ES2302122T3 - Derivados de 9-cloro-15-desoxiprostaglandina, proceso para su preparacion y su uso como medicamento. - Google Patents

Abstract

Compuestos de la fórmula general I (Ver fórmula) donde R1 es un grupo CH2OH, -COOR2, -CONHR2 o -CONHR3, R2 es hidrógeno, un radical alquilo C1-C10 que es lineal o ramificado, opcionalmente mono- a poliinsaturado y está opcionalmente mono- a polisustituido con halógeno, alcoxi C1-C4, arilo C3-C10 sustituido o aroílo C3-C10 opcionalmente sustituido, di-alquilamino C1-C5 o tri-alquilamino C1-C5, un cicloalquilo C3-C10 que está sustituido opcionalmente con alquilo C1-C4, un arilo C3-C10 que está sustituido opcionalmente con fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo que puede estar sustituido a su vez en posición 3 y en posición 4 con flúor, cloro, alcoxi o trifluorometilo o en posición 4 con hidroxi, halógeno, fenilo, uno o más grupos alquilo C1-C4, clorometilo, fluorometilo, trifluorometilo, carboxi, hidroxi o alcoxi C1-C4, o un heterocicloalquilo C3-C7, R3 es un ácido carboxílico C1-C15 o ácido sulfónico C1-C15, A es un grupo cis-CH=CH- o -CH2-CH2-, B es un grupo trans-CH=CH- o -CH2-CH2-, W es un alquileno C2-C6, R4 es un grupo hidroxi, un radical O-R6 u O-R7 donde R6 es un radical tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, trimetilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butil-difenilsililo o tribencilsililo y R7 es un ácido carboxílico C1-C15, R5 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C10 o alquenilo C1-C10, n es el número 1-4, y las sales de los mismos y los clatratos con ciclodextrina de los mismos, con bases fisiológicamente toleradas.

Description

Derivados de 9-cloro-15-desoxiprostaglandina, proceso para su preparación y su uso como medicamento.

La presente invención se refiere a derivados de 9-cloroprostaglandina, un proceso para su preparación y su uso como medicamentos.

Se sabe desde hace mucho tiempo que las prostaglandinas son las moléculas clave en los procesos de la biología reproductora femenina tales como, por ejemplo, el control de la ovulación, de la fertilización, de la nidación, de la decidualización (v.g. formación de la placenta) y de la menstruación. Las prostaglandinas desempeñan también un papel importante en los cambios patológicos en el tracto reproductivo, con inclusión de menorragia, dismenorrea, endometriosis y cáncer. El mecanismo por el cual las prostaglandinas realizan estos cambios no se ha esclarecido todavía por completo. Resultados recientes indican que las prostaglandinas, sus receptores y los caminos de transducción de señales de los mismos están implicados en procesos tales como angiogénesis, apoptosis y proli-
feración.

Los efectos de las prostaglandinas están mediados por sus receptores acoplados a proteína G que están localizados en la superficie celular. La prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) presenta interés particular, teniendo una gran diversidad de efectos celulares por fijación a subtipos de receptores funcionalmente diferentes, a saber los receptores EP_{1}, EP_{2}, EP_{3} y EP_{4}. Así, ha sido posible demostrar que las funciones reproductoras están deterioradas en los ratones con EP_{2} inutilizado ("knockout") (EP_{2}), y que estos animales tienen un "tamaño de camada" más pequeño (Matsumoto et al., 2001, Biology of Reproduction 64, 1557-1565). Fue asimismo posible demostrar que estos ratones con EP_{2} inutilizado (Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999, 31 agosto; 96(18): 10501-10506) exhiben una expansión del cúmulus claramente reducida y subfertilidad severa, demostrando la importancia del receptor de prostaglandina EP_{2} para este proceso. El receptor EP_{2}, de acuerdo con ello, representa una diana importante para el desarrollo de medicamentos para el control de la fertilidad femenina. Las cuatro subclases del receptor EP_{2} abren la posibilidad de un desarrollo direccionado de compuestos PGE_{2} selectivamente activos. Sin embargo, hasta la fecha, apenas se conocen algunos ligandos selectivos del receptor EP_{2}, y la mayoría de los compuestos conocidos se fijan también a los otros subtipos de receptores EP_{2} tales como, por ejemplo, al receptor EP_{4}.

La patente europea EP 1306087 describe agonistas del receptor EP_{2} que se utilizan en el tratamiento de la disfunción eréctil. La misma clase de estructuras se describe en la patente europea EP 860430, y se reivindica su uso para producir un medicamento para el tratamiento de trastornos inmunológicos, asma y aborto. La solicitud WO 04/32965 describe los agonistas de receptores EP_{2} que se utilizan para el tratamiento y la prevención de trastornos causados por una disfunción orgánica causada por isquemia. WO 04/009117 describe agonistas de los receptores EP_{2} y EP_{4} para el tratamiento de trastornos causados por contracción uterina, por ejemplo menstruación dolorosa.

Las solicitudes WO 03/74483 y WO 03/09872 describen agonistas que se fijan por igual a los receptores EP_{2} y EP_{4} (Ono Pharmaceuticals).

Los agonistas del receptor EP_{2} y del receptor EP_{4} se describen frecuentemente en conexión con el tratamiento de la osteoporosis (WO 99/19300, US 2003/0166631, WO 03/77910, WO 03/45371, WO 03/74483 y WO 03/09872) y para el tratamiento del glaucoma (WO 04/37813, WO 04/37786, WO 04/19938, WO 03/103772, WO 03/103664, US 6747037, US 6410591, WO 03/40123, WO 03/47513, y WO 03/47417).

La solicitud de patente WO 04/12656 reivindica agonistas del receptor EP_{2} en conexión con la inflamación.

La solicitud de patente WO 03/77919 reivindica agonistas del receptor EP_{4} para el tratamiento de la fertilidad. Agonistas selectivos del receptor EP_{2} que controlen los procesos que contribuyen finalmente a la nidación y decidualización y por consiguiente a la promoción de la fertilidad no han sido descritos hasta la fecha.

De ello se origina el objeto de proporcionar compuestos estables, selectivos y eficaces que se fijan al receptor EP_{2} para el desarrollo de nuevos medicamentos.

Las solicitudes de patente europea de Ono Pharmaceuticals (EP 0030377 y EP 1306087) arriba mencionadas describen derivados de prostaglandina que tienen un átomo de cloro en posición 9. Sin embargo, los compuestos reivindicados en estas patentes comprenden entre otras cosas un grupo hidroxi en la cadena lateral inferior, v.g. en posición 15 ó 16.

\newpage

Se ha encontrado ahora, sorprendentemente, que compuestos de la fórmula general I

1

donde

R^{1}

es un grupo CH_{2}OH, -COOR^{2}, -CONHR^{2} o -CONHR^{3},

R^{2}

es hidrógeno,

\quad

radical alquilo C_{1}-C_{10} que es lineal o ramificado, opcionalmente mono- a poliinsaturado y está opcionalmente mono- a polisustituido con halógeno, alcoxi C_{1}-C_{4}, arilo C_{3}-C_{10} sustituido o aroílo C_{3}-C_{10} opcionalmente sustituido, di-alquilamino C_{1}-C_{5} o tri-alquilamino C_{1}-C_{5},

\quad

un cicloalquilo C_{3}-C_{10} que está sustituido opcionalmente con alquilo C_{1}-C_{4}, un arilo C_{3}-C_{10} que está sustituido opcionalmente con fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo que puede estar sustituido a su vez en posición 3 y en posición 4 con flúor, cloro, alcoxi o trifluorometilo o en posición 4 con hidroxi, halógeno, fenilo, uno o más grupos alquilo C_{1}-C_{4}, clorometilo, fluorometilo, trifluorometilo, carboxi, hidroxi o alcoxi C_{1}-C_{4},

\quad

o un heterocicloalquilo C_{3}-C_{7},

R^{3}

es un ácido carboxílico C_{1}-C_{15} o ácido sulfónico C_{1}-C_{15},

A

es un grupo cis-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

B

es un grupo trans-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

W

es un alquileno C_{2}-C_{6},

R^{4}

es un grupo hidroxi, un radical O-R^{6} u O-R^{7} donde R^{6} es un radical tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, trimetilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butil-difenilsililo o tribencilsililo y R^{7} es un ácido carboxílico C_{1}-C_{15},

R^{5}

es hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{10} o alquenilo C_{1}-C_{10},

n

es el número 1-4,

\quad

y las sales de los mismos y los clatratos con ciclodextrina de los mismos, con bases fisiológicamente toleradas

resuelven las desventajas conocidas y, por omisión del grupo hidroxi, puede alcanzarse una mejor selectividad para el receptor EP_{2} y mejor actividad y duración de acción más larga.

Los grupos alquilo son grupos alquilo lineales o ramificados, saturados e insaturados que tienen 1-10 átomos de carbono. Ejemplos que pueden mencionarse son grupos metilo, etilo, propilo, butilo, iso-butilo, terc-butilo, ventilo, neopentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, butenilo, isobutenilo, propenilo, pentenilo, bencilo, m- y p-clorobencilo.

Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente mono- o poliinsustituidos con átomos de halógeno, v.g. flúor, cloro o bromo,

con grupos alcoxi tales como, por ejemplo, metoxi, etoxi, opcionalmente con grupos arilo o aroílo sustituidos, v.g. fenilo,

o con dialquilamino, v.g. dimetilamino, dietilamino, dimetilaminopropilo y trialquilamonio, en loa cuales debe preferirse la monosustitución.

Grupos arilo adecuados son grupos arilo tanto sustituidos como insustituidos tales como, por ejemplo, fenilo, 1-naftilo y 2-naftilo, cada uno de los cuales puede estar sustituido con 1-3 átomos de halógeno, un grupo fenilo, 1-3 grupos alquilo cada uno de los cuales tiene 1-4 átomos C, un grupo clorometilo, fluorometilo, trifluorometilo, carboxi, hidroxi o grupo alcoxi que tiene 1-4 átomos C.

