ES2303736T3 - Procedimiento para marcar un acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de fragmentación y marcaje de un ácido nucleico natural o sintético, que comprende las etapas siguientes: proporcionar una mezcla que contiene un ácido nucleico, un agente de marcaje que contiene un marcador detectable, un catalizador químico y por lo menos un catión metálico multivalente en una disolución sustancialmente acuosa, en el que el ácido nucleico es ARN o ARN que comprende por lo menos un nucleótido con tiofosfato y el catión multivalente es Sr2+, Ra2+, Pb2+, Cd2+, Fe2+, Ni2+, Ru3+, Cr3+, Ce3+, Eu3+, Tb3+, Tm3+, Yb3+ o Lu3+, y en el que el ácido nucleico es ADN o ADN que comprende por lo menos un nucleótido con tiofosfato y el catión multivalente es Mn2+, Zn2+, Be2+, Cr3+, Pb2+, In3+, Tb3+, Ce3+, Yb3+ o Ni2+; fragmentar químicamente el ácido nucleico utilizando el catalizador químico en la mezcla para producir una multiplicidad de fragmentos de ácido nucleico; y unir por lo menos un marcador a por lo menos uno de los fragmentos de ácido nucleico para producir un fragmento de ácido nucleico marcado de manera detectable.
Description
Procedimiento para marcar un ácido nucleico.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para marcar un ácido nucleico, y particularmente se
refiere a un procedimiento químico para fragmentar y marcar
simultáneamente ácidos nucleicos.
Existe un gran número de procedimientos para
marcar nucleótidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos (a los que
se hace referencia en la presente memoria mediante el término
polinucleótidos). Los polinucleótidos pueden marcarse o bien
durante la síntesis (por ejemplo, incorporando por lo menos un
nucleótido marcado) o añadiendo un marcador al polinucleótido tras
la síntesis. Por ejemplo, un procedimiento une el marcador a la
base, ya sea esta última una base natural o una base modificada. Un
segundo procedimiento une el marcador al azúcar, de nuevo ya sea un
azúcar natural o un azúcar modificado. Un tercer procedimiento une
el marcador al fosfato. A menudo, los procedimientos preferidos
unen el marcador a la base o al azúcar, porque los procedimientos
de este tipo resultan más convenientes y proporcionan más opciones
para el marcaje. Véanse, por ejemplo, los procedimientos dados a
conocer en los documentos
EP-A-0.329.198,
EP-A-0.302.175,
EP-A-0.097.373,
EP-A-0.063.879,
US-A-5.449.767,
US-A-5.328.824,
WO-A-93/16094,
DE-A-3.910.151 y
EP-A-0.567.841 en el caso de marcaje
de bases, o el documento
EP-A-0.286.898 en el caso de marcaje
de azúcares. La unión del marcador al fosfato es más compleja
porque los ácidos nucleicos son solubles en agua y la reactividad
del fosfato en una disolución acuosa es baja. No obstante, se han
descrito procedimientos de marcaje de fosfato en el documento
EP-A-0.280.058. En este
procedimiento, el marcador se une al fosfato, que está unido al
azúcar en las posiciones 3' y/o 5', para un desoxirribonucleótido,
y en las posiciones 2', 3' y/o 5' para un ribonucleótido. El
nucleótido marcado puede incorporarse al polinucleótido u
oligonucleótido durante la síntesis.
Sin embargo, el marcaje descrito en el documento
EP-A-0.280.058 no marca de manera
uniforme los ácidos nucleicos. La incorporación de los nucleótidos
marcados en los polinucleótidos no puede controlarse y depende de la
composición de los polinucleótidos sintetizados. Por tanto, algunos
polinucleótidos pueden contener un gran número de nucleótidos
marcados, mientras que otros pueden no contener ninguno. Como
resultado, la intensidad de la señal emitida por estos ácidos
nucleicos marcados no será uniforme, dificultando la interpretación
de los resultados cuando se detectan los ácidos nucleicos.
Otro procedimiento, descrito en el documento
US-A-5.317.098 se refiere a ácidos
nucleicos (por ejemplo, de 15 meros) que se marcan en sus extremos
5' utilizando imidazol y un brazo ligador. Además, se añade fosfato
a los ácidos nucleicos utilizando una cinasa, añadiendo así por lo
menos una etapa adicional. Cuando se utiliza este procedimiento
para marcar ácidos nucleicos más grandes, la actividad específica es
baja porque esta técnica sólo marca el extremo 5'.
En algunos casos, también resulta deseable la
fragmentación de un ácido nucleico marcado, tal como para aumentar
la cinética de hibridación del fragmento marcado con otro ácido
nucleico disminuyendo el tamaño del polinucleótido marcado. Por el
contrario, la hibridación que utiliza un polinucleótido marcado más
grande puede dar como resultado una pérdida cuantitativa y
cualitativa de la señal. La fragmentación de un polinucleótido
marcado también puede ser necesaria para reducir el impedimento
estérico.
El impedimento estérico puede resultar de la
longitud del ácido nucleico y de la existencia de estructuras
secundarias. La fragmentación ayuda a eliminar estas estructuras y,
por tanto, optimiza la hibridación. El impedimento estérico
desempeña un papel particularmente importante en la hibridación con
superficies que contienen una alta densidad de sondas de captura,
por ejemplo, en matrices de alta densidad de sondas como se producen
en los "chip de ADN" (GENECHIP®; Affymetrix, Santa Clara, CA,
US; (Chee et al., 1996, Science 274:610-614;
Caviani Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:5022-5026; US nº 5.445.934; US nº 5.744.305;
Ramsay, 1998, Nature Biotechnol. 16:40-44; Ginot,
1997, Human Mutation 10:1-10; Cheng et al.,
1996, Molec. Diagnosis 1(3):183-200; Livache
et al., 1994, Nucl. Acids Res. 22(15):
2915-2921; Cheng et al., 1998, Nature
Biotechnol. 16: 541-546; US nº 5.525.464, US nº
5.202.231, US nº 5.807.522 y US nº 5.700.637).
En la técnica se conocen procedimientos para
fragmentar ácidos nucleicos. Por ejemplo, la fragmentación puede
ser enzimática (es decir, mediante nucleasas tales como ADNasas o
ARNasas). Esto genera pequeños fragmentos que presentan extremos
3'-OH, 5'-OH,
3'-fosfato y 5'-fosfato.
Alternativamente, la fragmentación puede ser química. Por ejemplo,
para ADN, es posible eliminar las purinas o eliminar las pirimidinas
del ADN, que entonces se fragmenta en presencia de una base (es
decir, "\beta-eliminación"). El ADN puede
fragmentarse mediante mecanismos de oxidación, alquilación o de
adición por radicales libres. Se utilizan metales catiónicos, que
se combinan a menudo con moléculas orgánicas que pueden funcionar
como catalizadores químicos, por ejemplo imidazol, para fragmentar
el ARN. Esta fragmentación se lleva a cabo preferentemente en un
medio alcalino y genera fragmentos que presentan extremos
3'-fosfato. Se han descrito fragmentaciones de
ácidos nucleicos, que utilizan iones mercúricos o plata en
condiciones suaves (Mag et al., 1991, Nucleic Acid Research,
19(7), 1437-1441), que seleccionan como diana
enlaces 5'-fosforotioato de puente específicos de
oligo(desoxi)nucleótidos modificados.
Se han descrito diferentes técnicas de
fragmentación de ácidos nucleicos en Trawick et al., 1998,
Chem Rev. 98: 939-960 y Oivanen et al.,
1998, Chem Rev. 98: 961-990.
Se describe un procedimiento para fragmentar y
marcar ARN en el documento
WO-A-88/04300, en el que se lleva a
cabo la fragmentación utilizando ARN que presenta propiedades
enzimáticas (ribozimas). La fragmentación por ribozimas libera un
extremo (5') HO de ácido nucleico y un extremo (3')
HO-PO_{2} de ácido nucleico. Entonces se efectúa
el marcaje radiactivo incorporando un fosfato radiactivo, derivado
de GTP, en el extremo 5'OH; no se utiliza ningún fosfato que
resulte de la fragmentación en el marcaje. La fragmentación llevada
a cabo por ribozimas supone una especificidad entre las ribozimas y
los ácidos nucleicos diana que van a escindirse, tras lo cual el
fosfato actúa como el marcador. Se ha dado a conocer la
fragmentación selectiva de ARN que contiene por lo menos un par de
bases fluctuante G-U mediante una reacción de
fotooxidación en presencia de la acción de metales divalente
(documento EP 0 801 072 A2).
Las pruebas de diagnóstico fiables basadas en
técnicas de amplificación de ácidos nucleicos a menudo incluyen
etapas para controlar la contaminación por ácidos nucleicos que en
otro caso sirven como dianas para amplificación adicional. Se han
desarrollado varios procedimientos de descontaminación (Longo et
al., 1990, Gen. 93: 125-128; Abravaya et
al., en Nucleic Acid Amplification Technologies, págs.
125-133; (1997) Eds. Lee et al. (Eston
Publishing, 1997) en las págs. 125-133; documento EP
0 709 468 A1 y patente US nº 5.605.796). Estos procedimientos hacen
que el producto de ácido nucleico amplificado no pueda ser una diana
para amplificación adicional, generalmente degradando ácidos
nucleicos que en otro caso servirían como dianas (por ejemplo,
utilizando procedimientos con irradiación, endonucleasas, uracilo
ADN glicosilasa, modificación de cebadores o fotoquímicos). Algunos
de estos procedimientos son difíciles de poner en práctica, resultan
ineficaces o introducen etapas adicionales y/o compuestos tóxicos
en un procedimiento (por ejemplo, inactivación por UV, degradación
fotoquímica, modificación de cebadores). Los procedimientos
enzimáticos utilizan enzimas que resultan a menudo caras e
incompatibles con los tampones de detección y/o amplificación. Por
tanto, sigue existiendo una necesidad de procedimientos eficaces y
convenientes de eliminación de ácidos nucleicos diana.
Un aspecto de la presente invención es un
procedimiento de fragmentación y marcaje de un ácido nucleico
natural o sintético, que comprende las etapas que consisten en
proporcionar una mezcla que contiene un ácido nucleico, un agente
de marcaje que contiene un marcador detectable, un catalizador
químico y por lo menos un catión metálico multivalente en una
disolución sustancialmente acuosa; fragmentar químicamente el ácido
nucleico en la mezcla para producir una multiplicidad de fragmentos
de ácido nucleico; y unir por lo menos un marcador a por lo menos
uno de los fragmentos de ácido nucleico para producir un fragmento
de ácido nucleico marcado de manera detectable. En una forma de
realización del procedimiento, el ácido nucleico es ADN, ARN, un
polímero de ADN-ARN quimérico, ADN que comprende
por lo menos un nucleótido con tiofosfato o ARN que comprende por
lo menos un nucleótido con tiofosfato. En otra forma de realización,
los reactivos usados en las etapas de fragmentación y unión se
añaden a una mezcla de amplificación de ácido nucleico in
vitro. Según aún otra forma de realización, el por lo menos un
marcador se une a por lo menos un fosfato de los fragmentos de ácido
nucleico. El procedimiento puede comprender además la etapa que
consiste en tratar la mezcla tras las etapas de fragmentación y
unión para disminuir o eliminar el agente de marcaje no unido. En
una forma de realización, la etapa de tratamiento consiste en
añadir un agente extintor a la mezcla tras las etapas de
fragmentación y unión. Los agentes extintores preferidos incluyen
un pirofosfato, derivado de tiol, agente quelante, anión fosfato o
anión carbonato. En otra forma de realización, la etapa de
tratamiento separa físicamente el fragmento de ácido nucleico
marcado del agente de marcaje no unido en la mezcla tras las etapas
de fragmentación y unión. La etapa de tratamiento puede incluir
además añadir un ácido a la mezcla tras las etapas de fragmentación
y unión. Otra forma de realización de la etapa de tratamiento
incluye además añadir un agente quelante a la mezcla tras las
etapas de fragmentación y unión. En una forma de realización, la
etapa de tratamiento utiliza un disolvente orgánico para separar el
fragmento de ácido nucleico marcado del agente de marcaje no unido.
