regulado por SHP1 y SHP2 y que la expresión de IND1 modula la dehiscencia del fruto. La presente invención también proporciona procedimientos para el retraso de la dehiscencia del fruto mediante la supresión de la expresión de IND1.
Los genes SHP1 y SHP2 de Arabidopsis codifican las proteínas caja MADS con un 85% de identidad a nivel de aminoácidos. Los patrones de expresión de ADN de SHP1 y SHP2 también son notablemente similares. En particular, ambos ARN se expresan específicamente en flores, donde se acumulan en los carpelos en desarrollo. En particular, la fuerte expresión de estos genes se observa en el replum externo a lo largo del límite válvula/replum (Ma et al., supra, 1991; Savidge et al., The Plant Cell 7: 721-723 (1995); Flanagan et al., The Plant Journal 10: 343-353 (1996)). De este modo, SHP1 y SHP2 se expresan en el margen de las válvulas, por lo menos en las células del replum externo.
En general, la nomenclatura y los procedimientos de laboratorio en la tecnología de ADN recombinante descritos a continuación son aquellos bien conocidos y utilizados normalmente en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para la clonación, aislamiento de ADN y ARN, amplificación y purificación. Las reacciones generalmente enzimáticas que implican la ADN ligasa, la ADN polimerasa, las endonucleasas de restricción y similares, se realizan según las esecificaciones del fabricante. Estas técnicas y varias otras técnicas se realizan en general según Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, Nueva Cork, (1989).
II. Aislamiento de los ácidos nucleicos de la invención
El aislamiento de secuencias de los genes de la presente invención se puede realizar mediante una serie de técnicas. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos basadas en las secuencias descritas en la presente invención se pueden utilizar para identificar el gen deseado en una biblioteca de ADNc o ADN genómico de una especie de planta deseada. Para construir bibliotecas genómicas, se generan grandes segmentos de ADN genómico mediante fragmentación aleatoria, por ejemplo, utilizando endonucleasas de restricción, y se ligan con ADN vector para formar concatemeros que se pueden empaquetar en el vector apropiado. Para preparar una biblioteca de ADNc específicas de embriones, tales como IND1, se aísla el ARNm de los embriones y se prepara a partir del ARNm una biblioteca de ADNc que contiene los transcritos de genes.
EL ADNc o biblioteca genómica se puede entonces cribar utilizando una sonda basada en la secuencia de un gen IND1 clonado, tal como los polinucleótidos descritos en la presente invención. Las sondas se pueden utilizar para hibridarse con secuencias de ADN genómico o ADNc para aíslar genes homólogos en la misma o diferentes especies de plantas.
Alternativamente, los ácidos nucleicos de interés se pueden amplificar a partir de las muestras de ácido nucleico utilizando técnicas de amplificación. Por ejemplo, la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de los genes directamente de ARNm, de ADNc, de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. La PCR y otros procedimientos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácidos nucleicos que codifican para proteínas a expresar, para fabricar ácidos nucleicos a utilizar como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciar ácidos nucleicos, o para otros propósitos.
Los cebadores y sondas apropiadas para identificar genes, tales como IND1, de tejidos vegetales se generan a partir de comparaciones de las secuencias proporcionadas en la presente invención. Para una visión general de la PCR, véase PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. y White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990). Los cebadores apropiados para la amplificación de la región genómica de IND1 o el ADNc de IND1 incluyen los siguientes pares de cebadores: 5'-gatgaaaatggaaaatggtatgtata-3' and 5'-gttcatcagggttgggagttgtg-3'. Las condiciones de amplificación son habitualmente las siguientes. Componentes de reacción: 10 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM de cloruro potásico, 1,5 mM de cloruro magnésico, geltain al 0,001%, 200 \muM de dATP, 200 \muM de dCTP, 200 \muM de dGTP, 200 \muM de dTTP, 0,4 \muM de cebadores, y 100 unidades por ml de Taq polimerasa. Programa: 96 C durante 3 min., 30 ciclis de 96 C durante 45 s, 50 C durante 60 s, 72 durante 60 s, seguido de 72 C durante 5 min.
Los polinucleótidos también se pueden sintetizar mediante técnicas bien conocidas tal como se describe en la literatura técnica. Véase, por ejemplo, Carruthers et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418 (1982), y Adams et al., J. Am. Chem: Soc. 105: 661 (1983). A continuación, se pueden obtener fragmentos de ADN de doble cadena mediante la síntesis de la cadena complementaria y la hibridación de las cadenas en condiciones apropiadas, o mediante la adición de la cadena complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia de cebadores adecuada.
El género de secuencias de ácidos nucleicos IND1 de la presente invención incluye genes y productos génicos identificados y caracterizados por análisis utilizando secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, incluyendo la SEC ID No: 1, y secuencias de proteínas de la presente invención, incluyendo la SEC ID No: 2. Las secuencias de IND1 de la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que tienen una identidad sustancial con la SEC ID No: 1. Las secuencias de IND1 de la presente invención también incluyen secuencias de polipéptidos que tienen una identidad sustancial con la SEC ID No: 2.
III. Uso de los ácidos nucleicos de la invención A. Uso de los ácidos nucleicos de la invención para inhibir o suprimir la expresión de genes
La presente invención proporciona procedimientos de modulación de la dehiscencia del fruto en una planta mediante la introducción en una planta de un cassette de expresión recombinante que comprende un elemento regulador unido operativamente a un polinucleótido HLH, tal como IND1. La presente invención también proporciona procedimientos para retrasar la dispersión de semillas en una planta mediante la supresión de la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico IND1. En una planta transgénica de la presente invención, una molécula de ácido nucleico, o construcciones antisentido de la misma, que codifican un producto génico IND1 pueden estar unidos operativamente a un elemento regulador exógeno. La presente invención proporciona, por ejemplo, una planta transgénica caracterizada por una dispersión de semillas retardada que tiene una molécula de ácido nucleico expresada que codifica un producto génico IND1, o construcción antisentido del mismo, que está unido operativamente a un elemento regulador constitutivo exógeno. En una realización, la presente invención proporciona una planta transgénica que está caracterizada por la dispersión de semillas retardada debido a la supresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un ortólogo de IND1. En algunas realizaciones preferidas, la supresión de IND1 da lugar a una menor lignificación en las células del margen de las válvulas. Véase, también, U.S. 6.410.826.
Las secuencias IND1 preparadas tal como se describe en la presente invención, se pueden utilizar para preparar cassettes de expresión útiles en una serie de técnicas, incluyedo la inhibición o supresión de la expresión. Se pueden utilizar una serie de procedimientos para inhibir la expresión génica en plantas. Por ejemplo, se puede utilizar de manera conveniente la tecnología antisentido. Para llevar a cabo esto, un segmento de ácido nucleico del gen deseado se clona y se une operativamente a un promotor, de manera que se transcribirá la cadena antisentido de ARN. A continuación, el cassette de expresión se transforma en plantas y se produce la cadena antisentido de ARN. En las células vegetales, se ha sugerido que el ARN antisentido inhibe la expresión génica mediante la prevención de la acumulación de ARNm que codifica la enzima de interés, véase, por ejemplo, Sheehy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 8805-8809 (1988); Pnueli et al., The Plant Cell 6: 175-186 (1994); y Hiatt et al., U.S. Patent No. 4.801.340.
La secuencia de ácido nucleico antisentido transformada en las plantas será sustancialmente idéntica a por lo menos una parte del gen o genes endógenos a reprimir. Sin embargo, la secuencia no tiene que ser perfectamente idéntica para inhibir la expresión. De este modo, una molécula de ácido nucleico antisentido o de sentido que codifica sólo una parte de IND1 puede ser útil para producir una planta en la que se suprime la expresión de IND1. Los vectores de la presente invención se pueden diseñar de manera que el efecto inhibidor se aplica a otras proteínas en una familia de genes que exhiben una homología o una homología sustancial con el gen diana.
Para la supresión antisentido, la secuencia introducida tampoco necesita que sea de longitud completa con respecto al producto de transcripción primaria o el ARNm totalmente procesado. En general, se puede utilizar una homología más elevada para compensar el uso de una secuencia más corta. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrones o exones, y la homología de segmentos no codificantes puede ser igualmente efectiva. Normalmente, debería utilizarse una secuencia entre aproximadamente 30 ó 40 nucleótidos y aproximadamente nucleótidos de longitud completa, se prefiere mediante una secuencia de por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, es más preferido una secuencia de por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, y es especialmente preferido una secuencia de por lo menos aproximadamente 500 nucleótidos.
Las moléculas de ARN catalíticas o ribozimas también se pueden utilizar para inhibir la expresión de genes IND1. Es posible diseñar ribozimas que se emparejan específicamente con prácticamente cualquier ARN diana y dividen el esqueleto foasfodiéster en un punto específico, inactivando funcionalmente de esta manera el ARN diana. Al realizar esta división, el ribozima no se altera y, de este modo, es capaz de reciclarse y dividir otras moléculas, convirtiéndole en una verdadera enzima. La inclusión de secuencias de ribozimas en los ARN antisentido les confiere actividad de división de ARN, aumentando así la actividad de las construcciones.
