ES2301986T3 - Metodo para la predicion, diagnosis y diagnosis diferencial de la enfermedad de alzeimer. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar si un individuo tiene probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer (AD) que comprende los pasos siguientes: (a) Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde: * x es el nivel de péptidos Aa capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido Aa que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido Aa; * y es el nivel de péptidos Aa capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido Aa que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido Aa; (b) comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, y con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD; (c) determinar, a partir de la comparación del paso (b), si el individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo no tiene probabilidad de desarrollar AD.

Description

Método para la predicción, diagnosis y diagnosis diferencial de la enfermedad de Alzheimer.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la predicción, diagnosis y diagnosis diferencial de la enfermedad de Alzheimer. Más particularmente, la presente invención proporciona un método para determinar si un individuo, que no presenta signo clínico alguno de enfermedad de Alzheimer, tiene probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. La presente invención proporciona adicionalmente un método para la diagnosis de AD y/o para la diagnosis diferencial de la enfermedad de Alzheimer frente a otras demencias tales como la demencia con cuerpos de Lewy.

Antecedentes de la técnica

La demencia es un problema mundial grave, común, y que está aumentando rápidamente, asociado con utilización creciente de atención sanitaria. Es un indicador muy importante de morbilidad y mortalidad en los ancianos. La incidencia de las más de 100 enfermedades conocidas que producen esta afección depende de la edad, así como de factores genéticos relacionados con la geografía, la raza, y la etnicidad. La demencia puede definirse como un deterioro crónico de facultades cognitivas múltiples (memoria, atención, criterio, etc.) que empeora la eficiencia previamente satisfactoria de las actividades de la vida diaria. Su perfil clínico y su grado de gravedad se ven afectados no sólo por la cantidad total de pérdida neuronal, sino por las localizaciones específicas de las lesiones subyacentes. Con mucho, las formas más comunes de demencia son enfermedad de Alzheimer (40-60% de los casos), demencia con cuerpos de Lewy (10-20% de los casos), demencia vascular (25% y que contribuye posiblemente en hasta el 40% de los casos), y demencia frontotemporal (para la cual no está clara todavía la frecuencia) (Lowe, 2001; Leys et al., 2002; MacKetih, 2002; Knopman et al., 2002). Más del 33% de las mujeres y el 20% de los hombres de edad superior a 65 años desarrollarán demencia o formas más leves de deterioro cognitivo durante su vida (Yaffe y Gregg, 2002).

La enfermedad de Alzheimer (AD), la forma principal y prototipo de la demencia, puede clasificarse de acuerdo con criterios diferentes. Desde el punto de vista genético, la enfermedad puede clasificarse en dos tipos: (i) formas familiares heredadas, menos frecuentes (que comprenden desde menos del 5% para las formas de aparición precoz hasta el 10-15% para las formas de aparición tardía cuando se incluyen todos los factores genéticos de predisposición), y (ii) el tipo esporádico, mucho más común, para el cual no se han establecido patrones de herencia evidentes. La forma esporádica se presenta generalmente después de los 65 años, y se cree es de naturaleza multifactorial.

La diagnosis definitiva de AD está basada en el descubrimiento de cantidades destructivamente grandes de placas seniles y madejas neurofibrilares en las áreas afectadas del neopalio en la autopsia. Junto con la atrofia masiva de materia gris, estos dos tipos de estructuras anormales son los sellos de la enfermedad.

Las madejas neurofibrilares están constituidas por colecciones anormales de hebras retorcidas que se encuentran en el interior de las células nerviosas. Los componentes principales de estas madejas son agregados anormales de una proteína denominada tau. En el sistema nervioso central, las proteínas tau normales unen y estabilizan los microtúbulos que son constituyentes principales de la estructura interna de la célula. En la AD, sin embargo, tau está hiperfosforilada y se retuerce por sí misma en filamentos helicoidales apareados: dos hebras de tau se enrollan una alrededor de otra. Estos filamentos se agregan para formar las madejas neurofibrilares reveladoras (Goedert, 1996).

El segundo sello de AD, las placas seniles, está constituido en gran parte por un péptido insoluble llamado amiloide \beta (A\beta) que está rodeado por una diversidad de protuberancias neuronales y gliales. Este material acelular y amorfo se encuentra en los espacios entre las células nerviosas del cerebro. A\beta es un pequeño péptido que se encuentra principalmente en dos tamaños, de 40 (A\beta_{40}) y 42 (A\beta_{42}) aminoácidos, y en menores cantidades en otros tamaños (véase más adelante). Se sabe que A\beta es metabolizado a partir de la escisión proteolítica de APP (Saido, 2000) por dos caminos. En la primera ruta, no patógena, la escisión de la molécula APP por las enzimas secretasa conduce a proteínas no-amiloidogénicas más cortas (A\beta_{39} o A\beta_{40}). En el segundo camino relacionado con la enfermedad, la escisión de APP produce el fragmento más largo y potencialmente amiloidogénico A\beta_{42}, que tiende a plegarse defectuosamente y agregarse en cadenas de polímero que no sólo siembran las placas, sino que pueden causar finalmente deterioro neuronal (Selkoe, 1991).

El amiloide encontrado en los núcleos de las placas seniles es principalmente A\beta_{42} (Roher et al., 1993; Miller et al., 1993). Depósitos de amiloide se encuentran repartidos de modo disperso en diferentes regiones del cerebro con el envejecimiento normal, pero se hacen cada vez más abundantes en las etapas inicial y subsiguientes de la enfermedad de Alzheimer. El A\beta secretado soluble es un producto del metabolismo celular normal y se encuentra en diversos fluidos corporales que incluyen plasma y CSF. En los fluidos biológicos, se cree generalmente que A\beta_{40} y A\beta_{42} son la especie de amiloide principal (Seubert et al., 1992; Shoji et al., 1992; Vigo-Pelfrey et al., 1993; Ida et al., 1996). Sin embargo, además de A\beta_{40} y A\beta_{42} se ha encontrado también A\beta_{37/38/39} en CSF de AD y de individuos normales (Wiltfang et al., 2002).

El término N es la parte más heterogénea de A\beta, estando sujeto a truncación, racemización e isomerización. Desde el descubrimiento de A\beta como el constituyente principal de los depósitos de amiloide en AD (Glenner y Wong, 1984), se han identificado diferentes péptidos A\beta truncados y/o modificados en el terminal N en placas de pacientes de AD (Masters et al., 1985; Mori et al., 1992; Näslund et al., 1994; Saido et al., 1995; 1996; Iwatsubo et al., 1996; Russo et al., 1997; Tekirian et al., 1998; Lamer, 1999; Thai et al., 1999; Harigaya et al., 2000; Wiltfang et al., 2001; Kalback et al., 2002; Sergeant et al., 2003). Se han identificado también péptidos A\beta truncados y/o modificados en el terminal N en CSF de AD y de individuos normales (Seubert et al., 1992; Vigo-Pelfrey et al., 1993; Ida et al., 1996; Lewczuk et al., 2003; 2004).

"En WO 200072880 se describen ensayos ELISA sándwich en los que se utiliza el anticuerpo monoclonal 266, específico para A\beta 13-28 y el anticuerpo 3D6 específico para A\beta1-5. WO 200246237, aparte de describir los anticuerpos monoclonales 266 y 3D6 describe posteriormente además el uso de otro anticuerpo monoclonal 21F12, específico para A\beta 33-42".

La segunda causa más común de demencia primaria, después de la enfermedad de Alzheimer, es la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), que da cuenta de no menos del 10 a 20% de todos los casos de demencia (Lowe, 2001; McKeith, 2002). Los cuerpos de Lewy que definen la enfermedad son inclusiones neuronales compuestas de neurofilamentos fosforilados anormalmente, ubiquitina, y alfa-sinucleína. Se cree que estas anormalidades contribuyen a la disfunción neurológica dando como resultado síntomas clínicos que, dependiendo de la región del cerebro afectada, pueden asemejarse parcialmente a los asociados con la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson. De hecho, muchos casos de DLB se diagnostican todavía erróneamente como enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, la diferenciación de DLB y la enfermedad de Alzheimer es importante. Esto es debido a que ciertos agentes neurolépticos, prescritos en muchos casos para el tratamiento de los síntomas psicóticos y alteraciones del comportamiento comunes en la demencia, pueden dar como resultado reacciones de hipersensibilidad graves (potencialmente letales) en el caso de DLB (McKeith, 2002). Adicionalmente, los mecanismos patológicos que causan DLB pueden ser fundamentalmente diferentes de los de AD y, de acuerdo con ello, la diferenciación entre DLB y AD podría ser importante para el tratamiento de modificación de la enfermedad que se pretende en estos mecanismos patológicos.

Investigaciones clínicas recientes han identificado un estado de transición entre el deterioro cognitivo encontrado en el envejecimiento normal y la demencia. Este estado prodrómico ha sido denominado deterioro cognitivo leve (MCI). Las personas con MCI experimentan déficits de memoria consistentes antes y en mayor proporción de lo que podría esperarse para su edad, pero siguen siendo funcionalmente independientes. Por esta razón, no cumplen los criterios aceptados para una diagnosis positiva de una de las demencias primarias (Petersen et al., 2001). Los individuos que presentan síntomas cognitivos clínicamente leves pertenecen a un grupo heterogéneo y pueden no compartir finalmente la misma suerte. Algunos pueden llegar a desarrollar AD, mientras que otros pueden progresar a otra forma de demencia. Es posible que algunos de los individuos no progresen nunca más allá del estado de MCI. Sin embargo, dependiendo del origen y la definición del grupo, entre 19% y 50% de los individuos diagnosticados con MCI progresan a demencia (usualmente enfermedad de Alzheimer) (Chertkow, 2002).

Un esfuerzo muy importante se halla en curso para evaluar un gran número de opciones terapéuticas para AD y otras demencias. Estos enfoques incluyen numerosos agentes tales como inhibidores de la acetilcolinesterasa, fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDS), estrógeno, agentes neurotóxicos, e incluso vitaminas (Sramek y Cutler, 2000; Thai, 2000) así como la reducción de la formación de placas seniles por la identificación de inhibidores de secretasas y el desarrollo de un modelo de inmunización para la prevención de la deposición de amiloide (Conde, 2002). Dado que la terapia modificadora de la enfermedad es probable que sea más eficaz en los primeros estadios en el curso de la misma, el MCI podría ser la etapa óptima para la intervención terapéutica (Chertkow, 2002). Si bien actualmente no se recomienda tratamiento alguno para el MCI, se encuentran en curso pruebas clínicas concernientes a terapias potenciales. La diagnosis precoz es por consiguiente muy deseable antes que la neurodegeneración llegue a hacerse grave y generalizada. Por esta razón, un reto fundamental para el médico consiste en evaluar si el paciente ha cruzado la tenue línea situada entre el envejecimiento normal y el MCI. De hecho, la demencia incipiente debe distinguirse claramente de los problemas benignos de memoria asociados con edad, ansiedad, falta de atención, problemas médicos coexistentes, o depresión. Adicionalmente, dado que algunas de las formas de demencia son parcial o incluso completamente reversibles después del tratamiento (v.g. la demencia debida a deficiencia vitamínica, intoxicación por fármacos, alcoholismo, trastornos endocrinos, etc.), la importancia de la oportunidad y exactitud en la diagnosis clínica y la diagnosis diferencial es evidente.

La diagnosis de demencias tales como AD está basada actualmente en una elaboración amplia y profunda que consiste en (i) una evaluación clínica concienzuda (con inclusión de examen físico, anamnesis con el paciente y la familia, revisión de la medicación); (ii) un examen neurológico que implica pruebas neuropsicológicas y radiología; y (iii) pruebas de laboratorio (v.g., vitamina B12, ácido fólico, función del tiroides, química completa de la sangre y hemograma, etc.) (Marin et al., 2002) y exclusión de todas las formas de demencia restantes. Sin embargo, finalmente, sólo la confirmación por autopsia puede diferenciar inequívocamente entre los diversos trastornos
demenciales.

El valor de las pruebas neuropsicológicas para ayudar a la identificación de la presencia de deterioros precoces de memoria y cognitivos - y cuantificar el grado en el que se ve afectado el paciente - ha sido bien documentado (Welsh et al., 1991; Petersen et al., 1994; Masur et al., 1994). Sin embargo, en las etapas muy tempranas de la enfermedad, la delineación del protuberancia de la enfermedad con respecto al "envejecimiento normal" sigue siendo difícil. Incluso en las etapas más avanzadas de la enfermedad, la diagnosis de AD y la distinción entre AD y varias enfermedades neurodegenerativas asociadas con demencia, especialmente de DLB, puede ser también difícil.

Los procedimientos de diagnóstico necesitan ser mejorados a fin de poder identificar AD en la etapa pre-demencial y diferenciar AD de otras causas de deterioro cognitivo o demencia. Algunos aspectos de la cascada patológica de AD se reflejan en concentraciones alteradas de proteínas en fluidos corporales. Tales proteínas (biomarcadores o marcadores biológicos) que reflejan los protuberancias patógenos fundamentales asociados con la enfermedad, a saber la degeneración de las neuronas y sus sinapsis como se refleja en sus lesiones definitorias características (placas seniles y madejas neurofibrilares (The Ronald and Nancy Reagan Research Institute of the Alzheimer's Association of the National Institute on Aging Working Group, 1996), pueden aumentar la exactitud de esta diagnosis precoz y diferencial. Dado que todo el cerebro está en contacto directo con el CSF y que la AD y los trastornos afines están consideradas como enfermedades cerebrales, la posibilidad de encontrar diferencias importantes es probable que resida en este fluido corporal.

Dos biomarcadores de corriente principal de este tipo son la proteína CSF-A\beta que termina en el aminoácido 42 (A\beta_{42}) y la proteína CSF-tau. Por su parte, la concentración de CSF-A\beta_{42} parece estar asociada con la deposición de amiloide \beta en las placas extracelulares seniles (Motter et al., 1995; Andreasen et al., 1999a). Para CSF-tau, se cree que los niveles de esta proteína reflejan degeneración neuronal y axonal (Blennow et al., 1995; Andreasen et al., 1998) o la posible formación de madejas neurofibrilares (Tapiola et al., 1997). Niveles notablemente incrementados de CSF-tau (Motter et al., 1995; Vigo- Pelfrey et al., 1995) y concentraciones notablemente reducidas de CSF-A\beta_{42} (Blennow et al., 1995; Tapiola et al., 1997) se observaron a la vez en pacientes con enfermedad de Alzheimer en comparación con controles de individuos no dementes. De hecho, estudios multicentro extensos y bien diseñados realizados en los Estados Unidos (Galasko et al., 1998) y Japón (Kanai et al., 1998), y un estudio multicentro internacional (Hulstaert et al., 1999) encontraron consistentemente que el uso combinado de los marcadores CSF-tau y CSF-A\beta_{42} daba como resultado sensibilidad y especificidad altas, y cumplía los requisitos para discriminación de la enfermedad de Alzheimer respecto a trastornos de envejecimiento normal y neurológicos específicos (Sunderland et al., 2003). Esto sitúa con claridad su uso conjunto plenamente dentro de las directrices de consenso.

Otro avance potencialmente notable para la diagnosis mejorada de la demencia está ligado a la observación de la ausencia relativa de proteína tau fosforilada anormalmente en las células del cerebro de los pacientes con demencias no-tau (v.g. enfermedad de Parkinson, DLB) frente a las elevadas cantidades encontradas en aquéllos que padecen la enfermedad de Alzheimer (Harrington et al., 1994). Se encontraron diferencias importantes en los niveles de CSF-fosfo-tau entre la enfermedad de Alzheimer y otras demencias, especialmente DLB (Parnetti et al., 2001; Vanmechelen et al., 2001).

Wiltfang y colaboradores (2001) observaron también un nivel elevado de A\beta_{(2-42)} en el CSF de pacientes de AD. Ambos niveles de CSF-A\betax-42(43) y A\beta1-42(43) eran significativamente menores en los pacientes de AD que en un grupo de control, mientras que ni los niveles de CSF-A\betax-40 ni de CSF-A\beta1-40 exhibían diferencia alguna entre los dos grupos (Tamaoka et al., 1997). Sin embargo, no se especificaba cuáles eran los péptidos A\betax-42 que se midieron en este estudio.

Adicionalmente, ninguno de los estudios anteriores evaluó el comportamiento de estos biomarcadores en pacientes cognitivamente deteriorados o su valor en la predicción de la progresión de los pacientes de MCI a la demencia.

