ES2303760A1 - Metodo analitico para la medida de la actividad k-caseinolitica de enzimas. - Google Patents
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Abstract
Método analítico para la medida de la actividad k-caseinolítica de enzimas de interés en la industria quesera y en la investigación biológica. Se basa en la medición de la cantidad de k-caseína degradada, marcada con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína. El método comprende las siguientes etapas: 1) Elaboración del sustrato, FTC-k-caseína, por unión de isotiocianato de fluoresceína a k-caseína. 2) Incubación de una muestra enzimática en presencia de FTC-k-caseína con el tampón adecuado para la enzima. 3) La reacción se detiene por adición de tricloroacético (TCA). 4) La fluorescencia emitida se obtiene midiendo una alícuota del producto de la reacción empleando un fluorímetro. 5) Los valores de actividad se extraen a partir de la ecuación de una recta patrón que relaciona la fluorescencia con la cantidad de k-caseína degradada.
Description
Método analítico para la medida de la actividad
\kappa-caseinolítica de enzimas.
El método permite detectar y cuantificar la
actividad \kappa-caseinolítica de enzimas de interés en la
industria quesera y en la investigación biológica. Las enzimas que
producen la coagulación de la leche y que, por tanto, permiten
obtener masas queseras, son aquellas proteasas que actúan sobre la
\kappa-caseína de la leche. El método se basa en la
medición de la cantidad de \kappa-caseína degradada. La
\kappa-caseína es marcada con el fluorocromo isotiocianato
de fluoresceína. El método es preciso y permite determinar el grado
de purificación de las proteasas a partir de mezclas enzimáticas de
origen animal, vegetal, microbiano y recombinante. Debido a su
sensibilidad es útil para la caracterización y purificación de
enzimas con capacidad \kappa-caseinolítica.
Las caseínas constituyen una familia de
fosfoproteínas (\alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta,
\kappa) que forman casi el 80% de las proteínas de la
leche bovina (Lucey et al., 2003, J. Dairy Sci.
86:2725-2743). Son proteínas que se encuentran en la
leche formando micelas solubles. La solubilidad de las micelas se
debe a las moléculas de \kappa-caseína, que recubren y
estabilizan la estructura.
Básicamente, existen tres modelos que intentan
explicar la disposición espacial de las caseínas en las micelas
(Dalgleish, 1998, J Dairy Sci. 81:3013-3018).
Uno de ellos propone que el núcleo de las micelas está compuesto
por multitud de submicelas y que la periferia consiste en
microvellosidades de \kappa-caseína (Walstra, 1970, J.
Dairy Res. 46:317-322; Lucey, 2002, J. Dairy
Sci. 85:281-294). Otro de los modelos sugiere
que el núcleo está formado por fibras de caseína interconexionadas
(Holtz, 1992, Adv. Protein Chem. 43:51-63).
Finalmente, el modelo más reciente (Home, 1998, Internat. Dairy
J. 8:171-177), propone una doble conexión entre
las caseínas que hace que las micelas sean estables. Los tres
modelos consideran las micelas de la leche como partículas
coloidales formadas por agregados y recubiertas por las moléculas
solubles de \kappa-caseína.
El proceso de coagulación de la leche consiste
principalmente en tres fases (Carlson, et al., 1987,
Biotechnol. Bioeng. 29:582-589): i) la
degradación enzimática de la \kappa-caseína, ii) la
floculación de las micelas, y iii) la formación del gel. Cada una de
las fases sigue una cinética diferente, siendo la degradación de la
\kappa-caseína la fase limitante en el proceso de
coagulación de la leche. El proceso entero está influenciado por
factores físico-químicos, tales como el pH o la
temperatura (Esteves et al., 2003, J. Dairy Sci.
86:2558-2567; Vasbinder et al., 2003, J.
Dairy Sci. 86:1556-1563).
Las proteasas coagulantes de la leche actúan
sobre la porción soluble de las micelas, la
\kappa-caseína, produciendo una estructura inestable que
origina la formación de una masa quesera (Vasbinder et al.,
2003, J. Dairy Sci. 86:1556-1563). La
quimosina (E.C. 3.4.23.4) es una proteasa aspártica que hidroliza
el puente proteico fenilalanina_{105} - metionina_{106} de la
\kappa-caseína y está considerada como la proteasa más
eficiente en la industria quesera (Rao et al., 1998,
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:597-635). Sin
embargo, existen otras proteasas capaces de desencadenar la
coagulación de la leche, rompiendo otro tipo de enlaces diferentes
de la \kappa-caseína (Lucey, 2002, op. cited;
Esteves, 2003, op. cited). Este efecto permite la obtención
de quesos con una gran variedad de propiedades reológicas y
organolépticas.
