ES2301778T3 - Metodo y kit de valoracion del inicio de artritis reumatoide. - Google Patents
Metodo y kit de valoracion del inicio de artritis reumatoide. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2301778T3 ES2301778T3 ES03700501T ES03700501T ES2301778T3 ES 2301778 T3 ES2301778 T3 ES 2301778T3 ES 03700501 T ES03700501 T ES 03700501T ES 03700501 T ES03700501 T ES 03700501T ES 2301778 T3 ES2301778 T3 ES 2301778T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- baselineskip
- sequence
- mutation
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 133
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 66
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 37
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 27
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 23
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 19
- 208000022602 disease susceptibility Diseases 0.000 claims description 5
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 abstract description 30
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 29
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 29
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 abstract description 24
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002456 anti-arthritic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000003356 anti-rheumatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 229940076376 protein agonist Drugs 0.000 abstract 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 12
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 11
- 101000924552 Homo sapiens Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000000041 non-steroidal anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 4
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 102100022014 Angiopoietin-1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 101000753291 Homo sapiens Angiopoietin-1 receptor Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 2
- 108010090091 TIE-2 Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000012753 TIE-2 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002988 disease modifying antirheumatic drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000027932 Collagen disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000001790 Welch's t-test Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- -1 cDNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 210000004090 human X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000008407 joint function Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009745 pathological pathway Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 102200082402 rs751610198 Human genes 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
- G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
- G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
Método de evaluación, en una muestra derivada de una persona, del inicio o la posibilidad de inicio de artritis reumatoide en la persona, comprendiendo el método la etapa de: llevar a cabo o bien una detección de un gen (a) o un gen (b) o una proteína (c); o bien medir una cantidad de ARNm expresado (d), en el que: el gen (a) es un gen de susceptibilidad a la enfermedad para la artritis reumatoide, codificando el gen para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID NO. 1 y que tiene una mutación tal que se inserta glicina como el aminoácido número 269 en la secuencia; el gen (b) es un gen de susceptibilidad a la enfermedad para la artritis reumatoide, codificando el gen para una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID NO. 1 y que tiene una mutación tal que se inserta glicina como el aminoácido 269 en la secuencia, tiene una secuencia de bases mostrada en SEQ. ID NO. 2 y tiene una mutación tal que se insertan 3 bases "GGT" como las bases número 805 a 807 en la secuencia; la proteína (c) es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID NO. 1, y que tiene una mutación tal que se inserta glicina como el aminoácido número 269 en la secuencia; y el ARNm (d) se deriva de un gen de susceptibilidad a la enfermedad para la artritis reumatoide, teniendo el gen la secuencia de bases que es tal como se muestra en SEQ. ID NO. 2 pero con la deleción de 3 bases "GGT", que son las bases número 805 a 807 en la secuencia.
Description
Método y kit de valoración del inicio de
artritis reumatoide.
Se describe un gen de susceptibilidad a la
enfermedad para la artritis reumatoide y la presente invención se
refiere a un uso del mismo. Específicamente, la presente invención
proporciona un método de evaluación para evaluar el inicio o la
posibilidad de inicio de artritis reumatoide. El método de
evaluación detecta si está presente o ausente la mutación del gen o
la mutación de una proteína que es el producto de la traducción del
gen. Además, se describe un remedio y un medicamento de cura para el
reumatismo.
La artritis reumatoide (a continuación en el
presente documento, puede denominarme sólo como "AR"), cuyo
síntoma principal es la artritis erosiva múltiple, es una
enfermedad inflamatoria sistémica cuya causa se desconoce y que
afecta a múltiples órganos a la vez. La AR se desarrolla de manera
crónica alternando entre remisión y agravamiento, produce el daño y
la deformación de las articulaciones si no se trata y finalmente
muestra la disfunción de los órganos motores. En algunos casos, la
AR es potencialmente mortal. Por tanto, los pacientes con AR
padecen física y mentalmente fuertes dolores durante toda su
vida.
La AR muestra una amplia variedad de síntomas.
Para el diagnóstico de la AR, se han usado ampliamente los
criterios de diagnóstico del Colegio Americano de Reumatología
(American College of Rheumatology). Sin embargo, el inicio de la AR
es lento y normalmente tarda de varias semanas a varios meses. El
resultado positivo en porcentaje de un factor reumatoide que se usa
como un índice objetivo en los criterios de diagnóstico adoptados
por el Colegio Americano de Reumatología, es de aproximadamente el
33% en un plazo de tres meses y de aproximadamente el 88% en doce
meses y más (Treatment, Vol. 73, Nº 3, págs. 23-27,
en 1991), y no se ha logrado un diagnóstico definitivo de la AR. En
consecuencia, se han realizado enfoques del diagnóstico de la
artritis reumatoide detectando anticuerpos IgM relacionados con la
artritis reumatoide en sueros de pacientes que reaccionan con un
antígeno recombinante (véase la publicación de patente japonesa
abierta a consulta por el público número 513257/1998 (Tokukaihei
10-513257) publicada el 15 de diciembre de
1998).
Además, en el tratamiento de la AR, las medidas
terapéuticas que han de seleccionarse difieren habitualmente
dependiendo del transcurso en evolución del estado de la afección de
AR. Generalmente, en un estadio temprano, cuando no puede
proporcionarse un diagnóstico definitivo, se administra un fármaco
antiinflamatorio no esteroideo (AINE). En el caso de que pueda
proporcionarse el diagnóstico definitivo, se administran fármacos
antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME) además del
AINE. Especialmente en el estadio temprano del inicio de la AR, es
difícil proporcionar un diagnóstico definitivo. En las presentes
circunstancias, se lleva a cabo una discriminación de otras
enfermedades reumatoides, incluyendo enfermedad del colágeno, junto
con una observación cuidadosa de la evolución mientras se
administra el AINE. Cuando los síntomas evolucionan adicionalmente,
puede administrarse un fármaco esteroideo, y se lleva a cabo un
tratamiento médico para el aumento del alivio del dolor junto con
un tratamiento físico y un tratamiento ortésico para el
mantenimiento y la recuperación de la función articular. Además,
cuando el daño articular produce incomodidad en la vida diaria,
puede llevarse a cabo un tratamiento quirúrgico.
Se han esclarecido aspectos de la artritis y el
daño articular que produce la AR, particularmente los transcursos
patológicos de la misma, de manera gradual a través de diversos
trabajos de investigación. Se induce AR mediante la participación
concomitante de numerosos factores causantes incluyendo el entorno
de vida y entonces se agrava progresivamente hasta el estadio de
enfermedades manifiestas; por tanto, debe esclarecerse el mecanismo
interactivo per se de tales numerosos factores para una
caracterización precisa y un manejo terapéutico apropiado de la
enfermedad. La prevalencia de la AR no es superior al 1% a escala
global (New England Journal of Medicine, Vol. 322, págs.
1277-1289, en 1990), pero la frecuencia de la
enfermedad es aproximadamente 8 veces mayor entre los hermanos de
los pacientes con la enfermedad (Cell, Vol. 85, págs.
311-318, en 1996). Por tanto, se pronostica que un
factor genético determinado puede servir como uno de los factores
causantes. Dado que el entorno se considera como uno de los
factores causantes, el conocimiento previo de la posibilidad de
inicio de la AR hace posible retrasar y prevenir el inicio de la AR
prestando atención a la dieta, infecciones virales, tensiones, etc.
en la vida diaria. Además, un diagnóstico temprano y un tratamiento
apropiado en estadios tempranos pueden retrasar el transcurso de la
AR y se espera una mejora del pronóstico.