Debido a que el deterioro de la memoria y el MCI pueden ser química y patológicamente heterogéneos, los biomarcadores pueden ser particularmente útiles para la identificación de subtipos. En el momento actual, no existen datos definidos acerca de la utilidad de los biomarcadores en la clasificación del MCI y la predicción de si un paciente con MCI desarrollará una demencia primaria tal como la enfermedad de Alzheimer. La medida de CSF-tau podría ser utilizada eficazmente para identificar AD incipiente entre los pacientes diagnosticados clínicamente como enfermos de MCI (Sunderland et al., 1999; Riemenschneider et al., 2002). Sin embargo, Buerger et al. (2002) observaron que niveles elevados de CSF-fosfo-tau, pero no de CSF-tau estaban correlacionados con el deterioro cognitivo y la conversión desde MCI a AD. Arai et al. (2000) observaron tau y fosfo-tau elevadas en el CSF de pacientes con MCI que progresaron hasta desarrollar AD. Okamura et al. (2002) utilizaron el índice CSF-CBF para discriminar MCI que progresaba a AD versus MCI que no progresaba a AD. El índice CSF-CBF está basado en los niveles de CSF-tau divididos por el flujo sanguíneo regional cerebral (CBF) en la corteza cingulada posterior. Varios estudios informan acerca del uso de CSF-A\beta_{42} (en combinación con CSF-tau y/o CSF-fosfo-tau) como marcador biológico para la progresión de MCI a AD (Andreasen et al., 1999b; Riemenschneider et al., 2002; Andreasen et al., 2003). Individuos no dementes que desarrollaron demencia durante un periodo de seguimiento de 3 años tenían ya niveles inferiores de A\beta_{(1-42)} (pero no de A\beta_{(1-40)}) que aquéllos que permanecían libres de demencia (Skoog et al., 2003). El nivel de las formas de amiloide \beta parece decrecer constantemente a partir del comienzo de la AD. Aunque la relación A\beta_{40}/A\beta_{42} exhibía un aumento con la progresión de
AD, su incremento se había iniciado ya antes de la aparición de los síntomas clínicos de AD (Kanai et al., 1998).

Lo que antecede demuestra que ciertos biomarcadores están alterados anormalmente antes de la conversión a demencia clínica y que los mismos podrían ser prometedores como marcadores potenciales precoces para identificar pacientes de MCI que desarrollarán demencia primaria (especialmente enfermedad de Alzheimer).

Tales descubrimientos apuntan hacia el uso futuro combinado de dichos biomarcadores, junto con otros tests apropiados, como parte de una elaboración amplia de diagnóstico para MCI, enfermedad de Alzheimer, y otras demencias. Por consiguiente, es extremadamente importante que se identifiquen biomarcadores adicionales que están ya alterados en los pacientes antes de su conversión a demencia clínica y que podrían ayudar en la diagnosis de AD y la predicción de pacientes cognitivamente deteriorados que progresarán a demencias tales como AD.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos y kits de diagnóstico para la predicción, diagnosis y diagnosis diferencial de la enfermedad de Alzheimer (AD). Más especialmente, la presente invención proporciona un método y un kit de diagnóstico para determinar si un individuo que en el momento de la toma de muestra no presenta signos clínicos de AD, tiene probabilidad de desarrollar AD. Los métodos y kits de diagnóstico de la presente invención están basados en la determinación de las relaciones x/y en muestras de fluidos corporales obtenidas de los individuos objeto de diagnosis, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

Las relaciones x/y en las muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, se encontraban significativamente alteradas en comparación con las relaciones x/y en las muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona un método y un kit de diagnóstico para determinar si un individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, que comprende los pasos siguientes:

(a)

Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

(b)

comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, y con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD;

(c)

determinar, a partir de la comparación del paso (b), si el individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo no tiene probabilidad de desarrollar AD.

El método y el kit de diagnóstico de la presente invención pueden realizarse sobre muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que no presentan signo clínico alguno de deterioro de la memoria, MCI, o demencia. En una realización preferida, el método de la presente invención se realiza sobre muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos con deterioro de la memoria o individuos que han sido diagnosticados clínicamente como enfermos de MCI.

La presente invención proporciona también métodos y kits de diagnóstico para la diagnosis de individuos que sufren AD y/o para la diagnosis diferencial de individuos que sufren AD frente a individuos que sufren otras demencias tales como DLB. Los métodos y kits de diagnóstico de la presente invención están basados en el descubrimiento de que las relaciones x/y en muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que sufren AD están alteradas significativamente en comparación con las relaciones x/y en muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control e individuos que sufren DLB. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona métodos y kits de diagnóstico para la diagnosis de un individuo que sufre AD y/o para la diagnosis diferencial de un individuo que sufre AD frente a un individuo que sufre otra demencia tal como DLB, que comprenden los pasos
siguientes:

(a)

Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

(b)

comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como pacientes de AD, con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control, y con un intervalo de relaciones x/y definidas previamente como características de muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como enfermos de otra demencia tal como DLB;

(c)

determinar, a partir de la comparación realizada en el paso (b), si el individuo sufre o no AD u otra demencia tal como DLB, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como pacientes de AD es una indicación de que dicho individuo sufre AD; en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control es una indicación de que dicho individuo no sufre AD; y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como enfermos de otra demencia tal como DLB es una indicación de que dicho individuo sufre otra demencia tal como DLB.

La presente invención proporciona el uso de un juego de anticuerpos para determinar inmunológicamente la relación X/Y en los métodos arriba descritos que comprende al menos un primer anticuerpo que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta para detectar X y un segundo anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta para determinar Y.

En una realización preferida de la presente invención, x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. Aún más preferiblemente, x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50, y/o Anti-NI(D). En otra realización preferida de la presente invención, y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. Todavía más preferiblemente, y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o Anti-NI(D), tal como el anticuerpo monoclonal 4G8, el anticuerpo monoclonal 6E10, y/o el anticuerpo monoclonal 10H3. En otra realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-C)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-C)}. En otra realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} y/o A\beta_{(1-43)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)} y/o A\beta_{(N-43)}. En otra realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)}.

Los métodos y kits de diagnóstico de la presente invención pueden utilizarse sobre cualquier muestra de fluido corporal obtenida de un individuo. En una realización preferida, la muestra de fluido corporal es una muestra de fluido cerebroespinal o una muestra de plasma o suero.

Los métodos y kits de diagnóstico de la presente invención pueden utilizarse también en el seguimiento del tratamiento de un individuo que tiene probabilidad de desarrollar AD o de un individuo que ha sido diagnosticado como enfermo de AD.

La presente invención proporciona adicionalmente el uso de un kit de diagnóstico que comprende un primer anticuerpo que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta y un segundo anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta para determinar inmunológicamente la relación x/y en el método arriba descrito.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Secuencia parcial de aminoácidos de la proteína precursora de amiloide (APP) que comprende la secuencia de aminoácidos de A\beta. Se indican los sitios de escisión \alpha, \beta y \gamma en APP. Se indican además los epítopes de algunos de los anticuerpos monoclonales utilizados en los métodos y kits de diagnóstico de la presente invención.

Figura 2. Nivel x (pg equivalentes de péptido/ml) de péptidos específicos A\beta capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 3D6. El nivel se mide en muestras de CSF obtenidas de los grupos de pacientes siguientes: AD moderada (modAD), AD severa (sevAD), AD leve (mildAD), pacientes con padecimientos de memoria que progresaban a AD (Cog-AD), pacientes con padecimientos de memoria que no desarrollaron AD (Cog), pacientes que sufrían demencia con cuerpos de Lewy (DLB), pacientes que sufrían enfermedad de Parkinson (PD), e individuos de control (C).

Figura 3. Nivel y (pg equivalentes de péptido/ml) de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 6E10. El nivel se mide en muestras de CSF obtenidas de los grupos de pacientes siguientes: AD moderada (modAD), AD severa (sevAD), AD leve (mildAD), pacientes con padecimientos de memoria que progresaban a AD (Cog-AD), pacientes con padecimientos de memoria que no desarrollaron AD (Cog), pacientes que sufrían demencia con cuerpos de Lewy (DLB), pacientes que sufrían enfermedad de Parkinson (PD), e individuos de control (C).

Figura 4. Nivel y (pg equivalentes de péptido/ml) de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 4G8. El nivel se mide en muestras de CSF obtenidas de los grupos de pacientes siguientes: AD moderada (modAD), AD severa (sevAD), AD leve (mildAD), pacientes con padecimientos de memoria que progresaban a AD (Cog-AD), pacientes con padecimientos de memoria que no desarrollaron AD (Cog), pacientes que sufrían demencia con cuerpos de Lewy (DLB), pacientes que sufrían enfermedad de Parkinson (PD), e individuos de control (C).

Figura 5. Relación x/y en donde x es el nivel de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 3D6 y en donde y es el nivel de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 6E10. La relación x/y se determina en muestras de CSF obtenidas de los grupos de pacientes siguientes: AD moderada (modAD), AD severa (sevAD), AD leve (mildAD), pacientes con padecimientos de memoria que progresaban a AD (Cog-AD), pacientes con padecimientos de memoria que no desarrollaron AD (Cog), pacientes que sufrían demencia con cuerpos de Lewy (DLB), pacientes que sufrían enfermedad de Parkinson (PD), e individuos de control (C).

Figura 6. Relación x/y en donde x es el nivel de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 3D6 y en donde y es el nivel de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 4G8. La relación x/y se determina en muestras de CSF obtenidas de los grupos de pacientes siguientes: AD moderada (modAD), AD severa (sevAD), AD leve (mildAD), pacientes con padecimientos de memoria que progresaban a AD (Cog-AD), pacientes con padecimientos de memoria que no desarrollaron AD (Cog), pacientes que sufrían demencia con cuerpos de Lewy (DLB), pacientes que sufrían enfermedad de Parkinson (PD), e individuos de control (C).

Figura 7. Unión inmunológica de diferentes péptidos A\beta, A\beta_{(1-42)}, A\beta_{(2-42)}, A\beta_{(3-42)}, A\beta_{(4-42)}, A\beta_{(5-42)}, A\beta_{(8-42)}, A\beta_{(9-42)}, en ELISA con el anticuerpo monoclonal 21F12 como anticuerpo de captura y el anticuerpo monoclonal 3D6 como anticuerpo detector.

Figura 8. Unión inmunológica de diferentes péptidos A\beta, A\beta_{(1-42)}, A\beta_{(2-42)}, A\beta_{(3-42)}, A\beta_{(4-42)}, A\beta_{(5-42)}, A\beta_{(8-42)}, A\beta_{(9-42)}, en ELISA con el anticuerpo monoclonal 21F12 como anticuerpo de captura y el anticuerpo monoclonal 6E10 como anticuerpo detector.

Figura 9. Unión inmunológica de diferentes péptidos A\beta, A\beta_{(1-42)}, A\beta_{(2-42)}, A\beta_{(3-42)}, A\beta_{(4-42)}, A\beta_{(5-42)}, A\beta_{(8-42)}, A\beta_{(9-42)}, en ELISA con el anticuerpo monoclonal 21F12 como anticuerpo de captura y el anticuerpo monoclonal 4G8 como anticuerpo detector.

Figura 10. Unión inmunológica de los anticuerpos A\beta, A\beta_{(1-42)} y A\beta_{(2-42)} en un inmunoensayo multiparamétrico con los anticuerpos monoclonales 3D6, 6E10 y 4G8 como anticuerpos de captura y el anticuerpo monoclonal 21F12 como anticuerpo detector.

Figura 11. Nivel x (Unidades Luminex) de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 3D6. El nivel se mide en muestras de CSF obtenidas de individuos que sufren AD e individuos de control.

Figura 12. Nivel x (Unidades Luminex) de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 4G8. El nivel se mide en muestras de CSF obtenidas de individuos que sufren AD e individuos de control.

Figura 13. Relación x/y en donde x es el nivel de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 3D6 e y es el nivel de péptidos A\beta específicos capaces de unión con el anticuerpo monoclonal 4G8. La relación x/y se determina en muestras de CSF obtenidas de individuos que sufren AD e individuos de control.

Figura 14. Espectros SELDI-TOF de péptidos A\beta_{(42)} analizados en muestras de CSF de AD y controles. Los péptidos A\beta_{(42)} se inmunocapturaron en 4D7A3. Se muestran las masas moleculares medidas de los péptidos. En el experimento se realizó una calibración externa con Dynaphorin (Mr = 2147,50 Da), ACTH_{(1-24)} humana (2933,50), cadena beta de insulina de bovino (3495,94), e insulina humana (5807,65). Sobre esta base se calculó la exactitud de las masas para el pico de péptido A\beta_{(42)} con masa teórica de 4514,1 Da. El valor m/z medido por SELDI-TOF era 4512,069 Da) (desviación estándar 1,193456, % CV 0,02645), dando una exactitud para este experimento de 450 ppm.

Figura 15. Espectros SELDI-TOF de péptidos A\beta_{(42)} oxidados analizados en muestras de CSF humano.

Figura 16. Nivel (intensidad de pico) de péptidos A\beta_{(1-42)} medido en muestras de CSF obtenidas de individuos que sufrían AD e individuos de control.

Figura 17. Nivel (intensidad de pico) de péptidos A\beta_{(11-42)} medido en muestras de CSF obtenidas de individuos que sufrían AD e individuos de control.

Figura 18. Relación de péptidos A\beta_{(1-42)}/A\beta_{(11-42)} medida en muestras de CSF obtenidas de individuos que su-frían AD e individuos de control.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos para la predicción, diagnosis y diagnosis diferencial de AD. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para determinar si un individuo que no presenta signo clínico alguno de AD tiene probabilidad de desarrollar AD. El método de la invención comprende los pasos
siguientes:

(a)

Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

(b)

comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signos clínicos de AD y que más tarde desarrollaron AD, y con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signos clínicos de AD y que no desarrollaron AD;

(c)

determinar, a partir de la comparación realizada en el paso (b), si el individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signos clínicos de AD y que más tarde desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo tiene probabilidad de desarrollar AD; y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signos clínicos de AD y que no desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo no tiene probabilidad de desarrollar AD.

La presente invención está basada en el descubrimiento de que esta relación x/y, como se ha definido arriba, estaba significativamente disminuida en las muestras de fluido corporal obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, comparada con esta relación x/y en muestras de fluido corporal obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD. La indicación de que esta relación x/y está alterada significativamente en las muestras de fluido corporal de los individuos que desarrollaron AD constituye la base para el desarrollo de un test de diagnóstico para determinar si un individuo tiene probabilidad de desarrollar AD. En el momento actual, la delimitación del protuberancia de enfermedad con respecto al "envejecimiento normal" es todavía difícil. La diagnosis precoz de un protuberancia de enfermedad, antes que se presenten signos clínicos de demencia, es, sin embargo, sumamente deseable, dado que la terapia modificadora de la enfermedad alcanza probablemente su máxima eficacia en los primeros estadios del curso de la enfermedad.

El individuo sometido a diagnosis en el método anterior puede ser cualquier individuo que no presenta signos clínicos de demencia. El individuo sometido a diagnosis puede ser un individuo no humano tal como (pero sin carácter limitante) una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un caballo, un mono, un conejo, una liebre, un pollo, un perro, un gato, un ratón, una rata, un alce, un ciervo, un tigre, un pez cebra, un pez globo, una mosca, un gusano o C. elegans. Más preferiblemente, el individuo es un primate. Todavía más preferiblemente, el individuo es un humano. En una realización preferida, el individuo es un humano que no presenta signo clínico alguno de AD de acuerdo con los criterios NINCDS-ADRDA (McKhann et al., 1984), los criterios ICD-10 (Organización Mundial de la Salud, 1992), y/o los criterios DSM-IV (American Psychiatric Association, 1994). El término "AD" debe entenderse como enfermedad de Alzheimer.

El método anterior puede realizarse sobre muestras de fluido corporal obtenidas de individuos que, además de la ausencia de signos clínicos de demencia o AD, no presentan signo clínico alguno de deterioro de la memoria o MCI. Sin embargo, en una realización preferida de la invención, el método anterior se lleva a cabo sobre muestras de fluido corporal obtenidas de individuos que sufren deterioro de la memoria o individuos que sufren MCI. La diagnosis clínica del deterioro de memoria y MCI se realiza actualmente de acuerdo con Petersen et al. (1999), Palmer et al. (2003) y/o Wahlund et al. (2003).

En la presente invención, los términos "desarrollo de AD", "progreso a AD", "presentarán AD", etc. se utilizan intercambiablemente y significan que el individuo en el momento de la toma de muestra del fluido corporal (sobre el cual se realiza el método de la presente invención), no presenta signo clínico alguno de AD, pero que dicho individuo presenta signos clínicos de AD dentro de un periodo de como máximo 5 años, preferiblemente como máximo 3 años, y muy preferiblemente dentro de 1 año después de la toma de muestra de dicho fluido corporal. Los términos "probabilidad", "riesgo", "susceptibilidad", "predisposición", "prognosis" o "predicción" son intercambiables y se utilizan con respecto a la probabilidad de desarrollo de AD.