El método convencional para cuantificar una
enzima coagulante de leche (Poza et al., 2003, J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 30:691-698) utiliza leche
como sustrato, y determina el tiempo transcurrido hasta que aparece
el coágulo lácteo. Sin embargo, como la coagulación de la leche
puede verse influida por variaciones fisicoquímicas (Lucey, 2002,
op. cited; Lucey, 2003, op. cited; Vasbinder, 2003,
op. cited), puede llegar a ocurrir sin la participación de
ningún enzima. Como consecuencia, se pueden obtener resultados
confusos e irreproducibles, particularmente cuando se trabaja con
enzimas con poca actividad. Por otra parte, la medición del tiempo
de coagulación no es suficientemente precisa, dado que el momento
exacto de la formación del coágulo lácteo es difícil de observar y
es subjetivo, lo cual dificulta una determinación precisa de las
unidades enzimáticas.
Además, aunque está descrito que la hidrólisis
de la \kappa-caseína sigue una cinética clásica de
Michaelis-Menten (Carlson, et al., 1987,
Biotechnol. Bioeng. 29:582-589), es difícil
de determinar midiendo el tiempo de la coagulación. Cuando se
trabaja con enzimas poco activas, el tiempo que tarda en formarse el
coágulo se puede alargar durante horas, siendo posible que tenga
lugar una coagulación espontánea de la leche por aumento de la
temperatura o por bajada del pH.
Para solucionar estos problemas y mejorar el
estudio del proceso, se han propuesto diversos métodos: la
determinación del diámetro de halos en placas de
agar-leche (Poza, op. cited); la
determinación colorimétrica (Hull, 1947, J. Dairy Sci.
30:881-884); y la determinación de la degradación
de la caseína marcada previamente con un marcador radioactivo
(Christen, 1987, J. Dairy Sci. 70:1807-1814),
o con un compuesto fluorocrómico (Twining, 1984, Anal.
Biochem. 143:30-34). Todos estos métodos
utilizan caseína como sustrato para detectar la actividad
proteolítica y, en algunos casos, la actividad coagulante.
El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es una
sustancia fluorescente, que se une a grupos amino, utilizada para
el marcaje de proteínas (Schreiber, A.B., y Haimovich, J., 1983,
Methods Enzymol., 93:147-155). El grupo
isotiociantato reacciona con los grupos amino terminal y las aminas
primarias de la proteína, formando un derivado tiocarbamoil,
tiocarbamoil de fluoresceína (FTC) (Twining, 1984, op. cited)
que queda unido a la proteína.
La característica novedosa esencial del método
propuesto, consiste en la sustitución de la caseína como sustrato
por otro sustrato más específico, la \kappa-caseína,
marcado con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC). El
cambio de sustrato permite la cuantificación de las moléculas de
\kappa-caseína degradadas de un modo preciso y específico,
detectando aquellos enzimas que son capaces de actuar sobre el
sustrato formado FTC-\kappa-caseína.
El método analítico para la medida de la
actividad \kappa-caseinolítica de enzimas comprende las
siguientes etapas:
a) Elaboración del sustrato: Se incuba
\kappa-caseína en tampón carbonato y NaCl a pH 9.5, con el
fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC), durante una hora
en agitación. El sustrato resultante, FTC-\kappa-caseína,
se dializa varias veces frente a carbón activo, tampón
Tris-HCl, pH 8.5 y frente a
Tris-HCl, pH 7.5. Por último, el sustrato,
FTC-\kappa-caseína, se congela a -20ºC en alícuotas de 1
mL.
b) Preparación de la mezcla de reacción: Se
incuba la muestra enzimática, en presencia de
FTC-\kappa-caseína con el tampón adecuado para la muestra.
