ES2302699T3 - Oligonucleotidos quimericos antisentido y formulaciones de transfeccion celular de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un oligonucleótido quimérico que tiene la capacidad de activar la RNAsa H de la fórmula 5¿-W-X1-Y-X2-Z-3¿, donde W representa un 5¿-O-alquil nucleótido; Cada uno de los X1 y X2 representan un conjunto de siete a doce 2¿-O-alquil ribonucleótidos unidos a fosfodiester; Y representa un bloque de 5 a doce desoxiribonucleótidos unidos por fosforotioato; y Z representa un grupo bloqueante eficaz para bloquear la actividad nucleasa en el extremo 3¿ del oligonucleótido.
Description
Oligonucleótidos quiméricos antisentido y
formulaciones de transfección celular de los mismos.
La presente invención se refiere a
oligonucleótidos antisentido, y más particularmente a
oligonucleótidos antisentido quiméricos que exhiben una alta
resistencia a endo- y exonucleasas, alta especificidad de secuencia,
y la habilidad para activar la RNAsa H, tal como se evidencia por
la eficiente y duradera inactivación del ARNm diana. También se
proporcionan formulaciones de los oligonucleótidos con moléculas
portadoras que proporcionan una transfección eficiente dentro de
las células.
El uso de oligonucleótidos antisentido para
inhibir específicamente la función de genes diana ha sido objeto de
amplia investigación, debido a su potencial como terapia selectiva
antiviral y anticancerosa. Muchos estudios se han dirigido al
diseño de análogos de oligonucleótidos que tienen una combinación
óptima de propiedades, que incluyen estabilidad (es decir,
resistencia a nucleasas celulares), captación celular, afinidad y
especificidad de unión ADN/ARN y eficiencia de inhibición. Muchos
de los primeros estudios se dirigieron al diseño de análogos
resistentes a nucleasas debido a que los enlaces fosfodiester de
ácidos nucleicos nativos son degradados por endo- y exonucleasas.
Una clase de estos compuestos son los fosforotioatos, que son
relativamente estables in vivo y conservan la habilidad de
activar la RNAsa H, mecanismo principal por el cual los
oligonucleótidos antisentido desactivan un ARN diana. Sin embargo,
el uso de fosforotioatos plantea varias desventajas, que incluyen
un alto nivel de unión no específica a otros componentes celulares,
provocando a menudo efectos secundarios no deseados, y reducida
afinidad de unión por al ARN.
Los ribonucleótidos oligoméricos sustituidos en
el oxígeno 2' muestran altas afinidades de unión a ARN y, en
comparación a los oligonucleótidos no sustituidos, reducida
sensibilidad a nucleasas endógenas. Aunque los ribonucleótidos
2'-O-metil sustituidos proporcionan
mayor afinidad de unión que aquellos que tienen sustituyentes más
grandes (por ejemplo etilo, propilo, pentilo, alilo), se sabe que
los sutituyentes más grandes confieren mayor resistencia a
exonucleasas (ver, por ejemplo, Monia et al., J.Biol. Chem.
271(24):14533, 1996). Arrow et al. (Nº de Patente de
EE.UU 5,849,902) indicaron que "las bases
2'-O-metiladas con enlaces
fosfodiester son degradadas por exonucleasas y por ello no son
apropiadas para su uso en células o aplicaciones terapéuticas del
antisentido". Los enlaces fosforotioato y fosfotriester fueron
recomendados por el segundo grupo por tener mayor estabilidad,
aunque presentaran las desventajas de baja afinidad de unión,
síntesis más difícil (fosfotriester) y /o mayor toxicidad
(fosforotioato).
Por tanto, existe todavía una necesidad de
composiciones de oligonucleótidos antisentido con combinaciones
óptimas de actividad antisentido, afinidad de unión a la diana,
biocompatibilidad, y estabilidad.
La presente invención incluye en un aspecto, un
oligonucleótido quimérico con capacidad para activar la RNAsa H de
la fórmula
5'-W-X^{1}-Y-X^{2}-Z-3',
donde W representa un
5'-O-alquil-nucleótido,
como
5'-O-alquil-timidina;
cada uno de X^{1} y X^{2} representa un bloque de siete a doce
2'-O-alquil-ribonucleótidos
enlazados por fosfodiester; Y representa un bloque de cinco a doce
desoxirribonucleótidos unidos por fosforotioato; y Z representa un
grupo bloqueante eficaz para bloquear la actividad nucleasa en el
extremo 3' del oligonucleótido. En una realización, Z es un
nucleótido unido 3-a-3'. En
realizaciones más alejadas, los grupos alquilo del
5'-O-alquil-nucleótido
y/o los
2'-O-alquil-ribonucleótidos
son grupos metilo. En otras realizaciones más alejadas, los grupos W
y/o Z están unidos a X^{1} y X^{2}, respectivamente, vía
enlaces fosfodiester, fosfotriester, fosforotioato, o fosforamidato.
Preferiblemente, W está unido vía un enlace fosfodiester o
fosforotioato, y Z está unido vía un enlace relativamente
resistente a nucleasa, es decir, un enlace fosfotriester,
fosforotioato o fosforamidato.
En realizaciones específicas, el segmento
X^{1}-Y-X^{2} del
oligonucleótido quimérico tiene una secuencia representada por
cualquiera de las SEQ ID Nos: 1-24 aquí
representadas.
