ES2302359T3 - Lemnaceae transgenicas. - Google Patents
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Abstract
Un método para la transformación genética estable de plantas enteras, tejido vegetal o callos de Lemnaceae, que comprende: (i) poner en contacto la planta entera, tejido vegetal o callo de Lemnaceae con células de Agrobacterium que contienen un molécula de ADN transformante; e (ii) incubar la planta entera, tejido vegetal o callo de Lemnaceae con las células de Agrobacterium, por lo que las células en dicha planta entera, tejido vegetal o callo de vuelven establemente transformadas con dicho ADN, en donde las células de Agrobacterium se ponen en contacto, antes de o durante el método de transformación, con un medio potenciador que aumenta la virulencia de las células de Agrobacterium, comprendiendo dicho medio potenciador una suspensión de células frescas de plantas dicotiledóneas o comprendiendo extracto de planta Lemnaceae, y comprendiendo además cafeína a una concentración de 100-500 mg por litro de medio.
Description
Lemnaceae transgénicas.
La presente invención se refiere a plantas
transformadas establemente, la progenie de las mismas y productos
obtenidos de las células o progenie. La invención además concierne a
métodos para la transformación genética de plantas y más
específicamente a un método en donde se usa Agrobacterium
como el vector de transformación.
La técnica anterior considerada pertinente para
la siguiente divulgación aparece en una lista en la sección
titulada "Referencias" antes de las
reivindicaciones.
La transformación genética de plantas está
empezando gradualmente a jugar un papel importante en la agricultura
moderna. Se han hecho intentos para introducir ADN heterólogo en
plantas para aumentar su resistencia a infecciones víricas,
adquirir o aumentar la resistencia a varios herbicidas, modular los
tiempo de maduración o decaimiento, aumentar el valor nutricional
de varios productos de las plantas, hacer que produzcan productos
farmacéuticos, y producir varias otras moléculas químicas y
biológicas.
La producción comercial de compuestos
transgénicos en sistemas de bacterias, levaduras y células de
mamíferos con frecuencia está dificultada por los altos costes de
capital de inversión en equipos de fermentación y la necesidad de
eliminar priones o componentes de microplasmas de los productos
purificados. Recientemente, se ha conseguido la producción de
proteínas y péptidos heterólogos (por ejemplo,
\alpha-amilasa, anticuerpos, encefalinas,
seroalbúmina humana) en plantas (Pen et al., 1992, Miele,
1997). Las ventajas potenciales de los sistemas de plantas
transgénicas son: costes de producción de biomasa reducidos y una
reducción del riesgo biológico de contaminantes en el procesamiento
posterior de los productos. Las plantas transgénicas pueden de esta
manera ser biorreactores superiores para enzimas en masa en la
industria, productos purificados en medicina y productos
farmacéuticos oralmente
activos.
activos.
Para transformar plantas para producir un
producto deseado, el gen relevante, una vez identificado y clonado,
se tiene que introducir en la planta de interés de modo que la
planta resultante sea capaz de pasar el gen a su progenie. Los
métodos de introducción propuestos para este propósito incluyen
electroporación, microinyección, bombardeo con microproyectiles,
fusión de liposomas, transferencia mediada por Agrobacterium,
y muchas otras.
Uno de los vectores de transformación más
comúnmente usado es Agrobacterium, que un género de bacteria
patógena de plantas de la familia Rhizobiaceae, que no fija
el nitrógeno libre y normalmente produce agallas y raíces pilosas
en células infectadas. El ADN heterólogo se introduce en
Agrobacterium y a través de un proceso de transfección en
donde el material genético de Agrobacterium entra en la
célula de la planta, tiene lugar la transformación de la planta
(Armitage et al., 1992). Agrobacterium infecta
principalmente plantas dicotiledóneas e infecta plantas
monocotiledóneas solo con un rendimiento muy bajo (Armitage et
al., 1992).
Un intento de transformar plantas
monocotiledóneas fue mediante bomardeo de partículas en donde el ADN
heterólogo se distribuye mediante aire o mediante helio en la
planta o célula vegetal que se va a transformar. Esta técnica tiene
dos desventajas principales: primero, es bastante difícil dirigir
las partículas de ADN a la zona meristemática en donde, para
ciertas plantas tales como las de la familia Lemnaceae,
debería tener lugar la transformación para permitir la regeneración
a partir de allí de un planta completa transformada; segundo,
incluso si la partícula de ADN entra en la zona meristemática y
alcanza el núcleo de la misma, el ADN normalmente no se integra en
el cromosoma de la célula y, de esta manera después de unos pocos
ciclos celulares el ADN heterólogo no integrado se pierde, de modo
que la transformación por bombardeo de partículas es normalmente
simplemente transitoria.
Hubiera sido muy deseable proporcionar un método
para la transformación genética de plantas monocotiledóneas que
produjera transformación estable con un rendimiento
satisfactorio.
Una de las monocotiledóneas comercialmente más
prometedoras son las Lemnaceae, una familia acuática
ampliamente distribuida de plantas pequeñas (1-5
mm). Las Lemnaceae sobresalen en dos características
potencialmente explotables por la industria de la biotecnología: su
extraordinaria velocidad de crecimiento vegetativo y una tolerancia
alta para un espectro de nutrientes y sustancias tóxicas (Landolt y
Kandeler, 1987). En los EE.UU., la comercialización de
Lemnaceae se ha centrado alrededor y la gerencia de aguas
residuales y los piensos animales (Culley et al., 1981; Ngo,
1987). Sin embargo, el uso de acuaculturas y tecnología convencional
mezcladas ha tenido solo un éxito moderado. En Israel se tomó una
aproximación diferente, utilizando la cepa Lemna gibba
Hurfeish (Porath et al., 1979). Con su raíz especialmente
corta y alto contenido en proteína, carotenoide y hierro, esta cepa
se cultivó en condiciones modernas de invernadero (4 toneladas por
acre por semana recogidas; Tzora Biotechnology Inc., Kibbutz
Tzora), y se comercializó como producto vegetal empaquetado para la
industria alimentaria. A pesar de las velocidades de crecimiento
sumamente elevadas y el futuro prometedor de Lemnaceae como
una potencial fuente de alimentos, varios intentos de transformar
genéticamente estas plantas, mediante un método de transformación
estable se han demostrado, hasta la fecha, bastante infructuosos.
El fracaso en la transformación era debido al hecho de que
Lemnaceae se multiplican vegetativamente, surgiendo las
frondas hijas de las zonas meristemáticas profundas dentro de la
fronda madre. De esta manera, se debe alcanzar el meristemo inicial
para que se produzca la transformación estable. Los inventores de la
solicitud encontraron que el bombardeo con partículas de
Lemnaceae, el método actual en el estado de la técnica usado
por varios grupos para obtener sucesos de transformación
localizados, transitorios, era ineficaz en la transformación de
frondas hijas.
Sería muy deseable obtener plantas de
Lemnaceae que están transformadas establemente con ADN
heterólogo de interés y usar tales plantas transformadas para la
producción de productos químicos y biológicos.
En la siguiente descripción, el término
"transformación" se usará para indicar la introducción
de un ADN transformante en células o tejido vegetales que lleva a
la aparición en estas células o tejidos de caracteres que dichas
células o tejidos no poseían anteriormente o a la modulación de
caracteres presentes, a priori, en las plantas. El término
"transformación estable" se usará para indicar una
transformación genética tal que es heredable a generaciones futuras
de la planta transformada. El término "ADN
transformante" se usará aquí para indicar la molécula de ADN
exógeno que se introduce en las células vegetales y produce su
transformación. El ADN transformante puede ser de cualquier origen,
por ejemplo de origen vegetal, y también puede ser una secuencia de
ADN que está presente de forma natural en la planta transformada. El
ADN transformante puede comprender regiones codificantes y/o
secuencias de control capaces de regular la cantidad y el tiempo de
la transcripción. El término "planta transformada
establemente" se usará de aquí en adelante para indicar una
planta que comprende un ADN transformante integrado de forma estable
en su genoma. Una "Lemnaceae transformada establemente"
se ajusta a la descripción de una planta transformada
establemente.
Según la presente invención se encontró de
manera sorprendente que existen condiciones que permiten la
transformación estable de plantas Lemnaceae. De esta manera,
mediante uno de sus aspectos, la presente invención concierne a una
planta Lemnaceae transformada establemente, tejidos,
productos de la misma y progenie de la misma.
Las plantas Lemnaceae son preferiblemente
de los géneros: Spirodela, Lemna y Wolffia. La
presente invención concierne preferiblemente a cepas de
Lemnaceae transformadas capaces de una eficacia de
transformación extremadamente alta, siendo un ejemplo de tales
cepas la cepa 8717 de Spirodela punctata, que es un cepa de
Spirodela punctata aislada por E. Landolt y marcada
erróneamente como Lemna disperma en Landolt, 1986.
La planta Lemnaceae transformada, tejido
y productos de la misma de la invención se pueden usar para la
producción de varios productos químicos y biológicos tal como
proteínas y polipéptidos codificados por el ADN transformante y
también se puede usar para preparar varias enzimas capaces de
producir varios productos químicos tal como hidratos de carbono,
lípidos, alcaloides, pigmentos, vitaminas, etc.
La presente invención también concierne a un
método de producción de un producto de interés, por ejemplo
productos químicos o biológicos tal como proteínas, polipéptidos,
hidratos de carbono, lípidos, alcaloides, pigmentos, vitaminas, y
otros, en donde una Lemnaceae transformada según la invención
se hace crecer en un medio de cultivo apropiado, para producir el
producto de interés. El producto de interés puede ser además aislado
y purificado, total o parcialmente, para un uso adicional, para
servir como un aditivo de alimentos, un aditivo de cosméticos, una
vacuna, agente terapéutico, un biocatalizador para la conversión
enzimática de productos químicos, etc. De forma alternativa, el
producto de interés se puede usar en su forma cruda, sin aislar como
está presente en la planta Lemnaceae crecida, usando la
planta misma sin procesamiento o con procesamiento parcial para los
fines anteriores.
La presente invención también se ocupa, mediante
otro de sus aspectos, de un producto de interés que es un producto
químico o biológico tal como proteínas, polipéptidos, hidratos de
carbono, lípidos, alcaloides, pigmentos, vitaminas, y otros,
obtenidos de las plantas Lemnaceae anteriores transformadas
establemente.
La planta o tejido transformados también puede
expresar caracteres deseados que no se caracterizan en la producción
de nuevos productos, ejemplos de tales caracteres son: resistencia
a antibióticos, por ejemplo resistencia a kanamicina, conferida por
el gen npt II; o resistencia a herbicidas, por ejemplo
resistencia al herbicida BASTA 20 (glufosinato de amonio, Hoechst,
Alemania).
Las plantas o tejidos de Lemnaceae
transferidas también pueden expresar más de un gen exógeno, por
ejemplo, la planta se puede transformar para ser resistente a
varios herbicidas y/o antibióticos a la vez.