Son disolventes orgánicos preferidos 1-butanol,
2-butanol, alcohol isopentílico,
1-pentanol o ciclohexanol. En otra forma de
realización, la etapa de tratamiento separa el fragmento de ácido
nucleico marcado del agente de marcaje no unido utilizando
extracción en fase sólida de los fragmentos de ácido nucleico sobre
un soporte sólido. Preferentemente, el soporte sólido es perlas,
geles, resina de intercambio iónico, resina de fase inversa, matriz
de sílice o una membrana. En otra forma de realización, el fragmento
de ácido nucleico marcado se eluye del soporte sólido utilizando un
tampón que contiene betaína. Una forma de realización incluye una
etapa de tratamiento que precipita los fragmentos de ácido nucleico
marcados a temperatura ambiente a partir de una disolución que
contiene betaína, DTAB y ácido nucleico no marcado. Otra forma de
realización utiliza una etapa de tratamiento que diluye una mezcla
de amplificación de ácido nucleico in vitro. En una forma de
realización, las etapas de fragmentación y unión se realizan en una
única mezcla de reacción, mientras que en otra forma de
realización, las etapas de fragmentación y unión se efectúan en
etapas separadas. En las formas de realización preferidas, la etapa
de unión une un marcador a un tiofosfato interno o terminal o a un
fosfato interno o terminal. Preferentemente, el catalizador químico
es una base general seleccionada de entre el grupo constituido por
imidazol, un análogo sustituido de imidazol y un compuesto que
incluye un anillo de imidazol o un análogo sustituido de un anillo
de imidazol. Los catalizadores químicos preferidos se seleccionan
de entre el grupo constituido por N-metilimidazol,
MOPS, HEPES, PIPES y poliaminas bioorgánicas. Según el
procedimiento, el ácido nucleico es un ARN o ARN que comprende por
lo menos un nucleótido con tiofosfato y el catión metálico
multivalente es Sr^{2+}, Ba^{2+}, Pb^{2+}, Cd^{2+},
Fe^{2+}, Ni^{2+}, Ru^{3+}, Ce^{3+}, Eu^{3+}, Tb^{3+},
Tm^{3+}, Yb^{3+} o Lu^{3+}, o el ácido nucleico es ADN o ADN
que comprende por lo menos un nucleótido con tiofosfato y el catión
metálico multivalente es Mn^{2+}, Zn^{2+}, Be^{2+},
Cr^{3+}, Pb^{2+}, In^{3+}, Tb^{3+}, Ce^{3+}, Yb^{3-} o
Ni^{2+}. Las formas de realización preferidas del procedimiento
utilizan un catión metálico multivalente que es Mn^{2+},
Zn^{2+}, Tb^{3+} o Ce^{3+}. En las formas de realización
preferidas, la mezcla contiene el agente de marcaje en una
concentración de entre 0,1 mM y 4 mM, más preferentemente entre 0,1
mM y 1 mM. En las formas de realización preferidas, el agente de
marcaje está entre 0,3 mM y 0,55 mM. Preferentemente, la mezcla
contiene un agente de marcaje que contiene funciones reactivas de
haloacetamida o haluro de alquilo. Son agentes de marcaje preferidos
5-(bromometil)fluoresceína,
6-(bromometil)fluoresceína,
6-yodoacetamidofluoresceína o
5-yodoacetamidofluoresceína.
La presente invención incluye procedimientos
para fragmentar químicamente ácidos nucleicos y marcar
simultáneamente los fragmentos con un marcador detectable, tal como
un compuesto fluorescente. Los fragmentos marcados pueden
detectarse entonces mediante una variedad de procedimientos. Este
procedimiento es útil para preparar ácidos nucleicos marcados,
tales como fragmentos que van a unirse a sondas inmovilizadas o
sondas de detección. Este procedimiento puede limitar las señales
no específicas que resultan de la etapa de marcaje, particularmente
cuando se combina con etapas de purificación de ácidos nucleicos
utilizando cualquiera de entre una variedad de procedimientos.
Además, este procedimiento proporciona fragmentos de ácido nucleico
que están marcados de manera relativamente uniforme. El
procedimiento de fragmentación da como resultado fragmentos que son
de un tamaño óptimo para la hibridación con sondas de ácido
nucleico utilizadas en la detección de los ácidos nucleicos
fragmentados, haciendo así la etapa de detección más rápida y
eficaz.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para marcar un ácido nucleico natural o sintético,
caracterizado por las etapas de fragmentar un ácido nucleico
mediante procedimientos químicos y unir un marcador al ácido
nucleico fragmentado. El procedimiento puede incluir opcionalmente
el tratamiento de la mezcla de marcaje para disminuir la cantidad
de agente de marcaje en ella.
Por "ácido nucleico" se quiere decir ADN,
ARN o polímeros de ADN-ARN quiméricos
(monocatenarios, bicatenarios o parcialmente bicatenarios), y
moléculas de ácido nucleico compuestas parcial o completamente por
análogos de nucleótido o residuos abásicos que pueden estar
presente en la secuencia. El ADN o ARN puede purificarse a partir
de una fuente natural (por ejemplo, extraerse de una célula) o
prepararse sintéticamente (por ejemplo, mediante procedimientos de
síntesis químicos, enzimáticos u otros conocidos). En algunas formas
de realización, el ácido nucleico es ADN amplificado, ARN
amplificado una mezcla de los mismos, que puede incluir además por
lo menos un nucleótido con tiofosfato. Un fosfato puede ser un
fosfato terminal que está situado en el extremo 3' y/o el extremo
5' de los fragmentos de ácido nucleico, un fosfato interno o un
tiofosfato interno.
La expresión ácido nucleico incluye ARN y ADN
convencionales, así como análogos de los mismos. La "estructura
principal" de un ácido nucleico puede componerse de una variedad
de enlaces conocidos en la técnica, incluyendo uno o más de enlaces
azúcar-fosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico
(denominados en ocasiones "ácidos nucleicos peptídicos" tal
como se describen por Hydig-Hielsen et al.,
solicitud de patente PCT nº WO 95/32305), enlaces fosforotioato,
enlaces metilfosfonato o combinaciones de los mismos. Los restos de
azúcar del ácido nucleico pueden ser o bien ribosa o bien
desoxirribosa, o compuestos similares que presentan sustituciones
conocidas, tales como, por ejemplo, substituciones de
2'-metoxilo y substituciones de
2'-haluro (por ejemplo, 2'-F). Las
bases nitrogenadas pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U),
análogos conocidos de las mismas (por ejemplo, inosina o "I";
véase The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,
Adams et al., ed., 11ª ed., 1992), derivados conocidos de
bases púricas o pirimidínicas (por ejemplo,
N^{4}-metil-desoxiguanosina,
desaza o aza-purinas y desaza o
aza-pirimidinas, presentando las bases pirimidínicas
grupos sustituyentes en la posición 5 ó 6, presentando las bases
púricas un sustituyente alterado o de reemplazo en las posiciones
2, 6 u 8,
2-amino-6-metilaminopurina,
O^{6}-metilguanina,
4-tio-pirimidinas,
4-amino-pirimidinas,
4-dimetilhidrazin-pirimidinas y
O^{4}-alquil-pirimidinas; véase,
Cook, solicitud de patente PCT nº WO 93/13121) y residuos
"abásicos" en los que la estructura principal no incluye bases
nitrogenadas para uno o más residuos del polímero (patente US nº
5.585.481). Un ácido nucleico puede comprender sólo azúcares, bases
y enlaces convenciones que se encuentran en el ARN y ADN, o puede
incluir tanto componentes como sustituciones convencionales (por
ejemplo, bases convencionales ligadas a través de una estructura
principal de metoxilo o un ácido nucleico que incluye bases
convencionales y uno o más análogos de base).
Por "amplificación" se pretende hacer
referencia a cualquier procedimiento conocido para obtener múltiples
copias de una secuencia de ácido nucleico diana o su complemento o
fragmentos de los mismos. Los procedimientos de amplificación
conocidos incluyen, por ejemplo, amplificación mediada por
transcripción, amplificación mediada por replicasas, amplificación
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación
mediante reacción en cadena de la ligasa (LCR) y amplificación por
desplazamiento de cadena (SDA). La amplificación mediada por
replicasas utiliza moléculas de ARN autorreplicativo y una replicasa
tal como QB-replicasa (patente US nº 4.786.600;
solicitud de patente PCT nº WO 90/14439). La amplificación mediante
PCR se conoce bien y utiliza ADN polimerasa, cebadores y ciclación
térmica para sintetizar múltiples copias de las dos cadenas
complementarias de ADN o ADNc (por ejemplo, véanse las patentes US
nº 4.683.195, nº 4.683.203 y nº 4.800.159; Methods in Enzymology,
1987, Vol. 155: 335-350). La amplificación mediante
LCR utiliza por lo menos cuatro oligonucleótidos separados para
amplificar una cadena diana y su complementaria utilizando múltiples
ciclos de hibridación, ligamiento y desnaturalización (publicación
de solicitud de patente EP nº 0 320 308). La SDA es un procedimiento
en el que un cebador contiene un sitio de reconocimiento para una
endonucleasa de restricción de tal manera que la endonucleasa hará
una mella en una cadena de un dúplex de ADN hemimodificado que
incluye la secuencia diana, seguido por amplificación en una serie
de etapas de extensión de cebadores y desplazamiento de cadena
(Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:392-396; y patente US nº 5.422.252). La
amplificación asociada a transcripción en una realización preferida
de la presente invención. Sin embargo, resultará evidente para un
experto en la materia que los procedimientos de la presente
invención pueden utilizarse fácilmente con ácidos nucleicos
amplificados mediante cualquier procedimiento.
Por "amplificación mediada por
transcripción" o "amplificación asociada a transcripción" se
quiere decir cualquier tipo de amplificación de ácidos nucleicos
que utiliza una ARN polimerasa para producir múltiples transcritos
de ARN a partir de un molde de ácido nucleico (véanse las patentes
US nº 4.868.105 y nº 5.124.246, nº 5.130.238, nº 5.399.491 y nº
5.554.516, nº 5.437.990; y las solicitudes PCT nº WO 93/22461, WO
88/01302 y WO 88/10315, WO 94/03472 y WO 95/03430). La
amplificación asociada a transcripción utiliza generalmente una ARN
polimerasa, una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfato,
ribonucleósidos trifosfato y un oligonucleótido complementario
molde-promotor, y opcionalmente puede incluir uno o
más oligonucleótidos análogos. Se dan a conocer en detalle
procedimientos de amplificación mediada por transcripción (TMA)
preferidos en las patentes US nº 5.399.491 y nº 5.554.516 y las
solicitudes PCT nº WO 93/22461, WO 94/03472 y WO 95/03430.
