ES2301794T3 - Tratamiento de la diabetes de tipo 1, antes y despues de la expresion de marcadores de predisposicion. - Google Patents
Tratamiento de la diabetes de tipo 1, antes y despues de la expresion de marcadores de predisposicion. Download PDFInfo
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Abstract
Una composición para uso en el tratamiento de la diabetes de tipo 1, comprendiendo la composición una cantidad farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina soluble que tiene al menos una región CDR, en la que la inmunoglobulina puede unirse a un receptor de Fc de una célula presentadora de antígeno, teniendo la inmunoglobulina al menos un fragmento de proteína o péptido insertado dentro de dicha al menos una región CDR, en la que el fragmento de proteína o péptido se selecciona de INSBeta, GAD1, GAD2 y GAD 65.
Description
Tratamiento de la diabetes de tipo 1, antes y
después de la expresión de marcadores de predisposición.
La presente invención se refiere generalmente a
composiciones para tratar diabetes de tipo 1.
En un aspecto, la invención se refiere a
composiciones para presentación endocítica de un factor
inmunosupresor para la regulación por disminución de células T
diabetogénicas para el tratamiento de la diabetes de tipo 1 antes
y/o después de la expresión de marcadores de predisposición.
La diabetes de tipo 1, también conocida como
diabetes mellitus insulinodependiente ("DMID"), es una
enfermedad autoinmune en la que las células beta ("\beta")
de los islotes pancreáticos de Langerhans se destruyen como
consecuencia de reacciones inflamatorias provocadas por la
activación de células T específicas para antígenos asociados a
células \beta (1, 2; véase la sección "Referencias" al final
del documento). Los datos obtenidos de modelos animales preclínicos
de DMID, además de estudios clínicos, han implicado a las células T
autorreactivas CD4+ y CD8+ como efectores clave de la destrucción
de células de los islotes (J. F. Bach, Endocr. Rev., 1994). A pesar
de la disponibilidad de terapia de reemplazo de insulina para
mantener un control aceptable de niveles de glucosa en sangre, la
terapia de reemplazo de insulina crónica sigue estando asociada con
efectos secundarios importantes que incluyen posibilidades de
hipoglucemia aguda, enfermedad microvascular crónica (retinopatía,
nefropatía y neuropatía) y enfermedad macrovascular crónica
(enfermedad cardiaca y accidente cerebrovascular), todas
resultantes del escaso buen control del metabolismo de los hidratos
de carbono que puede conseguirse con inyección en bolo de insulina
(Simone y col., Diabetes Care, 22 supl. 2.:B7-B15,
1999). Estos efectos secundarios, combinados con el alto coste, la
naturaleza invasiva de la terapia con insulina y la creciente
prevalencia de DMID en el mundo desarrollado, han llevado a
esfuerzos para encontrar estrategias alternativas que incluyan
procedimientos para evitar la progresión del procedimiento
autorreactivo que incita a la pérdida irreversible de más del 90%
de la masa de islotes que guarda relación con la presentación
clínica de la enfermedad.
El ratón diabético no obeso ("NOD")
desarrolla una diabetes de tipo 1 espontánea que comparte muchos de
los rasgos asociados con la DMID humana, proporcionando un modelo
animal bien caracterizado para esta compleja enfermedad autoinmune
(3). La etapa inicial o de preinsulitis de la enfermedad empieza
aproximadamente a las 3 semanas de edad e implica la infiltración
celular en áreas que rodean los islotes pancreáticos sin lesión de
las células \beta (4). La siguiente fase de la enfermedad,
conocida como insulitis, empieza aproximadamente a la edad de 6
semanas e implica un aumento gradual en la infiltración celular que,
en última instancia, se apodera de los mecanismos inmunoreguladores
que conducen a una destrucción progresiva de las células \beta
(5). La pérdida completa de la producción de insulina conduce a la
desregulación del metabolismo de glucosa y la diabetes franca ya
puede manifestarse a las 12 semanas de edad (6). Ahora está muy
aceptado que la progresión de insulitis a diabetes guarda relación
con un aumento en las células del tipo Th1 específicas para
antígenos asociados a células \beta (7). Las citoquinas tales
como IFN\gamma y TNF\alpha producidas por estas células Th1
estimulan la incorporación de células inflamatorias que pueden
destruir las células \beta (8-10). De ahí que la
regulación por disminución de las células Th1 sería una solución
lógica para combatir la diabetes. Se están considerando varias
estrategias específicas para antígenos para la modulación de las
células T autorreactivas y tienen éxito en ratones NOD
(11-14), además de otros modelos animales de DMID
(15, 16). Sin embargo, todavía no está establecida la traslación al
ser humano y hay que vencer asuntos tales como practicabilidad,
efectos secundarios y eficacia con el fin de que se produzca la
transición.
Recientemente se ha demostrado que la
administración de péptidos restringidos de clase II sobre
inmunoglobulinas ("Ig") aumenta la presentación a células T
100 veces con respecto al péptido libre (17, 18). Esto es debido a
la internalización de Ig mediante receptores de Fc\gamma
("Fc\gammaR") que se procesan dentro del compartimento
endosomal y al acceso ilimitado de los péptidos a moléculas de MHC
recientemente sintetizadas (19). Dado el hecho de que las Ig son
automoléculas, los efectos secundarios son mínimos incluso cuando se
requieren reiteradas inyecciones. Además, debido a su naturaleza
autóloga, cuando se inyectan a animales sin adyuvante, las Ig no
inducen señales inflamatorias que regulan por incremento moléculas
coestimuladoras sobre células presentadoras de antígeno
("CPA") (20). De hecho, las pautas posológicas sin adyuvante
que usaron Ig para péptidos antigénicos de vehículos han demostrado
ser eficaces para la inducción de tolerancia en vez de inmunidad
(20-23). Por ejemplo, cuando el péptido PLP1, que
se corresponde con la secuencia encefalitogénica
139-151 de proteína proteolípido ("PLP"), se
expresó en una molécula de Ig, la Ig-PLP1 resultante
mostró funciones moduladoras frente a encefalomielitis alérgica
experimental ("EAE") y suprimió recaídas paralíticas (20, 22).
Además, la agregación de Ig-PLP1 condujo a la
reticulación de Fc\gammaR e inducción de la producción de
IL-10 por las CPA presentadoras (20, 22). Por
consiguiente, la Ig-PLP1 agregada ("ag") mostró
una mayor potencia frente a EAE que indujo una recuperación
completa y rápida de la enfermedad suprimiendo tanto la fase
paralítica grave inicial como las recaídas (22). La neutralización
de IL-10 mediante inyección de anticuerpo
anti-IL-10 invirtió el transcurso
de la acción de Ig-PLP1 ag y la enfermedad rebotó,
lo que indica que IL-10 endógena desempeña una
función crítica en la prevención de autoinmunidad. Además, la
solución de la administración de Ig demostró ser eficaz con un
péptido de la glicoproteína de la mielina del oligodendrocito
("MOG") y Ig-MOG pudo suprimir EAE incluso
cuando la inducción de la enfermedad usó homogeneizado del sistema
nervioso central ("CNS") que incluía epítopos múltiples (23).
La conclusión que se ha sacado de estas observaciones demuestra que
las quimeras de Ig ag se acoplan a IL-10 endógena
para que la tolerancia periférica ponga en movimiento una solución
multimodal eficaz contra la compleja autoinmunidad que implica
diversas especificidades de células T (20, 22, 23). La
administración de un péptido sobre Ig agregada debería llevar tanto
a la carga eficaz del péptido sobre moléculas de MHC de clase II de
SPC como a la producción de IL-10 por aquellas CPA.
Con este fin, la secuencia de nucleótidos que codifica el
9-23 de la secuencia diabetogénica de la cadena
\beta de insulina (INS\beta) se injertó en la región CDR3 de
cadena pesada del vehículo IgG2b y la quimera de
Ig-INS\beta resultante se presentó eficazmente a
líneas de células T específicas (23a). Además,
Ig-INS\beta agregada indujo cantidades
significativas de IL-10 con la incubación con CPA
esplénicas. De manera interesante, cuando la
Ig-INS\beta agregada se usó junto con CPA para
estimular un clon de Th1 de INS\beta, la IL-10
producida por las CPA presentadoras inhibió la producción de
IFN\gamma por el clon. Estos resultados sugieren que la
administración del autopéptido sobre Ig agregadas puede proporcionar
una solución útil para el tratamiento de autoinmunidad mediada por
células T, tal como diabetes mellitus insulinodependiente. En el
sistema NOD se ha mostrado que IL-10 muestra
efectos variables sobre la diabetes que dependen del modo de
administración (24-26) y la edad del animal
(27-29). Aparte de esta función variable, la falta
de una estrategia de administración práctica y el mecanismo mal
definido que subyace al modo de acción de IL-10
justifica la búsqueda de nuevas soluciones para dirigir la
IL-10 endógena a diversas células T diabetogénicas y
evitar diabetes espontánea en el ratón NOD.
Por tanto, existe la necesidad de pautas
posológicas de tratamiento adicionales para el tratamiento y/o
prevención y/o reducción del riesgo de desarrollar diabetes de tipo
1, o los síntomas asociados con, o relacionados con, diabetes de
tipo 1, en un sujeto en necesidad del mismo. La discusión que sigue
describe composiciones que ayudan a satisfacer estas
necesidades.
Por tanto, según un aspecto de la presente
invención se proporciona una composición según la reivindicación 1
de más adelante.
Además de ser útil para tratamiento humano, la
presente invención también es útil para otros sujetos que incluyen
animales veterinarios, reptiles, pájaros, animales exóticos y
animales de granja, incluyendo mamíferos, roedores y similares. Los
mamíferos incluyen caballos, perros, cerdos, gatos o primates, por
ejemplo, un mono, chimpancé o un lémur. Los roedores incluyen
ratas, ratones, ardillas o cobayas.
Un sujeto pueden tratarse con la composición de
la invención en la etapa de preinsulitis de diabetes de tipo 1. El
sujeto puede no haber experimentado todavía la seroconversión de
IAA. Alternativamente, el sujeto puede haberse seroconvertido y
produce autoanticuerpos frente a uno o más antígenos asociados a
células \beta. El sujeto es positivo para IAA. El sujeto puede no
haber desarrollado todavía hiperglucemia.
La composición de la invención puede usarse para
tratar o evitar diabetes de tipo 1 en un sujeto que expresa un
marcador de predisposición de diabetes de tipo 1.
En una realización, el péptido es un péptido de
INS\beta.
La composición puede endocitarse por células que
tienen un receptor de Fc y son procesadas y presentadas por las
células en asociación con moléculas de MHC de clase II, evitándose
así la activación de células T diabetogénicas.
La administración de la composición de la
presente invención a un sujeto predispuesto a diabetes de tipo 1
puede retrasar la aparición de diabetes de tipo 1.
En otra realización, la administración de la
composición de la presente invención a un sujeto puede inducir la
producción de IL-10.
En otra realización de la presente invención, la
inmunoglobulina tiene más de un péptido ligado a la inmunoglobulina.
En todavía otra realización de la presente invención, la
inmunoglobulina puede ser humana o humanizada, tal como, por
ejemplo, IgG humana, tal como IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4,
IgGA, IgA1, IgA2, IgGE, IgD, IgE o IgM. Ilustrativamente,
Ig-INS\beta puede comprender o
Ig-INS\beta sol.
En una realización de la presente invención, el
péptido se inserta dentro de la región variable de la
inmunoglobulina y la inmunoglobulina comprende IgG humana o IgG
humanizada.
En todavía otra realización de la presente
invención, el péptido se inserta dentro de la región variable de la
inmunoglobulina que comprende la región CDR1, CDR2 y/o CDR3.
Ilustrativamente, el péptido se inserta dentro de la región CDR3 de
la inmunoglobulina mediante deleción del segmento D e inserción del
péptido.
En una realización, el péptido comprende GAD1
y/o GAD2.
En todavía otra realización de la presente
invención, la composición comprende IgINS\beta, IgGAD1 y
IgGAD2.
La composición de la invención puede fomentar la
producción de IL-10 en células T esplénicas. La
composición puede inducir la producción de IL-10.
La composición puede inducir la producción de IL-10
por CPA, fomentándose así la tolerancia periférica a la aparición
de diabetes en la etapa preinsulítica. La composición de la presente
invención puede inducir la producción de células productoras de
TGF\beta y/o IL-10. La composición, cuando se
administra a un sujeto, puede retrasar la aparición de diabetes de
tipo 1. El sujeto puede estar en la etapa de preinsulitis y/o tras
la seroconversión.
En todavía otra realización de la presente
invención, el receptor es un receptor de Fc\gamma.
La composición puede administrarse diariamente,
semanalmente o mensualmente. Ilustrativamente, la composición puede
administrarse semanalmente y lograrse, por ejemplo, la completa
supresión de diabetes de tipo 1.
En una realización de la presente invención, la
composición comprende además un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona el uso de una composición según la invención para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de
tipo 1.