En otro aspecto, la invención proporciona una
composición terapéutica que comprende un oligonucleótido como se
describe arriba en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En
realizaciones preferidas, el vehículo incluye un conjugado
lípido-peptoide catiónico o "lipitoide". Una
clase de conjugados lípido-peptoide catiónico
incluye compuestos de la fórmula:
L-enlazador-[N(CH_{2}CH_{2}NH_{2})CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)]_{3}-NH_{2},
donde el grupo lipídico L es un
grupo derivado de ácido graso, tal como un grupo fosfolipídico (es
decir,
ROOCCH_{2}CH(COOR)CH_{2}OP(O)_{2}O-),
que tiene cadenas alquilo o alquenilo grasas de entre 8 y 24 átomos
de carbono de longitud, o un grupo derivado de esteroide, como un
grupo colesterilo, y la fracción de la molécula a la derecha del
enlazador es el segmento peptoide. En el segmento peptoide, R se
selecciona entre alquilo (ramificado o no ramificado),
aminoalquilo, y aralquilo. Tal como se utiliza aquí,
"aralquilo" se refiere a un sustituyente alquilo,
preferiblemente alquilo inferior, sustituyente que además está
sustituido con un grupo arilo; un ejemplo es un grupo bencilo.
"Arilo" se refiere a un radical aromático monovalente
sustituido o no sustituido que tiene un solo anillo (por ejemplo,
benceno) o dos anillos condensados (por ejemplo, naftilo). Este
término incluye grupos heteroarilo, que son grupos de anillos
aromáticos que tienen uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno, o
azufre en el anillo, como furilo, pirrol, piridilo, e indol. Por
"sustituido" se entiende que uno o más hidrógenos del anillo
en el grupo arilo está reemplazado por un sustituyente,
preferiblemente seleccionado de entre un halógeno, un grupo alquilo
inferior o un grupo alcoxi inferior, halometilo o
haloetilo.
Es realizaciones específicas, R es isopropilo o
4-metoxifenilo. Un solo lipitoide puede incluir
diferentes grupos R, o pueden ser el mismo dentro de la
molécula.
El enlazador puede ser un enlace directo, o
puede ser un grupo de unión sustancialmente lineal, como un
oligopéptido o una cadena alquilo, de cualquier longitud eficaz. El
enlazador puede ser también una cadena alquilo que tiene uno o más
grupos de enlaces que contiene heteroátomos, seleccionados entre el
grupo que cosiste en éster, amida, carbonato, carbamato, disulfido,
péptido, y éter, en cualquiera de los extremos de la cadena o que
intervenga entre uniones alquilo. En realizaciones selectas, el
enlazador es de 2 a aproximadamente 30 átomos, o de 3 a
aproximadamente 15 átomos de longitud.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso
de un nucleótido quimérico de la invención que es eficaz para
hibridarse específicamente a toda o parte de una secuencia de ácido
nucleico diana seleccionada obtenida del gen, en la fabricación de
un medicamento para su uso en la inhibición de la expresión de un
gen diana en un sujeto. En una realización, la secuencia del ácido
nucleico diana es un ARNm derivado del gen diana. En realizaciones
específicas, el segmento
X^{1}-Y-X^{2} del nucleótido
quimérico tiene una secuencia representada por cualquiera de las
SEQ ID Nos: 1-24 aquí representadas. En
realizaciones más alejadas, el medicamento incluye un conjugado
lípido-peptoide catiónico como el descrito
arriba.
Como se muestra aquí, los oligonucleótidos
quiméricos de la invención proporcionaron una estabilidad
sorprendentemente alta e inactivación eficaz y duradera del ARNm
diana. Estos y otros objetos y características de la invención
serán ampliamente evidentes cuando la siguiente descripción
detallada de la invención sea leída en conjunto con los dibujos que
la acompañan.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra una representación
esquemática de un oligonucleótido quimérico, de acuerdo con una de
las realizaciones de la invención;
La Figura 2 muestra una selección de conjugados
fosfolípido-peptoide ("lipitoides") y
conjugados colesterol-peptoide
("colesteroides") útiles como portadores de oligonucleótidos en
composiciones y métodos de la invención;
La Figura 3 muestra el efecto, sobre el nivel de
ARNm de AKT1, de oligos antisentido a AKT1 liberado a células
HT1080 vía Effectene^{TM}, Lipitoide 1, y peptoide 1, y oligos
control (AKT2-AS, AKT2-RC, y
AKT1-RC) liberados vía Effectene^{TM};
La Figura 4 muestra el efecto, sobre el nivel
deARNm de AKT1 de oligos antisentido a AKT1 liberado a células de
cáncer de colon (Lovo) en conjunción con: Lipitoide 1, dos
relaciones diferentes de carga de Lipitoide 2
(DMPE(NaeNiaNia)_{3}), 2 proporcioness diferentes de
carga de Colesteriode 1
(Col-\beta-ala-(NaeNmpeNmpe)_{3}),
y el agente de transfección Cytofectin^{TM} disponible
comercialmente;
Las Figuras 5-7 muestran el
efecto sobre la proliferación celular de la transfección de células
Lovo, Km 12L4, y Colo320DM de cáncer de colon, respectivamente, con
oligonucleótidos quiméricos de la invención, en conjunción con
diferentes portadores lipitoides y colesteroides; y
La Figura 8 muestra los resultados de varios
ensayos de viabilidad celular sobre células Km12L4 y
HCT-166 transfectadas con oligonucleótidos en
conjugación con lipitoides 1 y 2, colesteroides 1 y 3, y los agentes
de transfección Lipofectin® y Cytofectin^{TM}, disponibles
comercialmente, donde las regiones en blanco indican niveles de
células sanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos quiméricos de la invención
tienen la estructura general que se muestra abajo:
5'-W-X^{1}-Y-X^{2}-Z-3'
\newpage
En esta estructura, la fracción central de la
molécula, representada por Y, es un bloque de entre cinco y doce
desoxiribonucleótidos unidos por fosforotioato (ADN fosforotioato, o
ADN PS). En una realización, el bloque Y es eficaz para activar la
RNAsa H cuando se híbrida a una cadena de ARN suficientemente
complementaria, promoviendo de esta manera el anclaje del ARN. El
bloque Y está flanqueado por dos bloques de unión, representados
por X^{1} y X^{2}, cada uno de los cuales tiene entre siete y
doce subunidades de 2'-O-alquil
ribonucleótido unidos por fosfodiester
(2'-O-alquil ARN fosfodiester, o PO
2'-O-alquil-ARN).
