ES2301966T3 - Inhibicion del sistema ligando/receptor cd95 para el tratamiento de trastornos y lesiones neurologicos. - Google Patents
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Abstract
Uso de un inhibidor del ligando CD95 seleccionado de (a) un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo, (b) una molécula receptora de CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lesiones cerebrales o de la médula espinal, en donde dicho medicamento no comprende un inhibidor del ligando/receptor de TNF.
Description
Inhibición del sistema ligando/receptor CD95
para el tratamiento de trastornos y lesiones neurológicos.
La presente invención se refiere al uso de un
inhibidor del ligando CD95 seleccionado de un anticuerpo de ligando
inhibidor anti-CD95 o un fragmento de fijación de
antígeno del mismo y/o una molécula receptora CD95 soluble o una
porción de fijación de ligando CD95 de la misma para la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de trastornos o lesiones
neurológicos en un mamífero, particularmente para el tratamiento de
lesiones cerebrales o de la médula espinal, más particularmente
para el tratamiento de la paraplejia.
La muerte celular apoptótica contribuye al
deterioro secundario y disfunción neurológica subsiguientes a lesión
en la médula espinal (SCI) (1). Los inductores principales del
programa apoptótico en otros modelos neurodegenerativos, tales como
el derrame cerebral (2), son los sistemas ligando/receptor de TNF y
CD95. El receptor 1 del factor de necrosis tumoral
(TNF-R1, p55, CD120a) y CD95 (APO-1,
Fas), al igual que otros receptores de muerte, se caracterizan por
la presencia de un dominio de muerte que es crucial para la
transducción de la señal apoptótica (3). La ligación de receptores
por ligandos trimerizados conduce al reclutamiento de la proteína
adaptadora FADD (dominio de muerte asociado a Fas, MORT1; (4) y
caspasa-8 en un complejo de señalización inductor de
muerte (DISC) (5)). La caspasa-8 en el DISC se
activa por autoescisión (6), y somete la célula a la apoptosis por
activación de caspasas efectoras situadas aguas abajo.
La activación y escisión tanto de
caspasa-1 como de caspasa-3 fueron
detectadas en neuronas subsiguientemente a SCI, y su inhibición
reduce el tamaño post-traumático de la lesión (7).
Después de la SCI, la expresión de TNF, CD95 y CD95L se incrementa
en el sitio de lesión (8). Sin embargo, el papel del sistema
TNF-L/R en la SCI in vivo es controvertido.
Por una parte, la neutralización de TNF reducía significativamente
el número de células apoptóticas subsiguiente a la SCI (9). Por
otra parte, en ratones que carecen de TNF o TNF-R1
pudieron identificarse más células apoptóticas, las lesiones eran
mayores, y exhibían peor recuperación funcional que los ratones de
tipo salvaje (wt) (10). Se encontró expresión de CD95 en
astrocitos, oligodendrocitos, y microglía subsiguientes a SCI
cervical (11). Sin embargo, la implantación del sistema
CD95-L/R en SCI sigue pendiente de esclarecimiento,
aun cuando el documento WO 01/41803 sugiere el uso de combinaciones
de inhibidores de TNF\alpha y CD95L para la prevención o el
tratamiento de trastornos degenerativos, v.g. Alzheimer, Parkinson
y lesiones de la médula espinal.
El documento WO 99/14330 describe el polipéptido
DcR3, un homólogo de TNFR. El polipéptido DcR3 o una molécula
quimérica que comprende el polipéptido DcR3 es capaz de inhibir la
apoptosis inducida por CD95L en células de mamífero. Sin embargo,
no hay dato alguno que demuestre que una inhibición del sistema CD95
es beneficiosa para el tratamiento de la SCI.
WO 01/41803 A1 está dirigido al uso de una
combinación de inhibidores de TNF-\alpha e
inhibidores de CD95L para la prevención o el tratamiento de
trastornos neurodegenerativos.
WO 00/58466 A3 se refiere a análogos de FLINT
que son resistentes a la proteólisis in vivo e in
vitro en la posición del aminoácido 218 del FLINT mayor y a
usos clínicos y terapéuticos de los mismos.
Herr et al. (The EMBO Journal, vol. 16,
No. 20, 15 de octubre de 1997, páginas 6200-6208)
describen el uso de CD95L antisentido así como de FADD dominante
negativo para inhibición de las ceramidas y la apoptosis celular
inducida por estrés.
Pérez y White (The Journal of Cell Biology, vol.
141, no. 5, 1 de julio de 1998, páginas 1255-1266)
se refieren al papel del homólogo de adenovirus
Bcl-2 de E1B19K como inhibidor de la apoptosis
inducida entre otras cosas por FADD y
TNF-\alpha.
En Bradbury et al. (Nature, vol. 146, 11
de abril de 2002, páginas 636-640) se encontró que
la enzima condroitinasa ABC actúa como inhibidor de la formación de
escaras gliales y promueve la recuperación funcional después de
lesión en la médula espinal.
En (42), la expresión de CD95 en un modelo SCI
de rata se evalúa por inmunohistoquímica con un anticuerpo
monoclonal dirigido contra CD95. La inmunorreactividad con CD95 se
detecta en la materia blanca y la materia gris (en astrocitos,
oligodendrocitos y neuronas) hasta 2 semanas después de la lesión.
De acuerdo con los autores, la detección de células
CD95-positivas sugiere que el bloqueo del sistema
CD95 podría ser un enfoque terapéutico verosímil para la SCI.
Sin embargo, los datos contenidos en (42) no
llevan a la conclusión de que una inhibición del CD95 sea de hecho
beneficiosa para el tratamiento de la SCI. La expresión celular del
CD95 es necesaria pero no suficiente para la inducción de la
apoptosis en el sistema CD95. Por ejemplo, los astrocitos, uno de
los tipos de células que de acuerdo con (42) expresan CD95, no son
sensibles a la apoptosis mediada por CD95 (43). Así pues, la mera
detección de CD95 no permite llegar a la conclusión de que este
sistema esté implicado en la inducción de la muerte de estas
células. A tenor de estas líneas, la falta de expresión del receptor
TNF (10 y 44), que está implicado también en la apoptosis, no da
como resultado un mejor desenlace clínico subsiguiente a la SCI.
Por consiguiente, cualquier conclusión extraída respecto a la
eficacia de un tratamiento potencial contra SCI tiene que estar
respaldada por datos funcionales. Como resumen: (42) presenta
meramente datos descriptivos que no permiten llegar a la conclusión
de que el sistema CD95 esté implicado en el deterioro inducido por
SCI.
En la presente solicitud, se muestran por
primera vez datos funcionales que permiten llegar a la conclusión
de que la inhibición del sistema CD95 mejora significativamente el
desenlace clínico después de lesión de la médula espinal. Por
tanto, la presente solicitud es la primera descripción que hace
posible el tratamiento de SCI por inhibidores del sistema CD95.
Para abordar si el sistema CD95 y el sistema
TNF-ligando/receptor (L/R) están involucrados en el
deterioro inducido por SCI, se utilizó un modelo de SCI en
roedores. Después de transección dorsal de la médula espinal, la
expresión de CD95, CD95L y TNF aumentaba en el sitio de la lesión.
La monitorización terapéutica de CD95L solo o simultáneamente de
CD95L y TNF reducía la muerte celular apoptótica después de SCI. Y
como hecho más importante, los ratones tratados con anticuerpos
anti-CD95L, anticuerpos
anti-CD95L/anti-TNF o con proteínas
de fusión CD95-Fc eran capaces de iniciar
movimientos activos, lo que no sucedía en el caso de los ratones de
grupos de control o tratados con anti-TNF solo. La
mejora en la eficiencia locomotora en los animales carentes de
actividad de CD95L se reflejaba por un aumento en las fibras
regeneradoras en el sitio de la lesión y una regulación creciente
paralela de la proteína 43 asociada al crecimiento. Además, la
neutralización del sistema CD95L/R aumentaba la expresión de la
proteína básica mielina, un marcador indirecto de la viabilidad de
oligodendrocitos, y del marcador neuronal,
\betaIII-tubulina. Los autores de la presente
invención demuestran aquí por primera vez que la neutralización de
CD95L promueve la regeneración axonal en la médula espinal lesionada
de los adultos y la mejora funcional de los animales
lesionados.
Un primer aspecto de la invención se refiere al
uso de inhibidores del sistema CD95L/R para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de lesión cerebral o de la médula
espinal, v.g. lesiones cerebrales o lesiones parciales o completas
de la médula espinal, particularmente paraplejia en un mamífero,
v.g. en un paciente humano. Sorprendentemente, se encontró que
pueden tratarse con éxito lesiones de la médula espinal, v.g.
lesiones en individuos adultos. Adicionalmente, se ha encontrado que
la invención es particularmente útil para el tratamiento de
lesiones agudas. La lesión, particularmente la lesión de la médula
espinal, puede estar causada por un corte o una compresión, por una
condición isquémica o por otros medios. La administración de
inhibidores de CD95L/R conduce a una recuperación funcional que
comprende un crecimiento mejorado de los axones, particularmente un
crecimiento de neuronas, microglía y/u oligodendrocitos.