La fragmentación química del ácido nucleico se
lleva a cabo utilizando por lo menos un catión metálico
multivalente, que se combina con un catalizador químico. Los
catalizadores químicos utilizados en el procedimiento de
fragmentación son los que actúan como una base general, incluyendo,
por ejemplo, imidazol, un análogo sustituido (por ejemplo,
N-metilimidazol), o un compuesto químico que incluye
un anillo de imidazol o un análogo sustituido de los mismos.
Catalizadores químicos adicionales que pueden usarse para la
fragmentación de ácidos nucleicos incluyen MOPS, HEPES, PIPES y
poliaminas bioorgánicas, tales como espermina, espermidina y
putrescina (Arkadiusz et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:
3931-3937).
En los procedimientos preferidos de la presente
invención, el ácido nucleico que va a fragmentarse es ARN y el
catión metálico multivalente es por lo menos uno de Sr^{2+},
Ba^{2+}, Pb^{2+}, Cd^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+}, Ru^{3+},
Ce^{3+}, Eu^{3+}, Lu^{3+}, Tb^{3+}, Tm^{3+} o Yb^{3+}.
En otras formas de realización en las que se fragmenta ARN, el
catión metálico multivalente preferido es por lo menos uno de
Eu^{2+}, Pb^{2+}, Ce^{3+}, Cr^{3+}, Tb^{3+} o
Yb^{3+}.
En los procedimientos preferidos de la presente
invención, el ácido nucleico que va a fragmentarse es ADN y el
catión metálico multivalente es por lo menos uno de Mn^{2+},
Zn^{2+}, Be^{2+}, Pb^{2+}, Ni^{2+}, Cr^{3+}, Ce^{3+},
In^{3+}, Tb^{3+} o Yb^{3+}. En otra forma de realización
preferida, el ácido nucleico que va a fragmentarse es ADN que
incluye por lo menos un nucleótido con tiofosfato, y el catión
metálico es Tb^{3+}.
Puede efectuarse la fragmentación química
adicional de ADN que contiene opcionalmente por lo menos un
nucleótido con tiofosfato utilizando agentes quelantes de metales
(Sentagne et al., 1992, J. Photochem. Photobiol. B. 16:
47-59), compuestos fotoactivables (Nadji, 1992, Am.
Chem. Soc. 112: 9266-9269) y agentes alquilantes
(Povsic et al., 1990, J. Am. Chem. Soc. 112:
9428-9430).
Por "marcaje" se hace referencia a la unión
de un marcador detectable a un ácido nucleico para generar una
señal detectable asociada con el ácido nucleico. El compuesto que
comprende el marcador es el agente de marcaje. Los marcadores
conocidos incluyen enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina) que
produce una señal por ejemplo, mediante colorimetría,
fluorescencia, luminescencia; cromóforos (por ejemplo, compuestos y
colorantes fluorescentes y luminescentes); grupos electrodensos que
son detectables mediante microscopía electrónica o midiendo
propiedades eléctricas; grupos detectables dependientes del tamaño
que pueden detectarse utilizando procedimientos ópticos o físicos;
y radionúclidos.
Los agentes de marcaje de la presente invención
incluyen compuestos que incluyen funciones reactivas de haluro de
alquilo (por ejemplo, bromoalquilo o bromometilo) y haloacetamida
(por ejemplo, grupo yodoacetimido). Tales agentes de marcaje
incluyen, por ejemplo, 5-(bromometil)fluoresceína,
6-(bromometil)fluoresceína,
6-yodoacetamidofluoresceína y
5-yodoacetamidofluoresceína. Los expertos en la
materia apreciarán que pueden utilizarse de manera equivalente
otros compuestos reactivos basándose en su reactividad química
conocida, tal como, por ejemplo, hidrazina, alcoxilamina, haluros
de alquilo o arilo y maleimida. Las concentraciones preferidas del
agente de marcaje están en el intervalo que presenta un límite
inferior de 0,01 mM y un límite superior de 10 mM, más
preferentemente en un intervalo que presenta un límite inferior de
0,1 mM y un límite superior de 4 mM. En algunas formas de
realización preferidas, el agente de marcaje se utiliza en un
intervalo de concentración de entre 0,1 mM y 1 mM, y en otras
formas de realización en un intervalo de concentración de entre 0,3
mM y 0,55 mM. Cuando el agente de marcaje es
5-(bromometil)fluoresceína, las etapas de fragmentación y
marcaje preferentemente se producen en presencia de Mn^{2+} a de
15 mM a 60 mM, imidazol en un intervalo entre 5 mM y 30 mM y a un
pH en un intervalo entre 6,8 y 7,2. En una forma de realización de
la presente invención, la fragmentación y el marcaje de los ácidos
nucleicos se efectúan en una mezcla de reacción, proporcionando
además un procedimiento para la inactivación de la diana,
eliminando la necesidad de una etapa tras la detección de
eliminación de cualquier ácido nucleico diana restante. Por
ejemplo, una molécula diana de ARN presente en la mezcla de reacción
de fragmentación y marcaje se degradaría a fragmentos cortos.
Una ventaja de la presente invención es que la
reacción de fragmentación y marcaje de ácidos nucleicos también
actúa como herramienta de descontaminación. Es decir, el
procedimiento fragmenta moléculas de ARN presentes en la mezcla de
amplificación eliminando así posibles dianas para la amplificación
adicional del sistema debido a que los fragmentos de ARN
fragmentado no pueden ser una diana para la amplificación
adicional.
En otra forma de realización de la presente
invención, se efectúan la fragmentación y el marcaje en dos etapas,
utilizando o bien el volumen completo de la reacción de
amplificación o una parte del mismo.
En otra forma de realización de la invención, se
incluye una etapa de tratamiento tras las etapas de fragmentación y
marcaje para disminuir o eliminar el agente de marcaje que no ha
reaccionado. Esta etapa limita o elimina las señales no específicas
que de otro modo resultarían de la presencia del marcador que no ha
reaccionado. Una etapa de tratamiento de este tipo puede suponer
añadir un compuesto extintor a la reacción de marcaje, o puede
suponer separar físicamente los fragmentos de ácido nucleico
marcados de los agentes de marcaje que no han reaccionado
utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos.
Un agente extintor es un compuesto que (1) forma
complejos solubles con los cationes metálicos en la mezcla de
reacción, (2) precipita los cationes metálicos a partir de la mezcla
de reacción o (3) reacciona con el agente de marcaje residual,
eliminándolo así eficazmente de la mezcla. Pueden formarse complejos
solubles, por ejemplo, utilizando un agente quelante tal como EDTA.
Pueden formarse complejos que pueden precipitar añadiendo aniones
pirofosfato. Pueden seleccionarse compuestos extintores fácilmente
por parte de un experto en la materia basándose en las
interacciones químicas habituales con los grupos reactivos
particulares implicados en la reacción de marcaje. Los agentes
extintores preferidos incluyen pirofosfato o derivados de tiol tales
como ditiotreitol, cisteína, glutatión, ácido mercaptosuccínico.
Alternativamente, o además de utilizar un agente extintor, la etapa
de tratamiento puede eliminar el marcador que no ha reaccionado
mediante procedimientos que separan físicamente el ácido nucleico
marcado del agente de marcaje no unido. La separación del marcador
no unido de los fragmentos de ácido nucleico marcados puede suponer
extraer el marcador que no ha reaccionado con por lo menos un
disolvente orgánico, tal como 1-butanol,
2-butanol, alcohol isopentílico,
1-pentanol o ciclohexanol. Un disolvente preferido
es 1-butanol. Otro procedimiento de extracción
preferido incluye acidificar la mezcla de marcaje antes de la
extracción con disolventes. Alternativamente, el disolvente orgánico
utilizado para la extracción se mezcla con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) antes de que se inicie el
procedimiento de extracción.
Según otra forma de realización, la etapa de
tratamiento no se lleva a cabo mediante la precipitación de
fragmentos de ácido nucleico en una mezcla de acetato de sodio e
isopropanol frío.
La purificación de fragmentos de ácido nucleico
marcados también puede efectuarse eliminando el marcador no unido
utilizando un procedimiento de extracción en fase sólida. El soporte
de fase sólida para un procedimiento de extracción de este tipo es
preferentemente perlas, resinas para filtración en gel (por ejemplo,
Sephadex^{TM}, Sephacryl^{TM} y BioGel^{TM}), geles o
membranas (por ejemplo, de nylon, nitrocelulosa, fibra de vidrio o
sílice). Los medios de extracción en fase sólida particularmente
preferidos incluyen resina para filtración en gel Sephadex^{TM}
G-50, membranas de sílice y perlas de sílice. Los
procedimientos de extracción en fase sólida se realizan
preferentemente utilizando una columna que contenga el soporte de
fase sólida y las disoluciones pueden moverse a través de la
columna utilizando flujo por gravedad, succión por vacío o presión
positiva tal como mediante centrifugación o el uso de una jeringa
unida a la parte superior de la columna. Antes de aplicar la mezcla
de la reacción de marcaje a un medio de fase sólida para la
extracción, se añade un agente quelante tal como EDTA a la mezcla.
En una forma de realización preferida, la fase sólida son perlas
paramagnéticas recubiertas con sílice y los fragmentos de ácido
nucleico marcados capturados se eluyen con betaína.
Los procedimientos de purificación en fase
sólida son rápidos, sencillos, eficaces y no utilizan disolventes
orgánicos. Además, debido a su límite en la capacidad de unión,
puede adaptarse el soporte sólido para eliminar los fragmentos
marcados en exceso que pueden producir saturación de la señal
durante la etapa de detección.
Los procedimientos adicionales o alternativos
para tratar la mezcla de marcaje para disminuir la cantidad del
agente de marcaje que no ha reaccionado incluyen precipitar los
ácidos nucleicos fragmentados en un tampón de solución salina que
contiene betaína, un derivado de sal de trialquilamonio tal como
DTAB (bromuro de dodeciltrimetilamonio) o CTAB (bromuro de
cetiltrimetilamonio) y ADN exógeno. La mezcla de marcaje también
puede diluirse para disminuir la concentración del agente de
marcaje que no ha reaccionado antes de la etapa de detección.
Aunque sin pretender limitarse a ningún
mecanismo particular, los presentes procedimientos de fragmentación
y marcaje de ácidos nucleicos pueden unir el marcador a un grupo
fosfato o un grupo tiofosfato en el ácido nucleico. Una unión de
este tipo puede producirse en un grupo fosfato o tiofosfato terminal
o interno en el polímero.
Estos procedimientos se ilustran mediante los
ejemplos siguientes, que muestran algunas formas de realización
preferidas de la presente invención.