En la publicación de patente internacional
WO98/51791 (publicada el 19 de noviembre de 1998), los inventores
de la presente solicitud han realizado el análisis de ligamiento
usando marcadores de microsatélite en pacientes con AR y sus
hermanos y se especificaron tres loci en los que se ubican genes
causantes de la artritis reumatoide. Se han identificado los
siguientes genes causantes:
(1) Un gen causante de la artritis reumatoide,
gen que se ubica dentro de \pm1 centimorgan en una secuencia de
ADN en el cromosoma 1 humano con el que se hibridan los marcadores
de microsatélite D1S214 y/o D1S253.
(2) Un gen causante de la artritis reumatoide,
gen que se ubica dentro de \pm1 centimorgan en una secuencia de
ADN en el cromosoma 8 humano con el que se hibrida el marcador de
microsatélite D8S556.
(3) Un agente causante de la artritis
reumatoide, gen que se ubica dentro de \pm1 centimorgan en una
secuencia de ADN en el cromosoma X humano con el que se hibridan
los marcadores de microsatélite DXS1001, DXS1047, DXS1205, DXS1227
y/o DXS1232.
Tal como se describió anteriormente, se encontró
que los loci de los genes de susceptibilidad a la enfermedad de la
artritis reumatoide se ubican en los cromosomas 1, 8 y X. Entre los
cromosomas, se han identificado los genes de susceptibilidad a la
enfermedad de la AR para los cromosomas 1 y X, pero no para el
cromosoma 8.
En vista de esto, los objetos de la presente
invención son identificar los genes de susceptibilidad a la
enfermedad de la artritis reumatoide ubicados en el cromosoma 8
humano, y proporcionar un método de evaluación (diagnóstico) para
evaluar el inicio o la posibilidad de inicio de AR con alta
precisión detectando si está presente o ausente la mutación del gen
o la mutación de una proteína que es producto de la traducción del
mismo. Se describe un kit de evaluación (diagnóstico) de la misma
así como un remedio y un medicamento de cura para pacientes con AR
que tienen una mutación en el gen de susceptibilidad a la enfermedad
para la artritis reumatoide.
En vista de los objetos mencionados
anteriormente, el inventor de la presente invención llevó a cabo un
mapeo génico detallado del cromosoma 8 humano usando una pluralidad
de marcadores de microsatélite, identificando de ese modo un locus
de un gen relacionado con la AR. Además, el inventor de la presente
invención estudió la posibilidad de que el gen de la angiopoyetina
1 ubicado en las proximidades del locus sea un gen de
susceptibilidad a la enfermedad de la AR. Mediante experimentos, el
inventor de la presente invención descubrió lo siguiente: este gen
tiene dos tipos: tipo con inserción de 3 bases y tipo con deleción
de 3 bases; había una diferencia significativa entre un sujeto sano
y un paciente con AR, suponiendo que los homocigotos del tipo con
deleción de 3 bases no tiene mutación, y los heterocigotos y
homocigotos del tipo con inserción de tres bases tienen mutación; y
la expresión de ARNm en pacientes con AR es significativamente
inferior que en sujetos sanos.
Basándose en estos hallazgos, el inventor de la
presente invención descubrió la eficacia del método de evaluación
(diagnóstico) y del kit de evaluación (diagnóstico) para evaluar el
inicio o la posibilidad de inicio de la AR, y de ese modo se
consiguió la presente invención. Además, la presente invención
también es eficaz como un remedio y un medicamento de cura
novedosos para la artritis reumatoide.
En la presente memoria descriptiva, A, C, G y T
representan las bases de adenina, citosina, guanina y timina,
respectivamente, a menos que se indique lo contrario. Además, los
aminoácidos y residuos de aminoácido se expresan mediante un código
de una letra o un código de tres letras definidos por la IUPAC y la
IUB.
Un objeto de la presente invención se refiere a
un método detallado en la reivindicación 1, para evaluar, en una
muestra derivada de una persona, el inicio o la posibilidad de
inicio de artritis reumatoide en la persona, comprendiendo el
método la etapa de llevar a cabo o bien una detección de un gen (a)
o un gen (b) o una proteína (c) o bien medir una cantidad de ARNm
expresado (d).
El gen (a) usado según la presente invención es
un gen de susceptibilidad a la enfermedad para la artritis
reumatoide, codificando el gen para una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID NO. 1 y que tiene una
mutación tal que se inserta glicina como el aminoácido número 269 en
la secuencia. Específicamente, el gen (b) usado según la presente
invención puede ser, por ejemplo, el gen de la angiopoyetina 1, y
tiene la secuencia de bases mostrada en SEQ. ID NO. 2 y que tiene
una mutación tal que se insertan 3 bases "GGT" como las bases
número 805 a 807 en la secuencia. Las bases número 805 a 807
corresponden a las bases número 1114 a 1116 en la secuencia de
bases (número de registro U83508) registrada como el ADNc del gen de
la angiopoyetina 1 en el banco de
genes.
genes.
El término "gen" incluye polinucleótidos
tales como, al menos, ADN genómicos, ADNc, ARNm y similares. Por
tanto, el gen usado según la presente invención puede ser, además de
ADNc del gen de la angiopoyetina 1, (i) un ARNm que tiene una
secuencia de bases correspondiente a una secuencia de bases del
ADNc, (ii) un ADN genómico a partir del cual se transcribe el ARNm
o (iii) similares. Sin embargo, el término "gen" indica no sólo
ADN bicatenarios, si no también ADN monocatenarios (cadena sentido
o cadena antisentido) que constituyen los ADN bicatenarios, o ARN.
Además, el "gen" puede contener una secuencia de una región no
traducida (UTR), una secuencia promotora, una secuencia de vector
(incluyendo una secuencia de vector de expresión) y la secuencia
similar, además de una región de traducción.
El ARNm (d) se deriva en el presente documento
de un gen de susceptibilidad a la enfermedad para la artritis
reumatoide, teniendo el gen la secuencia de bases que es tal como se
muestra en SEQ ID NO: 2 pero con la deleción de 3 bases "GGT",
que son las bases número 805 a 807 en la secuencia.
La proteína (c) usada según la presente
invención es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en SEQ. ID NO.1, y que tiene una mutación tal que se
inserta glicina como el aminoácido número 269 en la secuencia. La
proteína es un producto de la traducción del gen de la angiopoyetina
1 mencionado anteriormente y puede contener además un polipéptido
adicional. Se añade tal polipéptido, por ejemplo, en el caso en el
que a esta proteína se le añade una cola con un epítopo usando una
cola de His o similares.
La angiopoyetina 1 mencionada anteriormente es
un factor que pertenece a la familia de la angiopoyetina y se
considera que desempeña un papel importante en la formación de vasos
sanguíneos. El receptor tipo tirosina cinasa relacionado con la
angiogénesis tiene la familia de receptores de VEGF y la familia de
receptores TIE. Se ha notificado que se produce VEGF de manera
excesiva en pacientes con AR (véase Ann Rheum Dis: 59:
i65-71, 2000). Se sabe que la angiopoyetina 1 es un
ligando para el receptor TIE2 y actúa de manera complementaria con
VEGF para suprimir el daño a los vasos y la hemorragia (véase Nature
Medicine: Vol.6:460-463:2000). Sin embargo, se
entiende escasamente la relación entre la angiopoyetina 1 y la
afección.