Se han identificado una serie de tipos de ribozimas. Un tipo de ribozimas deriva de una serie de ARNs circulares pequeños que son capaces de autodividirse y replicarse en plantas. Los ARN se replican solos (ARNs tiroides) o con un virus auxiliar (ARNs satélites). Entre los ejemplos se incluyen ARNs del viroide de la mancha del sol de aguacate y los ARNs satélites de virus del mosaico anular del tabaco, virus del rayado transitorio de la alfalfa, virus del mosaico del tabaco de terciopelo, virus del mosaico del solanum nodiflorum, y virus del mosaico del trébol subterráneo. El diseño y uso de ribozimas específicos de ARN diana se describe en Haseloff et al., Nature, 334: 585-591 (1988).
Otro método de supresión es la supresión de sentido (también conocido como cosupresión). Se ha observado que la introducción de cassettes de expresión en los que un ácido nucleico está configurado en la orientación de sentido con respecto al promotor es un medio eficaz por el cual se bloquea la transcripción de los genes diana. Para un ejemplo del uso de este método para modular la expresión de genes endógenos, véase Napoli et al., The Plant Cell 2: 279-289 (1990); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 3490-3496 (1994); Kooter y Mol, Current Opin. Biol. 4: 166-171 (1993); y las Patentes de Estados Unidos 5.034.323, 5.231.020 y 5.283.184.
En general, donde se desea la inhibición de la expresión, aparece cierta transcripción de la secuencia introducida. El efecto puede aparecer donde la secuencia introducida no contiene secuencia codificante per se, sino solamente secuencias de intrones o no traducidas homólogas a las secuencias presentes en el transcrito primario de la secuencia endógena. La secuencia introducida en general será sustancialmente idéntica a la secuencia endógena que se pretende reprimir. Esta identidad mínima será habitualmente mayor de aproximadamente un 65%, pero una mayor identidad podría ejercer una represión más eficaz de la expresión de las secuencias endógenas. Se prefiere una identidad sustancialmente mayor de más de aproximadamente un 80%, aunque lo más preferido sería aproximadamente de un 95% a la identidad absoluta. Con respecto a la regulación antisentido, el efecto debería aplicarse a cualquier otra proteína en una familia similar de genes que exhiben homología u homología sustancial.
Para la supresión de sentido, la secuencia introducida en el cassette de expresión, que necesita menos que la identidad absoluta, tampoco necesita ser de longitud completa, en relación con el producto de transcripción primario o el ARNm totalmente procesado. Esto puede ser preferible para evitar la producción simultánea de algunas plantas que son sobreexpresadoras. Una mayor identidad en una secuencia más corta que la longitud completa compensa una secuencia más larga pero menos idéntica. Además, la secuencia introducida no necesita tener el mismo patrón de intrones o exones y la identidad de segmentos no codificantes será igualmente eficaz. Normalmente, se utiliza una secuencia de los rangos de tamaño indicados anteriormente para la regulación antisentido.
En una realización preferida, la expresión de un ácido nucleico de interés se puede suprimir por la expresión simultánea de las construcciones tanto de sentido como antisentido (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964 (1998). Véase también Tabara et al. Science 282: 430-431 (1998).
Un experto en la materia entenderá que utilizando la tecnología basada en secuencias de nucleótidos específicas (por ejemplo, tecnología de supresión antisentido o de sentido), las familias de genes homólogos se pueden suprimir con un único transcrito de sentido o antisentido. Por ejemplo, si un transcrito de sentido o antisentido está diseñado para tener una secuencia que se conserva entre una familia de genes, entonces se pueden suprimir múltiples miembros de una familia de genes. En cambio, si el objetivo es solamente suprimir un miembro de una familia de genes homólogos, entonces el transcrito de sentido o antisentido debería dirigirse a secuencias con la mayor variación posible entre miembros de la familia.
Otro medio para inhibir la función de IND1 en una planta es mediante la creación de mutaciones negativas dominantes. En esta estrategia, se intoducen en la planta polipéptidos IND1 mutantes no funcionales, que retienen la capacidad de interaccionar con subunidades naturales. También se puede utilizar una construcción negativa dominante para suprimir la expresión IND1 en una planta. Una construcción negativa dominante útil en la presente invención contiene en general una parte de la secuencia codificante de IND1 completa suficiente, por ejemplo, para la unión a ADN o para una interacción proteína-proteína, tal como una interacción proteína-proteína homodimérica o heterodimérica, pero que carece de la actividad transcripcional de la proteína de tipo natural. Por ejemplo, un mutante por deleción carboxi terminal de AGAMOUS se utilizó como construcción negativa dominante para suprimir la expresión del gen AGAMOUS de la caja MADS (Mizukami et al., Plant Cell 8:831.844 (1996)). Un experto en la materia entiende que, de manera similar, una construcción IND1 negativa dominante se puede utilizar para suprimir la expresión de IND1 en una planta.
B. Uso de ácidos nucleicos de la invención para aumentar la expresión génica
Las secuencias aisladas preparadas tal como se describe en la presente invención también se pueden utilizar para preparar cassettes de expresión que aumentan o incrementan la expresión del gen IND1 endógeno. Cuando se desea la sobreexpresión de un gen, el gen deseado de una especie diferente se puede utilizar para disminuir los efectos potenciales de la supresión de sentido. La expresión aumentada de polinucleótidos de IND1 es útil, por ejemplo, para producir plantas con fruto pequeño.
Se pueden utilizar cualquiera de los medios conocidos en la técnica para aumentar la actividad de IND1 en plantas. Cualquier órgano puede estar marcado, tal como órganos/estructuras vegetativas de un brote (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores, y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semilla (incluyendo embriones, endospermas y recubrimiento de semilla) y fruto. Alternativamente, uno o varios de los genes IND1 se pueden expresar de manera constitutiva (por ejemplo, utilizando el promotor CaMV 35S).
Un experto entenderá que los polipéptidos codificados por los genes de la presente invención, como otras proteínas, tienen dominios diferentes que realizan diferentes funciones. De este modo, las secuencias de genes no necesitan ser de longitud completa, siempre y cuando se exprese el dominio funcional deseado de la proteína. Tal como se ha explicado anteriormente, los polipéptidos IND1 portan un dominio bHLH, que es capaz de unirse a ADN. De este modo, sin estar unido a ninguna teoría o mecanismo, IND1 actúa probablemente como un modulador transcripcional.
C. Modificación de genes IND1 endógenos
Los procedimientos para introducir mutaciones genéticas en genes de plantas y seleccionar plantas con las características deseadas son bien conocidos. Por ejemplo, las semillas u otro material vegetal se pueden tratar con una sustancia química mutagénica, según las técnicas estándar. Entre dichas sustancias químicas se incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: sulfato de dietilo, etilen imina, metanosulfonato de etilo y N-nitroso-N-etilurea. Alternativamente, se puede usar también la radiación ionizante de fuentes tales como rayos X o rayos gamma.
Las cadenas de proteínas modificadas también se pueden diseñar fácilmente utilizando varias técnicas de ADN recombinante bien conocidas por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra. La hidroxilamina también se puede utilizar para introducir mutaciones de bases individuales en la región codificante del gen (Sikorski, et al. (1991) Meth. Enzymol. 194: 302-318). Por ejemplo, las cadenas pueden variar de la secuencia natural a nivel de estructura primaria mediante sustituciones, adiciones, deleciones de aminoácidos, y similares. Estas modificaciones se pueden utilizar en una serie de combinaciones para producir la cadena de proteína final modificada.
Alternativamente, se puede utilizar una recombinación homóloga para inducir las modificaciones en el gen marcado marcando específicamente el gen IND1 in vivo (ver, en general, Grewal y Klar, Genetics 146: 1221-1238 (1997) y Xu et al., Genes Dev. 10: 2411-2422 (1996)). Se ha demostrado la recombinación homóloga en plantas (Puchta et al., Experiencia 50: 277-284 (1994), Swoboda et al., EMBO J. 13: 484-489 (1994); Offringa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7346-7350 (1993); y Kempin et al. Nature 389: 802-803 (1997)).
Al aplicar la tecnología de recombinación homóloga a los genes de la presente invención, se realizan mutaciones in vitro en partes seleccionadas de secuencias de un gen IND1 (incluyendo regiones en dirección 5', regiones en dirección 3' e intragénicas), tales como las descritas en la presente invención y, a continuación, se introducen en la planta deseada utilizando técnicas estándar. Debido a que se sabe que la recombinación homóloga es dependiente de los vectores utilizados, se utilizan vectores dicistrónicos dirigidos a genes tal como se describen en Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4303-4307 (1994); y Vaulont et al., Transgenic Res. 4: 247-255 (1995) de manera conveniente para aumentar la eficacia de la selección de la expresión del gen IND1 alterada en plantas transgénicas. El gen mutado interaccionará con el gen natural diana de manera que la recombinación homóloga y la sustitución dirigida del gen natural tendrá lugar en células de plantas transgénicas, dando lugar a la supresión de la actividad de IND1.