Indicaciones especialmente preferidas son la regeneración de la
eficiencia locomotora, la mejora de la estimulación y/o la
recuperación de la coordinación de movimientos después de lesión de
la médula espinal.
El inhibidor es un inhibidor del ligando CD95
(ligando Fas; ligando APO1) seleccionado de
- (a)
- un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo;
- (b)
- una molécula receptora de CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma.
Se prefieren anticuerpos inhibidores
anti-CD95L y fragmentos de fijación de antígeno de
los mismos y moléculas CD95R solubles o porciones de fijación de
CD95L de las mismas. Ejemplos de anticuerpos inhibidores
anti-CD95L adecuados se describen en los documentos
EP-A-0 842 948, WO 96/21350, (38),
WO 95/13293 o (39) así como anticuerpos quiméricos o humanizados
obtenidos a partir de los mismos, véase, v.g. WO 98/10070. Son
adicionalmente preferidas moléculas receptoras de CD95 solubles,
v.g. una molécula receptora CD95 soluble sin dominio transmembranal
como se describe en los documentos
EP-A-0 595 659 y
EP-A-0 965 637 o péptidos CD95R como
se describen en WO 99/65935.
Es especialmente preferido un inhibidor de CD95L
que comprende un dominio extracelular de la molécula CD95R
(particularmente los aminoácidos 1 a 172 (MLG ... SRS) o la
secuencia CD95 madura de acuerdo con la patente U.S. 5.891.434)
fusionada opcionalmente a un dominio de polipéptido heterólogo,
particularmente una molécula de inmunoglobulina Fc que incluye la
región bisagra v.g. de la molécula IgG1 humana. Una proteína de
fusión particularmente preferida que comprende un dominio CD95
extracelular y un dominio Fc humano se describe en WO 95/27735.
El inhibidor del ligando Fas FLINT o DcR3 o un
fragmento, v.g. fragmento soluble del mismo, por ejemplo el dominio
extracelular fusionado opcionalmente a un polipéptido heterólogo,
particularmente una molécula de inmunoglobulina Fc se describe en
WO 99/14330, WO 99/50413 o (41). FLINT y DcR3 son proteínas que son
capaces de fijar el ligando CD95 y LIGHT, otro miembro de la
familia TNF.
Adicionalmente, se contempla como inhibidor una
molécula efectora de ácido nucleico. La molécula efectora de ácido
nucleico puede seleccionarse de moléculas antisentido, moléculas
RNAi y ribozimas que son capaces de inhibir la expresión del gen
CD95R y/o CD95L.
Adicionalmente, se contempla un inhibidor que
puede estar dirigido contra la transducción de señales CD95R
intracelulares. Ejemplos de tales inhibidores se describen en WO
95/27735, v.g. un inhibidor de la enzima convertidora de
interleuquina 1\beta (ICE), particularmente
3,4-dicloroisocumarina, YVAD-CHO, un
tetrapéptido específico de ICE, CrmA o usurpina (WO 00/03023).
Adicionalmente, pueden utilizarse moléculas efectoras de ácido
nucleico dirigidas contra ICE.
El inhibidor o una combinación de los
inhibidores anteriores se administra a un individuo que se encuentra
en necesidad de ello, particularmente un paciente humano, en una
dosis suficiente para el tratamiento de la afección específica por
medios adecuados. Por ejemplo, el inhibidor puede formularse como
una composición farmacéutica junto con vehículos, diluyentes y/o
adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La eficacia terapéutica y
la toxicidad pueden determinarse de acuerdo con protocolos estándar.
La composición farmacéutica puede administrarse sistémicamente,
v.g. por vías intraperitoneal, intravenosa, o local, v.g. por vía
intratecal o por punción lumbar. Se prefiere una administración
intratecal.
La composición farmacéutica se administra
preferiblemente en el caso de lesiones agudas. Alternativamente, la
invención abarca un tratamiento de lesiones no agudas, en el cual se
introduce una nueva lesión, v.g. por una incisión o un corte y el
deterioro recién introducido se somete a un tratamiento con
inhibidor CD95 RL. Más preferiblemente, el tratamiento se inicia lo
más pronto posible, v.g. inmediatamente después de la producción de
la lesión de la médula espinal, y se continúa durante un tiempo
suficiente, v.g. hasta 30 días. La composición puede administrarse
una sola vez o varias veces, v.g. una sola vez al día, varias veces
al día, en días alternos, etc.
En algunas realizaciones de la presente
invención, el medicamento puede comprender un ingrediente activo
adicional. El ingrediente activo adicional puede seleccionarse de
inhibidores de la apoptosis, particularmente inhibidores de la
apoptosis intracelular, v.g. inhibidores de las caspasas tales como
inhibidores de la caspasa 3 o la caspasa 8, inhibidores Bid,
inhibidores Bax o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de
inhibidores adecuados son los inhibidores de las caspasas en
general, véanse los documentos WO 02/094263, WO 01/10383, WO
01/42216, WO 01/90070, WO 01/94351, WO 01/21600, WO 00/61542, WO
99/47545, inhibidores dipeptídicos (WO 99/47154), inhibidores de
carbamatos (WO 01/72707), acetales de ácido aspártico sustituidos
(WO 01/81330), heterociclildicarbamidas (WO 02/085899), derivados
de quinolina-(di-, tri-, tetrapéptido) (US 200126467), inhibidores
de la 2-aminobenzamida-caspasa
sustituidos (WO 00/55114), inhibidores de la
\alpha-hidroxiácido-caspasa
sustituidos (WO 01/16093); inhibición por nitrosilación (WO
98/43621); CASP-1: (WO 02/000853;
CASP-3: inhibidores de proteínas (WO 02/066050),
moléculas antisentido (WO 01/53310),
nicotinil-aspartil-cetonas (WO
01/27085), derivados de dipéptidos de
\gamma-cetoácidos (WO 02/48179, WO 00/32620, WO
00/55127), CASP-8: moléculas antisentido (WO
01/53541), proteínas interactivas (WO 00/39160)
CASP-9: moduladores antisentido (WO 02/22641);
CASP2: moléculas antisentido (WO 02/24720); CASP-6:
moléculas antisentido (WO 02/29066); CASP-7:
moléculas antisentido (WO 02/22640); inhibidores de
CASP-12: WO 00/59924. Ejemplos adicionales son
inhibidores mitocondriales tales como el factor modulador
BcI-2 (WO 02/097094); péptidos mutantes de
BcI-2 (WO 94/27426) derivados de Bad (WO 02/20568),
Bad (WO 96/13614), agonista de muerte del dominio interactivo BH3
(WO 98/09980), proteínas inhibidoras Bax (WO 98/40397), genes y
productos génicos BLK (WO 99/50414). Otros moduladores
intracelulares adecuados de apoptosis son moduladores de asociación
CASP9/Apaf-1 (WO 02/064128), moduladores antisentido
de la expresión de Apaf-1 (WO 02/32921), péptidos
para inhibición de la apoptosis (WO 99/43701), composiciones
anti-apoptóticas que comprenden la subunidad R1 del
virus del Herpes Símplex (WO 00/07618), MEKK1 y fragmentos de la
misma (WO 99/41385), moduladores de Survivin (WO 01/64741),
moduladores de inhibidores de apoptosis (WO 97/06182, WO 00/77201,
WO 01/59108, WO 02/053586) y HIAP2 (WO 00/08144). Adicionalmente,
puede utilizarse cualquier combinación de los inhibidores
anteriores.
El ingrediente adicional puede seleccionarse
también de inhibidores de sistemas receptores de ligandos de muerte
(distintos de CD95 L/R) tales como el sistema
TRAIL-L/TRAIL-R (véase el documento
WO 98/35986), el sistema
TRAMP-R/TRAMP-R o el sistema
DR6-L/R6-R (véanse los documentos
US-A-6.423.494 o WO 01/85209). Los
inhibidores adecuados son anticuerpos de ligandos o receptores
inhibidores anti-muerte o fragmentos de fijación de
antígeno de los mismos o moléculas solubles receptoras de muerte o
porciones de fijación de ligandos de muerte de las mismas, v.g.
fusiones con dominios Fc de inmunoglobulina.
Una administración combinada de inhibidores
CD95L/R e inhibidores TNF L/R se describe por ejemplo en el
documento WO 01/41803.