Tal como se utiliza aquí, "alquil" se refiere a un radical
monovalente acíclico totalmente saturado que contiene carbono e
hidrógeno, que puede ser de cadena ramificada o lineal; ejemplos de
grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo,
t-butilo, n-heptilo, e isopropilo.
"Alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo de uno a
seis átomos de carbono, y preferiblemente de uno a cuatro átomos de
carbono.
Los grupos alquilo de las subunidades de
2'-O-alquil-ribonucleótido
son preferiblemente grupos alquilo inferiores. En una realización,
los grupos alquilo son grupos metilo, que generalmente proporcionan
uniones superiores y captación celular en comparación con grupos
alquilo más largos. Los bloques de unión, aunque no son
necesariamente eficaces para participar en la activación de la
RNAsa H, proporcionan afinidad de unión a cadenas de ARN
suficientemente complementarias y pueden también proporcionar
reducida toxicidad celular en comparación con subunidades unidas
por fosforotioato.
En los extremos terminales 3' y 5' se
proporcionan los grupos bloqueantes Z y W, respectivamente. En una
realización, los grupos W y Z están unidos a los respectivos
bloques X por enlaces fosfodiester; en otra realización, éstos
están unidos vía enlaces fosforotioato. El grupo bloqueante Z en 3'
es preferiblemente un nucleótido unido
3'-a-3', aunque este extremo
terminal puede también ser bloqueado por otros métodos; por ejemplo
por unión del nucleótido terminal vía un enlace relativamente
estable a las nucleasas (por ejemplo fosforotioato, fosforamidato,
fosfotriester) o un apéndice de una fracción no nucleotídica.
El extremo terminal 5' es bloqueado con una
subunidad 5'-O-alquil nucleótido
(W), donde el alquilo es preferiblemente un alquilo inferior. En
una realización, W es una 5'-O-metil
timidina. Se encuentra que este grupo bloqueante confiere
estabilidad a los nucleótidos quiméricos en cultivo celular y en
suero. Por ejemplo, la duración de la inactivación de ARNm en
cultivos celulares (descrito mas abajo) oscila normalmente entre
3-5 días tras la transfección. Además de
proporcionar estabilidad, este grupo bloqueante, y el grupo
bloqueante nucleótido 3'-a-3', se
encontró que no interferían con la captación o distribución de los
oliginucleótidos.
Los oligonucleótidos quiméricos de la invención
pueden ser preparados usando fase de solución o, preferiblemente,
síntesis de fase sólida, de acuerdo con los procedimientos
establecidos. La síntesis de un oligonucleótido quimérico ejemplo,
como el de la Fig. 1, se describe en el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos quiméricos antisentido
basados en la fórmula de arriba, que tienen secuencias dirigidas
contra AKT1 (SEQ ID NO: 1) o AKT2 (SEQ ID NO: 2), fueron preparados
como se describe en el Ejemplo 1. Los oligonucleótidos también
incluían una 5'-O-metil timidina
5'-terminal, como se indica en la fórmula de arriba.
En estos oligonucleótidos, X^{1} y X^{2} fueron bloques de
siete bases de 2'-O-metil PO ARN, Y
es PS ADN, Z era un nucleótido unido
3'-a-3', y W era una
5'-O-metil timidina. Tanto Z como W
se unieron a los respectivos bloques X vía enlaces
fosfodiester.
Cuando se transfectaron en las células tal y
como se describe en el Ejemplo 2, los oligonucleótidos quiméricos
antisentido de la invención con distintas secuencias (véase tabla 1)
mostraron una sorprendente eficacia de degradación del ARNm
endógeno, dando como resultado una pérdida de actividad de los
respectivos genes. Las Figuras 5 y 6 muestran niveles de ARNm de
AKT1 endógeno en células de cáncer de colon y en células HT1080,
respectivamente, transfectadas con oligonucleótidos quiméricos
anti-AKT1 (SEQ ID NO: 1). De forma similar, un
oligonucleótido quimérico antisentido dirigido contra hCHK1 (SEQ ID
NO: 3) mostraba degradación de ARNm endógeno, pérdida de actividad
chk1 quinasa, y pérdida de función chk1 (es decir, control del
puesto de control del ciclo celular G2).