Otra realización de la presente invención
comprende al menos parte de un dominio de una región constante de
una inmunoglobulina.
En una realización de la presente invención, la
composición de la invención puede ser una formulación inyectable y
comprende, por ejemplo, una disolución acuosa o suspensión de los
compuestos adecuados para administración intravenosa. Cuando la
composición se prepara para inyección, particularmente para
administración intravenosa, ilustrativamente, la fase continua
comprende una disolución acuosa de modificadores de la tonicidad,
tamponada hasta un pH inferior, 7 por ejemplo, o inferior a 6, por
ejemplo. Los modificadores de la tonicidad comprenden, por ejemplo,
cloruro sódico, glucosa, manitol, trehalosa, glicerina u otros
agentes farmacéuticos que convierten la presión osmótica de la
formulación en isotónica con la sangre. Alternativamente, si se usa
en la formulación una cantidad mayor del modificador de la
isotonicidad, puede diluirse antes de la inyección con un diluyente
farmacéuticamente aceptable para convertir la mezcla en isotónica
con la sangre.
En otra realización de la presente invención se
añade un conservante a la formulación. Ilustrativamente, un
conservante incluye cloruro de benzalconio, propilparabeno,
butilparabeno, clorobutanol, alcohol bencílico, fenol, benzoato de
sodio o EDTA.
Las composiciones de la presente invención
pueden comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Los materiales de vehículo que pueden emplearse para
preparar las composiciones de la presente invención son cualquiera
de aquellos excipientes comúnmente usados en las farmacias y
deberían seleccionarse basándose en la compatibilidad con el agente
farmacéutico y las propiedades del perfil de administración de la
forma farmacéutica deseada. Ilustrativamente, a continuación se
elige como ejemplo un excipiente farmacéutico, excepto los fármacos
activos:
\vskip1.000000\baselineskip
- (a)
- Aglutinantes tales como goma arábiga, ácido algínico y sales del mismo, derivados de celulosa, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, silicato de magnesio y aluminio, polietilenglicol, gomas, ácidos polisacáricos, bentonitas, hidroxipropilmetilcelulosa, gelatina, polivinilpirrolidona, copolímero de polivinilpirrolidona/acetato de vinilo, crospovidona, povidona, polimetacrilatos, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, almidón, almidón pregelatinizado, etilcelulosa, tragacanto, dextrina, celulosa microcristalina, sacarosa o glucosa y similares.
- (b)
- Agentes de disgregación tales como almidones, almidón de maíz pregelatinizado, almidón pregelatinizado, celulosas, carboximetilcelulosa reticulada, almidón glicolato sódico, crospovidona, polivinilpirrolidona reticulada, croscarmelosa sódica, un complejo de alginato de calcio, de sodio, arcillas, alginatos, gomas o almidón glicolato sódico, y cualquier agente de disgregación usado en las preparaciones de comprimidos.
- (c)
- Cargas tales como lactosa, carbonato cálcico, fosfato de calcio, fosfato de calcio dibásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, polvo de celulosa, dextrosa, dextratos, dextrano, almidones, almidón pregelatinizado, sacarosa, xilitol, lactitol, manitol, sorbitol, cloruro sódico, polietilenglicol y similares.
- (d)
- Tensioactivos tales como lauril sulfato de sodio, monooleato de sorbitano, monooleato de polioxietilensorbitano, polisorbatos, polaxómeros, sales de la bilis, monoestearato de glicerilo, línea Pluronic (BASF) y similares.
- (e)
- Solubilizante tal como ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido maleico, bicarbonato sódico del ácido glutárico y carbonato sódico y similares.
- (f)
- También puede utilizarse estabilizadores tales como cualquier agente antioxidante, tampones o ácidos y similares.
- (g)
- Lubricantes tales como estearato de magnesio, hidróxido de calcio, talco, estearil fumarato de sodio, aceite vegetal hidrogenado, ácido esteárico, behapato de glicerilo, estearatos de magnesio, calcio y sodio, ácido esteárico, talco, ceras, Stearowet, ácido bórico, benzoato de sodio, acetato sódico, cloruro sódico, DL-leucina, polietilenglicoles, oleato de sodio o lauril sulfato de sodio y similares.
\newpage
- (h)
- Agentes humectantes tales como ácido oleico, monoestearato de glicerilo, monooleato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, monooleato de polioxietilensorbitano, monolaurato de polioxietilensorbitano, oleato de sodio o lauril sulfato de sodio y similares.
- (i)
- Diluyentes como lactosa, almidón, manitol, sorbitol, dextrosa, celulosa microcristalina, fosfato de calcio dibásico, diluyentes basados en sacarosa, azúcar glas, sulfato de calcio monobásico monohidratado, sulfato de calcio dihidratado, lactato de calcio trihidratado, dextratos, inositol, sólidos de cereales hidrolizados, amilosa, celulosa en polvo, carbonato cálcico, glicina o bentonita y similares.
- (j)
- Antiadherentes o deslizantes tales como talco, almidón de maíz, DL-leucina, lauril sulfato de sodio y estearatos de magnesio, calcio o sodio y similares.
- (k)
- Vehículo farmacéuticamente compatible comprende goma arábiga, gelatina, dióxido de silicio coloidal, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, maltodextrina, glicerina, silicato de magnesio, caseinato de sodio, lecitina de soja, cloruro sódico, fosfato de tricalcio, fosfato de dipotasio, estearil lactilato de sodio, carragenina, monoglicérido, diglicérido o almidón pregelatinizado y similares.
Adicionalmente, las formulaciones de fármacos se
tratan en, por ejemplo, Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania 1975. Otra
discusión de formulaciones de fármacos puede encontrarse en
Liberman, H. A. y Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms,
Marcel Decker, Nueva York, N. Y., 1980.
En la preparación de las composiciones de la
presente invención, los componentes pueden mezclarse con un
excipiente farmacéuticamente aceptable, diluirse por el excipiente
o encerrarse dentro de un vehículo tal, que puede ser en forma de
una cápsula, sobre, papel u otro recipiente. Algunos ejemplos de
excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa,
sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio,
alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa
microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe y
metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente:
agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio y
aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de
suspensión; agentes conservantes, tales como metil y
propilhidroxibenzoatos; edulcorantes; y aromatizantes.
Si el excipiente sirve de diluyente, puede ser
un material sólido, semisólido o líquido que actúa como un
vehículo, excipiente o medio para el principio activo. Por tanto,
las composiciones pueden ser en forma de un comprimido, píldora,
polvo, pastilla para chupar, sobre, sello, elixir, trocisco,
suspensión, emulsión, disolución, jarabe, aerosol (como un sólido o
en un medio líquido), cápsula de gelatina blanda y dura, polvo
envasado estéril, polvo dispensable, gránulos o líquido.
Las formas de comprimidos pueden incluir, por
ejemplo, uno o más de lactosa, manitol, almidón de maíz, almidón de
patata, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, dióxido de
silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de
magnesio, ácido esteárico y otros excipientes, colorantes,
diluyentes, agentes de tamponamiento, agentes humectantes,
conservantes, aromatizantes y vehículos farmacéuticamente
compatibles. En una realización de la presente invención, los
procedimientos de preparación pueden emplear uno o una combinación
de procedimientos: (1) mezclado en seco, (2) compresión directa,
(3) molienda, (4) granulación en seco o no acuosa, (5) granulación
en húmedo o (6) fusión. Lachman y col., The Theory and Practice
of Industrial Pharmacy (1986). Tales comprimidos también pueden
comprender recubrimientos de película que se disgregan con la
ingestión oral o en contacto con el diluyente.
En otra realización de la presente invención,
las composiciones sólidas, tales como comprimidos, se preparan
mezclando el agente terapéutico de la presente invención con un
excipiente farmacéutico para formar una composición de
preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea del agente
terapéutico y el excipiente. Cuando se hace referencia a estos
compuestos de preformulación como homogéneos se indica que los
agentes están uniformemente por toda la composición de manera que
la composición puede subdividirse fácilmente en formas farmacéuticas
unitarias igualmente eficaces, tales como comprimidos, píldoras y
cápsulas. A continuación, esta preformulación sólida se subdivide
en formas farmacéuticas unitarias del tipo descrito en este
documento.
Los comprimidos son formas farmacéuticas sólidas
preparadas compactando una formulación que contiene un agente
terapéutico y el excipiente seleccionado para ayudar en el
procesamiento y mejorar las propiedades del producto. El término
"comprimido" generalmente se refiere a un sencillo comprimido
sin recubrir para ingestión por vía oral preparado mediante una
única compresión o mediante golpes para compactación previa seguido
por una compresión final.
Los comprimidos o píldoras de la presente
invención pueden estar recubiertos o compuestos de otro modo para
proporcionar una forma farmacéutica que proporcione la ventaja de
características de manipulación o almacenamiento mejoradas. Por
ejemplo, el comprimido o píldora puede comprender un componente de
dosificación interna y uno de dosificación externa, estando este
último en forma de una envoltura sobre el anterior.
En otra realización, las composiciones de la
presente invención se administran por infusión intravenosa (iv) o
administración intraarterial durante un periodo deseado (por
ejemplo, inyección en bolo, infusiones de 5 min, 15 min, 30 min, 1
h, 2 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, 72 h o 96 horas). En una realización
de la presente invención, el periodo de administración no es
superior a aproximadamente 3 horas.
Las composiciones de la invención pueden usarse
para tratar una afección o trastorno en los que se indica el
tratamiento con un agente antidiabético de tipo 1 mediante
administración de una o más de las composiciones a un sujeto en
necesidad del mismo. La pauta posológica de dosificación para
evitar, aliviar o mejorar la afección o trastorno se corresponde
con dosificaciones de una vez al día o dos veces al día y puede
incluir, por ejemplo, una dosis unitaria de 0,0001 mg/kg, 0,0005
mg/kg, 0,001 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1
mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40
mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg,
110 mg/kg, 120 mg/kg, 130 mg/kg, 140 mg/kg, 150 mg/kg, 160 mg/kg,
170 mg/kg, 180 mg/kg, 190 mg/kg, 200 mg/kg, 220 mg/kg, 240 mg/kg,
250 mg/kg, 500 mg/kg, 750 mg/kg o 1.000 mg/kg de un agente
terapéutico de la presente invención, y puede modificarse según una
variedad de factores. Por ejemplo, estas cantidades específicas de
mg/kg pueden variar, por ejemplo, de entre aproximadamente el 0,01%
y aproximadamente el 20% o más, dependiendo de la aplicación y
resultado terapéutico deseado. Otros factores incluyen el tipo de
sujeto, la edad, peso, sexo, dieta y condición médica del sujeto y
la gravedad de la enfermedad. Por tanto, la pauta posológica de
dosificación realmente empleada puede variar ampliamente y, por
tanto, desviarse de la pauta posológica de dosificación expuesta
anteriormente. Las formas farmacéuticas unitarias de las
composiciones de la presente invención pueden contener normalmente,
por ejemplo, entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 2000 mg,
o aproximadamente 0,001 mg, o aproximadamente 0,01 mg, o
aproximadamente 0,1 mg, o aproximadamente 1 mg, o aproximadamente 2
mg, o aproximadamente 5 mg, o aproximadamente 10 mg, o
aproximadamente 15 mg, o aproximadamente 20 mg, o aproximadamente
30 mg, o aproximadamente 40 mg, o aproximadamente 50 mg, o
aproximadamente 60 mg, o aproximadamente 70 mg, o aproximadamente
80, mg, o aproximadamente 90 mg, o aproximadamente 100 mg, o
aproximadamente 110 mg, o aproximadamente 120 mg, o aproximadamente
130 mg, o aproximadamente 140 mg, o aproximadamente 150 mg, o
aproximadamente 160 mg, o aproximadamente 170 mg, o aproximadamente
180 mg, o aproximadamente 190 mg, o aproximadamente 200 mg, o
aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 400 mg, o aproximadamente
500 mg, o aproximadamente 750 mg, o aproximadamente 1.000 mg de un
agente terapéutico de la presente invención. Ilustrativamente, cada
forma farmacéutica unitaria contiene aproximadamente 0,1 mg, 1 mg,
5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 100 mg, 250 mg, 500 mg o
1000 mg de un agente terapéutico de la presente invención. La forma
unitaria de dosificación puede seleccionarse para acomodarse a la
frecuencia de administración deseada usada para lograr la
dosificación diaria especificada. La cantidad de la forma
farmacéutica unitaria de la composición farmacéutica que se
administra y la pauta posológica de dosificación para tratar la
afección o trastorno depende de una variedad de factores que
incluyen la edad, peso, sexo y condición médica del sujeto, la
gravedad de la afección o trastorno, la vía y frecuencia de
administración y, por tanto, puede variar ampliamente, como es muy
conocido. Ilustrativamente, si el sujeto es un niño o un animal
pequeño (por ejemplo, un perro), es probable que una cantidad
relativamente baja del agente en el intervalo de dosis de
aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg proporcione
concentraciones de suero en sangre consistentes con la eficacia
terapéutica. Si el sujeto es un ser humano adulto o un animal grande
(por ejemplo, un caballo), para lograr tales concentraciones de
suero en sangre del agente es probable que se requieran unidades de
dosis que contienen una cantidad relativamente mayor del agente,
por ejemplo; una dosis de 15 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 80 mg o 100
mg para un ser humano adulto, o una dosis de 100 mg, 250 mg, 500 mg
o 1000 mg para un caballo adulto. Estas cantidades específicas
pueden variar, por ejemplo, de entre aproximadamente el 0,01% y
aproximadamente el 20% o más, dependiendo de la aplicación y
resultado terapéutico deseado.