El inventor de la presente invención descubrió
un ligamiento en el microsatélite D8S556 realizando un mapeo génico
detallado tal como se describió anteriormente. Debido a que el
hallazgo concuerda con el resultado de un análisis de ligamiento
realizado anteriormente, el inventor de la presente invención
considera que este sitio es el locus del gen de susceptibilidad a
la enfermedad de la AR en el cromosoma 8 humano.
Se mapea el D8S556 mencionado anteriormente en
una región del brazo largo del cromosoma 8 humano. Esta región
corresponde a una región del cromosoma 15 en ratones. Se ha
notificado que están presentes loci Paam1 del gen de
susceptibilidad a la artritis en la región del cromosoma 15 (véase
"Ryumachi" 40(5):833-848, 2000).
Además, se ha encontrado que D8S556 se ubica en
584.52-584.72cR (véase "Ryumachi" vol.39: P445,
1999). La angiopoyetina 1 se mapea en 589.07cR en el mapa GB4.
Debido a su ubicación en los cromosomas, es razonable considerar a
la angiopoyetina 1 como candidato para un gen de susceptibilidad a
la enfermedad.
Además, como resultado del análisis en un gen
aislado de las membranas sinoviales y la sangre periférica de
pacientes con AR, se descubrió que existen dos tipos del gen de la
angiopoyetina 1; el tipo con inserción de 3 bases y el tipo con
deleción de 3 bases. A continuación en el presente documento, el
sitio en una secuencia génica en el que se produce inserción de
tres bases y deleción de tres bases se denomina "sitio de
mutación". De manera similar, el sitio en una secuencia de
aminoácidos en el que se produce inserción de glicina y deleción de
glicina se denomina "sitio de mutación". El sitio de mutación
en la secuencia de aminoácidos corresponde al sitio de mutación en
la secuencia génica.
Obsérvese que también se ha notificado que la
deleción de 3 bases se produce en la línea celular humana T98G
(véase Cell. Vol.87: 1161-1169, 1996).
La angiopoyetina 1 potencia la formación de la
red de vasos sanguíneos actuando de manera complementaria con VEGF.
Específicamente, VEGF es un importante factor promotor de la
angiogénesis, y promueve la migración y proliferación de células
endoteliales. Entonces, se estructura un vaso sanguíneo maduro
formando una nueva membrana basal vascular. De hecho, un vaso
sanguíneo inducido usando sólo VEGF en un experimento era inmaduro
y produjo fácilmente hemorragia. Se ha notificado que tiene lugar
una producción excesiva de VEGF en la AR. (Véase Ann Rheum Dis: 59:
i65-71, 2000). Sin embargo, no existe notificación
con respecto a la angiopoyetina 1 en tal estado. El inventor de la
presente invención comparó pacientes con AR y sujetos sanos en
cuanto a la cantidad de ARNm de angiopoyetina 1 expresado y
descubrió que la cantidad del ARNm expresado era significativamente
baja en la sangre periférica de los pacientes con AR. Esto sugiere
que, en la AR, la proliferación de vasos sanguíneos inmaduros
contribuye posiblemente al desarrollo de inflamación crónica que
está provocada por el escape de células inmunitarias de la
sangre.
Tal como se describe más adelante en detalle, un
gen y una proteína tal como se describen en el presente documento
tienen utilidad de manera eficaz en el método de evaluación para
evaluar el inicio o la posibilidad de inicio de AR, tal como se
detalla en las reivindicaciones 1 y 2.
En el presente documento, se explicará a
continuación el método de la presente invención de evaluación del
inicio o la posibilidad de inicio de AR (en otras palabras, un
método de diagnóstico de AR), tratando, en orden, (i) un caso en el
que se usa un ADN genómico como gen, (ii) un caso en el que se usa
un ARNm (ADNc) como gen y luego (iii) un caso en el que se usa una
proteína.
El presente método de evaluación usando el ADN
genómico puede llevarse a cabo tal como explica a continuación, por
ejemplo.
Puede obtenerse el genoma de un sujeto a partir
de cualquier célula de ser humano mediante métodos convencionales
conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede obtenerse el genoma a
partir de un cabello, cualquier órgano, un linfocito periférico,
una célula sinovial y similares. Además, puede obtenerse el genoma a
partir de una célula que se ha obtenido del sujeto y entonces se ha
cultivado después de eso para que se multiplique. Además, el genoma
así obtenido puede amplificarse antes de su uso. La amplificación
puede llevarse a cabo mediante un método de amplificación génica
llevado a cabo normalmente, tal como el método de PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), método de NASBA (amplificación basada en
la secuencia de ácido nucleico), el método de TMA (amplificación
mediada por transcripción), el método de SDA (amplificación por
desplazamiento de cadena) y similares.
No existe ninguna limitación particular sobre
cómo evaluar si el genoma tiene una mutación o no. Por ejemplo, la
evaluación puede realizarse usando el método de la sonda de
oligonucleótido específica de alelo, el método de ensayo de
ligación de oligonucleótidos, el método de PCR-SSCP,
el método de PCR-CFLP, el método de
PCR-PHFA, el método Invader, el método de RCA
(amplificación por circulo rodante), el método de extensión de bases
con oligonucleótidos cebadores o métodos similares.
Por ejemplo, la detección de si el genoma tiene
una mutación o no puede llevarse a cabo mediante (i) amplificar una
región que contiene el sitio de mutación del gen procedente del
genoma obteniendo de ese modo un producto de PCR, (ii) subclonar el
producto de PCR así obtenido y luego (iii) realizar la secuenciación
directa del producto de PCR subclonado. Además, usando la región
que contiene el sitio de mutación en una sonda de oligonucleótido,
también es posible detectar si el genoma tiene la mutación o no. La
región que contiene el sitio de mutación se usa en una sonda de
oligonucleótido, por ejemplo, en el caso en el que se constituye un
chip de ADN fijando, en un chip, un oligonucleótido que incluye una
secuencia de bases que contiene el sitio de mutación, y se usa el
chip de ADN para detectar si la mutación está presente o ausente. En
este caso, la sonda de oligonucleótido, que incluye el sitio de
mutación en la misma, tiene preferiblemente una longitud de 7 a 50
nucleótidos o una longitud de 10 a 30 nucleótidos y más
preferiblemente tiene una longitud de 15 a 25 nucleótidos.
Además, la detección de si el genoma tiene la
mutación o no puede realizarse llevando a cabo una transferencia de
tipo Southern o similar con el fin de detectar una diferencia entre
fragmentos del genoma en cuanto al tamaño, escindiéndose los
fragmentos del genoma usando una enzima de restricción
apropiada.
Realizando la detección de la mutación en el
genoma de estas formas, es posible diagnosticar, con alta precisión,
al sujeto en cuanto a la AR (evaluar si el sujeto ha desarrollado
AR o hay una posibilidad de que el sujeto desarrolle AR).
Específicamente, tal como se describe más adelante, se encontró una
diferencia significativa entre los pacientes con AR y los sujetos
sanos, en los que no se encuentra mutación en homocigotos del tipo
con deleción de tres bases pero se encuentra una mutación en
heterocigotos y homocigotos del tipo con inserción de tres bases.