Se prepararon oligonucleótidos quiméricos
adicionales que tienen las secuencias mostradas en la Tabla 1 y se
administraron a células tal como se describe en el Ejemplo 2. (Cada
oligonucleótido incluía una
5'-O-metil timidina, como se
describió arriba, que no se muestra en las secuencias listadas). En
estos oligonucleótidos, con referencia a la fórmula de arriba,
X^{1} y X^{2} son bloques de siete bases de
2'-O-metil PO ARN, Y es un conjunto
de nueve a once bases de PS ADN, Z es un nucleótido unido a
3'-a-3', y W es una
5'-O-metil timidina. Tanto Z como W
están unidos vía enlaces fosfodiester.
Con la excepción del oligo mTyr (SEQ ID NO:
17-18), que se transfectó a células B16 de melanoma,
todos los oligos mostrados en la Tabla 1 fueron transfectados a
células HT1080, usando "Lipitoide 1" (ver abajo) para la
transfección, e incubados durante 24 horas. La tabla da el nivel
aproximado de inactivación de ARNm observado en cada caso. Se
observaron frecuentemente reducciones de niveles de ARNm de un 90% o
más, tal como se muestra en la Tabla.
Existen una variedad de estrategias para aportar
a las células las composiciones de ácido nucleico. Los vectores
virales proporcionan una aportación relativamente eficaz, pero en
algunos casos presentan problemas de seguridad debido al riesgo de
complicaciones inmunológicas o propagación no deseada en el sujeto.
Los vectores adenovirales han mostrado ciertas ventajas, ya que no
se integran en el genoma de la célula y pueden ser transducidos al
interior de células en reposo. Sin embargo, todos estos vectores
deber ser preparados por técnicas de ADN recombinante que consumen
mucho tiempo. Los oligonucleótidos también pueden ser aportados a
las células vía agentes de transfección química, que han sido el
objeto de muchos de los trabajos recientes. Estos agentes incluyen
moléculas policatiónicas, como polilisina, y lípidos catiónicos. La
composición liposomial Lipofectin® (Felgner et al., PNAS
84:7413, 1987), que contiene el lípido catiónico DOTMA (cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio)
y el fosfolípido neutro DOPE (dioleil fosfatidil etanolamina), es
ampliamente usado. Cualquiera de estos métodos, así como otros
métodos tales como la transfección mediada por fosfato de calcio,
pueden ser usados para aportar los oligonucleótidos de la
invención, de acuerdo con los procedimientos publicados.
Un método de aportación implica el uso de
agentes de transfección conocidos como "lipitoides" y
"colesteroides", descritos, por ejemplo, en las publicaciones
PCT WO 98/06437 y WO 99/08711 (Zuckermann et al.), basadas en
los números de serie norteamericanas 60/023,867, 60/054,743, y
09/132,808, que se incorporan aquí en la referencia. Estos
conjugados lípido-peptoide catiónico se muestran en
estas referencias para ser reactivos eficaces para la aportación
in vitro a células de ADN plasmídico. Aquí se muestra que
estos componentes aportan eficientemente oligonucleótidos dentro de
una variedad de líneas celulares primarias y tumorales. Esta
eficacia de aportación se valoró por análisis de fluorescencia de
oligonucleótidos marcados con FITC, o por monitorización de los
niveles de ARNm tras la transfección de oligonicleótidos quiméricos
antisentido, tal como se describe mas abajo.
Cualquiera de los portadores descritos en las
solicitudes arriba referenciadas son apropiados para su uso en
transfección de los oligonucleótidos aquí descritos. Otra
divulgación de esteroides útiles para incorporarlos dentro de los
conjugados esteroide-peptoide catiónico se
encuentran en la publicación de la PCT WO 97/46223 (Fasbender et
al.) y en la correspondiente patente americana con número
5,935,936, que se incorporan aquí por referencia.
Estos compuestos pueden ser preparados por
solución convencional o por síntesis en fase sólida. En uno de
estos procedimientos, tal como se describe en Zuckermann et
al., citado arriba, el N-terminal del peptoide
unido a resina está acilado con un separador como el ácido
Fmoc-aminohexanoico o
Fmoc-\beta-alanina. Tras la
separación del grupo Fmoc. el grupo amino primario reacciona con
cloroformato de colesterol para formar un enlace carbamato, por
ejemplo tal como se muestra en los Colesteroides 2, 3 y 4 de la Fig.
2. El producto es entonces escindido de la resina con ácido
trifluoroacético y purificado por HPLC de fase reversa. Tal como se
muestra también en la Fig. 2, en lugar del resto esteroide se puede
usar un resto lipídico derivado de ácido graso, como un
fosfolípido.
El esteroide o cualquier otra fracción lipídica
puede también unirse a la fracción peptoide por otros enlaces, de
cualquier longitud eficaz, fácilmente disponible para el experto en
la técnica. El enlazador es una cadena de hasta aproximadamente 30
enlaces de longitud, y más preferiblemente de hasta aproximadamente
15 enlaces de longitud, aunque se puede utilizar cualquier longitud
eficaz. La cadena es típicamente lineal o substancialmente lineal,
aunque también se pueden utilizar cadenas ramificadas (incluidos
oligopéptidos) y enlazadores que contengan grupos cíclicos
intermedios. El enlazador generalmente comprende enlaces alquilo
(C-C) y uno o más grupos funcionales tales como
enlaces éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido o
éter. El enlazador puede comprender múltiples grupos funcionales,
como en un éster succinato o polieter, o puede ser un oligopéptido,
preferiblemente un 2- a 10-mero, y más
preferiblemente un 2- a 5-mero. El resto esteroide o
lipídico y el segmento peptoide pueden también estar unidos por un
enlace directo.