Según la presente invención, se encontró que la
transformación estable de plantas o tejidos de Lemnaceae se
puede obtener mediante el uso de células de Agrobacterium que
llevan dicho ADN transformante. De esta manera, según un de sus
aspectos adicionales, la presente invención concierne a un método
para la transformación estable de plantas o tejidos de
Lemnaceae que comprende incubar las plantas o tejido vegetal
de Lemnaceae con células de Agrobacterium que llevan
dicho ADN transformante, por lo cual las células en dicho tejido
vegetal se vuelven establemente transformadas mediante dicho ADN
transformante.
Se determinó además que existen cepas de
Agrobacterium que se pueden dirigir a y transformar
específicamente el tejido meristemático en Lemnaceae, por
ejemplo cepas de A. tumefaciens EHA105, EHA101 y GVE3103, o
cepas de Agrobacterium que se dirigen a y transforman
específicamente el área herida de la planta tal como las cepas de
A. tumefaciens LBA4404 y C58. Por lo tanto el método de la
invención concierne preferiblemente a la incubación de plantas
Lemnaceae con Agrobacterium de las cepas EHA105,
EHA101 y GVE3103 capaces de transformar el tejido meristemático o
cepas de Agrobacterium LBA4404 y C58 capaces de transformar
tejido herido.
Se encontró además que el uso de la filtración a
vacío durante la incubación de las plantas Lemnaceae con las
células de Agrobacterium aumenta la eficacia de la
transformación. De esta manera, mediante una forma de realización
preferida, el método de transformación incluye incubación de plantas
o tejidos de Lemnaceae con células de Agrobacterium
mientras se aplica infiltración a vacío.
Otra forma de realización del método de la
invención se basa en el descubrimiento de era posible aumentar la
eficacia de la transformación de Lemnaceae por
Agrobacterium exponiendo la zona merismática de la fronda
madre. Tal exposición se puede llevar a cabo de forma física, es
decir, eliminado las frondas hijas para exponer la zona
merismática, por ejemplo mediante un movimiento de tirón usando
pinzas, o mediante cualquier otro medio mecánico. De forma
alternativa, dicha exposición se puede llevar a cabo aplicando una
preparación química o una preparación hormonal capaz de eliminar
específicamente la fronda hija sin dañar la zona merismática
subyacente.
Todavía otro aspecto de la presente invención
concierne a un método nuevo para la transformación de plantas
usando células transformantes de Agrobacterium, que es
particularmente adecuado para la transformación en masa de tejido
vegetal. Según este método, las plantas se cortan en partículas
pequeñas que se incuban después con las células transformantes de
Agrobacterium, preferiblemente en presencia de un medio
potenciador que se describirá más adelante. El tamaño de las
partículas debe ser tal que al menos algunas de ellas contengan
tejido meristemático no dañado que sea capaz de regenerarse a
plantas enteras. Para alcanzar esta característica, las partículas
deben ser preferiblemente de un tamaño medio de más de 150 \mum de
diámetro, más preferiblemente en un intervalo de tamaño de
alrededor de 150 \mum - 750 \mum. Cortar el tejido vegetal en
tales partículas pequeñas maximiza el área de contacto entre el
tejido meristemático y Agrobacterium. Además, las células de
Agrobacterium infectan más fácilmente el tejido vegetal
dañado y al cotar la planta, las células de Agrobacterium están
expuestas a grandes regiones de tejido vegetal dañado. El resultado
total de estos factores es un marcado aumento en el rendimiento de
la transformación.
Otro método de transformación que se puede usar
en la realización de la presente invención, es la microinyección
que se conoce por si mismo. Según este método, las células de
Agrobacterium, preferiblemente junto con el medio
potenciador de la invención que se describirá más adelante, se
microinyectan a una zona de transformación deseada de la planta,
típicamente en el meristemo de la planta. Una ventaja principal de
la microinyección, es que permite dirigir específicamente las
células transformantes de Agrobacterium al tejido deseado,
por ejemplo solo al meristemo de las raíces, solo al meristemo de
las hojas, etc., de modo que el resultado es una planta que tiene
ADN exógeno solo en un tejido específico, por ejemplo, las raíces y
no en otros tejidos.
Otra forma de realización del método de
transformación de Lemnaceae se basa en el sorprendente
descubrimiento de que la transformación se puede llevar a cabo
in planta, esto es, usando la planta entera y no hay
necesidad de cortar la planta en partículas pequeñas, o de usar
cultivo de tejido y después regeneración in vivo para fines
de transformación. Se puede usar una planta completa para la
transformación siempre que las células de Agrobacterium se
dirijan al meristemo bien por microinyección directa como se ha
descrito anteriormente bien mediante la utilización de cepas de
Agrobacterium que se dirigen preferiblemente al meristemo
tales como las cepas de A. tumefaciens EHA105, EHA101 y
GVE3103. Así la presente invención proporciona un método para la
transformación in planta de Lemnaceae dirigiendo las
células de Agrobacterium que llevan el ADN transformante al
meristemo de la planta a ser
transformada.
transformada.
Según otra forma de realización de la invención,
se encontró que es posible aumentar la eficacia de la transformación
de plantas por células de Agrobacterium incubando las
células de Agrobacterium con el tejido vegetal a ser
transformado en presencia de un medio potenciador que es capaz de
aumentar la virulencia de Agrobacterium. Este aumento en
eficacia debido al uso del potenciador no está limitado a la
transformación de plantas Lemnaceae sino que también se
puede aplicar a plantas en general incluyendo plantas
monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas.
Agrobacterium se usa ya de forma
rutinaria para la transformación de plantas dicotiledóneas. Sin
embargo, según esta forma de realización de la invención, la
eficacia de transformación de plantas dicotiledóneas se aumenta
mediante incubación del medio potenciador de Agrobacterium.
Con respecto a las plantas monocotiledóneas, aunque ha habido
algunos informes de algunas transformaciones con éxito de tales
plantas con Agrobacterium, estos informes han sido
esporádicos y normalmente mostraban rendimientos de transformación
insatisfactorios. Aumentar la virulencia de Agrobacterium
mediante el medio potenciador, según dicha forma de realización,
permite por primera vez, la transformación de muchas especies de
plantas monocotiledóneas que no habían sido previamente
transformadas, incluidas las pertenecientes al género
Lemnaceae, así como un aumento en el rendimiento de
transformación de plantas que ya se sabía que se transformaban,
aunque con un rendimiento bajo mediante el uso de
Agrobacterium.
Las plantas transformadas establemente
producidas utilizando el medio potenciador según se ha descrito
anteriormente, también forman un aspecto de la invención.
El medio potenciador que aumenta la virulencia
de las células de Agrobacterium, comprende tejido vegetal
cultivado a un pH por debajo de alrededor de 5,2. Por ejemplo, el
medio potenciador puede comprender una suspensión de células
frescas de plantas dicotiledóneas, a una concentración del
1-10% (peso/volumen). La suspensión de células
frescas puede ser, por ejemplo, de plantas dicotiledóneas de la
familia Solanaceae.
Preferiblemente, el medio potenciador también
comprende cafeína a una concentración de 100-500 mg
por litro de medio.
Un ejemplo específico de un medio potenciador es
uno que comprende medio basal MS a un pH de alrededor de
3,5-4,2, del 1-10% (peso/volumen) de
una suspensión de células frescas de Nicotiana tabacum, y
alrededor de 100-500 mg por litro de medio de
cafeína.
Mediante otra alternativa, el medio potenciador
de la invención es un medio de crecimiento de plantas que comprende
extractos vegetales de Lemnaceae. Tal medio se puede producir
extrayendo plantas Lemnaceae en un medio adecuado tal como
un tampón fosfato.
Ambos tipos de medios potenciadores, teniendo
una o ambas de las especificaciones anteriores para su uso en
aumentar la eficacia de transformación de células de
Agrobacterium usadas como vectores de transformación,
también forman otro aspecto de la invención.
Mediante todavía otra forma de realización, la
presente invención concierne a un método para mantener callos
morfogenéticos de Lemnaceae durante períodos de tiempo
largos, usando niveles bajos de sacarosa en el medio de cultivo,
por ejemplo, del 0,1 al 1,5% de sacarosa. Se encontró que es posible
aumentar significativamente el período de mantenimiento de los
callos en un estado viable, por ejemplo, de 2 semanas a más de 3
meses disminuyendo el nivel de sacarosa en el medio de
crecimiento.
Otro aspecto de la invención concierne a un
método para la producción de callos de Lemnaceae muy
regenerativos, y además un método para la regeneración rápida y
eficaz de plantas a partir de callos, utilizando el efecto
combinado de minerales B5, niveles bajos de sacarosa (del 0,1 al
1,5% de sacarosa) y fitohormonas en el medio de crecimiento.
La presente invención se ilustrará ahora en
referencia a algunos ejemplos no limitantes.
La Figura 1 muestra una imagen esquemática del
plásmido Ti pME504.
A continuación, la invención se ilustrará a
veces con referencias específicas a la transformación de plantas,
tejidos o callos de Lemnaceae, siendo dadas tales referencias
meramente como un ejemplo y se debe entender que la invención no
está limitada a ellas.
Las plantas Lemnaceae establemente
transformadas contienen genes exógenos que confieren caracteres
útiles tal como: mejora de la calidad nutricional de la planta o
partes de la planta; expresión de novo de productos químicos
y biológicos deseados, por ejemplo enzimas; factores de crecimiento,
hormonas tal como insulina; anticuerpos, antioxidantes; defensinas;
proantocianidinas; citoquinas y otros polipéptidos y proteínas
biológicamente activos; sobreexpresión de productos ya expresados
por estas plantas; etc. Otros productos que se pueden obtener de
las plantas Lemnaceae transformadas son enzimas para
aplicaciones industriales, tal como la superóxido dismutasa (SOD),
\alpha-amilasa, invertasa, sacarosa fosfato
sintasa y similares, y productos químicos tales como pigmentos
alimentarios, por ejemplo \beta-caroteno,
antocianina, etc. El tipo de producto que se puede obtener de las
plantas transformadas depende obviamente de la naturaleza de dicho
ADN transformante. Mediante otra aplicación los genes pueden ser
aquellos que comunican resistencia a enfermedades.
Los genes que comunican resistencia a
enfermedades son conocidos en la materia, incluyendo péptidos
líticos, defensinas, genes de la oxalato oxidasa para tolerancia a
esclerotinia o quitinasas (US 5597946, US 4940840, US 5290687, US
5374540, US 5670706, US 53996801, US 5695939, todas las
publicaciones incorporadas aquí por referencia).
El ADN transformante que se introduce en las
células vegetales, incluye, como apreciará el experto en la materia,
secuencias codificantes que codifican para el carácter deseado así
como secuencias de control que controlan la expresión de la
secuencia codificante, por ejemplo, promotores, potenciadores,
terminadores, intrones y similares,
pre-pro-péptidos o péptidos de
tránsito, produciendo los últimos la expresión de dicho carácter
deseado en la región diana específica de la célula vegetal.