La presente invención se refiere también a un método para la diagnosis de un individuo que sufre AD y/o para la diagnosis diferencial de individuos que sufren AD frente a individuos que sufren otras demencias tales como DLB. El método de la invención comprende los pasos siguientes:

(a)

Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

(b)

comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como pacientes de AD, con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control, y con un intervalo de relaciones x/y definidas previamente como características de muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como enfermos de otra demencia tal como DLB;

(c)

determinar, a partir de la comparación realizada en el paso (b), si el individuo sufre o no AD u otra demencia tal como DLB, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como pacientes de AD es una indicación de que dicho individuo sufre AD; en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control es una indicación de que dicho individuo no sufre AD; y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como enfermos de otra demencia tal como DLB es una indicación de que dicho individuo sufre otra demencia tal como DLB.

El método anterior está basado en el descubrimiento de que las relaciones x/y, como se han definido arriba, en muestras de fluido corporal obtenidas de individuos que sufren AD están reducidas significativamente en comparación con las relaciones x/y en muestras de fluido corporal obtenidas de individuos de control y de individuos que sufren DLB. La indicación de que la relación x/y en muestras de fluido corporal obtenidas de individuos que sufren AD está alterada significativamente en comparación con la relación x/y en muestras de fluido corporal obtenidas de individuos de control y de individuos que sufren DLB constituye la base del desarrollo de un test de diagnóstico para la diagnosis de AD y/o la diagnosis diferencial de AD frente a otras demencias tales como DLB. El término "diagnosis" significa que los individuos que sufren cierta enfermedad neurológica se discriminan de los individuos que no sufren dicha enfermedad neurológica. En la presente invención, los individuos que sufren AD se discriminan de los individuos de control. El término "diagnosis diferencial" significa que los individuos que sufren cierta enfermedad neurológica se discriminan de los individuos que sufren otra enfermedad neurológica. En la presente invención, los individuos que sufren AD se discriminan de los individuos que sufren otra demencia tal como DLB. Aunque actualmente están disponibles criterios para la diagnosis de AD (McKhann et al., 1984; Organización Mundial de la Salud, 1992; American Psychiatric Association, 1994) y otras demencias tales como DLB (McKeith, 1996), los mismos pueden carecer de detalle suficiente para discriminar estas demencias tales como DLB respecto a AD (McKeith, 2002). La diferenciación de los individuos que sufren AD respecto de los individuos que sufren DLB sigue siendo un problema muy importante. Finalmente, sólo la autopsia puede diferenciar inequívocamente entre los diversos trastornos demenciales. Teniendo en cuenta las aplicaciones terapéuticas potencialmente diferentes para los individuos que sufren AD y los individuos que sufren DLB, esta diferenciación es, sin embargo, de importancia extremada. El método de la presente invención proporciona una herramienta adicional en la diagnosis diferencial de los individuos que sufren AD frente a los individuos que sufren DLB. El término "DLB" debe entenderse como demencia con cuerpos de Lewy.

El individuo sometido a diagnosis en el método anterior puede ser cualquier individuo que presente signos clínicos de demencia. El individuo sometido a diagnosis puede ser un individuo no humano tal como (pero sin carácter limitante), una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un caballo, un mono, un conejo, una liebre, un perro, un gato, un ratón, una rata, un alce, un ciervo o un tigre. Más preferiblemente, el individuo es un primate. Todavía más preferiblemente, el individuo es un humano. Los individuos de control son individuos sin historias, síntomas o signos de enfermedad psiquiátrica o neurológica.

Los métodos de la presente invención están basados en la detección de la relación x/y en muestras de fluidos corporales obtenidas del individuo sometido a diagnosis. El término "fluido corporal" hace referencia a todos los fluidos que están presentes en el cuerpo, con inclusión pero sin carácter limitante de sangre, linfa, orina, y fluido cerebroespinal (CSF), que contienen péptidos A\beta. La muestra de sangre puede ser una muestra de plasma o una muestra de suero. Podría ser posible también que x se determine en una muestra de cierto fluido corporal mientras y se determina en una muestra de un fluido corporal distinto. Sin embargo, en una realización preferida, x e y se determinan en la misma muestra de fluido corporal. En una realización preferida de la presente invención, la relación x/y se determina en una muestra de fluido cerebroespinal tomada del individuo. El término "fluido cerebroespinal" o "CSF" tiene por objeto incluir fluido cerebroespinal entero o derivados de fracciones del mismo bien conocidos por los expertos en la técnica. Así, una muestra de fluido cerebroespinal puede incluir diversas formas fraccionadas de fluido cerebroespinal o puede incluir diversos diluyentes añadidos para facilitar el almacenamiento o el procesamiento en un ensayo particular. Tales diluyentes son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen diversos tampones, conservantes, y análogos.

Dentro de la relación x/y de la presente invención, el numerador (x) se define como el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. Dentro de la relación x/y de la presente invención, el denominador (y) se define como el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. Los términos péptido A\beta, A\beta, péptido amiloide \beta, o péptido A4 se utilizan intercambiablemente a lo largo de la presente invención, y hacen referencia a un péptido de 37-43 aminoácidos (A\beta_{37}, A\beta_{38}, A\beta_{39}, A\beta_{40}, A\beta_{41}, A\beta_{42} o A\beta_{43}), que es el componente principal de las placas características de la enfermedad de Alzheimer. A\beta se genera por procesamiento de una proteína APP mayor por dos enzimas, denominadas secretasas \beta y \gamma (Figura 1; Haass et al. 1992; Seubert et al. 1992). La secuencia del péptido A\beta_{42} es la siguiente:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

(SEQ ID NO 1)

A\beta_{41}, A\beta_{40}, A\beta_{39}, A\beta_{38} y A\beta_{37} difieren de A\beta_{42} por la omisión de Ala (A), Ile-Ala (IA), Val-Ile-Ala (VIA), Val-Val-Ile-Ala (VVIA) y Gly-Val-Val-Ile-Ala (GVVIA) respectivamente, del extremo C-terminal. A\beta_{43} difiere de A\beta_{42} por la presencia de un residuo treonina en el término C. En los métodos de la presente invención, se detectan péptidos A\beta con cualquier extremo C-terminal. En una realización preferida de la presente invención, se determina el nivel de péptidos A\beta que terminan en Ala42 (A\beta_{42}) y/o Thr43 (A\beta_{43}). En otra realización preferida, se determina el nivel de péptidos A\beta que terminan en Ala42 (A\beta_{42}). Los péptidos A\beta que se detectan en los métodos de la presente invención pueden incluir también péptidos isomerizados. La isomerización del enlace ácido aspártico ha sido descrita, por ejemplo, por Szandrei et al. (1996). Los péptidos A\beta que se detectan en los métodos de la presente invención (x e y) se denominan también "péptido A\beta específico" o "péptidos A\beta específicos" y se refieren a péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un cierto epítope del péptido A\beta. El término "capaz de formar un complejo inmunológico con", "que reconoce (específicamente)", "que se une (específicamente) con", "que reacciona (específicamente) con", o "que forma (específicamente) una reacción inmunológica con" hace referencia a una reacción de unión por el anticuerpo al péptido A\beta específico que es determinante de la presencia de dicho péptido A\beta específico en la muestra en presencia de una población heterogénea de otros péptidos, proteínas, y/u otros materiales biológicos. Así, en las condiciones diseñadas del inmunoensayo, el anticuerpo especificado se une preferentemente al péptido A\beta específico, mientras que la unión a otros péptidos o proteínas no ocurre en cantidades significativas. La unión de un anticuerpo a un péptido A\beta depende del epítope disponible en dicho péptido A\beta. El término "epítope" hace referencia a aquella porción del antígeno (es decir el péptido A\beta) que es unida específicamente por un sitio de combinación de anticuerpo. Los epítopes pueden determinarse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica o pueden predecirse por una diversidad de modelos de predicción por ordenador conocidos en la técnica. Para el numerador de la relación x/y (x), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado debería contener el primer aminoácido (D, ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. En una realización preferida, dicho epítope debería contener el primer aminoácido (D; ácido aspártico), del péptido A\beta. De acuerdo con ello, en esta realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), del péptido A\beta. Ejemplos de anticuerpos que reconocen un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), del péptido A\beta incluyen (pero sin carácter limitante) el anticuerpo monoclonal 3D6, el anticuerpo monoclonal BAN-50 y el anticuerpo monoclonal Anti-N1(D) (Tabla 1). De acuerdo con ello, en una realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50, y/o
Anti-N1(D).

Para el denominador de la relación x/y (y), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado puede no contener el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

En una realización preferida, para el numerador (x), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta y, para el denominador (y), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado puede no contener el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. De acuerdo con ello, en esta realización preferida, y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. Dicho epítope debería ser por tanto diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o anti-N1(D), e y es por tanto el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o Anti-N1(D). Ejemplos de tales anticuerpos que reconocen un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta incluyen (pero sin carácter limitante) los anticuerpos dados en la Tabla 1. Anticuerpos preferidos incluyen 4G8, 6E10, y 10H3. De acuerdo con ello, en una realización preferida, y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal 4G8, con el anticuerpo monoclonal 6E10, y/o con el anticuerpo monoclonal 10H3.

En otra realización, para el numerador (x), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado contiene el segundo aminoácido (A; alanina) del péptido A\beta y, para el denominador (y), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado puede no contener el primer aminoácido (D; ácido aspártico) y el segundo aminoácido (A; alanina) del péptido A\beta. De acuerdo con ello, en esta realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el segundo aminoácido (A; alanina) del péptido A\beta, e y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) y el segundo aminoácido (A; alanina) del péptido A\beta.

En otra realización, para el numerador (x), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado contiene el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta y, para el denominador (y), el epítope reconocido por el anticuerpo que es capaz de unión con el "péptido A\beta específico" detectado puede no contener el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. De acuerdo con ello, en esta realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta e y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

Los péptidos A\beta específicos detectados en el numerador (x) de la relación x/y son capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. Dichos péptidos A\beta específicos deberían por tanto contener al menos un primer aminoácido (D; ácido aspártico), segundo aminoácido (A; alanina), y/o tercer amino-ácido (E; ácido glutámico) de los péptidos A\beta que está accesible para dicho anticuerpo. "Accesible" significa que dicho anticuerpo es capaz de formar un complejo inmunológico con dicho epítope que contiene el primer amino- ácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

Los péptidos A\beta específicos detectados en el denominador (y) de la relación x/y son capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer amino-ácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. Dichos péptidos A\beta específicos carecen por tanto de un primer aminoácido accesible (D; ácido aspártico), segundo aminoácido (A; alanina), y/o tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. Esta falta de accesibilidad podría estar causada, por ejemplo, por la formación de agregados u oligómeros por dichos péptidos A\beta específicos en donde el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta están enmascarados y por tanto ya no son accesibles. Un A\beta agregado se identifica como una mezcla de oligómeros en la cual las unidades monómeras se mantienen unidas por enlaces no covalentes. La falta de un primer aminoácido (D; ácido aspártico), segundo aminoácido (A; alanina), y/o tercer aminoácido (E; ácido glutámico) accesible del péptido A\beta puede estar causada también por la presencia de modificaciones en el extremo N-terminal del péptido A\beta. La modificación en el extremo N-terminal del péptido A\beta puede impedir la accesibilidad del epítope que comprende el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. Un ejemplo de una modificación de este tipo incluye (pero sin carácter limitante) acetilación.

La falta de un primer aminoácido (D; ácido aspártico), segundo aminoácido (A; alanina), y/o tercer aminoácido (E; ácido glutámico) accesible del péptido A\beta puede estar causada también por la simple deleción de dichos aminoácidos N-terminales, dando como resultado péptidos A\beta truncados en el terminal N. Los péptidos A\beta truncados en el terminal N pueden comenzar su secuencia de aminoácidos en el aminoácido 2 (A; alanina), 3 (E; ácido glutámico), 4 (F; fenilalanina), 5 (R; arginina), 6 (H; histidina), 7 (D; ácido aspártico), 8 (S; serina), 9 (G; glicina), 10 (Y; tirosina), 11 (E; ácido glutámico), 12 (V; valina), 13 (H; histidina), 14 (H; histidina), 15 (Q; glutamina), 16 (K; lisina), o 17 (L; leucina) del péptido A\beta. Algunos de los péptidos A\beta truncados en el terminal N que han sido identificados en células, cerebros y/o CSF humanos y animales se muestran en la Tabla 2. En esta realización específica, en donde la falta de un epítope accesible está causada por la deleción de uno o más aminoácidos del terminal N, x puede ser el nivel de péptidos A\beta que comprenden dichos aminoácidos N-terminales de A\beta, denominados también A\beta_{(1-C)}, en donde C significa cualquier extremo posible del terminal C (véase arriba). Preferiblemente, C puede ser 42 y/o 43, y x es por tanto el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} y/o A\beta_{(1-43)}. Más preferiblemente, se detectan péptidos A\beta que terminan en Ala42, es decir A\beta_{(1-42)}, y x es por tanto el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)}. En la misma realización específica (en la cual la falta de un epítope accesible está causada por la deleción de uno o más aminoácidos N-terminales), los péptidos A\beta específicos detectados en el denominador (y) de la relación x/y son entonces cualquier péptido A\beta, que comience en cualquier aminoácido del péptido A\beta, al que se hace referencia como A\beta_{(N-C)}, en donde N significa cualquier extremo posible del terminal N (es decir, el aminoácido 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ó 17 de A\beta). Como se ha indicado arriba, preferiblemente, C puede ser 42 y/o 43, e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)} y/o A\beta_{(N-43)}. Más preferiblemente, se detectan péptidos que terminan en Ala42 de A\beta, es decir A\beta_{(N-42)}. De acuerdo con ello, en estas realizaciones preferidas, x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} y/o A\beta_{(1-43)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)} y/o A\beta_{(N-43)}. En otra realización preferida, x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)}. En otra realización preferida, N es 11 e y es el nivel de péptidos A\beta_{(11-C)}. Preferiblemente, y es el nivel de péptidos A\beta_{(11-42)} y/o A\beta_{(11-43)}. Más preferiblemente, y es el nivel de A\beta_{(11-42)}.

El término "nivel" o "niveles", como se utiliza en la presente invención, hace referencia a la cantidad de péptido A\beta específico presente en la muestra de fluido corporal. Los niveles de péptido A\beta específico (x e y) obtenidos por análisis de las muestras de fluido corporal y su relación x/y dependerán del protocolo analítico particular y la técnica de detección que se utilice. De acuerdo con ello, los expertos en la técnica comprenderán que cualquier laboratorio, basado en la presente descripción, puede establecer un intervalo de referencia adecuado para la relación x/y, característico (1) para el grupo de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentan signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrolla AD, (2) para el grupo de individuos que en el momento de la toma de muestra no presenta signo clínico alguno de AD y que más tarde no desarrolla AD, (3) para el grupo de individuos que sufren AD, (4) para el grupo de individuos de control y (5) para el grupo de individuos que sufren otra demencia tal como DLB. La relación x/y obtenida para el individuo objeto de diagnosis puede compararse luego con estos intervalos de referencia y, basándose en esta comparación, puede llegarse a una conclusión en cuanto al grupo de los anteriores al que podría pertenecer el individuo objeto de diagnosis.