Alternativamente, se pueden utilizar oligonucleótidos compuestos de un tramo contiguo de residuos de ARN y ADN en una conformación de doble cadena con cabezas de horquillas dobles en los extremos. La secuencia de ARN/ADN se diseña para alinearse con la secuencia del gen IND1 diana y contener el cambio de nucleótido deseado. La introducción del oligonucleótido quimérico en un plásmido de ADN-T extracromosómico da lugar a una conversión eficaz y específica del gen IND1 dirigida por moléculas quiméricas en un pequeño número de células vegetales transformadas. Este método se describe en Cole-Strauss et al., Science 273: 1386-1389 (1996) y Yoon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2071-2076 (1996).
En otras realizaciones, los promotores derivados de los genes IND1 de la presente invención se pueden utilizar para dirigir la expresión de genes heterólogos de manera específica en el margen de las válvulas. Entre los genes estructurales que podrían utilizarse para este objetivo se incluyen genes que codifican proteínas citotóxicas tal como se describen a continuación.
Habitualmente, los promotores deseados se identifican mediante el análisis de las secuencias 5' de un clon genómico correspondiente a los genes IND1 descritos en la presente invención. Las secuencias características de las secuencias de promotor se pueden utilizar para identificar el promotor. Las secuencias que controlan la expresión de genes eucariotas han sido ampliamente estudiadas. Por ejemplo, los elementos de la secuencia de promotor incluyen la secuencia de consenso de la caja TATA (TATAAT), que está habitualmente de 20 a 30 pares de bases en dirección 5' del punto de inicio de la transcripción. En la mayoría de los casos, se requiere la caja TATA para un inicio de la transcripción precisa. En las plantas, más adelante la dirección 5' de la caja TATA, en las posiciones -80 a -100, existe habitualmente un elemento promotor con una serie de adeninas que rodean el trinucleótido G (o T) N G. J.Messing et al., in GENETIC ENGINEERING IN PLANTS, páginas 221-227 (Kosage, Meredith and Hollaender, eds. (1983)).
Existen una serie de métodos que son conocidos por los expertos en la materia para identificar y caracterizar las regiones de promotores en ADN genómico de planta (véase, por ejemplo, Jordano, et al., Plant Cell, 1: 855-866 (1989); Bustos, et al., Plant Cell, 1: 839-854 (1989); Green, et al., EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier, et al., Plant Cell, 3, 309-316 (1991); y Zhang, et al., Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996)).
IV. Preparación de vectores recombinantes
Para usar las secuencias aisladas en las técnicas anteriores, se preparan vectores de ADN recombinante adecuados para la transformación de células vegetales. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica. Véase, por ejemplo, Weising et al. Ann Rev. Genet., 22: 421-477 (1988). Una secuencia codificante de ADN para el polipéptido deseado, por ejemplo, una secuencia de ADNc que codifica una proteína de longitud completa, se combinará preferiblemente con secuencias reguladores de iniciación transcripcional y traduccional que dirigirán la transcripción de la secuencia del gen en los tejidos pretendidos de la planta transformada.
Por ejemplo, para la sobreexpresión, se puede utilizar un fragmento de promotor de planta que dirigirá la expresión del gen en todos los tejidos de una planta regenerada. A dichos promotores se hace referencia en la presente invención como promotores "constitutivos" y son activos en la mayoría de condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Entre los ejemplos de promotores constitutivos se incluyen la región de iniciación de la transcripción del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1' ó 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumafaciens, y otras regiones de iniciación de la transcripción de varios genes de planta conocidos por los expertos en la materia.
Alternativamente, el promotor de la planta puede dirigir la expresión del polinucleótido de la presente invención en un tejido específico (promotores específicos de tejido) o puede estar sinó bajo un control ambiental más preciso (promotores inducibles). Entre los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo control de desarrollo se incluyen promotores que inician la transcripción sólo en ciertos tejidos, tales como fruto, semillas o flores. Tal como se ha indicado anteriormente, los promotores de los genes IND1 descritos en la presente invención son particularmente útiles para dirigir la expresión génica, de manera que un producto génico deseado se localiza en el margen de las válvulas de fruto. Otros promotores adecuados incluyen aquellos de genes tales como SHP1 o SHP2 (Savidge, B., Rounsley, S.D., y Yanofsky, M.F. (1995) Plant Cell 7: 721-733). Entre los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción por promotores inducibles se incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, o la presencia de luz.
Si se desea la correcta expresión del polipéptido, debería incluirse una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas o de ADN-T.
El vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones codificantes) de genes de la presente invención comprenderá habitualmente un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en células vegetales. Por ejemplo, el marcador puede codificar resistencia a biocida, particularmente resistencioa a antibiótico, tal como resistencia a kanamicina, G418, bleomicina, higromicina o resistencia a herbicida, tal como resistencia a clorosluforon o Basta.
Las secuencias de ácido nucleico IND1 de la presente invención se expresan recombinantemente en células vegetales para aumentar e incrementar los niveles de polipéptidos IND1 endógenos. Alternativamente, las contrucciones antisentido u otras construcciones IND1 (descritas anteriormente) se utilizan para suprimir los niveles de expresión de IND1. Se pueden preparar una serie de diferentes construcciones de expresión diferentes, tales como cassettes de expresión y vectores adecuados para la transformación de células vegetales. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica. Véase, por ejemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988). Una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido IND1, por ejemplo una secuencia de ADNc que codifica una proteína de longitud completa, se puede combinar con secuencias reguladoras transcripcionales que actúan en cis (promotor) y actúan en trans (potenciador) para dirigir el transcurso, el tipo de tejido y los niveles de transcripción en los tejidos pretendidos de la planta transformada. También se pueden utilizar elementos de control traduccionales.
La presente invención proporciona un ácido nucleico IND1 unido operativamente a un promotor que, en una realización preferida, es capaz de dirigir la transcripción de la secuencia codificante de IND1 en plantas. El promotor puede derivar, por ejemplo, de fuentes vegetales o virales. El promotor puede ser, por ejemplo, constitutivamente activo, inducible o específico de tejido. En la construcción de cassettes de expresión, vectores, transgénicos recombinantes, de la presente invención, se pueden elegir y utilizar diferentes promotores para dirigir de manera diferencial de la expresión génica, por ejemplo, en algunos o todos los tejidos de una planta o animal. Habitualmente, tal como se ha descrito anteriormente, los promotores deseados se identifican analizando las secuencias 5' de un clon genómico correspondiente a los genes IND1 descritos en la presente invención.
A. Promotores constitutivos
Se puede utilizar un fragmento de promotor que dirigirá la expresión del ácido nucleico IND1 en todas las células de tejido transformadas, por ejemplo, como las de una planta regenerada. El término "elemento regulador constitutivo" significa un elemento regulador que confiere un nivel de expresión sobre una molécula de ácido nucleico unida operativamente que es relativamente independientemente del tipo de célula o tejido en el que se expresa el elemento regulador constitutivo. Un elemento regulador constitutivo que se expresa en una planta generalmente se expresa ampliamente en un gran número de tipos de células y tejidos. A los promotores que dirigen la expresión de manera continua en condiciones fisiológicas se hace referencia como promotores "constitutivos" y son activos bajo la mayoría de condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular.
En la técnica son conocidas una serie de elementos reguladores constitutivos útiles para la expresión ectópica en una planta transgénica. El promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV 35S), por ejemplo, es un elemento regulador constitutivo bien caracterizado que produce un nivel elevado de expresión en todos los tejidos de plantas (Odell et al., Nature 313: 810-812 (1985)). El promotor de CaMV 35S puede ser particularmente útil debido a su actividad en numerosas especies de plantas diversas (Benfey y Chua, Science 250: 959-966 (1990); Futterer et al., Physiol. Plant 79: 154 (1990); Odell et al., supra, 1985). Un promotor de 35S en tandem, en el que el elemento promotor intrínseco ha sido duplicado, confiere niveles de expresión más elevados en comparación con el promotor de 35S no modificado (Kay et al., Science 236: 1299 (1987)). Entre otros elementos reguladores constitutivos útiles se incluyen, por ejemplo, el promotor de virus del mosaico del mosaico de la coliflor 19S; el promotor del virus del mosaico de Figwort; y el promotor del gen de la nopalina sintasa (nos) (Singer et al., Plant Mol. Biol. 14: 433 (1990); An, Plant Physiol. 81: 86 (1986)).
En la técnica se conocen elementos reguladores constitutivos adicionales que incluyen aquellos para la expresión eficaz en monocots, por ejemplo, el promotor pEmu y promotores basados enla región 5' Actin-1 del arroz (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581 (1991); Mcelroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150 (1991); Mcelroy et al., Plant Cell 2: 163 (1990)). Los elementos reguladores quiméricos, que combinan elementos de genes diferentes, también pueden ser útiles para expresar de manera ectópica una molécula de ácido nucleico que codifica un polinucleótido IND1 (Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373 (1990)).
