ES2302331T3 - Vectores que codifican genomas de aav recombinantes. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA MATERIALES DE VIRUS ADENOASOCIADOS (AAV) Y METODOS UTILES PARA SUMINISTRAR ADN A LAS CELULAS. ESPECIALMENTE, LA INVENCION PROPORCIONA GENOMAS RECOMBINANTES AAV (RAAV), QUE COMPRENDEN REPETICIONES TERMINALES INVERTIDAS, DE VIRUS ADENOASOCIADOS, LAS CUALES FLANQUEAN A SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA UNA PROTEINA DEL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA, LIGADA OPERATIVAMENTE A SECUENCIAS PROMOTORAS Y DE POLIADENILACION. LA INVENCION PROPORCIONA TAMBIEN METODOS DE EMPAQUETAMIENTO DE LOS GENOMAS RAAV, LINEAS DE CELULAS HUESPED PRODUCTORAS DE RAAV Y METODOS PARA SUMINISTRAR LOS GENES DE INTERES A LAS CELULAS, UTILIZANDO EL RAAV. ESPECIALMENTE, SE DESCRIBEN RAAV UTILES PARA GENERAR INMUNIDAD FRENTE AL VIRUS-1 DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA Y PARA EL SUMINISTRO TERAPEUTICO DEL GEN DESTINADO AL TRATAMIENTO DE ALTERACIONES NEUROLOGICAS.
Description
Vectores que codifican genomas de AAV
recombinantes.
La presente invención se refiere, en general, a
materiales de virus adenoasociados (AAV) y a métodos que son útiles
para transportar ADN a células. Más en concreto, la invención se
refiere genomas de AAV recombinantes (rAAV), a métodos para
encapsular genomas de rAAV, a líneas celulares estables para
producir rAAV, y a métodos para transportar genes de interés hasta
células que utilizan los rAAV.
Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus
con replicación deficiente, cuyo genoma de ADN monocatenario tiene
una longitud de aproximadamente 4,7 kb, incluyendo repeticiones
terminales invertidas de 145 nucleótidos (ITR). Véase la Figura 1.
La secuencia de nucleótidos del genoma de AAV2 se presenta en
Srivastava et al., J. Virol., 45:555-564
(1983). Dentro de las ITR están contenidas secuencias de acción
cis que dirigen la replicación del ADN vírico (ori), la
encapsidación/encapsulación (pkg), y la integración en el cromosoma
de la célula hospedante (int). Tres promotores de AAV, p5, p19 y p40
(nombrados según sus colocaciones relativas en el mapa), conducen
la expresión de dos marcos de lectura abierta internos de AAV, que
codifican las proteínas rep y cap. Los dos promotores rep (p5 y
p19), acoplados con el corte y empalme diferencial del único intrón
de AAV (en los nucleótidos 2107 y 2227), da como resultado la
producción de cuatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 y rep
40) a partir del gen rep. Las proteínas rep poseen múltiples
propiedades enzimáticas que son responsables, en último término, de
la replicación del genoma vírico. El gen cap se expresa a partir
del promotor p40, y codifica las tres proteínas de la cápsida VP1,
VP2 y VP3. Otros sitios de inicio de la traducción alternativos y
no consenso son responsable de la producción de tres proteínas de la
cápsida relacionadas. Un único sitio de poliadenilación consenso se
encuentra en la posición del mapa 95 del genoma de AAV. El ciclo
vital y la genética de AAV se indican en Muzyczka, Current Topics
in Microbiology and Immunology, 158:97-129
(1992).
Cuando AAV infecta a una célula humana, el
genoma vírico se integra en el cromosoma 19, dando como resultado
una infección latente de la célula. La producción de virus
infecciosos no se produce a menos que la célula sea infectada con
un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus o herpesvirus). En el
caso del adenovirus, los genes E1A, E1B, E2S, E4 y VA proporcionan
funciones auxiliares. Tras la infección con el virus auxiliar, el
provirus de AAV se rescata y amplifica, y se producen tanto AAV como
adenovirus.
El AAV posee características exclusivas que le
hacen atractivo como vector para transportar ADN extraño hacia
células. La infección por AAV de células no es citopática, y la
infección natural de seres humanos y otros animales es silenciosa y
asintomática. Además, los AAV infectan a la mayoría de las células
de mamífero (sino a todas), lo cual permite la posibilidad de un
transporte dirigido hacia muchos tejidos diferentes in vivo.
Kotin et al., EMBO J., 11(13):5071-5078
(1992) indican que el genoma de ADN de AAV experimenta una
integración dirigida en el cromosoma 19 después de la infección. No
es necesaria la replicación del ADN vírico para la integración y,
por tanto, para este proceso no se requiere el virus auxiliar. El
genoma provírico de AAV es infeccioso como ADN clonado en plásmidos
que hacen factible la construcción de genomas recombinantes. Además,
debido a que las señales que dirigen la replicación, la
encapsidación del genoma y la integración de AAV están contenidas
dentro de las ITR del genoma de AAV, aproximadamente 4,3 kb internos
del genoma (que codifican la replicación y proteínas de la cápsida
estructurales, rep-cap) pueden, por tanto,
sustituirse por ADN extraño, tal como un módulo génico que contenga
un promotor, un ADN de interés y una señal de poliadenilación. Otra
características significativa de AAV es que es un virus
extremadamente estable y resistente. Aguanta con facilidad las
condiciones empleadas para inactivar los adenovirus (de 56ºC a 65ºC
durante varias horas), haciendo que la conservación en frío de
vacunas basadas en rAAV sea menos crítica. Por último, las células
infectadas por AAV no son resistentes a la superinfección.
Diversos grupos han estudiado el uso potencial
de AAV en el tratamiento de estados de enfermedad. La Publicación
Internacional según el Tratado de Cooperación de Patentes (PCT) nº
WO 91/18088, publicada el 28 de Noviembre de 1991, y el
correspondiente artículo periodístico de Chatterjee et al.,
Science, 258:1485-1488 (1992), describen la
transducción de resistencia intracelular al virus de la
inmunodeficiencia humano-1 (VIH-1)
en líneas celulares humanas hematopoyéticas y no hematopoyéticas
utilizando un rAAV que codifica un ARN antisentido específico para
la secuencia TAR y la señal de poliadenilación de
VIH-1. El artículo periodístico de Yu et al.,
Gene Therapy, 1:13-26 (1994), que trata sobre la
terapia génica para la infección por VIH-1, lista a
los AAV como posibles vectores de terapia génica para células
pluripotenciales hematopoyéticas. El uso de vectores de rAAV como
sistemas de transporte para la integración y expresión estables de
genes (en particular, el gen regulador transmembrana de la fibrosis
quística) en células epiteliales de las vías respiratorias
cultivadas se describe en la Publicación Internacional PCT nº WO
93/24641, publicada el 9 de Diciembre de 1993, y el correspondiente
artículo periodístico de Flotte et al., Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol., 7:349-356 (1992). Una terapia génica que
implica a rAAV en el tratamiento de hemoglobinopatías y otras
enfermedades hematopoyéticas, y en conferir resistencia a múltiples
fármacos específica de células, se propone en la Publicación
Internacional PCT nº WO 93/09239, publicada el 13 de Mayo de 1993;
Muro-Cacho et al., J. Immunol.,
11:231-237 (1992); LaFace et al., Virol.,
162:483-486 (1988); y Dixit et al., Gene,
104:253-257 (1991). El transporte de genes
terapéuticos hacia células de glioma se propone en Tenenbaum et
al., Gene Therapy, 1(suplemento 1):S80 (1994).