Los niveles de los péptidos A\beta específicos pueden determinarse por cualquier método conocido por los expertos en la técnica. Los mismos pueden identificarse por su estructura, por determinación de su secuencia parcial de aminoácidos, por ensayo funcional, por ensayo enzimático, por diversos métodos inmunológicos, o por métodos bioquímicos tales como electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de hiperdifusión, electroforesis bidimensional en fase líquida (2D-LPE; Davidsson et al., 1999), o por su patrón de migración en las electroforesis en gel. La electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) es un método ampliamente utilizado para separar proteínas a partir de mezclas complejas (Patterson y Aebersold, 1995). La misma puede realizarse en una configuración mono- o bidimensional (2D). El análisis simultáneo de diferentes variantes de péptidos A\beta es proporcionado por el Sistema Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization (SELDI) ProteinChip^{TM} (Ciphergen Biosystems Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.; Davies et al., 1999; Austen et al., 2000). En una realización preferida, el nivel de péptido A\beta específico se detecta por un inmunoensayo. Como se utiliza en esta memoria, un "inmunoensayo" es un ensayo que utiliza un anticuerpo que se une específicamente al antígeno (a saber, el péptido A\beta específico). Así pues, el inmunoensayo se caracteriza por detección de la unión específica del péptido A\beta específico a anticuerpos. Los inmunoensayos para detectar péptidos A\beta específicos pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los cuales se mide directamente la cantidad de analito capturado (es decir, el péptido A\beta específico). En los ensayos competitivos, la cantidad de analito (es decir, el péptido A\beta específico) presente en la muestra se mide indirectamente por medida de la cantidad de un analito añadido (exógeno) desplazada (o eliminada de la competencia) por un agente de captura (es decir, el anticuerpo) por el analito (es decir, el péptido A\beta específico) presente en la muestra. En un ensayo de competencia, se añade a la muestra una cantidad conocida del péptido A\beta específico (exógeno) y la muestra se pone luego en contacto con el anticuerpo. La cantidad de péptido A\beta específico (exógeno) añadido unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración del péptido A\beta específico en la muestra antes de la adición del péptido A\beta específico. En un ensayo "sándwich" preferido, por ejemplo, los anticuerpos pueden unirse directamente a un sustrato sólido en el cual se inmovilizan. Estos anticuerpos inmovilizados (anticuerpos de captura) capturan luego el péptido A\beta específico de interés presente en la muestra de test. Otros métodos inmunológicos incluyen, pero sin carácter limitante, reacciones de precipitación fluida o en gel, inmunodifusión (simple o doble), ensayos de aglutinación, inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA), transferencias Western, inmunoensayos con liposomas (LIA; Monroe et al., 1986), ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos de proteína A, o inmunoPCR. Una revisión de diferentes inmunoensayos se da en Wild (2001), Ghindilis et al. (2002) y Price y Newman (1997). Son particularmente ventajosos sistemas en los cuales los niveles de los diferentes péptidos A\beta, o los niveles de los péptidos A\beta específicos, posiblemente junto con otros marcadores biológicos, pueden detectarse simultáneamente. En este enfoque multiparamétrico, los anticuerpos pueden estar acoplados a microesferas o chips. Un ejemplo de un inmunoensayo que proporciona dicha detección simultánea incluye (pero sin carácter limitante) la tecnología xMap^{TM} (Luminex 100 IS, Austin, Texas,
EE.UU.).

En una realización preferida, el nivel del péptido A\beta específico se determina por un inmunoensayo que comprende al menos los pasos siguientes:

(a)

poner en contacto los péptidos A\beta específicos con un anticuerpo que reconoce específicamente el péptido A\beta específico, en condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y

(b)

detectar la unión inmunológica que ha tenido lugar entre el anticuerpo y el péptido A\beta específico.

En los métodos de la presente invención, la relación x/y se determina por tanto inmunológicamente haciendo uso de dos anticuerpos (un juego de anticuerpos), a saber un primer anticuerpo (que detecta x) que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta y un segundo anticuerpo (que detecta y) que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

En otra realización preferida, el péptido A\beta específico puede detectarse por un ELISA sándwich que comprende los pasos siguientes:

(a)

poner dicho péptido A\beta específico en contacto con un anticuerpo (anticuerpo de captura) que reconoce dicho péptido A\beta específico, en condiciones que son adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo;

(b)

poner el complejo formado entre dicho péptido A\beta específico y dicho anticuerpo de captura en contacto con otro anticuerpo (anticuerpo detector) que reconoce específicamente dicho péptido A\beta específico o dicho complejo anticuerpo de captura-péptido A\beta, en condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo;

(c)

poner el complejo antígeno-anticuerpo en contacto con un marcador o etiqueta, sea para direccionamiento específico o acoplamiento con dicho anticuerpo detector, siendo dicho marcador cualquier marcador posible conocido por las personas expertas en la técnica;

(d)

posiblemente también, para propósitos de estandarización, poner los anticuerpos en contacto con un péptido A\beta específico purificado que es reactivo con ambos anticuerpos.

Ventajosamente, el propio anticuerpo detector lleva un marcador o un grupo para acoplamiento directo o indirecto con un marcador.

En el método de la presente invención, la relación x/y puede determinarse por tanto inmunológicamente haciendo uso de dos anticuerpos de captura (o un juego de anticuerpos), a saber un primer anticuerpo (de captura) (que detecta x) que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta y un segundo anticuerpo (de captura) (que detecta y) que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. En una realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. En otra realización preferida, el primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50, o Anti-N1(D), y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta. En otra realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta, y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. En otra realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. En otra realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50, o anti-N1(D), y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer anticuerpo (D; ácido aspártico) del péptido A\beta. En otra realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta, y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o Anti-N1(D). En otra realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), del péptido A\beta, y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o Anti-N1(D). En otra realización preferida de la presente invención, el primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50 o Anti-N1(D), y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o Anti-N1(D). Cualquier anticuerpo que reconoce específicamente los péptidos A\beta específicos objeto de examen puede utilizarse en el método anterior. Ejemplos de anticuerpos conocidos en la técnica se proporcionan en la Tabla 1.

El anticuerpo detector a utilizar en el ELISA sándwich como se ha expuesto anteriormente, puede ser cualquier anticuerpo que reconoce un epítope en el péptido A\beta o en el complejo péptido A\beta-anticuerpo de captura, no enmascarado por el anticuerpo de captura. Ejemplos de anticuerpos que pueden utilizarse como anticuerpo detector se dan en la Tabla 3. En una realización preferida, se detectan péptidos A\beta que terminan en Ala42 (es decir A\beta_{42}) o Thr43 (es decir A\beta_{43}) con un anticuerpo que reconoce específicamente A\beta_{42} y/o A\beta_{43}. En otra realización preferida, se detectan péptidos A\beta que terminan en Ala42 (es decir A\beta_{42}).

Es evidente que, en el ELISA sándwich de la presente invención, los anticuerpos de captura y detector podrían intercambiar su lugar. Así, el primer y el segundo anticuerpo como se ha expuesto anteriormente, podrían utilizarse también como anticuerpo detector, cuando se utiliza como anticuerpo de captura un anticuerpo que reconoce un epítope en el péptido A\beta diferente del epítope reconocido por estos anticuerpos primero y/o segundo.

Los anticuerpos que se han expuesto anteriormente pueden utilizarse en la preparación de un kit de diagnóstico para uso en los métodos de la presente invención. De acuerdo con ello, la presente invención se refiere a un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo (un juego de anticuerpos) como se ha expuesto anteriormente, para la fabricación de un kit de diagnóstico para determinar si un individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, para la diagnosis de un individuo que sufre AD y/o para la diagnosis diferencial de un individuo que sufre AD frente a un individuo que sufre otra demencia tal como DLB.

Como se utiliza en la presente invención, un "anticuerpo" hace referencia a una proteína constituida por uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los genes de región variable de un sinnúmero de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, las cuales definen a su vez las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Se sabe que la unidad estructural básica de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero o dímero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, responsables fundamentalmente del reconocimiento de antígeno. Los términos "cadena ligera variable (V_{L})" y "cadena pesada variable (V_{H})" hacen referencia respectivamente a estas regiones variables de las cadenas ligera y pesada. Opcionalmente, el anticuerpo o la porción inmunológica del anticuerpo puede estar conjugado(a) químicamente a, o expresado como, una proteína de fusión con otras proteínas.

Los anticuerpos utilizados en la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanos, humanizados, o quiméricos, fragmentos variables simples (ssFv), fragmentos de cadena simple (scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotípicos, y fragmentos de unión de epítope de cualquiera de los anteriores, con tal que los mismos retengan las propiedades de unión originales. Asimismo pueden utilizarse en un método de la invención mini-anticuerpos y anticuerpos multivalentes tales como diacuerpos, triacuerpos, anticuerpos tetravalentes y peptacuerpos. La preparación y uso de estos fragmentos y anticuerpos multivalentes ha sido descrita extensamente en la Solicitud de Patente Internacional WO 98/29442. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier clase (a saber, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

Los péptidos A\beta específicos detectados en la presente invención pueden utilizarse como inmunógeno para generar los anticuerpos utilizados en la invención que se unen específicamente a un inmunógeno de este tipo. Pueden inmunizarse diversos animales hospedadores para inyección con dichos péptidos A\beta específicos, con inclusión, pero sin carácter limitante, de conejos, ratones, ratas, etc. Pueden utilizarse diversos adyuvantes para mejorar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyendo pero sin carácter limitante, adyuvante de Freund completo o incompleto, un gel mineral tal como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, poliol Pluronic, un polianión, un péptido, una emulsión de aceite, hemocianina de lapa bocallave, dinitrofenol, o un adyuvante tal como BCG (bacilo Calmette-Guerin), o Corynebacterium parvum. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede utilizarse cualquier técnica que haga posible la producción de moléculas de anticuerpo por líneas continuas de células en cultivo. Se ha emprendido la hiperinmunización de un donante apropiado, generalmente un ratón, con el antígeno. Se lleva a cabo luego el aislamiento de células esplénicas productoras de anticuerpos. Estas células se fusionan a una célula caracterizada por inmortalidad, tal como una célula de mieloma, para proporcionar un híbrido de células fusionado (hibridoma) que puede mantenerse en cultivo y que secreta el anticuerpo monoclonal requerido. Las células se cultivan luego en masa y los anticuerpos monoclonales se cosechan del medio de cultivo para su utilización. Técnicas específicas incluyen, pero sin carácter limitante, la técnica del hibridoma desarrollada por Kohler y Milstein (1975), la técnica del hibridoma de las células B humanas (Kozbor et al., 1983), o la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985). El cribado para el anticuerpo deseado puede realizarse por métodos conocidos en la técnica, tales como ELISA. Para selección de un anticuerpo que se une específicamente a un péptido A\beta específico, pero que no se une específicamente a otra proteína, la selección puede hacerse sobre la base de unión positiva al primero y ausencia de unión a la segunda.

Si bien se definen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de digestión enzimática de un anticuerpo intacto con papaína, pepsina u otras proteasas, un experto en la técnica apreciará que tales fragmentos de anticuerpo así como anticuerpos enteros pueden sintetizarse de novo químicamente o por utilización de metodología del DNA recombinante. Así pues, el término anticuerpo, tal como se utiliza en esta memoria, incluye también anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, o bien producidos por la modificación de anticuerpos enteros o sintetizados d de novo utilizando metodologías de DNA recombinante. El término "anticuerpo humanizado" significa que al menos una porción de las regiones de entramado de una inmunoglobulina se deriva de secuencias de inmunoglobulina humanas. Las versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales de ratón pueden producirse, por ejemplo, por medio de tecnología de DNA recombinante, partiendo de las secuencias de DNA genómico de ratón y/o humanas que codifican cadenas H y L o de clones de cDNA que codifican cadenas H y L. Formas humanizadas de anticuerpos de ratón pueden generarse enlazando las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas por técnicas de DNA recombinante (Queen et al., 1989; WO 90/07861). Alternativamente, los anticuerpos monoclonales utilizados en el método de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales humanos. Pueden obtenerse anticuerpos humanos, por ejemplo, utilizando métodos de presentación de fago (WO 91/17271; WO 92/01047). En estos métodos, se producen genotecas de fago en las cuales los miembros presentan anticuerpos diferentes en sus superficies externas. Los anticuerpos se presentan usualmente como fragmentos Fv o Fab. Pueden producirse también anticuerpos humanos contra péptidos A\beta específicos a partir de mamíferos transgénicos no humanos que llevan transgenes que codifican al menos un segmento del locus de inmunoglobulina humana y un locus de inmunoglobulina endógeno desactivado (WO 93/12227; WO 91/10741). Anticuerpos humanos pueden seleccionarse por experimentos competitivos de unión, o que tienen de cualquier otro modo la misma especificidad de epítope que un anticuerpo particular de ratón. De modo particularmente probable, tales anticuerpos compartirán las propiedades funcionales útiles de los anticuerpos de ratón. Pueden proporcionarse también anticuerpos policlonales humanos en la forma de suero de humanos inmunizados con un agente inmunógeno. Opcionalmente, tales anticuerpos policlonales pueden concentrarse por purificación de afinidad utilizando péptidos A\beta específicos como reactivo de afinidad. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales a partir de suero de acuerdo con la técnica descrita en WO 99/60846. También podrían ser útiles en los métodos anteriores los dominios variables de cadena pesada (VHH) producidos como parte de la respuesta humoral inmune de Camélidos. VHH recombinantes seleccionados de genotecas de VH humanas "camelizadas" podrían constituir ligandos excelentes para la detección de los péptidos A\beta específicos de la presente invención (Spinelli et al., 2000; Muyldermans, 2001; Cortez-Retamozo et al., 2002).

Los anticuerpos utilizados en los métodos de la presente invención pueden estar etiquetados por un marcador o etiqueta apropiado(a). La etiqueta o grupo detectable particular utilizado(a) en el ensayo no constituye un aspecto crítico de la invención, con tal que el mismo no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo utilizado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Tales etiquetas detectables han sido desarrolladas perfectamente en el campo de los inmunoensayos y, en general, prácticamente cualquier etiqueta útil en tales métodos puede aplicarse a los métodos de la presente invención. Así, una etiqueta es cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, radiológicos o químicos. Etiquetas útiles en la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, perlas magnéticas (v.g. Dynabeads^{TM}), tintes fluorescentes (v.g. isotiocianato de fluoresceína), Rojo Texas, rodamina, ficoeritrina, Alexa 532, cianina 3), radiomarcadores (v.g. ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{32}P, enzimas (v.g. peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, y otros utilizados comúnmente en un ELISA), y etiquetas colorimétricas tal como oro coloidal, vidrio coloreado, o plásticos (v.g., poliestireno, polipropileno, látex, etc.) en perlas.

La etiqueta puede acoplarse directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Como se ha indicado arriba, pueden citarse una gran diversidad de etiquetas, dependiendo la elección de la etiqueta de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requerimientos de estabilidad, la instrumentación disponible y las disposiciones de eliminación. Las etiquetas no radiactivas se fijan a menudo por medios indirectos. Generalmente, una molécula de ligando (v.g. biotina) se une covalentemente al anticuerpo. El ligando se une luego a una molécula de anti-ligando (v.g., estreptavidina), que o bien es inherentemente detectable o se une covalentemente a un sistema de señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Pueden utilizarse cierto número de ligandos y anti-ligandos. En el caso en que un ligando tiene un anti-ligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina, y cortisol, puede utilizarse el mismo en asociación con el o los anti-ligandos etiquetados existentes naturalmente. Alternativamente, puede utilizarse un compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo. Los anticuerpos pueden conjugarse también directamente a compuestos generadores de señal; por ejemplo, por conjugación con una enzima o un fluoróforo. Enzimas de interés como etiquetas serán principalmente hidrolasas, especialmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidorreductasas, especialmente peroxidasas. Compuestos fluorescentes incluyen fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, umbeliferona, etc. Compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol. Una reseña de otro sistema de etiquetado o producción de señal está disponible en la patente U.S. No. 4.391.904.

Medios para detección de etiquetas son bien conocidos en la técnica. Así, por ejemplo, en el caso en que la etiqueta es una etiqueta radiactiva, medios para detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como en la autorradiografía. En el caso en que la etiqueta es una etiqueta fluorescente, la misma puede detectarse por excitación del fluoróforo con la longitud de onda luminosa apropiada y detección de la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede detectarse visualmente, por medio de una película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos de carga acoplados (CCDs) o fotomultiplicadores, y análogos. De modo similar, pueden detectarse etiquetas enzimáticas mediante provisión de los sustratos apropiados para la enzima y detección del producto de reacción resultante. Finalmente, las etiquetas colorimétricas simples pueden detectarse por simple observación del color asociado con la etiqueta.

Algunos formatos de ensayo no requieren el uso de componentes etiquetados. Por ejemplo, pueden utilizarse ensayos de aglutinación para detectar la presencia de los anticuerpos diana. En este caso, partículas recubiertas de antígeno se aglutinan por medio de muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, ninguno de los componentes necesita estar etiquetado y la presencia del anticuerpo diana se detecta por simple inspección visual.

La presente invención proporciona también el uso de kits de diagnóstico que comprenden los anticuerpos a que se ha hecho referencia anteriormente. La invención proporciona por tanto el uso de un kit de diagnóstico para determinar si un individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, para la diagnosis de un individuo que sufre AD y/o para la diagnosis diferencial de un individuo que sufre AD frente a un individuo que sufre otra demencia tal como DLB, que comprende al menos un primer anticuerpo y un segundo anticuerpo (un juego de anticuerpos) como se ha expuesto anteriormente.