Otros ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1' o 2' derivado de ADN-T de Agrobacterium tumafaciens (véase, por ejemplo, Mengiste (1997) supra; O'Grady (1995) Plant Mol. Biol. 29: 99-108); promotores de actina, tales como promotor del gen de actina de Arabidopsis (veáse, por ejemplo, Huang (1997) Plant Mol. Biol. 1997 33: 125-139); promotores del gen de la alcohol deshidrogenasa (Adh) (véase, por ejemplo, Millar (1996) Plant Mol. Biol. 31: 897-904); ACT11 de Arabidopsis (Huang et al. Plant Mol. Biol. 33: 125-139 (1996)), Cat3 de Arabidopsis (Banco de Genes No. U43147, Zhong et al., Mol. Gen. Genet. 251: 196-203 (1996)), el gen que codifica la proteína portadora estearoil-acilo desaturasa de Brassica napus (Banco de Genes No. X74782, Solocombe et al. Plant Physiol. 104: 1167-1176 (1994)), GPc1 de maíz (Banco de Genes No. X15596, Martinez et al. J. Mol. Biol 208: 551-565 (1989)), Gpc2 de maíz (Banco de Genes No. U45855, Manjunath et al., Plant Mol. Biol. 33: 97-112 (1997)), otras regiones de iniciación de la transcripción de varios genes de plantas conocidos por los expertos en la materia. Véase también Holtorf Plant Mol. Biol. 29: 637-646 (1995).
B. Promotores inducibles
Alternativamente, un promotor de planta puede dirigir la expresión del ácido nucleico IND1 de la presente invención bajo la influencia del cambio en las condiciones ambientales o las condiciones de desarrollo. Entre los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción mediante promotores inducibles se incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, SECuía, o la presencia de luz. A dichos promotores se les hace referencia en la presente invención como promotores "inducibles". Por ejemplo, la presente invención incorpora el promotor inducible por la SECuía del maíz (Busk (1997) supra); el promotor inducible por el frío, la SECuía y la sal elevada de la patata (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897-909).
Alternativamente, los promotores de plantas que son inducibles tras la exposición a hormonas de plantas, tales como auxinas, se utilizan para expresar los ácidos nucleicos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención puede utilizar el fragmento de promotor de elementos de respuesta a auxina E1 (AuxREs) en la soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407); el promotor GST6 de Arabidopsis sensible a auxina (también sensible a ácido salicílico y peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC inducible por auxina del tabaco (Sakai (1996) 37: 906-913); un elemento de respuesta a la biotina de planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-93.7); y, el promotor sensible a la hormona del estrés, ácido abscísico (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).
Los promotores de plantas que son inducibles tras la exposición areactivos químicos que se pueden aplicar a la planta, tal como herbicidas o antibióticos, también se utilizan para expresar los ácidos nucleicos de la presente invención. Por ejemplo, se puede utilizar el promotor In2-2 del maíz, activado por el antídoto ("safener") de herbicidas bencenosulfonamida, (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); la aplicación de diferentes antídotos de herbicidas induce diferentes patrones de expresión génica, incluyendo la expresión en la raíz, hidatodos, y el meristema apical del brote. La secuencia codificante de IND1 también puede estar bajo el control de, por ejemplo, un promotor inducible por tetraciclina, por ejemplo, tal como se describe con plantas transgénicas del tabaco que contienen el gen de la arginina carboxilasa de la Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); o, un elemento sensible a ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324; Uknes et al., Plant Cell 5: 159-169 (1993); Bi et al., Plant J. 8: 235-245 (1995)).
Entre los elementos reguladores inducibles particularmente útiles se incluyen elementos reguladores inducibles por sobre (Mett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4567-4571 (1993); Furst et al., Cell 55: 705-717 (1988)); elementos reguladores inducibles por tetraciclina y cloro-tetraciclina (Gatz et al., Plant J. 2: 397-404 (1992); Röder et al., Mol. Gen. Genet. 243: 32-38 (1994); Gatz, Meth. Cell Biol. 50: 411-424 (1995)); elementos reguladores inducibles por ecdisona (Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314-6318 (1992); Kreutzweiser et al., Ecotoxicol. Environ. Safety 28: 14-24 (1994)); elementos reguladores inducibles por choque térmico (Takahashi et al., Plant Physiol. 99: 383-390 (1992); Yabe et al., Plant Cell Physiol. 35: 1207-1219 (1994); Ueda et al., Mol. Gen. Genet. 250: 533-539 (1996)); y elementos del operón lac, que se utilizan en combinación con un represor lac expresado de manera constitutiva para conferir, por ejemplo, una expresión inducible por IPTG (Wilde et al., EMBO J. 11: 1251-1259 (1992)). Un elemento regulador inducible útil en las plantas transgénicas de la presente invención también pueden ser, por ejemplo, un promotor inducible por nitrato derivado del gen de la nitrito reductasa de la espinaca (Back et al., Plant Mol. Biol. 17: 9 (1991)) o un promotor inducible por la luz, tal como el asociado con la pequeña subunidad de la RuBP carboxilasa o las familias de genes LHCP (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226: 449 (1991); Lam y Chua, Science 248: 471 (1990)).
C. Promotores específicos de tejido
Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión del polinucleótido dela presente invención en un tejido específico (promotores específicos de tejido). Los promotores específicos de tejido son elementos de control transcripcional que sólo son activos en células o tejidos concretos en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductores. Los promotores de los genes IND1 de la presente invención son particularmente útiles para la dirección específica de tejido de la expresión génica, de manera que un producto génico deseado se genera sólo o preferencialmente en embriones o semillas, tal como se describe a continuación.
Entre los ejemplos de promotores específicos de tejido bajo el control del desarrollo se incluyen promotores que inician la transcripción sólo (o principalmente sólo) e ciertos tejidos, tales como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas, o tejidos reproductores, tales como fruto, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores, o cualquier tejido embrionario. Los promotores reproductores específicos de tejido pueden ser, por ejemplo, específicos de óvulo, específicos de embrión, específicos de endosperma, específicos de integumento, específicos de semilla y cubierta de semilla, específicos de polen, específicos de pétalo, específicos de sépalo, o alguna combinación de los mismos.
La presente invención proporciona una planta transgénica que se caracteriza por una dispersión de semillas retardada debido a la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico IND1, o una construcción antisentido del mismo, unido operativamente a un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia. El elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia puede ser, por ejemplo, un elemento regulador SHP1 o un elemento regulador SHP2. El elemento regulador SHP1 puede derivar de la secuencia genómica SHP1 de Arabidopsis descrita en la presente invención como SEC ID No: 5 y puede ser, por ejemplo, una secuencia reguladora 5' o un elemento regulador intrónico. De manera similar, el elemento regulador SHP2 puede derivar de la secuencia genómica SHP2 de Arabidopsis descrita en la presente invención como SEC ID No: 6 y puede ser, por ejemplo, una secuencia reguladora 5' o elemento regulador intrónico.
Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia puede derivar de un gen que es un ortólogo de IND1 de Arabidopsis y se expresa selectivamente en el margen de las válvulas o la zona de dehiscencia de una planta con semilla. Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia puede derivar, por ejemplo, de un ortólogo de IND1 de Brassicaceae, tal como ortólogo IND1 de Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica campestris, Brassica juncea, Brassica nigra o Brassica carinata. Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia puede derivar, por ejemplo, de un ortólogo de IND1 de cánola. Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia también puede derivar, por ejemplo, de un ortólogo de IND1 de leguminosa, tal como soja, guisante, garbanzo, aconitifolia, habas, alubia de riñón, alubia lima, lenteja, frijol de vara, habas secas, cacahuete, alfalfa, forraje, lotus cornilatus, trébol, stylosanthes, lotononis bainessii, u ortólogo IND1 de sainfoin.
Un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencias también puede derivar de una variedad de otros genes que se expresan selectivamente en el margen de las válvulas o la zona de dehiscencia de una planta con semillas. Por ejemplo, el gen RDPG1 de la semilla de colza se expresa selectivamente en la zona de dehiscencia (Petersen et al., Plant Mol. Biol. 31: 517-527 (1996)). De este modo, el promotor RDPG1 o un fragmento activo del mismo puede ser un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia tal como se define en la presente invención. También se sabe que genes adicionales tales como el gen SAC51 de la semilla de colza se expresan selectivamente en la zona de dehiscencia; el promotor SAC51 o un fragmento activo del mismo también puede ser un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia de la presente invención (Coupe et al., Plant Mol. Biol. 23: 1223-1232 (1993)). El técnico en la materia entiende que un elemento regulador de cualquiera de los genes expresados selectivamente en células del margen de las válvulas o zona de dehiscencia puede ser un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia tal como se define en la presente invención.
Los elementos reguladores selectivos de la zona de dehiscencia adicionales se pueden identificar y aislar utilizando metodología de rutina. Las estrategias de cribado diferencial utilizando, por ejemplo, ARN preparado de la zona de dehiscencia y ARN preparado de material de la vaina adyacente se puede utilizar para aislar ADNc expresado selectivamente en células de la zona de dehiscencia (Coupe et al., supra, 1993); posteriormente, los genes correspondientes se aíslan utilizando la secuencia de ADNc como sonda.