Por tanto, se valora que existe una baja posibilidad de inicio de AR
o posibilidad de inicio de AR, cuando se detecta un homocigoto del
tipo con deleción de tres bases. En cambio, se valora que existe
una alta posibilidad de inicio de AR o posibilidad de inicio de AR
cuando se detecta un heterocigoto, especialmente cuando se detecta
un homocigoto del tipo con inserción de tres bases.
Obsérvese que pueden prepararse un cebador y una
sonda usados en el método de evaluación usando un sintetizador de
ADN mediante métodos convencionales conocidos en la técnica.
En el caso en el que se usa ARNm, la detección
de si la mutación está presente o ausente puede llevarse a cabo tal
como sigue, por ejemplo: se prepara un ADNc a partir del ARNm
mediante transcripción inversa, extrayéndose el ARNm de una célula
de un sujeto. Entonces, se amplifica la región del ADNc que contiene
el sitio de mutación. Después de eso, se lleva a cabo la detección
(i) secuenciando directamente una secuencia de bases del fragmento
así amplificado, (ii) usando un chip de ADN o (iii) usando el método
de RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción).
No existe ninguna limitación particular en el
cebador que va a usarse en la amplificación de la región que
contiene el sitio de mutación. Por ejemplo, puede realizarse una
reacción de amplificación en la que se usa un ADNc como molde
usando la siguiente combinación de cebadores.
| Cebador sentido: | 5'-GCTGGCAGTACAATGACAG-3' | (SEQ. ID NO. 3) | |
| Cebador antisentido: | 5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3 | (SEQ. ID NO. 4) |
Detectando, de esta forma, si el ARNm (ADNc)
tiene la mutación o no, es posible diagnosticar, con alta precisión,
al sujeto en cuanto a la AR (evaluar si el sujeto ha desarrollado
AR o hay una posibilidad de que el sujeto desarrolle AR).
Un método alternativo de evaluación del inicio o
la posibilidad de inicio de AR usando el ARNm es medir una cantidad
de un ARNm expresado (es decir, ARNm de angiopoyetina 1 del tipo con
deleción de 3 bases) derivado de un gen de susceptibilidad a la
enfermedad para AR, teniendo el gen una secuencia de bases que es
tal como se muestra en SEQ. ID NO. 2 y no está mutada de manera que
se inserten 3 bases "GGT", que son las bases número 805 a 807
en la secuencia.
En términos más específicos, el método de
evaluación anterior se dispone de manera que se fija un par de
valores umbral 1 y 2 con respecto a la cantidad del ARNm expresado,
siendo el valor umbral 1 < el valor umbral 2; si la cantidad de
ARNm expresado es igual o inferior al valor umbral 1, se valora que
el sujeto ha desarrollado de manera sumamente posible artritis
reumatoide o hay una alta posibilidad de que el sujeto desarrolle
artritis reumatoide en el futuro; y si la cantidad del ARNm
expresado es igual o superior al valor umbral 2, se valora que el
sujeto probablemente no ha desarrollado artritis reumatoide o hay
una baja posibilidad de que el sujeto desarrolle artritis
reumatoide en el futuro. Es posible usar el método de
RT-PCR o similar bien conocido de manera
convencional para medir la cantidad del ARNm expresado para su uso
en el método para evaluar el inicio o la posibilidad de inicio
de
AR.
AR.
En el caso en el que se usa la proteína
preparada a partir de la célula del sujeto, puede adoptarse un
método para evaluar si se inserta glicina o no en el sitio de
mutación en la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID NO. 1. La
detección de si se inserta glicina o no puede llevarse a cabo
mediante un método de secuenciación general para proteínas. Por
ejemplo, la detección de glicina puede llevarse a cabo tal como
sigue: se prepara un anticuerpo que reconoce sólo la proteína del
tipo con inserción de glicina, y entonces se realiza la detección
de glicina usando el método de ELISA; se aísla una proteína.
Entonces, usando un secuenciador de proteínas, se detecta la
mutación en la proteína aislada que, si es necesario, puede
fragmentarse usando una enzima o similar; se detecta la mutación
con respecto al punto isoeléctrico de un aminoácido; se detecta una
diferencia en la masa mediante espectrometría de masas. Es
preferible adoptar el método en el que se realiza la detección de
glicina preparando el anticuerpo que reconoce sólo la proteína del
tipo con inserción de glicina, y usando el método de ELISA.
Detectando de esta forma si se inserta glicina o
no en el sitio de mutación, es posible diagnosticar, con alta
precisión, al sujeto en cuanto a la AR (evaluar si el sujeto ha
desarrollado AR o hay una posibilidad de que el sujeto desarrolle
AR). Específicamente, tal como se describe más adelante, se encontró
una diferencia significativa entre los pacientes con AR y los
sujetos sanos, en los que no se encontró mutación en homocigotos
del tipo con deleción de tres bases pero se encontró una mutación en
heterocigotos y homocigotos del tipo con inserción de tres bases.
Por tanto, se valora que existe una baja posibilidad de inicio de AR
o posibilidad de inicio de AR, cuando no se detecta la proteína del
tipo con inserción de glicina (en otras palabras, sólo se detecta
la proteína del tipo con glicina delecionada). En cambio, se valora
que existe una alta posibilidad de inicio de AR o posibilidad de
inicio de AR, cuando se detectan ambos tipos de proteínas, y
especialmente cuando sólo se detecta la proteína del tipo con
inserción de
glicina.
glicina.
Un kit de evaluación para el inicio o la
posibilidad de inicio de AR (en otras palabras, un kit de
diagnóstico para AR) no está particularmente limitado, siempre que
el kit incluya el reactivo para la detección de la mutación, por
ejemplo, el cebador, la sonda, el anticuerpo o similar. El kit puede
estar dispuesto de manera que incluye adicionalmente otro reactivo
en combinación con el reactivo.
Por ejemplo, un kit para detectar si el genoma o
el ARNm (ADNc) tiene la mutación o no, puede ser un kit que incluye
un cebador diseñado de modo que el cebador puede amplificar una
región que contiene el sitio de mutación, y que incluye además uno
de o una combinación de reactivos necesarios para detectar la
mutación. El reactivo puede ser una sonda, una enzima de
restricción, un reactivo para su uso en un método de determinación
de una secuencia de bases (tal como el método de Maxam Gilbert, el
método de Sanger y similares) o reactivos similares, que se diseña
para que pueda realizar la detección con respecto a la mutación.
Obsérvese que el reactivo puede adoptarse arbitrariamente según qué
método de detección se adopte. Por ejemplo, el reactivo puede ser
dATP, dUTP, dTTP, dGTP, una enzima sintética de ADN, una enzima
sintética de ARN o similares. Además, el kit puede incluir un
tampón apropiado, líquido de lavado o similares, que no dificultan
la detección de la mutación.
En el caso de que el kit incluya el cebador, el
cebador no está particularmente limitado, siempre que el cebador
pueda amplificar la región que contiene el sitio de mutación. Por
ejemplo, el cebador puede ser un conjunto de los cebadores
mostrados en SEQ. ID NO. 3 y 4.
Además, el kit para detectar si la proteína
tiene la mutación o no puede ser, por ejemplo, un kit que incluye
el anticuerpo que reconoce sólo la proteína del tipo con inserción
de glicina.
Tal como se describió anteriormente, es posible
realizar el diagnóstico de la AR (evaluar el inicio o la posibilidad
de inicio de AR) con alta precisión usando esos kits de
evaluación.