Se deja reaccionar en agitación a la temperatura óptima de la
enzima. Se detiene la reacción por adición de ácido tricloroacético
(TCA) frío y en agitación. Mediante centrifugación, se eliminan las
proteínas precipitadas y se guarda el sobrenadante.
c) Medición de la fluorescencia: Se diluye parte
del sobrenadante con tampón Tris-HCl, pH 8.5. La
cantidad de fluorocromo liberado se mide empleando un fluorímetro
robotizado. Se realizan controles negativos sustituyendo la enzima
por el tampón; el valor basal de fluorescencia obtenido se resta al
obtenido tras la reacción.
d) Construcción de una recta patrón: Se incuban
cantidades crecientes del sustrato, FTC-\kappa-caseína,
con una proteasa un tiempo suficiente hasta la completa degradación
del sustrato de origen. Así, se obtiene la relación entre la
fluorescencia y la cantidad de FTC-\kappa-caseína
degradada.
Se define la unidad enzimática como la cantidad
de enzima necesaria para degradar 1 \mug de
FTC-\kappa-caseína en 1 h a 37ºC.
e) Interpolación de los datos: A partir de la
recta patrón obtenida, se deducen los datos de actividad de la
proteasa, a través de la cantidad de fluorescencia emitida.
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A continuación se ilustra más ampliamente la
invención mediante ejemplos no limitativos:
Para la preparación del sustrato del presente
método, 1 g de \kappa-caseína se disolvió en 100 mL de
tampón carbonato 50 mM, pH 9.5 y NaCl 150 mM. Posteriormente, se
añadieron 40 mg de isotiocianato de fluoresceína (FITC). La mezcla
se agitó suavemente durante una hora a temperatura ambiente.
Durante esta hora tiene lugar la unión del tiocarbamoil de
fluoresceína (FTC), derivado de FITC, y las moléculas de
\kappa-caseína. El FITC no unido se eliminó dializando la
muestra frente a 1% de carbón activo en 2 L de agua a 4ºC durante
toda la noche. Posteriormente, se dializó frente a tampón 50 mM
Tris-HCl, pH 8.5 durante toda una noche, seguido de
una diálisis frente a tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
La concentración de proteína en la muestra obtenida fue ajustada al
0.5% con tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. El sustrato
fue conservado a -20ºC en alícuotas de 1 mL. La cantidad de FITC
unido a la \kappa-caseína fue de 14.12 \mug por mg de
sólido. Esta determinación se obtuvo comparando el sustrato con un
sustrato comercial de FTC-caseína.
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La mezcla de reacción consistió en 10 \muL de
la muestra enzimática, 20 \muL de tampón adecuado para cada
enzima y 20 \muL de sustrato de FTC-\kappa-caseína. La
reacción se llevó a cabo en tubos cubiertos de 1,5 mL en
condiciones agitación (180 rpm) a la temperatura óptima de la
enzima y un tiempo variable, según las condiciones del experimento.
En el caso de las enzimas utilizadas en los ejemplos posteriores
(Ejemplos 4 a 7) fueron estas condiciones; 37ºC durante un tiempo
que varió entre 15 y 180 min, dependiendo del tipo de ensayo. La
reacción se detuvo mediante la adición de 120 \muL de ácido
tricloroacético (TCA) frío al 5% y agitando fuertemente los tubos.
La mezcla se dejó reposar como mínimo 1 hora a temperatura
ambiente. Las proteínas insolubilizadas por el TCA se precipitaron
mediante centrifugación durante 5 min a 14,000 rpm. Una alícuota de
60 \muL de sobrenadante se diluyó con 400 \muL de tampón 0.50 M
Tris-HCl, pH 8,5.
Los valores de fluorescencia se obtuvieron
mediante la medición de 350 \muL de las muestras obtenidas
empleando placas de 96 pocillos especiales para la medición por
fluorescencias empleando un fluorímetro robotizado con una apertura
de 2.5 y unas longitudes de onda de excitación y emisión de 490 y
525 nm, respectivamente.
Los niveles de fluorescencia basales fueron
substraídos de los valores de las mediciones para determinar la
cantidad de fluorocromo liberado. Se realizaron controles negativos
sustituyendo la enzima por el tampón empleado en la reacción.