Las estrategias de atrapamiento de potenciador o atrapamiento de genes también se pueden utilizar para identificar y aislar un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia de la presente invención (Sundaresan et al., supra, 1995; Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8467-8471 (1989); Kertbundit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5212-5216 (1991); Topping et al., Development 112: 1009-1019 (1991)). Los elementos de atrapamiento del potenciador incluyen un gen informador tal como GUS con un promotor débil o mínimo, mientras que los elementos de atrapamiento de genes carecen de una secuencia de promotor, dependiendo de la transcripción de un gen cromosómico flanqueante para la expresión de un gen informador. Los elementos transposables incluidos en las construcciones median las fusiones a loci endógenos; las construcciones expresadas selectivamente en el margen de las válvulas o la zona de dehiscencia se identifican por su patrón de expresión. Con el elemento insertado como una etiqueta, el elemento flanqueante regulador selectivo de la zona de dehiscencia se clona utilizando, por ejemplo, la metodología de reacción en cadena de la polimerasa inversa (véase, por ejemplo, Aarts et al., Nature 363: 715-717 (1993); véase también, Ochman et al., "Amplification of Flanking SECuences by Inverse PCR", in Innis et al., supra, 1990). El sistema de transposición Ac/Ds de Sundaresan et al., Genes. Devel. 9: 1797-1810 (1995), puede ser particularmente útil en la identificación y aislamiento de un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia de la presente invención.
Los elementos reguladores selectivos de la zona de dehiscencia también se pueden aislar mediante la inserción de una biblioteca de fragmentos aleatorios de ADN genómico delante de un gen informador sin promotor y el cribado de plantas transgénicas transformadas por la biblioteca para la expresión del gen informador selectivo de la zona de dehiscencia. El vector sin promotor pROA97, que contiene el gen npt y el gen GUS, cada uno bajo el control el promotor de 35S mínimo, puede ser útil para dicho cribado. La biblioteca genómica puede ser, por ejemplo, fragmentos Sau3A de ADN genómico de Arabidopsis thaliana o ADN genómico de, por ejemplo, otra Brassicaceae de interés (Ott et al., Mol. Gen. Genet. 223: 169-179 (1990); Claes et al., The Plant Journal 1: 15-26 (1991)).
La expresión selectiva de la zona de dehiscencia de un elemento regulador de la presente invención puede demostrarse o confirmarse mediante técnicas rutinarias, por ejemplo, utilizando un gen informador y un análisis de expresión in situ. Los informadores GUS y luciferasa de luciérnaga son particularmente útiles para la localización in situ de la expresión génica de la planta (Jefierson et al., EMBO J. 6: 3901 (1987); Ow et al., Science 334: 856 (1986)), y los vectores sin promotor que contienen el cassette de expresión GUS están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Clontech (Palo Alto, CA). Para identificar un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia de interés tal como un elemento regulador IND1, se pueden generar una o más partes de nucleótidos del gen IND1 utilizando metodología enzimática o basada en PCR (Glick y Thompson, supra, 1993; Innis et al., supra, 1990); los segmentos resultantes se fusionan a un gen informador, tal como GUS, y se analizan tal como se ha descrito anteriormente.
Otros promotores específicos de tejido incluyen promotores de semillas. Los promotores específicos de semilla adecuados derivan de los siguientes genes: MAC1 de maíz (Sheridan (1996) Genetics 142: 1009-1020); Cat3 de maíz (Banco de Genes No. L05934, Abler (1993) Plant Mol. Biol. 22: 10131-1038); vivparous-1 de Arabidopsis (Banco de Genes No. U93215); atmyc1 de Arabidopsis (Urao (1996) Plant Mol. Biol. 32: 571-57; Conceicao (1994) Plant 5: 493-505); napA de Brassica napus (Banco de Genes No. J02798, Josefsson (1987) JBL 26: 12196-1301); y la familia de genes napin de Brassica napus (Sjodahl (1995) Planta 197: 264-271).
También se pueden utilizar una serie de promotores específicamente activos en tejidos vegetativos, tales como hojas, tallos, raíces y tubérculos, para expresar los ácidos nucleicos IND1 de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores que controlan la patatina, la principal proteína de almacenamiento del tubérculo de la patata, váse, por ejemplo, Kim (1994) Plant Mol. Biol. 26: 603-615; Martin (1997) Plant J. 11: 53-62. También se puede utilizar el promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes que muestra una gran actividad en raíces (Hansen (1997) Mol. Gen. Genet. 254: 337-343. Otros promotores vegetativos útiles específicos de tejido incluyen: el promotor tarin del gen que codifica una globulina de una familia principal de proteínas del bulbo del taro (Colocasia esculenta L. Schott), tarin (Bezerra (1995) Plant Mol. Biol. 28: 137-144); el promotor curculin activo durante el desarrollo del bulbo del taro (de Castro (1992) Plant Cell 4: 1549-1559) y el promotor para el gen TobRB7 específico de la raíz del tabaco, cuya expresión se localiza en el meristema de la raíz y las regiones inmaduras del cilindro central (Yamamoto (1991) Plant Cell 3: 371-382).
Se pueden utilizar promotores específicos de hojas, tales como promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS). Por ejemplo, los genes del tomate RBCS1, RBCS2 y RBCS3A se expresan en hojas y plantas de semilleros que crecen con la luz, sólo RBCS 1 y RBCS2 se expresan en frutos tomate en desarrollo (Meier (1997) FEBS Lett. 415: 91-95). Se pueden utilizar promotores de ribulosa bisfosfato carboxilasa expresados casi exclusivamente en células mesofílicas en láminas foliares y las vainas de las hojas a niveles elevados, descritos por Matsuoka (1994) Plant J. 6: 311-319. Otro promotor específico de hoja es el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b fotorreceptora, véase, por ejemplo, Shiina (1997) Plant Physiol. 115: 477-483; Casal (1998) Plant Physiol. 116: 1533-1538. El promotor del gen relacionado con myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5) descrito por Li (1996) FEBS Lett. 379: 117-121, es específico de hoja. El promotor Atmyb5 se expresa en tricomas, estípulas, y células epidérmicas de hojas en desarrollo en los márgenes de hojas de rosetas jóvenes y hojas caulinares, y en semillas inmaduras. El ARNm de Atmyb5 aparece entre la fertilización y la etapa de 16 células del desarrollo embrionario y persiste más allá de la etapa de corazón. También se puede utilizar un promotor de hoja identificado en el maíz por Busk (1997) Plant J. 11: 1285-1295.
Otra clase de promotores vegetativos útiles específicos de tejido son promotores meristemáticos (root punta de raíz y brote apical). Por ejemplo, se pueden utilizar los promotores "SHOOTMERISTEMLESS" y "SCARECROW", que son activos en el brote en desarrollo o los meristemas apicales de la raíz, descritos por Di Laurenzio (1996) Cell 86: 423-433; y, Long (1996) Nature 379: 66-69. Otro promotor útil es aquel que controla la expresión del gen de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa HMG2, cuya expresión está limitada a tejidos meristemáticos y florales (zona secretora del estigma, granos de polen maduros, tejido vascular del gineceo, y óvulos fertilizados) (véase, por ejemplo, Enjuto (1995) Plant Cell. 7: 517-527). También son útiles los genes relacionados con kn1 del maíz y otras especies que muestran una expresión específica en el meristema, véase, por ejemplo, Granger (1996) Plant Mol. Biol. 31: 373-378; Kerstetter (1994) Plant Cell 6: 1877-1887; Hake (1995) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 350: 45-51. Por ejemplo, el promotor KNAT1 de Arabidopsis thaliana. En el brote apical, el transcrito KNAT1 se localiza principalmente en el meristema apical del brote; la expresión de KNAT1 en el meristema del brote disminuye durante la transición floral y está limitada al córtex del tallo con inflorescencia (véase, por ejemplo, Lincoln (1994) Plant Cell 6: 1859-1876).
Un experto en la material entenderá que un promotor específico de tejido puede provocar la expresión de secuencias unidas operativamente en tejidos diferentes del tejido diana. De este modo, tal como se utiliza en la presente invención un promotor específico de tejido es aquel que provoca la expresión preferencialmente en el tejido diana, pero también conduce a cierta expresión en otros tejidos.
En otra realización, un ácido nucleico IND1 se expresa a través de un elemento trasposable. Esto permite la expresión constitutiva, aunque periódica e infrecuente, del polipéptido consitutivamente activo. La presente invención también se proporciona para el uso de promotores específicos de tejido derivados de virus que pueden incluir, por ejemplo, el promotor sugbgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1679-1683; el virus baciliforme tungro del arroz (RTBV), que se replica sólo en células de floema en plantas de arroz infectadas, con su promotor que provoca la expresión fuerte del gen informador específico de floema; el promotor del virus de mosaico de la vena de la mandioca (CVMV), con la mayor actividad en los elementos vasculares, en células mesofílicas de la hoja, y en puntas de raíz (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139).
V. Producción de plantas transgénicas
Las construcciones de ADN de la invención pueden introducirse en el genoma de la planta huésped deseada mediante una serie de técnicas convencionales. Por ejemplo, puede introducirse la construcción de ADN directamente en el ADN genómico de la célula vegetal utilizando técnicas tales como la electroporación y la microinyección de protoplastos de célula vegetal, o pueden introducirse las construcciones de ADN directamente en el tejido vegetal utilizando métodos balísticos, tales como el bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, las construcciones de ADN pueden combinarse con regiones flanqueantes adecuadas de ADN-T e introducirse en un vector huésped de Agrobacterium tumefaciens convencional. Las funciones virulentas del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de la construcción y el marcador contiguo en el ADN de la célula vegetal cuando se infecte la célula por las bacterias.