Para producir ácidos nucleicos para la
fragmentación y el marcaje, se realizaron las siguientes reacciones
de amplificación de ácidos nucleicos. Estas reacciones utilizaron
dos fuentes diferentes de ácidos nucleicos como diana, una derivada
de Mycobacterium tuberculosis y la otra derivada del virus de
la inmunodeficiencia humana, VIH-1.
Se obtuvieron amplicones de ARNr 16S de
Mycobacterium tuberculosis utilizando amplificación mediada
por transcripción (TMA) (Kacian et al., patentes US nº
5.399.491 y nº 5.554.516; Kacian et al., solicitud de
patente PCT número WO 93/22461; McDonough et al., solicitud
de patente PCT nº WO 94/03472; y Ryder et al., solicitud de
patente PCT nº WO 95/03430). Se llevaron a cabo las reacciones de
amplificación utilizando 10^{6} copias de la diana de ARNr (16S
de M. tuberculosis) y los reactivos y procedimientos del kit
directo para Mycobacterium tuberculosis (MTD)
(Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA, US). Se dan
a conocer cebadores utilizados en TMA en una solicitud titulada
"Methods and Compositions for Detecting Mycobacterium
Species Using Nucleic Acid Amplification" que se presenta por
separado por los solicitantes el día previo a la fecha de
presentación de esta solicitud.
Brevemente, tras mezclar el ácido nucleico
diana, los cebadores y los sustratos de la amplificación, se incubó
la mezcla de amplificación a 42ºC durante 1 h. Se analizó el
producto de la TMA mediante electroforesis en un gel de
poliacrilamida al 6% que contiene urea 7 M y se visualizaron los
productos de amplicón separados tras tinción con bromuro de etidio,
para evaluar la cantidad y el tamaño de los productos mediante
comparación con un patrón de ARN en el gel.
Se prepararon amplicones de VIH utilizando una
reacción en cadena de la polimerasa, tal como se describe por Kozal
et al. (1996, Nature Med. 2 (7): 753-759).
Brevemente, se extrajo el ADN de 10^{6} células cultivadas
conjuntamente mediante, en primer lugar, el tratamiento de las
células con tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH
8,3, MgCl_{2} 2,5 mM, Tween^{TM}-20 al 0,45%,
KCl 50 mM, proteinasa K 0,1 mg/ml) durante 2 h a 56ºC.
Se utilizó un conjunto de reacciones de PCR
anidada para amplificar el ADN de VIH-1. La primera
reacción generó un amplicón de 1200 pb utilizando aproximadamente
1,0 \mug de ADN de entrada y los dos cebadores siguientes:
aattaaccctcactaaagggagaCAGAGCCAACAGCCCCACCA (SEC
ID nº: 1, en la que se muestra una secuencia promotora de ARN
polimerasa de T3 en minúsculas), y
taatacgactcactatagggagaTTTCCCCACTAACTTCTGTATGTCATTGACA
(SEC ID nº: 2, en la que se muestra una secuencia promotora de ARN
polimerasa de T7 en minúsculas). Se llevó a cabo la reacción de PCR
en una mezcla de reacción que contenía Tris-HCl 100
mM, pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, cada dNTP 0,2 mM,
cebadores 0,2 \muM (cada uno) y 1,25 unidades de Taq ADN
polimerasa. Se incubó la reacción a 94ºC durante 30 s, 55ºC durante
30 s, 72ºC durante 2 min. para 25 ciclos y 72ºC durante 10 min.
para el último ciclo.
La segunda reacción produjo una secuencia de 460
pb, interna con respecto a la primera secuencia amplificada,
utilizando el cebador de SEC ID nº: 1 tal como se usó en la primera
PCR y un tercer cebador que presenta la secuencia
taatacgactcactatagggagaGGGCCATCCATTCCTGGCTTTAATTT (SEC ID nº: 3). Se
incubó la reacción a 94ºC durante 30 s, 63ºC durante 30 s, 72ºC
durante 1 min. para 30 ciclos, y 72ºC durante 10 min. para el último
ciclo. Se transcribieron los productos de la PCR utilizando 20 U de
ARN polimerasa de T3 o T7 en una reacción in vitro que
contenía Tris-Ac_{2} 40 mM, pH 8,1, Kac 100 mM,
MgAc_{2} 30 mM, DTT 10 mM y rNTP 1,25 mM.
Se evaluó la cantidad y el tamaño de los
productos en un gel tal como se describió anteriormente.
Para reacciones de marcaje, se utilizaron
amplicones de ARN sin purificación adicional.
Se obtuvieron imidazol y MnCl_{2} de
Sigma-Aldrich Chimie (St Quentin Fallavier, Francia)
y se adquirió 5-(bromo-
metil)fluoresceína de Molecular Probes (Eugene, OR, US, referencia B 1355).
metil)fluoresceína de Molecular Probes (Eugene, OR, US, referencia B 1355).
Se prepararon amplicones de ARNr 16S tal como se
describió en el ejemplo 1. Cada reacción de marcaje (100 \mul)
incluyó: moléculas de ARN (5 \mul de mezcla de reacción de TMA), 6
\mul de imidazol (0,1 M), 6 \mul de MnCl_{2} (1 M), 2 \mul
de 5-(bromometil)fluoresceína (50 mM disuelta en DMF) y 81
\mul de agua pura. Se mezclaron las reacciones y se incubaron a
65ºC durante 30 min.
Se hibridó el producto, se detectó y se analizó
en una matriz de sondas inmovilizadas sobre un chip de ADN
(GENECHIP®) utilizando el protocolo del fabricante (Affymetrix,
Santa Clara, CA, US.). Este chip de ADN está diseñado para la
detección y el solapamiento 4-L de ARNr 16S de M.
tuberculosis (región 213-415 de la secuencia
M20940 de "Genbank", tal como se describe en Troesch et
al., 1999, J. Clin. Microbiol. 37(1):
49-55). Los resultados, obtenidos utilizando
funciones disponibles en el software GENECHIP® (Affymetrix),
incluyeron lo siguiente: BC: lectura de bases de nucleótidos
(expresada en porcentaje); S: intensidades medias de señal para
células con matriz de sondas (expresadas en unidades relativas de
fluorescencia: URF); B: intensidades medias del fondo (expresadas
en URF); y S/B : razón de señal con respecto a fondo. Para este
ensayo, se logró una lectura de bases del 96,2% con una señal media
de 5488 URF y un fondo de 2420 URF, para dar una razón S/B de
2,3.
Este resultado muestra que pueden obtenerse una
lectura de bases y una intensidad de señal útiles utilizando sólo
el 5% de los amplicones generados en una única reacción de
amplificación. Sin embargo, la razón S/B fue relativamente
baja.
En otros experimentos, se sometieron a prueba
volúmenes de las mezclas de fragmentación y marcaje menores. En
estos experimentos, se prepararon los amplicones de ARNr 16S tal
como se describió en el ejemplo 1 utilizando amplificación mediante
TMA. Se prepararon entonces reacciones de marcaje de 25 \mul y 50
\mul. Las reacciones de 25 \mul contenían: moléculas de ARN (5
\mul de mezcla de reacción de TMA), 1,5 \mul de imidazol (0,1
M), 1,5 \mul de MnCl_{2} (1 M), 2 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (50 mM en DMF) y 15 \mul de agua
pura. Las reacciones de 50 \mul contenían: moléculas de ARN (5
\mul de mezcla de reacción de TMA), 3 \mul de imidazol (0,1 M),
3 \mul de MnCl_{2} (1 M), 2 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (50 mM en DMF) y 37 \mul de
agua pura. Se mezclaron ambos volúmenes y se incubaron a 65ºC
durante 30 min.
Tras la incubación, se añadió agua pura a cada
mezcla para llevar el volumen final hasta 100 \mul. Entonces, se
hibridaron los productos de la reacción de marcaje, se detectaron y
se analizaron sobre un chip de ADN utilizando el protocolo del
fabricante (GENECHIP®, Affymetrix, Santa Clara, CA, US.), utilizando
el chip de ADN de solapamiento 4-L tal como se
describió anteriormente.
Los resultados se muestran a continuación.
Estos resultados muestran que las reacciones de
marcaje pueden realizarse en volúmenes menores sin afectar a la
lectura de bases o los niveles de intensidad.
Para aumentar la razón S/B, se incluyó una etapa
de purificación tras completarse la reacción de fragmentación y
marcaje. En la presente memoria, se utilizaron disolventes orgánicos
en un tampón de lavado para reducir la cantidad del agente de
marcaje no unido en la mezcla que se aplicó al chip de ADN para la
detección de los fragmentos de ARN marcados.
Se prepararon amplicones de ARNr 16S de M.
tuberculosis tal como se describió en el ejemplo 1. Se
realizaron la fragmentación y el marcaje de los amplicones en
reacciones de 25 \mul tal como se describió anteriormente. Tras
la fragmentación y el marcaje, se añadió agua pura para obtener un
volumen final de 100 \mul. Entonces, se hibridó el producto de
reacción, se detectó y se analizó sobre un chip de ADN tal como se
describió anteriormente, excepto porque los tampones de lavado
contenían o bien un 5% (v/v) de N,N-dimetilformamida
(DMF) o un 5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
Estos resultados se muestran a continuación.
Los resultados muestran que la adición de
disolventes orgánicos en los tampones de lavado reduce los niveles
de fondo, probablemente aumentando la solubilidad del marcador de
5-(bromometil)fluoresceína no unido en el tampón de lavado,
eliminándolo eficazmente de ese modo del chip de ADN. El porcentaje
de lectura de bases también fue superior en los ensayos que
incluyeron DMSO o DMF en los tampones de lavado.
Como otro procedimiento para mejorar la
detección sobre un chip de ADN, se incluyó una extracción de la
mezcla de reacción de fragmentación y marcaje con un disolvente
orgánico antes de la etapa de hibridación. La mezcla de reacción de
fragmentación y marcaje contenía: amplicones de ARNr 16S (50 \mul
de TMA), 15 \mul de imidazol (0,1 M), 15 \mul de MnCl_{2} (1
M), 5 \mul de 5-(bromometil)fluoresceína (50 mM en DMSO) y
agua pura añadida para un volumen final de 250 \mul. Se mezcló la
mezcla de reacción y se incubó a 65ºC durante 30 min.
Entonces, se extrajeron 100 \mul de la mezcla
de reacción utilizando 900 \mul de 1-butanol
saturado con agua. Tras la adición de 1-butanol, se
mezcló con vórtex de manera vigorosa la disolución y se centrifugó
para separar las fases acuosa y orgánica. Se mezclaron 100 \mul de
la fase acuosa con 700 \mul de tampón de hibridación (5X SSPE,
betaína 3 M, DTAB 5 mM, ADN de salmón 250 \mug/ml) y se realizó la
hibridación sobre el chip de ADN tal como se describió
anteriormente. Utilizando este procedimiento, la BC fue del 98,4%,
la señal fue de 2131 URF y el fondo fue de 314 URF, dando como
resultado una razón S/B de 6,8. Estos resultados muestran que se
redujo el nivel de fondo mediante la utilización de una extracción
con disolventes orgánicos tras la reacción de fragmentación y
marcaje, sin pérdida del porcentaje de lectura de bases.