Preferiblemente, el inhibidor CD95L/R se
administra sin inhibidor TNF L/R. De este modo, puede reducirse o
eliminarse la aparición de efectos secundarios potencialmente
perjudiciales, dado que una inhibición de TNF causaba de hecho
complicaciones graves en varios modelos de ratón, v.g. ligación
fecal y punción (40).
Ejemplos adicionales de otros ingredientes
activos son compuestos que inhiben la formación de escaras gliales,
tales como la condroitinasa ABC.
La dosis del inhibidor administrada dependerá
por supuesto del individuo a tratar, del peso del individuo, el
tipo y la gravedad de la lesión, el modo de administración y el
criterio del médico que prescribe el tratamiento. Para la
administración de anticuerpos anti-CD95R o L o
proteínas CD95R solubles, v.g. proteínas de fusión
CD95-Fc, es adecuada una dosis diaria de 0,001 a 100
mg/kg.
La presente invención se ilustra adicionalmente
por las Figuras y Ejemplos siguientes.
\newpage
Fig.
1
(A) Se evaluó la muerte celular apoptótica por
tinción TUNEL en animales operados falsamente y al cabo de 1, 3 y
14 días después de SCI torácica en animales C57BL/6 de tipo salvaje
(wt)(n = 4 por grupo). (B) Recuentos de células
CD95L-positivas; (C) recuentos de células
CD95-positivas; (D) número de células
TNF-positivas. Las células se sometieron a recuento
en tres secciones de médula espinal de 20 \mum de espesor
separadas a una distancia de 200 \mum unas de otras en animales
operados falsamente y 1, 3 y 14 días después de la SCI (n = 4
ratones por grupo). (E) Los animales de tipo salvaje
(wt)sometidos a SCI se trataron por vía intraperitoneal con
anti-CD95L, anti-TNF, o
anti-CD95L/anti-TNF o con solución
salina o IgG como control (n = 4 por grupo). Después de un tiempo
de supervivencia de 3 días, las células apoptóticas se tiñeron por
TUNEL y se sometieron a recuento en tres secciones de 20 \mum
separadas 200 \mum unas de otras. Los datos se presentan como
valor medio \pm el error estándar del valor medio. La
significación se determinó por comparación del número de células
apoptóticas en los animales tratados con anticuerpos con los grupos
de control, utilizando el Ensayo de Sumas de Rangos Wilcoxon
(**p \leq 0,01).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
2
Los animales se trataron con anticuerpos
anti-CD95L (círculos negros) o
anti-CD95L/anti-TNF (rombos
blancos), o con solución salina (triángulos negros) o IgG
(cuadrados blancos) como control (n = 11 por grupo). En una segunda
serie de experimentos, se trataron los animales con anticuerpo
anti-TNF (hexágonos blancos) o solución salina
(triángulos negros) como control. Todos los ensayos
conductuales se realizaron en la modalidad doble ciego. Los
animales se ensayaron al cabo de 1, 2, 3 y 4 semanas después de la
lesión en las tareas siguientes: (A) BBB (para esto, los animales
se ensayaron adicionalmente el día 1 después de la SCI); (B)
andadura sobre rejilla; (C) eficiencia de natación; (D) tiempo de
mantenimiento sobre la barra rotativa; (E) reacción a la
estimulación mecánica por "pelos de von Frey". Para
todas las tareas ensayadas, no se producía diferencia significativa
alguna entre los dos grupos de control, ni entre los dos grupos
tratados en cualquiera de los momentos estudiados. Los datos se
presentan como valor medio \pm el error estándar del valor medio.
Únicamente se muestran en los gráficos valores p de
comparación de los grupos tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF con el grupo de
solución salina; los valores p de comparación de los grupos
tratados con el grupo de IgG se dan en la Fig. S1; (* p
\leq 0,05; ** p \leq 0,01, Ensayo de Suma de Rangos
de
Wilcoxon).
Wilcoxon).
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
3
Se inyectó
biotina-dextrano-amina (BDA) en la
corteza sensorial-motora (coordenadas:
Bregma-1.5; 1; 1) de los animales tratados con
anti-CD95L,
anti-CD95L/anti-TNF, solución
salina, e IgG, dos semanas después de la SCI (n =
4-5 por grupo). (A) A las cuatro semanas después de
la lesión, se determinó la distancia desde el epicentro de la
lesión a las fibras en regeneración que se extendían más en
dirección caudal en tres secciones consecutivas de la médula
espinal. Las fibras marcadas anterógradamente se retraen del sitio
de la lesión en los animales tratados con solución salina e IgG en
250 \pm 11,5 \mum. La distancia media al epicentro de la lesión
en los animales tratados con anticuerpos es notablemente menor (95
\pm 62 \mum). (B) Ejemplos de fibras corticoespinales marcadas
con BDA en representantes de cada grupo. El epicentro de la lesión
se indica por una línea vertical. La CST se retrae del sitio de la
lesión en los animales de control tratados con solución salina e
IgG (paneles superiores), mientras que numerosas fibras
ectópicas que brotan del CST transseccionado crecen en la materia
blanca dorsal y la escara de lesión en los animales tratados con
anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF (paneles
inferiores). (C) Una mayor ampliación de las regiones de marco
muestra producción regenerativa de brotes y botones sinápticos
rostrales respecto al sitio de la lesión en los animales tratados
con anti-CD95L/anti-TNF (recuadro
derecho), o la ausencia de brotes regenerativos en la región
correspondiente en los animales tratados con solución salina
(recuadro izquierdo). Barra de escala, 20 \mum; regiones de
marco,
10 \mum.
10 \mum.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
4
Se sometieron los animales a SCI y se trataron
con anti-CD95L solo o junto con anticuerpo
anti-TNF, o con solución salina o IgG como control.
Después de un tiempo de supervivencia de 4 semanas, se detectaron
las proteínas indicadas por análisis de transferencia Western (n =
3 por grupo). Se utilizó actina como control para carga igual de
proteínas (20 \mug) en cada pista. (A) Análisis de los niveles de
expresión de marcadores neuronales en los animales tratados con
anticuerpo y control, representados como las bandas específicas de
50 kDa para las proteínas \betaIII-tubulina,
Tau-5 y Tau-1; (B) banda de 22 kDa
para MBP; (C) banda de 50 kDa para GFAP; (D) banda de 43 kDa para
GAP-43. S.O. = operado falsamente; E15 = día 15 del
embrión.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
5
Se muestran los valores p de comparación
de los grupos tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF con el grupo
IgG para cada ensayo (Ensayo de Suma de Rangos Wilcoxon); * p
\leq 0,05; ** p \leq 0,01 para todos los ensayos,
NS - no significativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig.
6
Los animales se trataron con CD95Fc (triángulos
negros) o con solución salina (cuadrados negros) como control. Los
animales se ensayaron al cabo de una, dos, tres y cuatro semanas
después de la lesión en la tarea BBB.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla
1
Se evaluó el comportamiento de natación de los
animales registrando las características siguientes: movimientos de
los miembros posteriores, coordinación miembro
posterior-miembro anterior, posición de la cola,
posición de las zarpas, equilibrio sagital y coronal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una lesión en la médula espinal en
ratones hembra de tipo salvaje (wt) sobre un entorno de
C57BL/6, emparejados todos ellos en edad (valor medio 75 días) y
peso (valor medio 24 g). Se realizó una anestesia profunda por
inyección i.p. de Ketamina y Rompun (150 mg/kg de peso corporal cada
uno). Se efectuó laminectomía al nivel vertebral Th8/9 con objeto
de dejar al descubierto la médula espinal. Se lesionó la médula
espinal dorsal simétricamente con tijeras finas de iridectomía
(FST, Heidelberg), dando como resultado un corte de dos tercios que
dejaba únicamente intactas las fibras en el funículo ventral.
Después de la suturación de los músculos y la piel por separado, se
dejó que los ratones se recuperaran en el bloque de calentamiento
(37ºC) antes de devolverlos a las jaulas.
Los animales se trataron
post-operativamente con antibióticos (Gentamicina, 5
ml/kg a 0,2 mg/ml) una sola vez al día durante 7 días. Todos los
ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y
recibieron agua y comida a discreción. Sus vejigas se exprimieron
manualmente una vez al día hasta restablecimiento de la función
autónoma de la vejiga.
Los animales se sometieron a SCI, y después de
tiempos de supervivencia diferentes (1, 3, y 14 días) se
anestesiaron profundamente y se sacrificaron por perfusión
intracardial.