Las técnicas de microinyección son conocidas en la técnica y están bien descritas en la literatura científica y de patentes. La introducción de construcciones de ADN utilizando la precipitación de polietilenglicol está descrita en Paszkowski et al Embo J. 3:2717-2722 (1984). Las técnicas de electroporación se describen en Fromm et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824 (1985). Las técnicas de transformación balística se describen en Klein et al. Nature 327:70-73 (1987).
Las técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluyendo el desarme y el uso de vectores binarios, se han descrito en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Horsch et al. Science 233:496-498 (1984), y Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983).
Las células vegetales transformadas que se derivan mediante cualquiera de las técnicas de transformación citadas anteriormente pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posea el genotipo transformado y de este modo el fenotipo deseado tal como la falta de semillas. Dichas técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo tisular, dependiendo habitualmente de un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pág. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pág. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. La regeneración también puede obtenerse a partir de callo de planta, explantes, órganos o partes de la misma. Tales técnicas de regeneración se describen de forma general en Klee et al. Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486 (1987).
Los ácidos nucleicos de la invención pueden utilizarse para conferir los rasgos deseados a esencialmente cualquier planta. De este modo, la invención puede usarse sobre un amplio rango de plantas, incluidas las especies de los géneros Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Trigonella, Triticum, Vitis, Vigna, y, Zea. Una planta de semilla dehiscente puede ser una planta útil en la invención, y puede ser una planta particularmente útil un miembro de las Brassicaceae, como por ejemplo la semilla de colza, o un miembro de las Fabaceae, como por ejemplo una planta de soja, guisante, lenteja o alubia.
En una realización, la invención proporciona una planta de semilla dehiscente que se caracteriza por una dispersión de semilla retardada debida a la expresión suprimida de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico IND1 en la planta de semilla dehiscente. Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "planta de semilla dehiscente" significa una planta que produce un fruto dehiscente seco, que tiene paredes en el fruto que se abren para permitir la salida de las semillas contenidas en el mismo. Los frutos dehiscentes contienen normalmente varias semillas e incluyen los frutos conocidos, como por ejemplo, las legumbres, las cápsulas y las silicuas.
En una realización, la invención proporciona una planta que se caracteriza por una dispersión de semilla retardada debida a la expresión suprimida de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico IND1, en la que la planta es un miembro de las Brassicaceae. Las Brassicaceae, comúnmente conocidas como las Brassicas, son un grupo diverso de plantas de cultivo con gran valor económico en el mundo entero (ver, por ejemplo, Williams y Hill, Science 232:1385-1389 (1986)). Las Brassicaceae producen aceites de semilla para la margarina, aceite para ensaladas, aceite para cocinar, usos plásticos e industriales; mostaza de condimento; verduras de hojas, almacenadas, elaboradas y en vinagre; forraje de animales y abonos verdes para el rejuvenecimiento de la tierra. La planta de la colza oleaginosa es una planta Brassica de la invención particularmente útil que no se encuentra de forma natural.
Hay seis especies de Brassica principales de importancia económica, cada una conteniendo un rango de formas de planta. Las Brassica napus incluyen plantas como la colza oleaginosa y el colinabo. Las Brassica oleracea son los cultivos de coles como por ejemplo la col, la coliflor, la col verde, el colirrábano, y las coles de Bruselas. La Brassica campestris (Bressica rapa) incluye: plantas como la col china, el nabo, y el pak choi. La Brassica juncea incluye una variedad de mostazas; la Brassica nigra es la mostaza negra; y la Brassica carinata es la mostaza etíope. El experto en la materia entiende que cualquier miembro de las Brassicaceae pude modificarse tal y como se describe en la presente invención para producir una planta Brassica que no se encuentra de forma natural caracterizada por una dispersión de semilla retardada.
En una segunda realización, la invención proporciona una planta que se caracteriza por una dispersión de semilla retardada debida a la expresión suprimida de una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico IND1, en la que la planta es un miembro de las Fabaceae. Las Fabaceae, que son comúnmente conocidas como miembros de la familia del guisante, son plantas que producen un fruto dehiscente seco característico conocido como una legumbre. La legumbre deriva de un único carpelo y se dehisza a lo largo de la sutura de los márgenes del carpelo y a lo largo de la vena mediana. Las Fabaceae comprenden tanto las legumbres de grano como las legumbres de pasto. Las legumbres de grano incluyen, por ejemplo, la soja (glicina), el guisante, el garbanzo, aconitifolia, haba, alubia de riñón, alubia lima, lenteja, frijol de vara, habas secas y cacahuete. Las legumbres de pasto incluyen alfalfa, forraje, lotus cornilatus, el trébol, las especies del género Stylosanthes, el lotononis bainessii y sainfoin. El experto en la técnica entenderá que cualquier miembro de las Fabaceae puede modificarse tal y como se explica en la presente invención para producir una planta de la invención que no se encuentra de forma natural caracterizada por una dispersión de semilla retardada.
Una planta de la invención que no se encuentra de forma natural caracterizada por una dispersión de semilla retardada también puede ser un miembro del género de plantas Cuphea (familia Lythraceae). Una planta Cuphea es particularmente válida ya que las semillas oleaginosas de la Cuphea contienen ácidos grasos de cadena media importantes industrial y nutricionalmente, especialmente el ácido láurico, que es suministrado actualmente sólo mediante aceites de coco y de nuez de palma.
Una planta de la invención que no se encuentra de forma natural también puede ser, por ejemplo, una de las hierbas monocotiledóneas, las cuales producen muchos de los cultivos válidos de cereal de grano pequeño del mundo. La supresión de la expresión de IND1 tal y como se ha descrito anteriormente, puede ser útil en la generación de una nueva planta de cereal de grano pequeño que no se encuentre de forma natural, como por ejemplo las plantas de la cebada, el trigo, la avena, el centeno, el dáctilo, la hierba de guinea, el sorgo o la hierba de césped caracterizadas por la dispersión de semilla retardada.
VI. Modificaciones adicionales que modulan la dispersión de la semilla
Debe entenderse que una planta de la invención, que contiene un polinucleótido IND1 exógeno, también puede contener una o más modificaciones adicionales, incluyendo las modificaciones naturales o no naturales, que pueden modular el retraso en la dispersión de la semilla. Por ejemplo, la hormona de la planta etileno fomenta la dehiscencia del fruto, y la expresión o la actividad modificada de reguladores positivos o negativos de la respuesta de etileno pueden incluirse en una planta de la invención (ver, de forma general, Meakin y Roberts, J. Exp. Botany 41:1003-1011 (1990); Ecker, Science 268:667-675 (1995); Chao et al., Cell 89:1133-1144 (1997)).
Las mutaciones en reguladores positivos de la respuesta de etileno muestran una reducción o ausencia de la sensibilidad al tratamiento con etileno exógeno. Las mutaciones de Arabidopsis en reguladores positivos de la respuesta de etileno incluyen mutaciones en etr, que inactivan un receptor de etileno histidina quinasa (Bleeker et al., Science 241:1086-1089 (1988); Schaller y Bleeker, Science 270:1809-1811 (1995)); ers (Hua y otros, Science 269:1712-1714 (1995)); ein2 (Guzman y Ecker, Plant Cell 2:513 (1990)); ein3 (Rothenberg y Ecker, Sem. Dev. Biol. Plant Dev. Genet. 4:3-13 (1993); Kieber y Ecker, Trends Genet. 9:356-362 (1993)); ain1 (van der Straeten et al., Plant Physiol. 102:401-408 (1993)); eti (Harpham et al., An. Bot. 68:55 (1991)) y ein4, ein5, ein6, y ein7 (Roman et al., Genetics 139: 1393-1409 (1995)). En otras especies de plantas se encuentran funciones genéticas similares; por ejemplo, la mutación nunca-madura corresponde a etr y confiere insensibilidad al etileno en el tomate (Lanahan et al., The Plant Cell 6:521-530 (1994); Wilkinson et al., Science 270:1807-1809 (1995)). Una planta de la invención puede incluir una modificación que da lugar a una expresión o actividad alterada de cualquiera de los reguladores positivos de la respuesta del etileno. Puede incluirse, por ejemplo, una mutación en un regulador positivo en una planta de la invención y puede modificar el retraso en la dispersión de la semilla en dichas plantas, por ejemplo, mediante el aplazamiento adicional del retraso en la dispersión de la semilla.
Las mutaciones en reguladores negativos de la respuesta del etileno manifiestan sensibilidad del etileno en ausencia de etileno exógeno. Dichas mutaciones incluyen aquellas relativas a la sobreproducción del etileno, por ejemplo, los mutantes eto1, eto2, y eto3, y aquellas relativas a la activación constitutiva del mecanismo de señalización del etileno, por ejemplo, mutaciones en CTR1, un regulador negativo con similitud de secuencias con la familia Raf de proteína quinasas (Kieber et al., Cell 72: 427-441 (1993)).
Una planta de la invención puede incluir una modificación que da lugar a la expresión o la actividad alterada de cualquiera de los reguladores negativos de la respuesta del etileno. Puede incluirse, por ejemplo, una mutación que de lugar a una sensibilidad del etileno en ausencia de etileno exógeno en una planta de la invención que no se encuentra de forma natural y puede modificar, por ejemplo, disminuir, el retraso en la dispersión de la semilla.