Los promotores que controlan la expresión de los
genes en células vegetales son bien conocidos en el campo de la
biotecnología de plantas, incluyendo cualquier secuencia de promotor
de un gen que se expresa de forma natural en plantas o células
vegetales, de origen vegetal, bacteriano o vírico. Los promotores
adecuados se divulgan en Weising et al., (1988), Annual
Rev. Genet., 22: 241), el objeto de la cual se incorpora
aquí por referencia. A continuación se da una lista representativa
parcial de promotores adecuados para su uso en el contexto de la
invención: secuencias reguladoras del ADN-T de A.
tumefaciens, incluyendo manopina sintasa, nopalina sintasa y
octopina sintasa; secuencias reguladoras de origen vegetal,
incluyendo el promotor de la alcohol deshidrogenasa de maíz,
promotores inducibles por luz tal como los promotores de la
subunidad pequeña de la
ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (SSU RuBisCo) de
genes de varias especies y los promotores de los principales genes
de unión a clorofila a/b, promotores de histonas (EP 507 698),
promotores de actina (US 5641876), promotores de ubiquitina 1 de
maíz (Christenses et al., (1996)), secuencias reguladoras de
orígenes víricos, tal como los promotores 19S o 35S del virus del
mosaico de la coliflor (US 5352605; US 5530196); promotores
regulados a través del desarrollo tal como los promotores waxy,
zeina o bronce de maíz; así como promotores sintéticos u otros
naturales que son bien inducibles o constitutivos, incluyendo
aquellos promotores que muestran expresión específica de órgano o
expresión en un estado de desarrollo específico de la planta, como
el promotor de la napina (EP 255 378) o el promotor de la
alfa-tubulina (YS 5635618); estando todas las
publicaciones incorporadas aquí por referencia.
Como una forma de realización preferida, el
promotor se selecciona del grupo que consiste en los promotores de
la subunidad pequeña de la
ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (SSU RuBisCo) de
genes de varias especies, los promotores de histona, los promotores
de actina, los promotores de la ubiquitina 1 de maíz y los
promotores 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S).
Según la presente invención, es posible usar con
el promotor, otros elementos reguladores normalmente localizados
entre el promotor y la secuencia codificante del carácter deseado,
elementos que inducen la expresión de dicho carácter deseado en un
región diana de la planta o célula vegetal específica, por ejemplo,
los cloroplastos. Los ejemplos son secuencias codificantes para
péptidos de tránsito, secuencias individuales o múltiples
combinadas, las últimas pueden estar separadas mediante secuencias
intermedias. Tales secuencias múltiples de péptidos de transito,
tal como secuencias dobles de péptidos de transito, pueden
comprender, en la dirección de transcripción (de 5' a 3'): un
péptido de transito de un gen vegetal que codifica una enzima
localizada en un plasto, una secuencia parcial de la parte
N-terminal madura de un gen vegetal que codifica una
enzima localizada en un plasto y después un segundo péptido de
transito de un gen vegetal que codifica una enzima localizada en un
plasto. Un ejemplo es el péptido de transito optimizado divulgado en
US 5510471 ó US 5633448 (incorporados aquí por referencia). Las
enzimas localizadas en plastos pueden ser de cualquier origen, por
ejemplo la subunidad pequeña (SSU) de la ribulosa, el gen de la
1,5-difosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCo), o el
gen EPSPS vegetal. El péptido señal del gen RP-1a
del tabaco descrito en Cornelissen et al., es otro ejemplo de
péptido de transito.
Otra región de control puede ser un terminador o
una señal de poliadenilación no traducida en el extremo 3' de la
secuencia codificante que puede ser de cualquier origen, por ejemplo
bacteriano, tal como el gen de la nopalina sintasa de
Agrobacterium tumefaciens, o de origen vegetal, tal como el
terminador del gen que codifica la SSU RuBisCo de maíz o girasol, o
el terminador de un gen de histona vegetal como se divulga en EP
633317, incorporada aquí por referencia.
Además, el ADN transformante puede comprender
también un gen marcador de selección, tal como un gen que codifica
para resistencia a un herbicida, resistencia a antibióticos, o
similares. Además o como alternativa, el ADN transformante puede
comprender además un gen indicador, tal como un gen que codifica
para un marcador de color. Un gen de marcador de selección o un gen
indicador facilitan la identificación y selección del tejido
transformado y permite su separación del tejido no
transformado.
Ejemplos específicos de genes de marcadores de
selección son la secuencia codificante de la higromicina
fosfotransferasa (HPT), que puede derivar de E. coli y que
confiere resistencia al antibiótico higromicina B; el gen de la
aminoglicosidasa fosfo-transferasa del transposón
Tn5 (AphII) que codifica resistencia a los antibióticos kanamicina,
neomicina y G418. Los genes que codifican proteínas que confieren
tolerancia a herbicidas son conocidos en la técnica, incluyendo
genes que comunican tolerancia a herbicidas de oxinilo (US 4810648 y
US 5559024), los genes que comunican tolerancia a los herbicidas
glifosato e inhibidor de EPSPS (US 4535060, US 4769061, US 5094945,
US 4940835, US 5188642, US 4971908, US 5145783, US 5312910, US
5310667, US 5633435, US 5627061, US 5554798, US 5633448, WO
96/04103, todas las publicaciones incorporadas aquí por referencia),
genes que comunican tolerancia a glufosinato (EP 242 236,
incorporada aquí por referencia), así como los genes que comunican
tolerancia los inhibidores de HPPD (WO 96/38567 y WO 98/02562, ambas
publicaciones incorporadas aquí por referencia). Aquellos genes de
marcadores de selección que confieren resistencia o tolerancia a
estos compuestos fitotóxicos también son de utilidad comercial en
las plantas transformadas resultantes.
Los genes indicadores se pueden usar para
identificar las células, tejidos o callos transformados y para
evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. Los genes
indicadores que codifican proteínas marcadoras de selección
fácilmente ensayables son bien conocidos en la técnica. En general,
un gen indicador es un gen que no está presente en, o es expresado
por, el organismo o tejido receptor y que codifica una proteína cuya
expresión se manifiesta mediante alguna propiedad fácilmente
detectable, por ejemplo, cambio fenotípico o actividad enzimática.
Ejemplos de tales genes son el gen de la cloranfenicol acetil
transferasa (CAT) de Tn9 de E. coli, el gen de la
\beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de
E. coli, la proteína fluorescente verde (GFP) obtenida de
A. Victoria y el gen de la luciferasa de la luciérnaga
Photinus pyralis. La expresión del gen indicador se ensaya a
un tiempo adecuado después de que el ADN se haya introducido en las
células receptoras. Un ejemplo de tal ensayo supone el uso del gen
de la \beta-glucuronidasa (GUS) de E. coli
(Jefferson et al., (1987)). Las células vegetales
transformadas y que expresan este gen se teñirán de azul tras la
exposición al sustrato
5-bromo-4-cloro-idolil-\beta-D-glucuronido
(X-GLUC), en el medio extracelular.
Según el método de la invención,
Agrobacterium, por ejemplo Agrobacterium tumefaciens,
se manipula de modo que contenga el ADN transformante que se va
insertar en la planta diana, por ejemplo la planta Lemnaceae
diana, manipulación que se realiza por medios conocidos por si
mismos. La planta entera o las células, tejidos o callos de la
planta se ponen entonces en contacto con las células de
Agrobacterium y se incuban juntos. Los tejidos de la planta
se seleccionan después para los que contienen el ADN transformante,
por ejemplo, ensayando la expresión fenotípica del gen marcador,
por ejemplo resistencia a herbicida o antibióticos, o para la
expresión del gen indicador, por ejemplo, un producto coloreado.
También es posible verificar la presencia del ADN transformante
introducido mediante un ensayo de ADN tal como mediante PCR.
La invención se ilustrará ahora adicionalmente
en los siguientes ejemplos.
Para la microinyección en la zona del meristemo,
se introdujo un inóculo axénico (aprox. 10 plantas) de Spirodela
oligorrhiza (aquí denominada Spirodela punctata) Hegelm.
o Lemna gibba Hurfeish en una botella de 250 ml que contenía
50 ml de media MS que tenía los ingredientes según se detallan en la
Tabla 1 posteriormente.
Los cultivos se hicieron crecer a 26ºC bajo luz
fluorescente continua (30 \muE m^{2}s^{-1}) en una atmósfera
enriquecida con CO_{2} al 3-5%.
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En condiciones estériles, se colocaron 2,5 g de
plantas Lemnaceae en una placa de Petri vacía de 9 cm. Se
preparó una suspensión de 10 ml de A. tumefaciens de
5-8x10^{8}/ml, en medio basal MS (Tabla 1) según
se describe en (IV) a continuación, y se añadió a la placa. Las
plantas se cocultivaron con la suspensión de A. tumefaciens
durante 20-40 minutos a temperatura ambiente. La
suspensión se eliminó de la placa y las plantas se lavaron 3 veces
con medio basal MS (Tabla 1) fresco. Las plantas se transfirieron a
un recipiente (15x20x12 cm) que contenía 1,5 l de medio SP (Tabla
2) a 26ºC bajo luz fluorescente continua (30 \muE m^{2}s^{-1})
en una atmósfera enriquecida con CO_{2} al
3-5%.
Se recogió una única colonia de Agrobacterium
tumefaciens, mantenido en placas de LB suplementadas con
antibióticos (medio LB supl.), (Tabla 3, a continuación), y se hizo
crecer durante la noche (28ºC, 250 rpm) en 10 ml de medio 2YT
suplementado con antibióticos (medio 2YT supl.) (Tabla 4, más
adelante). El cultivo crecido se transfirió a 50 ml de medio 2YT
supl. y se hizo crecer además durante 12 horas adicionales (28ºC,
250 rpm). Antes de la transformación, el cultivo de A.
tumefaciens se centrifugó (3200 x g, 5 minutos), se eliminó el
sobrenadante y las bacterias se resuspendieron en 10 ml de medio MS
(Tabla 1). Antes del cocultivo con las plantas Lemnaceae, la
concentración de bacterias se ajustó a 5-8x10^{8}
células/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Preparación de las plantas
Lemnaceae - Se cultivaron las plantas Lemnaceae
axénicas en recipientes (8,5 cm de diámetro por 11 cm de altura)
que contenían 50 ml de medio MS (Tabla 1) a 25ºC con bombillas
fluorescentes blancas frías (60 \muE m^{-2}s^{-1}). Todos los
tratamientos se realizaron en una cabina estéril de flujo laminar a
temperatura ambiente.
2. Preparación del vector de
transformación - Se utilizó Agrobacterium tumefaciens que
contenía un plásmido p35S GUS INT (Vancanneyt et al., 1990).