Tal como se describió anteriormente, la mutación
en la que se insertan 3 bases en el gen de la angiopoyetina 1 (y la
mutación correspondiente en la que se inserta glicina en una
secuencia de aminoácidos) se considera como una causa del inicio de
AR. Por tanto, se considera que es eficaz complementar la proteína
de tipo normal (es decir, la proteína del tipo con deleción de
glicina) al paciente con AR que tiene la mutación en la que se
inserta glicina en la angiopoyetina 1. Por tanto, la presente
invención puede ser útil para el siguiente remedio y medicamento de
cura para la AR.
- -
- Un remedio para la artritis reumatoide, que comprende las etapas de complementar, a un paciente con artritis reumatoide que tiene una proteína que tiene la mutación, con (a) una proteína de tipo normal que no tiene la mutación, (b) ADN que codifica para la proteína de tipo normal o (c) un compuesto de bajo peso molecular que actúa como agonista para una proteína receptora para la que la proteína normal es un ligando;
- -
- un medicamento de cura para su uso en la curación de un paciente con artritis reumatoide que tiene una proteína que tiene la mutación, conteniendo el medicamento de cura, como componente principal, (a) una proteína de tipo normal que no tiene la mutación, (b) ADN que codifica para la proteína de tipo normal o (c) un compuesto de bajo peso molecular que actúa como agonista para una proteína receptora para la cual la proteína normal es un ligando.
No está particularmente limitado cómo
complementar la proteína de tipo normal. Por ejemplo, puede
emplearse un sistema de expresión de proteínas bien conocido o un
método de introducción de genes. Específicamente, puede adoptarse
un vector de expresión, un vector viral o similares, que se usa para
expresar una proteína en una célula de mamífero. Además, tal como
se describió anteriormente, la angiopoyetina 1 es un ligando para
el receptor TIE2. Por tanto, se considera que es un remedio eficaz
para la AR administrar un compuesto de bajo peso molecular en el
cuerpo por vía oral o mediante inyección intravenosa, actuando el
compuesto de bajo peso molecular como un agonista para el receptor
TIE2. Obsérvese que el compuesto de bajo peso molecular tratado en
el presente documento puede ser una proteína tal como un péptido o
similares.
Además, pueden usarse la proteína normal o ADN
que codifica para la proteína, y el compuesto de bajo peso
molecular como el agonista para el receptor TIE2 solos o en
combinación como el medicamento de cura.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es una tabla que muestra el análisis
genético realizado usando 6 clases de marcadores de microsatélite
en un presente ejemplo.
La figura 2 es un diagrama esquemático que
ilustra esquemáticamente un gen relacionado con AR de la presente
invención. Obsérvese que, en la figura 2, A y B muestran dónde se
fijaron una sonda y un cebador en el presente ejemplo.
La figura 3(a) y 3(b) son vistas
que muestran los resultados del análisis de secuencia en una región
que contiene el sitio de mutación por inserción de 3 bases del gen
relacionado con AR. La figura 3(a) muestra el resultado del
análisis de secuencia en un gen del tipo con inserción de 3 bases,
mientras que la figura 3(b) muestra el resultado del
análisis de secuencia en un gen del tipo con deleción de 3
bases.
La figura 4 es una tabla que muestra los
resultados de la detección llevada a cabo en el presente ejemplo
para averiguar si se producía o no la mutación por inserción de 3
bases en pacientes con AR y sujetos sanos.
La figura 5 es un gráfico que muestra el
análisis cuantitativo de la expresión de ARNm en el presente
ejemplo.
La figura 6 es un gráfico que muestra el
resultado de la medición de las capacidades de migración de células
HUVEC del tipo con inserción de 3 bases (Ang1) y del tipo con
deleción de tres bases (Ang1(del3)).
Se describirá a continuación una realización de
la presente invención haciendo referencia a las figuras 1 a 6.
Obsérvese que la presente invención no se limita a la descripción a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis de longitud de cadena
para 33 familias, cada una de las cuales incluía dos pacientes y un
sujeto sano. A partir de ADN extraído de la sangre periférica, se
amplificaron los marcadores de microsatélite D8S176, D8S521,
D8S1738, D8S556, D8S1830 y D8S539 en el cromosoma 8 mediante el
método de PCR usando un cebador marcado fluorescente, teniendo
D8S176, D8S521, D8S1738, D8S556, D8S1830 y D8S539 heterocigosidad de
0,7 o más y ubicándose dentro de 10,8 cM desde el marcador de
microsatélite D8S556 mencionado anteriormente. Entonces, se
sometieron los marcadores de microsatélite amplificados a
electroforesis a 3000 V durante dos horas usando un secuenciador
modelo ABI377. Después de eso, se determinó el tamaño de los
marcadores usando Gene Scan (ver. 2.0.2). Posteriormente, usando
MAPMAKER/SIBS (ver. 2.1) (véase Complete multipoint
sib-pair analysis of quantitative and qualitative
traits. Am. J. Hum. Genet.57:439, 1995), se calcularon las
puntuaciones LOD máximas de los mismos mediante análisis de dos
puntos basándose en el método de parejas de hermanos
afectados.
afectados.
Los resultados se muestran en la tabla de la
figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, se observó la
puntuación LOD mayor, 1,35, únicamente en D8S556. A partir de este
resultado, se encontró que un gen relacionado con la AR según la
presente invención presenta ligamiento con el marcador de
microsatélite D8S556. Además, a partir del hecho de que la
angiopoyetina 1 se ubica en las proximidades de D8S556, y hechos
similares, se deduce que la angiopoyetina 1 mencionada
anteriormente es un gen candidato para el gen de susceptibilidad a
la AR.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la reacción de transcripción inversa
usando un cebador de oligo-dT (kit de PCR para ARN
GeneAmp) (Applied Biosystems), se sintetizó ADNc a partir de ARN
total preparado a partir de una fracción de monocitos de la sangre
periférica del paciente con AR y a partir de una célula sinovial del
paciente con AR. Tras amplificar una región génica de la
angiopoyetina 1, de 1508 pb, se realizó un análisis de secuencia
siguiendo el método de terminadores marcados. Obsérvese que los
cebadores usados en la reacción se enumeran a continuación:
| Cebador sentido: | AngF1.5: 5'-GCTGGCAGTACAATGACAG-3' | (SEQ. ID NO. 3) | |
| Cebador antisentido: | AngR1.5: 5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3 | (SEQ. ID NO. 4) |
Además, el cebador sentido AngF1.5 y el cebador
antisentido AngR1.5 se colocaron tal como se indica mediante A. en
la figura 2. Obsérvese que la molécula de angiopoyetina 1 tenía un
dominio de espiral enrollada y un dominio de tipo fibrinógeno.
Se comparó la secuencia de ADNc determinada
mediante secuenciación con una secuencia notificada anteriormente
(número de registro U83508) del gen de la angiopoyetina 1. Como
resultado, se encontró que existían dos tipos de gen de la
angiopoyetina 1 tal como se describió anteriormente, concretamente
el tipo con inserción de 3 bases y el tipo con deleción de 3 bases.
De estos tipos, se mostró una secuencia génica del tipo con
inserción de 3 bases en SEQ. ID NO. 2. Tal como se muestra en SEQ.
ID NO. 2, están insertadas 3 bases "GGT" como las bases número
805 a número 807 en la secuencia del tipo con inserción de 3
bases.