Para determinar si podrían usarse de manera
simular reacciones de mayor volumen, se utilizó un volumen de
reacción de TMA completo de 100 \mul. En este caso, los reactivos
de marcaje se añadieron directamente al tubo de la reacción de TMA
tal como se expone a continuación. A la reacción de TMA (100 \mul)
se le añadieron: 15 \mul de imidazol (0,1 M), 15 \mul de
MnCl_{2} (1 M), 5 \mul de 5-(bromometil)fluoresceína (50
mM en DMF) y agua pura hasta un volumen final de 250 \mul. Se
mezcló el medio de reacción y se incubó a 65ºC durante 30 min.
Alternativamente, se realizó el mismo protocolo,
seguido por una purificación con 1-butanol realizada
sustancialmente tal como se describió anteriormente. Entonces, para
ambos procedimientos (es decir, con y sin extracción con
disolventes orgánicos), se hibridaron 100 \mul del producto de
reacción, se detectó y se analizó sobre un chip de ADN tal como se
describió anteriormente. Estos resultados se muestran a
continuación.
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Este protocolo permitió la fragmentación y el
marcaje de los amplicones sin una etapa de transferencia adicional
de los amplicones a otro tubo dado que se añadieron los reactivos de
marcaje al tubo de TMA tras la amplificación.
Se realizaron ensayos similares utilizando
amplicones de VIH-1 producidos tal como se describió
en el ejemplo 1. Estas reacciones de fragmentación y marcaje (250
\mul) contenían: amplicones de ARN de proteasa de
VIH-1 (50 \mul), 15 \mul de imidazol (0,1 M),
15 \mul de MnCl_{2} (1 M), 5 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (100 mM en DMSO) y 165 \mul de
agua pura; y se mezclaron y se incubaron a 60ºC durante 30 min. Para
la extracción con disolventes orgánicos, se realizaron dos
extracciones utilizando 1-butanol, tal como se
describió anteriormente, utilizando 250, 300, 400 ó 1.000 \mul de
butanol por extracción. Entonces se hibridó el producto de reacción,
se detectó y se analizó sobre un chip de ADN tal como se describió
anteriormente, utilizando un chip de ADN para la detección del gen
de la proteasa de VIH-1 (Kozal et al., 1996,
Nature Med. 2(7): 753-758). Los resultados,
mostrados a continuación, indican que dos extracciones con
disolventes orgánicos disminuyeron sustancialmente el fondo para
todos los volúmenes utilizados.
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Se modificó este protocolo añadiendo EDTA (10
mM) a la mezcla de reacción de fragmentación y marcaje antes de la
etapa de extracción con 1-butanol. Esta adición
aumentó la solubilidad de los fragmentos de ARN marcados y evitó la
precipitación producida por los iones metálicos Mn^{2+}. Tal como
se muestra a continuación, la adición de EDTA mejoró la etapa de
detección tanto para BC como aumentando la razón S/B.
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Además del 1-butanol, también se
sometieron a prueba otros disolventes orgánicos utilizando
procedimientos de extracción similares, con amplicones de ARNr 16S
como el ácido nucleico diana para la fragmentación y el marcaje. Se
muestran a continuación los resultados para cada disolvente, que
muestran que puede utilizarse una variedad de disolventes orgánicos
para eliminar eficazmente el agente de marcaje no unido.
Como alternativa a la extracción con disolventes
orgánicos del marcador no unido, también se sometió a prueba la
precipitación de los fragmentos de ácido nucleico marcados y
fragmentados. En este experimento, se prepararon amplicones de
VIH-1 tal como se describió en el ejemplo 1. Cada
reacción incluyó: amplicones de ARN (50 \mul), 6 \mul de
imidazol (0,1 M), 6 \mul de MnCl_{2} (1 M), 2 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (50 mM en DMSO) y agua pura hasta
un volumen final de 100 \mul; se incubó la disolución mezclada a
65ºC durante 30 min. Para las reacciones control en las que no
precipitó el ARN fragmentado, se realizaron las etapas de
hibridación y detección tal como se describió anteriormente
utilizando el chip de ADN específico de VIH-1. Para
las reacciones experimentales que incluían una etapa de
precipitación, se realizó la etapa de precipitación antes de la
hibridación sobre el chip. Para la precipitación, se mezcló la
mezcla de reacción con 700 \mul de tampón de hibridación (5X
SSPE, betaína 3 M, DTAB 5 mM, ADN de esperma de salmón 25 \mug/ml)
a temperatura ambiente mediante agitación con vórtex. Se sedimentó
el precipitado y se eliminó el sobrenadante. Se resuspendió el
sedimento en 500 \mul del tampón de hibridación y se realizaron la
hibridación, detección y análisis sobre el chip de ADN específico
de VIH-1 tal como se describió anteriormente.
Los resultados se muestran a continuación para
ambos procedimientos.
Sin precipitación, la intensidad de la señal fue
alta pero la razón S/B fue baja (1,5); con precipitación, disminuyó
el fondo y aumentó la razón S/B.
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En este ejemplo, se separaron físicamente
fragmentos marcados, tras la fragmentación y el marcaje de ácidos
nucleicos, del marcador no unido utilizando extracción en fase
sólida.
El reactivo de fase sólida utilizado fueron
perlas magnéticas de sílice. El ácido nucleico diana eran amplicones
de ARNr 16S, preparados tal como se describió en el ejemplo 1. La
reacción incluyó: 50 \mul de mezcla de reacción de TMA, 9 \mul
de imidazol (0,1 M), 9 \mul de MnCl_{2} (1 M) y 3 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (100 mM en DMSO) que se mezclaron
y se incubaron a 60ºC durante 30 min.
Se realizó la extracción en fase sólida
utilizando reactivos disponibles comercialmente, el paquete de
iniciadores del sistema de purificación de ADN de plásmido Wizard
PureFaction^{TM} (Promega, Madison, WI, USA). En este
procedimiento, se mezcló la reacción de fragmentación y marcaje con
25 \mul de partículas paramagnéticas MagneSil y 1 ml de
disolución de lavado 4/40, se agitó de manera vigorosa (mediante
vórtex) y entonces se puso el tubo sobre un soporte de imán para
mantener las perlas magnéticas en el lateral del tubo. Se lavaron
las perlas utilizando 1 ml de etanol al 80% y se eluyeron los
fragmentos de ARN marcados utilizando 100 \mul de
Tris-Cl 10 mM, pH 8,5. Se hibridó el eluato, se
detectó y se analizó sobre un chip de ADN tal como se describió
anteriormente. Se muestran a continuación, los resultados de este
procedimiento de purificación, en comparación con los obtenidos
utilizando la extracción con 1-butanol.
Estos resultados muestran que la extracción en
fase sólida utilizando perlas de sílice reduce el fondo y aumenta
el valor de S/B.
En un experimento separado, se realizó una
extracción en fase sólida con perlas de sílice similar pero se
realizó la elución utilizando betaína (5 M disuelta en tampón de
hibridación, 300 \mul). Entonces se realizó la hibridación sobre
un chip de ADN tal como se describió anteriormente, utilizando
tampón de hibridación sin betaína. Cuando se hibridaron los
fragmentos marcados eluidos con betaína, la BC fue del 99,5%, la
señal fue de 2424 URF, el fondo fue de 170 URF y la S/B fue de
14,3.
En un experimento separado, se utilizó una
membrana de sílice en lugar de las perlas magnéticas de sílice para
la purificación tras el marcaje. En este experimento, se realizó la
reacción de fragmentación y marcaje utilizando amplicones de ARNr
16S en un volumen de reacción de 100 \mul tal como se describió en
el ejemplo 2, y se realizó la purificación tras el marcaje
utilizando una membrana de sílice (kit de eliminación de nucleótidos
QIAQUICK^{TM}, Qiagen, Hilden, Alemania). Para la purificación,
se añadieron 0, 15 ó 75 \mul de EDTA 0,5 M y 685 \mul de tampón
PN a la mezcla de reacción y se agitó con vórtex de manera vigorosa
la disolución. Entonces se trató una muestra siguiendo el protocolo
del fabricante. Se hibridó el eluato, se detectó y se analizó sobre
un chip de ADN tal como se describió anteriormente.
Se muestran a continuación los resultados de
este procedimiento de purificación, en comparación con los obtenidos
utilizando una extracción con 1-butanol, que
muestran que la purificación con membrana de sílice es comparable a
la extracción del marcador no unido utilizando un disolvente
orgánico si se incluyó EDTA en la mezcla purificada mediante el
procedimiento con membrana de sílice.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron procedimientos de purificación con
membrana de sílice similares en un experimento separado pero se usó
la elución con betaína (5 M) a partir de una membrana de sílice para
recuperar los fragmentos de ARN marcados, sustancialmente tal como
se describió anteriormente. En este ensayo, la BC fue del 94,6%, la
señal fue de 15836 URF, el fondo fue de 502 URF y la razón S/B fue
de 31,5.
Se realizó un procedimiento de purificación
adicional utilizando un kit de purificación de PCR con tampón PN y
un sistema de vacío (sistema QIAVAC^{TM} 6S) para sacar los
materiales a través de la columna (Qiagen, Hilden, Alemania). En
este ensayo, se fragmentaron amplicones de ARNr 16S y se marcaron
tal como se describió en el ejemplo 2 y se añadieron a continuación
15 \mul de EDTA 0,5 M y 685 \mul de tampón PN a la mezcla de
reacción, se agitó con vórtex de manera vigorosa la disolución y se
procesó siguiendo el protocolo del fabricante. Se lavó la columna
con 1 ml de tampón PE y se eluyeron los fragmentos de ácido nucleico
marcados, se hibridaron, se detectaron y se analizaron sobre un
chip de ADN tal como se describió anteriormente.
El procedimiento de purificación con
QIAVAC^{TM} produjo una lectura de bases del 100%, una señal de
15.984 URF, un fondo de 390 URF y una razón S/B de 41. En
comparación, los fragmentos marcados y escindidos de manera similar
que se purificaron utilizando extracción con
1-butanol produjeron una lectura de bases del 94,6%,
una señal de 7390 URF, un fondo de 294 URF y una razón S/B de
25,1.
Protocolos de extracción en fase sólida
adicionales utilizaron resinas para filtración en gel en el formato
de columna de centrifugación pequeña (se sometieron a prueba las
resinas SEPHADEX^{TM}, SEPHACRYL^{TM} y BIOGEL^{TM}). Estas
resinas permiten que se eluyan selectivamente moléculas mayores (es
decir, los fragmentos de ácido nucleico marcados), mientras que
retienen las moléculas más pequeñas (el agente de marcaje que no ha
reaccionado y otros componentes de la mezcla). El ácido nucleico
utilizado para las pruebas en estos ensayos fueron amplicones de
ARNr 16S preparados sustancialmente tal como se describió en el
ejemplo 1, que se sometieron a continuación a fragmentación y
marcaje sustancialmente tal como se describió en el ejemplo 2. El
procedimiento general fue equilibrar una columna de centrifugación
disponible comercialmente que contenía una resina para filtración
en gel (por ejemplo, una columna de centrifugación de
SEPHADEX^{TM} G-50 de Pharmacia) con un volumen
de 400 \mul de un tampón (por ejemplo, tampón
Tris-azida, pH 7,4) aplicando el tampón y entonces
eluyéndolo mediante centrifugación (1000 x g durante 1 min.),
repitiendo el procedimiento y finalmente humectando la resina con
400 \mul adicionales del mismo tampón. Entonces, se aplicó una
mezcla de reacción de 100 \mul a la columna preparada y se
eluyeron los fragmentos de ácido nucleico marcados centrifugando la
columna a 1.000x g durante 1 min.