Un concepto relativamente nuevo en el campo de
la transferencia de genes es que la inmunización puede conseguirse
mediante el producto de un gen transferido. Se han indicado varios
intentos de "inmunización genética", incluyendo la inyección
directa de ADN de secuencias de nucleoproteína A de la gripe [Ulmer
et al., Science, 259:1475-1749 (1993)],
inmunización con pistola biolística con secuencias de la hormona del
crecimiento humana [Tang et al., Nature,
356:152-154 (1992)], e infección con vectores
retrovíricos que contienen secuencias de la proteína de la envuelta
gp160 de VIH-1 [Warner et al., AIDS RESEARCH AND
HUMAN RETROVIRUSES, 7(8):645-655 (1991)].
Aunque estos enfoques parecen factibles, la inoculación directa de
ADN puede no proporcionar respuestas inmunológicas de acción a
largo plazo, y el uso de vectores retrovíricos está rodeado de
graves problemas de seguridad. El uso de AAV para la inmunización
genética es un nuevo enfoque que no sufre estos problemas.
Un obstáculo para el uso de AAV para la
administración de ADN es la falta de esquemas muy eficaces para la
encapsidación de genomas recombinantes. Se han descrito varios
métodos para encapsidar genomas de rAAV para generar partículas
víricas recombinantes. Todos estos métodos requieren in trans
rep-cap de AAV y funciones auxiliares de
adenovirus. El método más sencillo implica transfectar el genoma de
rAAV en células hospedantes, seguido de una coinfección con AAV de
tipo salvaje y adenovirus. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº
4.797.368, otorgada el 10 de enero, 1989, de Carter y Trastschin, y
el correspondiente artículo periodístico de Tratschin et al.,
Mol. Cell. Biol., 5(11):3251-3260 (1985). Sin
embargo, este método produce unos niveles inaceptablemente elevados
de AAV de tipo salvaje. Otra estrategia general implica suministrar
las funciones de AAV sobre un segundo plásmido (diferente del
genoma de rAAV) que se cotransfecta con el plásmido de rAAV. Véase,
por ejemplo, Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81:6466-6470 (1984), y Lebkowski et al.,
Mol. Cell. Biol., 8(10):3988-3996 (1988). Si no
existe solapamiento de secuencias entre los dos plásmidos, entonces
se evita la producción de AAV de tipo salvaje, como se describe en
Samulski et al., J. Virol., 63(9):3822-3828
(1989). Sin embargo, esta estrategia es inherentemente ineficaz,
debido al requerimiento de tres acontecimientos de transferencia de
ADN diferentes (la cotransfección de dos plásmidos, así como la
infección con adenovirus) para generar partículas de rAAV. La
producción a gran escala de rAAV mediante este método es cara y
está sometida a variaciones en la eficacia de la
transfección.
transfección.
Vincent et al., Vaccines,
90:353-359 (1990) indican que puede utilizarse
una línea celular que expresa funciones rep-cap
para encapsular rAAV. Estos métodos aún requieren la transfección
del genoma de rAAV en la línea celular, y la valoración resultante
de rAAV indicada es muy baja (sólo aproximadamente 10^{3} de
unidades infecciosas/ml). Dutton, Genetic Engineering News,
14(1):1 y 14-15 (15 de enero, 1994) indican que
la doctora Jane Lebkowski de Applied Immune Sciences fabrica rAAV
utilizando plásmidos quiméricos de AAV/virus de
Epstein-Barr que contienen un genoma recombinante de
AAV, el gen de resistencia a la higromicina y el fragmento ori P de
EBV y el gen EBNA. Los plásmidos se transfectan en células para
generar líneas celulares estables. Las líneas celulares estables
entonces se transfectan con funciones rep-cap de AAV
de tipo salvaje, y se infectan con adenovirus para producir rAAV.
Como en el método de Vincent, el método de encapsulación de
Lebkowski requiere acontecimientos de transfección e infección para
generar partículas de rAAV.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de
métodos eficaces para encapsular genomas de rAAV, y de rAAV
específicos útiles como vectores para el transporte de ADN a
células.
En un primer aspecto de la presente invención,
se proporciona un vector de ADN como se indica en la reivindicación
4.
En un segundo aspecto de la presente invención,
se proporciona una célula hospedante de mamífero transfectada de
forma estable con el vector de ADN de la presente invención.
La presente invención proporciona vectores de
ADN que comprenden genomas de AAV recombinante (rAAV) útiles para
transportar ADN de interés que no es de AAV a una célula. Los
genomas de rAAV para su uso con los vectores de la invención
incluyen ITR de AAV que flanquean secuencias de ADN de interés que
no es de AAV, y carecen de secuencias rep-cap que
codifican proteínas rep-cap funcionales. Puesto que
resulta deseable expresar el ADN de interés como un polipéptido en
la célula, el genoma de rAAV también incluye un promotor
(constitutivo o regulable) y una señal de poliadenilación
operablemente conectada al ADN de interés para formar un módulo
génico. El módulo génico también puede incluir secuencias de
intrones para facilitar el procesamiento del transcrito de ARN en
las células hospedantes de mamífero. Un módulo génico preferido en
la actualidad incluye los siguientes segmentos de ADN: (1) el
promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), (2) el intrón
de \beta-globina de conejo, (3) los genes de la
envuelta (gp160) y rev del virus de la inmunodeficiencia de simio
(SIV) o de la inmunodeficiencia humana (VIH), y (4) la señal de
poliadenilación de \beta-globina de conejo. Los
genomas de rAAV de la invención se ensamblan en vectores útiles para
la transfección de células que son permisibles a la infección por
un virus auxiliar de AAV (por ejemplo, adenovirus, adenovirus con E1
deleccionado o herpesvirus). Un vector de la invención que contiene
un genoma de rAAV que incluye el anterior módulo génico preferido,
un gen de resistencia a la neomicina, y secuencias
rep-cap de AAV de tipo salvaje, se depositó en
células DH5 de E. coli en American Type Culture Collection
(ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, el 1 de
junio, 1994, y se le asignó el nº de registro ATCC
69637.