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Se realizó una recta patrón que relacionó la
cantidad de fluorescencia con la cantidad de
FTC-\kappa-caseína degradada. Esto se consiguió incubando
concentraciones crecientes del sustrato (de 0 mg/mL a 43 mg/mL de
FTC-\kappa-caseína) en presencia de tripsina (100
\mug/mL) hasta conseguir la degradación completa. Esto permitió
obtener la relación entre la fluorescencia y la cantidad de
FTC-\kappa-caseína degradada.
Se definió la unidad enzimática como la cantidad
de enzima necesaria para degradar 1 pg de
FTC-\kappa-caseína en 1 h a 37ºC.
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Se llevó a cabo una recta patrón de
FTC-caseína degradada del mismo modo descrito en el
ejemplo 4. Con estos valores y los obtenidos en el ejemplo 4 se
llevó a cabo una recta patrón que relacionó la cantidad de
FTC-\kappa-caseína y FTC-caseína degradadas
(Tabla 1).
Se realizaron mediciones con el sustrato
comercial FTC-caseína y con el sustrato
FTC-\kappa-caseína del modo descrito en los ejemplos 2 y
3.
Se incubó 1 \mug/mL de tripsina en presencia
de los dos sustratos. Los valores obtenidos en el experimento, tal
como era de suponer, fueron muy similares, no encontrándose
diferencias significativas con un a de 0,05% (Tabla 1).
Se incubaron 5 \mug/mL de la proteasa
coagulante de leche procedente de R. miehei, que sólo actúa
sobre la \kappa-caseína, en presencia de los dos sustratos.
Se obtuvieron valores de actividad 2.65 veces más elevados
empleando el método aquí propuesto y empleando
FTC-\kappa-caseína como sustrato que cuando se empleó
FTC-caseína como sustrato, tal como se puede
observar en la Tabla 1.
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Se incubaron las siguientes muestras enzimáticas
del modo descrito en los ejemplos anteriores.
La proteasa comercial producida por R.
miehei (13 \mug/mL), la quimosina obtenida a partir de un
cuajar de búfalo lactante (164 \mug/mL), la proteasa procedente de
una infusión de flores de Cynara cardunculus (13 \mug/mL)
y la quimosina comercial recombinante producida por Escherichia
coli (5 \mug/mL).
Las diluciones de las muestras fueron incubadas
frente a concentraciones crecientes de sustrato
FTC-\kappa-caseína (de 0 a 1,47 mg/mL) y las mezclas se
incubaron durante 1 h a 37ºC. Se midió la actividad y la cantidad de
proteína del modo anteriormente descrito. Con estos valores se
realizó la gráfica de Michaelis-Menten (Figura 1) y
la representación de Lineweaver-Burk (Figura 2), lo
cual permitió la obtención de los valores de K_{m} y V_{máx} de
dichas enzimas
(Tabla 2).
(Tabla 2).
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Con el objetivo de observar la linealidad de la
degradación de FTC-\kappa-caseína, la reacción se prolongó
en el tiempo. Las muestras enzimáticas consistieron en dos
diluciones de la enzima coagulante procedente de R. miehei
(7 y 13 \mug/mL) y el sustrato fue FTC-\kappa-caseína,
preparado del modo descrito en los ejemplos anteriores.
Las reacciones se incubaron durante un tiempo
variable, desde 5 minutos hasta 3 horas y se realizaron por
triplicado (Figura 3).
Con el objeto de observar linealidad en la
degradación de \kappa-caseína cuando la reacción tiene
lugar empleando distintas concentraciones de enzima, se realizaron
ensayos del mismo modo descrito en ejemplos anteriores, donde las
reacciones fueron incubadas durante 1 h y se varió la concentración
de la muestra enzimática (de 44 a 440 \mug/mL) procedente de
R. miehei (Figura 4).
Tal como se puede observar en las figuras 3 y 4,
los resultados originaron una representación lineal en ambos casos.
De la figura 3 se extrajo el dato de que el método detecta
cantidades mínimas de enzima (tales como 2,6 ng en reacción). Esto
lo hace ideal para ser empleado durante la purificación de enzimas;
aunque se tenga poca actividad o poca cantidad de enzima, el método
permite detectar la enzima.
El método analítico para la medida de la
actividad \kappa-caseinolítica de enzimas detecta
actividad sobre la \kappa-caseína en cantidades que no
consiguen originar la coagulación de la leche sin que pueda
intervenir factores fisicoquímicos, tales como el pH y la
temperatura.