La cantidad de agente terapéutico necesaria para
provocar un efecto terapéutico puede determinarse experimentalmente
basándose en, por ejemplo, la tasa de absorción del agente en el
suero en sangre, la biodisponibilidad del agente y la cantidad de
proteína que se une al agente. Sin embargo, se entiende que los
niveles de dosis específicos de los agentes terapéuticos de la
presente invención para cualquier sujeto particular dependen de una
variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto
específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo y
dieta del sujeto (incluyendo, por ejemplo, si el sujeto está en
estado de ayuno o de alimentación), el tiempo de administración, la
tasa de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad del
trastorno particular que está tratándose y forma de administración.
Las dosificaciones de tratamiento pueden valorarse generalmente
para optimizar la seguridad y eficacia. Normalmente, las relaciones
dosificación-efecto de pruebas in vitro y/o
in vivo pueden proporcionar inicialmente una orientación útil
sobre las dosis apropiadas para la administración a sujetos. Para
una orientación generalmente pueden usarse estudios en modelos
animales en lo que respecta a dosificaciones eficaces para el
tratamiento de trastornos o enfermedades diabéticos según la
presente invención. En términos de protocolos de tratamiento debería
apreciarse que la dosificación que va a administrarse dependerá de
varios factores, que incluyen el agente particular que se
administra, la vía administrada, la afección del sujeto particular,
etc. Generalmente, se deseará administrar una cantidad del
compuesto que sea eficaz para lograr un nivel de suero acorde con
las concentraciones encontradas que son eficaces in vitro
durante un periodo de tiempo eficaz para provocar un efecto
terapéutico. Por tanto, si se encuentra que un compuesto demuestra
actividad in vitro a, por ejemplo, 10 ng/ml, se deseará
administrar una cantidad del fármaco que sea eficaz para
proporcionar al menos aproximadamente una concentración de 10 ng/ml
in vivo durante un periodo de tiempo que provoque un efecto
terapéutico deseado, por ejemplo, disminución del nivel de glucosa
en sangre hasta niveles aceptables, o mejora o eliminación de
síntomas, y otros indicadores que se seleccionan como medidas
apropiadas por aquellos expertos en la materia. La determinación de
estos parámetros es fácil dentro de la destreza de la técnica.
Estas consideraciones son muy conocidas en la técnica y se
describen en libros de texto clásicos.
El tratamiento inicial de un sujeto que padece
una afección o trastorno en el que se indica tratamiento con un
agente antidiabético de tipo 1 puede empezar con las dosificaciones
indicadas anteriormente. El tratamiento continúa generalmente según
se necesite durante un periodo de horas, días, semanas hasta varios
meses o años hasta que se haya controlado o eliminado la afección o
trastorno. Los sujetos que se someten a tratamiento con las
composiciones descritas en este documento pueden controlarse
rutinariamente mediante cualquiera de los procedimientos muy
conocidos en la técnica para determinar la eficacia de la terapia.
El análisis continuo de tales datos permite la modificación de la
pauta posológica de tratamiento durante la terapia de manera que en
cualquier momento se administren cantidades eficaces óptimas de
compuestos de la presente invención, y de manera que también pueda
determinarse la duración del tratamiento. De esta manera, la pauta
posológica de tratamiento/programa de administración puede
modificarse racionalmente durante el transcurso de la terapia de
manera que se administre la cantidad más baja de un agente
antidiabético de tipo 1 que presenta eficacia satisfactoria, y de
manera que la administración sólo continúe mientras sea necesaria
para tratar satisfactoriamente la afección o trastorno.
Las presentes composiciones de la invención
también pueden usarse en combinación ("politerapia") con otro
agente farmacéutico que esté indicado para tratar o evitar diabetes
de tipo 1, tales como, por ejemplo, insulina, un inhibidor de
alfa-glucosidasa, un sensibilizador de insulina, o
un agente hiperglicémico, que comúnmente se administran para tratar
los síntomas y/o complicaciones relacionados con este trastorno.
Estos fármacos tienen ciertas desventajas asociadas a su uso.
Algunos de estos fármacos no son completamente eficaces en el
tratamiento de las afecciones anteriormente mencionadas y/o producen
efectos secundarios adversos tales como hipoglucemia, enfermedad
microvascular y enfermedad macrovascular. Sin embargo, si se usan
conjuntamente con la presente invención, es decir, en politerapia,
muchos de estos efectos secundarios no deseados, si no todos,
pueden reducirse o eliminarse. El perfil de efectos secundarios
reducidos de estos fármacos se atribuye generalmente a, por
ejemplo, la reducción de la dosificación necesaria para lograr un
efecto terapéutico con la combinación administrada.
La frase "politerapia" engloba la
administración de una composición de la presente invención
conjuntamente con otro agente farmacéutico que está indicado para
tratar o evitar diabetes de tipo 1 en un sujeto como parte de una
pauta posológica de tratamiento específica prevista para
proporcionar un efecto beneficioso de la co-acción
de estos agentes terapéuticos para el tratamiento de la diabetes de
tipo 1. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se
limita a, co-acción farmacocinética o
farmacodinámica resultante de la combinación de agentes
terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en
combinación normalmente se lleva a cabo durante un periodo de
tiempo definido (normalmente sustancialmente simultáneamente,
minutos, horas, días, semanas, meses o años dependiendo de la
combinación seleccionada). "Politerapia" no pretende englobar
generalmente la administración de dos o más de estos agentes
terapéuticos como parte de pautas posológicas de monoterapia
separadas que casualmente y arbitrariamente dan como resultado las
combinaciones de la presente invención. "Politerapia" pretende
englobar la administración de estos agentes terapéuticos en un modo
secuencial, es decir, en el que cada agente terapéutico se
administra a un tiempo diferente, además de la administración de
estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes
terapéuticos, en un modo sustancialmente simultáneo. La
administración sustancialmente simultánea puede llevarse a cabo, por
ejemplo, administrando al sujeto una única inyección, comprimido o
cápsula que tiene una relación fijada de cada agente terapéutico o
en múltiples inyecciones, cápsulas, o comprimidos únicos para cada
uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o
sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede
efectuarse mediante cualquier vía apropiada. Por ejemplo, la
composición de la presente invención pueden administrarse por vía
oral, percutánea, intravenosa, intramuscular y/o absorberse
directamente a través de las membranas mucosas, por ejemplo,
mientras que el otro agente terapéutico de la combinación puede
administrarse mediante cualquier vía apropiada para ese agente
particular, que incluye, pero no se limita a, una vía oral, una vía
percutánea, una vía intravenosa, una vía intramuscular o mediante
absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa. La
secuencia en la que los agentes terapéuticos se administran no es
exhaustivamente crítica. "Politerapia" también puede englobar
la administración de los agentes terapéuticos como se describen
anteriormente en combinación adicional con otros componentes
biológicamente activos tales como, pero no se limitan a, (1) agentes
antiinflamatorios, tales como un fármaco antiinflamatorio
esteroideo o no esteroideo y/o un inhibidor de
5-lipoxigenasa; o (2) un agente para tratar
enfermedad o trastornos cardiovasculares tal como, por ejemplo, un
agente antihipertensor que incluye, por ejemplo, un inhibidor de la
enzima conversora de angiotensina (inhibidor de ACE), un agonista
alfa-adrenérgico, un agonista
beta-adrenérgico, un bloqueador
alfa-adrenérgico, un antagonista del receptor de
angiotensina II; un diurético, que incluye, por ejemplo, un
antagonista de aldosterona, un derivado de benzotiadiazina, un
organomercúrico, una purina, un esteroide (por ejemplo, canrenona,
oleandrina, espironolactona), un derivado de sulfonamida o un
uracilo; un agente antianginoso; un agente antiarrítmico; un agente
antiarteriosclerótico; un agente antihiperlipoproteinémico; un
agente anticolelitogénico; un agente anticolesterolémico; un agente
antihipercolesterolémico; un agente antihiperlipidémico; un agente
antihipertensor; un agente antihipotensor; un agente
antilipidémico; un bloqueador de los canales de calcio; un agente
depresor cardíaco; un agonista del receptor de dopamina; un
antagonista del receptor de dopamina; un inhibidor de HMG CoA
reductasa; un agente hipocolesterolémico; un agente hipolipidémico;
un agente hipotensor; un inhibidor de monoamina oxidasa; un
relajante muscular; un activador de los canales de potasio; un
agente hipertensor; un antagonista de la recaptación de serotonina;
un agente trombolítico; un agente vasodilatador; un agente
vasotensor; o un agente vasoprotector (basado en parte en la lista
proporcionada en The Merck Index, Merck & Co. Rahway, N. J.
(2001), que se incorpora mediante este documento como referencia);
y con terapias sin fármacos, tales como, pero no se limitan a,
cirugía.
Los compuestos terapéuticos que constituyen la
politerapia pueden ser una forma farmacéutica combinada o formas
farmacéuticas separadas previstas para administración
sustancialmente simultánea. Los compuestos terapéuticos que
constituyen la politerapia también pueden administrarse
secuencialmente, administrándose cualquiera de los compuestos
terapéuticos mediante una pauta posológica que requiere
administración de dos etapas. Por tanto, una pauta posológica puede
requerir administración secuencial de los compuestos terapéuticos
con administración espaciada de los agentes activos separados. El
periodo de tiempo entre las etapas de administración múltiple puede
oscilar de, por ejemplo, algunos minutos a varias horas, a días, que
dependen de las propiedades de cada compuesto terapéutico tales
como potencia, solubilidad, biodisponibilidad, semivida en el plasma
y perfil cinético del compuesto terapéutico, además de depender del
efecto de la ingestión de alimentos y la edad y condición del
sujeto. La variación circadiana de la concentración de moléculas
diana también puede determinar el intervalo de dosis óptimo. Los
compuestos terapéuticos de la politerapia, tanto si se administran
simultáneamente, sustancialmente simultáneamente como
secuencialmente, pueden implicar una pauta posológica que requiera
la administración de un compuesto terapéutico, por ejemplo, por vía
oral y otro compuesto terapéutico por una vía oral, una vía
percutánea, una vía intravenosa, una vía intramuscular o por
absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa.
Tanto si los compuestos terapéuticos de la politerapia se
administran por vía oral, por inhalación de pulverización,
rectalmente, tópicamente, bucalmente (por ejemplo, sublingual) como
parenteralmente (por ejemplo, inyecciones subcutáneas,
intramusculares, intravenosas e intradérmicas, o técnicas de
infusión), por separado o juntos, cada compuesto terapéutico tal
estará contenido en una formulación farmacéutica adecuada de
excipientes, diluyentes u otros componentes de formulación
farmacéuticamente aceptables.
El término "evitar" o "prevención", en
relación con un trastorno o enfermedad diabética de tipo 1,
significa que no se desarrolla trastorno o enfermedad diabética de
tipo 1 si no se ha producido ninguno, o que no se desarrolla más el
trastorno o enfermedad diabética de tipo 1 si ya ha habido
desarrollo del trastorno o enfermedad.
El uso del término "más o menos" en la
presente descripción significa "aproximadamente", e
ilustrativamente, el uso del término "más o menos" indica que
valores ligeramente fuera de los valores citados también pueden ser
eficaces y seguros y tales dosificaciones también están englobadas
por el alcance de las presentes reivindicaciones.
El término "cantidad farmacéuticamente
eficaz" en relación con la cantidad de un agente para tratar
diabetes de tipo 1 significa, consistente con las consideraciones
conocidas en la técnica, la cantidad de un agente diabético de tipo
1 eficaz para provocar un efecto farmacológico o efecto terapéutico
(incluyendo, pero no se limitan a, reducción y/o control de
hiperglucemia) sin demasiados efectos secundarios adversos.
El término "tratar" o "tratamiento"
como se usa en este documento se refiere a cualquier tratamiento de
un trastorno o enfermedad asociados con diabetes de tipo 1 e
incluye, pero no se limita a, evitar que se produzca el trastorno o
enfermedad en un sujeto que puede tener predisposición al trastorno
o enfermedad, pero todavía no se le ha diagnosticado que tiene el
trastorno o enfermedad; inhibir el trastorno o enfermedad, por
ejemplo, deteniendo el desarrollo del trastorno o enfermedad;
aliviar el trastorno o enfermedad, por ejemplo, produciendo la
regresión del trastorno o enfermedad; y/o aliviar la afección
producida por la enfermedad o trastorno, por ejemplo, deteniendo
los síntomas de la enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el
tratamiento de un sujeto incluye reducir los niveles de glucosa en
sangre en un sujeto hiperglucémico y/o mantener aceptable el control
de niveles de glucosa en sangre en el sujeto. Tal tratamiento,
prevención, síntomas y/o afecciones pueden determinarse por un
experto en la materia y se describen en libros de texto
clásicos.