69637.
Los genomas de rAAV preferidos en la actualidad
para su uso con la invención incluyen los genes de la envuelta
(gp160) y rev de SIV, o los genes de la envuelta y rev de VIH, como
el(los) ADN de interés que no es(son) de AAV. También
se prefieren genomas de rAAV que contengan secuencias que codifiquen
proteínas que pueden mejorar trastornos neurológicos tales como:
secuencias que codifican el factor del crecimiento nervioso (NGF),
factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de
cerebro (BDNF), neurotrofinas 3 y 4/5 (NT-3 y 4/5),
factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), factores del
crecimiento transformantes (TGF), y factor del crecimiento de
fibroblastos ácido y básico (a- y bFGF); secuencias que codifican la
tirosina hidroxilasa (TH) y aminoácido aromático descarboxilasa
(AADC); secuencias que codifican la superóxido dismutasa (SOD 1 ó
2), catalasa y glutatión peroxidasa; secuencias que codifican
interferones, linfoquinas, citoquinas y sus antagonistas, tales
como el factor de necrosis tumoral (TNF), anticuerpos específicos de
CD4, y receptores de TNF o CD4; secuencias que codifican isoformas
del receptor GABA, la enzima sintetizadora de GABA ácido glutámico
descarboxilasa (GAD), canales de potasio dependientes de calcio o
canales de potasio sensibles al ATP; y secuencias que codifican la
timidina quinasa. La invención también contempla el uso de genomas
de rAAV que incluyen secuencias de globina, oncogenes, ras y p53.
Los genomas de AAV recombinantes que incluyen nucleótidos
antisentido que afectan a la expresión de ciertos genes, tales como
genes supresores de la muerte celular (por ejemplo,
bcl-2) o que afectan a la expresión de receptores de
aminoácidos excitatorios (por ejemplo, receptores de glutamato y
NMDA) también se contemplan para modular trastornos
neurológicos.
Otras secuencias de ADN de interés contempladas
por la invención incluyen secuencias de patógenos que incluyen:
VIH-1 y VIH-2 (secuencias diferentes
de las secuencias rev y gp160); virus
T-linfotróficos humanos de tipo I y II; virus
sincitial respiratorio; virus de parainfluenza de tipos
1-4; virus del sarampión; virus de las paperas;
virus de la rubéola; virus de la polio de tipos 1-3;
virus de la gripe de tipo A, B y C; virus de la gripe no humanos
(aviar, equina, porcina); virus de la hepatitis de tipo A, B, C, D y
E; rotavirus; virus de Norwalk; citomegalovirus; virus de
Epstein-Barr; virus del herpes simplex de tipo 1 y
2; virus de la varicela-zoster; virus del herpes
humano de tipo 6; hantavirus; adenovirus; Chlamydia
pneumoniae; Chlamydia trachomatis; Micoplasma
pneumoniae; Mycobacterium tuberculosis; micobacterias
atípicas; virus de la leucemia felina; virus de la inmunodeficiencia
felina; virus de la inmunodeficiencia bovina; virus de la anemia
infecciosa equino; virus de la artritis y encefalitis caprino; y
visnavirus.
Las líneas celulares de la invención se
transfectan de forma estable con genomas de rAAV de la invención y
con copias de genes rep y cap de AAV. Las líneas celulares
preferidas son líneas celulares de mamífero, por ejemplo, líneas
celulares HeLa. La infección de las líneas celulares de la invención
con un virus auxiliar de AAV produce la encapsulación de los
genomas de rAAV como partículas infecciosas de rAAV. Una línea
celular estable preferida en la actualidad es la línea celular HeLa
A64, que se depositó en ATCC el 1 de Junio de 1994, y se le asignó
el nº de registro ATCC CRL 11639. La presente invención también
proporciona líneas celulares estables que contienen secuencias rep
y cap de AAV pero no genoma de rAAV.
Los AAV recombinantes generados por los
anteriores procesos de encapsulación son útiles para transportar el
ADN de interés hasta células. In vivo, los rAAV pueden
utilizarse como vectores de transporte antisentido, vectores de
terapia génica o vectores de vacunas (es decir, inmunización
genética). El tratamiento de trastornos de enfermedad que incluyen,
por ejemplo, SIDA; trastornos neurológicos, incluyendo cáncer,
enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Huntington, y enfermedades autoinmunológicas, tales como esclerosis
múltiple, traumatismos, depresión, migraña, dolor o trastornos de
ataques; leucemia de células T en adultos; paraparesis espástica
tropical; infecciones del tracto respiratorio superior e inferior;
sarampión; paperas; rubéola; polio; gripe; hepatitis; diarrea;
infecciones por citomegalovirus sistémicas; enfermedades de tipo
mononucleosis; infecciones por el virus de
Epstein-Barr sistémicas; mononucleosis infecciosa
clásica; infecciones por herpes simplex de tipo 1 y 2 sistémicas;
infecciones por herpes simplex genitales; varicela; roséola;
enfermedad febril debida al virus del herpes de tipo 6 humano;
neumonía y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos;
infecciones; conjuntivitis; infecciones del tracto genital;
tuberculosis pulmonar y extrapulmonar; infecciones sistémicas
debidas a micobacterias atípicas; leucemia felina; SIDA felino; SIDA
bovino; anemia infecciosa equina; artritis y encefalitis en cabras;
y neumonía y encefalitis en ovejas, se contempla por la invención.
Como vector de vacunas, el rAAV transporta un gen de interés hasta
una célula, y el gen se expresa en la célula. Los vectores de
vacunas pueden utilizarse para generar inmunidad intracelular si el
producto génico es citoplásmico (por ejemplo, si el producto génico
evita la integración o replicación de un virus). Como alternativa,
puede generarse inmunidad extracelular/sistémica si el producto
génico se expresa sobre la superficie de la célula o se
segrega.
Un hospedante (en especial un hospedante humano)
puede inmunizarse contra un polipéptido de un organismo que provoca
una enfermedad, administrando al hospedante una cantidad inductora
de inmunidad de un rAAV de la invención que codifica el
polipéptido. La inmunización de un hospedante humano con un rAAV de
la invención implica la administración mediante inoculación de una
dosis inductora de inmunidad del virus a través de la vía parenteral
(por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular o
subcutánea), mediante escarificación superficial, o mediante
inoculación hacia la interior de una cavidad corporal. De forma
típica, una o varias inoculaciones de entre aproximadamente 1000 y
aproximadamente 10.00.000 unidades infecciosas, según se mide en
líneas celulares susceptibles humanas o de primates no humanos, es
suficiente para lograr la inmunización de un hospedante humano. El
virus que se va a utilizar como vacuna puede emplearse en forma
líquida o liofilizada (en combinación con uno o más conservantes
adecuados y/o agentes protectores para proteger al virus durante el
proceso de liofilización). Para la terapia génica (por ejemplo, de
trastornos neurológicos que pueden mejorarse mediante un producto
génico específico), se administra una dosis terapéuticamente eficaz
de un rAAV de la invención que codifica el polipéptido, a un
hospedante que necesite dicho tratamiento. Se contempla el uso de
rAAV de la invención para la fabricación de un medicamento para
inducir inmunidad, o para proporcionar una terapia génica, a un
hospedante.