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Figura 1. Efecto de la concentración de sustrato
sobre la actividad enzimática de las muestras procedentes de:
quimosina recombinante (\sqbullet), R. miehei (o), B.
arnee bubalis (\blacktriangle) y C. cardunculus
(\lozenge). Las barras de error corresponden a la desviación
estándar de la media.
Figura 2. Representación de
Lineweaver-Burk de la actividad enzimática de las
muestras procedentes de: quimosina recombinante (y = 0.072x + 0.629;
R^{2} = 0.995) (\sqbullet), R. miehei (y = 0.041x +
0.087; R^{2} = 0.996) (o), B. arnee bubalis (y = 0.095x +
0.045; R^{2} = 0.997) (\blacktriangle) y C. cardunculus
(y = 0.058x + 0.256; R^{2} = 0.993) (\lozenge).
Figura 3. Efecto del tiempo de incubación y el
valor de dilución sobre la actividad enzimática de la proteasa
procedente de R. miehei. Factor de dilución 1/1,000 (Y =
0.071X + 0.574; R^{2} = 0.995) (\Box) y factor de dilución
1/10,000 (Y = 0.020X - 0.431; R^{2} = 0.995) (\sqbullet). Las
barras de error corresponden a la desviación estándar de la
media.
Figura 4. Actividad específica de la proteasa
procedente de R. miehei. (Y = 46.093X + 4.497; R^{2} =
0.984) (\Box). Las barras de error corresponden a la desviación
estándar de la media.
Claims (3)
1. Método analítico para la medida de la
actividad \kappa-caseinolítica de enzimas, que comprende
las siguientes etapas:
a) Elaboración del sustrato: Se incuba
\kappa-caseína en tampón carbonato y NaCl a pH 9.5, con el
fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC), durante una hora
en agitación. El sustrato resultante, FTC-\kappa-caseína,
se dializó varias veces frente a carbón activo, tampón
Tris-HCl, pH 8.5 y frente a
Tris-HCl, pH 7.5. Por último, el sustrato,
FTC-\kappa-caseína, se congela a -20ºC en alícuotas de 1
mL.
b) Preparación de la mezcla de reacción: Se
incuba la muestra enzimática en presencia de
FTC-\kappa-caseína con el tampón adecuado para la muestra.
Se deja reaccionar en agitación a la temperatura óptima de la
enzima. Se detiene la reacción por adición de ácido tricloroacético
(TCA) frío y en agitación. Mediante centrifugación, se eliminan las
proteínas precipitadas y se guarda el sobrenadante.
c) Medición de la fluorescencia: Se diluye parte
del sobrenadante con tampón Tris HCl, pH 8.5. La cantidad de
fluorocromo liberado se mide empleando un fluorímetro robotizado.
Se realizan controles negativos sustituyendo la enzima por el
tampón; el valor basal de fluorescencia obtenido se resta al
obtenido tras la reacción.
d) Construcción de una recta patrón: Se incuban
cantidades crecientes del sustrato FTC-\kappa-caseína, con
una proteasa un tiempo suficiente hasta la completa degradación de
sustrato de origen. Así, se obtiene la relación entre la
fluorescencia y la cantidad de FTC-\kappa-caseína
degradada.
Se define la unidad enzimática como la cantidad
de enzima necesaria para degradar 1 \mu de
FTC-\kappa-caseína en 1 h a 37ºC.
e) Interpolación de los datos: A partir de la
recta patrón obtenida, se deducen los datos de actividad de la
proteasa, a través de la cantidad de fluorescencia emitida.
2. Un método analítico, según la reivindicación
1, donde las enzimas o muestras enzimáticas que se evalúan son
proteasas que actúan sobre la \kappa-caseína.
3. Un método analítico, según la reivindicación
1, para la detección de nanogramos de enzima con actividad
\kappa-caseinolítica, y su utilización para llevar a cabo
procesos de purificación de enzimas y para la industria
quesera.
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| JPWO2017006926A1 (ja) * | 2015-07-06 | 2018-04-19 | 合同酒精株式会社 | 乳製品 |
| EP3320781A4 (en) * | 2015-07-06 | 2019-02-20 | Godo Shusei Co., Ltd. | milk product |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2303760B1 (es) | 2009-09-11 |
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