Este plásmido lleva el gen NPTII que codifica resistencia a
kanamicina y la secuencia codificante del gen indicador uidA
de la \beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson, 1987)
interrumpido por el intrón IV2 (Eches et al., 1986). El uso
de este vector permitió teñir para la expresión de GUS
inmediatamente después de la transformación y, al mismo tiempo,
evitó fondo positivo de GUS derivado de Agrobacterium. Para
los experimentos de transformación, se cogió una única colonia y se
resuspendió en medio 2YT supl., los ingredientes del cual se
detallan en la siguiente tabla 4:
Las bacterias se cultivaron durante 16 horas en
un agitador giratorio (250 rpm) a 28ºC. Antes de cocultivar las
bacterias y las plantas, el cultivo de bacterias se diluyó con medio
MS (Tabla 1) o medio potenciador (Tabla 5, a continuación) hasta
una densidad óptica a 550 nm de 0,6 y se llevó a un pH de 4 con HCl.
Esto produjo una preparación de Agrobacterium adecuada para
la transformación de Lemnaceae.
3. Microinyección - Las plantas
Lemnaceae se transfirieron a medio MS llevado a pH 4, o a
medio potenciador de la invención que tenía los ingredientes como
se detallan en la siguiente Tabla 5:
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Las plantas se microinyectaron bajo un
microscopio de disección usando una jeringuilla estéril desechable
de 1 ml con una aguja G-27, y llenada con una
preparación de Agrobacterium adecuada para la transformación
de Lemnaceae. Las inyecciones se dirigieron hacia las zonas
meristemáticas de las plantas para poner las bacterias en contacto
con los meristemos en crecimiento. En cada inyección, se inyectaron
alrededor de 20 \mul dentro de la zona meristemática y cada zona
se inyectó tres veces.
4. Cocultivo - Las plantas Lemna o
Spirodela se coincubaron con el Agrobacterium adecuado
preparado en medio MS (Tabla 1) llevado a pH 4, o en el medio
potenciador de la invención (Tabla 5), durante 48 horas a 25ºC bajo
bombillas fluorescentes blancas frías (30 \muE m^{-2}s^{-1}).
Después de esto, las plantas se lavaron 3 veces con agua destilada
estéril a temperatura ambiente y se cultivaron en medio MS (Tabla 1)
suplementado con 400 mg/l de claforan.
En un tubo Eppendorf de 1,8 ml, se disolvieron 5
mg de x-gluc (Duchefa Biochemie BV) en 150 \mul de
dimetil-formamida. A continuación se añadió la
siguiente solución de tinción: 10 ml de Tris 100 mM pH 7,0; 15
\mul de ferrocianuro 500 mM (solución de partida mantenida
congelada); 15 \mul de ferrocianuro 500 mM (solución de partida
mantenida congelada) y 100 \mul de Triton X-100
al 10%. Las plantas se transfirieron a una placa de Petri de 9 cm y
se añadieron 10 ml de solución de tinción. Los tubos se incubaron
durante la noche a 37ºC en la oscuridad. Después se eliminó la
solución de tinción y se enjuagó con agua destilada. Las plantas
positivas para GUS se observaron con un microscopio binocular.
Las plantas de Spirodela punctata se
transfirieron a medio SP (Tabla 2) durante 5 días a 26ºC bajo luz
fluorescente continua (30 \muE m^{-2}s^{-1}). Las plantas se
colocaron bajo un microscopio binocular, iluminado desde abajo, y
las frondas hijas en crecimiento se eliminaron, mediante un
movimiento de tirón usando unas pinzas. Para la inducción de callo,
las frondas madre se hicieron crecer en medio B-5
(Tabla 6, a continuación) suplementado con sacarosa al 1,0%, BA 2
mg/l y Dicamba 50 mg/l. Después de crecer durante 3 semanas en este
medio, los callos se transfirieron a medio B-5
suplementado con 2IP 2 mg/l y 2,4-D 10 mg/l. El
mantenimiento a largo plazo de los callos se alcanzó mediante
transferencia periódica cada 4 semanas a medio B-5
fresco suplementado con sacarosa al 1,0%, 2IP 2 mg/ml y
2,4-D 10 mg/ml.
Los callos de Spirodela se mantuvieron en
medio B-5 (Tabla 6 a continuación) suplementado con
sacarosa al 1,0%, 2IP 3 mg/ml y 2,4-D 10 mg/ml.
Para la regeneración, los callos se transfirieron a medio
B-5 suplementado con sacarosa al 1,0% y 2IP 2
mg/ml. Las plantas de S. punctata totalmente regeneradas se
obtuvieron de forma eficaz en 1-2 semanas. Los
callos de Spirodela y las plantas regeneradas, se hicieron
crecer a 26ºC bajo luz fluorescente continua (30 \muE
m^{-2}s^{-1}).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
1. Sincronización del crecimiento de
Spirodela y Lemna mediante exposición de
meristemos - Todos los materiales se esterilizaron y todos los
procedimientos se llevaron a cabo en condiciones asépticas. Las
plantas (10 g) se recogieron en una cabina estéril con flujo
laminar vertiendo el contenido de un recipiente de cultivo a través
de un tamiz de acero inoxidable estéril de malla 10 (tamaño de poro
1,7 mm). Las plantas de Spirodela o Lemna se
transfirieron desde la parte superior del tamiz con una cuchara
estéril a un homogenizador estéril de 1 l de capacidad, modificado
para contener 6 cuchillas colocadas en tres planos diferentes
(Blumenthal et al., 1993). El homogenizador se llenó con 250
ml de agua destilada, esterilizada por filtración y se activó
durante 4 segundos a 17000 rpm. Las plantas parcialmente
homogenizadas se vertieron de forma aséptica del homogenizador a
través de un tamiz Nitex esterilizado de malla 20 (tamaño de poro
800 \mu) y se recogieron en un tamiz Nitex esterilizado de malla
42 (tamaño de poro 350 \mu). Posteriormente, se dirigió un chorro
de agua destilada esterilizada por filtración (2 atm., 10 litro/min)
encima del tamiz Nitex de malla 20 para forzar a todas las
partículas de explantes de tamaño menor de 800 \mum a pasar a
través, produciendo una población de un tamaño de partícula de
350-750 \mum, Las partículas de explantes mayores
de 800 \mum se volvieron a transferir al homogenizador con una
cuchara estéril, el homogenizador se activó durante 3 segundos a
17000 rpm, y todos los pasos de tamizado y lavado se repitieron como
antes. La población combinada de tamaño de 350-750
\mum, recogida en un tamiz Nitex esterilizado de malla 42, se
sometió a un lavado final con chorro de agua. Las partículas de
explantes tamizadas de 350-750 \mum (5 g) se
recogieron mediante una cuchara estéril y se espaciaron en una
placa de Petri estéril de 14 cm. A lo largo de este proceso, todos
los residuos se dirigieron mediante fuerza gravitacional a un
envase de plástico de 30 litros situado debajo de la cabina de flujo
laminar.
2. Cocultivo seguido por un período de
recuperación - Todos los materiales se esterilizaron y todos los
procedimientos se llevaron a cabo en condiciones asépticas. Las
partículas de explantes tamizadas de 350-750 \mum
de Spirodela o Lemna, en la placa Petri de 14 cm, se
resuspendieron en 15 ml de medio MS (Tabla 1) llevado a pH 4, y
después se mezclaron con 15 ml de Agrobacterium previamente
cultivado en medio 2YT supl. (Tabla 4) durante 24 horas a 25ºC en
un agitador rotatorio a 250 rpm. La mezcla
explante-bacteria se cocultivó durante 1 hora a
25ºC y 10 \muE m^{-2}s^{-1}. Después de esto, la mezcla se
transfirió mediante una cuchara a un tamiz Nitex esterilizado de
malla 100 (tamaño de poro 150 \mu). Las partículas excluidas por
el tamiz se lavaron con 5 ml de medio MS (Tabla 1) llevado a pH 4,
y se transfirieron a un recipiente de cultivo de 3 l de boca ancha
que contenía 500 ml del mismo medio. El cocultivo continuó durante
48 horas a 25ºC bajo luz fluorescente continua (30 \muE
m^{-2}s^{-1}). Al final de este período, la mezcla se tamizó a
través de un tamiz Nitex esterilizado de malla 100 (tamaño de poro
150 \mu), seguido de tres aclarados de 200 ml con agua destilada.
Las partículas de explantes asociadas con bacterias se transfirieron
mediante una cuchara a un recipiente de cultivo de 3 l de boca
ancha que contenía 500 ml de medio MS (Tabla 1) suplementado con
claforan 400 mg/l y se cultivaron durante 5 días a 25ºC y luz 30
\muE m^{-2}s^{-1}. Los explantes se tamizaron entonces como
antes, seguido mediante separación del material flotante (la mayoría
del cual estaba vivo y en proliferación) de las partículas
hundidas, no vitales. Esto se alcanzó echando el material de
explantes junto con agua destilada, en una probeta graduada de 200
ml y recogiendo el material flotante con una cuchara coladora. Los
explantes se cultivaron en botellas Erlenmeyer de 1 litro que
contenían 300 ml de medio SP (Tabla 2) durante 3 días.
Se usaron selección por NPT II y tinción de GUS
para determinar si las células de los tejidos vegetales o callos
tratados estaban transformadas, es decir, que contenían el ADN
transformante. Como vector de expresión, se usó un ADN que
comprendí el promotor 35S del caMV seguido por la secuencia
codificante de NPT II de E. coli, que confiere resistencia a
kanamicina. Se ensayó la herencia estable de los caracteres
transgénicos (resistencia a kanamicina y actividad GUS) en medio
permisivo mientras que el gen NPT II y sus productos se ensayaron
mediante PCR e inmunotransferencia, respectivamente.
Se transfirieron un gen indicador con marcador
de color (GUS) y un gen que confiere resistencia al antibiótico
kanamicina (NPT II) a plantas Lemnaceae (Lemna gibba
Hurfeish y Spirodela punctata) mediante transformación
mediada por Agrobacterium tumefaciens. Esto se alcanzó
después de preparar las plantas de forma adecuada y promover
activamente la transferencia de ADN al núcleo de la planta como se
ha especificado anteriormente.
El medio potenciador de la invención (Tabla 5)
aumentó marcadamente la virulencia de Agrobacterium contra
Lemnaceae. Aplicar Agrobacterium a plantas de
Lemna o Spirodela, mantenidas durante dos meses en
medio MS (Tabla 1), al tiempo que se omitía el medio acelerador
redujo drásticamente las frecuencias de transformación mediadas por
microinyección como se muestra en los resultados de los siguientes
experimentos:
Experimento 1.1
49 de 100 plantas de Lemna micoinyectadas
mantenidas en medio MS eran positivas para GUS cuando se usó el
medio potenciador de la invención, mientras que 3 de 100 fueron
positivas para GUS cuando el medio potenciador se omitió.
Experimento 1.2
47 de 100 plantas de Spirodela
micoinyectadas mantenidas en medio MS eran positivas para GUS cuando
se usó el medio potenciador de la invención, mientras que 2 de 100
fueron positivas para GUS cuando se omitió el medio
potenciador.