Numerosos otros aspectos y ventajas de la
presente invención serán evidentes tras considerar su siguiente
descripción detallada, haciendo referencia a los dibujos, en los
que:
la Figura 1 es una representación esquemática
del genoma de AAV;
la Figura 2 es una representación esquemática
del plásmido psub201, que es la fuente de las secuencias de AAV2
utilizadas en los ejemplos;
la Figura 3A a 3B es un diagrama de flujo de la
construcción de un genoma de rAAV de la invención en el vector
pAAV/CMV/SIVrev-gp160;
la Figura 4 es un diagrama de flujo de la
construcción del vector
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap
útil para generar una línea celular estable que produce rAAV de la
invención; y
la Figura 5 es una representación esquemática de
un método para encapsular rAAV utilizando líneas celulares estables
de hospedantes de la invención.
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos que tratan de la producción y uso de rAAV de la
invención. El Ejemplo 1 describe la construcción de un vector que
incluye un genoma de rAAV que contiene los genes de la envuelta
(gp160) y rev de SIV, mientras que el Ejemplo 2 describe la
construcción de un vector que incluye los genes
rep-cap de AAV y un gen de resistencia a la miocina.
El Ejemplo 3 expone la construcción de un vector que se utiliza
para generar líneas celulares estables que producen rAAV a partir de
los vectores descritos en los Ejemplos 1 y 2. La generación de
líneas celulares estables que producen rAAV que codifican las
proteínas gp160 y rev de SIV se detalla en el Ejemplo 4. El Ejemplo
5 expone un procedimiento preferido para purificar rAAV a partir de
líneas celulares estables de la invención. El Ejemplo 6 describe la
generación de líneas celulares estables que expresan los genes
rep-cap de AAV. El Ejemplo 7 presenta los resultados
de la infección de diversas líneas celulares y células de mamífero
con los rAAV descritos en el Ejemplo 4, que demuestran que la
proteína gp160 se expresa en las células infectadas. El Ejemplo 8
describe la generación de líneas celulares estables que producen un
rAAV que incluye el gen de \beta-galactosidasa
como ADN de interés y que es útil como virus de control positivo
para la expresión de un ADN de interés en células o tejidos diana.
El Ejemplo 9 presenta los resultados de experimentos en los que un
rAAV de la invención se utilizó para expresar un ADN de interés
in vivo. El Ejemplo 10 describe métodos contemplados por la
invención para aumentar la valoración de rAAV producidos por líneas
celulares estables.
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Ejemplo
1
Un vector que incluye un genoma de rAAV que
contiene un módulo génico de envuelta (gp160) y rev de SIV se
construyó a partir de un plásmido existente denominado psub201
[Samulski et al., supra]. La Figura 2 es un diagrama del
plásmido psub201 en el que se muestran los sitios de endonucleasas
de restricción y se abrevian como sigue: P, PvuII; X, XbaI; B,
BamHI; H, HindIII; y N, NaeI. El plásmido contiene un genoma de AAV2
de tipo salvaje modificado clonado entre los sitios de restricción
PvuII. La secuencia de ADN del genoma de AAV2 de tipo salvaje se
presenta en SEQ ID NO: 1. La secuencia de AAV2 se modificó para que
incluyera sitios de restricción convenientes. De forma específica,
se añadieron dos sitios de restricción XbaI a través de la adición
de conectores en las posiciones de la secuencia 190 y 4484. Estos
sitios son internos a las repeticiones terminales invertidas (ITR)
de 191 pb que incluyen las ITR de 145 pb del genoma de AAV. La
inserción de estos sitios permite la eliminación completa del
fragmento interno de 4,3 kb que contiene los genes
rep-cap de AAV tras la digestión con XbaI del
plásmido. En la Figura 2, las ITR de 191 pb se indican mediante
flechas invertidas.
El vector del genoma de rAAV de la invención
(pAAV/CMV/SIVrev-gp160) se generó en varias
etapas.
En primer lugar, el plásmido psub201 se digirió
con XbaI y se aisló el fragmento del vector de aproximadamente 4 kb
que incluye las ITR de AAV. Entonces se insertó un módulo de
expresión génico de CMV entre las ITR de AAV mediante acoplamiento
de extremos romos. El módulo de expresión de CMV se derivó como un
fragmento de ADN XbaI-AfilIII de 1,8 kb a partir
del vector pCMV-NEO-BAM descrito en
Karasuyama et al., J. Exp. Med., 169: 13-25
(1989). Antes del acoplamiento, los extremos moleculares se
rellenaron utilizando un fragmento de Klenow de la ADN polimerasa
I. El módulo de expresión de CMV contenía una porción de 750 pb del
promotor inmediato temprano de CMV, seguido de un intrón de 640 pb
y una secuencia de señal de poliadenilación de 360 pb que se
derivaron del gen de \beta-globina de conejo.
Entre el intrón y las secuencias de poliA se encontraban dos sitios
de clonación: un sitio BamHI exclusivo y dos sitios de restricción
EcoRI flanqueantes. El vector resultante se denominó pAAV/CMV.
Véase la Figura 3A, en la que se muestran los sitios de ruptura por
endonucleasas de restricción y se abrevian como sigue: B, BamHI; E,
EcoRI; N, NaeI; y P, PvuII.
En segundo lugar, el vector de expresión
pAAV/CMV se linealizó en el sitio BamHI y se crearon extremos romos
en los extremos pegajosos con Klenow. Un fragmento subgenómico de
2,7 kb de SIV, generado mediante PCR, que contiene las secuencias
de la envuelta (gp160) y rev [SEQ ID NO: 2, Hirsch et al.,
Nature, 339: 389-392 (1989)] se clonó en el
sitio BamHI con extremos romos. El vector del genoma de AAV
recombinante resultante, pAAV/CMV/SIVrev-gp160,
tiene una longitud de 8,53 kb. Véase la Figura 3B, en la que se
muestran los sitios de ruptura por endonucleasas de restricción y
se abrevian como sigue: N, NaeI; y P, PvuII. El vector contiene los
siguientes segmentos de ADN en secuencia: (1) una ITR de AAV, (2) el
promotor de CMV, (3) el intrón de \beta-globina
de conejo, (4) las secuencias de la envuelta y rev de SIV, (5) la
señal de poliadenilación de \beta-globina de
conejo, y (6) una ITR de AAV. En ensayos de transfección transitoria
de células 293 humanas, este vector produce unos altos niveles de
expresión de la proteína gp160 de SIV, según se determina mediante
ensayos de radioinmunoprecipitación utilizando sueros policlonales
de monos infectados con SIV.