El grupo cicloalquilo puede comprender 3-10 átomos de carbono en el anillo. Los anillos pueden estar sustituidos con grupos alquilo que tienen 1-4 átomos de carbono. Ejemplos que pueden mencionarse son ciclopentilo, ciclohexilo, metilciclohexilo y adamantilo. Grupos heterocíclicos adecuados son heterociclos de 5 y 6 miembros que comprenden al menos un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre. Ejemplos que pueden mencionarse son 2-furilo, 2-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, oxazolilo, tiazolilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, 3-furilo, 3-tienilo, y 2-tetrazolilo.

Residuos de ácidos fisiológicamente tolerados son adecuados como residuo ácido. Ácidos preferidos son ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos orgánicos que tienen 1-15 átomos de carbono y que pertenecen a las series alifática, cicloalifática, aromática, y heterocíclica. Ejemplos de sustituyentes que pueden mencionarse son grupos alquilo C_{1}-C_{15}, hidroxi, alcoxi C_{1}-C_{15}, oxo y amino, o átomos de halógeno. Ejemplos de ácidos carboxílicos que pueden mencionarse son los siguientes: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido caproico, ácido enántico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido cáprico, ácido undecílico, ácido láurico, ácido tridecílico, ácido mirístico, ácido pentadecílico, ácido trimetilacético, ácido dietilacético, ácido terc-butilacético, ácido ciclopropilacético, ácido ciclopentilacético, ácido ciclohexilacético, ácido ciclopropanocarboxílico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido fenilacético, ácido fenoxiacético, ácido metoxiacético, ácido etoxiacético, ácido mono-, di- y tricloroacético, ácido aminoacético, ácido dietilaminoacético, ácido piperidinoacético, ácido morfolinoacético, ácido láctico, ácido succínico, ácido adípico, ácido benzoico, ácidos benzoicos sustituidos con grupos halógeno, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi o carboxi, ácido nicotínico, ácido isonicotínico, ácido furan-2-carboxílico, ácido ciclopentilpropiónico. Ejemplos de ácidos sulfónicos adecuados son ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido isopropanosulfónico, ácido \beta-cloroetanosulfónico, ácido butanosulfónico, ácido ciclopentanosulfónico, ácido ciclohexanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido p-clorobencenosulfónico, ácido N,N-dimetilaminosulfónico, ácido N,N-dietilamino-sulfónico, ácido N,N-bis(\beta-cloro-etil)aminosulfónico, ácido N,N-diisobutilaminosulfónico, ácido N,N-dibutil-aminosulfónico, y ácido pirrolidino-, piperidino-, piperazino-, N-metilpiperazino- y morfolinosulfónico.

El grupo hidroxi puede estar modificado funcionalmente, por ejemplo por eterificación o esterificación.

Residuos éter adecuados son residuos conocidos por las personas expertas. Se da preferencia a residuos éter que pueden eliminarse fácilmente, tales como, por ejemplo, los radicales tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, trimetilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butildifenilsililo o tribencilsililo.

Radicales acilo adecuados son los ácidos carboxílicos mencionados bajo R^{7}. Ejemplos de aquéllos que pueden mencionarse por su nombre son acetilo, propionilo, butirilo y benzoílo.

Adecuadas para la formación de sales son bases inorgánicas y orgánicas como son conocidas por las personas expertas para la formación de sales fisiológicamente toleradas. Ejemplos que pueden mencionarse son hidróxidos de metal alcalino tales como los hidróxidos de sodio y potasio, hidróxidos de metal alcalinotérreo, tales como hidróxido de calcio, amoníaco, aminas tales como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, morfolina, y tris(hidroximetil)metilamina.

Compuestos de la fórmula general I que han demostrado ser particularmente eficaces son aquéllos en los cuales

R^{1}

es un grupo CH_{2}OH, -COOR^{2}, -CONHR^{2} o -CONHR^{3},

R^{2}

es hidrógeno o

\quad

un radical alquilo C_{1}-C_{10} que es lineal o ramificado, opcionalmente mono- a poliinsaturado y está monosustituido opcionalmente con flúor, cloro o bromo, con alcoxi C_{1}-C_{4}, arilo C_{3}-C_{10} sustituido o aroílo C_{3}-C_{10} opcionalmente sustituido, di-alquilamino C_{1}-C_{5} o tri-alquilamino C_{1}-C_{5},

\quad

un cicloalquilo C_{5}-C_{6} que está sustituido opcionalmente con alquilo C_{1}-C_{4},

\quad

un radical arilo C_{3}-C_{10} que está sustituido opcionalmente con fenilo, que puede estar sustituido en posición 3 ó 4 con flúor, cloro, alcoxi o trifluorometilo o en posición 4 con hidroxi,

\quad

un heterocicloalquilo C_{5}-C_{6} que puede estar interrumpido una o más veces por nitrógeno, oxígeno o azufre,

R^{3}

es un ácido carboxílico C_{1}-C_{10} o ácido sulfónico C_{1}-C_{10},

A

es un grupo cis-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

B

es un grupo trans-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

W

es un alquileno C_{2}-C_{6},

R^{4}

es un grupo hidroxi,

R^{5}

es hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o alquenilo C_{1}-C_{10}, y

n

es el número 1-4.

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Compuestos de la fórmula general I que han demostrado ser muy particularmente eficaces son aquéllos en los cuales

R^{1}

es un grupo -CH_{2}OH, -COOR^{2}, -CONHR^{2} o -CONHR^{3},

R^{2}

es hidrógeno o un alquilo C_{1}-C_{4} que está sustituido opcionalmente con fenilo,

\quad

un cicloalquilo C_{5}-C_{6,}

\quad

un arilo C_{3}-C_{6} que está sustituido opcionalmente con fenilo,

R^{3}

es un ácido carboxílico C_{1}-C_{6} o ácido sulfónico C_{1}-C_{6},

A

es un grupo cis-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

B

es un grupo trans-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

W

es un alquileno C_{2},

R^{4}

es un grupo hidroxi,

R^{5}

es hidrógeno, alquilo saturado C_{1}-C_{4} o alquenilo C_{1}-C_{5}, y

n

es el número 1-4.

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La invención se refiere adicionalmente a un proceso para la preparación de los derivados de prostano de acuerdo con la invención de la fórmula general I, caracterizado porque un aldehído de la fórmula general II:

2

en la cual R^{1} tiene el significado de los radicales -COOR^{2}, -CONHR^{3}, y A y R^{4} tienen los significados arriba indicados, en donde el grupo OH libre en R^{4} está protegido, se hace reaccionar con el carbanión de la sulfona de la fórmula general III

3

La acetilación de la hidroxisulfona resultante va seguida por eliminación reductora a fin de producir la olefina y, en caso apropiado, una desprotección subsiguiente de los grupos hidroxi que están protegidos en cualquier secuencia y, en caso apropiado, esterificación, eterificación y/o hidrogenación de enlaces dobles y/o esterificación de un grupo carboxi esterificado (R^{1} = COOR^{2}) y/o de un grupo carboxi libre (COOR^{2} con R^{2} = H) y/o conversión de un grupo carboxi libre (COOR^{2} con R^{2} = H) en una amida (R^{1} = CONR^{2}) y/o reducción de un grupo carboxi libre o esterificado (R^{1} = CONHR^{3}).

La reacción del aldehído de la fórmula general II con el carbanión generado por la sulfona III tiene lugar de una manera conocida per se utilizando un disolvente inerte tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano o dietil-éter a temperaturas comprendidas entre -100ºC y 24ºC, preferiblemente -100ºC a -70ºC. El carbanión de la sulfona III se genera de manera convencional con una base tal como, por ejemplo, butil-litio, metil-litio, terc-butóxido de potasio, hidruro de sodio, diisopropilamiduro de litio, preferiblemente butil-litio. La formación del carbanión se lleva a cabo a temperaturas de -78 a 25ºC, preferiblemente a -78ºC.

La acetilación del grupo hidroxi generado tiene lugar de manera conocida con anhídrido acético, en caso apropiado en presencia de una base, por ejemplo piridina, a temperaturas entre -78ºC y 25ºC.

La eliminación por reducción de la acetoxi-sulfona intermedia para dar la trans-olefina de la fórmula general I tiene lugar con polvo de magnesio en metanol con adición de una cantidad catalítica de clorotrimetilsilano. La reacción se lleva a cabo a temperaturas entre 0ºC y 60ºC, con preferencia entre 15ºC y 25ºC. Alternativamente, la eliminación reductora puede llevarse a cabo también con amalgama de sodio.

La reducción para dar los compuestos de la fórmula general I en la que R^{1} tiene el significado de un grupo -CH_{2}OH se lleva a cabo con un agente reductor adecuado para reducir los ésteres o ácidos carboxílicos, tal como, por ejemplo, hidruro de litio y aluminio o hidruro de diisobutilaluminio. Disolventes adecuados son dietil-éter, tetrahidrofurano, dimetoxietano, tolueno, etc. La reducción se lleva a cabo a temperaturas de -30ºC hasta el punto de ebullición del disolvente utilizado, preferiblemente 0ºC a 30ºC.

Grupos hidroxi funcionalmente modificados se liberan por métodos conocidos. Por ejemplo, la eliminación de grupos protectores de hidroxi tales como, por ejemplo, el radical tetrahidropiranilo se lleva a cabo en una solución acuosa de un ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido oxálico, ácido acético, ácido propiónico, entre otros, o en una solución acuosa de un ácido inorgánico tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico. Es conveniente añadir un disolvente orgánico inerte miscible en agua para mejorar la solubilidad. Ejemplos de disolventes orgánicos adecuados son alcoholes tales como metanol y etanol, y éteres tales como dimetoxietano, dioxano y tetrahidrofurano. Preferentemente se utiliza tetrahidrofurano. La eliminación se lleva a cabo preferiblemente a temperaturas entre 20ºC y
80ºC.

Los grupos acilo se hidrolizan por ejemplo con carbonatos o hidróxidos de metal alcalino o metal alcalinotérreo en un alcohol o en la solución acuosa de un alcohol. Alcoholes adecuados son alcoholes alifáticos tales como, por ejemplo, metanol, etanol, butanol, preferiblemente metanol. Carbonatos e hidróxidos de metal alcalino que pueden mencionarse son sales de potasio y sodio. Se prefieren las sales de potasio.

Ejemplos de carbonatos e hidróxidos alcalinotérreos adecuados son carbonato de calcio, hidróxido de calcio y carbonato de bario. La reacción tiene lugar entre -10ºC y +70ºC, preferiblemente a +25ºC.