Los experimentos 1.1 y 1.2 prueban así que el
medio potenciador de la invención aumenta significativamente la
eficacia de transformación.
Experimento 1.3
34 de 100 plantas de Lemna micoinyectadas
mantenidas en medio MS eran positivas para GUS cuando el medio
potenciador de la invención se llevó a pH 4,0; 19 de 100 eran
positivas para GUS cuando el medio potenciador se llevó a pH 5,2; 9
de 100 eran positivas para GUS cuando el medio potenciador se llevó
a pH 7,5.
Experimento 1.4
31 de 100 plantas de Spirodela
micoinyectadas mantenidas en medio MS eran positivas para GUS cuando
el medio potenciador de la invención se llevó a pH 4,0; 13 de 100
eran positivas para GUS cuando el medio potenciador se llevó a pH
5,2; 5 de 100 eran positivas para GUS cuando el medio potenciador se
llevó a pH 7,5.
Estos resultados indican claramente que un pH
por debajo de alrededor de 5,2 aumenta la eficacia de
transformación.
Se encontró que la adición de cafeína, un agente
nuevo en protocolos de transformación, y células vivas de tabaco
(Aviv y Galun, 1984), fomentaban la transformación por
Agrobacterium, como se muestra en los siguientes
experimentos:
Experimento 1.5
44 de 100 plantas de Lemna micoinyectadas
mantenidas en medio MS eran positivas para GUS cuando el cocultivo
se llevó a cabo en medio MS llevado a pH 4,0, que contenía cafeína y
células vivas de tabaco; mientras que solo 33 de 100 fueron
positivas para GUS cuando se omitieron la cafeína y las células
vivas de tabaco.
Experimento 1.6
39 de 100 plantas de Spirodela
micoinyectadas mantenidas en medio MS eran positivas para GUS cuando
el cocultivo se llevó a cabo en medio MS llevado a pH 4,0, que
contenía cafeína y células vivas de tabaco; mientras que solo 31 de
100 fueron positivas para GUS cuando se omitieron la cafeína y las
células vivas de tabaco.
Los experimentos 1.5 y 1.6 indican de este medo
que la adición de cafeína y células vivas de tabaco al medio
potenciador de la invención aumenta la eficacia de
transformación.
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El proceso semiautomatizado de triturado de
Lemnaceae produjo una fracción purificada de partículas de
explantes de tamaño de 350-750 \mum, bien de
Lemna o de Spirodela, que representaban
aproximadamente el 50% del material total de partida. Entre las
partículas de de 350-750 \mum había partículas de
explantes que se vio que contenían zonas meristemáticas no dañadas,
a partir de las cuales las plantas nuevas crecieron vigorosamente.
Las partículas de explantes menores de de 150-350
\mum drásticamente redujeron el número de plantas que crecían de
forma activa. Los explantes que contenían meristemos se mantuvieron
verdes, flotaban y crecieron hasta la madurez. Todas las otras
partículas de explantes rápidamente se volvieron
amarillentas-marrones, con el tiempo decolorándose
del todo, y la mayoría se hundía al fondo del recipiente de cultivo.
La muerte en masa de las secciones de explantes no meristemáticos
no inhibía el desarrollo normal de las plantas nuevas, que se
desarrollaron a partir de las secciones de explantes que contenían
meristemos en plantas Lemnaceae maduras morfológicamente
indistinguibles de las plantas no trituradas, como se demuestra en
los siguientes experimentos:
Experimento 2.1
Cuarenta y ocho horas después del proceso de
triturado, 600-800 partículas de explantes de un
total de 80.000 dieron lugar a plantas de Spirodela verdes
diminutas. Las colonias incipientes contenía cada una
1-2 plantas no más largas de 1 mm. Seis después del
triturado, estas colonias consistían en 3 plantas, cada una de
2-3 mm de longitud, y 2-3 raíces
desarrolladas de nuevo (5-6 mm de longitud). Nueve
días después del triturado, las plantas alcanzaron un tamaño medio
de alrededor de 4-5 mm de longitud y una forma
comparable a la de la Spirodela control no triturada. En
esta fase, las colonias contenían 5-7 frondas y
5-6 raíces totalmente elongadas. Estas plantas se
subcultivaron adicionalmente durante al menos 5 generaciones. El
tiempo medio de duplicación de biomasa fue de 2 días y no era
distinguible del de las plantas control. No se observó variación
somaclonal.
Experimento 2.2
Cuarenta y ocho horas después del proceso de
triturado, 300-500 partículas de explantes de un
total de 80.000 dieron lugar a plantas de Lemna verdes
diminutas. Las colonias incipientes contenían cada una 1 planta no
más larga de 1 mm. Seis después del triturado, estas colonias
consistían en 2 plantas, cada una de 2-3 mm de
longitud, y 2 raíces desarrolladas de nuevo (1 mm de longitud).
Nueve días después del triturado, las plantas alcanzaron un tamaño
medio de alrededor de 7 mm de longitud y tenían una forma comparable
a la de la Lemna control no triturada. En esta fase, las
colonias contenían 4 plantas y 2-4 raíces. Estas
plantas se subcultivaron adicionalmente durante al menos 5
generaciones. El tiempo medio de duplicación de biomasa fue de 2
días y no era distinguible del de las plantas control. No se observó
variación somaclonal.
Tras la transformación con Agrobacterium
que tenía el gen indicador uidA de la
\beta-glucuronidasa (GUS), se cultivaron los
explantes durante 3-7 días y después se tiñeron para
la actividad de GUS. Los siguientes son los resultados de dos de
tales experimentos:
Experimento 3.1
Dieciséis horas después sumergir colonias de
Spirodela transformadas por Agrobacterium en una
mezcla de reacción de GUS (Jefferson, 1987), 120 de 600 colonias en
una repetición, y 400 de 800 colonias en otra, mostraron sectores
azules, indicando que el 20-50% de los explantes se
habían transformado. El tamaño de los sectores transformados varió
desde 0,01 a 1 mm^{2}. Las plantas controles no transformadas no
mostraron ninguna tinción de GUS. En 2 de las 600 y 16 de las 800
colonias (0,3-2%), las plantas de la generación hija
se tiñeron de azul sistémicamente. Esto indica que las zonas
meristemáticas a partir de las que se regeneran las plantas hijas,
se habían transformado. En algunas colonias, las plantas de la
generación madre se mantuvieron no teñidas mientras que se observó
tinción de GUS sistémica en algunas plantas de la generación hija.
Esto indica que la exposición de meristemo en masa de las plantas
de Spirodela puede llevar a transformación dirigida al
meristemo.
Experimento 3.2
Dieciséis horas después sumergir colonias de
Lemna transformadas por Agrobacterium en una mezcla de
reacción de GUS (Jefferson, 1987), 60 de 300 colonias en una
repetición, y 250 de 500 colonias en otra, mostraron sectores
azules, indicando que el 20-50% de los explantes se
habían transformado. El tamaño de los sectores transformados varió
desde 0,01 a 1 mm^{2}. Las plantas controles no transformadas no
mostraron ninguna tinción de GUS. En 1 de las 300 y 5 de las 500
colonias (0,3-1%), las plantas de la generación hija
se tiñeron de azul sistémicamente.
Para verificar la inserción e integración del
ADN que se transfiere de Agrobacterium, se extrajo el ADN
total de plantas de Lemna y Spirodela que se habían
seleccionado previamente por tinción positiva de GUS. El ADN se
amplificó en una reacción de PCR (alineamiento a 55ºC) con los
siguientes cebadores de las regiones codificantes del NPT II:
- 1.
- 5' GCACGAGGTTCTCCGGCCGCTTGGG 3';
- 2.
- 5' GAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGG 3'.
Estos cebadores producen un fragmento de 780 bp
dentro del gen NPT II. El producto de la reacción de PCR se sometió
a electroforesis en un gel de agarosa (0,8%) y se tiñó con bromuro
de etidio. Las plantas de Lemna y Spirodela positivas
para GUS mostraron la banda esperada del tamaño esperado para el
transgén NPT II. Los controles no transformados de plantas de
Lemna y Spirodela no contenían esta banda. La misma
banda en la misma posición de migración también era evidente en ADN
aislado del plásmido Ti de Agrobacterium, que se sometió a
electroforesis en el mismo gel como control positivo. Estos
resultados verificaron que Agrobacterium es capaz de
transformar genéticamente plantas de Lemna y
Spirodela.
En el 5% de la población transformada, la
expresión del gen GUS introducido se detectó solo en el sistema de
la raíz. En estos casos, la expresión de GUS se detectó en todo el
sistema de la raíz. Esto tiene importancia en casos donde en los
que es de interés expresar el gen introducido en solo una parte
definida de la planta tal como el tejido de la raíz.
Se mantuvieron plantas de Spirodela
punctata y Lemna gibba var. Hurfeish en medio SP (Tabla
2) en condiciones de crecimiento estándar (procedimiento II).
Usando el procedimiento estándar de transformación (procedimiento
III), se colcultivaron plantas intactas con 5 capas diferentes de
A. tumefaciens (EHA105 [Xiu-Qing Li et
al., 1992]; EHA101 [Hood et al., 1987]; GVE3103 [Deblaere
et al., 1985]; LBA4404 [Ooms et al., 1982]; y C58
[Van Larebeke et al., 1974]) llevando cada una el plásmido Ti
pME504 (mostrado en la figura 1). Este plásmido lleva: el gen
nptII, que confiere resistencia al antibiótico kanamicina,
bajo el control del promotor de la nopalina sintasa; el gen
bar, que confiere resistencia al herbicida BASTA (Thompson
et al., 1987), bajo el control del promotor
35S-CaMV; y el gen uidA interrumpido por un
intrón (Vancanneyt et al., 1990), que codifica por el
indicador GUS, también bajo el control del promotor
35S-CaMV. Se determinó la expresión de GUS
(procedimiento VI) contando puntos azules. Se determinó la
especificidad de tejido de las distintas cepas de A.
tumefaciens valorando la distribución de los puntos azules en
las plantas de Lemnaceae. Los datos se resumen en la Tabla
7, más adelante.
El método implicó herir las plantas de
Spirodela punctata y Lemna gibba Hurfeish, cocultivar
las plantas con 5x10^{8} bacteria ml^{-1}, infiltración a vacío
(30 mbar, 5-10 minutos) y cocultivo adicional
durante 4 horas. Se ensayaron las frondas para la expresión de GUS
10 días después del cocultivo.
Los resultados indican que la expresión de GUS
en S. punctata cocultivada con las cepas de A.
tumefaciens EHA105, EHA101 y GVE3103 se restringía
principalmente a las fronda hijas que surgían del tejido
meristemático, mientras que la expresión de GUS en S.
punctata cocultivada con las cepas de A. tumefaciens
LBA4404 y C58 se restringía principalmente a las áreas heridas de
la fronda madre.