La invención contempla específicamente la
sustitución, mediante técnicas de ADN recombinante convencionales,
de las siguientes secuencias por las secuencias de envuelta/rev de
SIV en el anterior vector: secuencias de envuelta/rev de
VIH-1 (la secuencia de envuelta/rev de
VIH-1_{MN} se indica en SEQ ID NO: 3); factor de
crecimiento nervioso [Levi-Montalcini, Science,
237: 1154-1162 (1987)]; factor neurotrófico
ciliar [Manthorpe et al., comienza en p. 135 en Nerve
Growing Factors, Wiley and Sons (1989)]; factor neurotrófico
derivado de células gliales [Lin et al., Science, 260:
1130-1132 (1993)]; factores del crecimiento
transformantes [Puolakkainen et al., comienza en p. 359 en
Neurotrophic Factors, Academic Press (1993)]; factores del
crecimiento de fibroblastos ácidos y básicos [Unsicker et
al., comienza en p. 313 en Neurotrophic Factors,
Academic Press (1993)]; neurotrofina 3 [Maisonpierre et al.,
Genomics, 10: 558-568 (1991)]; factor
neurotrófico derivado de cerebro [Maisonpierre, supra];
neurotrofina 4/5 [Berkemeier et al., Neuron, 7:
857-866 (1991)]; tirosina hidroxilasa [Grima et
al., Nature, 326: 707-711 (1987)]; y aminoácido
aromático descarboxilasa [Sumi et al., J. Neurochemistry, 55:
1075-1078 (1990)].
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Ejemplo
2
Un plásmido denominado
pSV40/neo/rep-cap que contiene los genes
rep-cap de AAV y un gen de resistencia a la
neomicina se construyó para ser utilizado junto con el vector del
genoma de AAV descrito en el Ejemplo 1 para generar una línea
celular estable que produce rAAV.
Un plásmido denominado pAAV/SVneo (Samulski
et al., supra) se digirió con EcoRI y BamHI para liberar un
inserto de 2,7 kb que incluye una porción de 421 pb del promotor
temprano de SV40, un gen de resistencia a la neomicina de 1,4 kb, y
un fragmento de ADN de 852 pb que contiene el sitio de escisión t
pequeño de SV40 y una señal de poliadenilación de SV40. Este
inserto liberado se clonó en los sitios EcoRI y BamHI de pBLUESCRIPT
KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) para generar el plásmido pSV40/neo
de 5,66 kb. Después, el fragmento de ADN de aproximadamente 4,3 kb
que contiene los genes rep-cap de AAV, derivado de
la digestión de psub201 con XbaI como se describe en el Ejemplo 1,
se acopló al sitio de restricción XbaI de pSV40/neo para crear el
plásmido pSV40/neo/rep-cap (aproximadamente 10 kb).
La construcción del plásmido se detalla en la primera mitad de la
Figura 4, en la que se muestran los sitios de endonucleasas de
restricción y se abrevian como sigue: B, BamHI; E, EcoRI; P, PvuII;
N, NotI; RV, EcoRV; y X, XbaI. Este plásmido era funcional en
ensayos transitorios de actividad rep y cap, y en último término se
utilizó en sí mismo para derivar líneas celulares estables (véase
el Ejemplo 5 a continuación).
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Ejemplo
3
Un vector final que se utiliza para generar
líneas celulares estables que producen rAAV se generó a partir del
vector pAAV/CMV/SIVrev-gp160 (Ejemplo 1) y el
plásmido pSV40/neo/rep-cap (Ejemplo 2).
La construcción implica retirar el módulo génico
neo-rep-cap de
pSV40/neo/rep-cap e insertarlo en un sitio NaeI
exclusivo en pAAV/CMV/SIVrev-gp160 (véase la Figura
3B). De forma específica, el vector
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap
se produjo mediante el aislamiento de una banda en gel de agarosa de
un fragmento de ADN EcoRV-NotI de 7,0 kb que
contiene los dominios de expresión SV/neo y rep-cap
a partir de pSV40/neo/rep-cap. Se crearon extremos
romos en los extremos pegajosos con Klenow, y el fragmento se acopló
en el sitio NaeI de extremos romos de
pAAV/CMV/SIVrev-gp160. Véase la Figura 4. El vector
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap
(ATCC 69637) contiene los siguientes elementos: (1) el genoma de
rAAV; (2) los genes rep-cap de AAV; y (3) el gen de
resistencia a la neomicina.
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Ejemplo
4
El vector
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap se
utilizó para generar líneas celulares estables que contienen el
genoma de rAAV de la invención y los genes rep-cap
de AAV.
Células HeLa con una confluencia de 70% se
transfectaron con 10 \mug de ADN del plásmido
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap
en placas de 100 mm. Las células se transfectaron durante 6 horas
después de la formación de complejos de DOTAP/ADN en medio sin
suero como indica el protocolo del fabricante
(Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN). Después de
la retirada del medio de transfección se añadió a las células medio
DMEM que contiene suero bovino fetal al 10%. Tres días después, se
utilizó medio suplementado con 700 \mug/ml de geneticina
(Gibco-BRL, Gaithesburg, MD) para seleccionar
células que expresasen de forma estable el gen de resistencia a la
neomicina. Se añadió medio DMEM fresco que contiene geneticina cada
cuatro días. Los clones resistentes a la geneticina se
seleccionaron a los 10-14 días después de añadir el
medio selectivo. Se seleccionó un total de 55 colonias y se
trasladaron a placas de 24 pocillos y se expandieron para su
posterior análisis.
Las 55 líneas celulares HeLa resistentes a la
neomicina se seleccionaron, en primer lugar, para la actividad del
gen rep funcional; 21 resultaron positivas. La actividad del gen rep
se ensayó infectando las líneas celulares con adenovirus de tipo 5
(Ad5). La infección con el adenovirus transactiva los genes rep y
cap. Esto da como resultado la replicación del genoma de rAAV y la
posterior encapsidación de estas secuencias en partículas rAAV
infecciosas. En la Figura 5 se muestra una representación
esquemática de la producción de rAAV. Después del máximo efecto
citopático inducido por Ad5 (CPE; las células se redondean y hay 90%
de desprendimiento del matraz de cultivo), se prepararon lisados
celulares y se aisló ADN de Hirt (ADN de bajo peso molecular)
[Hirt, J. Mol. Biol., 26:365-369 (1967)]. Se
utilizó un análisis de la transferencia Southern para visualizar la
síntesis de formas replicativas de AAV recombinante (rAAV) (formas
monocatenarias, monómeras y dímeras). Los pocillos control que no
recibieron Ad5 siempre eran negativos. Las líneas celulares con
altos niveles relativos de actividad del gen rep se seleccionaron
para su posterior
estudio.
estudio.