En otra realización de la presente invención, la
composición de la presente invención se presenta en forma de un kit
o envase que contiene una o más de las composiciones o agentes
terapéuticos de la presente invención. La composición que contiene
la composición o agente terapéutico puede envasarse en forma de un
kit o envase en el que las dosificaciones están dispuestas por
horas, diariamente, semanalmente o mensualmente (u otro periodo)
para una adecuada administración secuencial o simultánea. La
presente invención proporciona además un kit o envase que contiene
una pluralidad de unidades de dosificación, adaptadas para
administración diaria sucesiva, comprendiendo cada unidad de
dosificación al menos una de las composiciones o agentes
terapéuticos de la presente invención. Este sistema de
administración de fármaco puede usarse para facilitar la
administración de cualquiera de las diversas realizaciones de las
composiciones y agentes terapéuticos de la presente invención. En
una realización, el sistema contiene una pluralidad de dosis que van
a administrarse diariamente o según se necesiten para alivio
sintomático. El kit o envase también puede contener agentes
utilizados en politerapia para facilitar la apropiada
administración de las formas farmacéuticas. El kit o envase también
puede contener un conjunto de instrucciones para el sujeto.
Lo que sigue es una descripción sólo a modo de
ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos de las realizaciones
de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En los dibujos:
La fig. 1 muestra las secuencias de nucleótidos
y aminoácidos de los insertos de INS\beta y HEL, además de las
regiones flanqueantes que los rodean dentro de la CDR3 de cadena
pesada de la Ig 91A3. El panel inferior de la fig. 1 muestra Ig
quimérica secretada en el sobrenadante de células de transfectoma
que indican que se crearon constructos completos;
la fig. 2 demuestra que la línea de células T
específicas para INS\beta proliferó significativamente en la
incubación con CPA esplénicas de NOD irradiadas y péptido de
INS\beta (figura 2(a)), o IgINS\beta (figura
2(b)), indicando que Ig-INS\beta es
requerido por las CPA y se genera un péptido de INS\beta y se
presenta a células T. Las figuras 2(c) y 2(d) indican
que la presentación de INS\beta y Ig-INS\beta
es específica;
la fig. 3 muestra que los autoanticuerpos
específicos para insulina pueden servir como un marcador del
desarrollo temprano de diabetes;
la fig. 4 muestra una supresión dependiente de
dosis de diabetes por Ig-INS\beta sol en ratones
NOD positivos para IAA;
la fig. 5 muestra que IL-10
secretada por CPA durante la presentación de
Ig-INS\beta ag antagoniza la producción de
IFN\gamma por células T específicas para INS\beta;
la fig. 6 muestra que
Ig-INS\beta ag reduce las respuestas a Th 1, pero
refuerza la producción de IL-10 y TGF\beta con la
administración a ratones NOD;
la fig. 7 muestra que
Ig-INS\beta ag no muestra retraso significativo de
diabetes en ratones positivos para IAA;
la fig. 8 muestra que la forma soluble de
Ig-INS\beta es mucho más eficaz que la forma
agregada en la supresión de diabetes;
la fig. 9 muestra que el tratamiento con
Ig-INS\beta ag en la etapa de preinsulitis conduce
a la supresión eficaz de diabetes;
la fig. 10 muestra que la administración de
Ig-INS\beta ag a ratones NOD
IL-10^{-/-} en la etapa de preinsulitis no
retrasa la aparición de diabetes; y
la fig. 11 ilustra que células T específicas
para INS\beta esplénicas e infiltrantes en islotes elevan
respuestas diferenciales a IFN\gamma con la estimulación con
Ig-INS\beta ag.
La función de IL-10 en la
diabetes depende de varios factores (24-29). Se ha
mostrado que las IL-10 sistémicas previenen la
diabetes en ratones NOD, mientras que la producción local de
IL-10 aceleró el desarrollo de la enfermedad en la
cepa NOD (24-26). Como se muestra en los siguientes
ejemplos y ejemplos comparativos, se inyectó
Ig-INS\beta ag intraperitonealmente y CPA o las
células T "reguladoras" produjeron IL-10 de un
modo sistémico; sin embargo, la diabetes no se retrasó aún cuando
se estableció un mecanismo de tolerancia periférica por la falta de
coestimulación. A diferencia, cuando se administró
Ig-INS\beta ag intraperitonealmente en la etapa
de preinsulitis, fue mucho más eficaz que la forma soluble para la
supresión de diabetes (figura 9). La implicación de
IL-10 en este régimen de preinsulitis es crucial ya
que los ratones deficientes en IL-10 tratados con
Ig-INS\beta ag no mostraron retraso de la diabetes
(figura 10). Por tanto, parece que IL-10 muestra
una función estimuladora cuando su producción se provoca después de
la seroconversión de IAA, pero refuerza una función moduladora
cuando se produce en la etapa de preinsulitis. Una explicación para
esta observación es la que establece que el encuentro de
IL-10 por células T diabetogénicas dentro de los
islotes promueve la estimulación, mientras que la exposición de los
linfocitos T diabetogénicos antes de la migración a los islotes
preserva la modulación. De hecho, Ig-INS\beta sol
dada a ratones después de la seroconversión de IAA reforzó el
retraso y la protección parcial frente a la diabetes indicando que
las células T diabetogénicas permanecían susceptibles a la
tolerancia, mientras que Ig-INS\beta ag, que
también reforzaría la presentación de péptidos con coestimulación
mínima o sin coestimulación, pero incluye la producción de
IL-10 por CPA, no tuvo efecto protector.
A la edad de 10 a 12 semanas, tiempo en el que
los ratones se han seroconvertido para ser positivos para IAA, la
insulitis se establece normalmente y las células T diabetogénicas ya
han infiltrado los islotes (4). Sin embargo, estas células T,
aunque vulnerables al tratamiento con Ig-INS\beta
sol, parecen resistir a la forma agregada de la quimera. Debido a
que tanto las formas agregadas como solubles de Ig no regulan por
incremento las moléculas coestimuladoras (20), pero sólo la forma
agregada induce la producción de IL-10 por CPA, es
probable que las células T diabetogénicas expuestas
IL-10 dentro de los islotes resistan a la
tolerancia. De hecho, estas células se estimularon para producir
IFN\gamma con la incubación con Ig-INS\beta ag o
incluso péptido de INS\beta y IL-10r (figura
11).
Previamente se ha mostrado que las
IL-10 locales producidas dentro de los islotes
regulan por incremento ICAM-1 en endotelio vascular
pancreático y facilitan la aceleración de insulitis (24). En la
etapa de preinsulitis, las células T diabetogénicas pueden
exponerse a IL-10 fuera de los islotes, dando como
resultado más probable sinergia con falta de coestimulación que
conduce a un retraso eficaz de la diabetes. De hecho, las células T
esplénicas de ratones de 14 semanas regularon por disminución la
producción de IFN\gamma cuando se incubaron con
Ig-INS\beta ag o INS\beta y
IL-10 (figura 11). La idea de que el encuentro de
células T con IL-10 antes de la migración a los
islotes tiene un resultado diferente de los encuentros que se
producen dentro de los islotes está reforzada por estudios que
demuestran que con la administración de IL-10 a una
edad temprana y antes de insulitis tienen lugar retrasos de la
diabetes (27, 48), mientras que la prevención de las interacciones
IL-10-IL-10R antes
de insulitis agrava la enfermedad (28). Por tanto, la observación
promete mucho de la función moduladora de la IL-10
liberada por el vector transgénico y vírico, que modularía células T
antes de la migración a los islotes (29, 49, 50). Sin embargo, no
queda claro cómo la inyección de anticuerpo
anti-IL-10 en la etapa de
preinsulitis retrasa la diabetes (27,49) a pesar de que el
tratamiento de Ig-INS\beta ag no pudo retrasar la
enfermedad en ratones deficientes en IL-10 (véase la
figura 10). Por tanto, la inyección de anticuerpo
anti-IL-10 durante el tratamiento
con Ig-INS\beta ag en la etapa de preinsulitis
retrasó la enfermedad (no mostrado) y esta función puede
relacionarse con una reactividad cruzada con otras citoquinas o
moléculas implicadas en la regulación de la patogénesis de diabetes
(49). Debido a que Ig-INS\beta ag indujo células T
productoras de TGF\beta, además de IL-10 (figura
6), no queda claro cómo una citoquina supresora tal no pudo conducir
al retraso de la diabetes.
En conjunto, la composición de la presente
invención muestra bajo diferentes circunstancias distintas funciones
moduladoras y puede adaptarse para retrasar la diabetes en un
paciente humano o no humano antes del desarrollo de insulitis o en
individuos predispuestos que se han seroconvertido y producen
autoanticuerpos frente a uno o más antígenos asociados a células
\beta, tales como, por ejemplo, individuos positivos para IAA, y
también puede llevar a la supresión de diabetes de tipo 1.
Aunque no se pretende ceñirse a la teoría, la
investigación sugiere que IL-10 puede actuar como un
inmunosupresor. Sin embargo, ahora se ha descubierto que esta
función puede explotarse frente a la autoinmunidad en el tratamiento
de la diabetes de tipo 1. Se han observado efectos variables cuando
IL-10 se utilizó para la supresión de la diabetes
de tipo 1. En este documento, el péptido 9-23 de la
cadena \beta de insulina ("INS\beta") se expresa
genéticamente en una quimera de inmunoglobulina (Ig) y la
Ig-INS\beta resultante facilitó el control de
IL-10 endógena y el análisis de su función frente a
la diabetes. Ig-INS\beta soluble ("sol")
reforzó la eficiente presentación de péptidos, mientras que
Ig-INS\beta agregada ("ag") se reticuló a los
receptores de Fc\gamma que provocaron adicionalmente la
producción de IL-10 por las células presentadoras
de antígeno. A continuación, ambas formas se probaron para la
supresión de diabetes en ratones NOD en la etapa de preinsulitis y
tras la seroconversión para la producción de autoanticuerpos de
insulina ("IAA"). Ig-INS\beta soluble mostró
retraso de la diabetes dependiente de la dosis cuando se administró
en cualquier etapa. Sin embargo, Ig-INS\beta
agregada, que indujo células T productoras de IL-10
y TGF\beta, implicando así a la IL-10 endógena
preservada, fue protectora frente a la diabetes cuando se administró
antes del desarrollo de insulitis, pero no tuvo efecto en ratones
predispuestos positivos para IAA. Esta discrepancia guardó relación
con la susceptibilidad variable a IL-10 entre
células T patógenas de islotes y periféricas. Por tanto,
IL-10 sinergiza con la tolerancia periférica en la
etapa de preinsulitis, mientras que en ratones positivos para IAA,
en los que la infiltración en islotes es progresiva, la supresión de
la enfermedad es más eficaz en ausencia de IL-10.
Por tanto, en este documento se contempla que la expresión de
péptido diabetogénico sobre Ig muestra una amplia eficacia frente a
las diversas especificidades de células T responsables de la
diabetes en ratones NOD.
Para demostrar esta premisa, el péptido
9-23 de la cadena beta de insulina (INS\beta)
restringida por I-A^{g7} (30, 31) se manipuló
genéticamente en la región variable de una molécula de IgG2b y las
formas solubles y agregadas de la quimera de
Ig-INS\beta resultante se probaron para
presentación a células T diabetogénicas y supresión de diabetes
antes y después de la seroconversión en la producción de
autoanticuerpos específicos para insulina (IAA). Los resultados
indican que Ig-INS\beta sol muestra protección
parcial contra la diabetes tanto en la etapa de preinsulitis como
en animales positivos para IAA, mientras que
Ig-INS\beta ag, que indujo células productoras de
IL-10 y TGF\beta, es eficaz antes de, pero no
después de la seroconversión de IAA. La función asimétrica de
IL-10 endógena puede relacionarse con la
susceptibilidad variable de las células T diabetogénicas a la
citoquina dependiendo de si la exposición se produce antes o después
de la migración a los islotes.
La presente invención demuestra que
Ig-INS\beta sol, que no induce la producción de
IL-10 con la unión a Fc\gammaRs, muestra
funciones reguladoras por disminución in vivo y retrasa la
aparición de diabetes en ratones NOD seropositivos para IAA
(figuras 4, 5 y 7). Aunque no se ha logrado la completa supresión,
el retraso observado sigue siendo de gran importancia ya que la
solución proporciona un medio para tratar sujetos predispuestos
después de que la enfermedad progrese hasta una etapa irreversible.