Las figuras 3(a) y 3(b) muestran
resultados del análisis de secuencia de una región que contiene el
sitio de mutación. La figura 3(a) muestra el resultado del
análisis del tipo con inserción de 3 bases, mientras que la figura
3(b) muestra el resultado del análisis del tipo con deleción
de 3 bases (tipo con reducción de 3 bases). Obsérvese que las
figuras 3(a) y 3(b) muestran los resultados del
análisis de secuencia de secuencias complementarias de las
secuencias génicas. A partir de la figura 3(a), se confirmó
que se produjo la inserción de 3 bases "GGT" en el tipo con
inserción de 3 bases (inserción de 3 bases "ACC" en la
secuencia complementaria). A partir de la figura 3(b), se
confirmó que se pierden estas 3 bases en el tipo con deleción de 3
bases.
Tal como se muestra en SEQ. ID NO. 1, se inserta
glicina como el aminoácido número 269 en una secuencia de
aminoácidos de una proteína producida mediante la traducción del
tipo con inserción de 3 bases del gen. Por otro lado, está
delecionada esta glicina como el aminoácido número 269 en una
proteína producida a partir de la traducción del tipo con deleción
de 3 bases del gen.
Se llevó a cabo la detección de si la mutación
por inserción de 3 bases estaba presente o ausente en (a) pacientes
con AR de familias (a continuación en el presente documento,
denominadas familias con AR) que tenían otro paciente con AR en
parientes además del propio paciente con AR, (b) sujetos sanos de
las familias con AR, (c) pacientes con AR de familias (a
continuación en el presente documentos, denominadas familias
esporádicas) que no tenían otro paciente con AR además del propio
paciente con AR y (d) sujetos sanos de las familias esporádicas.
Se llevó a cabo la detección (1) extrayendo ADN
genómico de las personas que se van a someterse a prueba, (2)
amplificando la región que contiene el sitio de mutación mediante
reacción de PCR en la que se usó un cebador apropiado, (3)
realizando análisis de secuencia de los productos de PCR
resultantes. Obsérvese que, como cebador apropiado, puede usarse
arbitrariamente uno de un cebador sentido y un cebador antisentido,
con el que puede llevarse a cabo la amplificación de la región que
contiene la mutación de inserción de 3 bases. Además, no existe
ninguna limitación particular sobre la longitud del cebador
apropiado, siempre que no se produzca la amplificación de una
región no seleccionada como diana como resultado de un apareamiento
erróneo. En general, se usa un cebador que tiene una longitud de 15
a 25 nucleótidos. Los siguientes oligonucleótidos son ejemplos del
cebador sentido y el cebador antisentido.
| Cebador sentido: | 5'-CAACCTTGTCAATCTTTGC-3' | (SEQ. ID NO. 5) | |
| Cebador antisentido: | 5'-ACACCTTTTTGGGTTCTGGC-3' | (SEQ. ID NO. 6) |
Los resultados de la detección de la mutación
según el método se muestran en la figura 4. En la figura 4, "AR
familiar" indica los pacientes con AR de las familias con AR,
"sin AR familiar" indica los sujetos sanos de las familias con
AR, "AR esporádica" indica los pacientes con AR de las familias
esporádicas y "sin AR esporádica" indica los sujetos sanos de
las familias esporádicas. Además, "n" indica el número total de
cada tipo de las personas sometidas a prueba. Las columnas
respectivas muestran respectivamente los números de personas (en la
figura 4, indicado como "nt805(del3) homo") que tienen
el gen normal de manera homóloga, los números de personas (en la
figura 4, indicado como "nt805(del3) hetero") que tienen
la mutación del gen de manera homóloga y los números de personas
(en la figura 4, indicado como "nt805 homo") que tiene la
mutación del gen de manera homóloga. Además, se muestran entre
paréntesis las proporciones de personas con respecto al número de
personas sometidas a prueba.
Tal como se muestra en la figura 4, tanto en las
familias con AR como en las familias esporádicas, sólo los
pacientes con AR tienen el gen del tipo con inserción de 3 bases de
manera homocigótica. Además, cuando se pone que los homocigotos del
tipo con deleción de 3 bases no están mutados, los heterocigotos y
el tipo con inserción de 3 bases están mutados, se encontró una
diferencia significativa entre los pacientes con AR de las familias
esporádicas y los sujetos sanos de las familias esporádicas y entre
los sujetos con AR de las familias esporádicas y lo sujetos sanos
de las familias con AR. Este hallazgo confirmó que el inicio de AR
está relacionado con si la mutación está presente o ausente.
Por tanto, mediante la detección usando el
método anterior de si se produce o no la mutación por inserción de
3 bases en el gen relacionado con la AR, es posible evaluar si se ha
producido o no el inicio de AR en una persona, o si una persona
tiene posibilidad o no de inicio de AR. Específicamente, por
ejemplo, se somete a prueba un sujeto para detectar la mutación por
inserción de 3 bases según el método. Si sólo se detecta el gen
mutado (es decir, el sujeto tiene el gen mutado de manera
homocigótica) o se detectan tanto el gen mutado como el gen normal,
se evalúa que existe una alta posibilidad de que el sujeto haya
desarrollado AR. Además, en el caso en el que la detección no
detecta el gen mutado (es decir, la persona sometida a prueba tiene
el gen normal de manera homocigótica), se evalúa que existe una baja
posibilidad de que el sujeto haya desarrollado AR o de que
desarrolle AR en el futuro. Obsérvese que la evaluación según la
presente invención no se limita a la forma mencionada
anteriormente, y la evaluación según la presente invención puede
llevarse a cabo de manera arbitraria de otras formas según los
datos de la detección.
Se midió la cantidad de ARNm de angiopoyetina 1
expresado en la sangre periférica para veintiún pacientes con AR y
dieciocho sujetos sanos realizando RT-PCR
cuantitativa con ABI7700 usando el kit de RT-PCR
TaqMan EZ (Applied Biosystems). Se usaron los siguientes cebadores
y sonda. GAPDH fue un patrón interno. Obsérvese que las posiciones
de los cebadores y la sonda se indican mediante B. en la figura
2.
| Cebador sentido AngF272: | 5'-TTTGCGAGAGGCACGGAA-3' | (SEQ. ID NO. 7) | |
| Cebador antisentido AngR389: | 5'-TATATCTTCTCCCACTGTTT-3' | (SEQ. ID NO. 8) | |
| Sonda Probe Taq Man: | 5'-TTCCTCGCTGCCATTCTGACTCACATA-3' | (SEQ. ID NO. 9) |
Se calcularon los resultados del análisis
cuantitativo como cantidades relativas que están en una razón con
el patrón interno, y luego se calcularon estadísticamente mediante
la prueba t de Welch. La figura 5 es un gráfico que muestra un
valor promedio y una desviación estándar de la cantidad analizada
cuantitativamente del ARNm expresado extraído de la sangre
periférica del sujeto sano (control) y los pacientes con AR. Los
resultados se muestran a continuación como promedios \pm
desviaciones estándar.
Sujetos sanos: 0,3372 \pm 0,2421
Pacientes con AR: 0,0986 \pm 0,0937
Los resultados anteriores confirmaron que los
pacientes con AR tienen una cantidad significativamente pequeña de
ARNm de angiopoyetina 1 expresado en comparación con los sujetos
sanos.