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Se mantuvieron plantas de Spirodela
punctata y Lemna gibba Hurfeish en medio SP (Tabla 2) en
condiciones de crecimiento estándar (procedimiento II). Usando el
procedimiento estándar de transformación (procedimiento III), se
cocultivaron plantas intactas con 5 capas diferentes de A.
tumefaciens que lleva cada una el plásmido Ti pME504 (mostrado
en la figura 1). Se determinó la expresión de GUS contando puntos
azules. Se determinó la especificidad de tejido de las distintas
cepas de A. tumefaciens valorando la distribución de los
puntos azules en las plantas de Lemnaceae. La expresión de
GUS en S. punctata cocultivada con las cepas de A.
tumefaciens LBA4404 y C58 se restringía principalmente a las
áreas heridas de la fronda madre, mientras que la expresión de GUS
en S. punctata cocultivada con las cepas de A.
tumefaciens EHA105, EHA101 y GVE3103 se restringía
principalmente a las fronda hijas que surgían del tejido
meristemático como se muestra en la Tabla 7, anteriormente.
Se mantuvieron plantas de Spirodela
punctata y Lemna gibba Hurfeish en medio SP (Tabla 2) en
condiciones de crecimiento estándar (procedimiento II). Se
cocultivaron plantas intactas con la cepa de A. tumefaciens
EHA105 que lleva el plásmido Ti pME504 usando el procedimiento
estándar de transformación (procedimiento III) con y sin
infiltración a vacío (30 mbar, 5-10 minutos). La
eficacia de transformación se determinó puntuando la expresión de
GUS (puntos azules). Los datos se muestran en la Tabla 8, a
continuación.
El método implicó herir las plantas de
Spirodela punctata var. Helgm y Lemna gibba var.
Hurfeish, cocultivarlas con 5x10^{8} bacteria ml^{-1} (cepa de
A. tumefaciens EHA105 que lleva el plásmido Ti pME504) e
infiltración a vacío (30 mbar durante 5-10 minutos).
Las plantas control se hirieron y cocultivaron como antes pero sin
infiltración al vacío. Las plantas se ensayaron para la expresión de
GUS 10 días después del cocultivo.
Los datos muestran un aumento en la eficacia de
transformación del 61% para Spirodela y del 400% para
Lemna tras la infiltración a vacío.
\vskip1.000000\baselineskip
Para exponer parcialmente las zonas
meristemáticas de las frondas madre de Lemnaceae a
Agrobacterium, las plantas se situaron bajo un microscopio
binocular, iluminado desde abajo, y se eliminaron las frondas hijas
en crecimiento; por ejemplo, mediante un movimiento de tirón usando
unas pinzas. Este procedimiento no tuvo efecto en la viabilidad de
las frondas tratadas. Un experimento que implicaba 500 plantas de
Spirodela punctata, la mitad de las cuales tuvieron sus
zonas meristemáticas expuestas mediante eliminación de las frondas
hijas, produjo un aumento de la expresión de GUS en zonas
meristemáticas del 14% (no tratadas) hasta el 23% (zona
meristemática expuesta).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la eliminación de las frondas hijas de los
bolsillos meristemáticos de la fronda madre, la fronda madre se
seccionó longitudinalmente bajo el microscopio binocular para
exponer totalmente sus zonas meristemáticas. Se realizó un
experimento en el que las frondas hijas se eliminaron de 500 plantas
de Spirodela punctata. Tras esto, 250 de estas plantas
también se seccionaron longitudinalmente. La expresión de GUS se
determinó 10 días después del cocultivo con A. tumefaciens
EHA105 que lleva el plásmido Ti pME504. La expresión de GUS se
observó en el 33% de las plantas seccionadas longitudinalmente,
comparadas con el 25% en las no seccionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El método implicó el tratamiento de quinientas
Spirodela punctata como se ha descrito en el ejemplo 8. Para
todas las plantas, primero se eliminaron las frondas hija. Además,
la mitad de las frondas madre se seccionaron longitudinalmente y se
cocultivaron con 5x10^{8} bacteria ml^{-1} de la cepaEHA105 de
A. tumefaciens que lleva el plásmido Ti pME504. Las plantas
se infiltraron al vacío (30 mbar durante 5-10
minutos). Las plantas se ensayaron para la expresión de GUS 5, 10 y
15 días después del cocultivo y se registró su relación filial con
la fronda madre seccionada. Los resultados se muestran el la Tabla
9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo un aumento en la estabilidad de la
expresión de GUS transformado meristemáticamente de una generación
filial a la siguiente como es evidente de la Tabla 9.
Se mantuvieron plantas de Spirodela
punctata en medio SP (Tabla 2) en condiciones de crecimiento
estándar (procedimiento II). Usando el procedimiento estándar de
transformación (procedimiento III), se cocultivaron las plantas con
la cepa EHA105 de A. tumefaciens que lleva el plásmido Ti
pME504. Las plantas se hirieron o se dejaron intactas (no heridas).
Después de esto, se cocultivaron con A. tumefaciens en medio
SP y se suplementaron durante varios períodos de tiempo con un
extracto de plantas de Spirodela. Se determinó la eficacia
de la transformación valorando la expresión de GUS (puntos
azules).
El método implicó el mantenimiento de 500
Spirodela punctata tratadas como se ha descrito en el
procedimiento III. De estas 500 plantas, 250 se hirieron. Todas las
plantas se colcultivaron con 5x10^{8} bacteria ml^{-1} (cepa de
A. tumefaciens EHA105 que lleva el plásmido Ti pME504), y se
expusieron a un extracto de Spirodela. El extracto se
preparó mediante homogenización de 20 g de plantas de
Spirodela de un cultivo de una semana de edad en 50 ml de
tampón fosfato (pH 7,0). El homogenado se centrifugó (10 minutos a
10000 rpm) y el sobrenadante se esterilizó por filtración. El
extracto de Spirodela resultante se aplicó 4 horas durante el
cocultivo, o durante este período más los 10 días posteriores. Las
plantas controles no se expusieron al extracto. Todas las plantas
se ensayaron para la expresión de GUS 10 días después del
cocultivo.
Los datos resumidos en la Tabla 10 muestran que
la presencia del extracto de Spirodela aumentó la eficacia
de transformación de las plantas no heridas.
Todas las plantas se mantuvieron en medio SP
(Tabla 2) en condiciones estándar de crecimiento (procedimiento
II). Usando el procedimiento estándar de transformación
(procedimiento III), se cocultivaron las plantas con la cepa EHA105
de A. tumefaciens que lleva el plásmido Ti pME504. La Tabla
11 resume el porcentaje de plantas de las diferentes especies de
Lemnaceae que expresan GUS 10 días después del cocultivo. Se
determinó la expresión de GUS en las frondas hijas de la F_{1}
para tres géneros diferentes de Lemnaceae: (A)
Spirodela; (B) Lemna; y (C) Wolffia, todas
inoculadas con la cepa EHA105 de A. tumefaciens
(pME504).
El método implicó herir las plantas,
cocultivarlas con 5x10^{8} bacteria ml^{-1} (cepa de A.
tumefaciens EHA105 que lleva el plásmido Ti pME504),
infiltración a vacío (30 mbar durante 5-10 minutos)
y después cocultivo adicional durante 30 minutos. Las plantas se
ensayaron para la expresión de GUS (tinción azul) 10 días después
del cocultivo.
Los resultados demuestran la aplicabilidad
general del método de la invención para la transformación de
Lemnaceae.
Se colocaron plantas de Spirodela
punctata obtenidas mediante el procedimiento de transformación
estándar (procedimiento III) en medio SP (Tabla 2) que contenía
kanamicina a 2 \mug/ml. En cultivos controles no transformados,
las plantas nuevas emergente crecieron blancas en presencia del
antibiótico. Sin embargo, tras la transformación y el cultivo en
presencia de kanamicina (2 \mug/ml durante dos meses), tres de 500
(Experimento 1), y tres de 300 (Experimento 2) plantas que emergían
de nuevo fueron verdes y resistentes a los efectos decolorantes del
antibiótico. Esto indicaba que el gen NPTII estaba presente y
se expresaba en las plantas verdes, resistentes. Se evaluaron las
siguientes plantas: un clon resistente a kanamicina 10 generaciones
después del inicio del Experimento 2; una colonia sensible a
kanamicina (Kn-) con frondas hijas decoloradas, que no se
desarrolló más en presencia de kanamicina durante los dos meses del
experimento; un control no transformado que muestra una colonia con
frondas hijas decoloradas después de 7 días de exposición a
kanamicina 2 \mug/ml. La tinción de una muestra tomada del clon
resistente a kanamicina dos meses después del inicio del Experimento
2 mostró tinción azul de GUS en más del 80% de las frondas. Los
resultados se muestran en la Tabla 12.
El método implicó herir las plantas,
colcultivarlas con 5x10^{8} bacteria ml^{-1} (cepa EHA105 de
A. tumefaciens que lleva el plásmido Ti pME504) durante 30
minutos e infiltración a vacío (30 mbar durante
5-10 minutos). Las plantas de Spirodela
punctata transformadas se hicieron crecer en medio SP (Tabla 2)
suplementado con kanamicina a 2 \mug/ml durante 2 a 5 semanas. Se
ensayaron seis plantas verdes resistentes a kanamicina, y un
muestreo de las decoloradas, para la expresión de GUS.
Los datos resumidos en la Tabla 12 indican que
las plantas verdes resistentes al antibiótico estaban realmente
transformadas.
Se cocultivaron quinientas plantas de
Spirodela punctata 8717 con A. tumefaciens EHA105
(pME504), que lleva: el gen nptII que confiere resistencia
al antibiótico kanamicina; el gen bar que confiere
resistencia la herbicida BASTA; y el gen uid A (interrumpido
por un intrón (Vancanneyt et al., 1990) que codifica para el
marcador GUS. Las plantas cocultivadas se hicieron crecer en medio
SP (Tabla 2) suplementado con BASTA 2 \mug/ml durante 5 semanas.
Las plantas se transfirieron periódicamente a medio fresco
suplementado con BASTA cada 2 semanas. En estas condiciones, las
plantas control no pudieron crecer y con el tiempo se decoloraron
completamente después de 16 días. Treinta y cuatro de 500 plantas
cocultivadas con A. tumefaciens EHA105 (pME504) fueron
resistentes a los efectos decolorantes del herbicida. Esto indica
que el gen bar estaba presente y se expresaba en estas
plantas verdes, que crecían. Se evaluaron las siguientes plantas:
plantas verdes de un clon resistente a herbicida; una planta
sensible a BASTA, decolorada (BASTA-) que no fue capaz de
desarrollar frondas hijas de F_{1}; y un control (no transformado
controlado que muestra una planta decolorada. Las plantas se
evaluaron 16 días después del cocultivo. La tinción de una muestra
tomada del clon resistente a BASTA 25 días después del inicio del
experimento mostró tinción azul para GUS en más del 75% de las
frondas. Los datos se resumen en la Tabla 12. Los resultados indican
que las plantas verdes, resistentes a herbicida, seleccionadas
repetidamente en medio suplementado con BASTA fresco, estaban de
hecho transformadas.