En ciertas realizaciones, el enlazador incorpora
uno o más enlaces que son susceptibles de escindirse in vivo
bajo condiciones apropiadas; por ejemplo, enlaces éster
hidrolizables, enlaces carbonato, enlaces carbamato, o enlaces
péptídicos; enlaces disulfuros, que son escindidos en compartimentos
celulares que tienen un entorno suficientemente reductor; y enlaces
péptídicos, escindidos por peptidasas endógenas. Con respecto a los
últimos, se contemplan enlazadores peptídicos que tienen diez o
menos enlaces, o, en más aspectos, 5 o menos enlaces peptídicos,
aunque también pueden usarse enlazadores más largos.
\newpage
En realizaciones particulares, el conjugado
lípido-peptoide catiónico pertenece a una clase de
compuestos que tienen la fórmula:
L-(CH_{2})_{n}-(C=O)-[N(CH_{2}CH_{2}NH_{2})CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)]_{3}-NH_{2},
donde L se selecciona de (i) un
grupo fosfatidiletanolamino (es decir
ROOCCH_{2}CH(COOR)CH_{2}OP(O)_{2}O-CH_{2}
CH_{2}NH_{2}-), que tiene cadenas alquilo o alquenilo grasas de entre 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y (ii) un grupo colesterilo unido al segmento -(CH_{2})_{n} adyacente por una unión éster, amida o carbamato; n es 1-5; y R se selecciona entre isopropilo y 4-metoxifenilo. Aquí se dan las designaciones de las estructuras representativas de esta clase, mostradas en la Fig. 2:
CH_{2}NH_{2}-), que tiene cadenas alquilo o alquenilo grasas de entre 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y (ii) un grupo colesterilo unido al segmento -(CH_{2})_{n} adyacente por una unión éster, amida o carbamato; n es 1-5; y R se selecciona entre isopropilo y 4-metoxifenilo. Aquí se dan las designaciones de las estructuras representativas de esta clase, mostradas en la Fig. 2:
Tal como se utiliza aquí, el término
"lipitoide" puede ser usado genéricamente para incluir tanto a
lipitoides como a colesteroides, a menos que se refieran a un
Lipitoide en particular, como L1 o L2, arriba mencionados.
Para preparar las composiciones de transfección,
se formula una solución acuosa de un peptoide, lipitoide o
colesteroide con el oligonucleótido, tal como se describe en el
Ejemplo 2A. Los componentes son utilizados preferiblemente en
cantidades relativas de tal forma que haya al menos dos, y
preferiblemente de dos a cuatro, cargas positivas de lipitoide por
cada carga negativa de ADN. La proporción exacta de oligonucleótido
antisentido a lipitoide preferiblemente se determina empíricamente
para cada tipo celular, pero generalmente está en el intervalo de
1,5-2 mmol lipitoide/\mug oligonucleótido
antisentido. Las células deben ser transfectadas tal como se
describe arriba y en el Ejemplo 2B.
La extensión de oligonucleótidos quiméricos
marcados con FITC aportadas al interior de células de fibrosarcoma
humano (HT1080) se evaluó vía análisis de fluorescencia. (Todos los
oligonucleótidos utilizados en los estudios subsecuentes fueron
oligonucleótidos quiméricos tal como se describe para los estudios
representados en la Tabla 1). La secuencia de los oligonucleótidos
fue el control inverso de PDK1 (SEQ ID NO: 25, el inverso de SEQ ID
NO: 23) por lo que el efecto de los oligonucleótidos sobre las
células debería ser mínimo. Los oligonucleótidos se tranfectaron
vía complejación con (a) un agente de transfección disponible
comercialmente, Effectene^{TM}, (b) el peptoide
(NaeNmpeNmpe)_{3} (peptoide 1), (c) Lipitoide 1, en una
proporción de carga 1:4 de oligo a lipitoide, y (d) Lipitoide 1, en
una relación de carga 1:3. En comparación con Effectene^{TM}, el
Lipitoide 1 dio una eficacia de transfección significativamente más
alta y un mayor grado de liberación nuclear del oligonucleótido,
tal como se evidencia por el análisis de fluorescencia de las
células transfectadas. La mayor relación de carga lipitoide/oligo
(1:4; c) también parece ser más eficaz que la relación 1:3.
La Figura 3 muestra la reducción en el ARNm
endógeno de AKT1 en células HT1080 resultantes de la transfección
de un oligonucleótido quimérico antisentido en AKT1, tal como se
describe arriba (AKT1-AS), en comparación con
oligonucleótidos control AKT1-RC (RC= control
inverso; SEQ ID NO: 26; inverso de SEQ ID NO: 1), AKT2.AS, y
AKT2-RC (SEQ ID NO: 27; inverso de SEQ ID NO: 2).
Los mismos oligos también fueron aportados por lípidos comerciales
(Effectene^{TM}) y peptoides comerciales
((NaeNmpeNmpe)_{3}). Los resultados, representados en la
Fig. 3, muestran que los oligonucleótidos quiméricos antisentido
AKT1 transfectados con L1 dio la reducción más pronunciada en el
nivel del ARNm diana.
Se encontró que la eficacia de liberación del
oligonucleótido por colesteroides era similar o superior a la
ocasionada por los lipitoides (no-esteroide). Por
ejemplo, tal como se muestra en la Fig. 4, la liberación del oligo
quimérico anti-AKT1 descrito arriba por el
Colesteroide 1 produce una mejor inactivación del ARNm de AKT1 que
la aportación producida por Lipitoide 1 o Lipitoide 2 en una línea
celular de cáncer de colon (Lovo).