Para el tratamiento con anticuerpos, se
utilizaron o bien el anticuerpo anti-CD95L (MFL3;
Pharmingen, Alemania) solo, o junto con anticuerpo
anti-TNF V1q (32) 50 \mug de cada uno. Los
anticuerpos se inyectaron por vía intraperitoneal 30 minutos
después de la lesión y cada día durante hasta 3 días (tiempo de
supervivencia 3 días, n = 4 por grupo) o 2 h antes de la
lesión dos veces por semana hasta 4 semanas (tiempo de supervivencia
4 semanas, n = 11 por grupo), en la modalidad doble ciego.
Adicionalmente, se inyectaron ratones con solución salina e IgG de
rata (Sigma) con control. En una segunda serie de experimentos, los
ratones se trataron por vía intraperitoneal con anticuerpo
anti-TNF solo o solución salina como control.
Después de tiempos de supervivencia de 3 días o 4 semanas, los
ratones se anestesiaron profundamente y se sacrificaron por
perfusión intracardial o decapitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procesaron secciones criostáticas
longitudinales de la médula espinal (20 \mum) de acuerdo con la
técnica de marcación del extremo de la mella con UTP biotinilado
mediado por desoxinucleotidil-transferasa terminal
(TdT) (TUNEL) (33). Los núcleos se despojaron de proteínas por
incubación en PBS con 1% Triton X-100 a 4ºC durante
una noche. Se desactivó la peroxidasa endógena por recubrimiento de
las secciones con H_{2}O_{2} al 2% durante 5 min a la
temperatura ambiente. Las secciones se incubaron con dUTP
biotinilado 0,35 mM, 10 unidades de tampón TdT, CoCl_{2} 2 mM,
dATP 1 mM (Roche, Suiza), en una cámara de humedad a 37ºC durante
60 min. La reacción se terminó por transferencia de los portaobjetos
a tampón Tris-EDTA a la temperatura ambiente
durante 15 min. Las secciones se procesaron ulteriormente utilizando
el complejo avidina-biotina (ABC) (Vector
Laboratories) e incubación subsiguiente con
diamino-bencidina (DAB, Sigma). Los núcleos
normales, que contenían solamente una cantidad insignificante de
extremos 3'-OH de DNA, no se teñían con esta
técnica. Las células con morfología necrótica y concentraciones
detectables de extremos DNA exhibían una marcación más difusa
comparadas con los núcleos apoptóticos. Como control, se incubaron
secciones en ausencia de la enzima o del nucleótido. Las células
apoptóticas se sometieron a recuento en tres secciones consecutivas
separadas 200 \mum unas de otras en 4 ratones/grupo por una
persona ciega respecto al tratamiento. Todos los datos se
proporcionan como valor medio \pm el error estándar del valor
medio. La significación se midió utilizando el ensayo Wilcoxon.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procesaron secciones criostáticas
longitudinales de la médula espinal (20 \mum) de ratones sin
tratar para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Después de un
tiempo de supervivencia de 1, 3 ó 14 días, las secciones se
incubaron con anticuerpos primarios contra CD95L, CD95 (M20, Santa
Cruz) y TNF-\alpha (Sigma). La inmunorreactividad
de las proteínas CD95L, CD95 y TNF-\alpha se
visualizó por diaminobenzidina (Alexis, Alemania). Únicamente era
detectable CD95 en las médulas espinales de los animales operados
falsamente, si bien todas ellas eran detectables en el timo de los
ratones y en secciones de tumores transfectados con CD95L murina.
Ninguna de estas tres proteínas podía detectarse en las tinciones de
control realizadas sin el primer anticuerpo o la IgG isotipo de
control. Se realizó una inmunofluorescencia doble con anticuerpos
primarios previos, y el marcador neuronal (NeuN, Chemicon),
linfocítico (CD3, Chemicon), de astrocitos (GFAP, Chemicon), de
oligodendrocitos (marcador oligodendrocítico, Chemicon), y
microglial (CD11b, Serotec). Las inmunorreactividades se
visualizaron con un anticuerpo secundario mono- o policlonal marcado
con Cy3 y FITC (Dianova, Hamburgo, Alemania). Para ensayar la
distribución del anticuerpo MFL3 en la médula espinal, se utilizó
anticuerpo MFL3 biotinilado (Pharmingen, Alemania). El anticuerpo
se inyectó por vía intraperitoneal 2 horas antes de la SCI, y
después de tiempos de supervivencia de 3, 6 ó 24 h, se procesaron
las secciones longitudinales de la médula espinal en cuanto a
tinción con estreptavidina-rodamina (Dianova,
Alemania).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos semanas después de la lesión de la médula
espinal, algunos de los animales (n = 5 por grupo) se anestesiaron
profundamente y se colocaron en el bastidor estereotáctico. Se
practicó una incisión en el cuero cabelludo y se taladraron
orificios en la corteza sensorimotora. Se realizaron inyecciones a
presión de 1 \mul de una solución al 10% de dextrano
biotinilado-amina (BDA, Molecular Probes, Eugene,
OR) en solución salina, bilateralmente en la corteza sensorimotora
(coordenadas: Bregma-1,5; 1; 1). Dos semanas después
de la inyección, se procesaron secciones flotantes libres de la
médula espinal (50 \mum) respecto a tinción con BDA, como se ha
descrito previamente (34). El único punto de referencia claro en el
sitio de lesión era el epicentro de la lesión. Por esta razón, se
cuantificó la distancia desde el brote más próximo a la cola
respecto al epicentro de la lesión (Scion Image, Scion. comp). La
distancia más allá del epicentro de la lesión se registró como
distancia positiva, y en caso contrario como distancia negativa.
\vskip1.000000\baselineskip
El tejido de la médula espinal del sitio de la
lesión (1 mm tanto rostral como caudal respecto a la lesión) de 3
animales por grupo se lisó en tampón RIPA (NaCl 150 mM, EDTA 1 mM,
desoxicolato de sodio 0,5%; NP-40 1%,
Tris-HCl 50 mM de pH 7,4, complementado con los
inhibidores de proteasas PMSF 1 mM, aprotinina, leupeptina y
pepstatina 1 \mug/ml de cada una), y se trataron por ultrasonidos.
Se utilizaron los anticuerpos monoclonales siguientes:
anti-tubulina de ratón (1:2000, Chemicon), tau
Ab-2 de ratón (clon TAU-5, 1:2500,
Neomarkers), anti-tau-1 de ratón
(1:2500, Chemicon), proteína básica anti-mielina de
rata (MBP, 1:8000, Chemicon), proteína ácida fibrilar
anti-glial de ratón (GFAP, 1:2500, Chemicon), y
proteína-43 asociada a
anti-crecimiento de ratón (GAP-43,
1:2500, Sigma). Los anticuerpos fijados se detectaron con conjugado
de peroxidasa de rábano picante anti-ratón o
anti-rata (1:5000, Amersham) y quimioluminiscencia
incrementada (Nalgene). El tejido de los animales individuales se
analizó por separado. Para el tratamiento con fosfatasa alcalina, se
incubaron los lisados de proteínas con Tris 50 mM de pH 8,5, EDTA
0,1 mM y el inhibidor de proteasas 3 h a 37ºC, añadiéndose después
0,25 U de fosfatasa alcalina/\mug de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Los hipocampos de ratones E15 se diseccionaron,
tripsinizaron y disociaron físicamente. Las células se lavaron
luego en HBSS, y se extendieron 300.000 células sobre cubreobjetos
de vidrio con poli-L-lisina (PLL) en
cápsulas de Petri de 6 cm que contenían medio esencial mínimo (MEM)
y 10% de suero de caballo desactivado. Las células se mantuvieron
en 5% de CO_{2} a 36,5ºC durante 4 h. Los cubreobjetos se
transfirieron luego al MEM que contenía suplemento
B-27 y N2. Después de 8 días in vitro (DIV),
se sometieron las neuronas cultivadas del hipocampo a axotomía
(Laser Palm), y se trataron inmediatamente con 10 \mug/ml de
anti-CD95L, o 10 \mug/ml de IgG durante 24 h, o
se dejaron sin tratar.
Las células se fijaron luego en PFA al 4% en
PBS, se lavaron, y se tiñeron con anticuerpo GAP-43
(GAP-43, 1:250, Sigma). La inmunorreactividad se
visualizó con un anticuerpo secundario monoclonal marcado con
rodamina (Dianova, Hamburgo, Alemania). Con objeto de visualizar
los núcleos apoptóticos, se añadió DAPI (1:1000, Sigma) al
anticuerpo secundario.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los ensayos conductuales se realizaron en
la modalidad doble ciego. Los animales se ensayaron al cabo de 1,
2, 3 y 4 semanas después de la lesión. Para el registro de BBB, los
animales se ensayaron adicionalmente el día uno después de la SCI.
Los animales se monitorizaron con videocámara mientras se ensayaban,
y su eficiencia se evaluó a partir de vídeos digitalizados a una
velocidad de un cuarto.