El grupo éster -COOR^{2} para R^{1}, por ejemplo, en el cual R^{2} es un grupo alquilo que tiene 1-10 átomos C, se introduce por los métodos conocidos por las personas expertas. Los compuestos 1-carboxi se hacen reaccionar por ejemplo con diazohidrocarburos de una manera conocida per se. La esterificación con diazohidrocarburos tiene lugar por ejemplo por mezcla de una solución del diazohidrocarburo en un disolvente inerte, preferiblemente en dietil-éter, con el compuesto 1-carboxi en el mismo disolvente o en un disolvente inerte diferente, tal como, por ejemplo, cloruro de metileno. Después que la reacción se ha completado en 1 a 30 minutos, se elimina el disolvente y se purifica el éster de manera convencional. Los diazoalcanos son, o bien conocidos, o pueden prepararse por métodos conocidos (Org. Reactions Vol. 8, páginas 389-394 (1954)).

El grupo éster COOR^{2} para R^{1}, en el cual R^{2} es un grupo arilo sustituido o insustituido, se introduce por los métodos conocidos por las personas expertas. Por ejemplo, los compuestos 1-carboxi se hacen reaccionar con los compuestos aril-hidroxi apropiados con diciclohexilcarbodi-imida en presencia de una base adecuada, por ejemplo piridina, DMAP, trietilamina, en un disolvente inerte. Disolventes adecuados son cloruro de metileno, cloruro de etileno, cloroformo, acetato de etilo, tetrahidrofurano, preferiblemente cloroformo. La reacción se lleva a cabo a temperaturas entre -30ºC y +50ºC, preferiblemente a 10ºC.

Si se desea reducir los enlaces dobles C=C presentes en el producto inicial, la hidrogenación tiene lugar por métodos conocidos per se.

La hidrogenación del enlace doble 5,6 se lleva a cabo de una manera conocida per se a temperaturas bajas, con preferencia a aproximadamente -20ºC, en una atmósfera de hidrógeno en presencia de un catalizador de metal noble. Un ejemplo de un catalizador adecuado es paladio al 10% sobre carbono.

Si se hidrogenan tanto el enlace doble 5,6 como el enlace doble 13,14, se utiliza una temperatura más alta, con preferencia aproximadamente 20ºC.

Los derivados de prostaglandina de la fórmula general I en los que R^{2} significa un hidrógeno pueden convertirse en una sal por neutralización utilizando cantidades adecuadas de las bases inorgánicas apropiadas. Por ejemplo, disolviendo los ácidos prostaglandínicos apropiados en agua que contiene la cantidad estequiométrica de la base da como resultado la sal orgánica sólida, después que se ha evaporado el agua o se ha añadido un disolvente miscible en agua, v.g. alcohol o acetona.

Una sal de amina se prepara de manera convencional disolviendo el ácido prostaglandínico por ejemplo en un disolvente adecuado, tal como etanol, acetona, dietil-éter, acetonitrilo o benceno, y añadiendo al menos la cantidad estequiométrica de la amina a esta solución. Esto da usualmente como resultado la sal en forma sólida, o la misma se aísla de manera usual después de evaporación del disolvente.

El grupo amida -CONHR^{3} para R^{1} se introduce por métodos conocidos por las personas expertas. Los ácidos carboxílicos de la fórmula general I (R^{2} = H) se convierten inicialmente en el anhídrido mixto con cloroformiato de isobutilo en presencia de una amina terciaria tal como, por ejemplo, trietilamina. La reacción del anhidro mixto con la sal de metal alcalino de la amina apropiada o con amoníaco (R^{3} = H) tiene lugar en un disolvente o una mezcla de disolventes inerte, tal como, por ejemplo, tetrahidrofurano, dimetoxietano, dimetilformamida, triamina hexametilfosfórica, a temperaturas entre -30ºC y +60ºC, preferiblemente a 0ºC hasta 30ºC.

Una posibilidad adicional para introducir el grupo amida -CONHR^{3} para R^{1} consiste en hacer reaccionar un ácido 1-carboxílico de la fórmula general I (R^{2} = H), en la cual existe opcionalmente protección intermedia de los grupos hidroxi libres, con compuestos de la fórmula general IV

IVO = C = N - R^{3}

en la cual R^{3} tiene el significado arriba indicado.

La reacción del compuesto de la fórmula general I (R^{2} = H) con un isocianato de la fórmula peral IV tiene lugar en caso apropiado con adición de una amina terciaria tal como, por ejemplo, trietilamina o piridina. La reacción puede llevarse a cabo sin disolvente o en un disolvente inerte, preferiblemente acetonitrilo, tetrahidrofurano, acetona, dimetilacetamida, cloruro de metileno, dietil-éter, tolueno, a temperaturas entre -80ºC y 100ºC, con preferencia a 0ºC hasta 30ºC.

Si el material de partida comprende grupos OH en el residuo de prostano, estos grupos OH se hacen reaccionar también. Si los productos finales eventualmente deseados comprenden grupos hidroxi libres en el residuo de prostano, es conveniente partir de materias primas con protección intermedia de aquéllos por radicales éter o acilo que pueden ser eliminados fácilmente de modo preferible.

Los aldehídos de la fórmula general II que se utilizan como material de partida son conocidos o se pueden preparar por ejemplo por epoxidación selectiva de una manera conocida per se del enlace doble 13,14 de una 9-haloprostaglandina de la fórmula general V, en la que R^{1} significa preferiblemente un grupo -COOCH_{3}, con hidroperóxido de terc-butilo e isopropóxido de titanio (IV) en cloruro de metileno a -20ºC.

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La escisión subsiguiente del epóxido con ácido peryódico en dietil-éter y, en caso apropiado, protección del grupo 11-hidroxi, por ejemplo con dihidropirano, proporciona el aldehído de la fórmula general II.

La sulfona de la fórmula general III utilizada como material de partida puede prepararse a partir de ácidos cicloalquilcarboxílicos de la fórmula general VII en la cual n tiene el significado arriba indicado, por alquilación con un haluro de alquilo de la fórmula general VIII en la cual R^{5} tiene el significado arriba indicado, y el halógeno puede ser yodo, cloro o bromo.

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La esterificación de IX con yoduro de metilo y carbonato de potasio en acetona va seguida por reducción del éster metílico resultante al alcohol con hidruro de litio y aluminio en dietil-éter. La oxidación del alcohol con complejo SO_{2}-piridina en presencia de trietilamina en una mezcla de dimetil-sulfóxido y cloruro de metileno proporciona el aldehído de la fórmula general X. Una reacción Wittig-Horner subsiguiente y, en caso apropiado, hidrogenación del enlace doble para dar XI conduce, después de reducción con hidruro de diisobutilaluminio, al alcohol de la fórmula general XII. La hidrogenación del enlace doble puede, sin embargo, llevarse a cabo también después de reducción del éster XI al alcohol XII, donde W significa un enlace doble.

El reemplazamiento subsiguiente del grupo hidroxi tiene lugar después de tosilación intermedia por reacción con tiofenol en tolueno. El tioéter XIII obtenido de este modo se oxida finalmente en una solución acuosa metanólica para dar la sulfona de la fórmula general III.

Comparados con la prostaglandina E_{2}, los nuevos agonistas EP_{2} se distinguen por mayores selectividad y estabilidad. Los nuevos análogos de prostaglandina del tipo EP_{2} son adecuados por ejemplo para el tratamiento y la profilaxis de trastornos que incluyen trastornos de la fertilidad, enfermedades infecciosas, cáncer, infecciones virales, trastornos cardiovasculares, presión intraocular elevada, glaucoma, trastornos del sistema esquelético, trastornos angiogénicos, anormalidades de la contracción uterina, dolor y trastornos nefrológicos.

Por trastornos de la fertilidad se entienden trastornos que conducen a que no tenga lugar la ovulación, a que el complejo celular oocito ovulado/cúmulus no sea fertilizable, a que no tenga lugar la nidación de un oocito fertilizado y no tenga lugar decidualización; por enfermedades infecciosas se entienden enfermedades causadas por parásitos unicelulares; por cáncer se entienden tumores sólidos y leucemia; por infecciones virales se entienden infecciones por citomegalovirus, hepatitis B y C, y trastornos por HIV; por trastornos cardiovasculares se entienden trastorno isquémico de reperfusión, estenosis, arterioesclerosis y restenosis; por trastornos angiogénicos se entienden por ejemplo endometriosis; por presión intraocular elevada se entiende glaucoma; por anormalidades de la contracción uterina se entienden por ejemplo menstruación dolorosa; por trastornos del sistema esquelético se entienden osteoporosis, y por trastornos nefrológicos se entienden glomerulonefritis.

Para uso de los compuestos de acuerdo con la invención como medicamentos, los mismos se convierten en la forma de un producto farmacéutico que, además del ingrediente activo, comprende materiales vehículo farmacéuticos inertes orgánicos o inorgánicos, adecuados para administración enteral o parenteral, tales como, por ejemplo, agua, gelatina, goma arábiga, lactato, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetales y polialquilenglicoles. Los productos farmacéuticos pueden encontrarse en forma sólida, por ejemplo como tabletas, tabletas recubiertas, supositorios, cápsulas, o en forma líquida, por ejemplo como soluciones, suspensiones o emulsiones. Los mismos comprenden adicionalmente en caso apropiado excipientes tales como conservantes, estabilizadores, agentes humectantes o emulsionantes; sales para alterar la presión osmótica, o tampones.

La presente invención se refiere también a estos productos farmacéuticos.

Las soluciones de aerosol se producen convenientemente por inhalación.

Son particularmente adecuadas para uso oral tabletas, tabletas recubiertas o cápsulas con talco y/o vehículos o aglomerantes de hidratos de carbono, tales como, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz, o almidón de patata. Es también posible el uso en forma líquida, tal como, por Ejemplo, como fluido al cual se añade un edulcorante en caso apropiado.

Se utilizan soluciones acuosas o aceitosas estériles inyectables para administración parenteral. Son particularmente adecuadas soluciones para inyección o suspensiones, especialmente soluciones acuosas de los compuestos activos en aceite de ricino polietoxilado.

Los supositorios, por ejemplo, son adecuados y habituales para administración vaginal.