Para obtener una recuperación eficaz de los
fragmentos de ácido nucleico marcados a partir de una mezcla de la
reacción de marcaje, se añadió EDTA (de 25 mM a 125 mM) y se mezcló
con la mezcla de la reacción de marcaje antes de que se aplicara a
la resina para filtración en gel, para la purificación. Se
observaron una recuperación y detección óptimas (sobre un chip de
ADN, evaluadas mediante la razón S/B) cuando la concentración de
EDTA fue de 25 mM o 50 mM; a concentraciones de EDTA de 75 mM y
superiores, aumentó el fondo sobre el chip de detección.
Normalmente, se añadió EDTA 50 mM a la mezcla de marcaje antes de
aplicarse a la resina para filtración en gel.
Se demostró la eficacia de este procedimiento de
purificación utilizando este procedimiento básico para purificar
fragmentos marcados obtenidos a partir de amplicones de ARNr 16S,
tal como se describió anteriormente. Entonces se detectaron los
fragmentos marcados purificados ("purificados + EDTA") tras
aplicarlos a un GENECHIP® específico de Mycobacterium
sustancialmente tal como se describió en el ejemplo 2. Para
comparación, también se aplicó el mismo tipo de fragmentos marcados
obtenidos directamente a partir de una reacción de fragmentación y
marcaje, sin purificación mediante filtración en gel ("no
purificados") y se analizó utilizando el mismo procedimiento con
chip de ADN. También, para comparación, se realizó el ensayo
utilizando el mismo tipo de fragmentos marcados que se purificaron
mediante filtración en gel pero sin añadir EDTA ("purificados -
EDTA") a la mezcla de marcaje antes de aplicarla a la columna.
Se muestran a continuación los resultados de estos análisis con chip
de ADN.
Estos resultados muestran que la purificación
mediante filtración en gel, en presencia de EDTA 50 mM, es un
procedimiento rápido y eficaz para proporcionar fragmentos de ácido
nucleico marcados que pueden detectarse fácilmente sobre una matriz
de sondas de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, se utilizaron cantidades
diferentes de agente de marcaje en la reacción de fragmentación y
marcaje para determinar si la concentración de agente de marcaje
afecta al ensayo. Se prepararon amplicones de ARNr 16S tal como se
describió en el ejemplo 1. Cada una de las reacción incluyó: ARN (50
\mul de TMA), 9 \mul de imidazol (0,1 M), 9 \mul de
MnCl_{2} (1 M), cantidades variables de
5-(bromometil)fluoresceína (50 mM en DMF) para obtener
concentraciones finales de 1 mM (3 \mul), 2 mM (6 \mul) o 4 mM
(12 \mul) y agua pura para obtener un volumen final de 150
\mul. Se mezcló la mezcla y se incubó a 60ºC durante 30 min. Se
purificó entonces la mezcla de la reacción de marcaje utilizando
extracción con 1-butanol tal como se describió
anteriormente y se hibridaron 100 \mul del producto purificado, se
detectó y se analizó sobre un chip de ADN tal como se describió en
el ejemplo 2. Se notifican a continuación los resultados, que
muestran que todas las concentraciones sometidas a prueba del
agente de marcaje marcaron de manera eficaz el ARN fragmentado. Se
produjo una mayor señal para las mayores concentraciones de agente
de marcaje, sin un aumento significativo en el nivel de fondo.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se ajustó el pH del
reactivo de imidazol hasta 6, 6,8 y 7,0 para su utilización en las
reacciones de fragmentación y marcaje que contenían: amplicones de
ARNr 16S (50 \mul de reacción de TMA), 45 \mul de una mezcla de
imidazol con el pH ajustado (20 mM) y MnCl_{2} (200 mM), 5 \mul
de 5-(bromometil)fluoresceína (100 mM en DMSO) y agua pura
hasta un volumen final de 150 \mul. Se mezclaron las reacciones y
se incubaron a 60ºC durante 30 min. Se realizaron entonces la
hibridación, detección y análisis sobre un chip de ADN tal como se
describió en el ejemplo 2. Se muestran a continuación los resultados
para las diferentes condiciones de pH de las reacciones. Basándose
en estos resultados, todas las condiciones de pH sometidas a prueba
produjeron fragmentos marcados de manera detectable que
proporcionaron lecturas de bases del 98% o más; el pH 7,0 parece
ser el óptimo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra las eficacias relativas del
marcaje con fluoresceína de diferentes oligonucleótidos
monocatenarios, utilizando diferentes agentes de marcaje y cationes
metálicos multivalentes en las reacciones de fragmentación y
marcaje. Se compararon el marcaje de ADN, ADN que contiene un
nucleótido con tiofosfato interno y ADN que presenta un
3'-tiofosfato con 5-(bromometil)fluoresceína
y 6-yodoacetamidofluoresceína en presencia o
ausencia de diferentes cationes metálicos.
Los oligonucleótidos usados en los experimentos
de fragmentación y marcaje fueron los siguientes:
GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT (SEC ID nº: 4);
GCTCGTTGCGGGACTT-s-AACCCAACAT
(SEC ID nº: 5) en la que "-s-" indica un tiofosfato entre los
nucleótidos en las posiciones 16 y 17; y
GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-s
(SEC ID nº: 6) en la que "-s-" indica a
3'-tiofosfato terminal.
El tampón para la reacción fue tampón
Tris-HCl, pH 8,1, y los diferentes cationes
metálicos multivalentes fueron: Zn^{2+}, Mn^{2+}, Co^{2+},
Ni^{2+}, Cd^{2+}, Pb^{2+}, Ce^{3+}, Tb^{3+}, Yb^{3+},
Cr^{3+}, In^{3+}, Be^{2+}, Sn^{2+}, Rb^{+} y Cs^{+}
(todos en disolución con contraiones Cl^{-}). El control negativo
que no contenía cationes multivalentes era un volumen equivalente de
agua pura. Los agentes de marcaje, disueltos en
N,N-dimetilformamida (DMF) seca, fueron:
5-(bromometil)fluoresceína y
6-yodoacetamidofluoresceína (Molecular Probes,
Inc., Eugene, OR, US). Generalmente, se añadieron los compuestos
disueltos en DMF a mezclas de reacción de tal manera que la
concentración final de DMF en la mezcla era del 5% (v/v).
La reacción de fragmentación y marcaje típica
(100 \mul) contenía (con las concentraciones finales indicadas
entre paréntesis para cada componente): 30 \mul de oligonucleótido
(6,667 DO/ml; 0,2 DO = 0,00932 mM), 50 \mul de tampón
Tris-HCl 100 mM (50 mM), 10 \mul de catión
metálico 10 mM (1 mM) o H_{2}O pura y 10 \mul de reactivo de
marcaje 2,5 mM en DMF (0,25 mM). Se mezcló la mezcla de reacción
mediante agitación con vórtex y se incubó a 60ºC durante 30 min. Se
purifican los productos marcados añadiendo a la mezcla de la
reacción de marcaje 10 \mul de acetato de sodio 3 M, pH 5,0,
entonces 150 \mul de 1-butanol saturado con agua y
mezclando mediante agitación con vórtex. Tras separarse las fases,
se retiró la fase acuosa (113 \mul) hasta un tubo limpio al que
se añadieron 400 \mul de etanol y se agitó con vórtex la
disolución y se incubó sobre hielo seco durante 15 min. Se
centrifugó la mezcla 15 min. a 14.000 rpm, se eliminó el
sobrenadante y se lavó el sedimento con 100 \mul de etanol al 70%
frío. Se resuspendió el sedimento en 500 \mul de tampón carbonato
de sodio 100 mM, pH 9,5. Se midieron los productos (ADN marcado y
ADN no marcado) utilizando espectroscopía UV o HPLC de fase inversa
e integración de picos.
Se resumen los resultados de estos experimentos
en la tabla 1 para el marcaje de los oligonucleótidos de SEC ID nº:
5 y SEC ID nº: 6 con 5-(bromometil)fluoresceína
("5-BMF") y
6-yodoacetamidofluoresceína
("6-IA-F") en presencia de 15
cationes metálicos multivalentes.
Se potenció el marcaje del ADN que contenía un
tiofosfato interno (SEC ID nº: 5), utilizando o bien
5-BMF o bien
6-IA-F, con respecto al control
negativo, por la presencia de iones metálicos trivalentes y
Pb^{2+}, Zn^{2+}, y Be^{2+} divalentes pero no por los otros
cationes metálicos sometidos a prueba. Hay poca diferencia entre
los dos agentes de marcaje cuando se utilizo un catión metálico
común. Se potenció el marcaje del ácido nucleico con un
3'-tiofosfato (SEC ID nº: 6) por
5-BMF con respecto al control negativo por la
presencia de Pb^{2+} y los cationes metálicos trivalentes
sometidos a prueba, pero no por los otros cationes sometidos a
prueba. Se potenció el marcaje del ácido nucleico con un
3'-tiofosfato (SEC ID nº: 6) por
6-IA-F con respecto al control
negativo principalmente por Pb^{2+} y Ni^{2+}. El marcaje
mediante 6-IA-F de SEC ID nº: 6 fue
relativamente alto en el control negativo sin cationes
metálicos.
El rendimiento de marcaje obtenido con el
oligonucleótido que no contenía un grupo tiofosfato (SEC ID nº: 4)
fue inferior al 10% para todos los cationes metálicos sometidos a
prueba. El ADN libre de tiofosfato no se marcó de manera detectable
en ausencia de cationes metálicos (es decir, el control de
agua).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra la unión relativa de
fluoresceína sobre ARN que contiene tiofosfato
(ARN-\alpha-S), utilizando
diferentes agentes de marcaje y cationes metálicos. Se comparó el
marcaje con fluoresceína de ARN que contiene tiofosfatos internos o
3'-terminales utilizando dos agentes de marcaje,
6-IA-F y
5-yodoacetamidofluoresceína
(5-IA-F), en presencia o ausencia de
diferentes cationes metálicos.
El protocolo para el experimento es similar al
protocolo descrito en el ejemplo 6 pero los oligonucleótidos usados
fueron polímeros de ARN que presentan las secuencias siguientes:
GCUCGUUGCGGGACUU-s-AACCCAACAU
(SEC ID nº: 7), en la que "-s-" indica un tiofosfato entre los
dos los nucleótidos en las posiciones 16 y 17; y
GCUCGUUGCGGGACUUAACCCAACAU-s
(SEC ID nº: 8), en la que "-s-" indica un tiofosfato
3'-terminal.