Se evaluó la eficiencia locomotora global de los
animales utilizando la escala de evaluación locomotora BBB con
ligeras modificaciones (35). Los ratones se pusieron sobre una pista
de plexiglás de 1 m de longitud y 6 cm de anchura. Se dispuso la
pista encima de un espejo inclinado (ángulo de 60º), a fin de
facilitar la observación de los movimientos de los miembros
posteriores. Cada animal tenía que cruzar la pista 3 veces. En cada
sesión de ensayo, se asignaron puntos a los animales
independientemente por dos observadores ciegos respecto al
tratamiento. La locomoción del miembro posterior se registró desde 0
(para ausencia total de movimiento observable del miembro
posterior) hasta 21 puntos. La escala se modificó si la secuencia de
recuperación de las características motoras no era la misma que se
describe en el registro original. Dado que los ratones levantan sus
colas al principio de su recuperación (ya para el registro de 10
puntos), se asignaron 0,5 puntos adicionales para la posición de la
cola.
Se examinaron los déficits en el control motor
descendente por evaluación de la capacidad para navegar a través de
una pista de 1 m de longitud con lagunas asignadas irregularmente
(0,5-2 cm) entre barras metálicas redondas (36). Se
eligió para el análisis un sector definido de 10 barras. A fin de
impedir la habituación a una distancia de barras fija, las barras
de este sector se cambiaron para cada sesión de ensayo. Cada animal
tenía que cruzar este sector tres veces. El análisis se realizó por
recuento del número de errores en la colocación de los pies; si el
animal no tenía soporte del peso en los miembros posteriores, el
mismo cometería dos errores por barra, dando como resultado un
total de 20 errores.
Con objeto de obtener información acerca de la
eficiencia locomotora en ausencia del aportación cutánea y
propioceptiva de los miembros a la médula espinal, se utilizó un
ensayo de natación. Se dejaron nadar los ratones en un tanque de 1
m de longitud y 6 cm de anchura en cuyo extremo los mismos podían
salir del agua trepando a una isla (con pendiente de 45º o 60º). El
tiempo utilizado para la natación y el trepado no reflejaba el
grado de eficiencia de los animales, dado que el mismo se veía muy
influenciado por la motivación de los animales para cruzar el
tanque, que no podía normalizarse por entrenamiento u ofrecimiento
de una recompensa al final de cada realización. Por esta razón, se
evaluó la eficiencia de natación por registro de las características
siguientes: movimientos de las extremidades posteriores,
coordinación miembro posterior-miembro anterior,
posición de la cola, posición de la zarpa, y equilibrio sagital y
coronal. Cada animal tenía de cruzar el tanque dos veces y se le
asignaron puntos en cada sesión de
prueba.
prueba.
Para ensayar un aprendizaje de coordinación y
destreza motora, se realizó el ensayo Rotarod. Los animales se
pusieron sobre un cilindro de plástico (5 cm de diámetro, 10 cm de
longitud y 40 cm por encima del suelo), que se aceleraba durante 20
s (desde 4 a 7 rpm). Se registró el tiempo de mantenimiento durante
hasta 180 s, en tres pruebas para cada animal.
\newpage
Para evaluar el comportamiento nociceptivo de
los animales, se realizó un ensayo de "pelos de von Frey" para
alodinia mecánica. Los animales se introdujeron en un cilindro
metálico con orificios redondos a fin de introducir "pelos de von
Frey". Se ensayaron los ratones en cuanto a respuestas a la
estimulación mecánica con "pelos de von Frey" (Stoelting,
tamaños 2,36 (0,023 g), 2,44 (0,028 g) y 2,83 (0,068 g)) en
dermátomos adyacentes a la lesión. Las respuestas alodínicas se
registraron de 0 a 3 en modalidad doble ciega y se determinaron los
valores medios para cada momento del ensayo. El registro se realizó
como sigue: 0 - ausencia de respuesta; 1 - flexión transitoria; 2 -
sacudida; 3 - escape.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron las diferencias en los números de
células por el Ensayo de Suma de Rangos Wilcoxon. Los valores
resultantes de las diferentes tareas de los dos grupos de
tratamientos y los dos de control se compararon estadísticamente
unos contra otros en cada momento utilizando el ensayo de Suma de
Rangos Wilcoxon (Mann-Whitney U). La evolución de
estos valores resultantes se describió por separado en cada grupo
para las tareas BBB, de barra giratoria y andadura sobre rejilla,
por la pendiente de la regresión lineal del valor resultante frente
al tiempo. Se utilizó un ensayo F para comparar las pendientes de
los diferentes grupos. Los animales que no exhibían mejora alguna
tuvieron que excluirse en esta regresión paramétrica. Para incluir
todos los animales, se utilizó el procedimiento no paramétrico de
Koziol (37) a fin de comparar las series completas de curvas de
evolución entre los grupos. Se utilizó el coeficiente de correlación
de Pearson para describir la dependencia entre el valor resultante
de las diferentes tareas (registro BBB, registro de natación y
ensayo de andadura sobre rejilla) y la distancia al epicentro de la
lesión, junto con un ensayo estadístico respecto a la presencia de
una correlación distinta de cero. Se evaluó la significación
estadística al nivel de 0,05 y se registró por el valor p de los
procedimientos estadísticos de ensayo. Todos los análisis se
realizaron con el paquete de programas ADAM de la Unidad de
Bioestadística del Centro de Investigación del Cáncer de
Alemania.
Alemania.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transeccionaron los dos tercios dorsales de
la médula espinal en ratones wt y se examinaron el alcance y
la cinética temporal de muerte celular apoptótica. Se detectaron
células muertas, como se evaluó por tinción TUNEL, en el sitio de
lesión ya el día 1 después de la SCI, alcanzando niveles máximos al
cabo de tres días para ser apenas detectables a las dos semanas
(Fig. 1A). Es importante que la cinética de expresión de CD95L era
paralela a la muerte celular apoptótica (Fig. 1B). CD95 era ya
detectable en la médula espinal no lesionada, pero se encontraron
células CD95-positivas adicionales después de la SCI
(Fig. 1C). La expresión de TNF aumentaba el día 1, alcanzaba un
máximo el día 3 y se mantenía inalterada al cabo de dos semanas
(Fig. 1D). Para analizar minuciosamente la contribución de los
sistemas de CD95 y TNF-L/R a la muerte inducida por
SCI, los autores neutralizaron la actividad de CD95L y/o TNF. La
penetración tisular de los anticuerpos neutralizantes se confirmó
por la detección de un anticuerpo biotinilado en la médula espinal
lesionada ya al cabo de 3 h, y a las 6 h y 24 h después de
inyección i.p. (datos no presentados). Después de ello, se
inyectaron por vía i.p. los anticuerpos anti-CD95L
y/o anti-TNF (50 \mug de cada uno) en modalidad
doble ciega. Adicionalmente, se inyectaron los ratones con solución
salina e IgG de rata (50 \mug) como control. Después de un tiempo
de supervivencia de 3 días, se detectaron numerosas células
TUNEL-positivas en el sitio de lesión de los
animales tratados con solución salina e IgG (Fig. 1E). La
neutralización aguda de TNF no reducía significativamente la muerte
celular (Fig. 1E). Es importante que la neutralización de CD95L
solo o junto con TNF, reducía significativamente el número de
células TUNEL-positivas (Fig. 1E).
Para investigar las consecuencias a largo plazo
de la neutralización de CD95L y TNF, se ensayaron la eficiencia
locomotora y la reacción frente a la estimulación mecánica de los
ratones lesionados. Para esto, se trataron los animales con
anticuerpos neutralizantes contra CD95L solo o junto con TNF, o con
solución salina o IgG de rata dos veces por semana hasta 4 semanas
(n = 11 por grupo). Todos los ensayos conductuales se realizaron en
modalidad doble ciega. Los animales se evaluaron antes, y un día
después (solamente para el ensayo locomotor BBB), 1, 2, 3 y 4
semanas después de la lesión. Para todas las tareas ensayadas no se
encontró diferencia significativa alguna entre los dos grupos de
control, o entre los dos grupos tratados, para ninguno de los
momentos puntuales estudiados (Suma de Rangos Wilcoxon).
Primeramente, se cuantificaron aspectos
múltiples de locomoción espontánea sobre el suelo por el registro
locomotor BBB (12). Un día después de la lesión, todos los animales
estaban completamente parapléjicos y tenían registro BBB 0 (excepto
dos animales que alcanzaban registro 3; Fig. 2A). Los animales en
los grupos de control exhibían una recuperación nula o sólo
insignificante de movimientos activos a lo largo del periodo de
tiempo estudiado (ensayo Koziol). Es muy notable que la evolución
clínica y la eficiencia locomotora en cada momento puntual ensayado
en los ratones en los que se bloquearon CD95L, o a la vez CD95L y
TNF, eran significativamente mejores que en los animales de control
(Fig. 2A). De acuerdo con ello, la recuperación locomotora absoluta
de los dos grupos de tratamiento, tal como se evaluaba por la
pendiente del análisis de regresión lineal, era significativamente
mejor que en los grupos de control (Fig. 2A).