Sistemas vehículo que pueden utilizarse también son agentes tensioactivos tales como sales de ácidos biliares o fosfolípidos animales o vegetales, pero también mezclas de los mismos, y liposomas o constituyentes de los mismos.

La presente invención se refiere asimismo a las administraciones enteral, parenteral, vaginal y oral.

Los compuestos de la invención se administran a un paciente que se encuentra en necesidad de ello en una cantidad eficaz. Por una "cantidad eficaz" se entiende una cantidad o dosis necesaria para tratar o prevenir un trastorno particular, cantidad o dosis que puede ser determinada por métodos conocidos en la técnica sin experimentación excesiva.

La dosis de los ingredientes activos puede variar dependiendo de la ruta de administración, la edad y el peso del paciente, la naturaleza y gravedad del trastorno a tratar, y de factores similares. La dosis diaria es 0,5-1000 mg, preferiblemente 50-200 mg, siendo posible que la dosis se suministre como una dosis simple a administrar de una vez o diluida en dos o más dosis diarias.

La presente invención se refiere también a medicamentos para el tratamiento de los trastornos arriba mencionados, que comprenden al menos un compuesto de acuerdo con la fórmula general I, y medicamentos con sustancias de formulación y vehículos adecuados.

La presente invención se refiere también al uso de los compuestos de la fórmula general (I) para producir un medicamento para el tratamiento y la profilaxis de trastornos que incluyen trastornos de la fertilidad, enfermedades infecciosas, cáncer, infecciones virales, trastornos cardiovasculares, presión intraocular elevada, glaucoma, trastornos del siste-
ma esquelético, trastornos angiogénicos, anormalidades de la contracción uterina, dolor y trastornos nefrológicos.

Por trastornos de la fertilidad se entienden trastornos que conducen a que no tenga lugar la ovulación, a que el complejo celular oocito ovulado/cúmulus no sea fertilizable, a que no tenga lugar la nidación de un oocito fertilizado y no tenga lugar decidualización; por enfermedades infecciosas se entienden enfermedades causadas por parásitos unicelulares; por cáncer se entienden tumores sólidos y leucemia; por infecciones virales se entienden infecciones por citomegalovirus, hepatitis B y C, y trastornos por HIV; por trastornos cardiovasculares se entienden trastorno isquémico de reperfusión, estenosis, arterioesclerosis y restenosis; por trastornos angiogénicos se entienden por ejemplo endometriosis; por presión intraocular elevada se entiende glaucoma; por anormalidades de la contracción uterina se entienden por ejemplo menstruación dolorosa; por trastornos del sistema esquelético se entienden osteoporosis, y por trastornos nefrológicos se entienden glomerulonefritis.

Los compuestos de acuerdo con la invención de la fórmula general I se fijan al receptor EP_{2} y tienen acción agonista. La fijación de PGE_{2} al subtipo EP_{2} del receptor de PGE_{2} humano induce la activación de las adenilato-ciclasas asociadas a la membrana y conduce a la formación de cAMP.

La Figura 1 muestra una actividad muy alta (CE50 < 9,5 x 10 e-10 M), en el ensayo de agonismo celular sin inhibición alguna del ensayo de antagonismo (CI_{50} > 2 x 10 e-5 M).

La presente invención se refiere también al uso de las sustancias de acuerdo con la invención como agonistas del receptor EP_{2}.

Los compuestos de acuerdo con la invención de la fórmula general I tienen un efecto profértil. El oocito está rodeado en el folículo antral preovulatorio por células de cúmulus que forman un anillo denso de células alrededor del oocito. Después del pico de hormona luteinizante (pico LH), se activa una serie de procesos que conduce a un gran cambio morfológico en este anillo de células compuesto de células de cúmulus. En este caso, las células de cúmulus forman una matriz extracelular que conduce a la denominada expansión del cúmulus (Vanderhyden et al. Dev. Biol. 1990, agosto; 140(2): 307-317). Esta expansión del cúmulus es un componente importante del proceso ovulatorio y de la posibilidad subsiguiente de fertilización.

Las prostaglandinas, y en este caso la prostaglandina E_{2} cuya síntesis es inducida por el pico de LH, tienen una importancia crucial en la expansión del cúmulus. Ratones con el prostanoide EP_{2} inutilizado (Hizaki et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, agosto 31, 96(18): 10501-6) exhiben una expansión del cúmulus notablemente reducida y subfertilidad severa, demostrando la importancia del receptor prostanoide EP_{2} para este proceso.

El agonista EP_{2} conduce a una gran expansión, dependiente de la concentración, en el complejo de cúmulus. La expansión del cúmulus inducida por la sustancia de ensayo es equivalente en concentraciones de 0,5 \muM y 1 \muM a la expansión del cúmulus inducida por el agonista natural del receptor EP_{2}, PGE_{2}, en una concentración de 1 \muM (n = 16 complejos cúmulus-oocito por grupo; véase la Figura 1).

El agonista EP_{2} conduce a un aumento importante de oocitos ovulados dependiente de la concentración. Este importante aumento en oocitos ovulados tiene lugar por administración de sólo 0,00015 mg/animal en cada caso y demuestra que es posible aumentar el número de oocitos ovulados incluso con una dosis estándar de HCG utilizada para la ovulación (n = 11-12 animales por grupo; **p < 0,005 y *p < 0,05), Figura 2).

La presente invención se refiere también al uso de los compuestos de acuerdo con la invención para el tratamiento de trastornos de la fertilidad tales como ovulación deteriorada o ausente, fertilización deteriorada del complejo oocito/células de cúmulus, implante deteriorado y decidualización deteriorada.

Las prostaglandinas juegan un papel importante en la angiogénesis (Sales, Jabbour, 2003, Reproduction 126, 559-567).

La endometriosis es un trastorno crónico causado por deterioros de los vasos sanguíneos. Aproximadamente el 10% de las mujeres sufren regularmente de hemorragias intensas durante la menstruación, causadas por cambios en los vasos sanguíneos del endometrio. Adicionalmente, se han observado diferencias estructurales en los vasos sanguíneos, tales como, por ejemplo, formación incompleta de la capa de células musculares lisas (Abberton et al, 1999, Hum. Reprod. 14, 1072-1079). Dado que la pérdida sanguínea durante la menstruación está controlada parcialmente por la constricción de los vasos sanguíneos, es evidente que los defectos en los músculos lisos aportan una contribución sustancial a la hemorragia.

Las prostaglandinas y los efectos mediados por el receptor EP_{2} juegan también un papel en la regulación hormonal de las lesiones del endometrio (Sun et al. 2003, Endocrinology 144, 3934-3942).

Evidencias crecientes sugieren que la endometriosis está asociada con una respuesta inflamatoria importante que puede estar mediada por macrófagos y linfocitos activados así como por niveles incrementados de citoquinas, quimioquinas, y factores de crecimiento. Se supone que estos procesos inflamatorios intervienen como mediadores de algunas de las características clínicas asociadas con la endometriosis. Se sabe que el fluido peritoneal de las mujeres con endometriosis contiene más células inflamatorias y sus citoquinas, quimioquinas, y factores de crecimiento asociados (Murphy AA. Clinical aspects of endometriosis. Ann NY Acad. Sci. marzo 2002; 955:1-10). El resultado es un entorno que favorece la implantación y proliferación.

Las prostaglandinas, y en este caso la prostaglandina E_{2}, reducen la expresión de citoquinas inflamatorias, tales como TNF\alpha a partir de los macrófagos activados. Los ratones con el prostanoide EP_{2} inutilizado (Shinomiya S et al. Regulation of TNF\alpha y IL-10 production by prostaglandins I2 y E2: studies with prostaglandin receptor-deficient mice y prostaglandin E-receptor subtype-selective synthetic agonists (Bioch Phar 2001; 61 1153) fracasan en cuanto a la respuesta a los agonistas de EP_{2}, demostrando la importancia del receptor del prostanoide EP_{2} para este
proceso.

La Tabla 1 muestra que un agonista EP_{2} conduce a una inhibición en los niveles de citoquinas medidos en el sobrenadante de cultivo. El agonista EP_{2} causa también una disminución importante en TNF\alpha como se muestra en la Figura 3.

La presente invención se refiere al uso de los compuestos de la fórmula general I para el tratamiento de la endometriosis.

Las prostaglandinas juegan un papel importante en la contracción uterina, y contracciones excesivamente fuertes son responsables de la menstruación dolorosa (Sales, Jabbour, 2003, Reproduction 126, 559-567).

La presente invención se refiere al uso de las sustancias de la fórmula general I para el tratamiento de la menstruación dolorosa.

Los agonistas del receptor EP_{2} juegan adicionalmente un papel importante en el control de la presión intraocular. Ha sido posible demostrar que en particular los receptores EP_{2} están presentes a concentraciones altas en los vasos de la red trabecular (TM) del ojo. Las lágrimas salen del ojo a través del TM y el canal de Schlemm, y los agonistas del receptor EP_{2} influyen en la dinámica del fluido lacrimal por estimulación del flujo de salida de fluido lacrimal, conduciendo por tanto a una reducción en la presión intraocular (W. Kamphuis et al. Current Eye Res. 2004, 29, 17-26). La presente invención se refiere al uso de las sustancias de acuerdo con la invención para el tratamiento de la presión intraocular elevada tal como la asociada entre otras cosas con el glaucoma.

Las prostaglandinas juegan también un papel importante en los procesos que contrarrestan la osteoporosis. La presente invención se refiere por tanto al uso de las sustancias de acuerdo con la invención para el tratamiento de la osteoporosis.

Las prostaglandinas juegan también un papel importante en los procesos que controlan la presión sanguínea. La presente invención se refiere por tanto al uso de las sustancias de acuerdo con la invención para el tratamiento de la presión sanguínea elevada.