En estas reacciones de marcaje, los cationes
metálicos sometidos a prueba fueron Mg^{2+}, Cr^{3+}, Mn^{2+},
Ni^{2+}, Zn^{2+}, In^{3+}, Pb^{2+}, Ce^{3+}, Eu^{3+},
Tb^{3+} y Yb^{3+} (todos con contraiones Cl^{-}); el control
negativo fue agua pura. Se disolvieron cada uno de los agentes de
marcaje, 5-IA-F y
6-IA-F, en DMF seca. Las reacciones
de 100 \mul contenían (con las concentraciones finales indicadas
entre paréntesis): 50 \mul de tampón Tris-Cl 100
mM, pH 8,1 (50 mM), 30 \mul de 6,667 DO por ml de oligómero (0,2
DO = 0,00932 mM final), 10 \mul de catión metálico 10 mM (1 mM) o
agua pura y 10 \mul de reactivo de marcaje 2,5 mM (0,25 mM); la
concentración de DMF final fue del 5%. Se mezcló la combinación
mediante agitación con vórtex y se incubó a 60ºC durante 30
min.
Tras la purificación utilizando extracción con
1-butanol tal como se describió en el ejemplo 6, se
precipitaron 120 \mul de fase acuosa con etanol y se resuspendió
el ácido nucleico sedimentado en 500 \mul de tampón carbonato de
sodio 100 mM, pH 9,5. Se analizó el rendimiento de marcaje mediante
espectroscopía UV tal como se describió en el ejemplo 6. Se resumen
los resultados en la tabla 2, en la que "ND" significa no
determinado. No se incluyen en la tabla los resultados para las
pruebas con Mn^{2+}, Zn^{2+} y In^{3+} dado que mostraron una
actividad relativamente baja.
El marcaje de ARN, como el de ADN, es sensible
al catión metálico y al agente de marcaje. Tanto
5-IA-F como
6-IA-F marcaron
ARN-\alpha-S en grados similares,
marcándose el ARN-\alpha-S
3'-terminal ligeramente mejor que el ARN que
contiene un tiofosfato interno. Los cationes metálicos trivalentes o
Pb^{2+} proporcionaron el marcaje más potenciado con respecto al
control negativo con ambos agentes de marcaje
Este ejemplo muestra las eficacias relativas de
la fragmentación de ARN en presencia de diversos cationes
metálicos. Los sustratos para la fragmentación en estos experimentos
fueron oligonucleótidos de ARN sintéticos que presentan las
siguientes secuencias:
GCUCGWGCGGGACUUAACCCAACAU (SEC ID nº: 9), y
GCUCGWGCGGGACUU-s-AACCCAACAU
(SEC ID nº: 7), en la que "-s-" indica un tiofosfato entre
nucleótidos 16 y 17.
Se prepararon secuencias de ARN complementarias
sintéticas para SEC ID nº: 7 y SEC ID nº: 9 y se usaron para formar
un ARN bicatenario con el oligonucleótido complementario apropiado.
Para las pruebas de fragmentación, se usaron tanto ARN
monocatenario como bicatenario.
La sonda utilizada en la etapa de detección era
una secuencia de 26-nucleótidos complementaria a SEC
ID nº: 9, con un marcador de éster de acridinio (AE) entre las
posiciones 16 y 17 (descrito en Nelson et al., 1996, Nucleic
Acids Res. 24(24): 4998-5003). El
procedimiento general supone fragmentar 100 fmoles de ARN en un
volumen total de 100 \mul (es decir, la concentración de ARN final
en la reacción es de 1 fmol/\mul) en tampón imidazol 50 mM a pH
7,6, que contiene 2,5 \mumoles de cada uno de los cationes
metálicos sometidos a prueba. Tras incubarse la reacción a 60ºC
durante 30 min., se detuvo la reacción de fragmentación añadiendo
un exceso molar de 2 a 3 veces de EDTA, pH 8, con respecto a la
concentración de catión metálico e incubando a -20ºC. Para
monitorizar la cantidad de la fragmentación de ARN, se tomaron
aproximadamente 5 fmol de ARN de la mezcla y se trataron con sonda
con un exceso de 20 veces de la sonda marcada con AE. Todas las
hibridaciones con sondas se realizaron a 60ºC durante 60 min. (en
tampón de hibridación 1X PACE® 2, Gen-Probe, San
Diego CA, US.).
El tratamiento con sonda de una pequeña cantidad
de ARN procedente del material fragmentado también permite que se
diluya adecuadamente el volumen de la mezcla de fragmentación con el
volumen de hibridación de tal manera que los componentes de la
reacción de fragmentación no afectan a la hibridación de la sonda
con la diana. Se utilizaron aproximadamente 200 \mul de reactivo
de selección PACE® 2 (Gen-Probe Incorporated, San
Diego CA, US.) para hidrolizar la sonda no hibridada. Se detectó la
sonda hibridada utilizando un luminómetro para detectar
quimioluminescencia (tal como se describió previamente por Nelson
et al., mencionado anteriormente). La quimioluminescencia se
expresa como unidades relativas de luz o URL.
Para el ARN bicatenario, se hibridaron
aproximadamente 160 pmol de SEC ID nº: 9 con un exceso de 3 veces de
la secuencia complementaria en tampón de hibridación 1X PACE® 2 a
65ºC durante 30 min. Se utiliza la concentración de la cadena
complementaria en exceso 3 veces para garantizar la hibridación
completa. La sonda marcada con AE presenta exactamente la misma
secuencia y, por tanto, la cadena en exceso no se unirá a la
sonda.
Se realizó en paralelo una reacción control sin
cationes metálicos (es decir, sustituyendo con agua pura) y se
utilizó la señal de quimioluminescencia del control para calcular el
porcentaje de fragmentación.
Los cationes metálicos elegidos para la
fragmentación pueden dividirse ampliamente en tres categorías
diferentes: (1) metales que no son de transición tales como Mg, Sr,
Ba (grupo II) y Pb (grupo IV); (2) metales de transición, tales
como Zn, Cd, Mn, Fe, Co, Ni y Ru, y (3) lantánidos, tales como Ce,
Eu, Tb, Tm, Yb y Lu. El contraión para todos los cationes metálicos
sometidos a prueba fue Cl^{-} (todo de Aldrich Chemical Co.,
Milwaukee, WI, US.).
La tabla 3 muestra la eficacia de fragmentación
de dieciocho cationes metálicos multivalentes diferentes a 0,25 mM
sobre ARN mono y bicatenario en tampón imidazol 50 mM (pH 7,6),
cuando se incubó la reacción a 60ºC durante 30 min. Todos los
resultados se expresan como porcentaje de fragmentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los lantánidos fragmentaron el ARN
monocatenario de manera más eficaz que el ARN bicatenario. Entre
los metales de transición, Zn y Fe fragmentaron el ARN bicatenario
de manera menos eficaz que el ARN monocatenario. La mayoría de los
metales de transición y que no son de transición fragmentaron de
manera eficaz el ARN bicatenario.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra que también puede
conseguirse la fragmentación de ARN monocatenario en otras
condiciones de tampón, tales como en las condiciones de la
disolución de TMA. Los procedimientos utilizados son sustancialmente
los mismos descritos en el ejemplo 8, con las siguientes
excepciones.
Las reacciones de amplificación mediante TMA
negativas se realizaron tal como se describió en el ejemplo 1 en
ausencia de ARN diana. Se juntaron las reacciones de amplificación
negativas para constituir una disolución de TMA. Entonces se
añadieron concentraciones conocidas del oligonucleótido de ARN
sintético (SEC ID nº: 7) en esta disolución de TMA para las
reacciones de fragmentación. Se utilizaron cuatro tampones de
fragmentación diferentes, todos a pH 7,5: imidazol, MOPS, HEPES y
PIPES (todos de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, US.). Los
tampones variaban en concentración desde 50 mM hasta 200 mM,
conteniendo la disolución de TMA el oligonucleótido de ARN
sintético diluido hasta una razón de 1:20 o no diluido (razón de
1:1). Se sometieron a prueba tres cationes metálicos diferentes
(Zn^{2+}, Ce^{3+} y Tb^{3+}), todos a 5 mM.
Se determinó el rendimiento de fragmentación tal
como se describió en el ejemplo 8 y se resumen los resultados en la
tabla 4 para los ensayos con dilución 1:20. Sin dilución de la
disolución de TMA, la fragmentación fue inferior al 10%.
Estos resultados muestran que la fragmentación
de ARN también es eficaz en una variedad de condiciones de tampón
en presencia de cationes metálicos multivalentes, particularmente
Ce^{3+}.
Este ejemplo muestra el marcaje con fluoresceína
de fragmentos de oligonucleótido en presencia y ausencia de
cationes metálicos y si la fragmentación está asociada con el
marcaje. Se cuantificó la unión de fluoresceína a los
oligonucleótidos mediante espectroscopía de absorción y se comparó
con fragmentos de oligonucleótido detectados mediante
espectroscopía de masas MALDI-TOF
(desorción/ionización mediante láser asistida por
matriz-tiempo de vuelo).
Las reacciones de fragmentación se realizaron
sustancialmente tal como se describió en el ejemplo 6 utilizando
oligonucleótidos de ARN y ADN sintéticos que presentan las
secuencias siguientes:
GCUCGUUGCGGGACUU (SEC ID nº: 10),
GCUCGWGCGGGACUU-s (SEC ID nº:
11), que es idéntica a SEC ID nº: 10 pero que incluye un tiofosfato
3'-terminal,
GCUCGWGCGGGACUU-s-AACCCAACAU
(SEC ID nº: 7), y
GCTCGTTGCGGGACTT-s-AACCCAACAT
(SEC ID nº: 5), en la que -s- indica un tiofosfato entre las bases
16 y 17.
En estos ensayos, el tampón fue imidazol, y los
cationes metálicos fueron Zn^{2+} o Tb^{3+} (ambos con
contraiones Cl^{-}); el control negativo fue agua pura. Los
agentes de marcaje, en DMF seca, fueron
5-(bromometil)fluoresceína o
6-yodoacetamidofluoresceína. Las reacciones de 100
\mul contenían (concentraciones finales mostradas entre
paréntesis): 50 \mul de tampón imidazol 100 mM, pH 7,6 (50 mM), 30
\mul de 6,667 DO/ml de oligómero (0,2 DO = 0,00932 mM final), 10
\mul de catión metálico 25 mM (2,5 mM) o agua pura, y 10 \mul de
reactivo de marcaje 2,5 mM (0,25 mM), o agua pura para las
reacciones sólo de fragmentación.
Se mezclaron las mezclas de reacción utilizando
agitación con vórtex y se incubaron a 60ºC durante 30 min. Tras una
etapa de purificación, se añadieron 10 \mul de acetato de sodio (3
M, pH 5,0) y 150 \mul de 1-butanol saturado con
agua y se mezcló la mezcla mediante agitación con vórtex, entonces
se incubó en hielo seco durante 15 min., se centrifugó 15 min. a
14.000 rpm y se lavó el sedimento con 100 \mul de etanol al 70%
frío. Se resuspendió el sedimento en 40 \mul de agua pura y se
reservaron 3 \mul para la detección mediante
MALDI-TOF. Se diluyó la parte restante hasta 500
\mul con tampón carbonato de sodio 100 mM, pH 9,5 para la
espectrofotometría UV-visible.