Para ensayar la funcionalidad del gen cap, se
infectaron líneas celulares con Ad5 y se prepararon lisados
aclarados después de desarrollarse el CPE máximo. Se utilizaron los
lisados celulares, Ad5, y AAV de tipo salvaje para infectar células
HeLa. Después del desarrollo de CPE inducido por Ad5 (72 horas), se
aisló ADN de Hirt y se realizó un análisis de la transferencia
Southen. Los lisados de las líneas celulares que produjeron
secuencias replicativas de rAAV hibridables con gp160 (gp160 de
SIV) puntuaron como positivas para la producción de cápsidas.
Se derivó una valoración infecciosa en
unidades/ml (IU/ml) de rAAV producida por cada línea celular
coinfectando células C12 (que muestran una expresión estable de los
genes rep y cap) con Ad5 y diluciones en serie en diez veces de los
lisados de líneas celulares aclarados que se van a ensayar. Después
de un CPE máximo inducido por Ad5, se aisló ADN de Hirt y se
realizó un análisis de la transferencia Southern para detectar la
presencia de formas replicativas de rAAV. La dilución de punto
final que produjo intermedios de replicación monómeros y dímeros
visibles se tomó como la valoración. La estimación de la valoración
se basó en dos a cuatro experimentos duplicados.
Los resultados de la caracterización de ocho de
las 55 líneas celulares se muestran en la Tabla 1 a continuación,
en la que "ND" indica un valor no determinado.
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La línea celular A64 (ATCC CRL 11639) produjo
una alta valoración de rAAV (10^{6} IU/ml) en lisados aclarados.
Esta valoración es aproximadamente 1000 veces mayor que la
valoración de rAAV indicada por Vincent et al., supra.
Los rAAV producidos por las diversas líneas
celulares también se ensayaron para su capacidad para expresar
gp160 de SIV en células HeLa infectadas con el virus recombinante.
Se generaron cepas concentradas de rAAV producidos por las ocho
líneas celulares estables listadas en la Tabla 1. Los lisados
celulares que contenían partículas de rAAV se sometieron a una
purificación en gradiente de densidad en etapas (CsCl). Después de
una diálisis de desalinización y de la inactivación por calor de
Ad5, las partículas de rAAV se utilizaron para infectar
(transducir) células HeLa en cultivo. Se siguieron dos líneas de
investigación. En primer lugar, las células transducidas se
ensayaron para la presencia de ARNm específico de gp160 de SIV
llevando a cabo una RT-PCR sobre el ARN total
recogido 72 horas después de la transducción. Los cebadores
específicos de gp160 de SIV amplificaron un fragmento predicho de
300 pb sólo en presencia de transcriptasa inversa y Taq polimerasa;
las muestras ensayadas sin transcriptasa inversa eran siempre
negativas. En segundo lugar, se transdujeron células HeLa con
diversas diluciones de la misma cepa rAAV/SIV que se describió
anteriormente y, 72 horas después de la transducción, se realizó
una inmunofluorescencia indirecta en las células infectadas. En
todas las diluciones ensayadas (hasta 1:200) se detectaron células
positivas para la proteína gp160 de SIV; las diluciones menores
tenían, evidentemente, más células positivas.
La línea celular A64 se ensayó para la
producción de AAV de tipo salvaje mediante un método convencional.
La línea celular se infectó con adenovirus para producir rAAV como
un lisado. El lisado entonces se utilizó para infectar células HeLa
normales: (i) sólo; (ii) con adenovirus; o (iii) con adenovirus y
AAV de tipo salvaje. Como control, células HeLa se infectaron con
adenovirus y AAV de tipo salvaje sin rAAV. Se preparó ADN de Hirt y
se analizó mediante transferencia Southern (dos transferencias
diferentes) para formas replicantes de rAAV o de AAV de tipo
salvaje. No se detectó AAV de tipo salvaje en células A64 que no
fueron expuestas a AAV de tipo salvaje.
Debido a que la presente invención implica el
establecimiento de líneas celulares estables que contengan no sólo
copias de los genes rep y cap de AAV, sino también del genoma de
rAAV (con ITR flanqueando el ADN de interés), se produce rAAV
simplemente infectando la línea celular con adenovirus. No se
requiere la transfección de ADN exógeno, aumentando, con ello, la
eficacia de la producción de rAAV comparada con los métodos
previamente descritos. Otras características significativas de la
invención es que no se produce AAV de tipo salvaje y que la
transformación de escala para la producción de rAAV es fácil y sólo
está limitada por las restricciones normales del crecimiento
celular en cultivo.
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Ejemplo
5
Se desarrolló un método para aislar y purificar
rAAV a partir de líneas celulares estables (productoras).
Las células productoras (por ejemplo, las
células A64 del Ejemplo 4) se sembraron con un densidad celular de
3 x 10^{6} células productoras por 175 cm^{2} de superficie
específica en medio de crecimiento. Las células alcanzaron una
densidad de aproximadamente 8 x 10^{6} células después de
16-18 horas, y entonces se infectaron con
adenovirus (Ad5) a una multiplicidad de infección (moi) de 5 durante
1-2 horas en medio de crecimiento. Se utilizó un
volumen de infección de 15 ml, y después de las 1-2
horas de infección, se añadieron 10 ml de medio de crecimiento a
cada matraz para obtener un volumen final de 25 ml (como
alternativa, Ad5 puede añadirse directamente: eliminando todo menos
15 ml del medio de crecimiento y añadiendo Ad5 en un volumen de 10
ml (diluido en HBSS) para producir un volumen final de 25 ml).
Las células se recogieron aproximadamente
48-60 horas después de la infección cuando la
mayoría de las células se desprendieron del matraz después de una
agitación vigorosa. Las células entonces se tiñeron con azul de
tripano para determinar el porcentaje de células viables. Resulta
deseable que más de 80% sean viables. Las células entonces se
trasladaron a botellas cónicas desechables de 250 ml (Corning) y se
sedimentaron a 1000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante
resultante se retiró, guardando una parte alícuota, y las células
se suspendieron en tampón TM (Tris 50 mM, pH 8,0, y MgCl_{2} 1 mM)
a una densidad de 5 x 10^{6} células/ml. Las células se
sometieron a tres ciclos de congelación/descongelación en hielo seco
con agitación en vórtice durante 2 minutos entre cada
descongelación. Las células lisadas entonces se calentaron hasta
56ºC durante 30 minutos a una hora, con agitación en vórtice cada
7,5 minutos durante la última descongelación. Se añadió
desoxicolato al 10% al lisado hasta una concentración final de 1%, y
la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 minutos con una agitación en
vórtice intermitente para lograr una lisis completa. Si es necesario
para lograr una lisis completa, la mezcla se sonica tres veces en
el ajuste máximo durante 2 minutos cada vez. Se utilizó un
hemocitómetro para confirmar la lisis celular completa. El residuo
celular se sedimentó a 2000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se guardó
el sobrenadante que contiene
rAAV.
rAAV.