Por tanto, la administración semanal continua de
Ig-INS\beta sol puede proteger completamente
contra la enfermedad en ratones positivos para IAA. Debido a que
Ig-INS\beta usa el mismo isotipo IgG2b que
Ig-PLP1 y Ig-MOG (22, 23) y como
estas quimeras no pueden inducir la regulación por incremento de
moléculas coestimuladoras en CPA con la inyección a animales libre
de adyuvante (20), la presentación de INS\beta resultante in
vivo carece con gran probabilidad de guía coestimuladora hacia
un mecanismo similar a tolerancia periférica eficaz frente a células
T diabetogénicas. Por otra parte, se muestra que
Ig-INS\beta ag, que se reticula a Fc\gammaR,
induce la producción de IL-10 por CPA (figura 5).
Como consecuencia, tal secreción de IL-10 por CPA
condujo a la regulación por disminución de la producción de
IFN\gamma por células T específicas que cooperaron con las CPA por
el péptido de INS\beta derivado de Ig-INS\beta
ag (figura 5). Además, Ig-INS\beta ag estimuló la
inducción de células T productoras de IL-10 y
TGF\beta in vivo (figura 6). Sin embargo,
Ig-INS\beta ag no pudo suprimir la diabetes o
incluso preservar las funciones moduladoras parciales que
normalmente se producen como consecuencia de la presentación de
péptidos con coestimulación mínima o sin coestimulación en aquellos
ratones positivos para IAA (figura 7). Por tanto, la movilización
de IL-10 endógena, tanto si es por estimulación de
CPA como por inducción de células T "reguladoras" en animales
que se han seroconvertido para la producción de IAA e iniciado
insulitis, parece antagonizar la tolerancia periférica y refuerza la
progresión de la enfermedad.
A continuación se describen los materiales y
procedimientos como se usan en los siguientes ejemplos
experimentales.
Se compraron ratones NOD
(H-2^{g7}) de Jackson Laboratories (Bar Harbor,
ME) y los ratones NOD deficientes en IL-10
(IL-10^{-/-}) se habían descrito previamente (32)
y también están disponibles de Jackson Laboratories. Todos los
ratones se mantuvieron en un animalario mientras duraron los
experimentos y los procedimientos experimentales realizados en
estos animales se llevaron a cabo según las directrices del comité
institucional para el cuidado de animales.
Los ratones se sangran semanalmente por la vena
de la cola y las muestras de sangre se usan para evaluar tanto el
contenido de glucosa como los anticuerpos
anti-insulina. Para la medición de glucosa se coloca
directamente una gota de sangre en una tira reactiva y el contenido
de glucosa se lee usando un sistema de control
Accu-Chek Advantage (Roche Diagnostics,
Indianapolis, IN). Para la detección de anticuerpos
anti-insulina, la sangre se deja coagular durante 1
hora a temperatura ambiente y el suero se separa y se usa para
ELISA. Un ratón se considera diabético cuando la glucosa en sangre
es superior a 300 mg/dl durante dos semanas consecutivas.
Todos los péptidos usados en este estudio se
compraron de Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL) y se
purificaron por HPLC hasta > 90% de pureza. El péptido de
INS\beta (Seq. ID. No. 1 [SHLVEALYLVCGERG]) engloba un epítopo
diabetogénico correspondiente a los residuos de aminoácidos
9-23 de la cadena \beta de insulina (30, 31). El
péptido de lisoenzima de huevo de gallina ("HEL") (Seq. ID. No.
2 [AMKRHGLDNYPGYSL]) engloba un epítopo no diabetogénico
correspondiente a los residuos de aminoácidos 11-25
de HEL. Tanto los péptidos de INS\beta como de HEL se presentan a
células T en asociación con moléculas de MHC de clase II de
I-A^{g7} (30, 33). Otros péptidos que pueden
insertarse dentro de la región variable dentro la región CDR de una
Ig y utilizarse para crear composiciones para el tratamiento de la
diabetes de tipo 1 como se enseña en la presente invención son:
GAD1 (ácido glutámico descarboxilasa-65, también
conocido como "GAD65"); correspondiente a los residuos de
aminoácidos 524-543 de GAD 65 (Seq. ID. No. 3
[SRLSKVAPVIKARMMEYGTT]) para crear quimeras de
Ig-GAD1; y 2) GAD2; correspondiente a los residuos
de aminoácidos 206-220 de GAD 65 (Seq. ID. No. 4
[TYEIAPVFVLLEYVT]).
Los péptidos se denominan frecuentemente en este
documento "determinante o epítopo que coopera con células T"
porque pueden funcionar como un agonista o un antagonista o pueden
interferir de otro modo con el receptor de células T.
Ig-INS\beta es una quimera que
expresa el péptido de INS\beta, que se corresponde con los
residuos de aminoácidos 9-23 de la cadena \beta
de insulina. La construcción de Ig-INS\beta usó
los genes que codificaban las cadenas pesadas y ligeras del
anticuerpo anti-arsonato, 91A3, según los
procedimientos descritos para la construcción de
Ig-PLP1 (18, 34). En resumen, el gen
91A_{3}V_{H} se subclonó en el sitio EcoRI de un plásmido pUC19
y se usó como ADN molde en reacciones de mutagénesis por PCR para
generar fragmentos de 91A_{3}V_{H} que llevaban la secuencia de
INS\beta (91A_{3}V_{H}-INS\beta) en lugar
del segmento D dentro de la complementariedad que determina la
región 3 (CDR3). A continuación, el fragmento de
91A_{3}V_{H}-INS\beta se subclonó en un
vector de expresión delante de los exones que codifican la región
constante de \gamma2b de BALB/c (18). A continuación, este
plásmido se co-transfectó en la línea de células B
de mieloma SP2/0 no productora de Ig con un vector de expresión que
llevaba la cadena ligera de 91A3 parental. Los transfectantes que
produjeron Ig-INS\beta se seleccionaron en
presencia de geneticina y ácido micofenólico.
Ig-HEL, que engloba los residuos de aminoácidos
11-25 de HEL, se construyó usando los mismos genes
de 91A3 según el procedimiento descrito para
Ig-INS\beta. Ambas quimeras están hechas de
cadenas pesadas y ligeras idénticas, pero llevan diferentes
péptidos. Ig-W, la Ig 91A3 parental (codificada por
genes de tipo salvaje) que no engloba ningún péptido foráneo, se ha
descrito en otra parte (18). Los cultivos a gran escala de células
de transfectoma se llevaron a cabo en medio DMEM que contenía suero
bovino enriquecido con hierro al 10% (Bio Whittaker, Walkersville,
MD). La purificación de Ig-INS\beta,
Ig-HEL y Ig-W se llevó a cabo en
columnas separadas de AcM de rata anti-cadena kappa
de ratón acopladas a sefarosa 4B activada con CNBr (Amersham
Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
También está dentro del alcance de la invención
que la inmunoglobulina tenga más de un péptido ligado a la
inmunoglobulina. Además, la inmunoglobulina, o una parte de la
misma, puede ser humana o humanizada, tal como, por ejemplo, IgG
humana, tal como IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgGA, IgA1,
IgA2, IgGE, IgD, IgE o IgM. Las quimeras de Ig-P de
la presente invención también pueden comprender un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Las quimeras se agregaron mediante precipitación
con (NH_{4})_{2}SO_{4} saturado al 50% como se ha
descrito previamente (22). En resumen,
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturado al 100% filtrado se añadió
a un volumen igual a la preparación de quimeras de Ig. La mezcla se
incubó a 24ºC durante 1 hora con agitación suave cada 20 minutos.
Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm y el
sedimento se volvió a suspender a 1 mg/ml en PBS. La electroforesis
en un gel de acrilamida al 10% confirmó que la preparación de
quimeras de Ig estaba en forma agregada. Debido a que tanto
Ig-INS\beta como Ig-HEL derivan
del mismo esqueleto de Ig y así comprenden idéntico isotipo IgG2b,
sus funciones asociadas al Fe serán similares.
Se usó RIA de captura para evaluar la secreción
de constructos completos de Ig-INS\beta y
Ig-HEL a partir de transfectantes de SP2/0. Se
recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con anticuerpo
policlonal de conejo específico para anti-cadena
\gamma2b de ratón (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) (2
\mug/ml en PBS) durante la noche a 4ºC y luego se bloquearon con
BSA al 2% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A
continuación, las placas se lavaron tres veces con PBS y 100
\mul/pocillo de sobrenadante de células de SP2/0 que crecieron en
presencia de fármacos selectivos se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente. Después de tres lavados con PBS, las quimeras
de Ig capturadas se revelaron mediante incubación con 1x10^{5}
cpm/pocillo de AcM de rata marcado con ^{125}I
anti-kappa de ratón (ATCC, Rockville, MD) durante 2
horas a 37ºC. A continuación, las placas se lavaron cinco veces con
PBS y se contaron usando un contador gamma Wallac LKB.
Líneas de células T: una línea de células T
específicas para el péptido de INS\beta se generó inmunizando
ratones NOD con 100 \mug de péptido de INS\beta en 200 \mul de
PBS/CFA (vol/vol) subcutáneamente ("s.c.") en las almohadillas
de las patas y en la base de cada extremidad. Después de 10 días se
eliminaron los ganglios linfáticos drenantes y las células T se
estimularon in vitro durante 2 rondas en presencia de
esplenocitos singénicos irradiados (3000 rads), complemento de
T-Stim al 5% (Collaborative Biomedical Products,
Bedford, MA) y péptido de INS\beta (25 \mug/ml). El medio de
cultivo usado para llevar a cabo estas estimulaciones y otros
ensayos de activación de células T en este estudio fue DMEM
complementado con PCS al 10% (Hyclone, Logan, UT),
2-mercaptoetanol 0,05 mM, glutamina 2 mM, piruvato
de sodio 1 mM y 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Los ratones
NOD también se usaron para la inmunización con el péptido de HEL y
la generación de la línea de células T específicas para HEL según
procedimientos similares a la línea específica para INS\beta.
Hibridomas de células T: una línea de células T
específicas para HEL se fusionó con el timoma negativo de TCR
\alpha\beta BW1100 (ATCC) usando polietilenglicol 4000 (Sigma,
St. Louis, MO). A continuación, los híbridos se seleccionaron
complementando los medios de cultivo con
hipoxantina-azaserina (Sigma). A continuación, los
hibridomas resultantes se examinaron para la reactividad respecto al
péptido de HEL probando la producción de IL-2 en el
sobrenadante tras la estimulación con esplenocitos irradiados (3000
rads) en presencia de 15 \mug/ml de péptido de HEL. A
continuación, los hibridomas positivos se clonaron limitando la
dilución y se usaron para evaluar la presentación del péptido de
HEL y la quimera de Ig-HEL.
La detección de autoanticuerpos de insulina
("IAA") en el suero de ratones NOD se llevó a cabo mediante
ELISA del siguiente modo: se recubrieron placas de microtitulación
número 3369 (Coming Inc, Coming, NY) con 50 \mul de disolución de
bicarbonato sódico (pH 9,6) que contenía 10 \mug/ml de insulina
porcina (Sigma, Saint Louis, MO) durante 16 horas a 4ºC. A
continuación, las placas se lavaron 3 veces con
Tween-20 al 0,05% en PBS y los sitios sin plástico
se saturaron mediante incubación con caseína al 2,5% (en NaCl 0,3 M,
pH 7) durante 2 horas a TA. Posteriormente se añadieron las
muestras de suero (diluciones 1/200) y las placas se incubaron
durante 16 horas a 4ºC. Se añadió AcM de rata conjugado con biotina
anti-kappa de ratón (100 \mul a 1 \mug/ml) y
las placas se incubaron durante 1 hora a TA. El AcM
anti-kappa de ratón unido se reveló mediante
incubación con una disolución de caseína que contenía 2,5 mg/ml de
avidina peroxidasa durante 30 min a TA seguido por la adición de
sustrato ABTS. Las muestras se leyeron a 405 nm en un Spectramax 190
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Tratamiento de ratones NOD positivos para IAA
con Ig-INS\beta: se llevaron a cabo estudios
preliminares que indicaron que la seroconversión a positivos para
IAA se produce más frecuentemente entre las edades de 8 y 12
semanas. A los ratones se les administra semanalmente inyecciones
intraperitoneales de o Ig-INS\beta ag o sol o
Ig-HEL empezando la semana de la seroconversión. A
los ratones se les administra o 2 ó 3 inyecciones 7 días después de
la quimera de Ig en 300 \mul de solución salina. Empezando en la
semana 12 de edad, los ratones se probaron semanalmente para
glucosa en sangre hasta la semana 30, a menos que previamente se
diagnostiquen diabéticos.
Tratamiento de ratones NOD con
Ig-INS\beta en la etapa de preinsulitis: a los
ratones se les administró una inyección i.p. semanalmente de 300
\mug de Ig-INS\beta o Ig-HEL en
300 \mul de solución salina empezando en la semana 4 durante un
total de 3 inyecciones. Empezando en la semana 12 de edad, los
ratones se probaron semanalmente para glucosa en sangre hasta la
semana 30, a menos que previamente se diagnostiquen diabéticos.