Por tanto, midiendo la cantidad del ARNm
expresado mediante el método, es posible evaluar si una persona
sometida a prueba ha desarrollado AR o no. Específicamente, por
ejemplo, se fijan dos valores umbral (valores umbral 1 y 2) con
respecto a la cantidad del ARNm expresado. Si la cantidad del ARNm
expresado es igual o inferior al valor umbral 1, se valora que la
persona sometida a prueba ha desarrollado de manera sumamente
posible AR o hay una alta posibilidad de desarrolle el inicio de AR
en el futuro; si la cantidad del ARNm expresado es igual o superior
al valor umbral 2, se valora que la persona sometida a prueba no ha
desarrollado probablemente AR o hay una baja posibilidad de que
desarrolle el inicio de AR en el futuro. Es preferible que el valor
umbral 1 se fije para que sea igual o inferior a un valor promedio
(es decir, 0,0986 o inferior) de los pacientes con AR. Además, es
preferible que el valor umbral 2 se fije para que sea igual o
superior a un valor promedio (es decir, 0,3372 o superior) de los
sujetos sanos.
A continuación, se compararon el tipo con
inserción de 3 bases y el tipo con deleción de 3 bases del gen de
la angiopoyetina 1 (Ang1) en cuanto a la función fisiológica. En el
tipo con inserción de 3 bases del gen de la angiopoyetina 1 (Ang1),
estaban insertadas las 3 bases, mientras que en el tipo con deleción
de 3 bases del gen de la angiopoyetina 1 (Ang1), estaban
delecionadas las 3 bases. Se realizó la comparación en cuanto a la
función fisiológica midiendo la capacidad de migración de células
HUVEC usando un método explicado a continuación.
Se recubre fibronectina humana (Becton,
Dickinson and Company: nº 354008) de concentración final de 50
\mug/ml sobre una placa Transwell-24 (Coster
Inc.: nº 3422) que tiene una membrana (tamaño de poro: 8,0 \mug).
La placa Transwell tiene dos capas con el fin de medir la capacidad
de migración de las células. Se cuenta como el número de migración
celular el número de células migradas hasta una capa inferior desde
una capa superior sobre la que se inoculan las células. Se
inocularon 25.000 células HUVEC suspendidas en 100 \mul de M199
con BSA al 1% por cada pocillo de la placa Transwell. En cada
pocillo de la placa Transwell, se añadieron 600 \mul del
sobrenadante de un cultivo de células SVS (J. Mol. Cell. Cardiol.,
29(8), 1997, 2177-2186) en el que se
introdujo el Ang1 del tipo con inserción de 3 bases o el Ang1 del
tipo con deleción de 3 bases, preparándose el cultivo mediante
incubación durante dos días en M199 con BSA al 1%.
Tras incubar los pocillos de la placa Transwell
durante 6 horas, se llevó a cabo la fijación y tinción de las
células mediante métodos convencionales conocidos en la técnica.
Entonces, se contaron los números de células migradas hasta una
superficie inferior de la membrana para el tipo con inserción de 3
bases y el tipo con deleción de 3 bases, respectivamente. Usando un
microscopio invertido, se realizó el recuento de este modo tomando
6 vistas por pocillo con un aumento de 40 veces. Se hallaron un
total (A) y un promedio (B) del recuento. Se realizó este recuento
para 6 pocillos y se calculó la desviación estándar de los 6
pocillos. Los resultados del recuento se muestran a continuación.
Además, la figura 6 muestra los promedios de los números de células
migradas, respectivamente, para el tipo con inserción de 3 bases
(Ang1) y el tipo con deleción de 3 bases (Ang1(del3)).
| Valor promedio | Desviación estándar | |
| (A/B) | (A/B) | |
| Tipo con deleción de 3 bases | 260/43 | 41/17 |
| Tipo con inserción de 3 bases | 520/87 | 81/14 |
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en los resultados anteriores
y en la figura 6, se confirmó que la capacidad de migración de
células HUVEC es significativamente alta en el tipo de mutación en
el que se insertan 3 bases en Ang1. Este resultado sugiere que el
Ang1 del tipo con inserción de 3 bases es un factor de crecimiento
sinovial, mejorando la angiogénesis más que en el tipo sano.
Tal como se describió anteriormente, según la
presente invención, el uso de un gen mutado o una proteína mutada
hace posible evaluar de manera segura y fácil, con alta precisión,
el inicio o la posibilidad de inicio de artritis reumatoide
detectando si la mutación está presente o ausente. Por tanto, la
presente invención es eficaz. Además, la presente invención es
eficaz como método de prevención novedoso, remedio novedoso y
medicamento de cura novedoso para la artritis reumatoide.
<110> Shiozawa, Shunichi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Estructura de ADN y proteínas
responsables de la patogénesis de la artritis reumatoide, método de
diagnóstico de la enfermedad, kit de diagnóstico para detectar la
enfermedad, técnica de tratamiento y medicamento curativo de la
enfermedad
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0224
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento JP
2002-005326
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-1-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctggcagta caatgacag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21 1
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaaatct aaaggtcgaa t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaccttgtc aatctttgc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaccttttt gggttctggc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgcgagag gcacggaa
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatatcttct cccactgttt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
oligonucleótido sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcctcgctg ccattctgac tcacata
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (2)
1. Método de evaluación, en una muestra derivada
de una persona, del inicio o la posibilidad de inicio de artritis
reumatoide en la persona, comprendiendo el método la etapa de:
llevar a cabo o bien una detección de un gen (a)
o un gen (b) o una proteína (c); o bien
medir una cantidad de ARNm expresado (d),
en el que:
el gen (a) es un gen de susceptibilidad a la
enfermedad para la artritis reumatoide, codificando el gen para una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID
NO. 1 y que tiene una mutación tal que se inserta glicina como el
aminoácido número 269 en la secuencia;
el gen (b) es un gen de susceptibilidad a la
enfermedad para la artritis reumatoide, codificando el gen para una
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID
NO. 1 y que tiene una mutación tal que se inserta glicina como el
aminoácido 269 en la secuencia, tiene una secuencia de bases
mostrada en SEQ. ID NO. 2 y tiene una mutación tal que se insertan
3 bases "GGT" como las bases número 805 a 807 en la
secuencia;
la proteína (c) es una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID NO. 1, y que tiene una
mutación tal que se inserta glicina como el aminoácido número 269 en
la secuencia; y
el ARNm (d) se deriva de un gen de
susceptibilidad a la enfermedad para la artritis reumatoide,
teniendo el gen la secuencia de bases que es tal como se muestra en
SEQ. ID NO. 2 pero con la deleción de 3 bases "GGT", que son
las bases número 805 a 807 en la secuencia.