Un kit preferido para realización de los métodos de la presente invención comprende:

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un primer y un segundo anticuerpo (anticuerpos de captura) que forman un complejo inmunológico con los péptidos A\beta específicos a detectar;

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un anticuerpo (anticuerpo detector) que reconoce los péptidos A\beta específicos (o el complejo específico péptido A\beta-anticuerpo de captura) a detectar, y que no reconoce un epítope reconocido por el primer o segundo anticuerpo;

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un marcador o etiqueta para identificación o acoplamiento específico(a) con dicho anticuerpo detector;

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soluciones tampón apropiadas para realización de la reacción inmunológica entre el anticuerpo de captura y el péptido A\beta específico, entre el anticuerpo detector y el complejo anticuerpo de captura-péptido A\beta específico y/o entre el anticuerpo detector unido y el marcador o la etiqueta;

-

posiblemente, para propósitos de estandarización, péptidos A\beta específicos purificados.

La presente invención proporciona por tanto el uso de un primer y un segundo anticuerpo (un juego de anticuerpos) o un kit de diagnóstico, como se ha definido arriba, en la determinación de si un individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, para la diagnosis de un individuo que sufre AD y/o para uso en la diagnosis diferencial de un individuo que sufre AD frente a un individuo que sufre otra demencia tal como DLB.

En los métodos de la presente invención, la detección de al menos la relación x/y puede combinarse opcionalmente con la detección de uno o más biomarcadores adicionales conocidos para enfermedades neurológicas, con inclusión, pero sin carácter limitante, de otros péptidos A\beta, tau, fosfo-tau, sinucleína, Rab3a, citoquinas, glutamina-sintasa (GS) y proteína neural de hebras. La combinación de marcadores biológicos relevantes puede aumentar la sensibilidad y especificidad de la diagnosis. Los métodos de la invención pueden utilizarse también para confirmación ulterior de una diagnosis realizada previamente con uno o más marcadores biológicos distintos.

Los métodos, kits de diagnóstico y/o juegos de anticuerpos de la presente invención pueden utilizase también para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo, lo que se denomina también monitorización terapéutica o seguimiento del tratamiento, y gestión del paciente. De acuerdo con ello, la presente invención concierne también a los métodos que se han descrito arriba para uso en el seguimiento del tratamiento de un individuo que tiene probabilidad de desarrollar AD o de un individuo que ha sido diagnosticado como enfermo de AD. Los cambios en la relación x/y pueden utilizarse para evaluar la respuesta de un individuo al tratamiento con fármacos. De este modo pueden desarrollarse también nuevos regímenes de tratamiento por examen de la relación x/y en un individuo. El método de la presente invención puede servir de ayuda por tanto en la monitorización de un estudio clínico, por ejemplo, para evaluación de una cierta terapia para individuos con deterioro de la memoria, individuos con MCI o individuos que sufren AD. En este caso, se somete a test un compuesto químico respecto a su capacidad para normalizar la relación x/y en un individuo al que se ha diagnosticado desarrollo o padecimiento de AD.

Los métodos de la presente invención pueden utilizarse también en modelos animales o celulares, por ejemplo, para selección de fármacos. El modelo animal al que puede aplicarse el método de la presente invención puede ser cualquier modelo de un animal en el cual el sistema de control corporal está dirigido por un CNS. El animal puede pertenecer por tanto a los Platelmintos, Asquelmintos, Anélidos, Artrópodos, Moluscos, Equinodermos, Acranios, Ciclostomas, Condrictios, Osteíctios, Anfibios, Reptiles, Aves, y Mamíferos. En una realización preferida, el modelo animal es un ratón, una rata, un mono, un conejo, un gusano, una mosca, un pez cebra, un pez globo o C. elegans. En otra realización, el animal es un animal transgénico, modificado posiblemente por uno o más determinantes que causan AD. Modelos celulares a los cuales puede aplicarse el método de la presente invención pueden ser cualquier línea de células en la cual se exprese APP. Ejemplos incluyen cultivos primarios de neuronas que expresan APP como los descritos por De Jonghe et al. (2001), células CHO (de Ovario de Hámster Chino) transfectadas con APP humana de tipo salvaje o mutante y células de neuroblastoma humano (SKNSH-SY5Y) transfectadas con APP humana de tipo salvaje o mutante como se describe en WO 02/37118.

A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que el término "comprenden", y variaciones tales como "comprende" y "que comprenden" implica(n) la inclusión de un número entero o paso expresado o grupo de números enteros o pasos expresados, pero sin exclusión de ningún otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos.

La presente invención se ilustrará a continuación por referencia a los ejemplos que siguen, que exponen realizaciones particularmente ventajosas. No obstante, debe indicarse que estos ejemplos son ilustrativos y no pueden interpretarse como restrictivos de la invención en modo alguno.

Ejemplos Ejemplo 1 Mapeado de epítopes de los anticuerpos monoclonales utilizados en la presente invención 1. Determinación de las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales 3D6, 6E10 y 4G8 en ELISA

Tres anticuerpos de amiloide J3, 3D6 (Elan Pharmaceuticals, South San Francisco, CA, EE.UU.), 6E10 y 4G8 (Signet Laboratories, Dedham, MA, EE.UU.) se sometieron a test en ELISA respecto a unión inmunológica con diferentes péptidos de amiloide \beta truncados en su extremo N-terminal: A\beta_{(1-42)}, A\beta_{(2-42)}, A\beta_{(3-42)}, A\beta_{(4-42)}, A\beta_{(5-42)}, A\beta_{(8-42)} y A\beta_{(9-42)}. Los péptidos sintéticos se obtuvieron de Bachem (Heidelberg, Alemania), Neosystems (Strasbourg, Francia), o AnaSpec (San José, California, EE.UU.). El formato ELISA y sus características han sido descritos previamente en detalle (Vanderstichele et al., 2000). Resumidamente, se pre-recubrieron placas con el anticuerpo monoclonal 3D6, 6E10 o 4G8, específico para el término N de A\beta42, como anticuerpo de captura. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de muestra en blanco o muestra de péptido y se incubaron durante 3 horas. Después de varios pasos de lavado, se incubaron las placas durante 1 h con el anticuerpo monoclonal biotinilado 21F12, específico para el término carboxi de A\beta42. Los anticuerpos biotinilados se detectaron por medio de estreptavidina etiquetada con peroxidasa. Después del paso de lavado final, se añadió sustrato y se paró la reacción al cabo de 30 min por adición de ácido sulfúrico 0,2 N. La densidad óptica (DO) se midió a 450 nm.

La reactividad de 3D6, 6E10 y 4G8 con los diferentes péptidos A\beta truncados en el terminal N se muestra en las Figuras 7, 8 y 9 respectivamente. Las concentraciones de péptidos se han normalizado de acuerdo con la reactividad con el anticuerpo 4G8. 3D6 era reactivo únicamente con A\beta_{(1-42)}, lo que indica que 3D6 reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico). 6E10 reaccionaba con A\beta_{(1-42)}, A\beta_{(2-42)}, A\beta_{(3-42)}, A\beta_{(4-42)}, y A\beta_{(5-42)}. De acuerdo con ello, 6E10 reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer (D; ácido aspártico), el segundo (A; alanina) y el tercer aminoácido (E; ácido glutámico). 4G8 era reactivo con todos los péptidos A\beta ensayados. Por consiguiente, 4G8 debería reconocer un epítope de A\beta residente más allá del aminoácido 9. Los epítopes reconocidos por estos anticuerpos monoclonales se indican en la Figura 1.

2. Determinación de las especificidades de unión de los anticuerpos monoclonales 3D6, 6E10 y 4G8 en un inmunoensayo multiparamétrico

Los tres anticuerpos de amiloide \beta, 3D6, 6E10 y 4G8 se sometieron a test en un ensayo multiparamétrico para unión inmunológica con A\beta_{(1-42)} y A\beta_{(2-42)}. Los péptidos sintéticos se obtuvieron de Bachem (Heidelberg, Alemania), Neosystems (Strasbourg, Francia), o AnaSpec (San José, California, EE.UU.).

Se utilizó la tecnología xMAP^{TM} (Luminex, Austin, Texas, EE.UU.) para diseñar un ensayo multiparamétrico basado en perlas. Se acoplaron covalentemente 3D6, 6E10, y 4G8 sobre series de microesferas carboxiladas de acuerdo con un protocolo modificado suministrado por el fabricante. Resumidamente, se utilizó una mezcla de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC; Pierce Chemicals, Erembodegem, Bélgica) soluble en agua y N-hidroxi-sulfosuccinimida (Sulfo-NHS; Pierce Chemicals, Erembodegem, Bélgica) para activar los grupos carboxilo libres sobre las perlas. Los grupos amino de los anticuerpos se unieron luego covalentemente a los grupos carboxi de las microesferas. Las perlas acopladas al anticuerpo se contaron utilizando un hemocitómetro. Las microesferas acopladas se guardaron en la oscuridad a 2-8ºC.

Todas las incubaciones se realizaron a la temperatura ambiente (25ºC). Se pretrató primeramente una placa de filtración de 96 pocillos (Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.) con 250 \mul de tampón de lavado (PBS, 0,05% Tween 20). El tampón de lavado se retiró de las placas con un distribuidor de vacío (Millipore Corporation, Bruselas, Bélgica). Las microesferas acopladas se dejaron equilibrar a la temperatura ambiente durante al menos 15 min, después de lo cual se añadieron a la placa de filtración 100 \mul de microesferas tratadas por ultrasonidos (30.000 perlas/ml para cada parámetro), y a continuación se cubrieron las placas con lámina delgada de aluminio. Después de aspiración del tampón, se añadieron a los pocillos 50 \mul del anticuerpo detector biotinilado 21F12 (Innogenetics N.V., Gante, Bélgica) y 50 \mul de la muestra de péptido. La incubación se realizó durante una noche (16 horas) por agitación mediante sacudidas a la temperatura ambiente en un agitador de sacudidas orbital de placas a 1000 rpm. Los pocillos se lavaron 3 veces por aspiración con 300 \mul de tampón de lavado y se incubaron con 100 \mul de estreptavidina-ficoeritrina (Streptavidin-PE; Caltag, Burlingame, CA, EE.UU.; Sanbio, Uden, Países Bajos) durante 60 min en un agitador de sacudidas de placas. Los pocillos se lavaron de nuevo 3 veces por aspiración con tampón de lavado. Finalmente, se redisolvieron las microesferas en PBS. Se midió la intensidad de fluorescencia en el instrumento Luminex 100 utilizando la versión de software 2.1 para análisis.

La reactividad de 3D6, 6E10 y 4G8 con los péptidos A\beta_{(1-42)} y A\beta_{(2-42)} se muestra en la Figura 10. 3D6 era reactivo con A\beta_{(1-42)} pero no con A\beta_{(2-42)}. Esto confirma que 3D6 reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico). 6E10 y 4G8 reaccionaban con ambos péptidos A\beta_{(1-42)} y A\beta_{(2-42)}, confirmando que 6E10 y 4G8 reconocen un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico). Los epítopes reconocidos por estos anticuerpos monoclonales se indican en la Figura 1.

Ejemplo 2 Análisis de los péptidos A\beta que unen 3D6 y los péptidos A\beta que unen 4G8 o 6E10 en muestras de CSF obtenidas de individuos que sufren deterioro de la memoria o demencia 1. Individuos

Se realizó un estudio basado en muestras de CSF archivadas en el Hospital de la Universidad de Sahlgren, Göteborg, Suecia, que incluía 166 individuos. Para 12 muestras de CSF no se determinaron todos los parámetros. La exclusión de estos resultados parciales no afectaba al análisis final. Se exponen a continuación los resultados de 154 muestras, que incluían los grupos de pacientes siguientes: 18 pacientes con AD moderada (modAD), 21 pacientes con AD severa (sevAD), 20 pacientes con AD leve (mildAD), 39 pacientes con deterioro cognitivo, 12 pacientes que sufrían demencia con cuerpos de Lewy (DLB), 15 pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) y 29 individuos de control (C). Todos los pacientes con AD satisfacían los criterios NINCDS-ADRDA (McKhann et al., 1984). Para el grupo de pacientes con deterioro cognitivo, no se consignó o identificó síntoma alguno distinto del deterioro de la memoria, y ninguno de estos pacientes satisfacía los criterios DSM-IV para demencia. Dentro de un periodo de seguimiento de 5 años, 14 pacientes con deterioro cognitivo habían progresado a AD (Cog-AD) mientras que en 25 pacientes con deterioro cognitivo, los problemas de memoria no progresaron a AD (Cog). La DLB se diagnosticó de acuerdo con las directrices de Consenso para la diagnosis clínica y patológica de la demencia con cuerpos de Lewy (McKeith et al., 1996). Se incluyeron los pacientes de PD de acuerdo con Langston et al., (1992). El grupo de control (C) estaba constituido por individuos sin historias, síntomas, o signos de enfermedad psiquiátrica o neurológica, enfermedad maligna, o trastornos sistémicos (v.g. artritis reumatoide, enfermedad infecciosa).

El estudio fue aprobado por los Comités de Ética de la Universidad de Göteborg, Suecia. Todos los pacientes (o sus parientes más próximos) y los controles dieron su consentimiento informado para participar en el estudio, que fue conducido de acuerdo con las provisiones de la Declaración de Helsinki.

2. Toma de muestras

Se tomaron muestras de CSF utilizando cánulas atraumáticas localizadas en el espacio intervertebral L3/L4 o L4/L5 del individuo. Se recogieron 12 ml en tubos estériles de polipropileno y se mezclaron suavemente. Se centrifugó el CSF durante 10 minutos a 4000 g. Las muestras se enviaron al Laboratorio Clínico de Neuroquímica en el Hospital de la Universidad de Sahlgrens en Mölndal, Suecia. Después de su recepción, las muestras se dividieron en partes alícuotas y se guardaron congeladas a -80ºC. Las muestras se guardaron sin ser descongeladas y congeladas nuevamente. En el CSF nativo se realizó la determinación de los parámetros químicos de rutina, con inclusión de recuentos de leucocitos y hematíes así como medidas de glucosa y lactato, contenido total de proteínas, relaciones CSF-suero de albúmina e inmunoglobulina G, y un cribado para bandas oligoclonales. No se incluyeron en el estudio muestras del CSF si las mismas contenían más de 500 hematíes por \mul.

3. Inmunoensayo

Se determinaron los niveles x e y de péptidos A\beta específicos en las muestras de CSF utilizando la tecnología xMap^{TM} (Luminex 100IS, Austin, Texas, EE.UU.). Como anticuerpo de captura se utilizó el anticuerpo monoclonal 3D6 (Elan Pharmaceuticals, South San Francisco, CA, EE.UU.) para la detección de x, y se utilizaron los anticuerpos monoclonales 6E10 y 4G8 (Signet Laboratories, Dedham, MA, EE.UU.) para la detección de y. Como anticuerpo detector se utilizó el anticuerpo monoclonal 21F12 (Innogenetics N.V. Gante, Bélgica). El ensayo multiparamétrico se llevó a cabo como se ha descrito arriba. Las unidades Luminex se convirtieron en pg de equivalentes peptídicos/ml ELI-
SA utilizando el péptido amiloide _{(1-42)} sintético como estándar y un ajuste sigmoidal como modelo de ajuste de curvas.

4. Análisis estadístico

El análisis de los datos se basó en la representación gráfica por medio de gráficos en recuadro. Estos gráficos representan los valores de la mediana y el intervalo 25%-75% que abarca el 50% central de los puntos de datos para cada variable. Un respaldo adicional para la capacidad de una variable en cuanto a discriminar entre dos grupos es proporcionado por un test U formal de Mann-Whitney. Este test valora la hipótesis de que la suma de los rangos de los puntos de datos en cada grupo es la misma. Valores p significativos (< 0,05) rechazan esta hipótesis y proporcionan por tanto una evidencia sólida de la capacidad de discriminación de una variable entre los dos grupos. Los valores
P < 0,10 sugieren una tendencia para la capacidad de discriminación de una variable entre los dos grupos.

5. Discriminación de los individuos con deterioro de la memoria que progresarán a AD con respecto a pacientes con problemas de memoria prolongados

En la Figura 2 ([x]_{3D6}), la Figura 3 ([y]_{6E10}) y la Figura 4 ([y]_{4G8}), se muestran la mediana y el intervalo 25%-75% para los niveles x e y de péptidos A\beta específicos en las muestras de CSF de los diferentes grupos de individuos, utilizando 3D6, 6E10 y 4G8 como anticuerpo de captura, respectivamente. No puede observarse diferencia alguna en el nivel de los péptidos A\beta que se unían a 3D6 o péptidos A\beta que se unían a 6E10 o 4G8 entre los pacientes con deterioro cognitivo que progresaban a AD (Cog-AD) comparados con los pacientes con deterioro cognitivo que no desarrollaron AD (Cog). Los valores p del test U de Mann-Whitney eran 0,46, 0,23, y 0,15 para [x]_{3D6}, [y]_{6E10} e [y]_{4G8}, respectivamente.