Las prostaglandinas influyen también en la producción de citoquinas. La esclerosis múltiple (MS) está considerada como una enfermedad sistémica autoinmune mediada por los linfocitos T, cuyo tejido diana es el sistema nervioso central. Los perfiles de liberación de citoquinas de los linfocitos T pueden desviarse hacia el linaje adyuvante T1 o el linaje adyuvante T2 (Th-1 o Th-2). Las células Th-1 secretan citoquinas tales como el interferón gamma (INF-\gamma) e inducen una respuesta inmune mediada por las células, en tanto que las células Th-2 secretan IL-4, IL-5 e IL-10 e inducen una respuesta humoral o mediada por anticuerpos (Mossman et al. 1989, Annual Rev. Immunol. 7: 145-173). La expresión de INF-\gamma está asociada con MS y la utilización de una medida multifactorial de la incapacidad, y la expresión de IFN-\gamma en respuesta a péptidos PLP y péptidos MBP está correlacionada significativamente con la incapacidad (Hirsch et al. 1985, J. Clin. Immunol Nov; 5(6): 386-389; Moldovan et al. 2003, J. Neuroimmunol. Aug; 141 (1-2): 132-140). Es importante que estudios clínicos demuestran que la administración de IFN-\gamma causa exacerbaciones en los pacientes de MS (Panitch et al., Lancet, abril 18; (8538):893-895).

La Tabla 2 muestra que el agonista EP_{2} conduce a una inhibición de la expresión de IFN-\gamma a partir de células T donantes humanas activadas en el ensayo de las células T activadas. La Tabla 3 muestra una regulación decreciente de las citoquinas asociadas a Th-1 en un ensayo de células dendríticas derivadas de monocitos de donantes humanos activadas en presencia de un agonista EP_{2}. Por esta razón, tanto por inhibición de la expresión de INF-\gamma directamente como por el desvío de la polarización mediada por las células dendríticas de las células T CD4+ lejos del linaje Th-1 que expresan INF-\gamma, se predice que el agonista EP_{2} reducirá la expresión de INF-\gamma en los pacientes de MS.

La presente invención se refiere también al uso de los compuestos de acuerdo con la invención para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como enfermedades autoinmunes seleccionadas del grupo constituido por esclerosis múltiple, esclerosis múltiple secundaria progresiva, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, y alopecia areata.

En los casos en que no se describe la preparación de los compuestos de partida, los mismos son conocidos o pueden prepararse por analogía a compuestos conocidos o a procesos descritos en esta memoria. También es posible realizar todas las reacciones descritas en esta memoria en reactores paralelos o por medio de técnicas operativas combinatorias.

Las mezclas de isómeros pueden fraccionarse por métodos convencionales tales como, por ejemplo, cristalización, cromatografía o formación de sales en los enantiómeros o isómeros E/Z.

Las sales se preparan de una manera convencional por adición de la cantidad equivalente o un exceso de una base o un, que se encuentra en solución en caso apropiado, a una solución del compuesto de fórmula I, y separación del precipitado o tratamiento de la solución de manera convencional.

La invención se refiere por tanto a medicamentos basados en los compuestos de la fórmula general I y excipientes o vehículos convencionales.

Los ejemplos que siguen tienen por objeto explicar la invención en detalle sin que se entienda por los mismos una limitación.

Ejemplos de preparación Ejemplo 1 (5Z,13E)-(9R,11R)-9-Cloro-11-[(2H)-tetrahidropiran-2-il-oxi]-17,17-tetrametileno-20-nor-5,13-prostadienoato de metilo

Se añaden gota a gota 0,68 ml de una solución 1,6 M de butil-litio en hexano a una solución de 290 mg de 1-fenilsulfonil-4,4-(trimetileno)hexano en 2,4 ml de tetrahidrofurano a -78ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita a -78ºC durante 1,5 horas. Esta solución se añade luego gota a gota a -100ºC a una solución de 315 mg de aldehído (del Ejemplo 1c) en 2,4 ml de tetrahidrofurano. La mixtura se agita luego a -100ºC durante 30 min y a -78ºC durante 1 hora. Se añaden a continuación 0,16 ml de anhídrido acético a la mixtura de reacción, y la mixtura se calienta a la temperatura ambiente en el transcurso de 1 hora. La mixtura de reacción se mezcla con solución de cloruro de amonio y se extrae 3 veces con acetato de etilo, y las fases orgánicas reunidas se lavan una vez con agua y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. El compuesto intermedio de disuelve en 6 ml de metanol y, bajo nitrógeno, se añaden 160 mg de polvo de magnesio. La mixtura se agita luego a la temperatura ambiente durante 15 min. Se añade luego una gota de clorotrimetilsilano a la mixtura de reacción, y se agita la mixtura a la temperatura ambiente durante 3 horas más. La mixtura de reacción se añade a 5 ml de solución de cloruro de amonio enfriada en hielo y se extraen 3 veces con acetato de etilo, después de lo cual las fases orgánicas reunidas se lavan una vez con agua y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. La cromatografía en gel de sílice con hexano/acetato de etilo (8:2) da como resultado 140 mg del éster.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,75 (3H), 1,4-2,4 (30H), 3,44 (1H), 3,66 (3H), 3,8-4,15 (3H), 4,63 (1H), 5,15-5,65 (4H)

El aldehído de partida se prepara como sigue:

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1a) (5Z)-(9R,11R,13RS,14RS,15S)-9-Cloro-11,15-dihidroxi-16,16-dimetil-13,14-epoxi-5-prostenoato de metilo

Se añaden gota a gota 4,7 ml de isopropóxido de titanio(IV) a una solución de 6,52 g de (5Z,13E)-(9R,11R,15R)-9-cloro-11,15-dihidroxi-16,16-dimetil-5,13-prostadienoato de metilo en 33 ml de cloruro de metileno a -20ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita a -20ºC durante 30 min. Se añaden luego a la mixtura de reacción 6 ml de hidroperóxido de terc-butilo. Se añaden subsiguientemente una solución de 10 g de sulfato de hierro y 20 g de ácido cítrico en 100 ml de agua, y la mixtura se extrae 3 veces con cloruro de metileno. Las fases orgánicas reunidas se lavan una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. La cromatografía en gel de sílice con cloruro de metileno/acetato de etilo (0-40%) da como resultado 3,55 g del epóxido como un aceite incoloro.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,75-1,05 (9H), 1,1-2,4 (18H), 2,9-3,0 (2H), 3,2 (1H), 3,65 (3H), 4,0-4,15 (2H), 4,63 (1H), 5,3-5,55 (2H)

6

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1b) (5Z)-(9R,11R)-9-Cloro-11-hidroxi-14,15,16,17,18,19,-20-heptanor-12-oxo-5-prostenoato de metilo

Se agitan enérgicamente 5 g de ácido peryódico en 360 ml de éter bajo nitrógeno durante 1 hora. Se añaden 125 ml de esta solución a una solución de 2 g del epóxido en 5 ml de éter, y la mixtura se agita bajo nitrógeno a la temperatura ambiente. Después de 1 hora, se añaden 125 ml más de solución de ácido peryódico a la mixtura de reacción y, después de 2 h, se añade el resto de la solución de ácido peryódico. Después de filtración, se lava el filtrado una vez con solución saturada de bicarbonato de sodio, una vez con agua y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra a vacío. Rendimiento: 1,9 g del aldehído.

7

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1c) (5Z)-(9R,11R)-9-Cloro-11-[(2H)-tetrahidropiran-2-il-oxi]-14,15,16,17,18,19,20-heptanor-12-oxo-5-proste- noato de metilo

Se disuelven 1,9 g del aldehído en 20 ml de cloruro de metileno y se mezclan con 1,6 ml de dihidropirano y 8,8 mg de pTsOH y se agita durante 30 min. Se diluye luego la mixtura con éter, se lava una vez con solución saturada de bicarbonato de sodio y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra a vacío. La cromatografía en gel de sílice dos veces [primera columna: cloruro de metileno/acetato de etilo (2-10%), segunda columna: hexano/acetato de etilo (0-20%)] da como resultado 720 mg del tetrahidropiranil-éter.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 1,35-2,7 (17H), 3,65 (3H), 3,4-4,1 (3H), 4,58 (2H), 5,3-5,55 (2H), 9,75 (1H)

8

Preparación de la sulfona 1d) Ácido 2,2-(trimetileno)butanoico

Se añade gota a gota una solución de 61,6 ml de diisopropilamina en 180 ml de tetrahidrofurano a 275 ml de butil-litio (1M en hexano) a -10ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita a -10ºC durante 30 min. Se añaden gota a gota a -20ºC 19,1 ml de ácido ciclobutanocarboxílico a la mixtura de reacción, y la mixtura de reacción se agita durante 4 horas, durante las cuales se calienta a la temperatura ambiente. La suspensión se vierte en 300 ml de agua con hielo, se ajusta a pH 1 con ácido clorhídrico 2 N y se extrae 4 veces con 300 ml de éter cada vez, después de lo cual se lavan las fases orgánicas reunidas una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. Rendimiento: 30,1 g del ácido carboxílico.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,88 (3H), 1,75-1,95 (6H), 2,4 (2H)

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9

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1e) 2,2-Trimetilenobutan-1-al

Se añaden 62,2 g de carbonato de potasio y 28 ml de yoduro de metilo a una solución de 25,6 g de 1d en 300 ml de acetona a la temperatura ambiente bajo nitrógeno, y la mixtura se agita durante 12 horas. El precipitado se separa luego por filtración con succión, y se concentra el filtrado a vacío a la temperatura ambiente. El producto bruto se disuelve en 500 ml de éter y se lava una vez con agua y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, después de lo cual se seca la fase orgánica sobre sulfato de sodio y se concentra a vacío. El residuo se destila a vacío a 85 mbar y 110ºC (punto de ebullición 85-90ºC). Rendimiento: 24,5 g del éster. Se disuelven 20 g del éster en 40 ml de éter, se añade gota a gota esta solución a una suspensión de 4,8 g de hidruro de litio y aluminio en 390 ml de éter a 0ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita a 0ºC durante 1 hora y a la temperatura ambiente durante 1 hora. Se descompone con precaución el exceso de hidruro de litio y aluminio a 0ºC, con 11 ml de agua, 11 ml de solución de hidróxido de sodio de concentración 15%, y de nuevo con 30 ml de agua. La agitación durante 20 minutos va seguida por filtración y a continuación por un lavado concienzudo con éter, después de lo cual se seca el filtrado sobre sulfato de sodio y se concentra a vacío. Rendimiento: 16,3 g del alcohol.