Se mantuvieron plantas de Spirodela
punctata en medio SP (Tabla 2) en condiciones de crecimiento
estándar (procedimiento II). Usando el procedimiento estándar de
transformación (procedimiento III), se cocultivaron las plantas con
A. tumefaciens EHA105 (pME506) que lleva, el gen nptII
que confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el gen
bar que confiere resistencia la herbicida BASTA; y el gen
luc que codifica en indicador luciferasa de la luciérnaga
LUC. En paralelo, se cocultivaron otras plantas con A.
tumefaciens EHA105 (pME508) que lleva, el gen nptII que
confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el gen bar
que confiere resistencia la herbicida BASTA; y un gen que codifica
para la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea
victoria. La expresión de los genes indicadores fluorescentes en
las plantas de Spirodela se determinó (Millar et al.,
1992; Chiu et al., 1996) 10 días después del cocultivo. La
expresión de GFP se encontró en toda la fronda, cuando se observó
con un aumento de 200 veces.
Se cocultivaron plantas de S. punctata
con A. tumefaciens EHA105 (pME504) que lleva, el gen
nptII que confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el
gen bar que confiere resistencia la herbicida BASTA; y el
gen uid A (interrumpido por un intrón (Vancanneyt et
al., 1990) que codifica para el indicador GUS. Las plantas
transformadas se hicieron crecer en medio SP (Tabla 2) en presencia
de kanamicina 2 \mug/ml o BASTA 2 \mug/ml durante
2-5 semanas. Se ensayaron las plantas resistentes
verdes, así como una muestra de plantas decoloradas, para la
expresión de GUS. Los resultados, resumidos en la tabla 12,
demuestran una alta correlación entre las plantas verdes
resistentes a antibiótico o a herbicida, y las plantas que expresan
GUS. Esto demuestra la coexpresión de múltiples genes en
Lemnaceae transformadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos demostraron una alta frecuencia
de tinción de GUS de una población representativa de Spirodela
punctata 8717 transformada cuatro días después de la
transformación. La tasa de transformación para esta cepa usando el
procedimiento de transformación estándar (procedimiento III) es >
90%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantuvieron plantas de Spirodela punctata
8717 en medio SP (Tabla 2) en condiciones de crecimiento
estándar (procedimiento II). Usando el procedimiento estándar de
transformación (procedimiento III), se cocultivaron las plantas con
A. tumefaciens EHA105 (pME504) que lleva, el gen nptII
que confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el gen
bar que confiere resistencia la herbicida BASTA; y el gen
uidA (interrumpido por un intrón (Vancanneyt et al.,
1990) que codifica para el indicador GUS (Figura 1). La expresión
del gen indicador GUS en las plantas transformadas se determinó
periódicamente mediante muestreo de la población 4, 10 y 35 días
después del cocultivo. Ejemplos representativos muestran más de 7
generaciones sucesivas (unidas por sus estipes) de las plantas
transformadas que expresan GUS en todos sus tejidos. Esto indica
transformación estable, no quimérica de las plantas
Lemnaceae enteras durante varias generaciones y un período de
tiempo extendido.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas de S. punctata se
cocultivaron con A. tumefaciens GV3103 (pVCGUS) (Koncz et
al., 1989) que contiene una construcción de GUS (el gen
uidA interrumpido por un intrón) sin promotor. Se evaluaron
las plantas transformadas, que expresaban GUS siete días después del
cocultivo. La expresión de GUS sin promotor solo es posible si el
uidA estaba integrado en el cromosoma de la Lemnaceae
adyacentes a secuencias endógenas reguladoras de Lemnaceae.
Como resultado de la integración al azar del gen uidA, se
esperaría variabilidad en la expresión de GUS entre los diferentes
sucesos de transformación. Los resultados del experimento muestran
3 intensidades diferentes en la tinción azul de GUS, la más intensa
de las cuales es similar a la intensidad fuerte típica encontrada
en plantas transformadas bajo el promotor
35S-CaMV.
La Tabla 13 resume los resultados de más 12.000
plantas en 4 experimentos diferentes (cada uno con 3 cepas
diferentes de A. tumefaciens) que se valoraron para la
tinción de GUS 10 días después del cocultivo. Se cocultivaron
cuatro mil plantas con A. tumefaciens GV3103 que carecía de
vector binario (Control). Ninguna se tiñó de azul, indicando que no
había actividad GUS endógena. Se cocultivaron cuatro mil plantas con
A. tumefaciens GV3103 que lleva la construcción sin promotor
(pVCGUS). Hasta el 1,4% de las plantas se tiñó de azul, indicando
un nivel altamente significativo (frente al control) de integración
del gen uidA sin promotor en el cromosoma de la
Lemnaceae adyacente a secuencias endógenas reguladoras de
Lemnaceae. Se cocultivaron cuatro mil plantas con A.
tumefaciens GV3103 (pME504), que lleva el gen uidA bajo
el control del promotor 35S-CaMV. Veintiocho por
ciento de las plantas se tiñeron de azul, indicando un nivel
relativamente alto de expresión usando este promotor
heterólogo.
heterólogo.
El método implicó el cocultivo de
aproximadamente de 3000 plantas de Spirodela punctata (6 g de
peso fresco) en cada experimento de transformación (1000 plantas
por cada una de las 3 construcciones). Las plantas se valoraron
para la expresión de GUS 10 días después del cocultivo. Los
resultados se clasificaron según la intensidad del color azul:
ligero (+), medio (++) y oscuro (+++).
Los datos en la Tabla 13 muestran que la
variabilidad en intensidad de la tinción de GUS entre las plantas
cocultivadas con A. tumefaciens GV3103 (pVCGUS) era
considerablemente mayor que la de aquellas cocultivadas con A.
tumefaciens GV3103 (pME504). El porcentaje y la variabilidad
relativamente bajos (frente al control) en la intensidad de la
tinción de GUS en plantas cocultivadas con la construcción de GUS
sin promotor se explican por la integración al azar de este gen en
el cromosoma de S. punctata y la expresión mediante varios
promotores endógenos de Spirodela.
Se demostró que era posible desarrollar un
sistema nuevo de transformación en Lemnaceae que no requiere
procedimientos de cultivo de tejido o regeneración in vitro.
El procedimiento permite dirigir in planta directo al
meristemo el vehículo de transformación. En este sistema nuevo, se
transforma un meristemo y tiene la capacidad de seguir creciendo y
de esta manera formar la nueva generación. Además, no se necesita
presión selectiva para evitar el crecimiento del tejido no
meristemático en la misma planta de Lemnaceae. Se pueden ver
ejemplos de la validez de esta aproximación en los resultados de los
Ejemplos 1, 4, 6 y 10 a 18.
Se ha descrito previamente la formación
transitoria de callos y el mantenimiento de callos a corto plazo en
2 especies de Lemna (Chang y Chiu, 1978a, 1978b). Usando el
medio de formación de callos de un de estos autores (Murashige y
Skoog, 1962), suplementado con sacarosa al 3%, 2IP 1 mg/ml, y
2,4-D 10 mg/ml, se obtuvieron callos de
Spirodela punctata pero el desarrollo del callo se paraba en
los 14 a 21 días. Durante este período, se observó en el callo una
dramática acumulación de almidón (medido como aumento en el material
teñido con yodo). Estos callos se decoloraban y, con el tiempo
morían, debido aparentemente a envenenamiento por almidón. El
mantenimiento a largo plazo es un prerrequisito para la
transformación a nivel del callo ya que los pasos de cribado y/o
selección son necesarios.
Se buscaron las condiciones para el
mantenimiento a largo plazo de los callos de Spirodela. Se
estudiaron varios medios (medio MS (Tabla 1), B-5
(Tabla 5), y concentraciones de sacarosa (3,0, 1,0, 0,5%) diferentes
en combinación con varias fitohormonas (2IP; 2,4-D;
Dicamba; BA; Zeatina). Se encontró que el medio B-5
suplementado con una concentración baja (1,0%) de sacarosa era el
mejor para promover el mantenimiento a largo plazo de los callos de
Spirodela con varias combinaciones de hormonas. Los datos en
las Tablas 14, 15 y 16 resumen el porcentaje de la formación y
mantenimiento a largo plazo de callos con varias combinaciones de
hormonas. El método final para la formación y mantenimiento a largo
plazo de callos morfogenéticos de Spirodela se da en el
procedimiento VII. Exige únicamente una concentración baja de
sacarosa combinada con combinaciones hormonales particulares.
Usando este procedimiento, se mantuvieron callos verdes, en
crecimiento durante más de tres meses.
El método implicó cultivar frondas de
Spirodela punctata var. Helgm en medio B-5
suplementado con sacarosa al 1% y varias concentraciones de 2IP y
2,4-D como se indica. La formación de callos se
evaluó después de 8 semanas usando un microscopio de disección. Los
callos se subcultivaron en medio fresco cada 4 semanas. Los
resultados se muestran en la Tabla 14:
En otro experimento las frondas de Spirodela
punctata separadas se cultivaron en medio B-5
suplementado con sacarosa al 1% y varias concentraciones de BA y
Dicamba como se indica. La formación de callos se evaluó después de
3 semanas usando un microscopio de disección. Los callos se
subcultivaron en medio fresco cada 3 semanas. Los resultados se
muestran en la Tabla 15:
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento las frondas de Spirodela
punctata separadas se cultivaron en medio B-5
suplementado con sacarosa al 1% y varias concentraciones de zeatina
y Dicamba como se indica. La formación de callos se evaluó después
de 3 semanas usando un microscopio de disección. Los callos se
subcultivaron en medio fresco cada 3 semanas. Los resultados se
muestran en la Tabla 16:
\vskip1.000000\baselineskip
El único método para la producción de callos de
Spirodela se describe en el procedimiento VII. Usando este
procedimiento junto con el procedimiento VIII, se obtuvieron
eficientemente plantas de S. punctata regeneradas (Tabla 17
a continuación). La combinación de dos procedimientos representa el
método para producir callos de Spirodela altamente
regenerativos.
Los callos de Spirodela punctata var.
Helgm, mantenidos durante 7 a 16 semanas en medio
B-5 suplementado con sacarosa al 1%, 2IP 2 mg/ml y
2,4-D 10 mg/ml, se transfirieron a medio
B-5 suplementado con sacarosa al 1% y diferentes
concentraciones de 2IP. Las plantas regeneradas se puntuaron
visualmente después de 2 semanas
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descrito la regeneración de estructuras
similares a frondas a partir de callos de Lemna perpusilla;
sin embargo, los autores afirman que no observaron más desarrollo de
estas estructuras similares a frondas incluso después de 2 meses
(Chang y Hsing, 1978). En un estudio adicional, se describió la
regeneración de plantas a partir de callos de Lemna gibba
(Chang y Chiu, 1978). Sin embargo, el procedimiento requirió dos
meses para obtener una planta de propagación asexual (Chang y Chiu,
1978). La regeneración de plantas de Spirodela a partir de
callos no se ha descrito nunca. Usando la metodología nueva de la
invención para la regeneración de plantas, se obtuvieron plantas de
S. punctata intactas, regeneradas de forma eficaz en
1-2 semanas. El método rápido único para la
regeneración de plantas de Lemnaceae se da en el
procedimiento VIII.