Para la detección mediante
MALDI-TOF, se mezcló una muestra de 3 \mul de 5
DO/ml de oligómero (0,015 DO) con 1 \mul de tampón citrato de
amonio 30 mM, pH 9,4 y 6 \mul de ácido
3-hidroxipicolínico 50 mg/ml (HPA, matriz) y una
resina de intercambio catiónico triturando aproximadamente 10 X con
un dispositivo de pipeteo. Se dejó que sedimentara la resina y se
aplicó una muestra de 2 \mul sobre un soporte de oro, se secó al
aire durante 20 min. y se recogieron los datos de masas utilizando
un espectrómetro de masas MALDI-TOF Voyager DE de
PerSeptive Biosystems. Las masas se basaron en la utilización del
oligonucleótido de SEC ID nº: 10 como patrón externo.
Se resumen los resultados del marcaje y la
fragmentación mediante MALDI-TOF de las reacciones
que utilizaron 5-BMF y
6-IA-F, con o sin los cationes
Zn^{2+} o Tb^{3+}, en las tablas 5 y 6. En la tabla 5, "-"
indica oligómeros marcados con fluoresceína no detectados, "+"
indica oligómero marcado con monofluoresceína detectado, y
"++" indica oligómero marcado con difluoresceína detectado. En
la tabla 6, "-" indica productos fragmentados no detectados,
"+" indica unos cuantos grupos/productos fragmentados (2 - 5)
detectados, "++" indica más (8 - 12) productos fragmentados
detectados y "+++" indica muchos productos fragmentados
detectados (> 15). "ND" significa no detectado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestra la cuantificación del marcaje con
fluoresceína, detectado mediante espectrofotometría, en la tabla 7
como el porcentaje de fluoresceína unida al oligonucleótido en
presencia y ausencia de cationes metálicos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Estos resultados muestran que ambos agentes de
marcaje, 5-BMF y
6-IA-F, resultaron eficaces en el
marcaje de oligonucleótidos de ARN en presencia de Zn^{2+} y
Tb^{3+}; en ausencia de cationes metálicos hubo poco marcaje por
cualquier agente de marcaje. La espectroscopía de masas detectó
oligonucleótidos marcados con fluoresceína de manera sencilla y
doble sólo cuando la eficacia de marcaje fue superior al 30% y el
40%, respectivamente. El marcaje con fluoresceína resultó eficaz en
presencia de Zn^{2+} en todos los oligonucleótidos sometidos a
prueba con 5-BMF y en los oligómeros de ARN y ADN
más largos con 6-IA-F. En presencia
de Zn^{2+} más cualquier agente alquilante, se produjo
significativamente más fragmentación que en ausencia del agente
alquilante. Tb^{3+} más agentes alquilantes fragmenta el ADN.
Este ejemplo muestra que los iones Ce^{3+}
pueden fragmentar eficazmente amplicones de VIH-1
que se marcan en la misma mezcla de reacción con un marcador
fluorescente, proporcionando fragmentos de ácido nucleico para la
detección sobre un chip de ADN. Se prepararon los amplicones de la
secuencia de proteasa de VIH-1 tal como se
describió en el ejemplo 1. Para la fragmentación y el marcaje, la
reacción incluyó; 50 \mul de amplicones de ARN de
VIH-1, 125 \mul de tampón imidazol (0,1 M), 12,5
\mul de CeCl_{3} (100 mM), 6,25 \mul de
5-(bromometil)fluoresceína (10 mM en DMSO) y agua pura para
obtener un volumen de reacción final de 250 \mul. Se mezcló la
disolución y se incubó a 60ºC durante 30 min. Se hibridó entonces el
producto de reacción, se detectó y se analizó sobre un chip de ADN
de VIH- 1, tal como se describió en el ejemplo 2.
Los resultados muestran que la lectura de bases
fue del 98,1% para una mediana de la señal de 1656 URF, con un
fondo de 390 URF, proporcionando una razón S/B de 4,2. Por tanto, la
utilización de CeCl_{3} permite una fragmentación y un marcaje
eficaces por 5-(bromometil)fluoresceína.
Se realizaron las reacciones de TMA tal como se
describió en el ejemplo 1. Se realizaron las reacciones de
fragmentación y marcaje en un tubo de plástico utilizando 100 \mul
de amplicones de TMA de la diana de M. tuberculosis con las
condiciones descritas en el ejemplo 2 con la excepción de que se
incluyó una capa superior de aceite de silicio inerte en la mezcla
de reacción. Tras la fragmentación y el marcaje, se extrajo la
mezcla de reacción con 2400 \mul de 1-butanol
(saturado con agua), tal como se describió en el ejemplo 2. Tras la
separación de las fases acuosa y orgánica, se realizaron las
reacciones de TMA utilizando 5 \mul de cada fase, y utilizando el
mismo volumen que contiene diana no marcada como control positivo.
Aunque la diana no marcada dio el producto de amplificación
esperado, no se detectaron amplicones en las reacciones de TMA que
utilizaron alícuotas de o bien la fase acuosa o bien la fase
orgánica. Estos resultados muestran que los fragmentos producidos
durante la reacción de fragmentación y marcaje no pueden
amplificarse en estas condiciones. Por tanto, el procedimiento de
fragmentación y marcaje puede servir como procedimiento de
descontaminación.
<110> BIO MERIEUX
\hskip1cmGEN-PROBE INCORPORATED
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA MARCAR UN ÁCIDO
NUCLEICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CLIVPUR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaaccct cactaaaggg agacagagcc aacagcccca cca
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg agatttcccc actaacttct gtatgtcatt gaca
\hfill54
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg agagggccat ccattcctgg ctttaattt
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcgttgcg ggacttaacc caacat
\hfill26
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador; el fosfato entre los nucleótidos en las
posiciones 16 y 17 es un tiofosfato
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgctcgttgcg ggacttaacc caacat
\hfill26
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<210> 6
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador; el fosfato en el extremo 3' es un
tiofosfato
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\hskip-.1em\dddseqskipterminal
\hfill
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<400> 6
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\hfill26
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<210> 7
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<211> 26
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<212> ARN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador; el fosfato entre los dos nucleótidos en la
posición 16 y 17 es un tiofosfato
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipgcucguugcg ggacuuaacc caacau
\hfill26
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<210> 8
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<211> 26
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<212> ARN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador; el fosfato en el extremo 3' es un
tiofosfato
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\hskip-.1em\dddseqskipterminal
\hfill
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 16
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<212> ARN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgcucguugcg ggacuu
\hfill16
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<210> 11
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<211> 16
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<212> ARN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador; el fosfato en el extremo 3' es un
tiofosfato
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\hskip-.1em\dddseqskipterminal
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcucguugcg ggacuu
\hfill16
Claims (26)
1. Procedimiento de fragmentación y marcaje de
un ácido nucleico natural o sintético, que comprende las etapas
siguientes:
proporcionar una mezcla que contiene un ácido
nucleico, un agente de marcaje que contiene un marcador detectable,
un catalizador químico y por lo menos un catión metálico
multivalente en una disolución sustancialmente acuosa,
en el que el ácido nucleico es ARN o ARN que
comprende por lo menos un nucleótido con tiofosfato y el catión
multivalente es Sr^{2+}, Ra^{2+}, Pb^{2+}, Cd^{2+},
Fe^{2+}, Ni^{2+}, Ru^{3+}, Cr^{3+}, Ce^{3+}, Eu^{3+},
Tb^{3+}, Tm^{3+}, Yb^{3+} o Lu^{3+}, y
en el que el ácido nucleico es ADN o ADN que
comprende por lo menos un nucleótido con tiofosfato y el catión
multivalente es Mn^{2+}, Zn^{2+}, Be^{2+}, Cr^{3+},
Pb^{2+}, In^{3+}, Tb^{3+}, Ce^{3+}, Yb^{3+} o
Ni^{2+};
fragmentar químicamente el ácido nucleico
utilizando el catalizador químico en la mezcla para producir una
multiplicidad de fragmentos de ácido nucleico; y
unir por lo menos un marcador a por lo menos uno
de los fragmentos de ácido nucleico para producir un fragmento de
ácido nucleico marcado de manera detectable.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que los reactivos utilizados en las etapas de fragmentación y
unión se añaden a una mezcla de amplificación de ácido nucleico
in vitro.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa que consiste en tratar la mezcla tras las
etapas de fragmentación y unión para disminuir o eliminar el agente
de marcaje no unido.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la etapa de tratamiento consiste en añadir un agente extintor
a la mezcla tras las etapas de fragmentación y unión.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el agente extintor es un pirofosfato, derivado de tiol,
agente quelante, anión fosfato o anión carbonato.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la etapa de tratamiento separa físicamente el fragmento de
ácido nucleico marcado del agente de marcaje no unido en la mezcla
tras las etapas de fragmentación y unión.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que la etapa de tratamiento incluye además añadir un ácido a la
mezcla tras las etapas de fragmentación y unión.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que la etapa de tratamiento incluye además añadir un agente
quelante a la mezcla tras las etapas de fragmentación y unión.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la etapa de tratamiento utiliza un
disolvente orgánico para separar el fragmento de ácido nucleico
marcado del agente de marcaje no unido.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el disolvente orgánico es 1-butanol,
2-butanol, alcohol isopentílico,
1-pentanol o ciclohexanol.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la etapa de tratamiento separa el
fragmento de ácido nucleico marcado del agente de marcaje no unido
utilizando extracción en fase sólida de los fragmentos de ácido
nucleico sobre un soporte sólido.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que dicho soporte sólido es perlas, geles, resina de intercambio
iónico, resina de fase inversa, matriz de sílice o una membrana.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 ó
12, en el que el fragmento de ácido nucleico marcado se eluye del
soporte sólido utilizando un tampón que contiene betaína.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la etapa de tratamiento precipita
los fragmentos de ácido nucleico marcados a temperatura ambiente a
partir de una disolución que contiene betaína, DTAB y ácido
nucleico no marcado.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que la etapa de tratamiento diluye una
mezcla de amplificación de ácido nucleico in vitro.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que las etapas de fragmentación y
unión se realizan en una única mezcla de reacción.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que las etapas de fragmentación y
unión se efectúan en etapas separadas.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que la etapa de unión une un marcador
a un tiofosfato interno o terminal o a un fosfato interno o
terminal.
19. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el catalizador químico es una base general seleccionada de
entre el grupo constituido por imidazol, un análogo sustituido de
imidazol y un compuesto que incluye un anillo de imidazol o un
análogo sustituido de un anillo de imidazol.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que el catalizador químico se selecciona de entre el grupo
constituido por N-metilimidazol, MOPS, HEPES, PIPES
y poliaminas bioorgánicas.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que el ácido nucleico es un ADN y el
catión metálico multivalente es Tb^{3+}.
22. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla contiene el agente de marcaje en una concentración
de entre 0,1 mM y 4 mM.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, en
el que la mezcla contiene el agente de marcaje en una concentración
de entre 0,1 mM y 1 mM.
24. Procedimiento según la reivindicación 22 ó
23, en el que el agente de marcaje está comprendido entre 0,3 mM y
0,55 mM.
25. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla contiene un agente de marcaje que contiene
funciones reactivas de haloacetamida o haluro de alquilo.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, en el que el agente de marcaje es
5-(bromometil)fluoresceína,
6-(bromometil)fluoresceína,
6-yodoacetamidofluoresceína o
5-yodoacetamidofluoresceína.
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