La detección de IL-10 y
IFN\gamma se realizó según el protocolo convencional de BD
Pharmingen. Los Ac de captura fueron del siguiente modo:
IL-10 de rata anti-ratón,
JES5-2A5, y IFN\gamma de rata
anti-ratón, R4-6A2. Los Ac
biotinilados anti-citoquinas fueron del siguiente
modo: IL-10 de rata anti-ratón,
JES5-16E3, y IFN\gamma de rata
anti-ratón, XMG1.2. Ambos anticuerpos se compraron
de BD Pharmingen (San Diego, CA). Se realizó ELISA para la
detección de TGF\beta activo usando el kit DuoSet para
TGF\beta_{1} humano (R&D Systems, Mineápolis, MN) según las
instrucciones del fabricante. TGF\beta unido se reveló usando el
sistema de sustrato de peroxidasa TMB microwell (Kirkegaard &
Perry Laboratories, Gaithersburg, MA). Todos los ensayos se leyeron
en un contador SpectraMAX 190. Las cantidades graduadas de
IFN\gamma, IL-10 y TGF\beta de ratón
recombinante se incluyeron en todos los experimentos para la
construcción de curvas patrón. La concentración de citoquinas en
sobrenadantes de cultivos se obtuvo por interpolación de la parte
lineal de la curva patrón.
Respuestas de líneas de células T: se sembraron
en placa células dendríticas de cargar purificadas ("DC") a
5x10^{4} células/pocillo/50 \mul y se incubaron con cantidades
graduadas de quimeras de Ig sol o ag (100 \mul/pocillo) durante 1
hora. Posteriormente se añadieron células T específicas para péptido
(5x10^{4} células/pocillo/50 \mul) y el cultivo continuó
durante 24 h. La detección y cuantificación de citoquinas se
evaluaron mediante ELISA a partir de 100 \mul de sobrenadante de
cultivo como se describe anteriormente.
Respuestas de células T esplénicas NOD con el
tratamiento con Ig-INS\beta: las células
esplénicas (1x10^{6} por pocillo) que incluyen tanto linfocitos T
como CPA se incubaron con 30 \mug de péptido de INS\beta y se
analizaron las respuestas a células T. Las citoquinas se midieron
mediante ELISA después de 48 horas de incubación como se describe
anteriormente y la proliferación se evaluó mediante la incorporación
de [^{3}H]-timidina después de 3 días. En este
ensayo de proliferación, las células se incubaron en placas de fondo
plano de 96 pocillos con o sin el estimulante durante 3 días y se
añadió 1\muCi de [^{3}H]-timidina por pocillo
durante las últimas 14,5 h de estimulación. A continuación, las
células se recogieron en un colector Trilux 1450 Microbeta Wallac y
la [^{3}H]-timidina incorporada se contó usando el
software Microbeta 270.004 (EG&G Wallac INC, Gaithersburg, MD).
Se incluyó un medio de control sin estimulante y se usó como
ruido.
Se purificaron DC esplénicas según el
procedimiento convencional de colagenasa/adherencia diferencial
(35). Brevemente, el bazo se homogeneizó en una disolución de
colagenasa y las DC aisladas se hicieron flotar en un gradiente de
BSA denso. Posteriormente, las células se dejaron adherirse a placas
de petri durante 90 minutos a 37ºC, se lavaron y se incubaron
durante la noche. A continuación, las DC se recogieron y se
purificaron adicionalmente sobre microperlas acopladas a
anti-CD11c según las instrucciones de Miltenyi.
Las DC de CD11c^{+} esplénicas purificadas de
ratones NOD se sembraron en placa con cantidades graduadas de
quimeras de Ig sol o ag y entonces el cultivo se incubó durante 24 h
con o sin células T específicas. A continuación, la detección y
cuantificación de citoquinas se evaluó por ELISA a partir de 100
\mul de sobrenadante de cultivo como se describe
anteriormente.
Las células infiltrantes en islotes se derivaron
de ratones NOD hembra de 14 semanas mediante la digestión con
colagenasa como se describe previamente (36). Brevemente, los
páncreas se recogieron en una disolución de PBS que contenía FCS al
5% y glucosa al 1%, se molieron finamente y se digirieron en una
disolución de colagenasa tipo IV (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)
complementada con FCS al 15% durante 8 min a 37ºC. A continuación,
los islotes se prensaron a través de un tamiz de metal de 100 \mum
y se filtraron sucesivamente a través de cedazos de nailon de 70
\mum y 40 \mum para recuperar las células infiltrantes. La
viabilidad de las células se determinó mediante exclusión con azul
de tripano.
Estudios recientes han revelado que los ratones
con una EAE en curso mejoran su enfermedad cuando se tratan con Ig
quiméricas que expresan epítopos de mielina (20, 22, 23). Esta
investigación busca determinar si la administración similar de un
péptido diabetogénico sobre Ig podría inhibir DMID en el ratón NOD.
El péptido de INS\beta restringido por I-A^{g7}
que se definió por estar asociado con el desarrollo de diabetes en
el ratón NOD (37, 38) se seleccionó para expresión sobre Ig para
generar una quimera de Ig-INS\beta adecuada para
la evaluación contra la diabetes. El péptido de HEL, que se presenta
en moléculas de MHC de clase II de I-A^{g7} sin
causar diabetes (30), se usó para generar una quimera de
Ig-HEL que sirviera de control. Por consiguiente,
las secuencias de nucleótidos de INS\beta y HEL se insertaron por
separado en la CDR3 de la cadena pesada de 91A3 mediante
mutagénesis por PCR (18) y los genes de cadena pesada quimérica
resultantes se analizaron mediante secuenciación de ADN (véase
"Materiales y procedimientos").
Los resultados presentados en la figura 1
muestran las secuencias de nucleótidos de estos insertos, además de
las regiones flanqueantes que los rodean. El panel superior muestra
una comparación de la secuencia de nucleótidos del gen
91A_{3}V_{H} parental con las secuencias de los
91A_{3}V_{H}-INS\beta y
91A_{3}V_{H}-HEL quiméricos. Ambos fragmentos
de 91A_{3}V_{H}-INS\beta y
91A_{3}V_{H}-HEL quiméricos se subclonaron en
un vector de expresión delante de los exones que codifican la región
constante de una \gamma2b de BALB/c. A continuación, los
plásmidos se co-transfectaron por separado en la
línea de células B de mieloma SP2/0 no productora de Ig con un
vector de expresión que llevaba la cadena ligera de 91A3 parental.
Los transfectantes que produjeron Ig-INS\beta se
seleccionaron en presencia de geneticina y ácido micofenólico como
se describe en "Materiales y procedimientos" ("Quimeras de
Ig") (18). En el panel inferior, la detección de Ig quimérica
secretada en el sobrenadante de células de transfectoma se llevó a
cabo mediante incubación de sobrenadante de transfectantes de
Ig-INS\beta, Ig-HEL o
Ig-W en placas de microtitulación recubiertas con
anticuerpo de conejo específico para anti-cadena
\gamma2b de ratón y revelación de quimeras de Ig capturadas con
AcM de rata marcado con [^{125}I] anti-cadena
ligera kappa de ratón. Cada barra representa la media \pm DE de
triplicados.
Los datos indican que la secuencia de
nucleótidos de INS\beta se insertó completamente en lugar del
segmento D. Las regiones flanqueantes que rodean INS\beta son
idénticas a aquellas regiones que flanquean el segmento D dentro de
la cadena pesada parental, indicando que la secuencia de nucleótidos
de INS\beta se insertó en el marco de lectura correcto. Se
obtuvieron resultados similares con péptido de HEL que indican que
una secuencia de nucleótidos completa de péptido de HEL se
incorporó en el marco de lectura correcto. Posteriormente, estos
genes de cadena pesada quimérica se subclonaron en un vector de
expresión pSV2 y se co-transfectaron por separado
con el gen de cadena ligera kappa de 91A3 parental en la línea de
células B de mieloma SP2/0 no productora de Ig (18) y como se
enseña en "Materiales y procedimientos" ("Quimeras de
Ig").
Los pocillos con crecimiento celular se
identificaron visualmente usando fármacos selectivos y sus
sobrenadantes se probaron para la presencia de Ig. Como se
representa en el panel inferior de la figura 1, el sobrenadante de
un transfectante de Ig-INS\beta representativo se
incubó en placas recubiertas con anticuerpo
anti-\gamma2b unido a un AcM de rata
anti-cadena ligera kappa de ratón, como hizo
Ig-W, indicando el anticuerpo 91A3 parental con un
dominio CDR3 intacto que la cadena pesada quimérica de
91A3-INS\beta se apareó con la cadena ligera
parental y formó un molécula de Ig-INS\beta
completa. Similarmente, un sobrenadante representativo de un
transfectante de 91A3-HEL mostró una unión
significativa del anticuerpo anti-cadena ligera,
indicando que la inserción del péptido de HEL dentro de la región
variable de cadena pesada no alteró el apareamiento con la cadena
ligera parental y se produjo una molécula de Ig-HEL
completa.
La siguiente cuestión a resolver fue si
Ig-INS\beta se procesa apropiadamente y genera un
péptido de INS\beta que pueda presentarse a células T. Para
demostrar esta premisa, la quimera se purificó a partir del
sobrenadante de cultivos a gran escala mediante cromatografía de
afinidad y se ensayó para la presentación usando una línea de
células T específicas para INS\beta que se había generado en
ratones NOD mediante inmunización con péptido de INS\beta (véase
"Materiales y procedimientos"). Similarmente, para garantizar
que el péptido de HEL podría procesarse a partir de
Ig-HEL y presentarse a células T, se generó un
hibridoma específico para HEL fusionando la línea de células T de
corto plazo específica para HEL con el timoma negativo para el
receptor de células T \alpha\beta (TCR \alpha\beta) BW1100
(véase "Material y procedimientos").
A continuación se determinó la presentación de
quimera de Ig-INS\beta a células T específicas T.
Los esplenocitos NOD irradiados (3000 rads) (5x10^{5} células/50
\mul/pocillo) se incubaron con 100 \mul de antígeno y una hora
después se añadieron las células T (5x10^{4} células/pocillo/50
\mul) específicas para o péptido de INS\beta (fig.
2(a)-2(b)) o de HEL (fig.
2(c)-2(d)). Para la presentación de
péptido de INS\beta y Ig-INS\beta (fig.
2(a) y 2(b) respectivamente), la activación se evaluó
mediante incorporación de [^{3}H]-timidina ya que
las células T eran de una línea. Por consiguiente, se añadió 1
\muCi de [^{3}H]-timidina por pocillo durante
las últimas 14 horas de un periodo de incubación de 3 días y las
células se recogieron y se contó la radiactividad. Para la
presentación de péptido de HEL (fig. 2(c)) y
Ig-HEL (Fig. 2(d)), la activación de células
T se evaluó midiendo la producción de IL-2 ya que
las células específicas para HEL eran de un hibridoma. Por
consiguiente, después de incubación de 24 horas,
IL-2 se midió en 100 \mul de sobrenadante mediante
ELISA. En este ensayo, los péptidos se usaron a concentración 10
\muM y las quimeras de Ig a 1 \muM. Cada punto o barra
representa la media de triplicados.
Como se indica en la figura 2, la línea de
células T específicas para INS\beta proliferó significativamente
con la incubación con CPA esplénicas NOD irradiadas y péptido de
INS\beta (figura 2(a)) o Ig-INS\beta
(figura 2(b)), indicando que Ig-INS\beta es
requerida por las CPA y se genera un péptido de INS\beta y
presenta a células T. El péptido de HEL y Ig-HEL,
aunque pueden estimular el hibridoma específico para HEL como se
mide por la producción de IL-2 (figuras 2(c)
y
2(d)), no pudieron inducir la proliferación de la línea específica para INS\beta indicando que la presentación de INS\beta y Ig-INS\beta es específica. Los resultados anteriormente descritos demuestran que el péptido de INS\beta y de HEL expresado en Ig es funcional y adecuado para la evaluación de la supresión de diabetes.
2(d)), no pudieron inducir la proliferación de la línea específica para INS\beta indicando que la presentación de INS\beta y Ig-INS\beta es específica. Los resultados anteriormente descritos demuestran que el péptido de INS\beta y de HEL expresado en Ig es funcional y adecuado para la evaluación de la supresión de diabetes.
Un estudio de la incidencia de diabetes por
género en la colonia NOD indicó que el 38% de ratones NOD macho
desarrollan diabetes espontánea a la edad de 26 semanas. Sin
embargo, los ratones NOD hembra han mostrado una mayor
susceptibilidad a la enfermedad y el 80% desarrollaron diabetes
espontánea a la edad de 26 semanas. Esto concuerda bien con
informes previos y sugiere que el uso de ratones hembra sería más
adecuado para la investigación.