En la Figura 5 ([x]_{3D6}/[y]_{6E10}) y la Figura 6 ([x]_{3D6}/[y]_{4G8}), se muestran la mediana y el intervalo 25%-75% para las relaciones x/y en las muestras de CSF de los diferentes grupos de individuos. Para esta relación, se observó una disminución clara en el caso de los pacientes con deterioro cognitivo que progresaban a AD (Cog-AD) en comparación con los pacientes con deterioro cognitivo que no progresaban a AD (Cog). Los valores p del test U de Mann-Whitney eran < 0,001 y < 0,001 para [x]_{3D6}/[y]_{6E10} y [x]_{3D6}/[y]_{4G8}, respectivamente. Esto demuestra que en una población de individuos con problemas de memoria, la relación x/y permite una discriminación excelente entre los individuos que desarrollan AD y los individuos con problemas de memoria prolongados que no desarrollan AD.

6. Discriminación de los individuos que sufren AD respecto a los individuos que sufren DLB

En las Figuras 2 ([x]_{3D6}), 3 ([y]_{6E10}) y 4 ([y]_{4G8}) se muestran la mediana y el intervalo 25%-75% para los niveles x e y de péptidos A\beta específicos en las muestras de CSF de los diferentes grupos de individuos utilizando 3D6, 6E10, y 4G8 como anticuerpo de captura, respectivamente. Si bien puede observarse una clara disminución en el nivel de péptidos A\beta que se unen a 3D6 entre los pacientes que sufren cualquier forma de AD (ModAD, SevAD, MildAD) comparados con individuos de control (C), con pacientes de PD (PD) o con pacientes que sufren deterioro de la memoria (Mem, Mem-AD), los niveles de x o y no hacían posible la discriminación entre los pacientes que sufrían AD frente a los pacientes que sufrían DLB. En la comparación de todos los casos de AD (ModAD, SevAD, y MildAD agrupados) con DLB, los valores p del test U de Mann- Whitney eran 0,16, 0,68, y 0,79 para [x]_{3D6}, [y]_{6E10} e [y]_{4G8}, respectivamente.

En las Figuras 5 ([x]_{3D6}/[y]_{6E10}) y 6 ([x]_{3D6}/[y]_{4G8}) se muestran la mediana y el intervalo 25%-75% para las relaciones x/y en las muestras de CSF de los diferentes grupos de individuos. Para esta relación, puede observarse una disminución clara en el caso de los pacientes que sufren cualquier forma de AD (ModAD, SevAD, MildAD) comparados con pacientes que sufren DLB. Los valores p del test U de Mann-Whitney eran 0,098 y < 0,001 para [x]_{3D6}/[y]_{6E10} y [x]_{3D6}/[y]_{4G8}, respectivamente. Esto demuestra que la relación x/y hace posible la discriminación entre individuos que sufren AD frente a los individuos que sufren DLB.

Ejemplo 3 Análisis de los niveles x e y de péptidos A\beta específicos en muestras obtenidas de individuos que sufren AD 1. Individuos

Muestras de CSF de pacientes con AD (n = 22) y controles no dementes (n = 20) fueron proporcionadas por el Hospital de la Universidad de Sahlgren, Göteborg, Suecia. Las muestras se recogieron para el propósito de procedimiento de diagnóstico rutinario de pacientes diagnosticados de acuerdo con los criterios aceptados generalmente de AD, ICD-10 (Organización Mundial de la Salud, 1992) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y de Comunicación y la Asociación para el Derrame Cerebral y la Enfermedad de Alzheimer y Trastornos Afines (criterios NINCDS-ADRDA; McKann et al., 1984). El grupo de control estaba integrado por individuos sin historias, síntomas o signos de enfermedad psiquiátrica o neurológica.

El estudio fue aprobado por los Comités de Ética de las Universidades de Göteborg, Suecia. Todos los pacientes (o sus parientes más próximos) y los controles dieron su consentimiento informado para participar en el estudio, que se condujo de acuerdo con las provisiones de la Declaración de Helsinki.

2. Análisis de los niveles x e y de péptidos A\beta específicos por inmunoensayo multiparamétrico

Los niveles x e y de péptidos A\beta específicos en las muestras de CSF se determinaron utilizando la tecnología xMAP^{TM} (Luminex, Austin, Texas, EE.UU.). Como anticuerpo de captura se utilizó el anticuerpo monoclonal 3D6 para detección de x y el anticuerpo monoclonal 4G8 para detección de y. Como anticuerpo detector se utilizó el anticuerpo monoclonal 21F12. El ensayo multiparamétrico se realizó como se ha descrito arriba.

El análisis de los datos se basó en la representación gráfica por medio de gráficos en recuadro. Éstos representan los valores de la mediana y el intervalo 25%-75% que abarca el 50% central de los puntos de datos para cada variable. Un respaldo adicional para la capacidad de una variable en cuanto a discriminar entre los dos grupos (AD y controles) fue proporcionado por el test de Student-Newman-Keuls para comparaciones por pares. Un valor p significativo (< 0,05) proporciona un respaldo sólido para la capacidad de discriminación de una variable entre los pacientes de AD y los controles.

En la Figura 11 (3D6-21F12) y la Figura 12 (4G8-21F12) se muestran la mediana y el intervalo 25%-75% para, respectivamente, los niveles x e y de péptidos A\beta específicos en las muestras de CSF de los pacientes de AD y el grupo de control. Se observó una diferencia clara en los péptidos A\beta que se unían a 3D6 o 4G8 entre los pacientes que sufrían AD y los individuos de control. Los valores p del test de Student-Newman-Keuls eran < 0,001 y 0,008 respectivamente, lo que indicaba la capacidad de discriminación de los niveles x (péptidos A\beta específicos que se unen a 3D6) e y (péptidos A\beta específicos que se unen a 4G8).

En la Figura 13 (RELACIÓN: 3D6 versus 4G8) se muestran la mediana y el intervalo 25%-75% para las relaciones x/y (en donde x es el nivel de péptidos específicos A\beta_{42(43)} que se unen a 3D6, e y es el nivel de péptidos específicos A\beta_{42(43)} que se unen a 4G8) en las muestras de CSF de los pacientes de AD y el grupo de control. Asimismo, se observa para esta relación x/y una diferencia clara entre los pacientes que sufren AD y los individuos de control. El valor p del test de Student-Newman-Keuls era 0,003, indicativo de la capacidad de discriminación de esta relación.

3. Análisis de los niveles x e y de péptidos específicos A\beta por tecnología de desorción/ionización láser intensificada en superficie

Se aplicó la tecnología de desorción/ionización láser intensificada en superficie (SELDI) para analizar y comparar los patrones de péptido A\beta_{(42)} en el CSF de 22 muestras de CSF individuales de pacientes con AD (n = 22) y controles que no sufrían demencia alguna (n = 20). Las muestras de CSF se analizaron en el instrumento SELDI-TOF (PBS IIc) respecto a la presencia de péptidos A\beta_{(42)} específicos. Para hacer posible esto, los péptidos A\beta se unieron inmunológicamente a un ProteinChip por el protocolo de preparación de inmuno-redes siguiente. Un anticuerpo monoclonal (4D7A3; Innogenetics Cat. No. BR032D) dirigido hacia el término C del péptido amiloide \beta_{(42)} se enlazó covalentemente al ProteinChip PS 10 por aplicación de 1 \mug de 4D7A3 en el punto de red e incubación en una cámara de humedad (3h, TA) a fin de hacer posible la unión covalente a la red ProteinChip PS 10. Las redes se lavaron dos veces con PBS/0,1% Triton X-100. Se realizó un lavado adicional dos veces con PBS (pH 8,0). Se bloquearon las redes con Tris 0,5 M de pH 8,0 (durante 2 h, TA). Se lavaron de nuevo las redes dos veces con PBS/0,1% Triton X-100. Se cargaron 100 \mul de CSF en urea 0,1 M/CHAPS 0,1% en un punto utilizando el bioprocesador ProteinChip y se incubaron por agitación constante mediante sacudidas durante una noche a 4ºC. Las redes se lavaron de nuevo dos veces con PBS/0,1% Triton X-100 y dos lavados adicionales con Hepes 50 mM de pH 8,0. En los puntos de red secados al aire se aplicó ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico en 50% ACN/50% TFA y se realizó el análisis de masas. Se preparó la misma inmuno-red con anticuerpo 31D11 como anticuerpo de control para obtener un espectro sin péptido A\beta alguno (Figura 14).

Se realizó la calibración externa con Dynorphorin (Mr = 2147,50 Da), ACTH_{(1-24)} humana (2933,50), cadena beta de insulina de bovino (3495,94), e insulina humana (5807,65). Sobre esta base, se calculó la exactitud de las masas para el pico del péptido A\beta_{(42)} con masa teórica de 4514,1 Da. El valor m/z medido por SELDI-TOF era 4512,069 Da (DESVIACIÓN ESTÁNDAR 1,193456, % CV 0,02645) dando la exactitud para este experimento de 450 ppm. Teniendo en cuenta esta exactitud de masa del SELDI-TOF (450 ppm), y utilizando análisis complementario de péptidos amiloides \beta sintéticos relevantes, se asignaron nuevos péptidos amiloides \beta truncados en el terminal N sobre la base de sus masas moleculares como sigue: 1-42, 11-42, 8-42, 5-42 y 3-42 (Figura 14). La oxidación de la muestra de CSF dio como resultado un cambio de masa de 16 Daltons para los péptidos A\beta (Figura 15). Las masas teórica y medida y la exactitud de masa de la presente tecnología se muestran en la Tabla 4. Para varios péptidos A\beta, se obtuvo una exactitud de masa muy alta. Las intensidades de los picos de los diferentes péptidos A\beta específicos en las muestras sometidas al test se dan en la Tabla 5. Las intensidades de los picos peptídicos de A\beta_{(1-42)} disminuían específicamente en el CSF de AD si se comparaba con el CSF de los controles que no padecían demencia. Para las intensidades medidas de los picos peptídicos de amiloide \beta_{(42)} truncados en N no se detectó diferencia significativa alguna entre dos grupos de pacientes. En cambio, cuando las intensidades de los picos de masa de las especies de amiloide detectadas se expresaron como relación A\beta_{(1-42)}/A\beta_{(N-42)}, los pacientes con enfermedad de Alzheimer podían diferenciarse del grupo de controles (datos no presentados).

Con objeto de mejorar las medidas, se expusieron las mismas muestras a la intensidad de láser alta y se obtuvieron para varias muestras datos más exactos. Para los propósitos de calibración se aplicaron 7 fmol del péptido amiloide \beta 9-42 (AnaSpec, San José, CA; cat. No. 60084-1) y 6 fmol de insulina de bovino (Ciphergene Biosystems Fremont, CA) y se utilizaron para la calibración de los datos. En las Figuras 16 y 17, se calculan la mediana y el intervalo 25%-75% con datos normalizados para los péptidos específicos A\beta_{(1-42)} y A\beta_{(11-42)} en las muestras de CSF del grupo AD y el grupo de control. La capacidad de los niveles de A\beta_{(1-42)} y A\beta_{(11-42)} para discriminar entre AD y los individuos de control se estimó ulteriormente por el test de Student-Newman-Keuls para comparación por pares. El valor para el nivel de A\beta_{(11-42)} era 0,041, lo que indicaba la capacidad de discriminación del nivel de A\beta_{(11-42)}. En la Figura 18, se calculan la mediana y el intervalo 25%-75% con datos normalizados para la relación A\beta_{(1-42)}/A\beta_{(11-42)} en las muestras de CSF del grupo AD y el grupo de control. Para esta relación se observa también una diferencia clara entre los pacientes que sufren AD y los individuos de control. El valor p calculado por el test de Student-Newman-Keuls era 0,003, lo que indicaba la capacidad de discriminación de esta relación A\beta_{(1-42)}/A\beta_{(11-42)}. Si se utilizaban datos normalizados para el análisis de la relación, el grado de diferenciación entre el grupo AD y el grupo de control mejoraba.

Tablas TABLA 1 Anticuerpos capaces de formar un complejo inmunológico con los péptidos específicos A\beta detectados en los métodos de la invención

1

TABLA 2 Péptidos A\beta truncados en el terminal N que han sido identificados

3

TABLA 2 (continuación)

4

TABLA 2 (continuación)

5

TABLA 2 (continuación)

6

TABLA 3 Anticuerpos a utilizar como anticuerpo detector en los métodos de la presente invención

7

TABLA 4 Masas moleculares y exactitud de masa de los péptidos A\beta detectados en CSF humano

8

TABLA 5 Péptidos A\beta_{42} en el CSF de 42 casos clínicos. Los datos representan alturas de pico o intensidades detectadas por SELDI-TOF después de inmunocaptura con el anticuerpo monoclonal 4D7A3 (ox; formas oxidadas)

9

TABLA 5 (continuación)

10

Referencias

Allsop D., Landon M., Kidd M., Lowe J.S., Reynolds G.P., Gardner A. (1986) Monoclonal antibodies raised against a subsequence of senile plaque core protein react with plaque cores, plaque periphery and cerebrovascular amyloid in Alzheimer's disease. Neurosci. Lett. 68: 252-256.

Allsop D., Haga S., Bruton C., Ishii T., Roberts G.W. (1990) Neurofibrillary tangles in some cases of dementia pugilistica share antigens with amyloid beta-protein of Alzheimer's disease. Am. J. Pathol. 136: 255-260.

American Psychiatric Association (1994) Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 5th edn. Washington, DC: American Psychiatric Association.

Anderson J.P., Chen Y., Kim K.S., Robakis N.K. (1992) An alternative secretase cleavage produces soluble Alzheimer amyloid precursor protein containing a potentially amyloidogenic sequence. J. Neurochem. 59: 2328-2331.

Andreasen N., Vanmechelen E., Van de Voorde A., Davidsson P., Hesse C., Tarvonen S., Raiha L, Sourander L., Winblad B., Blennow K. (1998) Cerebrospinal fluid tau protein as a biochemical marker for Alzheimer's disease: a community based follow up study. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 64: 298-305.

Andreasen N., Hesse C., Davidsson P., Minthon L., Wallin A., Winblad B., Vanderstichele H., Vanmechelen E., Blennow K. (1999a) Cerebrospinal fluid beta-amyloid(1-42) in Alzheimer disease: differences between early- and late-onset Alzheimer disease and stability during the course of disease. Arch. Neurol. 56: 673-680.

Andreasen N., Minthon L., Vanmechelen E., Vanderstichele H., Davidsson P., Winblad B., Blennow K. (1999b) Cerebrospinal fluid tau and A\beta42 as predictors of development of Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment. Neurosci. Lett. 273: 5-8.

Andreasen N., Vanmechelen E., Vanderstichele H., Davidsson P., Blennow K. (2003) Cerebrospinal fluid levels of total-tau, phospho-tau and A\beta42 predicts development of Alzheimer's disease in patients with mild cognitive impairment Acta Neurol. Scand. 107 (Suppl. 179): 47-51.

Arai H., Ishiguro K., Ohno H., Moriyama M., Itoh N., Okamura N., Matsui T., Morikawa Y., Horikawa E., Kohno H., Sasaki H., Imahori K. (2000) CSF phosphorylated tau protein and mild cognitive impairment: a prospective study. Exp. Neurol. 166: 201-203.

Asami-Odaka A., Ishibashi Y., Kikuchi T., Kitada C., Suzuki N. (1995) Long amyloid beta-protein secreted from wildtype human neuroblastoma IMR-32 cells. Biochemistry 34: 10272-10278.

Austen B.M., Frears E.R., Davies H. (2000) The use of seldi proteinchip arrays to monitor production of Alzheimer's betaamyloid in transfected cells. J. Pept. Sci. 6: 459-469.

Bancher C., Grundke-Iqbal I., Iqbal K., Kim K.S., Wisniewski H.M. (1989) Immunoreactivity of neuronal lipofuscin with monoclonal antibodies to the amyloid beta-protein. Neurobiol Aging 10: 125-132.

Bard F., Cannon C., Barbour R., Burke R.L., Games D., Grajeda H., Guido T., Hu K., Huang J., Johnson-Wood K., Khan K., Kholodenko D., Lee M., Lieberburg I., Motter R., Nguyen M., Soriano F., Vasquez N., Weiss K., Welch B., Seubert P., Schenk D., Yednock T. (2000) Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nat. Med. 6: 916-919.