2. Método según la reivindicación 1, en el que,
si el método mide una cantidad del ARNm expresado (d), se fija un
par de valores umbral 1 y 2 con respecto a la cantidad del ARNm
expresado, siendo el valor umbral 1 < el valor umbral 2, siendo
el valor umbral 1 de 0,0986 o inferior y siendo el valor umbral 2 de
0,3372 o superior; si la cantidad del ARNm expresado es igual o
inferior al valor umbral 1, se valora que el sujeto ha desarrollado
de manera sumamente posible artritis reumatoide o hay una alta
posibilidad de que el sujeto desarrolle artritis reumatoide en el
futuro; y
si la cantidad del ARNm expresado es igual o
superior al valor umbral 2, se valora que el sujeto probablemente
no ha desarrollado artritis reumatoide o hay una baja posibilidad de
que el sujeto desarrolle artritis reumatoide en el futuro.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002-5326 | 2002-01-11 | ||
| JP2002005326A JP4242590B2 (ja) | 2002-01-11 | 2002-01-11 | 慢性関節リウマチの疾患感受性遺伝子、及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2301778T3 true ES2301778T3 (es) | 2008-07-01 |
Family
ID=19191091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03700501T Expired - Lifetime ES2301778T3 (es) | 2002-01-11 | 2003-01-08 | Metodo y kit de valoracion del inicio de artritis reumatoide. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7615341B2 (es) |
| EP (1) | EP1471143B1 (es) |
| JP (1) | JP4242590B2 (es) |
| KR (1) | KR100976005B1 (es) |
| AT (1) | ATE387460T1 (es) |
| CA (1) | CA2473218C (es) |
| DE (1) | DE60319342T2 (es) |
| DK (1) | DK1471143T3 (es) |
| ES (1) | ES2301778T3 (es) |
| PT (1) | PT1471143E (es) |
| WO (1) | WO2003060126A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4657757B2 (ja) * | 2005-02-23 | 2011-03-23 | 株式会社膠原病研究所 | 肺高血圧症発症関連遺伝子を用いた肺高血圧症の診断および治療 |
| JP2006325528A (ja) * | 2005-05-27 | 2006-12-07 | Institute For Rheumatic Diseases Co Ltd | 糖尿病性網膜症の診断および予防 |
| JP4657857B2 (ja) * | 2005-08-25 | 2011-03-23 | 株式会社膠原病研究所 | メタボリックシンドロームの診断および予防 |
| JP2009136229A (ja) * | 2007-12-07 | 2009-06-25 | Institute For Rheumatic Diseases Co Ltd | 自己免疫疾患モデル細胞又は自己免疫疾患モデル動物の作製方法、並びに自己免疫疾患の診断方法 |
| JP2018527016A (ja) * | 2015-06-24 | 2018-09-20 | オックスフォード バイオダイナミックス リミテッド | 染色体相互作用の検出 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585464A (en) | 1993-02-19 | 1996-12-17 | Theratech, Inc. | Recombinant antigen for diagnosing rheumatoid arthritis |
| US5814464A (en) | 1994-10-07 | 1998-09-29 | Regeneron Pharma | Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2 |
| JP4122056B2 (ja) | 1995-04-06 | 2008-07-23 | リジエネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | Ｔｉｅ−２リガンド、その作製方法および使用方法 |
| WO1998051791A1 (en) * | 1997-05-15 | 1998-11-19 | Shunichi Shiozawa | Gene causative of rheumatoid arthritis, method for the diagnosis of rheumatoid arthritis, and method for the determination of factors causing rheumatoid arthritis |
| US7067109B1 (en) * | 1998-07-13 | 2006-06-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer treatment kits comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids |
| AU5472899A (en) * | 1998-08-20 | 2000-03-14 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human angiopoietin-3 |
| DK1164190T3 (da) * | 1999-03-20 | 2011-08-15 | Shunichi Shiozawa | Rheumatoid arthrit-gen og fremgangsmåde til diagnose af rheumatoid arthrit |
| US6342219B1 (en) | 1999-04-28 | 2002-01-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody compositions for selectively inhibiting VEGF |
| DE10100586C1 (de) | 2001-01-09 | 2002-04-11 | Ribopharma Ag | Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens |
| JP3596433B2 (ja) * | 2000-06-29 | 2004-12-02 | 株式会社デンソー | 車載用電子制御装置 |
| AU2002210926B2 (en) | 2000-10-24 | 2005-12-15 | Shunichi Shiozawa | Genomes participating in rheumatoid arthritis, method of the diagnosis thereof, method of evaluating the onset possibility thereof, diagnostic kit for detecting them and therapeutic method and remedies for rheumatoid arthritis |
-
2002
- 2002-01-11 JP JP2002005326A patent/JP4242590B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-01-08 AT AT03700501T patent/ATE387460T1/de active
- 2003-01-08 WO PCT/JP2003/000089 patent/WO2003060126A1/ja not_active Ceased
- 2003-01-08 ES ES03700501T patent/ES2301778T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-08 DE DE60319342T patent/DE60319342T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-08 CA CA2473218A patent/CA2473218C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-08 EP EP03700501A patent/EP1471143B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-08 DK DK03700501T patent/DK1471143T3/da active
- 2003-01-08 US US10/501,259 patent/US7615341B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-01-08 PT PT03700501T patent/PT1471143E/pt unknown
- 2003-01-08 KR KR1020047010787A patent/KR100976005B1/ko not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1471143A4 (en) | 2005-09-14 |
| JP2003204790A (ja) | 2003-07-22 |
| CA2473218C (en) | 2011-07-19 |
| DE60319342D1 (de) | 2008-04-10 |
| KR20040077715A (ko) | 2004-09-06 |
| DK1471143T3 (da) | 2008-06-16 |
| EP1471143B1 (en) | 2008-02-27 |
| AU2003201847A1 (en) | 2003-07-30 |
| DE60319342T2 (de) | 2009-03-19 |
| US20050176004A1 (en) | 2005-08-11 |
| ATE387460T1 (de) | 2008-03-15 |
| WO2003060126A1 (en) | 2003-07-24 |
| US7615341B2 (en) | 2009-11-10 |
| KR100976005B1 (ko) | 2010-08-17 |
| JP4242590B2 (ja) | 2009-03-25 |
| PT1471143E (pt) | 2008-05-20 |
| EP1471143A1 (en) | 2004-10-27 |
| CA2473218A1 (en) | 2003-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2208892T3 (es) | Deteccion de predisposicion genetica a la osteoporisis. | |
| US20020182599A1 (en) | Methods for diagnosing and treating heart disease | |
| EP0883694B1 (en) | Determination of collagen genotype | |
| ES2301778T3 (es) | Metodo y kit de valoracion del inicio de artritis reumatoide. | |
| AU2002242116B2 (en) | Methods for diagnosing and treating heart disease | |
| US20240182973A1 (en) | Treatment Of Obesity In Subjects Having Variant Nucleic Acid Molecules Encoding Calcitonin Receptor (CALCR) | |
| AU2002337787B2 (en) | Methods for diagnosing and treating heart disease | |
| JP4657757B2 (ja) | 肺高血圧症発症関連遺伝子を用いた肺高血圧症の診断および治療 | |
| ES2354525T3 (es) | Gen de predisposición a la enfermedad de alzheimer. | |
| AU2002337787A1 (en) | Methods for diagnosing and treating heart disease | |
| AU2002330177B2 (en) | Methods for diagnosing and treating diseases and conditions of the heart or digestive system, and cancer | |
| ES2325807T3 (es) | Adn genomicos que participan en la artritis reumatoide, procedimiento para su diagnostico, procedimiento de estimacion de su aparicion y kit diagnostico para su deteccion. | |
| Zhang et al. | Recurrent UMOD Mutations in Australian Families with Autosomal Dominant Tubulointerstitial Kidney Disease: A Possible Founder Effect? | |
| WO2004065626A2 (en) | A method of sepsis prognosis | |
| Li | Functional characterization of systemic sclerosis transcriptome | |
| Morosini | Integrated genetic diagnosis of Neurofibromatosis type 1 (NF1) and molecular characterization of one case of compound heterozygosity | |
| TW202012634A (zh) | 用於識別及治療患有靜脈注射免疫球蛋白抗性的川崎氏病患者的方法 |