Los colesteroides proporcionan el beneficio
adicional de reducir substancialmente la toxicidad a células in
vitro. La Fig. 5 muestra un ensayo de proliferación de 4 días,
guiado como se describe en el Ejemplo 3, de células de cáncer de
colon Lovo tras transfección de 50-300 nM de
oligonucleótidos. (De nuevo, se utilizaron controles inversos de
oligonucleótidos quiméricos de PDK1, que se esperaban fueran
no-activos). Estos gráficos demuestran el
incremento significativo en la proliferación y viabilidad de las
células Lovo tras una transfección del oligonucleótido con
Colesteroides 2 y 3 (Fig. 5B,D) comparado con transfección con
Lipitoides 1 y 2 (Fig.5A, B). Este efecto no se limita a este tipo
celular, y también se observó en ensayos de proliferación de células
Km12L4 de cáncer de colon (Fig. 6) y en células Colo320DM de cáncer
de colon. (Fig. 7).
Para investigar aún más la reducida toxicidad de
los colesteroides, se realizó un análisis FACS de las células, tras
transfección (véase Ejemplo 4), para determinar el número de células
necróticas (PI+), precozmente apoptóticas (anexina+), tardíamente
apoptóticas (anexina+/PI+) y sanas (anexina-/PI-). Las columnas
blancas de la Fig. 8 reflejan el número de células sanas, mientras
que las porciones coloreadas de las barras (demarcadas por
segmentos de trazo corto para aclarar) representan las células
muertas o moribundas. El análisis se realizó en células Km12L4
(Fig. 8A-B) y células HCT116 (Fig.
8C-D). El porcentaje de células moribundas se
determinó a las 4 horas (Fig. 8A, C) o a las 24 horas (Fig. 8B, D)
tras la transfección. Si bien los diferentes tipos celulares
muestran distinta sensibilidad a la transfección, las células
transfectadas con colesteroides contenían consistemente las células
más sanas y mostraron el menor grado de muerte celular. Esta menor
toxicidad también se observó en la comparación de colesteroides con
los lípidos Lipofectamine® and Cytofectin^{TM} disponibles
comercialmente.
Los siguientes ejemplos ilustran pero no
pretenden de ninguna manera limitar la invención.
Los oligonucleótidos quiméricos se prepararon
usando la síntesis en fase sólida, de acuerdo con los procedimientos
establecidos. Se utilizaron un Sintetizador Perspective Biosystems
(Framingham, MA) 8909 y un Sintetizador ABI 394
(ABI/Perkin-Elmer, Foster City, CA) para las
adiciones de ARN y de ADN unido a fosforotioato, respectivamente.
También es posible realizar la síntesis utilizando sólo un
instrumento con ocho botellas de reactivo amidito. A no ser que se
diga lo contrario, la preparación y síntesis de todos los reactivos
se realizó utilizando los protocolos clásicos del fabricante.
La columna de soporte 5'-CPG,
los fosforamiditos de
5'-O-metil-ARN, el
fosforamidito de
5'-O-metil-dT-CE,
y el reactivo sulfurante,
3H-1,2-bonzoditiol-3-ona-2,2-dióxido,
se obtuvieron de Glen Research (Sterling, VA).
Para realizar una síntesis representativa, las
últimas siete bases de la secuencia deseada se introdujeron dentro
del Sintetizador 8909, provisto de fosforamiditos de
2'-O-metil-ARN, se
unió la columna 5'-CPG adecuada, y se llevó a cabo
la síntesis a escala de 1 \mumol de ARN con el DMT final.
Después se retiró la columna del 8909 y se unió
al ABI394. El agente sulfurante se instaló en posición 15 (para
reemplazar al oxidante), y se llevó a cabo una síntesis para la
sección media del fosforotioato del oligo , utilizando el programa
de 1 \mumol de Azufre con el DMT final.
Después se retiró la columna y se recolocó sobre
la 8909. Se añadieron las últimas siete bases de
2'-O-metil ARN, utilizando el
programa de 1 \mumol de ARN, con DMT. Finalmente, se añadió la
cadena terminadora, fosforamidito de
5'-O-metil-dT-CE
(cianoetilo) utilizando un protocolo de 1 \mumol de ADN modificado
para extender el tiempo de acoplamiento a 300 segundos. El
oligonucleótido se escindió del soporte, se desprotegió y se
purificó en gel utilizando métodos clásicos.
Para cada mezcla de transfección, se preparó una
molécula portadora, preferiblemente un lipitoide o colesteroide, a
una concentración de trabajo de 0,5 mM en agua, se sonicó para
obtener una solución uniforme, y se filtró a través de una membrana
PVDF de 0.45 \mum. El oligonucleótido antisentido se preparó a una
concentración de trabajo de 100 \muM en agua Millipore
estéril.
El oligonucleótido se diluyó en OptiMEM^{TM}
(Gibco/BRL), en un tubo de microfuga, de 2 \muM, a aproximadamente
20 \mug oligo/ml de OptiMEM^{TM}. En un tubo de microfuga
aparte, el lipitoide o colesteroide, típicamente en la cantidad de
1,5-2 nmol lipitoide/\mug oligonucleótido
antisentido, se diluyó al mismo volumen de OptiMEM^{TM} usado
para diluir el oligonucleótido. El oligonucleótido antisentido
diluido se añadió inmediatamente al lipitoide diluido y mezclado
por pipeteo.