Blennow K., Wallin A., Agren H., Spenger C., Siegfried J., Vanmechelen E. (1995) Tau protein in cerebrospinal fluid: a biochemical marker for axonal degeneration in Alzheimer's disease? Mol. Chem. Neuropathol. 26: 231-235.

Brayden D.J., Templeton L., McClean S., Barbour R, Huang J., Nguyen M., Ahern D., Motter R, Johnson-Wood K., Vasquez N., Schenk D., Seubert P. (2001) Encapsulation in biodegradable microparticles enhances serum antibody response to parenterally-delivered beta-amyloid in mice. Vaccine 19: 4185-4193.

Buerger K., Teipel S.J., Zinkowski R, Blennow K., Arai H., Engel R, Hofinann-Kiefer K., McCulloch C., Ptok U., Heun R., Andreasen N., DeBernardis J., Kerkman D., Moeller H.-J., Davies P., Hampel H. (2002) CSF tau protein phsophorylated at threonine 231 correlates with cognitive decline in MCI subjects. Neurology 59: 627-629.

Cescato R, Dumermuth E., Spiess M., Paganetti P.A. (2000) Increased generation of alternatively cleaved beta-amyloid peptides in cells expressing mutants of the amyloid precursor protein defective in endocytosis. J. Neurochem. 74: 1131-1139.

Chertkow H. (2002) Mild cognitive impairment. Curr. Opin. Neurol. 15: 401-407.

Citron M., Oltersdorf T., Haass C., McConlogue L., Hung A.Y., Seubert P., Vigo-Pelfrey C., Lieberburg I., Selkoe D.J. (1992) Mutation of the beta-amyloid precursor protein in familial Alzheimer's disease increases beta-protein production. Nature 360: 672-674.

Cole et al. (1985) In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R Liss, Inc. pp. 77-96.

Conde S. (2002) \beta-amyloid peptide as a target for treatment of Alzheimer's disease. Expert Opin. Ther. Patents 12: 503-512.

Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh Gh. G., Gobert M., Conrath K., Muyldermans S., De Baetselier P., Revets H. (2002) Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels. Int. J. Cancer 98: 456-462.

Davidsson P., Westman A., Puchades M., Nilsson C.L., Blennow K. (1999) Characterization of Proteins from Human Cerebrospinal Fluid by a Combination of Preparative Two-Dimensional Liquid-Phase Electrophoresis and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. Anal. Chem. 71: 642-647.

Davies H., Lomas L., Austen B. (1999) Profiling of amyloid beta peptide variants using SELDI Protein Chip arrays. Biotechniques 27: 1258-1261.

De Jonghe C., Esselens C., Kumar-Singh S., Craessaerts K., Serneels S., Checler F., Annaert W., Van Broeckhoven C., De Strooper B. (2001) Pathogenic APP mutations near the gamma-secretase cleavage site differentially affect Abeta secretion and APP C-terminal fragment stability. Hum. Mol. Genet. 10: 1665-1671.

DeMattos R.B., Bales K.R, Cummins D.J., Dodart J.C., Paul S.M., Holtzman D.M. (2001) Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 8850-8855.

Enya M., Morishima-Kawashima M., Yoshimura M., Shinkai Y., Kusui K., Khan K., Games D., Schenk D., Sugihara S., Yamaguchi H., Ihara Y. (1999) Appearance of sodium dodecyl sulfate-stable amyloid beta-protein (A beta) dimer in the cortex during aging. Am. J. Pathol. 154: 271-279.

Friedland R.P., Majocha R.E., Reno J.M., Lyle L.R., Marotta C.A. (1994) Development of an anti-A beta monoclonal antibody for in vivo imaging of amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Mol. Neurobiol. 9: 107-113.

Fukumoto H., Asami-Odaka A., Suzuki N., Iwatsubo T. (1996) Association of A beta 40-positive senile plaques with microglial cells in the brains of patients with Alzheimer's disease and in non-demented aged individuals. Neurodegeneration 5: 13-17.

Galasko D., Chang L., Motter R., Clark C.M., Kaye J., Knopman D., Thomas R., Kholodenko D., Schenk D., Lieberburg I., Miller B., Green R., Basherad R., Kertiles L., Boss M.A., Seubert P. (1998) High cerebrospinal fluid tau and low amyloid beta42 levels in the clinical diagnosis of Alzheimer disease and relation to apolipoprotein E genotype. Arch. Neurol. 55: 937-945.

Games D., Adams D., Alessandrini R., Barbour R., Berthelette P., Blackwell C., Carr T., Clemens J., Donaldson T., Gillespie F., et al. (1995) Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F beta-amyloid precursor protein. Nature 373: 523-527.

Ghindilis A.L., Pavlov A.R, Atanassov P.B. (eds.) (2002) Immunoassay Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, US.

Ghiso J., Rostagno A., Gardella J.E., Liem L., Gorevic P.D., Frangione B. (1992) A 109-amino-acid C-terminal fragment of Alzheimer's-disease amyloid precursor protein contains a sequence, -RHDS-, that promotes cell adhesion. Biochem. J. 288: 1053-1059.

Glenner G.G., Wong C.W. (1984) Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 885-890.

Goedert M. (1996) Tau protein and the neurofibrillary pathology of Alzheimer's disease. Ann. N Y Acad. Sci. 777: 121-131.

Gravina S.A., Ho L., Eckman C.B., Long K.E., Otvos L. Jr., Younkin L.H., Suzuki N., Younkin S.G. (1995) Amyloid beta protein (A beta) in Alzheimer's disease brain. Biochemical and immunocytochemical analysis with antibodies specific for forms ending at A beta 40 or A beta 42(43). J. Biol. Chem. 270: 7013-7016.

Haass C., Schlossmacher M.G., Hung A.Y., Vigo-Pelfrey C., Mellon A., Ostaszewski B.L., Lieberburg I., Koo E.H., Schenk D., Teplow D.B., Selkoe D.J. (1992) Amyloid beta-peptide is produced by cultured cells during normal metabolism. Nature 359: 322-325.

Harigaya Y., Saido T.C., Eckman C.B., Prada C.-M., Shoji M., Younkin S.G. (2000) Amyloid \beta Protein Starting Pyroglutamate at Position 3 Is a Major Component of the Amyloid Deposits in the Alzheimer's Disease Brain. Biochemical and Biophysical Research Communications 276: 422-427.

Harrington C.R, Quinn G.B., Hurt J., Day I.N., Wischik C.M., (1993) Characterisation of an epitope specific to the neuron-specific isoform of human enolase recognised by a monoclonal antibody raised against a synthetic peptide corresponding to the C-terminus of beta/A4-protein. Biochim. Biophys. Acta 1158: 120-128.

Harrington C.R., Perry R.H., Perry E.K., Hurt J., McKeith I.G., Roth M., Wischik C.M. (1994) Senile dementia of Lewy body type and Alzheimer type are biochemically distinct in terms of paired helical filaments and hyperphosphorylated tau protein. Dementia 5: 215-228.

Hulstaert F., Blennow K., Ivanoiu A., Schoonderwaldt H.C., Riemenschneider M., De Deyn P.P., Bancher C., Cras P., Wiltfang J., Mehta P.D., Iqbal K., Pottel H., Vanmechelen E., Vanderstichele H. (1999) Improved discrimination of AD patients using \beta-amyloid(1-42) and tau in CSF: a multicenter study. Neurology 52: 1555-1562.

Ida N., Hartmann T., Pantel J., Schroder J., Zerfass R., Forst H., Sandbrink R., Masters C.L., Beyreuther K. (1996) Analysis of heterogeneous \betaA4 peptides in human cerebrospinal fluid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271: 22908-22914.

Ikeda S., Wong C.W., Allsop D., Landon M., Kidd M., Glenner G.G. (1987) Immunogold labeling of cerebrovascular and neuritic plaque amyloid fibrils in Alzheimer's disease with an anti-beta protein monoclonal antibody. Lab. Invest. 57: 446-449.

Iwatsubo T., Odaka A., Suzuki N., Mizusawa H., Nukina N., Ihara Y. (1994) Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is A beta 42(43). Neuron 13: 45-53.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Iwatsubo T., Saido T.C., Mann D.M.A., Lee V.M.-Y., Trojanowski J.Q. (1996) Full-length amyloid-\beta(1-42(43)) and amino terminally modified and truncated amyloid-\beta42(43) deposit in diffuse plaques. Am. J. Pathol. 149:1823-1830.

Jensen M., Hartmann T., Engvall B., Wang R., Uljon S.N., Sennvik K., Naslund J., Muehlhauser F., Nordstedt C., Beyreuther K., Lannfelt L. (2000) Quantification of Alzheimer amyloid beta peptides ending at residues 40 and 42 by novel ELISA systems. Mol. Med. 6: 291-302.

Kalback W., Watson M.D., Kokjohn, T.A., Kuo Y.-M., Weiss N., Luehrs D.C., López J., Brune D., Sisodia S.S., Staugenbiel M., Emmerling M., Roher A.E. (2002) APP transgenic mice Tg2576 accumulate Abeta peptides that are distinct from the chemically modified and insoluble peptides deposited in Alzheimer's disease senile plaques. Biochemistry 41: 922-928.

Kanai M., Matsubara E., Isoe K., Urakami K., Nakashima K., Arai H., Sasaki H., Abe K., Iwatsubo T., Kosaka T., Watanabe M., Tomidokoro Y., Shizuka M., Mizushima K., Nakamura T., Igeta Y., Ikeda Y., Amari M., Kawarabayashi T., Ishiguro K., Harigaya Y., Wakabayashi K., Okamoto K., Hirai S., Shoji M. (1998) Longitudinal study of cerebro-spinal fluid levels of tau, A betal-40, and A betal-42(43) in Alzheimer's disease: a study in Japan. Ann. Neurol. 44: 17-26.

Kawarabayashi T., Younkin L.H., Saido T.C., Shoji M., Ashe K.H., Younkin S.G. (2001) Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J. Neurosci. 21: 372-381.

Kida E., Wisniewski K.E., Wisniewski H.M. (1995) Early amyloid-beta deposits show different immunoreactivity to the amino- and carboxy-terminal regions of beta-peptide in Alzheimer's disease and Down's syndrome brain. Neurosci. Lett. 193: 105-108.

Kim K.S., Miller D.L., Sapienza V.J., Chen C.-M. J., Bai C., Grundke-Iqbal I., Currie J.R., Wisniewski H.M. (1988) Production and characterization of monoclonal antibodies reactive to synthetic cerebrovascular amyloid peptide. In: Neuroscience Research Communications, published by John Wiley & Sons, Ltd. Vol. 2, No. 3, pages 121-130.

Kim K.S., Wen G.Y., Bancher C., Chen C.M.J., Sapienza V.J., Hong H., Wisniewski H.M. (1990) Detection and quantitation of amyloid b-peptide with 2 monoclonal antibodies. In: Neuroscience Research Communications, published by John Wiley & Sons, Ltd. Vol. 7, No. 2, pages 113-122.

Knopman D., Ritchie K., Polge C., Alafuzoff I., Soininen H. (2002) Alzheimer's disease. In: Qizilbash N. (ed.) Evidence-based Dementia Practice. Oxford: Blackwell Science, p. 228-259.

Kohler G., Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256: 495-497.

Konig G., Graham P., Bushnell A., Webster S., Wunderlich D., Perlmutter L.S. (1996) Development and characterization of a monoclonal antibody 369.2B specific for the carboxyl-terminus of the beta A4 peptide. Ann. NY Acad. Sci. 777: 34.4-355.

Kozbor D., Dexter D., Roder J.C. (1983) A comparative analysis of the phenotypic characteristics of available fusion partners for the construction of human hybridomas. Hybridoma 2:7-16.

Langston J.W., Widner H., Goetz C.G., Brooks D., Fahn S., Freeman T., Watts R. (1992) Core assessment program for intracerebral transplantations (CAPIT). Mov. Disord. 7: 2-13.

Lamer A.J. (1999) Hypothesis: amyloid \beta-peptides truncated at the N-terminus contribute to the pathogenesis of Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging 20: 65-69.

Lewczuk P., Esselmann H., Meyer M., Wollscheid V., Neumann M., Otto M., Maler J.M., Ruther E., Kornhuber J., Wiltfang J. (2003) The amyloid-beta (Abeta) peptide pattern in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease: evidence of a novel carboxyterminally elongated Abeta peptide. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17: 1291-1296.

Lewczuk P., Esselmann H., Groemer T.W., Bibl M., Maler J.M., Steinacker P., Otto M., Kornhuber J., Wiltfang J. (2004) Amyloid beta peptides in cerebrospinal fluid as profiled with surface enhanced laser desorption/ioniza-
tion time-of-flight mass spectrometry: evidence of novel biomarkers in Alzheimer's disease. Biol. Psychiatry 55:
524-530.

Leys D., Englund E., Erkinjuntii T. (2002) Vascular dementia. In: Qizilbash.N. (ed.) Evidence-based Dementia Practice. Oxford: Blackwell Science, p. 260-287.

Lowe J. (2001) The pathological diagnosis of neurodegenerative diseases causing dementia. Curr. Top. Pathol. 95: 149-177.

Majocha RE., Reno J.M., Friedland RP., VanHaight C., Lyle L.R., Marotta C.A. (1992) Development of a monoclonal antibody specific for beta/A4 amyloid in Alzheimer's disease brain for application to in vivo imaging of amyloid angiopathy. J Nucl. Med 33: 2184-2189.

Marin D.B., Sewell M.C., Schlechter A. (2002) Alzheimer's disease: Accurate and early diagnosis in the primary care setting. Geriatrics 57: 36-40.

Masters C.L., Simms G., Weinman N.A., Multhaup G., McDonald B.L., Beyreuther K. (1985) Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4245-4249.

Masur D.M., Sliwinski M., Lipton R.B., Blau A.D., Crystal H.A. (1994) Neuropsychological prediction of dementia and the absence of dementia in healthy elderly persons. Neurology 44: 1427-1432.

McKeith I.G., Galasko D., Kosaka K., Perry E.K., Dickson D.W., Hansen L.A., Salmon D.P., Lowe J., Mirra S.S., Byrne E.J., Lennox G., Quinn N.P., Edwardson J.A., Ince P.G., Bergeron C., Burns A., Miller B.L., Loverstone S., Collerton D., Jansen E.N.H., Ballard C., d Vos R.A.I., Wilcock G.K., Jellinger K.A., Perry RH. (1996) Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): Report of the consortium on DLB international workshop. Neurology 47: 1113-1124.

McKeith I.G. (2002) Dementia with Lewy bodies. Br. J. Psychiatry 180: 144-147.

McKhann G., Drachman D.A., Folstein M.F., Katzman R, Price D.L., Stadlan E. (1984) Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of the Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease. Neurology 34: 939-944.

Metha P.D., Kim K.S., Wisniewski H.M. (1991) ELISA as a laboratory test to aid the diagnosis of Alzheimer's disease. In: Bullock et al., Techniques in diagnostic pathology, Vol. 2, published by Academic Press (London), pages 100-112.

Miller D.L., Papayannopoulos LA., Styles J., Bobin S.A., Lin Y.Y., Biemann K., Iqbal K. (1993) Peptide compositions of the cerebrovascular and senile plaque core amyloid deposits of Alzheimer's disease. Arch. Biochem. Biophys. 15: 41-52.

Monroe et al. (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41.

Mori H., Takio K., Ogawara M., Selkoe D.J. (1992) Mass spectrometry of purified amyloid \beta protein in Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 267: 17082-17086.

Motter R, Vigo-Pelfrey C., Kholodenko D., Barbour R., Johnson Wood K., Galasko D., Chang L., Miller B., Clark C., Green R et al. (1995) Reduction of \beta-amyloid peptide 42 in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease. Ann. Neurol 38: 643-648.

Murphy G.M. Jr., Forno L.S., Higgins L., Scardina J.M., Eng L.F., Cordell B. (1994) Development of a monoclonal antibody specific for the COOH-terminal of beta-amyloid 1-42 and its immunohistochemical reactivity in Alzheimer's disease and related disorders. Am. J. Pathol. 144: 1082-1088.

Muyldermans S. (2001) Single domain camel antibodies: current status. J. Biotechnol. 74: 277-302.

Näslund J., Schierhom A., Hellman U., Lannfelt L., Roses A.D., Tjernberg L.O., Silberring J., Gandy S.E., Winblad B., Greengard P., Nordstedt C., Terenius L. (1994) Relative abundance of Alzheimer A\beta amyloid peptide variants in Alzheimer disease and normal aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8378-8382.