\newpage
Una de las limitaciones del registro BBB es que
el mismo está enfocado principalmente en los movimientos
estereotipados controlados por caminos reflejos en la médula
espinal (es decir, el generador de patrón central) (13). Por esta
razón, se realizaron ensayos adicionales que reflejan la integridad
de los tractos motores espinales dorsales (tracto cortico- o
rubroespinal). Uno de los ensayos que está enfocado en aspectos
voluntarios de los movimientos de los miembros, es el ensayo de
andadura sobre rejilla. Los déficits en el control motor
descendente se examinaron por evaluación de la capacidad para
controlar con precisión y poner las patas posteriores sobre una
rejilla horizontal, semejante a una escalera. De nuevo, los únicos
animales que exhibían una recuperación significativa de los
movimientos voluntarios eran los animales tratados con
anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF (Fig. 2B).
Con objeto de obtener información acerca de la
eficiencia locomotora en ausencia del aportación cutánea y
propioceptiva de los miembros a la médula espinal, se utilizó un
ensayo de natación. Se evaluó la eficiencia natatoria por registro
desde 0 a 10 de las características siguientes: movimientos de los
miembros posteriores, coordinación miembro
posterior-miembro anterior, posición de la cola,
posición de la zarpa, equilibrio sagital y coronal (Tabla 1). Una
vez más, los ratones tratados con anticuerpos
anti-CD95L o
anti-CD95L/anti-TNF, exhibían un
aumento significativo en el registro natatorio para cada momento
puntual ensayado en comparación con los animales tratados con
solución salina e IgG (Fig. 2C).
Para ensayar el aprendizaje de coordinación y
destreza motora, se realizó el ensayo Rotarod (14). Se registró el
tiempo de mantenimiento sobre un cilindro rotativo de plástico que
se aceleraba desde 4 a 7 rpm. El tiempo sobre la barra rotativa de
los animales tratados con anti-CD95L era
significativamente más largo al cabo de 2 y 3 semanas después de
SCI, y en los animales tratados con
anti-CD95L/anti-TNF al cabo de 1, 3
y 4 semanas después de SCI, cuando se comparaban con ratones de
control (Fig. 2D).
Los movimientos voluntarios mejorados de los
animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF indican una
capacidad regenerativa incrementada de los axones lesionados. Sin
embargo, esto puede ser un arma de dos filos, dado que un
crecimiento aberrante puede dar lugar a hiperalgesia (15). La
neutralización de TNF atenúa la hiperalgesia en los ratones con
lesión de constricción crónica (16). Para ensayar la influencia de
la neutralización de CD95L solo o junto con TNF en la reacción de
los animales lesionados frente a otros estímulos
no-nociceptivos, se utilizó el "ensayo de von
Frey" (17). Para esto, se ensayaron los ratones respecto a las
respuestas a estimulación mecánica de umbral bajo mediante
"pelos de von Frey". Las respuestas alodínicas se
registraron de 0 a 3 dependiendo de la intensidad de la reacción al
estímulo. Antes de la operación, todos los animales tenían un
registro alodínico de 0. En cada momento puntual posterior a la
lesión, únicamente los ratones con doble tratamiento exhibían una
disminución significativa en el comportamiento alodínico cuando se
comparaban con ratones de control (Fig. 2E). Así pues, una posible
ventaja de la adición del anticuerpo anti-TNF al
tratamiento podría ser atenuar la hiperalgesia.
Para confirmar el efecto
"símil-placebo" de la neutralización del TNF en
la eficiencia locomotora observada previamente, se realizó una
segunda serie de experimentos. Para esto, los animales se inyectaron
con el anticuerpo anti-TNF solo o con solución
salina. Como era de esperar, las diferencias en las tareas motoras
tal como se evaluaban por BBB (Fig. 2A) y andadura sobre rejilla
(Fig. 2B) no eran significativas. Sin embargo, la eficiencia sobre
la barra rotativa de los animales tratados con
anti-TNF era significativamente mejor en comparación
con los ratones tratados con solución salina (Fig. 2D). En este
sentido, los ratones con lesión cerebral silenciados en TNF estaban
significativamente menos deteriorados en el ensayo Rotarod y tenían
déficits significativamente menos severos en retención de memoria
que los ratones wt (18). De acuerdo con informes anteriores,
únicamente los animales tratados con anti-TNF, pero
no los tratados con solución salina, exhibían una disminución
significativa de la reacción alodínica a todo lo largo del periodo
de tiempo estudiado (análisis de regresión lineal, datos no
presentados).
La integridad del tracto corticoespinal dorsal
(CST) en algunos de los animales tratados previamente
(4-5 por grupo), se evaluó por inyección de
biotina-dextrano-amina (BDA) en la
corteza sensorial-motosa (19). En los ratones que
recibieron solución salina o IgG, las fibras CST transeccionadas se
retraían del sitio de la lesión en \sim250 \mum (\pm 11,5
\mum) (Fig. 3A). Únicamente se detectaban el pequeño número de
brotes que se extendían desde los axones cortados al tejido
adyacente, pero no crecían hacia el interior del área de lesión.
Significativamente, en los animales tratados con
anti-CD95L o
anti-CD95L/anti-TNF, brotaban
numerosas fibras ectópicas desde el CST transeccionado en dirección
rostral hacia el sitio de la lesión (Fig. 3B). Estas fibras
regeneradoras crecían hacia el interior de la materia blanca dorsal
y la cicatriz de la lesión. Un pequeño número de fibras cruzaban
incluso el epicentro de la lesión. El número relativamente bajo de
fibras de cruzamiento comparado con otros estudios (20) está
relacionado con el tamaño de la lesión. En este caso, los autores
de la invención cortaron dos tercios de la médula espinal, lo que
conduce a la transección del componente dorsal entero del CST. De
acuerdo con ello, las lesiones grandes de la médula espinal están
correlacionadas con un crecimiento regenerativo pobre (20). Las
vistas con gran aumento de fibras CST en el sitio de la lesión de
los animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF demostraban una
morfología consistente con botones sinápticos, lo que sugería que
estas fibras regeneradoras forman conexiones funcionales con
(Fig. 3B).
(Fig. 3B).
Es interesante que, a pesar del bajo número de
animales seguidos por BDA, era evidente por los datos que la
regeneración de fibras estaba correlacionada con el registro en la
eficiencia de la andadura sobre rejilla (R = 0,66; p \leq 0,05;
correlación de Pearson). Este registro refleja movimientos
voluntarios, y por consiguiente, la mejora funcional de los
animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF no puede ser
debida a tractos ventrales disponibles (tractos retículo- y
vestíbulo-espinales) que son los encargados de
producir movimientos reflejos.
Para descifrar los mecanismos moleculares
subyacentes en la recuperación clínica de los animales, se evaluó
la expresión de diversos marcadores para degeneración, regeneración
o inflamación. Se extrajeron proteínas de las médulas espinales de
animales (n = 3 por grupo) ensayados previamente con respecto a
eficiencia locomotora.
Se sabe que la neutralización de CD95L disminuye
la apoptosis. Ahora bien, ¿qué tipos de células se recuperan? Las
neuronas y la microglía expresan tanto CD95L como CD95, los
astrocitos expresan TNF y CD95, mientras que los linfocitos
infiltrantes expresan CD95L (datos no presentados). En contraste con
los astrocitos, los oligodendrocitos son sensibles a la apoptosis
inducida por CD95 (21). Dado que CD95 se expresa también en neuronas
y en microglía, las células recuperadas deben ser neuronas,
microglía u oligodendrocitos.
Para abordar esta cuestión, se evaluó la
expresión de una proteína neuronal citoesquelética,
\betaIII-tubulina (22). Se ha demostrado que el
nivel de \betaIII-tubulina aumenta durante la
regeneración axonal (23). En conformidad con ello, en los animales
tratados con anti-CD95L o
anti-CD95L/anti-TNF, pero no en los
grupos de control, la expresión de la
\betaIII-tubulina aumentaba notablemente (Fig.
4A).