Las células se sembraron en placas de cultivo
celular un día antes de la transfección, en medio de crecimiento
con suero, para obtener una densidad en la transfección del
60-90%. La mezcla oligonucleótido/lipitoide se
añadió a las células, inmediatamente tras la mezcla, a una
concentración final de 100-300 nM de oligonucleótido
antisentido. Las células se incubaron con la mezcla de transfección
durante 4-24 horas a 37ºC, 5% de CO_{2}. Tras la
incubación, la mezcla de transfección se desechó y se reemplazó con
medio normal de crecimiento con suero.
Se extrajo ARN total usando el kit RNeasy^{TM}
(Quiagen Corporation, Chatsworth, CA), de acuerdo con los
protocolos del fabricante.
Se cuantificó el nivel de ARNm diana utilizando
la máquina de PCR a tiempo real de Roche LightCycler^{TM}. Los
valores del ARNm diana se normalizaron contra un control interno
(por ejemplo beta-actina).
Por cada 20 \mul de reacción, el ARN extraído
(generalmente 0,2-1 \mug total) se colocó en un
tubo de microcentrífuga estéril de 0.5 o 1,5 ml, y se añadió agua
hasta un volumen total de 12,5 \mul. A cada tubo se le añadió 7,5
\mul de una mezcla tampón/enzima, preparada mezclando (en el orden
citado) 2,5 \mul de H_{2}O, 2,0 \mul de tampón
de reacción10X, 10 \mul de oligo dT (20 pmol), 1,0
\mul de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), 0,5 \mul
de RNAsin® (20u) (Ambion, Inc., Hialeah, FL), y 0,5 \mul
de transcriptasa inversa MMLV (50u) (Ambion, Inc.). Los contenidos
se mezclaron por pipeteo y se incubó la mezcla de reacción a 42ºC
durante 1 hora. Los contenidos de cada tubo se centrifugaron antes
de la amplificación.
Se preparó una mezcla de amplificación mezclando
en el siguiente orden: 1X de tampón II de PCR, MgCl_{2} 3 mM, 140
\muM de cada dNTP, 0,175 pmol de cada oligo, 1:50,000 dil de SYBR®
Green, 0,25 mg/ml de BSA, 1 unidad de Taq polimerasa, y
H_{2}O hasta 20 \mul. (El tampón II de PCR está disponible en
una concentración 10X a partir de Perkin-Elmer
(Norwalk, CT). En la concentración de 1X, contiene 10 mM de Tris pH
8,3 y 50 mM de KCl. SYBR® Green (Molecular Probes, Eugene, OR) es
un tinte que fluoresce cuando se une a una cadena doble de ADN.
Como el producto de doble cadena de PCR se produce durante la
amplificación, la fluorescencia de SYBR® Green se incrementa).
A cada alícuota de 20 \mul de la mezcla de
amplificación se le añadieron 2 \mul de RT patrón, y se realizó
la amplificación de acuerdo con los protocolos clásicos.
Las células se sembraron en placas de 96
pocillos a una densidad de 5.000 células por pocillo. Para un ensayo
de proliferación de 4 días, se prepararon 5 placas independientes
de 96 pocillos, uno por cada día. Tras incubación toda la noche,
las células se transfectaron utilizando el procedimiento descrito
arriba. Cada día del ensayo de proliferación, todo el medio se
recoge de cada placa y se congela a -70ºC. En el día cuatro, todas
las placas se desarrollan con el kit de ensayo Quantos^{TM}
(Stratagene, La Jolla, CA) que determina la cantidad de ADN, y con
ello el número de células, en cada pocillo.
Las células se sembraron en placas de 35 mm a
35.000 células/pocillo y se dejó que se pegaran a la placa durante
la noche. Después, las células fueron transfectadas con
formulaciones oligonucleótido/lípido a 50-300 nM y
se incubaron durante 4 o 24 horas. Las células se recogieron 12
horas después, incluyendo el medio que contenía células en
flotación. Las células vivas se tiñeron con yoduro de propidio (PI)
para detectar células necróticas y apoptóticas y se contratiñeron
con anexina V acoplada a FITC (que detecta células apoptóticas
precoces y tardías) de acuerdo con las instrucciones del Kit de
Detección de Apoptosis de R&D Systems (Minneapolis, MN).
Después, las células se analizaron por análisis FACS para determinar
el número relativo de células PI+, Anexina V+, PI+ anexina V+ y
PI-/ anexina V-. Los resultados se expresan como porcentaje (Fig.
8).
<110> Chiron Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Oligonucleótidos Quiméricos
Antisentido y Formulaciones de Transfección Celular de los
Mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2456-0017.41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No asignado todavía
\vskip0.400000\baselineskip
<141> Presentado adjunto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/151,246
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-08-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la version 4.0 de
Windows
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip0.85cm100
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip0.85cm101
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip0.85cm102
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0.85cm103
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0.85cm104
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0.85cm105
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0.85cm106
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip0.85cm107
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0.85cm108
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip0.85cm109
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip0.85cm110
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip0.85cm111
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip0.85cm112
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip0.85cm113
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip0.85cm114
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip0.85cm115
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 17
\hskip0.85cm116
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<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip0.85cm117
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<210> 19
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<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
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<400> 19
\hskip0.85cm118
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
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<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 20
\hskip0.85cm119
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 21
\hskip0.85cm120
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip0.85cm121
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip0.85cm122
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido antisentido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip0.85cm123
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Control inverso de PDK1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip0.85cm124
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> control inverso de AKT1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip0.85cm125
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> control inverso de AKT2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip0.85cm126
Claims (21)
1. Un oligonucleótido quimérico que tiene la
capacidad de activar la RNAsa H de la fórmula
5'-W-X^{1}-Y-X^{2}-Z-3',
donde
W representa un
5'-O-alquil nucleótido;
Cada uno de los X^{1} y X^{2} representan un
conjunto de siete a doce 2'-O-alquil
ribonucleótidos unidos a fosfodiester;
Y representa un bloque de 5 a doce
desoxiribonucleótidos unidos por fosforotioato; y
Z representa un grupo bloqueante eficaz para
bloquear la actividad nucleasa en el extremo 3' del
oligonucleótido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1,
donde los grupos alquilo del
5'-O-alquil nucleótido y de los
2'-O-alquil ribonucleótidos son
grupos alquilo inferior.