Okamura N., Arai H., Maruyama M., Higuchi M., Matsui T., Tanji H., Seki T., Hirai H., Chiba H., Itoh M., Sasaki H. (2002) Combined analysis of CSF tau levels and [1231]lodamphetamine SPECT in Mild Cognitive Impairment: implications for a novel predictor of Alzheimer's disease. Am. J. Psychiatry 159: 474-476.

Oshima N., Morishima-Kawashima M., Yamaguchi H., Yoshimura M., Sugihara S., Khan K., Games D., Schenk D., Ihara Y. (2001) Accumulation of amyloid beta-protein in the low-density membrane domain accurately reflects the extent of beta-amyloid deposition in the brain. Am. J. Pathol. 158: 2209-2218.

Palmer K., Fratiglioni L., Winblad B. (2003) What is mild cognitive impairment? Variations in definitions and evolution of nondemented persons with cognitive impairment. Acta Neurol. Scand. 107 (Suppl. 179): 14-20.

Parnetti L., Lanari A., Amici S., Gallai V., Vanmechelen E., Hulstaert F. (2001) CSF phosphorylated tau is a possible marker for discriminating Alzheimer's disease from dementia with Lewy bodies. Phospho-Tau International Study Group. Neurol. Sci. 22: 77-78.

Patterson S.D., Aebersold R. (1995) Mass spectrometric approaches for the identification of gel-separated proteins. Electrophoresis 16: 1791-814.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Petersen RC., Smith G.E., Ivnik R.J., Kokmen E., Tangelos E.G. (1994) Memory function in very early Alzheimer's disease. Neurology 44: 867-872.

Petersen R.C., Stevens J.C., Ganguli M., Tangalos E.G., Cummings J.L., DeKosky S.T. (2001) Practice parameter: Early detection of dementia: Mild cognitive impairment (an evidence-based review). Report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology 56: 1133-1142.

Pirttila T., Kim K.S., Mehta P.D., Frey H., Wisniewski H.M. (1994) Soluble amyloid beta-protein in the cerebrospinal fluid from patients with Alzheimer's disease, vascular dementia and controls. J. Neurol. Sci. 127: 90-95.

Price C.P., Newman D.J. (1997) Principles and practice of immunoassay. 2nd Edition. McMillan Reference Ltd.

Queen C., Schneider W.P., Selick H.E., Payne P.W., Landolfi N.F., Duncan J.F., Avdalovic N.M., Levitt M., Junghans R.P., Waldmann T.A. (1989) A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 10029-10033.

Riemenschneider M., Lautenschlager N., Wagenpfeil S., Diehl J., Drzezga A., Kurz A. (2002) Cerebrospinal fluid tau and \beta-amyloid 42 proteins identify Alzheimer disease in subjects with Mild Cognitive Impairment. Arch. Neurol. 59: 1729-1734.

Roher A.E., Lowenson J.D., Clarke S., Woods A.S., Cotter R.J., Gowing E., Ball M. (1993) \beta-amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10836-10840.

Russo C., Saido T.C., DeBusk L.M., Tabaton M., Gambetti P., Teller J.K. (1997) Heterogeneity of water-soluble amyloid \beta-peptide in Alzheimer's disease and Down's syndrome brains. FEBS Lett. 409: 411-416.

Saido T.C., Iwatsubo T., Mann DM.A., Shimada H., Ihara Y., Kawashima S. (1995) Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE); in senile plaques. Neuron 14: 457-466.

Saido T.C., Yamao-Harigaya W., Iwatsubo T., Kawashima S. (1996) Amino- and carboxyl-terminal heterogeneity of beta-amyloid peptides deposited in human brain. Neurosci. Lett. 215: 173-176.

Saido T.C. (2000) Degradation of amyloid-\beta peptide: a key to Alzheimer pathogenesis, prevention and therapy. Neurosci. News 3: 52-62.

Selkoe D.J. (1991) The molecular pathology of Alzheimer's disease. Neuron 6: 487-498.

Sergeant N., Bombois S., Ghestem A., Drobeck H., Kostanjevecki V., Missiaen C., Wattez A., David J.-P., Van-mechelen E., Sergheraert C., Delacourte A. (2003) Truncated Abeta species in preclinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J. Neurochem. Accepted.

Seubert P., Vigo-Pelfrey C., Esch F., Lee M., Dovey H., Davis D., Sinha S., Schlossmacher M., Whaley J., Swindlehurst C., et al. (1992) Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature 359: 325-327.

Shoji M., Golde T.E., Ghiso J., Cheung T.T., Estus S., Shaffer L.M., Cai X.-D., McKay D.M., Tintner R., Frangione B., Younkin S.G. (1992) Production of the Alzheimer amyloid \beta protein by normal proteolytic processing. Science 258: 126-129.

Skoog I., Davidsson P., Aevarsson O., Vanderstichele H., Vanmechelen E., Blennow K. (2003) Cerebrospinal Fluid Beta-Amyloid 42 Is Reduced before the Onset of Sporadic Dementia: A Population-Based Study in 85-Year-Olds. Dement Geriatr Cogn Disord. 15: 169-176.

Spillantini M.G., Goedert M., Jakes R, Klug A. (1990) Different configurational states of beta-amyloid and their distributions relative to plaques and tangles in Alzheimer disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3947-3951.

Spinelli S., Frenken L.G., Hermans P., Verrips T., Brown K., Tegoni M., Cambillau C. (2000) Camelid heavy-chain variable domains provide efficient combining sites to haptens. Biochemistry. 39: 1217-1222.

Sramek J.J., Cutler N.R. (2000) Ongoing trials in Alzheimer's disease. Expert Opin. Investig. Drugs 9: 899-915.

Sunderland T., Wolozin B., Galasko D., Levy J., Dukoff R, Bahro M., Lasser R, Motter R, Lehtimaki T., Seubert P. (1999) Longitudinal stability of CSF tau levels in Alzheimer patients. Biol. Psychiatry 46:750-755.

Sunderland T., Linker G., Mirza N., Putnam K.T., Friedman D.L., Kimmel L.H., Bergeson J., Manetti G.J., Zimmermann M., Tang B., Bartko J.J., Cohen RM. (2003) Decreased \beta-amyloid 1-42 and increased tau levels in cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer disease. JAMA 289: 2094-2103.

\global\parskip0.900000\baselineskip

Suzuki N., Cheung T.T., Cai X.D., Odaka A., Otvos L. Jr., Eckman C., Golde T.E., Younkin S.G. (1994) An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants. Science. 264: 1336-1340.

Szendrei G.I., Prammer K.V., Vasko M., Lee V.M., Otvos L. Jr. (1996) The effects of aspartic acid-bond isomerization on in vitro properties of the amyloid beta-peptide as modeled with N-terminal decapeptide fragments. Int. J. Pept. Protein Res. 47: 289-296.

Tabaton M., Nunzi M.G., Xue R., Usiak M., Autilio-Gambetti L., Gambetti P. (1994) Soluble amyloid beta-protein is a marker of Alzheimer amyloid in brain but not in cerebrospinal fluid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 200: 1598-1603.

Tamaoka A., Sawamura N., Fukushima T., Shoji S., Matsubara E., Shoji M., Hirai S., Furiya Y., Endoh R, Mori H. (1997) Amyloid \beta protein 42(43) in cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease. J Neurol. Sci. 148: 41-45.

Tanzi R.E., McClatchey A.I., Lamperti E.D., Villa-Komaroff L., Gusella J.F., Neve R.L. (1988) Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer's disease. Nature 331: 528-530.

Tapiola T., Overmyer M., Lehtovirta M., Helisalmi S., Ramberg J., Alafuzoff I., Riekkinen P. Sr., Soininen H. (1997) The level of cerebrospinal fluid tau correlates with neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease. Neuroreport. 8: 3961-3963.

Tekirian T.L., Saido T.C., Markesbery W.R, Russell M.J., Wekstein D.R, Patel E., Geddes J.W. (1998) N-terminal heterogeneity ofparenchymal and cerebrovascular A\beta deposits. J. Neurpathol. Exp. Neurol. 57: 76-94.

Thal D.R., Sassin I., Schultz C., Haass C., Braak E., Braak H. (1999) Fleecy amyloid deposits in the internal layers of the hupman enthorhinal cortex are comprised of N-terminal truncated fragments of A\beta. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58: 210-216.

Thal L.J. (2000) Trials to slow progression and prevent disease onset. J. Neural. Transm. Suppl. 59: 243-249.

The Ronald and Nancy Reagan Research Institute of the Alzheimer's Association of the National Institute on Aging Working Group. (1998) Consensus Report of the Working Group on Molecular and Biochemical Markers of Alzheimer's Disease. Neurobiol. Aging 19: 109-116.

Vanderstichele H., Van Kerschaver E., Hesse C., Davidsson P., Buyse M.A., Andreasen N., Minthon L., Wallin A., Blennow K., Vanmechelen E. (2000) Standardization of measurement of beta-amyloid(1-42) in cerebrospinal fluid and plasma. Amyloid 7: 245-58.

Vanmechelen E., Van Kerschaver E., Blennow K., De Deyn P.P., Galasko D., Parnetti L., Sindic C.J. M., Arai H., Riemenschneider M., Hampel H., Pottel H., Valgaeren A., Hulstaert F., Vanderstichele H. (2001) CSF-phospho-tau (181P) as a promising marker for discriminating Alzheimer's disease from dementia with Lewy bodies. In: Iqbal K, Sisodia SS, Winblad B. Alzheimer's disease: Advances in etiology, pathogenesis and therapeutics. Chichester: John Wiley & Sons; p. 285-291.

Vigo-Pelfrey C., Lee D., Keim P., Lieberburg I., Schenk D.B. (1993) Characterization of \beta-amyloid peptide from human cerebrospinal fluid J. Neurochem. 61: 1965-1968.

Vigo-Pelfrey C., Seubert P., Barbour R, Blomquist C., Lee M., Lee D., Coria F., Chang L., Miller B., Lieberburg I., et al. (1995) Elevation of microtubule-associated protein tau in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease. Neurology 45: 788-793.

Wahlund L.-O., Pihlstrand E., Eriksdotter Jönhagen M. (2003) Mild cognitive impairment: experience from a memory clinic. Acta Neurol. Scand. 107 (Suppl. 179): 21-24.

Wang R, Sweeney D., Gandy S.E., Sisodia S.S. (1996) The profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media. Detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunoprecipitation-mass spectrometry. J. Biol. Chem. 271:31894-31902.

Welsh K.A., Butters N., Hughes J., Mohs R., Heyman A. (1991) Detection of abnormal memory decline in mild cases of Alzheimer's disease using CERAD neuropsychological measures. Arch. Neurol. 48: 278-281.

Wild D. (ed.) (2001) The Immunoassay Handbook 2nd edition. Nature Pr., London, UK.

Wiltfang J., Esselmann H., Cupers P., Neumann M., Kretzschmar H., Beyermann M., Schleuder D., Jahn H., Ruther E., Kornhuber J., Annaert W., De Strooper B., Saftig P. (2001) Elevation of beta-amyloid peptide 2-42 in sporadic and familial Alzheimer's disease and its generation in PSI knockout cells. J. Biol. Chem. 276: 42645-42657.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Wiltfang J., Esselmann H., Bibl M., Smirnov A., Otto M., Paul S., Schmidt B., Klafki H.-W., Maler M., Dyrks T., Bienert M., Beyermann M., Rüther E., Kornhuber J. (2002) Highly conserved and disease-specific patterns of carboxyterminally truncated A\beta peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 in Alzheimer's disease and in patients with chronic neuroinflammation. J. Neurochem. 81: 481-496.

World Health Organization (1992) The ICD-10 Classification of Mental and Behavioral Disorders. Geneva, World Health Organization.

Yaffe K., Gregg E.W. (2002) Diabetes mellitus, cognitive function, and risk of dementia in older adults. Available at: http://www.harrisonsonline.com/server-java/Arknoid/amed/harrisons/ex editorials/ed12566 p01.html. Accessed April 26, 2002.

Claims (31)

1. Un método para determinar si un individuo tiene probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer (AD) que comprende los pasos siguientes:

(a)

Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

(b)

comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, y con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD;

(c)

determinar, a partir de la comparación del paso (b), si el individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que más tarde desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo tiene probabilidad de desarrollar AD, y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos que en el momento de la toma de muestra no presentaban signo clínico alguno de AD y que no desarrollaron AD, es una indicación de que dicho individuo no tiene probabilidad de desarrollar AD.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado adicionalmente porque el individuo es un individuo con memoria deteriorada.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado adicionalmente porque el individuo con memoria deteriorada padece deterioro cognitivo leve (MCI).

4. Un método para la diagnosis de un individuo que padece AD y/o para la diagnosis diferencial de un individuo que padece AD frente a un individuo que padece otra demencia tal como Demencia con Cuerpos de Lewy (DLB) que comprende los pasos siguientes:

(a)

Determinar, en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo, la relación x/y, en donde:

\bullet

x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

\bullet

y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta;

(b)

comparar la relación x/y obtenida en (a) con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como pacientes de AD, con un intervalo de relaciones x/y definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control y con un intervalo de relaciones x/y definidas previamente como características de muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como enfermos de otra demencia tal como DLB;

(c)

determinar, a partir de la comparación realizada en el paso (b), si el individuo sufre o no AD u otra demencia tal como DLB, en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como pacientes de AD es una indicación de que dicho individuo sufre AD; en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos de control es una indicación de que dicho individuo no sufre AD; y en donde una relación x/y en un intervalo definido previamente como característico para muestras de fluidos corporales obtenidas de individuos diagnosticados como enfermos de otra demencia tal como DLB es una indicación de que dicho individuo sufre otra demencia tal como DLB.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{42} o péptidos A\beta_{43} capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta, e y es el nivel de péptidos A\beta_{42} o péptidos A\beta_{43} capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50, y/o Anti-N1(D).

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado adicionalmente porque y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado adicionalmente porque y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo que reconoce un epítope diferente del epítope 3D6, BAN-50, y/o Anti-N1(D).

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado adicionalmente porque y es el nivel de péptidos A\beta capaces de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal 4G8, con el anticuerpo monoclonal 6E10 y/o con el anticuerpo monoclonal 10H3.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-C)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-C)}.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} y/o A\beta_{(1-43)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)} y/o péptidos A\beta_{(N-43)}.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(N-42)}.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-C)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(11-C)}.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} y/o A\beta_{(1-43)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(11-42)} y/o A\beta_{(11-43)}.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado adicionalmente porque x es el nivel de péptidos A\beta_{(1-42)} e y es el nivel de péptidos A\beta_{(11-42)}.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado adicionalmente porque la muestra de fluido corporal es una muestra de fluido cerebroespinal o una muestra de plasma o suero.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso en el seguimiento del tratamiento de un individuo que tiene probabilidad de desarrollar AD o de un individuo que ha sido diagnosticado como enfermo de AD.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado adicionalmente porque la relación x/y se determina inmunológicamente haciendo uso de un primer anticuerpo que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina) y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta y haciendo uso de un segundo anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta.

20. Uso de un juego de anticuerpos para determinación inmunológica de la relación x/y en los métodos de las reivindicaciones 1 y 4, que comprende al menos un primer anticuerpo que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta para la detección de X y un segundo anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta para determinación de Y.

\newpage

21. Uso de un kit de diagnóstico que comprende un primer anticuerpo que reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta, y un segundo anticuerpo que reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico), el segundo aminoácido (A; alanina), y/o el tercer aminoácido (E; ácido glutámico) del péptido A\beta para determinación inmunológica de la relación x/y en los métodos de las reivindicaciones 1 y 4.

22. Uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizado adicionalmente porque se trata de un ensayo multiparamétrico para la detección simultánea de los niveles de diferentes péptidos A\beta.

23. Uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado adicionalmente porque utiliza la tecnología xMap^{TM}.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50 o Anti-N1(D).

26. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer amino-ácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50 o Anti-N1(D) y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta que no contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta diferente del epítope 3D6, BAN-50 y/o Anti-N1(D).

30. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el primer anticuerpo reconoce específicamente un epítope del péptido A\beta que contiene el primer aminoácido (D; ácido aspártico) del péptido A\beta y el segundo anticuerpo reconoce el epítope del péptido A\beta diferente del epítope 3D6, BAN-50 y/o Anti-N1(D).

31. El método de acuerdo con la reivindicación 19, el uso de un juego de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 20, o el uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado adicionalmente porque el primer anticuerpo es el anticuerpo monoclonal 3D6, BAN-50 o Anti-N1(D), y el segundo anticuerpo reconoce un epítope del péptido A\beta diferente del epítope 3D6, BAN-50 y/o Anti-N1(D).