Recientemente se ha demostrado que IAA puede
usarse como un marcador para la predicción de diabetes de tipo 1 en
niños y ratones NOD jóvenes (39, 40). Esto es ventajoso ya que
centra la intervención antes de la destrucción significativa de
células \beta sin comprometer la exactitud del estudio. Por tanto,
se decidió desarrollar un gráfico que sólo incluyera ratones
positivos para IAA para evaluar la capacidad de
Ig-INS\beta para la supresión de diabetes. Por
consiguiente, un grupo de 70 ratones hembra NOD se sometió a pruebas
semanales para IAA empezando en la semana 6 hasta la semana 12 de
edad y los ratones positivos para IAA se controlaron para glucosa
en sangre después de esto y hasta 30 semanas.
En la figura 3(a), 70 ratones hembra NOD
adultos se sangraron semanalmente empezando a la edad de 6 semanas
y sus muestras de suero se probaron para IAA a una dilución 1/200
mediante ELISA como se describe en la sección de "Materiales y
procedimientos". Una muestra se considera positiva para IAA
cuando la DO_{405} es > 0,2. El límite de 0,2 se eligió porque
las muestras de suero de 10 ratones SJL, no propensos al desarrollo
de diabetes y supuestamente no producen autoanticuerpos específicos
para insulina, nunca superaron DO_{405} de 0,2. De los 70 ratones
probados, 58 (83%) han mostrado un resultado positivo para IAA. En
la figura 3(b), los 58 ratones que se probaron positivos
para IAA a la semana 12 se sometieron a medición semanal de glucosa
en sangre empezando en la semana 12 continuando hasta la semana 30.
De los 58 ratones positivos para IAA, 49 (84%) fueron diabéticos a
la edad de 30 semanas. La figura 3(c) muestra la incidencia
en porcentaje de diabetes temprana (15-20 semanas
de edad) y retrasada (21 a 30 semanas de edad) para ratones que
desarrollaron IAA a las semanas indicadas, n indica el número de
ratones por grupo.
Como se indica en la figura 3(a), la
aparición de IAA empieza en la semana 7 y a las 12 semanas de edad,
58 de los 70 ratones probados (83%) eran positivos para IAA.
Además, de los 58 ratones positivos para IAA, el 84% fueron
diabéticos a las 30 semanas de edad (figura 3(b)), que indica
que IAA puede servir como un marcador para el desarrollo de
diabetes de tipo 1 en ratones NOD hembra. De manera interesante, un
porcentaje significativo (60%) de los ratones que fueron positivos
para IAA en la semana 8, 9 ó 10 manifestó diabetes a la edad de 15
a 20 semanas y tal incidencia temprana aumentó hasta el 80% para los
ratones que desarrollaron IAA a la semana 11 de edad (figura
3(c)). Por tanto, estos resultados sugieren demostrar que el
desarrollo de IAA entre la edad de 8 a 11 semanas puede servir como
un marcador para el desarrollo de diabetes a la edad temprana de 15
a 20 semanas.
Aunque la infiltración de los islotes
pancreáticos con células inflamatorias se produce mucho antes que la
hiperglucemia, la biopsia pancreática para el análisis histológico
representa una solución poco práctica para la predicción de la
aparición de diabetes. La detección de IAA en muestras de sangre es
práctica y ha demostrado ser fidedigna para la predicción de la
aparición de diabetes temprana en el ratón NOD (39, 40). Por tanto,
el marcador de IAA se usó para la evaluación de
Ig-INS\beta para la supresión de diabetes antes de
la aparición de hiperglucemia. Por consiguiente, los ratones NOD se
probaron para la presencia de IAA y aquellos que se
seroconvirtieron a la edad de 8 a 11 semanas se les administró
Ig-INS\beta sol en solución salina en la semana
de seroconversión y después de esto como se indica, y se controlaron
para glucosa en sangre hasta la semana 26 de edad. Específicamente,
a los grupos de ratones NOD hembra (10 por grupo) positivos para IAA
entre la edad de 8 y 11 semanas se les administró una inyección
intraperitoneal ("i.p.") de 100 \mug (a), 200 \mug (b) o
300 \mug (c) de o Ig-INS\beta sol (barras
negras) o Ig-HEL sol (barras rayadas) en la semana
de seroconversión. A todos los grupos se les administró una
inyección adicional de la misma cantidad 7 días después y los
ratones en la fig. 4(c) recibieron una tercera inyección en
el día 14 después de la seroconversión. Un séptimo grupo no recibió
ninguna inyección (cero: barras blancas) y se incorporó en los tres
paneles para servir de control. La incidencia en el porcentaje de
diabetes se muestra en cada uno de los grupos a la semana 19 y 26
de edad en las figs. 4(a) - 4(c).
Como puede verse en la figura 4(a), dos
dosis de 100 \mug de Ig-INS\beta sol no tuvieron
retraso significativo en la aparición temprana de diabetes y la
mayoría de los animales fueron diabéticos a la semana 26 de edad.
Cuando se administraron dos dosis de 200 \mug de
Ig-INS\beta sol (fig. 4(b)), la aparición
de diabetes se retrasó y sólo el 30% de los ratones fue diabético a
la semana 19 respecto al 50% en el grupo sin tratar. No se logró la
prevención completa y a la semana 26 la mayoría de los animales
tratados con Ig-INS\beta sol desarrollaron
diabetes. El retraso de la diabetes es específica para antígeno ya
que Ig-HEL no tuvo retraso significativo o
protección contra la diabetes. El aumento de la dosis hasta 300
\mug por inyección y dando un total de 3 inyecciones retrasó la
diabetes de aparición temprana significativamente ya que sólo el 20%
de los ratones desarrollaron diabetes a la semana 19 respecto al
50% en el grupo sin tratar (fig. 4(c)). Además, el 50% de
los ratones tratados con Ig-INS\beta sol
permanecieron sin enfermedad a la semana 26 de edad, mientras que
sólo el 20% en el grupo sin tratar no tuvo diabetes.
Ig-HEL de control no tuvo retraso significativo o
protección contra diabetes temprana o retrasada.
Ejemplo comparativo
5
La agregación de Ig confiere funciones asociadas
a Fc tales como reticulación de Fc\gammaRs y activación del
complemento (41, 42). Previamente se ha mostrado que la agregación
de quimeras de Ig-mielina que usan el mismo
esqueleto de IgG2b que Ig-INS\beta y
Ig-HEL se reticula con Fc\gammaRs en CPA e induce
la producción de IL-10 tanto por células
dendríticas como por macrófagos (22, 23). Además, mientras que las
quimeras de Ig-mielina sol suprimieron recaídas con
un pequeño efecto en la fase grave inicial de EAE, las quimeras ag
indujeron la recuperación completa y rápida de la fase paralítica
inicial y las recaídas (20, 22). La neutralización de
IL-10 endógena mediante la administración de
anticuerpo anti-IL-10 durante el
tratamiento con las quimeras de Ig-mielina ag
restauró la gravedad de la enfermedad (22). Estos resultados
indicaron que la reticulación de Fc\gammaRs y la producción de
IL-10 por CPA potencian la función moduladora de
quimeras de Ig-mielina y promueven la supresión
eficaz de EAE (20, 22). Tal eficacia puede ser debida a la sinergia
entre IL-10 endógena y la presentación de
mielina-péptido con mínima coestimulación (20). Sin
embargo, puesto que IL-10 puede servir como factor
de crecimiento para el desarrollo de células T reguladoras (43, 44),
puede haber inducción de tales células que podría reforzar la
producción continua de IL-10 y proporcionar
funciones moduladoras adicionales contra células T patogénicas.
Para demostrar si podrían desarrollarse efectos similares en el
sistema NOD, se agregó Ig-INS\beta (véase
"Agregación de quimeras de Ig" en "Materiales y
procedimientos") y se demostró para la inducción de
IL-10 por CPA, regulación por disminución de la
línea de células T específicas para INS\beta in vitro e
inducción de células productoras de IL-10 T in
vivo.
En la figura 5a, las DC esplénicas NOD
purificadas (5x10^{4} células/pocillo) se incubaron en cantidades
graduadas de Ig-INS\beta ag (círculos sólidos) o
Ig-INS\beta sol (círculos blancos) y la producción
de IL-10 se midió mediante ELISA 24 horas después.
Para la regulación por disminución de células T específicas para
INS\beta (figs. 5b-5d), las DC esplénicas NOD
purificadas (5x10^{4} células/pocillo) se incubaron con
cantidades graduadas de Ig-INS\beta ag (fig. 5b) o
Ig-INS\beta sol (fig. 5c) durante 1 h.
Posteriormente se añadió la línea de células T específicas para
INS\beta TCL-INS\beta-C1
(0,2x10^{5} células/pocillo) y la incubación continuó durante 24
h adicionales. Entonces se midió la producción de
IL-10 (diamantes sólidos) y IFN\gamma (diamantes
blancos) en los mismos pocillos de cultivo mediante ELISA a partir
de 100 \mul de sobrenadante de cultivo. Cada punto representa la
media de pocillos triplicados.
En la figura 5d, el ensayo se llevó a cabo en
ausencia (barras sólidas) o presencia (barras blancas) de 40
\mug/ml de anticuerpo anti-IL-10 o
control del isotipo, IgG de rata (barras rayadas) con tres
concentraciones diferentes de Ig-INS\beta ag.
Cada barra representa la media \pm DE de pocillos triplicados.
Los datos muestran que
Ig-INS\beta ag, que engloba el isotipo IgG2b
idéntico como el de las quimeras de Ig-mielina,
indujo la producción de IL-10 por DC (figura 5a).
Sin embargo, Ig-INS\beta sol no pudo provocar la
producción de IL-10 por las mismas DC, indicando que
la reticulación de Fc\gammaRs se requiere para la producción de
citoquinas. Además, IL-10, producida por las DC con
la presentación de Ig-INS\beta ag, mostró
funciones reguladoras por disminución en la activación de células T
específicas que cooperaron con las DC a través del péptido de
INS\beta. De hecho, cuando las células T específicas para
INS\beta se incubaron con DC y Ig-INS\beta ag,
la secreción de IFN\gamma por las células T disminuyó a medida que
aumentaba la producción de IL-10 por las DC (figura
5b). Tal regulación por disminución de IFN\gamma no se produjo
con Ig-INS\beta sol que no indujo la secreción de
IL-10 por las DC (figura 5c). La neutralización de
IL-10 durante la estimulación con
Ig-INS\beta ag restaura la producción de
IFN\gamma por las células T (figura 5d).
En conjunto, estos resultados indican que
Ig-INS\beta ag lleva tanto a la producción de
IL-10 como a la presentación de péptidos por CPA
que refuerzan la regulación por disminución de células T específicas
para INS\beta.
Ejemplo comparativo
6
Debido a que se ha definido que
IL-10 funciona como un factor de crecimiento para el
desarrollo de células T reguladoras (45, 46) productoras de
IL-10 (43, 47), se probó
Ig-INS\beta ag (que provoca la producción de
IL-10 por CPA) para la estimulación de células T
productoras de citoquinas no proliferativas in vivo. Por
consiguiente, las células esplénicas de ratones a los que se les
administró Ig-INS\beta ag en la semana 4, 5 y 6
se recogieron en la semana 12 y se probaron para la proliferación y
producción de citoquinas con la estimulación in vitro con
péptido de INS\beta. Las razones para probar las células en la
semana 12, en vez de 10 días después de completarse el tratamiento,
están relacionadas con el hecho de que Ig-INS\beta
se inyectó sin adyuvantes y la acumulación de células supresoras
puede necesitar un periodo de tiempo más largo. Además, se necesita
que la tolerancia de células T patogénicas esté avanzada para
minimizar respuestas residuales.
Un grupo de 5 ratones NOD hembra sin tratar
(barras grises, véase la figura 6), además de un grupo de 5 ratones
receptores de 300 \mug de Ig-INS\beta ag a la
semana 4, 5 y 6 de edad (barras negras, véase la figura 6), se
sacrificaron a las 12 semanas y se midieron sus respuestas
proliferativas esplénicas y a citoquinas. En la fig. 6(a),
los esplenocitos reunidos (1x10^{6} células/pocillo) de 5 ratones
se estimularon con 30 \mug/ml de péptido de INS\beta durante 72
h y la proliferación se evaluó como se describe en la sección
"Materiales y procedimientos". En las figuras 6(b) -
6(d), los esplenocitos reunidos se estimularon con péptido
de INS\beta durante 48 h y la producción de citoquinas se ensayó
mediante ELISA usando 100 \mul de sobrenadante. Cada barra
representa la media de pocillos triplicados.
Los resultados ilustrados en las figuras
6(a) - 6(d) indican que la proliferación se reduce en
ratones a los que se administró Ig-INS\beta
respecto a animales sin tratar y IFN\gamma ha empezado a disminuir
lo más probable debido a la regulación por disminución de células T
diabetogénicas. Además, se ha observado un aumento en la producción
de IL-10, acompañado por una secreción selectiva de
TGF\beta, en los ratones a los que se les administró
Ig-INS\beta ag respecto a los ratones sin tratar.