También puede incluirse mutaciones morfológicas del fruto en una planta de la invención. Tales mutaciones incluyen aquellas en los genes de identidad del carpelo como por ejemplo AGAMOUS (Bowman et al., ver referencia anterior, 1989; Yanofsky et al., ver referencia anterior, 1990) y en genes requeridos para el desarrollo normal del fruto como por ejemplo ETTIN, CRABS CLAW, SPATULA, AGL8 y TOUSLED (Sessions et al., Development 121:1519-1532 (1995); Alvarez y Smyth, Flowering Newsletter 23:12-17 (1997); y Roe et al., Cell 75:939-950 (1993)). De este modo, se entiende que una planta de la invención puede incluir una o más modificaciones genéticas adicionales, las cuales pueden disminuir o aumentar el retraso en la dispersión de la semilla.
VII. Expresión de productos génicos citotóxicos
La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que incluye un elemento regulador selectivo de la zona dehiscente unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico citotóxico. Adicionalmente en la presente invención se proporciona una planta de la invención que se caracteriza por una dispersión de la semilla retardada debida a la expresión de una molécula de ácido nucleico recombinante que tiene un elemento regulador selectivo de la zona dehiscente unido operativamente a una molécula de ácido nucleico que codifica un producto génico citotóxico.
Un producto génico citotóxico es un producto génico que causa la muerte de la célula en la cual se expresa y, preferiblemente, no da lugar a la muerte de células diferentes de la célula en la que se ha expresado. De este modo, la expresión de un producto génico citotóxico a partir de un elemento regulador selectivo de la zona dehiscente puede utilizarse para extirpar la zona dehiscente sin células vecinas perturbantes del replum o la válvula. En la técnica se conoce una variedad de productos génicos citotóxicos útiles en plantas de semillas incluyendo, por ejemplo, los polipéptidos de cadena A de la toxina de la difteria; RNasa T1; Barnasa RNasa; polipéptidos de cadena A de la toxina de la ricina; y productos génicos de la timidina quinasa (tk) del virus de herpes simplex. A pesar de que la cadena A de la toxina de la difteria, la RNasa T1 y la Barnasa RNasa son productos génicos citotóxicos preferentes, el experto en la materia entiende que estos, u otros productos génicos citotóxicos pueden utilizarse con un elemento regulador selectivo de la zona dehiscente para generar una planta de semilla que no se encuentra de forma natural caracterizada por la dispersión de la semilla retarda.
La toxina de la difteria es la toxina natural de la Comebacterium diphtariae, la cual cataliza la ADP-ribosilación del alargamiento del factor 2, dando lugar a la inhibición de la síntesis proteica y la consecuente muerte celular (Collier, Bacteriol. Rev. 39:54-85 (1975)). Una sola molécula de la toxina completamente activa es suficiente para matar una célula (Yamaizumi et al., Cell 15:245-250 (1978)). La toxina de la difteria tiene dos subunidades: la cadena B de la toxina de la difteria dirige la internalización hacia la mayoría de células eucariotas a través de un receptor de membrana específico, mientras que la cadena A codifica el dominio catalítico tóxico. La cadena DT-A catalítica no incluye un péptido señal y no se secreta. Adicionalmente, cualquier DT-A liberado por células muertas en ausencia de la cadena B de la toxina de la difteria se excluye de la unión celular. De esta manera, la DT-A es autónoma respecto la célula y dirige la citólisis sólo de las células en las que se expresa sin daño aparente hacia las células vecinas. El cassette de expresión de DT-A de Palmiter et al., que contiene los 193 residuos de la cadena A diseñada con un ATG sintético y con una carencia de la secuencia líder nativa, es particularmente útil en las plantas de semilla de la invención (Palmiter et al., Cell 50:435-443 (1987); Greenfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80: 6853-6857 (1983)).
La RNasa T1 de Aspergillus oryzae y la Barnasa RNasa de Bacillus amylolique-faciens también son productos génicos citotóxicos útiles en las plantas de semillas de la invención (Thorsness and Nasrallah, Methods in Cell Biology 50:439-448 (1995)). La Barnasa RNasa generalmente puede ser más tóxica para las plantas que la RNasa T1 y, de esta manera se la prefiere en los procedimientos de la invención.
La ricina, una proteína desactivadora de ribosoma producida por semillas de ricino, también es un producto génico citotóxico útil en una planta de semilla de la invención no natural. El polipéptido de la cadena A de la toxina de la ricina puede utilizarse para dirigir la ablación específica de la célula tal y como se describe, por ejemplo en Moffat et al., Development 114:681-687 (1992). Los ribosomas de la planta son variablemente susceptibles a la toxina de la ricina derivada de la planta. El experto entiende que la toxicidad de la ricina depende de si es variable y debe valorarse su toxicidad en las especies de la planta de semilla de interés (ver Olsnes y Phil, Molecular Action of Toxins and Viruses, págs. 51-105, Amsterdam: Elsevier Biomedical Press (1982)).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.
Ejemplo 1
El marcador del margen de la válvula GT140 (Sundaresan, V., et al. Genes Dev. 9, 1797-1810 (1995)) se expresa en el margen de la válvula del gineceo en desarrollo justo antes de la fertilización (etapa 13) y este patrón persiste en el fruto maduro (etapa 17). Como expresión de que este marcador está en gran parte ausente de los márgenes de la válvula de los frutos indehescentes shp1 shp2 (Liljegren, S.J., Ditta, G.S., Eshed, Y., Savidge, B., Bowman, J.L., and Yanofsky, M.F. Nature, en la prensa), se esperaba que el gen correspondiente a este marcador también podría estar involucrado en el desarrollo del margen de la válvula y ser requerido para la dehiscencia del fruto.
Para aislar la secuencia genómica flanqueante del sitio de inserción del marcador GT140, se realizó una TAIL/PCR tal y como se ha descrito anteriormente (Tsugeki, R., et al. Plant J. 10, 479-489 (1996)). La secuenciación posterior de los productos de la PCR aislados demostró que se corresponden a un BAC completamente secuenciado a partir del cromosoma 4, disponible en la base de datos pública como parte de la Arabidopsis Genome Initiative. La inserción de GT140 se localiza entre dos genes, uno que codifica un factor de trascripción hélice-bucle-hélice básico (bHLH) pronosticado y otro que representa un gen novedoso.
Mediante diferentes líneas de posterior investigación, se confirmó que el factor de trascripción bHLH (en la presente invención referido como IND1 tal como se indica a continuación) era el gen relevante (SEC ID Nº:1). Las fusiones promotor/potenciador::GUS del gen IND1 se introdujeron en plantas de tipo natural y se descubrió que expresaban GUS en un patrón idéntico al de la línea del marcador de GT140. De modo interesante, aproximadamente el 25% de las líneas transgénicas no consiguieron expresar actividad de GUS significativa y se manifestó un fenotipo indehiscente. La explicación más probable de estos resultados es que las fusiones INDI::GUS, además del gen IND1 endógeno, se cosuprimieron. La transferencia de ARN posterior confirmó una subregulación del gen IND1 en estas líneas, y una transferencia de ARN adicional mostró, tal y como se esperaba, una disminución en la expresión del gen de IND1 en los frutos shp1 shp2.
En paralelo a los estudios del marcador GT140 del margen de las válvulas descrito anteriormente, también se llevaron a cabo cribados para los mutantes de Arabidopsis que producen frutos indehiscentes. Además de la obtención de alelos adicionales de SHP1 y SHP2 mediante mutagénesis EMS de las existencias de semillas shp2-1 y shp1-1, se obtuvieron también mutantes indehiscentes que no eran alélicos a SHP1 o SHP2, respectivamente. Debido a que los estudios de GT140 sugirieron la posibilidad de que uno o más de esos mutantes indehiscentes pudiera corresponder al gen IND1, se clonó y se secuenció IND1 de varios de estos mutantes. Cuatro alelos representan alelos mutantes independientes de IND1. El alelo más fuerte, ind1-2, contiene una única deleción de nucleótido dentro del codón 55 que da lugar a un desplazamiento del marco de lectura y la producción de una proteína truncada de 64 en lugar de 198 aminoácidos. Los alelos ind1-1 y ind1-3 contienen substituciones de nucleótidos en los codones 141 y 128 que cambian un aminoácido de leucina por uno de fenilalanina y una arginina por una histidina, respectivamente. Estos aminoácidos afectados se encuentran ambos en posiciones conservadas dentro del dominio de bHLH. El alelo ind1-4 contiene una substitución de nucleótido en el codón 92 que cambia una glutamina por un codón de parada, causando la producción de una proteína truncada de 91 aminoácidos. Dado que la inactivación de este factor de trascripción bHLH previene la deshidencia del fruto, el gen es referido como INDEHISCENTE1 (IND1) y el mutante como, ind1. Hasta la fecha, ind1 representa la única mutación génica individual descrita en Arabidopsis que bloquea específicamente la dehiscencia del fruto.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido una gran precaución a la hora de recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.