Ulteriormente, se examinó la expresión de Tau,
una proteína asociada a los microtúbulos neuronales. Como era de
esperar, la cantidad total de Tau, tal como se evaluaba por el
anticuerpo Tau5, era mayor en ambos grupos tratados (Fig. 4A). Es
muy importante que la proporción de Tau no fosforilada (Ser 199 y
202) era mayor en los grupos tratados (Fig. 4A). Además, en los
animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF, se detectaba
una banda adicional para Tau (flechas). Para determinar si
esta banda era debida a degradación o desfosforilación de Tau, se
trataron los lisados con fosfatasa alcalina (AP). El tratamiento con
AP desplazaba hacia abajo las bandas superiores (datos no
presentados). Así pues, los autores de la invención deducen que la
neutralización de CD95L facilita la desfosforilación de Tau. La Tau
desfosforilada estabiliza las estructuras de microtúbulos (MT),
permitiendo con ello el crecimiento axonal (24).
Se ha comunicado que los oligodendrocitos sufren
apoptosis después de la SCI (25). La pérdida de oligodendrocitos da
como resultado la desmielinación de axones que podrían haber
sobrevivido al traumatismo inicial. Además, se ha postulado que el
sistema CD95-L/R es un desencadenante principal de
la desmielinación en la esclerosis múltiple (26). Por esta razón,
se ve incentivada la especulación de que el tratamiento con
anti-CD95L disminuye la muerte de los
oligodendrocitos y, por tanto, la desmielinación axonal subsiguiente
a la lesión de la médula espinal. Para abordar esta cuestión, se
evaluaron los niveles de la proteína básica Mielina (MBP). Esta
proteína es producida por los oligodendrocitos y su presencia puede
servir como parámetro indirecto de la viabilidad de los
oligodendrocitos (27). En los animales tratados con
anti-CD95L solo o junto con
anti-TNF, los niveles de MBP aumentaban en
comparación con ratones de control (Fig. 4B).
La regeneración puede facilitarse también por
interferencia con la respuesta inflamatoria. La amplificación de la
reacción inflamatoria puede ser impulsada por CD95L y TNF, como
sucede en otros sistemas (28). Después de la SCI, los astrocitos
reactivos invaden el sitio de lesión para producir la escara
astrogial. La escara se convierten en un obstáculo mecánico para la
regeneración axonal (29). La inhibición de CD95L podría reducir la
formación de escara después de la SCI. Por esta razón, se evaluaron
los niveles del marcador para astrocitos reactivos, la proteína
ácida fibrilar glial (GFAP). Los niveles de expresión de GFAP no
diferían entre los grupos tratados y de control
(Fig. 4C).
(Fig. 4C).
La neutralización de CD95L podría aumentar
también directamente el potencial de regeneración de los axones
lesionados. Para comprobar esto, se examinaron los niveles de
expresión de la proteína 43 asociada al crecimiento
(GAP-43). Se ha demostrado que la expresión de
GAP-43 aumenta después de SCI torácica únicamente en
los axones que pueden regenerarse (30). Además, la
co-expresión de GAP-43 y
CAP-23, otra proteína cónica de crecimiento
importante [sic], conduce a un aumento de 60 veces en la
regeneración de los axones DRG después de la SCI (31). En los
animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF, la expresión de
GAP-43 aumentaba cuando se comparaba con los grupos
de control (Fig. 4D).
En suma, se ha demostrado por primera vez con
ensayos locomotores que la neutralización de CD95L promueve la
recuperación funcional después de SCI. Aparte del registro BBB que
está enfocado principalmente en movimientos reflejos
estereotipados, se han realizado también ensayos que reflejan la
integridad de los tractos espinales dorsales que se ven afectados
por la lesión. Estos son el ensayo de andadura sobre rejilla y el
ensayo de natación. Se ha desarrollado una escala de natación de
acuerdo con la eficiencia natatoria de los animales a fin de
cuantificar los aspectos múltiples de la locomoción en ausencia de
aportación cutánea y propioceptiva desde las extremidades a la
médula espinal. En cada ensayo, la recuperación funcional de los
animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF era
significativamente mejor que en los dos grupos de control. Los
animales tratados con anti-TNF solo no exhibían una
recuperación funcional significativa, pero la adición del anticuerpo
anti-TNF al tratamiento atenuaba la alodinia
mecánica.
En segundo lugar, el estudio de seguimiento BDA
indicaba una capacidad regeneradora incrementada de los axones
lesionados únicamente en los animales tratados con
anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF. Además, estas
fibras regeneradoras formaban conexiones funcionales, como se
demostró por la formación de botones sinápticos en el sitio de la
lesión. Así pues, la neutralización de CD95L es probable que mejore
la plasticidad axonal, conduciendo a la remodelación funcional de
la circuitería de la médula espinal. La regeneración axonal se
producía a pesar de la ausencia de efecto de CD95L sobre la escara
de la lesión. La recuperación locomotora y la regeneración
incrementada se reflejaban por un aumento del marcador neuronal
\betaIII-tubulina, así como por un aumento en la
viabilidad de los oligodendrocitos. Por esta razón, la
neutralización de CD95L protege las neuronas e inhibe a la vez la
desmielinación. Además, la expresión de GAP-43
aumentaba en los animales tratados con anti-CD95L y
anti-CD95L/anti-TNF, lo que indicaba
que la neutralización de CD95L podría aumentar directamente el
potencial regenerador de los axones lesionados. Asimismo,
GAP-43 puede aumentar debido a que el mantenimiento
de la viabilidad de los oligodendrocitos impide la desmielización
axonal y proporciona a los axones la posibilidad de
regenerarse.
El traumatismo espinal y cerebral explica la
mayoría de casos de muerte e incapacidades permanentes en la
población inferior a la edad de 40 años. Las consecuencias para la
sociedad son devastadoras, habiéndose designado como la epidemia
silenciosa. Actualmente, las estrategias que apuntan a la reparación
de las lesiones de la médula espinal se enfocan en neuroprotección,
regeneración mejorada, o tratamiento de la desmielinación. Dada la
complejidad de la lesión de la médula espinal, podrían requerirse
intervenciones múltiples direccionadas a las diferentes fuentes de
deterioro. Los autores de la presente invención han demostrado que
después de la SCI, la neutralización de CD95L actúa a tres niveles:
protege las neuronas, inhibe la desmielinación, y promueve la
regeneración y, por tanto, puede ofrecer una nueva terapia para los
traumatismos espinales humanos.
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Se ensayó si una proteína de fusión
CD95-Fc (v.g. como la descrita en el documento
WO95/27735) es capaz de ejercer un efecto terapéutico subsiguiente
a la SCI por hemisección. Los animales de ensayo (n = 6) se trataron
siete veces por vía intraperitoneal con 25 mg/kg de
CD95-Fc cada tres días, respectivamente. Los
animales de control (n = 6) se trataron con solución salina. De
hecho, la administración repetida de CD95-Fc
atenuaba significativamente la parálisis de los miembros
posteriores de los ratones cuatro semanas después de la
administración espinal. Los resultados se muestran en Fig. 6. Los
ratones tratados con CD95-Fc recuperaban la
motilidad de los miembros posteriores para un registro BBB de 11
por término medio. Este registro corresponde a un soporte total del
peso y una colocación sobre la mayor parte de la planta de los
miembros posteriores. En contraste, los ratones tratados con
solución salina, tenían un registro medio de 1,5 que corresponde a
una capacidad ligera de movimiento de los miembros posteriores en
dos articulaciones, pero por lo demás una incapacidad de utilizar
los miembros posteriores para
locomoción.
locomoción.
El tratamiento con CD95-Fc
mejoraba eficazmente la recuperación funcional del movimiento de los
miembros posteriores después de hemisección espinal cervical. Un
progreso de la motilidad de los miembros posteriores como el
demostrado en esta memoria en los ratones podría corresponderse a
una mejora espectacular en la calidad de vida y una necesidad
reducida de atención sanitario cuando se correlaciona con humanos
que sufren parálisis subsiguiente a SCI.
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siguiente)
(1) M.J. Crowe, J.C. Bresnahan,
S.L. Shuman, J.N. Masters, M.S. Beattie,
Nat Med 3, 73-6. (1997).
(2) A. Martin-Villalba
et al., Cell Death Differ 8, 679-86.
(2001).
(3) L.A. Tartaglia, T.M. Ayres,
G.H. Wong, D.V, Goeddel, Cell 74,
845-53. (1993).
(4) F.C. Kischkel et al., Embo J
14, 5579-88. (1995).
(5) J.P. Medema et al., Embo J 16,
2794-804. (1997).
(6) C. Scaffidi et al., Embo 17,
1675-87. (1998).
(7) J.E. Springer, R.D. Azbill,
P.E. Knapp, Nat Med 5, 943-6.
(1999).
(8) M. Li et al., Neuroscience 99,
333-42. (2000); M. Zurita, J.
Vaquero, I. Zurita, J Neurosurg 94,
257-64. (2001).
(9) Y.B. Lee et al., Exp Neurol
166, 190-5. (2000).