Se añaden 48 ml de trietilamina y 22,27 g de complejo SO_{3}-piridina a una solución de 8 g de alcohol en 450 ml de cloruro de metileno y 100 ml de dimetilsulfóxido a la temperatura ambiente bajo nitrógeno. La mixtura se agita durante 1 hora, se mezcla luego con 300 ml de solución saturada de cloruro de amonio y se agita de nuevo durante 15 min. Se diluye luego con 1,5 l de éter, se separan las fases, y la fase orgánica se lava dos veces con solución saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra a vacío. Rendimiento: 9,5 g del aldehído.

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10

1f) 4,4-(Trimetileno)-2-hexenocarboxilato de etilo

Se añade gota a gota una solución de 18,3 ml de fosfonoacetato de trietilo en 20 ml de tetrahidrofurano a una suspensión de 3,39 g de hidruro de sodio en 60 ml de tetrahidrofurano a 0ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita a la temperatura ambiente durante 30 min. Se añade luego gota a gota el aldehído (preparado en 1e) a la mixtura de reacción a 0ºC, y la mixtura se agita a la temperatura ambiente durante 3 horas. Se extingue luego con solución saturada de cloruro de amonio y se extrae 3 veces con éter, después de lo cual se lavan las fases orgánicas reunidas una vez con agua y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. La cromatografía sobre gel de sílice con hexano/éter (0-10%) da como resultado 9,81 g del éster.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,71 (3H), 1,27 (3H), 1,65 (2H), 1,78-2,1 (6H), 4,18 (2H), 5,75 (1H), 6,97 (1H)

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11

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1g) 4,4-(Trimetileno)hexan-1-ol

Se añaden lentamente gota a gota 78,5 ml de DIBAH a una solución de 7,8 g del éster preparada como en 1f) en 65 ml de cloruro de metileno a -70ºC bajo nitrógeno. Después de 30 min, se añaden lentamente gota a gota 20 ml de isopropanol y luego 36 ml de agua a la mixtura de reacción. La mixtura se agita a la temperatura ambiente durante 2 horas, se separa el precipitado por filtración con succión y se lava cuidadosamente con cloruro de metileno, después de lo cual se concentra el filtrado a vacío. La cromatografía sobre gel de sílice con hexano/acetato de etilo (0-40%) da como resultado 5,4 g del alcohol alílico.

Se disuelven 5 g del alcohol alílico en 200 ml de acetato de etilo mixturado con 500 mg de Pd/C, y esto va seguido por filtración con succión a través de Celita y lavado concienzudo con acetato de etilo. La concentración del filtrado a vacío da como resultado 4,5 g del alcohol primario.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,8 (3H), 1,2-1,9 (12H), 3,6 (2H)

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12

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1h) 1-Feniltio-4,4-(trimetileno)hexano

Una solución de 6,19 g de cloruro de p-tolueno-sulfonilo y 7,4 ml de tolueno se añade gota a gota a una mixtura de 4,4 g del alcohol preparado como en 1g), 25 ml de tolueno, 997 mg de bromuro de tetrabutilamonio y 46 ml de NaOH 2N a 0ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita durante 2 horas. Se separan luego las fases, y la fase orgánica se lava 3 veces con agua y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra a vacío. La cromatografía sobre gel de sílice con hexano/éter (0-20%) da como resultado 4,6 g del tioéter.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,75 (3), 1,39 (2H), 1,45-1,88 (10H), 2,88 (2H), 7,15-7,53 (5H)

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13

1i) 1-Fenilsulfonil-4,4-(trimetileno)hexano

Una solución de 18 g de ozono en 70 ml de agua se añade gota a gota a una solución de 4,6 g del producto preparado como en 1h) en 70 ml de metanol a 0-10ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita durante 2 horas. Se diluye luego con 100 ml de agua y se extrae 4 veces con acetato de etilo, y las fases orgánicas reunidas se lavan una vez con agua, dos veces con solución saturada de tiosulfato y una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. La cromatografía en gel de sílice con hexano/acetato de etilo (0-20%) da como resultado 2,55 g de la sulfona.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,7 (3H), 1,3-1,85 (12H), 3,08 (2H), 7,5-7,7 (3H), 7,9 (2H)

14

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Ejemplo 2 (5Z,13E)-(9R,11R)-9-Cloro-11-hidroxi-17,17-tetrametileno-20-nor-5,13-prostadienoato de metilo

Se añaden 2,5 mg de pTsOH a una solución de 140 mg del producto preparado en el Ejemplo 1 en 1,5 ml de metanol a 0ºC bajo nitrógeno, y la mixtura se agita durante 3 horas. Se vierte luego la mixtura de reacción en 3 ml de solución saturada de carbonato de sodio y se extrae 3 veces con acetato de etilo, y las fases orgánicas reunidas se lavan una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. La cromatografía en gel de sílice con hexano/acetato de etilo (0-50%) da como resultado 105 mg del alcohol.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,75 (3H), 1,38-2,4 (24H), 3,65 (3H), 3,9-4,13 (2H), 5,2-5,63 (4H).

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Ejemplo 3 Ácido (5Z-13E)-(9R,11R)-9-cloro-11-hidroxi-17,17-tetra-metileno-20-nor-5,13-prostadienoico

Se añaden 0,2 ml de solución 2N de hidróxido de sodio a una solución de 68 mg del alcohol preparado en el Ejemplo 2 en 1 ml de metanol bajo nitrógeno, y la mixtura se agita durante 5 horas. Se diluye luego con 1 ml de agua, se ajusta a pH 3 con ácido clorhídrico 2 N y se extrae 3 veces con acetato de etilo, y las fases orgánicas reunidas se lavan una vez con solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a vacío. La cromatografía en gel de sílice con hexano/acetato de etilo (50-80%) da como resultado 50,3 mg del ácido carboxílico.

^{1}H-NMR (CDCl_{3}): \delta = 0,75 (3H), 1,38-2,4 (24H), 3,9-4,1 (2H), 5,2-5,62 (4H).

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Ejemplos biológicos 1. Detección del antagonismo de la señal del receptor de la prostaglandina humana E_{2} (subtipo EP_{2}) 1.1. Principio de detección

La fijación de PGE_{2} al subtipo EP_{2} del receptor PGE_{2} humano induce la activación de adenilato-ciclasas y asociadas a la membrana conduce a la formación de cAMP. En presencia del inhibidor de fosfodiesterasa IBMX, el cAMP que se ha acumulado debido a esta estimulación y ha sido liberado por la lisis celular se emplea en un método de detección competitivo. En este ensayo, el cAMP contenido en el lisado compite con cAMP-XL665 para la fijación de un anticuerpo anti-cAMP marcado con criptato de Eu.

Esto da como resultado, en ausencia de cAMP celular, una señal máxima que se deriva del acoplamiento de este anticuerpo a la molécula cAMP-XL665. Después de excitación a 337 nm, esto da como resultado una señal de emisión de larga duración, basada en FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) a 665 nm (y a 620 nm). Las dos señales se miden en un instrumento de medida adecuado con un retardo temporal, es decir después que ha declinado la fluorescencia del sustrato.

Cualquier aumento en la señal baja de FRET causado por la adición de prostaglandina E_{2} (medido como cambio de la relación de pocillo = emisión_{665nm}/emisión_{620nm} * 10.000) muestra el efecto de los antagonistas.

1.2. Método de detección 1.2.1. Ensayo de antagonismo (datos para cada pocillo de una placa de 384 pocillos)

Las soluciones de sustancia (0,75 \mul) introducidas en una placa de ensayos y 30% de DMSO se disuelven en 16 \mul de una solución de estimulación KRSB + IBMX (1 X tampón de bicarbonato Krebs-Ringer; Sigma-Aldrich # K-4002; que incluye 750 \muM de 3-isobutil-1-metilxantina Sigma-Aldrich # I-7018), y a continuación se transfieren 15 \mul de la misma a una placa de cultivo de células exenta de medio que se ha lavado poco antes con KRSB.

Después de preincubación a la temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos, se añaden 5 \mul de una solución 4 x PGE_{2} (11 nM), y se lleva a cabo la incubación en presencia del agonista a TA durante 60 minutos más (volumen = \sim20 \mul) antes de parar la reacción por adición de 5 \mul de tampón de lisis y se incuba a TA durante 20 min adicionales (volumen: \sim25 \mul). El lisado de células se transfiere luego a una placa de medida y se mide de acuerdo con la información del fabricante (kit de AMP cíclico Cisbio International # 62AMPPEC).

1.2.2 . Ensayo de agonismo (datos para cada pocillo de una placa de 384 pocillos)

Las soluciones de sustancia (0,75 \mul) introducidas en una placa de ensayos y 30% de DMSO se disuelven en 16 \mul de una solución de estimulación KRSB + IBMX (1 X Tampón de Bicarbonato Krebs-Ringer; Sigma-Aldrich # K-4002; que incluye 750 \muM de 3-isobutil-1-metilxantina Sigma-Aldrich # I-7018), y a continuación se transfieren 15 \mul de la misma a una placa de cultivo de células exenta de medio que se ha lavado poco antes con KRSB.

Después de incubación a la temperatura ambiente (TA; volumen: \sim15 \mul) durante 60 minutos, se para luego la reacción por adición de tampón de lisis y se incuba a TA durante 20 minutos adicionales (volumen: \sim20 \mul). El lisado de células se transfiere luego a una placa de medida y se mide de acuerdo con la información del fabricante (kit de AMP cíclico Cisbio International # 62AMPPEC).

En el ensayo de agonismo celular, el compuesto de prueba demostró una actividad muy alta (CE_{50} < 9,5x10e-10M) sin inhibición alguna en el ensayo de antagonismo (CI_{50} > 2x10e-5M).

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2. El subtipo EP_{2} del receptor PGE_{2} y la expansión del cúmulus preovulatorio 2.1. Antecedentes

En el folículo antral preovulatorio, el oocito está rodeado por células de cúmulus que forman un anillo denso de células alrededor del oocito. Después del pico de LH (hormona luteinizante), se activa una serie de procesos y conduce a un gran cambio morfológico en este anillo de células compuesto de células de cúmulus. En este caso, las células de cúmulus forman una matriz extracelular que conduce a la denominada expansión del cúmulus (Vanderhyden et al., Dev. Biol. 1990, agosto; 140 (2): 307-317). Esta expansión del cúmulus es un componente importante del proceso ovulatorio y de la posibilidad subsiguiente de fertilización.