Usando la metodología para la regeneración de
plantas (procedimiento VIII), > 90% de las plantas de S.
punctata regeneradas aparecían visualmente de tipos verdaderos
después de 3 semanas de crecimiento en medio SP. Las plantas de
S. punctata, vistas después de 3 meses de crecimiento en
condiciones estándar, seguían apareciendo de tipo verdadero. Cuando
se compararon con el progenitor parental con respecto a la velocidad
de crecimiento, tamaño y morfología de las frondas no se
encontraron diferencias significativas.
La capacidad de aumentar la diversidad genética
en Spirodela es importante ya que en varias especies, la
propagación es estrictamente vegetativa (Landolt y Kandeler, 1987).
Usando la metodología para la regeneración de plantas
(procedimiento VIII), varias plantas regeneradas parecían
visualmente aberrantes y después de 3 semanas de crecimiento en
condiciones estándar, seguían pareciendo aberrantes. Cuando se
compararon con el progenitor parental, se encontraron diferencias
significativas en tamaño (más pequeñas), velocidad de crecimiento
(más lenta) y morfología (forma de la fronda).
Los callos de Spirodela se mantuvieron en
medio B-5 (Tabla 6) suplementado con sacarosa la 1%,
2IP 2 mg/ml y 2,4-D 10 mg/ml. Se cocultivaron
quinientos callos con Agrobacterium que llevaba el plásmido
pME504. Después de 2 días de cocultivo, los callos se transfirieron
a medio fresco suplementado con kanamicina 30 mg/l y carbenicilina
300 mg/ml. Después de 15 días, 488 callos estaban completamente
decolorados. Los restantes 12 callos verdes se transfirieron a
medio fresco suplementado con kanamicina 30 mg/l. Tres callos se
mantuvieron verdes tras dos subcultivos adicionales (2 meses) en
medio fresco que contenía kanamicina como anteriormente. Se
evaluaron los callos verdes que se mantuvieron durante más de dos
meses en medio B-5 suplementado con sacarosa la 1%,
2IP 2 mg/ml, 2,4-D 10 mg/ml y kanamicina 30 mg/l.
Los resultados indican que los callos persistentes, verdes eran
resistentes a kanamicina como resultado de la expresión de los genes
introducidos.
Se mantuvieron plantas de Spirodela
punctata en medio SP en condiciones de crecimiento estándar
(Tabla 2). Usando el procedimiento estándar de transformación
(procedimiento III), se cocultivaron las plantas con la cepa EHA105
de A. tumefaciens que lleva el plásmido Ti pME504. Dos días
después de la transformación las plantas intactas se cultivaron en
medio B-5 suplementado con Dicamba 10 mg/l, BA 2
mg/l y kanamicina 30 mg/l (procedimiento VII). Se desarrollaron dos
callos verdes, compactos resistentes a kanamicina a partir de las
regiones meristemáticas después de 25 días. Los callos verdes en
crecimiento se seccionaron del tejido original y se subcultivaron
más en medio fresco que contenía kanamicina 30 mg/l durante 20 días
adicionales. Después de esta transferencia también, los dos callos
se mantuvieron verdes. Los resultados indican que los callos
persistentes verdes eran resistentes a kanamicina como resultado de
los genes introducidos.
Se mantuvieron plantas de Spirodela punctata
8717 en medio SP en condiciones de crecimiento estándar (Tabla
2). Usando el procedimiento estándar de transformación
(procedimiento III), se cocultivaron las plantas con la cepa EHA105
de A. tumefaciens que lleva el plásmido Ti pME504. Dos días
después de la transformación, las plantas intactas se cultivaron en
medio B-5 suplementado con Dicamba 10 mg/l, BA 2
mg/l y kanamicina 30 mg/l (procedimiento VII). Se desarrollaron
diez callos resistentes a kanamicina a partir de las regiones
meristemáticas después de 25 días. Los callos verdes se
transfirieron a medio B-5 suplementado con sacarosa
al 1%, 2IP 2 mg/l y kanamicina 30 mg/l. Se vio una planta verde en
regeneración después de dos semanas. Esta planta se transfirió al
mismo medio aproximadamente cada 2 semanas durante un período de 8
meses, dando lugar a numerosos descendientes vegetativos
resistentes a kanamicina, designados de aquí en adelante como clon
ME11. El clon ME11 se ha propagado como verde y resistente a
kanamicina en el medio anterior durante más de 65 generaciones.
Se ha demostrado la capacidad de obtener callos
resistentes a kanamicina mediante la producción de callos
transgénicos a partir de plantas Lemnaceae infectadas con
Agrobacterium (Ejemplo 25), o mediante la producción de
callos transgénicos a partir de callos de Lemnaceae
infectados con Agrobacterium (Ejemplo 26). Puesto que se
pueden producir callos resistentes a kanamicina y se pueden
regenerar plantas Lemnaceae de tipo verdadero de forma
eficaz y fácil a partir de callos (procedimiento VIII), se ha
demostrado la tecnología para producir plantas Lemnaceae
transformadas que se originan a partir de callos resistentes a
antibióticos.
Se mantuvieron plantas de Spirodela punctata
8717 en medio SP en condiciones de crecimiento estándar (Tabla
2). Se propagó el clon ME11, transformado como en el ejemplo 27,
como verde y resistente a kanamicina en medio SP suplementado con
kanamicina 2 mg/l durante aproximadamente 40 generaciones. Para
verificar la expresión y estabilidad a largo plazo de los
caracteres introducidos, el clon ME11 se subcultivó en el mismo
medio que carecía de kanamicina durante aproximadamente 60
generaciones. Se evaluó entonces el clon ME11 para resistencia a
kanamicina o a BASTA mediante subcultivo en medio SP suplementado
con kanamicina 2 mg/l o con BASTA 1,5 mg/l con o sin sacarosa al 1%
durante 5-10 generaciones.
Las plantas de Spirodela punctata 8717
controles, no transformadas se decoloraron y finalmente murieron.
Las plantas del clon ME11 permanecieron verdes y mantuvieron su
crecimiento normal.
Estos resultados demuestran la expresión estable
de la resistencia a kanamicina en plantas ME11 a pesar de la
eliminación de la presión de selección durante más de 60
generaciones. También demuestran la expresión estable de la
resistencia a BASTA a pesar de la falta de cualquier presión de
selección para este carácter.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (18)
1. Un método para la transformación genética
estable de plantas enteras, tejido vegetal o callos de
Lemnaceae, que comprende:
- (i)
- poner en contacto la planta entera, tejido vegetal o callo de Lemnaceae con células de Agrobacterium que contienen un molécula de ADN transformante; e
- (ii)
- incubar la planta entera, tejido vegetal o callo de Lemnaceae con las células de Agrobacterium, por lo que las células en dicha planta entera, tejido vegetal o callo de vuelven establemente transformadas con dicho ADN,
en donde las células de
Agrobacterium se ponen en contacto, antes de o durante el
método de transformación, con un medio potenciador que aumenta la
virulencia de las células de Agrobacterium, comprendiendo
dicho medio potenciador una suspensión de células frescas de
plantas dicotiledóneas o comprendiendo extracto de planta
Lemnaceae, y comprendiendo además cafeína a una
concentración de 100-500 mg por litro de
medio.
2. El método según la reivindicación 1, en
donde el medio potenciador comprende una suspensión de células
frescas obtenidas de una planta dicotiledónea.
3. El método según la reivindicación 2, en
donde la suspensión de células frescas está a una concentración del
1-10% (peso/volumen).
4. El método según la reivindicación 2 ó 3, en
donde la suspensión de células frescas de una planta dicotiledónea
se obtiene de la familia de Solanaceae.
5. El método según la reivindicación 1, en
donde el medio potenciador es un medio de cultivo de plantas que
tiene un pH de alrededor de 3,5 a 4,2, y comprende del
1-10% (peso/volumen) de una suspensión de células
frescas de Nicotiana tabacum y cafeína a una concentración
de 100-500 mg por litro de medio.
6. Un método para la transformación genética
estable de plantas enteras, tejidos vegetales o callos de
Lemnaceae, que comprende:
- (i)
- poner en contacto la planta entera, tejido vegetal o callo de Lemnaceae con células de Agrobacterium que contienen un molécula de ADN transformante; e
- (ii)
- incubar la planta entera, tejido vegetal o callo de Lemnaceae con las células de Agrobacterium, por lo que las células en dicha planta entera, tejido vegetal o callo de vuelven establemente transformadas con dicho ADN,
en donde las células de
Agrobacterium se ponen en contacto, antes de o durante el
método de transformación, con un medio potenciador que aumenta la
virulencia de las células de Agrobacterium, siendo dicho
medio potenciador un extracto de plantas de
Lemnaceae.
7. El método según la reivindicación 1 ó 6, en
donde el extracto de plantas de Lemnaceae es un extracto de
Spirodela punctata.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la planta entera, tejido vegetal o
callo de Lemnaceae es del género Spirodela,
Lemna o Wolffia.
9. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde las células de Agrobacterium
están específicamente dirigidas al tejido meristemático de la
planta.
10. El método según la reivindicación 9, en
donde las células de Agrobacterium son las cepas EHA105,
EHA101 o GVE3103 de A. tumefaciens.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde las células de Agrobacterium
están dirigidas a regiones heridas en la planta.
12. El método según la reivindicación 11, en
donde Agrobacterium es la cepa LBA4404 o C58 de A.
tumefaciens.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en donde, durante la incubación del tejido
vegetal de Lemnaceae con las células de
Agrobacterium, se aplica infiltración a vacío.
14. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en donde, antes de la incubación del tejido
vegetal de Lemnaceae con las células de
Agrobacterium, se expone la zona meristemática de la planta
mediante eliminación de las frondas hijas.
15. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en donde el proceso de transformación tiene
lugar en un medio que tiene un pH por debajo de alrededor de
5,2.
16. Un método para la transformación genética de
un planta Lemnaceae, que comprende
- (i)
- cortar la planta en partículas de un tamaño tal que todavía contienen tejido meristemático no dañado capaz de desarrollarse en plantas enteras;
- (ii)
- incubar dichas partículas con células de Agrobacterium que contienen moléculas de ADN transformante, por lo que dicho ADN transformante se introduce en las células meristemáticas en dichas partículas; y
- (iii)
- producir plantas transformadas a partir del tejido meristemático transformado.
17. El método según la reivindicación 16, en
donde las partículas tienen diámetros, la media de los cuales está
por encima de 150 \mum.
18. El método según la reivindicación 17, en
donde las partículas tienen diámetros, la media de los cuales es
alrededor de 150 \mum hasta alrededor de 750 \mum.
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