El rAAV se aisló utilizando un lecho de CsCl
1,31 g/ml. Se extendieron 21 ml del sobrenadante del lisado sobre
un lecho de CsCl de 14 ml en un tubo SW-28, y se
centrífugo a 16.000 rpm, 10ºC, durante 16 horas. El sobrenadante
resultante se aspiró y el sedimento de rAAV se lavó con HBSS para
eliminar el CsCl residual. El sedimento de rAAV se redisolvió en
Tris 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM (tampón TMN) el
volumen más pequeño manejable (aproximadamente 500
\mul/sedimento) y se dejó que se hidratase durante la noche.
Después se calentó hasta 56ºC durante 30 minutos agitando en
vórtice cada 5 minutos. En este punto final, el virus se dializó
contra el tampón TMN para eliminar todas las trazas de cesio si el
virus no se va purificar aún más.
El rAAV puede purificarse aún más mediante
formación de bandas isopícnica. Esto resulta apropiado en
condiciones en las que el virus se va a administrar in vivo.
El rAAV hidratado se llevó hasta una densidad de CsCl de 1,41 g/ml,
y después se agitó en un tubo SW-41 a 30K durante 48
horas a 10ºC. La porción superior del gradiente que contiene
adenovirus (densidad de 1,34-1,36 g/ml) se rechazó y
la porción restante del gradiente de CsCl se diluyó con TMN hasta
una densidad hidrostática menor que 1,1 g/ml. Entonces el rAAV se
sedimentó mediante una centrifugación durante la noche a >60.000
x g. El rAAV se resuspendió en una cantidad mínima de tampón TMN
suplementado con gelatina al 1%. Para una hidratación eficaz, el
sedimento se dejó en reposo durante la noche a 4ºC. Entones se
formaron partes alícuotas de rAAV y se conservaron a -20ºC.
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Ejemplo
6
Al mismo tiempo que la generación de las células
estables descritas en el Ejemplo 4, se establecieron líneas
celulares HeLa estables mediante métodos similares que contienen
genes rep-cap pero no genoma de rAAV utilizando el
plásmido pSV40/neo/rep-cap (Ejemplo 2). Se aisló y
caracterizó un total de 52 líneas celulares HeLa resistentes a la
neomicina.
Para ensayar la función del gen rep, cada línea
celular se infectó con Ad5 y posteriormente se transfectó con
pAAV/CMV/SIVrev-gp160. Después de CPE inducido por
Ad5 (72 horas), se aisló ADN de Hirt y se realizó un análisis de la
transferencia Southern. La función rep obtuvo una puntuación
positiva en las líneas celulares que produjeron secuencias gp160 de
rAAV monómeras y dímeras. La intensidad de la señal
autorradiográfica se utilizó como una medida relativa de la
expresión del gen rep (1-5+). Las muestras control
sin Ad5 nunca produjeron formas replicativas de rAAV. La
competencia del gen cap se ensayó de una manera similar (infección
con Ad5 y transfección con pAAV/CMV/SIVrev-gp160),
excepto que se preparó un lisado celular aclarado después del
desarrollo del CPE máximo. Entonces se coinfectaron células HeLa
con una porción del lisado celular aclarado, Ad5, y AAV de tipo
salvaje. Se aisló ADN de Hirt 72 horas después, y se utilizó un
análisis de hibridación para visualizar la existencia de formas
replicativas de rAAV/gp160 (monómeras y dímeras). En el ensayo
descrito, la línea celular C12 produjo la mayor proporción relativa
de secuencias de rAAV/gp160/120.
Los resultados de los ensayos de caracterización
de ocho líneas celulares se presentan en la Tabla 2, en la que la
abreviatura "ND" indica que no se determinó un valor.
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Existen dos usos principales para las líneas
celulares estables que expresan secuencias rep-cap:
(1) la generación de partículas rAAV si las líneas celulares se
transfectan con un genoma de rAAV y se infectan con un virus
auxiliar; y (2) la determinación de valoraciones infecciosas de
rAAV. Para la estimación de valoraciones infecciosas de rAAV, estas
líneas celulares se coinfectan con adenovirus y diluciones en serie
de la cepa de rAAV. Después del CPE máximo, se aisló ADN de Hirt y
se visualizaron las formas replicativas de rAAV mediante análisis de
la transferencia Southern. La valoración de punto final (última
dilución de la cepa de rAAV que produce una señal de hibridación
positiva) se utiliza entonces para determinar la valoración
infecciosa.
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Ejemplo
7
Se ensayó la capacidad de rAAV producido por la
línea celular HeLa A64 para infectar (transducir) y producir
proteína gp160 de SIV en diversos tipos celulares de mamífero,
además de células HeLa (véase el Ejemplo 4). El rAAV (a una
multiplicidad de infección de aproximadamente 1) se utilizó para
infectar células en una monocapa o en una suspensión, dependiendo
del tipo celular. Tres días después de la infección con rAAV, las
células se fijaron en acetona/metanol y se evaluaron para la
producción de gp160 mediante inmunofluorescencia indirecta
utilizando antisuero policlonal a partir de un mono infectado con
SIV. Las siguientes células o líneas celulares se infectaron y se
demostró que producían gp160: células cerebrales de rata fetal
(neuronas y células gliales), fibroblastos 3T3 de ratón, vagina de
ragón, vagina humana, colon humano, linfocitos humanos y de mono, y
células 293. No se identificó ningún tipo celular no permisivo.
Estos resultados demuestran que el rAAV producido por la línea
celular A64 infecta a una amplia gama de tipos celulares de mamífero
y conduce a la expresión sobre la superficie celular del producto
génico de la envuelta de SIV, gp160, en las células
transducidas.
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Ejemplo
8
Se generaron líneas celulares estables que
producían rAAV que porta el gen de
\beta-galactosidasa como gen de interés. Estos
rAAV son útiles como control positivo para ensayar la expresión de
un ADN de interés en una célula o tejido diana.