Las prostaglandinas, y en este caso la prostaglandina E_{2}, cuya síntesis es inducida por el pico de LH, son de importancia crucial en la expansión del cúmulus. Los ratones con el prostanoide EP_{2} inutilizado (Hizaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, agosto 31; 96 (18): 10501-6) exhiben una expansión del cúmulus notablemente reducida y subfertilidad severa, demostrando la importancia del receptor del prostanoide EP_{2} para este proceso.

2.2. Ensayo de expansión del cúmulus in vitro

Se induce foliculogénesis en ratones hembra inmaduros (variedad: CD1 (ICR) de Charles River) con una edad de 20-24 días por una sola dosis (intraperitoneal) de 7,5 U.I. de PMSG (Gonadotropina del Suero de Yegua Preñada; Sigma G-4877, lote 68H0909). 47 a 50 horas después de la inyección, se extirpan los ovarios y se separan los complejos cúmulus-oocito. El complejo de cúmulus no está expandido todavía en esta etapa.

Se incuban luego los complejos cúmulus-oocito con prostaglandina E2 (PGE_{2}) (1 \muM), control de vehículo (etanol) o sustancias de ensayo durante 20-24 horas.

Medio: medio alfa-MEM con IBMX 0,1 mM, piruvatos (0,23 mM), glutaminas (2 mM), pen/estrep 100 UI/ml pen. y 100 \mug/ml estrep.) y HSA (8 mg/ml)). Se establece luego la expansión del cúmulus por la división en cuatro etapas (de acuerdo con Vanderhyden et al. Dev. Biol. agosto 1990; 140 (2): 307-317).

La sustancia de ensayo conduce a una gran expansión dependiente de la concentración en el complejo del cúmulus. La expansión del cúmulus inducida por la sustancia de ensayo es equivalente en concentraciones de 0,5 \muM y 1 \muM a la expansión del cúmulus inducida por el agonista PGE_{2} natural del receptor EP_{2} en una concentración de 1 \muM (n = 16 complejos cúmulus-oocito por grupo; véase la Figura 1).

2.3. Ensayo de ovulación in vivo

Se induce la foliculogénesis en ratones hembra inmaduros (variedad: (B6D2F1) de Charles River) con una edad de 16-20 días por una dosis simple (intraperitoneal) de 10 U.I. de PMSG (Gonadotropina del Suero de Yegua Preñada; Sigma G-4877, lote 68H0909). 47 a 50 horas después de la estimulación con PMSG, se utiliza una dosis de 10 UI de HCG (gonadotropina coriónica humana) para inducir la maduración final del folículo y la ovulación. La sustancia de ensayo se administra 10 horas, 5 horas y 0 horas antes de la dosis de HCG (subcutáneamente en benzoato de bencilo/aceite de ricino, 1 + 4 v/v). Catorce horas después de la dosis de HCG, se realiza la autopsia y se determina el número de oocitos ovulados en el tubo de Falopio.

El agonista EP_{2} conduce a un aumento significativo dependiente de la concentración de oocitos ovulados. Este aumento significativo de oocitos ovulados ocurre después de la administración de sólo 0,00015 mg/animal en cada caso y demuestra que es posible aumentar el número oocitos ovulados incluso con una dosis estándar de HCG para la ovulación (n = 11-12 animales por grupo; ** p < 0,005 y * p < 0,05).

3. El subtipo EP_{2} del receptor PGE_{2} y el ensayo de liberación de citoquinas 3.1. Antecedentes

Pruebas crecientes sugieren que la endometriosis está asociada con una respuesta inflamatoria significativa que puede estar mediada por macrófagos y linfocitos activados y por niveles incrementados de citoquinas, quimioquinas, y factores de crecimiento. Se ha supuesto que estos procesos inflamatorios median algunos de los rasgos clínicos distintivos asociados con la endometriosis. Se sabe que el fluido peritoneal de las mujeres con endometriosis contiene más células inflamatorias y sus citoquinas, quimioquinas, y factores de crecimiento asociados. (Murphy AA. Clinical aspects of endometriosis. Ann. NY Acad. Sci. marzo 2002; 955: 1-10). El resultado es un ambiente que favorece la implantación y proliferación.

Las prostaglandinas, y en este caso la prostaglandina E_{2}, reduce(n) la expresión de citoquinas inflamatorias, tales como TNF\alpha por los macrófagos activados. Los ratones con el prostanoide EP_{2} inutilizado (Shinomiya S et al., Bioch. Phar., 2001; 61, 1153) no responden a los agonistas EP_{2}, demostrando la importancia del receptor del prostanoide EP_{2} para este proceso.

3.2. Ensayo de liberación de citoquinas in vitro

Se cultivan células dendríticas derivadas de monocitos de donantes humanos en RPMI-1640 que contiene 10% de suero bovino fetal durante seis días en presencia de 10 ng/ml de IL-4 y 200 ng/ml de GM-CSF. Las células se activan con diversos estímulos de activación: 10 ng/ml de LPS (Sigma), 5 \mug/ml de ligando humano CD-40 recombinante (R & D Systems), o 5 \muM de CpG-DNA humano (HyCult Biotechnology) en presencia de prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) (1 \muM), vehículo de control (DMSO) o sustancias de ensayo (1 \muM) durante 18 horas. Los niveles de TNF\alpha sobrenadante del cultivo de células para donantes individuales se miden por medio de kits ELISA comerciales. Las sustancias de ensayo conducen a una inhibición de los niveles de citoquinas medidos en el sobrenadante de cultivo como se muestra en la Tabla 1.

3.3. Ensayo de liberación de citoquinas ex vivo

La sustancia de ensayo o el vehículo de control se administran intraperitonealmente a los grupos de tratamiento de ratones CD-1 que pesan 30-35 gramos cada uno (n = 5). 20 minutos más tarde, se sacrifican los ratones por eutanasia, se extirpan los bazos y se cultivan los esplenocitos en RPMI + 10% de suero bovino fetal. Las células se activan con PHA y ConA en ausencia de sustancia de ensayo y se cultivan durante 18 horas. Los niveles de TNF\alpha sobrenadante del cultivo de células para ratones individuales se miden con kits ELISA comerciales. El agonista EP_{2} causa una disminución significativa en TNF\alpha como se muestra en la Figura 3.

4. Demostración de la inhibición de la liberación de la citoquina Th-1 por los linfocitos T 4.1. Principios

La activación de un linfocito T humano por una célula presentadora de antígeno y antígeno por el receptor de las células T se mimetiza en condiciones experimentales por la lectina Concanavalina A (ConA). Se sabe que ConA se fija al receptor de las células T y estimula la célula para liberar diversas citoquinas. Una de las citoquinas Th-1 liberadas es INF-\gamma. La bioquímica y las actividades biológicas de INF-\gamma han sido revisadas extensamente.

4.2. Método de detección

INF-\gamma es un dímero de la proteína expresada de 143 aminoácidos. Ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) basados en anticuerpos específicos para INF-\gamma están disponibles comercialmente. Los patrones y las muestras se pipetean en los pocillos de una microplaca. Se añade a los pocillos un anticuerpo específico para INF-\gamma humano. Se añade un sustrato a los pocillos y se desarrolla el color en proporción a la cantidad de INF-\gamma fijada. Se mide la intensidad del color.

4.3. Procedimiento

Se aíslan linfocitos de sangre periférica de donantes humanos utilizando un gradiente de densidad Ficoll y los eritrocitos residuales se eliminan por lisis selectiva. Se cultivan los linfocitos a aproximadamente 10^{6} células por ml en RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal adicional. Los cultivos de células se activan con 2 \mug/ml de ConA como se ha descrito arriba. Se añade la sustancia de ensayo a diversas diluciones durante la activación con ConA. Se incuban las células durante aproximadamente 18 h a 37ºC. El INF-\gamma liberado durante la activación se mide por ELISA.

5. Demostración de la inhibición de la liberación de citoquinas por las células dendríticas derivadas de monocitos humanos 5.1. Principio

Las células dendríticas (DC) son las células presentadoras de antígeno más potentes y juegan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria. Después de la estimulación por los receptores semejantes a peaje ("toll-like") (TLR), las DCs expresan y liberan citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, y pueden inducir activación y proliferación de células T naif. La fijación de un agonista EP_{2} al receptor DC EP inhibe la liberación de interleuquina 12 (IL-12) estimulada por el ligando TLR4 (LPS). La fijación de un agonista EP_{2} al receptor DC EP no inhibe la liberación de interleuquina 10 (IL-10) estimulada por el ligando TLR4 (LPS). Por consiguiente, un agonista EP_{2} desvía la diferenciación de las células T CD4 apartándola del linaje Th.

5.2 . Método de detección

IL-12 es un heterodímero de glicoproteína de 75 kDa (p70) compuesto de dos subunidades genéticamente no relacionadas entre sí, unidas por un enlace disulfuro. Ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) basados en anticuerpos específicos para IL-12 p70 están disponibles comercialmente. Los patrones y las muestras se pipetean en los pocillos de una microplaca. Se añade a los pocillos un anticuerpo específico para IL-12 humana. Se añade un sustrato a los pocillos y se desarrolla el color en proporción a la cantidad de IL-12 fijada. Se mide la intensidad de color.

IL-10 designada inicialmente factor inhibidor de la síntesis de citoquinas (CSIF), se identificó originalmente como un producto de clones Th-2 que suprimían la producción de citoquinas por los clones Th-1 en respuesta a la estimulación por un antígeno en presencia de células presentadoras de antígeno. IL-10 es un dímero compuesto de dos subunidades idénticas de 160 aminoácidos. Están disponibles comercialmente ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA) basados en anticuerpos específicos para IL-10. Los patrones y las muestras se pipetean en los pocillos de una microplaca. Se añade a los pocillos un anticuerpo específico para IL-10 humana. Se añade un sustrato a los pocillos y se desarrolla el color en proporción a la cantidad de IL-10 fijada. Si mide la intensidad del color.