3. El oligonucleótido de la reivindicación 2,
donde los grupos alquilo de los
2'-O-alquil ribonucleótidos son
grupos metilo.
4. El oligonucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el
5'-O-alquil nucleótido es una
5'-O-alquil-timidina.
5. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el
5'-O-alquil nucleótido está unido a
X^{1} vía un enlace fosfodiester o un enlace fosforotioato.
6. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el grupo Z está unido a X^{2}
vía un enlace seleccionado del grupo consistente en un enlace
fosfotriester, enlace fosforotioato, y enlace fosforamidato.
7. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde Z es un nucleótido unido
3'-a-3'.
8. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde
X^{1}-Y-X^{2} tiene una
secuencia nucleotídica que corresponde a una secuencia seleccionada
del grupo consistente en SEQ ID Nos: 1-24.
9. Una composición útil para inhibir la
expresión de un gen diana en un sujeto, que comprende un
oligonucleótido quimérico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
10. La composición de la reivindicación 9, donde
el vehículo incluye un conjugado lípido-peptoide
catiónico de la fórmula:
L-enlazador-[N(CH_{2}CH_{2}NH_{2})CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)]_{3}-NH_{2}
donde
L se selecciona de un resto lipídico que
comprende al menos una cadena alquilo o alquenilo grasa de entre
aproximadamente 8 a 24 átomos de carbono de longitud y un
esteroide;
cada grupo R se selecciona independientemente de
alquilo, aminoalquilo, y aralquilo, y el enlazador se selecciona
del grupo que consiste en un enlace directo, un oligopéptido, una
cadena alquilo substancialmente lineal de entre 2 a 30 enlaces de
longitud, y una cadena substancialmente lineal de 2 a
aproximadamente 30 enlaces de longitud consistente en enlaces
alquilo y uno o más enlaces seleccionados del grupo consistente en
éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido, y éter.
\vskip1.000000\baselineskip
11. La composición de la reivindicación 10,
donde el enlazador es de 3 a aproximadamente 15 enlaces de
longitud.
12. La composición de la reivindicación 10,
donde dicha cadena alquilo o alquenilo grasa es de entre 14 y 24
átomos de carbono de longitud.
13. La composición de la reivindicación 10,
donde L es un grupo fosfolipídico, teniendo dos cadenas alquilo o
alquenilo grasas de entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono
de longitud.
14. La composición de la reivindicación 10,
donde L es un grupo colesterilo.
15. La composición de la reivindicación 10,
donde R es isopropilo o 4-metoxifenilo.
16. La composición de la reivindicación 10,
donde el conjugado lípido-peptoide catiónico es de
la fórmula:
L-(CH_{2})_{n}-(C=O)-[N(CH_{2}CH_{2}NH_{2})CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)-N(CH_{2}CH_{2}R)CH_{2}(C=O)]_{3}-NH_{2}.
donde
L se selecciona de (i) un grupo
fosfatidiletanolamino, que tiene cadenas alquilo o alquenilo grasas
de entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y
(ii) un grupo colesterilo unido al segmento
-(CH_{2})_{n}- adyacente por un enlace éster, amida o
carbamado; n es 1-5; y R se selecciona entre
isopropilo y 4-metoxifenilo.
17. La composición de la reivindicación 16,
donde el conjugado lípido-peptoide catiónico es
seleccionado del grupo consistente en los compuestos representados
aquí como:
(a) Lipitoide 1, o DMPE
(NaeNmpeNmpe)_{3};
(b) Lipitoide 2,
DMPE(NaeNiaNia)_{3};
(c) Colesteroide 1, o
Col-\beta-ala(NaeNmpeNmpe)_{3};
(d) Colesteroide 2, o
Col-Ahx-(NaeNmpeNmpe)_{3};
(e) Colesteroide 3, o
Col-\beta-ala(NaeNiaNia)_{3};
y
(f) Colesteroide 4, o
Col-Ahx-(NaeNiaNia)_{3}.
18. Uso de un oligonucleótido quimérico tal como
se ha citado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es
eficaz para hibridar específicamente con toda o parte de una
secuencia de ácido nucleico diana seleccionada obtenida del gen,
para la fabricación de un medicamento para su uso en la inhibición
de la expresión del gen diana en un sujeto.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18,
donde la secuencia del ácido nucleico diana es un ARNm obtenido del
gen diana.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 19,
donde el segmento X^{1}-Y-X^{2}
del oligonucleótido quimérico tiene una secuencia nucleotídica
seleccionada del grupo consistente en SEQ ID Nos:
1-24.
21. Uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, donde el medicamento incluye un conjugado
lípido-peptoide catiónico tal como se ha citado en
una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.
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