En conjunto, estos resultados indican que
Ig-INS\beta ag induce células T no proliferativas
específicas para antígeno productoras tanto de IL-10
como de TGF\beta.
\newpage
Ejemplo comparativo
7
Como Ig-INS\beta ag indujo
IL-10 por CPA y estimuló linfocitos T productores de
citoquinas supresoras, se esperaba que las quimeras fueran eficaces
contra la diabetes en ratones positivos para IAA. Sorprendentemente,
los resultados ilustrados en la figura 7 señalan un resultado
diferente.
A grupos de ratones NOD hembra (10 por grupo)
positivos para IAA entre la edad de 8 y 11 semanas se les administró
una inyección intraperitoneal de 100 \mug [fig. 7(a)], 200
\mug [fig. 7(b)] o 300 \mug [fig. 7(c)] de o
Ig-INS\beta ag (barras negras) o
Ig-HEL ag (barras rayadas) en la semana de
seroconversión. A todos los grupos se les administró una inyección
adicional de la misma cantidad 7 días después y los ratones en la
fig. 7(c) recibieron una tercera inyección en el día 14
después de la seroconversión. Un séptimo grupo no recibió ninguna
inyección (cero: barras blancas) y se incorporó en los tres paneles
para servir de control. Las figs. 7(a) - 7(c)
muestran la incidencia en porcentaje de diabetes en cada uno de los
grupos a la semana 19 y 26 de edad.
El testimonio con 2 dosis de 100 \mug de
Ig-INS\beta ag no retrasó la aparición de diabetes
temprana y, por consiguiente, no se observó una protección
prolongada contra la enfermedad. El aumento de la dosis hasta 200
\mug por inyección tampoco indujo un retraso significativo de la
aparición de diabetes temprana y la mayoría de los ratones
desarrollaron hiperglucemia a la semana 26 de edad. La inyección de
300 \mug de Ig-INS\beta ag una vez a la semana
durante 3 semanas consecutivas no retrasó significativamente la
aparición de diabetes temprana y, por tanto, no se produjo
protección a largo plazo contra la enfermedad.
Como se muestra en la fig. 8, las barras
representan el porcentaje de ratones NOD que permanecieron sin
diabetes temprana (19 semanas) con el tratamiento con o
Ig-INS\beta ag o Ig-INS\beta
sol. Estos porcentajes se generaron según la siguiente fórmula:
número de animales sin enfermedad en grupos tratados menos el número
de ratones sin enfermedad en el grupo sin tratar respecto al número
de animales diabéticos en el grupo sin tratar. Estos resultados se
generaron a partir de la comparación de los ratones receptores de 3
inyecciones de 300 \mug de Ig-INS\beta sol
(figura 4c) o Ig-INS\beta ag (figura 7c).
Estos resultados son similares a los obtenidos
con la Ig-HEL de control. En conjunto,
Ig-INS\beta agregada tenía un pequeño efecto en
el retraso de la aparición de diabetes temprana o retrasada. De
hecho, la comparación de las formas solubles y agregadas de
Ig-INS\beta para la supresión de diabetes después
de la seroconversión de IAA muestra claramente que
Ig-INS\beta sol retrasa significativamente la
aparición de diabetes temprana y el 60% de los ratones no tuvieron
la enfermedad en la semana 19 (figura 8). A diferencia, la forma
agregada de Ig-INS\beta, que introduce
IL-10 en el mecanismo, no tuvo efecto
estadísticamente significativo incluso en la supresión de diabetes
temprana.
Ejemplo comparativo
9
Se ha demostrado que IL-10
muestra efectos opuestos en la diabetes dependiendo del modo de
administración a las células diana (24-26).
Similarmente, las interacciones
IL-10-IL-10R
mostraron una regulación diferencial de la diabetes en animales
jóvenes frente a mayores (28). Debido a que
Ig-INS\beta ag induce la producción de
IL-10 por CPA, pero no suprime la diabetes en
animales positivos para IAA, mientras que
Ig-INS\beta sol, que no induce producción de
IL-10, retrasó la diabetes, se decidió investigar si
tal efecto diferencial en la diabetes se manifiesta cuando las
quimeras se administran en la etapa de preinsulitis.
Por consiguiente, a los ratones NOD se les
administró una inyección de 300 \mug de o
Ig-INS\beta ag o sol a la edad de 4 semanas y dos
inyecciones adicionales (300 \mug) a las semanas 5 y 6,
respectivamente, y los animales se controlaron para glucosa en
sangre semanalmente hasta la semana 26 de edad. A los grupos de
ratones NOD hembra (10 por grupo) se les administró una inyección
i.p. de una solución salina que contenía 300 \mug de
Ig-INS\beta sol o Ig-INS\beta ag
(barras negras) o Ig-HEL (barras rayadas) a las 4, 5
y 6 semanas de edad (figs. 9(a) - 9(b)). Para fines
de control se incluyó un quinto grupo que no recibió ninguna
inyección (cero: barras blancas). A continuación, los ratones se
controlaron para glucosa en sangre semanalmente hasta las 30
semanas de edad. La incidencia en porcentaje de diabetes se muestra
en cada uno de los cinco grupos a la semana 16, 20 y 26 de
edad.
Como puede verse en la figura 9,
Ig-INS\beta sol retrasó la aparición de diabetes y
ningún animal tuvo hiperglucemia a la semana 16 de edad. Tal
retraso persistió hasta la semana 20, pero la mayoría de los ratones
desarrollaron diabetes a la semana 26. No se observó tal retraso
con Ig-HEL sol, que indica que el efecto en la
diabetes mediante Ig-INS\beta es específico para
el antígeno. Sorprendentemente, sin embargo,
Ig-INS\beta ag retrasó la diabetes en todos los
ratones excepto 1 hasta la semana 20 y tal retraso permaneció
significativo a la semana 26, en la que sólo el 30 por ciento de
los ratones tuvieron alta la glucosa en sangre, mientras que el 80%
de los ratones sin tratar fueron diabéticos (figura 9b). Merece la
pena anotar que Ig-HEL que induce la producción de
IL-10 por CPA demostró un retraso significativo en
la diabetes hasta la semana 20, posiblemente debido a la supresión
presencial de IL-10 (figura 9b).
Estos resultados indican que
Ig-INS\beta ag es eficaz para retrasar la
aparición de diabetes cuando se administra en la etapa de
preinsulitis y sugieren que IL-10 muestra una
función reguladora por disminución en esta etapa.
Ejemplo comparativo
10
El papel de IL-10 inducidas por
Ig-INS\beta ag en la supresión de diabetes fue
evidente cuando los ratones IL-10^{-/-} no
retrasaron su aparición de diabetes con el tratamiento con
Ig-INS\beta ag, mientras que sí con
IL-10^{+/+}. A los grupos (10 ratones por grupo)
de ratones NOD de tipo salvaje hembra
(IL-10^{+/+}) y IL-10^{-/-} se
les administró i.p. 300 \mug de Ig-INS\beta ag
en la semana 4, 5 y 6 de edad y se controlaron para glucosa en
sangre semanalmente. Se muestra la incidencia en porcentaje de
diabetes en tanto ratones IL-10^{-/-} como
IL-10^{+/+} a la semana 12, 16 y 20 de edad
después de recibir las inyecciones de Ig-INS\beta
ag. Los resultados enfatizan la importancia de
IL-10 en la supresión de diabetes en la etapa de
preinsulitis (véase la figura 10).
Ejemplo comparativo
11
En ratones de 4 semanas, no ha tenido lugar la
infiltración en los islotes y la mayoría de las células T
diabetogénicas permanecen periféricas, mientras que en ratones
positivos para IAA, que habrían alcanzado la edad de 14 semanas
mediante finalización del tratamiento con
Ig-INS\beta, la insulitis habría avanzado y la
mayoría de las células T diabetogénicas habrían infiltrado los
islotes (4). Por tanto, la diferencia en el retraso de la diabetes
por Ig-INS\beta ag en ratones jóvenes frente a
positivos para IAA puede ser debido a una susceptibilidad variable
a IL-10 de células T de islotes frente a
periféricas.
Para probar esta premisa, células esplénicas y
de islotes de ratones de 14 semanas se estimularon con
Ig-INS\beta ag, que induce la producción de
IL-10 por las CPA presentadoras, y se midió la
secreción de IFN\gamma. Las células esplénicas (a) y de islotes
(b) (5x10^{5} células/pocillo) de ratones NOD hembra de 14 semanas
se estimularon con el antígeno indicado en presencia o ausencia de
1 ng de IL-10r durante 24 horas. El sobrenadante
(100 \mul/pocillo) se usó para medir IFN\gamma mediante ELISA
como se indica en "Materiales y procedimientos". El péptido de
INS\beta se usó a 18 \muM y las quimeras de
Ig-INS\beta ag y sol se usaron a concentración 1
\muM. Cada barra representa la media \pm DE de pocillos
triplicados para esplenocitos y pocillos duplicados para células de
islotes.
Como puede verse en la figura 11, las células
tanto T esplénicas como de islotes desarrollaron respuestas a
IFN\gamma con la estimulación con INS\beta o
Ig-INS\beta sol. Sin embargo, la estimulación con
Ig-INS\beta ag redujo la respuesta a IFN\gamma
por células T esplénicas, pero potenció significativamente la
respuesta a células T de islotes. Se observaron efectos similares
cuando las células se estimularon con Ig-INS\beta
sol o péptido de INS\beta en presencia de IL-10.
Estos resultados indican que las células T específicas para
INS\beta de islotes y periféricas muestran susceptibilidad
diferencial a IL-10.
Para todas las formulaciones en este documento,
las dosis múltiples pueden mezclarse proporcionalmente como se
conoce en la técnica.
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<213> desconocido
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<220>
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<223> la insulina se conserva entre las
diferentes especies
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<400> 1
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\sa{Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
Gly Glu Arg Gly}
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<210> 2
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<213> Gallus sp.
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\sa{Ala Met Lys Arg His Gly Leu Asp Asn Tyr Arg
Gly Tyr Ser Leu}
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<213> desconocido
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<220>
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<223> Ácido glutámico descarboxilasa se
conserva entre las diferentes especies
\newpage
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<400> 3
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\sa{Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Ile Lys
Ala Arg Met Met Glu}
\sac{Tyr Gly Thr Thr}
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<220>
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<223> Ácido glutámico descarboxilasa se
conserva entre las diferentes especies
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<400> 4
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\sa{Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu
Glu Tyr Val Thr}
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<210> 5
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> desconocido
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<223> la insulina se conserva entre las
diferentes especies
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<400> 5
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\sa{Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser Gly Asp
Met Tyr Cys Phe Asp}
\sac{Tyr Trp}
Claims (13)
1. Una composición para uso en el tratamiento de
la diabetes de tipo 1, comprendiendo la composición una cantidad
farmacéuticamente eficaz de una inmunoglobulina soluble que tiene al
menos una región CDR, en la que la inmunoglobulina puede unirse a
un receptor de Fc de una célula presentadora de antígeno, teniendo
la inmunoglobulina al menos un fragmento de proteína o péptido
insertado dentro de dicha al menos una región CDR, en la que el
fragmento de proteína o péptido se selecciona de INS\beta, GAD1,
GAD2 y GAD 65.
2. La composición de la reivindicación 1, en la
que la composición puede endocitarse por las células del receptor
de Fc y procesarse por dichas células para presentar el al menos un
fragmento de proteína o péptido a moléculas endógenas de MHC de
clase II, evitándose así la activación de células T diabetogénicas
específicas para el al menos un fragmento de proteína o
péptido.
3. La composición de la reivindicación 1, en la
que la inmunoglobulina comprende Ig-INS\beta
sol.
4. La composición de la reivindicación 1, en la
que la al menos una región CDR se selecciona de las regiones CDR1,
CDR2 y CDR3.
5. La composición de la reivindicación 1, en la
que la inmunoglobulina comprende IgG humana.
6. La composición de la reivindicación 1, que
comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. La composición de la reivindicación 6, en la
que la composición es adecuada para administración intravenosa.
8. Uso de una composición en la preparación de
un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 1,
comprendiendo la composición una cantidad farmacéuticamente eficaz
de una inmunoglobulina soluble de la misma que tiene al menos una
región CDR, en la que la inmunoglobulina puede unirse a un receptor
de Fc de una célula presentadora de antígeno, teniendo la
inmunoglobulina al menos un fragmento de proteína o péptido
insertado dentro de dicha al menos una región CDR, en la que el
fragmento de proteína o péptido se selecciona de INS\beta, GAD1,
GAD2 y GAD 65.
9. El uso según la reivindicación 8, en el que
la inmunoglobulina comprende Ig-INS\beta sol.
10. El uso según la reivindicación 8 ó 9, en el
que la al menos una región CDR se selecciona de las regiones CDR1,
CDR2 y CDR3.
11. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 8 - 10, en el que la inmunoglobulina comprende IgG
humana.
12. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 8 - 11, en el que la composición comprende además
un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 8 - 12, en el que la composición es adecuada para
administración intravenosa.
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