5.3. Procedimiento

Se aíslan células dendríticas derivadas de monocitos humanos a partir de donantes humanos utilizando un gradiente de densidad Ficoll y se eliminan los eritrocitos residuales por lisis selectiva. Se utilizan Microperlas CD14 para separación de las células humanas basadas en la expresión del antígeno CD14. Las células dendríticas se cultivan a razón de aproximadamente 1,5 x 10^{6} células por ml en RPMI 1640 con suero bovino fetal, 200 ng/ml de GM-CSF (leuquina) y 10 ng/ml de IL-4. Las células se dejan crecer durante un periodo de 3 días y se cambia después el medio. Se utilizan 10 ng/ml de LPS para activar las células. Se añaden 1 \muM de sustancia (agonista EP_{2}) y 1 \muM de PGE_{2} durante la estimulación con LPS. Se incuban las células durante aproximadamente 18 h a 37ºC. Las IL-12 e IL-10 liberadas durante la activación se miden por ELISA.

Tablas

La Tabla 1 muestra el efecto de la sustancia de ensayo sobre la liberación de TNF\alpha por células monocíticas activadas in vitro. La sustancia de ensayo se administra en una concentración de 18 mM. Las células se activan durante 18 horas. La sustancia de ensayo muestra una actividad inhibidora muy alta de respuesta a la dosis en la liberación de la citoquina Th-1 por los linfocitos T.

La Tabla 2 demuestra el efecto de la sustancia de ensayo sobre la inhibición de la liberación de la citoquina Th-1 por los linfocitos T. La sustancia de ensayo se añade dependiendo de la dosis (0-20 nM) a las células durante su activación por ConA, y se incuban las células durante 18 horas.

Las Tablas 3a) y b) demuestran el efecto de la sustancia de ensayo sobre la inhibición de la liberación de citoquinas por las células dendríticas derivadas de monocitos humanos. Se añade la sustancia de ensayo o PGE_{2} a una concentración de 1 \muM durante la estimulación de las células con LPS. Se incuban las células durante 18 horas. El compuesto de ensayo exhibe una alta actividad inmunomoduladora en el ensayo de liberación de citoquinas por las células dendríticas (DC) derivadas de monocitos humanos, y una supresión de la citoquina IL-12 promotora de Th-1 (3a) respetando en cambio, y de hecho incrementando, la citoquina IL-10 promotora de Th-2 (3b).

Figuras

La Figura 1 muestra la expansión del cúmulus inducida por la sustancia de ensayo en concentraciones de 0,5 \muM y 1 \muM. Esta expansión es equivalente a la expansión del cúmulus inducida por el agonista PGE_{2} natural del receptor EP_{2} en una concentración de 1 \muM (n = 16 complejos cúmulus-oocito por grupo).

La Figura 2 muestra la ovulación inducida por la sustancia de ensayo in vivo. La sustancia de ensayo se administra en concentraciones de 0,00015; 0,0015 y 0,015 mg/animal, 10, 5 y 0 horas antes de HCG.

La Figura 3 muestra el efecto de la sustancia de ensayo sobre la activación de los esplenocitos de ratón ex vivo. Las células se activan con PHA o ConA. La sustancia de ensayo se administra intraperitonealmente en concentraciones de 1 y 2 \mug/animal, 20 min antes del sacrificio.

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TABLA 1 Inhibición de la liberación de TNF\alpha por las células monocíticas activadas

15

TABLA 2 Inhibición de la liberación de la citoquina Th-1 por los linfocitos T

16

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TABLA 3a Inhibición de la liberación de citoquinas por las células dendríticas derivadas de monocitos humanos, medida de IL-12 (pg/ml)

17

TABLA 3b Inhibición de la liberación de citoquinas por las células dendríticas derivadas de monocitos humanos, medida de IL-10 (pg/ml)

18

Claims (23)

1. Compuestos de la fórmula general I

19

donde

R^{1}

es un grupo CH_{2}OH, -COOR^{2}, -CONHR^{2} o -CONHR^{3},

R^{2}

es hidrógeno,

\quad

un radical alquilo C_{1}-C_{10} que es lineal o ramificado, opcionalmente mono- a poliinsaturado y está opcionalmente mono- a polisustituido con halógeno, alcoxi C_{1}-C_{4}, arilo C_{3}-C_{10} sustituido o aroílo C_{3}-C_{10} opcionalmente sustituido, di-alquilamino C_{1}-C_{5} o tri-alquilamino C_{1}-C_{5},

\quad

un cicloalquilo C_{3}-C_{10} que está sustituido opcionalmente con alquilo C_{1}-C_{4}, un arilo C_{3}-C_{10} que está sustituido opcionalmente con fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo que puede estar sustituido a su vez en posición 3 y en posición 4 con flúor, cloro, alcoxi o trifluorometilo o en posición 4 con hidroxi, halógeno, fenilo, uno o más grupos alquilo C_{1}-C_{4}, clorometilo, fluorometilo, trifluorometilo, carboxi, hidroxi o alcoxi C_{1}-C_{4},

\quad

o un heterocicloalquilo C_{3}-C_{7},

R^{3}

es un ácido carboxílico C_{1}-C_{15} o ácido sulfónico C_{1}-C_{15},

A

es un grupo cis-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

B

es un grupo trans-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

W

es un alquileno C_{2}-C_{6},

R^{4}

es un grupo hidroxi, un radical O-R^{6} u O-R^{7} donde R^{6} es un radical tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, trimetilsililo, terc-butildimetilsililo, terc-butil-difenilsililo o tribencilsililo y R^{7} es un ácido carboxílico C_{1}-C_{15},

R^{5}

es hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{10} o alquenilo C_{1}-C_{10},

n

es el número 1-4,

\quad

y las sales de los mismos y los clatratos con ciclodextrina de los mismos, con bases fisiológicamente toleradas.

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2. Compuestos de acuerdo con la reivindicación 1, donde

R^{1}

es un grupo CH_{2}OH, -COOR^{2}, -CONHR^{2} o -CONHR^{3},

R^{2}

es hidrógeno o

\quad

un radical alquilo C_{1}-C_{10} que es lineal o ramificado, opcionalmente mono- a poliinsaturado y está monosustituido opcionalmente con flúor, cloro o bromo, con alcoxi C_{1}-C_{4}, arilo C_{3}-C_{10} sustituido o aroílo C_{3}-C_{10} opcionalmente sustituido, di-alquilamino C_{1}-C_{5} o tri-alquilamino C_{1}-C_{5},

\quad

un cicloalquilo C_{5}-C_{6} que está sustituido opcionalmente con alquilo C_{1}-C_{4},

\quad

un radical arilo C_{3}-C_{10} que está sustituido opcionalmente con fenilo, que puede estar sustituido en posición 3 ó 4 con flúor, cloro, alcoxi o trifluorometilo o en posición 4 con hidroxi,

\quad

un heterocicloalquilo C_{5}-C_{6} que puede estar interrumpido una o más veces por nitrógeno, oxígeno o azufre,

R^{3}

es un ácido carboxílico C_{1}-C_{10} o ácido sulfónico C_{1}-C_{10},

A

es un grupo cis-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

B

es un grupo trans-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

W

es un alquileno C_{2}-C_{6},

R^{4}

es un grupo hidroxi,

R^{5}

es hidrógeno, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o alquenilo C_{1}-C_{10}, y

n

es el número 1-4.

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3. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde

R^{1}

es un grupo -CH_{2}OH, -COOR^{2}, -CONHR^{2} o -CONHR^{3},

R^{2}

es hidrógeno o un alquilo C_{1}-C_{4} que está sustituido opcionalmente con fenilo,

\quad

un cicloalquilo C_{5}-C_{6,}

\quad

un arilo C_{3}-C_{6} que está sustituido opcionalmente con fenilo,

R^{3}

es un ácido carboxílico C_{1}-C_{6} o ácido sulfónico C_{1}-C_{6},

A

es un grupo cis-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

B

es un grupo trans-CH=CH- o -CH_{2}-CH_{2}-,

W

es un alquileno C_{2},

R^{4}

es un grupo hidroxi,

R^{5}

es hidrógeno, alquilo saturado C_{1}-C_{4} o alquenilo C_{1}-C_{5}, y

n

es el número 1-4.

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4. Medicamentos que comprenden al menos uno de los compuestos de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1-3.

5. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizados porque el derivado de prostaglandina de la fórmula general I está presente en una cantidad eficaz.

6. Compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 y medicamentos de acuerdo con las reivindicaciones 4 y 5 con sustancias de formulación y vehículos adecuados.

7. Derivado de prostaglandina de la fórmula I de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 para uso como medicamento.

8. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 7 para promover la fertilidad.

9. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 7 para fertilización in vitro.

10. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 7 para promover la ovulación.

11. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 7 para eliminar la expansión del cúmulus deteriorado y las secuelas de la misma.

12. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 7 para el tratamiento de trastornos.

\newpage

13. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende trastornos de la fertilidad.

14. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende menstruación dolorosa.

15. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende endometriosis.

16. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende presión intraocular elevada.

17. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende osteoporosis.

18. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende presión sanguínea elevada.

19. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizados porque el trastorno comprende enfermedades autoinmunes.

20. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo constituido por esclerosis múltiple, esclerosis múltiple secundaria progresiva, psoriasis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, y alopecia areata.

21. Medicamentos de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha enfermedad autoinmune es esclerosis múltiple.

22. Derivado de prostaglandina de la fórmula general I de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 en la forma de un producto farmacéutico para administración enteral, parenteral, vaginal y oral.

23. Proceso para la preparación de los compuestos de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque un aldehído de la fórmula general II

20

en la cual R^{1} tiene el significado de los radicales -COOR^{2}, -CONHR^{3}, y A y R^{4} tienen los significados arriba indicados,

en donde el grupo OH libre en R^{4} está protegido,

se hace reaccionar con el carbanión de la sulfona de la fórmula general III

21

y

la acetilación de la hidroxisulfona resultante va seguida por eliminación reductora para dar la olefina y, en caso apropiado, una desprotección subsiguiente de los grupos hidroxi que están protegidos en cualquier secuencia y, en caso apropiado, esterificación, eterificación y/o hidrogenación de enlaces dobles y/o esterificación de un grupo carboxi esterificado (R^{1} = COOR^{2}) y/o de un grupo carboxi libre (COOR^{2} con R^{2} = H) y/o conversión de un grupo carboxi libre (COOR^{2} con R^{2} = H) en una amida (R^{1} = CONR^{2}) y/o reducción de un grupo carboxi libre o esterificado (R^{1} = CONHR^{3}).