(10) G.M. Kim et al., J Neurosci
21, 6617-25. (2001); M. Farooque, J.
Isaksson, Y. Olsson, J Neurotrauma 18,
105-14. (2001).
(11) S. Casha, W.R. Yu, M.G.
Fehlings, Neuroscience 103, 203-18.
(2001).
(12) D.M. Basso, M.S. Beattie,
J.C. Bresnahan, J Neurotrauma 12,
1-21. (1995).
(13) S. Rossignol, R. Dubuc,
Curr Opin Neurobiol 4, 894-902.
(1994).
(14) L.L. Counghenour, J.R.
McLean, R.B. Parker, Pharmacol Biochem Behav
6, 351-3. (1977).
(15) C.J. Woolf, Drugs 47,
1-9, discussion 46-7.
(1994).
(16) T. Lindenlaub, P. Teuteberg,
T. Hartung, C. Sommer, Brain Res 866,
15-22. (2000).
(17) A.E. Lindsey et al., Neurorehabil
Neural Repair 14, 287-300. (2000).
(18) U. Scherbel et al., Proc Natl
Acad Sci USA 96, 8721-6. (1999).
(19) J.D. Guest et al., J Neurosci
Res 50, 888-905. (1997).
(20) C. Brosamle, A.B. Huber, M.
Fiedler, A. Skerra, M.E. Schwab, J
Neurosci 20, 8061-8. (2000); T.
GrandPre, S. Li, S.M. Strittmatter,
nature 417, 547-51. (2002).
(21) S.D. D'Souza et al, J Exp Med
184, 2361-70. (1996); B. Becher, S.D.
D'Souza, A.B. Troutt, J.P. Antel,
Neuroscience 84, 627-34. (1998); W.
Li et al., J Neurosci Res 69, 189-96.
(2002).
(22) H. Braun, K. Schafer, V.
Hollt, J Neurotrauma 19, 975-83.
(2002).
(23) A.E. Fournier, L.
McKerracher, J Neurosci 17, 4623-32.
(1997).
(24) D.A. Shackelford, K.E.
Nelson, J Neurochem 66, 286-95.
(1996).
(25) S.L. Shuman, J.C. Bresnahan,
M.S. Beattie, J Neurosci Res 50,
798-808. (1997).
(26) U. Malipiero et al., Eur J
Immunol 27, 3151-60. (1997).
(27) D. Bartholdi, M.E. Schwab,
Glia 23, 278-84. (1998).
(28) J.J. Chen, Y. Sun, G.J.
Nabel, Science 282, 1714-7.
(1998); Y. Mano-Hirano et al., J
Nalt Cancer Inst 78, 115-20. (1987).
(29) S.J. Davies et al., Nature
390, 680-3. (1997).
(30) K.J. Fernandes, D.P. Fan,
B.J. Tsui, S.L. Cassar, W. Tetzlaff, J Comp
Neurol 414, 495-510. (1999).
(31) H.M. Bomze, K.R. Bulsara, B.
J. Iskandar, P. Caroni, J.H. Skene, Nat
Neurosci 4, 38-43. (2001).
(32) B. Echtenacher, W. Falk, D.N.
Mannel, P.H. Krammer, J Immunol 145,
3762-6. (1990).
(33) Y. Gavrieli, Y. Sherman, S.A.
Ben-Sasson, J Cell Biol 119,
493-501. (1992).
(34) A. Herzog, C. Brosamle, J
Neurosci Methods 72, 57-63. (1997).
(35) D. M. Basso, M.S. Beattie,
J.C. Bresnahan, J Neurotrauma 12,
1-21. (1995).
(36) G.A. Metz, D. Merkler, V.
Dietz, M.E. Schwab, K. Fouad, Brain Res
883, 165-77. (2000).
(37) J.A. Koziol, D.A. Maxwell, M.
Fukushima, M.E. Colmerauer, Y.H. Pilche,
Biometrics 37, 383-90. (1981).
(38) N. Kayagaki et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA 94, 3914. (1997).
(39) Y. Nakamoto et al., J. Exp.
Med. 196, 1105. (2002).
(40) B. Echtenacher et al., J
Immunol 145, 3762-3766. (1991).
(41) V.J. Wroblewski et al., Biochem
Pharmacol 65, 657-667. (2003).
(42) M. Zurita et al., J.
Neurosurg. (Spine 2) 94, 257-264.
(2001).
(43) B. Becker et al.,.
Neuroscience 84, 627-634. (1998).
(44) M. Farooque et al., J.
Neurotrauma 18, 105-114. (2001).
Claims (15)
1. Uso de un inhibidor del ligando CD95
seleccionado de
- (a)
- un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento de fijación de antígeno del mismo,
- (b)
- una molécula receptora de CD95 soluble o una porción de fijación de ligando CD95 de la misma,
- \quad
- para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lesiones cerebrales o de la médula espinal, en donde dicho medicamento no comprende un inhibidor del ligando/receptor de TNF.
2. El uso de la reivindicación 1, para el
tratamiento de lesiones parciales o completas de la médula
espinal.
3. El uso de las reivindicaciones 1 ó 2 para el
tratamiento de la paraplejia.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 para la regeneración de la
eficiencia locomotora, la mejora de las reacciones para la
estimulación y/o la recuperación de la coordinación de
movimientos.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1-4 para el tratamiento de lesiones cerebrales o de
la médula espinal en personas adultas.
6. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 para el tratamiento de
humanos.
7. El uso de las reivindicaciones
1-6, en donde el inhibidor del ligando CD95 es un
dominio extracelular de la molécula receptora CD95.
8. El uso de la reivindicación
1-7, en donde el inhibidor del ligando CD95 es un
dominio extracelular de la molécula receptora CD95 fusionada a un
dominio polipeptídico.
9. El uso de la reivindicación 8, en donde el
inhibidor del ligando CD95 es un dominio extracelular de la
molécula receptora CD95 fusionada a una molécula de inmunoglobulina
Fc.
10. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en donde el medicamento
comprende el al menos un inhibidor del ligando CD95 seleccionado de
la reivindicación 1(a) y (b) como el ingrediente activo junto
con vehículos, diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente
aceptables.
11. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, en donde el medicamento se
administra por vía sistémica.
12. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en donde el medicamento se
administra por vía local.
13. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en donde el medicamento se
administra por vía intratecal.
14. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, para el tratamiento de
lesiones agudas.
15. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, para el tratamiento de
lesiones no agudas después de introducción de una nueva lesión.
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Families Citing this family (7)
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|---|---|---|---|---|
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| US20110189194A1 (en) * | 2008-07-14 | 2011-08-04 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Use of cd95 inhibitors for the treatment of inflammatory disorders |
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| KR20120103587A (ko) | 2009-11-12 | 2012-09-19 | 제넨테크, 인크. | 수상돌기 소극 밀도를 증진시키는 방법 |
| SG11201803330WA (en) | 2015-10-22 | 2018-05-30 | Juno Therapeutics Gmbh | Methods for culturing cells and kits and apparatus for same |
| CN111546719B (zh) * | 2020-04-21 | 2022-07-01 | 中国船舶重工集团公司第七二五研究所 | 一种磁性宽频带电磁吸波超材料 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4447484C2 (de) * | 1994-04-08 | 1997-07-17 | Deutsches Krebsforsch | Mittel zur Hemmung von Apoptose |
| CA2225852C (en) | 1995-06-30 | 2009-04-14 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Anti-fas ligand antibody and assay method using the anti-fas ligand antibody |
| CA2270423C (en) | 1996-10-31 | 2009-09-15 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Prophylactic/therapeutic agent |
| US6001962A (en) * | 1996-11-15 | 1999-12-14 | The Regents Of The University Of California | Modified Fas ligands |
| WO1999014330A1 (en) | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Genentech, Inc. | DcR3 POLYPEPTIDE, A TNFR HOMOLOG |
| EP1165781B1 (en) | 1999-03-30 | 2007-08-29 | Eli Lilly And Company | Protease resistant flint analogs |
| KR100386399B1 (ko) * | 1999-05-26 | 2003-06-02 | 이쿠오 토라따니 | 짧은 바지 및 수영복 등의 의류 |
| DE19959049A1 (de) * | 1999-12-07 | 2001-06-28 | Deutsches Krebsforsch | Kombination von Verbindungen, welche die biologischen Wirkungen von TNF-alpha und CD95L hemmen |
| PE20011267A1 (es) * | 2000-03-29 | 2001-12-15 | Vertex Pharma | Carbamato como inhibidores de caspasa |
| AU2002256895B2 (en) * | 2001-05-18 | 2008-09-18 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Anti-TRAIL-R antibodies |
-
2003
- 2003-02-14 EP EP03003426A patent/EP1447093A1/en not_active Withdrawn
-
2004
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