Se construyó un vector como
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap
que incluía un módulo de expresión génica de
\beta-galactosidasa (Clontech, Palo Alto, CA) que
contiene el promotor de CMV humano, el gen de
\beta-galactosidasa de E. coli, y la
secuencia de ruptura/poliadenilación de SV40 en lugar del intrón de
\beta-globina de conejo, rev y secuencias de la
envuelta de SIV, y una señal de poliadenilación de
\beta-globina de conejo entre las ITR de AAV.
Este módulo de expresión génica de
\beta-galactosidasa se clonó entre las ITR de AAV
mediante métodos recombinantes
convencionales.
convencionales.
Se generaron líneas celulares HeLa estables que
producen rAAV que contiene el gen de
\beta-galactosidasa
(rAAV/\beta-gal) como se describe en el Ejemplo 4,
utilizando el vector anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
El rAAV/\beta-gal del Ejemplo
8 se utilizó para demostrar el uso de rAAV de la invención para la
transferencia de genes hacia los cerebros de ratones vivos. Se
inyectó directamente rAAV/\beta-gal en los
cerebros de ratones, y entonces los cerebros se examinaron para
detectar evidencias de actividad
\beta-galactosidasa.
Ratones Balb/c (n = 3; machos; 9 meses de edad)
se anestesiaron y se aseguraron sobre una plataforma estereotáctica
murina. Utilizando una técnica estéril, se inyectó
rAAV/\beta-gal (1 \mul que contiene 3 x 10^{6}
unidades infecciosas) en el hipocamplo derecho. Otros ratones (n =
3) recibieron una inyección de diluyente como control. Una semana
después de la inyección, los ratones se sacrificaron mediante
exanguinación cardíaca, seguido de una infusión secuencial de 50 ml
de disolución salina tamponada con fosfato heparinizada, después 50
ml de una mezcla de paraformaldehído (al 0,5%) y glutaraldehído (al
2,5%) en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,3). Se retiraron los cerebros
completos, se posfijaron en la misma mezcla de fijación (2 horas) y
se congelaron en O.C.T. Secciones criostáticas (10 \mum) se
colocaron sobre portaobjetos de microscopio revetidos con
poli-L-lisina y se conservaron a
-20ºC. Los portaobjetos se descongelaron a temperatura ambiente, se
volvieron a fijar (5 minutos a 4ºC), se lavaron dos veces en PBS, y
se trasladaron a un tinte X-gal (un sustrato para la
actividad enzimática de \beta-galactosidasa).
Después de una incubación durante la noche a 37ºC, los portaobjetos
se lavaron dos veces en PBS, se contratiñeron con rojo rápido
nuclear, y se estudiaron al microscopio para detectar células
teñidas de azul (células en las que se está expresando la
\beta-galactosidasa).
En los cerebros de los ratones inyectados con
rAAV/\beta-gal, las células teñidas de azul en el
hipocampo pudieron detectarse con facilidad tras el estudio
microscópico. En los cerebros de ratones inyectados con diluyente
(controles), no se encontraron células teñidas de azul.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La invención contempla diversos métodos para
aumentar la valoración de rAAV generados a partir de líneas
celulares estables que implican proporcionar más genes rep y cap de
AAV a las líneas celulares.
En un primer método que demuestra la utilidad de
proporcionar más genes rep y cap, una línea celular productora se
transfecta con un plásmido auxiliar que porta genes rep y cap de AAV
antes de la infección con adenovirus. Los resultados de los
experimentos en los que una línea celular productora de
rAAV/\beta-gal (H44) transfectada de esta manera
se muestran en la Tabla 3 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
En un segundo método, los genes rep y cap de AAV
se colocan en otro plásmido que contiene un origen EBV o BPV de la
replicación del ADN y un marcador de resistencia a un fármaco
(higromicina). El plásmido se transfecta en una línea celular
productora y entonces se seleccionan nuevas líneas celulares en
neomicina e higromicina. Esta presión selectiva da como resultado
líneas celulares estables que contienen los genomas de rAAV y
múltiples copias de los genes rep y cap de AAV.
En un tercer método, los genes rep y cap de AAV
se clonan en el genoma de adenovirus en la posición E3 bajo el
control del operador de tetraciclina.
Aunque la presente invención se ha descrito en
términos de las realizaciones preferidas, se entenderá que los
expertos en la técnica realizarán variaciones y mejoras. Por tanto,
sólo deben aplicarse a la invención las limitaciones que aparecen
en las reivindicaciones.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Johnson, Philip R.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Materiales y métodos de virus adenoasociados
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray y Borun
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6300 Sears Tower, 233 S. Wacker Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Chicago
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Illinois
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 60606
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/254.358
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUN-1994
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Noland, Greta E.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.302
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 32634
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (312) 474-6300
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (312) 474-0448
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 25-3856
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4680 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2658 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2571 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un vector de ADN que comprende un genoma de
virus adenoasociado recombinante y secuencias de ADN que codifican
proteínas rep/cap adenoasociadas, en el que dicho genoma de virus
adenoasociado recombinante comprende repeticiones terminales
invertidas de virus adenoasociado que flanquean a secuencias de ADN
que no son de virus adenoasociado unidas operablemente a un
promotor y secuencias de poliadenilación, y en el que dicho genoma
de virus adenoasociado recombinante carece de secuencias
rep-cap que codifiquen proteínas
rep-cap funcionales.
2. El vector de ADN de la reivindicación 1, en
el que dichas secuencias de ADN que no son de virus adenoasociado
son secuencias de ADN que codifican una proteína de un virus de la
inmunodeficiencia.
3. El vector de ADN de la reivindicación 2, que
es el vector
pAAV/CMV/SIVrev-gp160/neo/rep-cap
(ATCC 69637).
4. Una célula hospedante de mamífero
transfectada de forma estable con el vector de ADN de la
reivindicación 1.
5. La célula hospedante de mamífero de la
reivindicación 4, en la que dichas secuencias de ADN que no son de
virus adenoasociado son secuencias de ADN que codifican una proteína
de un virus de la inmunodeficiencia.
6. La célula hospedante de mamífero de la
reivindicación 5, que es la línea celular HeLa A64 (ATCC CRL
11639).
7. Un método para producir virus adenoasociados
recombinantes infecciosos, que comprende la etapa de infectar una
célula hospedante según la reivindicación 4, con un virus auxiliar
de virus adenoasociado.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
dicho virus auxiliar contiene genes rep-cap de virus
adenoasociado insertados en su genoma.
9. Un vector de ADN según la reivindicación 1,
en el que dichas secuencias de ADN que no son de virus adenoasociado
son secuencias de ADN que codifican un polipéptido seleccionado del
grupo que consiste en tirosina hidroxilasa, aminoácido aromático
descarboxilasa, factor del crecimiento nervioso, factor neurotrófico
derivado del cerebro, NT-3, NT-4/5,
factor neurotrófico derivado de células gliales, y factor del
crecimiento de fibroblastos.
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