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SEC ID No: 1 IND1 genómico
\vskip1.000000\baselineskip
Rango de secuencia: 1 a 3856
1
2
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No: 2 Proteína IND1
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No: 3 Promotor 5' de IND1
\vskip1.000000\baselineskip
6
7
8 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO: 4 Promotor 3' de IND1
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID NO: 5 SHP1 genómico
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID No: 6 SHP2 genómico
\vskip1.000000\baselineskip
15
16
17
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Liljegren, Sarah
\hskip1.05cmYanofsky, Martin F.
\hskip1.05cmThe Regents of the University of California
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Control la dehiscencia del Fruto en Arabidopsis mediante genes INDEHISCENTES 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 19452A-000700US
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> WO PCT/US01/11967
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2001-04-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/548,971
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-04-13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> INDEHISCENTE1 (IND1) genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2765) .. (3361)_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> IND1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
20
21
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína INDEHISCENTE1 (IND1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2765
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región no traducida 5' del promotor de IND1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región no traducida 3' del promotor de IND1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5622
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SHATTERPROOF1 (SHP1) genómico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (935).._(941)_
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<223> n = cualquier nucleótido
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<400> 5
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27
28 
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<210> 6
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<211> 6138
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<212> ADN
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<213> Arabidopsis thaliana 
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<220>
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<223> SHATTERPROOF2 (SHP2) genómico
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<400> 6
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29
30 
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<210> 7
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<211> 51
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: dominio de unión a ADN hélice-bucle-hélice (bHLH) básico de IND1
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<400> 7
31 
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<210> 8
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador para la amplificación de región genómica IND1 de ADNc
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
gatgaaaatg gaaaatggta tgtata 
\hfill
26 
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<210> 9
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador para la amplificación de región genómica IND1 de ADNc
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttcatcagg gttgggagtt gtg 
\hfill
23

Claims (47)

1. Cassette de expresión que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos IND1, o un complemento de la misma, que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a la SEC ID No: 2.
2. Cassette de expresión según la reivindicación 1, en el que el polipéptido IND1 comprende la SEC ID No: 2.
3. Cassette de expresión según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido IND1 comprende las posiciones desde aproximadamente 2765 a aproximadamente 3361 de la SEC ID No: 1.
4. Cassette de expresión según la reivindicación 3, en el que el polinucleótido IND1 comprende la SEC ID No: 1.
5. Cassette de expresión que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un polinucleótido, o un complemento del mismo, en el que el polinucleótido es idéntico por lo menos en un 60% a por lo menos 200 nucleótidos contiguos de una secuencia que codifica la SEC ID No: 2.
6. Cassette de expresión según la reivindicación 5, en el que la secuencia es la SEC ID No: 1.
7. Cassette de expresión según la reivindicación 5, en el que el polinucleótido es idéntico por lo menos en un 60% a una secuencia de nucleótidos que codifica la SEC ID No: 2.
8. Cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el promotor es constitutivo.
9. Cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el promotor es específico de tejido.
10. Cassette de expresión según la reivindicación 9, en el que el promotor es un promotor específico de la zona de dehiscencia.
11. Cassette de expresión según la reivindicación 10, en el que el promotor comprende las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1.
12. Planta que comprende un cassette de expresión recombinante que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos IND1 que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a la SEC ID No: 2.
13. Planta que comprende un cassette de expresión recombinante tal como se define en la reivindicación 5.
14. Procedimiento para retrasar la dehiscencia del fruto en una planta, comprendiendo el procedimiento la supresión de la expresión de un ácido nucleico IND1 en la planta mediante la introducción en la planta de un cassette de expresión recombinante que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido IND1 idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a la SEC ID No: 2.
15. Planta según la reivindicación 12 ó 13, en la que la secuencia de polinucleótidos está unida operativamente al promotor en la orientación antisentido.
16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la secuencia de polinucleótidos está unida operativamente al promotor en la orientación antisentido.
17. Planta según la reivindicación 12 ó 13, en la que la secuencia de polinucleótidos está unida operativamente al promotor en la orientación de sentido.
18. Procedimiento según la reivindicación 14, en la que la secuencia de polinucleótidos está unida operativamente al promotor en la orientación de sentido.
19. Planta según la reivindicación 17, cuando depende de la reivindicación 12, en la que la secuencia de polinucleótidos comprende además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1 donde la segunda secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a un segundo promotor en la orientación antisentido.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la secuencia de polinucleótidos comprende además una segunda secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido IND1 donde la segunda secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a un segundo promotor en la orientación antisentido.
21. Planta según la reivindicación 17, cuando depende de la reivindicación 13, en la que la planta comprende además un segundo polinucleótido idéntico por lo menos en un 60% a por lo menos 200 nucleótidos contiguos de una secuencia que codifica la SEC ID No: 2, donde la segunda secuencia de polinucleótidos está unida operativamente a un segundo promotor en la orientación antisentido.
22. Planta según la reivindicación 12 ó 13, en la que la lignificación se reduce en las células del margen de las válvulas.
23. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la lignificación se reduce en las células del margen de las válvulas.
24. Planta según la reivindicación 12, en la que el promotor es tal como se define en la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
25. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el promotor es tal como se define en la reivindicación 10 o la reivindicación 11.
26. Planta según la reivindicación 13, en la que el promotor es tal como se ha definido en la reivindicación 8 ó 10.
27. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el cassette de expresión recombinante se introduce en la planta utilizando Agrobacterium.
28. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el polipéptido IND1 comprende la SEC ID No: 2.
29. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el polinucleótido IND1 comprende las posiciones desde aproximadamente 2765 a aproximadamente 3361 de la SEC ID No: 1.
30. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el polinucleótido IND1 comprende la SEC ID No: 1.
31. Planta según la reivindicación 13, en la que la secuencia es la SEC ID No: 1.
32. Planta según la reivindicación 13, en la que el polinucleótido es idéntico por lo menos en un 60% a una secuencia de nucleótidos que codifica la SEC ID No: 2.
33. Planta según la reivindicación 13, en la que la planta está caracterizada por una dehiscencia de la semilla retardada en comparación con una planta que no comprende el cassette de expresión.
34. Procedimiento para retrasar la dehiscencia del fruto en una planta, comprendiendo el procedimiento:
(i) suprimir la expresión de un gen IND1 o un polipéptido idéntico por lo menos en un 60% a la SEC ID No: 2 en la planta mediante la introducción en la planta de un cassette de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos idéntica por lo menos aproximadamente en un 70% a las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3586 de la SEC ID No: 1; y
(ii) seleccionar una planta con dehiscencia de fruto retardada en comparación con una planta en la que la expresión del gen IND1 o el polipéptido no está suprimida.
35. Procedimiento según la reivindicación 34, parte (i), en el que la secuencia de polinucleótidos comprende las posiciones desde aproximadamente 1 a aproximadamente 2764 o desde aproximadamente 3362 a aproximadamente 3856 de la SEC ID No: 1.
36. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que la lignificación se reduce en las células del margen de las válvulas.
37. Procedimiento para retrasar la dehiscencia del fruto en una planta, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
(i) tratar las semillas o material vegetal con una sustancia química mutagénica o con radiación ionizante;
(ii) identificar las plantas con un gen IND1 mutado, en las que el gen IND1, antes de mutar, codifica un polipéptido que tiene una identidad en la secuencia de por lo menos un 60% con la SEC ID No: 2; y
(iii) seleccionar una planta con dehiscencia del fruto retardada en comparación con una planta en la que el gen IND1 no está mutado.
38. Procedimiento según la reivindicación 34, parte (i), en la que la etapa de supresión comprende la introducción en la planta de un cassette de expresión recombinante tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el polinucleótido está unido operativamente al promotor en la orientación antisentido.
40. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el polinucleótido está unido operativamente al promotor en la orientación de sentido.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, en el que el polinucleótido comprende además un segundo polinucleótido idéntico por lo menos en un 60% a por lo menos 200 nucleótidos contiguos de una secuencia que codifica la SEC ID No: 2, donde el segundo polinucleótido está unido operativamente a un segundo promotor en la orientación antisentido.
42. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el promotor es un elemento regulador selectivo de la zona de dehiscencia
43. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el cassette de expresión recombinante se introduce en la planta utilizando Agrobacterium.
44. Planta que comprende un polinucleótido modificado idéntico por lo menos en un 65% a la SEC ID No: 1, en la que la planta muestra una dehiscencia de fruto retardada en comparación con una planta que carece del polinucleótido modificado.
45. Planta según la reivindicación 44, en la que el polinucleótido modificado es idéntico por lo menos en un 70% a la SEC ID No: 1.
46. Procedimiento de creación de una planta con dehiscencia de fruto retardada, comprendiendo el procedimiento la introducción en dicha planta de un cassette de expresión recombinante que comprende un promotor unido operativamente a un polinucleótido que es idéntico por lo menos en un 60% a por lo menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID No: 1 y la selección de una planta con dehiscencia de fruto retardada en comparación con una planta que carece del cassette de expresión recombinante.
47. Procedimiento según la reivindicación 46, que comprende la expresión en la planta de un polinucleótido de sentido idéntico por lo menos en un 65% a por lo menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID No: 1 y la expresión en la planta de un polinucleótido antisentido idéntico por lo menos en un 65% a por lo menos 200 nucleótidos contiguos de la SEC ID No: 1.
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