ES2304127T3

ES2304127T3 - Promotores del virus del rizado de hoja amarilla de cestrum.

Info

Publication number: ES2304127T3
Application number: ES01915416T
Authority: ES
Inventors: Thomas Hohn; Livia Stavolone; Petrus Theodorus De Haan; Hope Thompson Ligon; Maria Kononova
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 2000-03-27
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2008-09-16
Anticipated expiration: 2021-03-26
Also published as: KR100766290B1; AR044724A1; CN100457913C; HUP0300570A3; ATE393829T1; KR20020086724A; JP2003529353A; CN1430673A; EP1268826A1; BR0109530B1; HUP0300570A2; EP1268826B1; JP4739634B2; HU225788B1; PL358790A1; PL204327B1; WO2001073087A8; EA006761B1; EA200200960A1; CA2406191A1

Abstract

Secuencia de ADN que comprende a) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20, o b) el complemento de una secuencia de ADN que se hibrida en condiciones severas con una cualquiera de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3 ó SEC ID Nº: 4, en donde dicho complemento actúa como promotor de transcripción de una secuencia de nucleótidos asociada, c) una secuencia de ADN que comprende una tira consecutiva de al menos 50 nt de la SEC ID Nº: 1, en donde dicha secuencia de ADN actúa como promotor de transcripción de una secuencia de nucleótidos asociada.

Description

Promotores del virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum.

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La presente invención se refiere a nuevas secuencias de ADN que actúan como promotores de transcripción de secuencias de nucleótidos asociadas en plantas. Más específicamente, esta invención se refiere a nuevos promotores que confieren una expresión constitutiva a una secuencia de nucleótidos asociada de interés.

En el campo de la agricultura existe un continuo deseo de modificar plantas en función de las necesidades. Un modo de lograr esto es usando modernas técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, introduciendo un gen de interés en la planta, ésta puede ser modificada específicamente para expresar un rasgo fenotípico deseable. Para ello, lo más habitual es que las plantas sean transformadas con un gen heterólogo que comprende una región promotora, una región codificadora y una región de finalización. Cuando se diseña genéticamente un gen heterólogo para su expresión en plantas, la selección de un promotor es un factor crítico. Aunque puede ser deseable expresar determinados genes únicamente como respuesta a estímulos particulares o confinados en células o tejidos específicos, otros genes se expresan de forma más deseable constitutivamente, es decir, en toda la planta y en todo momento y la mayoría de tejidos y órganos. En el pasado se ha usado ampliamente el promotor 35S de Virus del Mosaico de la Coliflor (promotor CaMV 35S) para la expresión constitutiva de genes heterólogos en plantas. Sin embargo, hay ocasiones en las que es deseable usar promotores alternativos. Por lo tanto, un objetivo principal de la presente invención es proporcionar dichos promotores alternativos para la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés en plantas. La invención también proporciona moléculas de ADN recombinante, vectores de expresión y plantas transgénicas que comprenden los promotores de la presente invención.

Así, la presente invención proporciona:

una secuencia de ADN capaz de conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos asociada, en donde dicha secuencia de ADN se obtiene a partir del genoma del virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum (CmYLCV). Se prefiere una secuencia de ADN que se obtiene del promotor de longitud completa de CmYLCV y que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:1.

En particular, se proporcionan secuencias de ADN, en donde

- dicha secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:2

- dicha secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:3

- dicha secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:4

- dicha secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:5

- dicha secuencia de ADN comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:6

- dicha secuencia de ADN se hibrida en condiciones severas con una cualquiera de SEC ID Nº:1, SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:3, SEC ID Nº:4, SEC ID Nº:5 ó SEC ID Nº:6, en particular en donde la secuencia de ADN tal como se ha men-
cionado anteriormente comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº:19 ó en la SEC ID Nº:20.

La invención proporciona demás secuencias de ADN que comprenden un tira consecutiva de al menos 50 nt, preferiblemente de entre aproximadamente 400 bases y aproximadamente 650 bases, más preferiblemente de entre aproximadamente 200 bases y aproximadamente 400 bases y aún más preferiblemente de aproximadamente 350 bases de longitud de la SEC ID Nº:1, en donde dichas secuencias de ADN son capaces de conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos asociada.

En una realización particular de la invención dicha tira consecutiva de al menos 500 nt, preferiblemente de entre aproximadamente 400 bases y aproximadamente 650 bases, más preferiblemente de entre aproximadamente 200 bases y aproximadamente 400 bases, y aún más preferiblemente de aproximadamente 350 bases de longitud, tiene al menos un 75%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90% y aún más preferiblemente un 95% de identidad de secuencia con una tira consecutiva correspondiente de al menos 50 nt, preferiblemente de entre aproximadamente 400 bases y aproximadamente 650 bases, más preferiblemente de entre aproximadamente 200 bases y aproximadamente 400 bases, y aún más preferiblemente de aproximadamente 350 bases de longitud de la SEC ID Nº:1. La invención proporciona además moléculas de ADN recombinante que comprenden una región promotora de tránscrito de longitud completa aislada del virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum. Adicionalmente, la invención proporciona moléculas de ADN y cajas de expresión de ADN que comprenden una secuencia de ADN de acuerdo con la invención ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. La invención también proporciona vectores de expresión de ADN que comprenden dicho ADN recombinante y dichas cajas de expresión, respectivamente.

En particular, se proporcionan moléculas de ADN recombinante y cajas de expresión de ADN en las que la secuencia de nucleótidos de interés comprende una secuencia codificadora, particularmente en donde

- la secuencia codificadora codifica un rasgo fenotípico deseable

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- la secuencia codificadora codifica un gen marcador seleccionable o monitorizable

- la secuencia codificadora codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, valor nutricional mejorado, mejor aprovechamiento en un proceso industrial o capacidad reproductora alterada

- la secuencia codificadora codifica una proteína que confiere una ventaja selectiva positiva a las células que han sido transformadas con dicha secuencia codificadora

- la secuencia codificadora codifica una proteína que confiere una ventaja metabólica a las células que han sido transformadas con dicha secuencia codificadora que consiste en ser capaz de metabolizar un compuesto, en donde dicho compuesto es manosa o xilosa o un derivado o precursor de las mismas, o un sustrato de la proteína, o ser capaz de ser metabolizado por las células transformadas con dicha secuencia codificadora en dicho sustrato

- la secuencia codificadora codifica una enzima seleccionada del grupo de xiloisomerasas, fosfomano-isomerasa, manosa-6-fosfato isomerasa, manosa-1-fosfato isomerasa, fosfomano mutasa, manosa epimerasa, manosa o xilosa fosfatasa, manosa-6-fosfatasa, manosa-1-fosfatasa y manosa o xilosa permeasa

- la secuencia codificadora codifica una fosfomano isomerasa

- la región codificadora es no traducible

- la región codificadora no traducible procede de un gen vírico, en particular de TSWV, más particularmente del gen TSWV NP

- la secuencia codificadora codifica enzimas de valor comercial o metabolitos de la planta

- la secuencia codificadora se encuentra en orientación antisentido

La invención también proporciona vectores de expresión de ADN que comprenden una secuencia de ADN o una molécula de ADN recombinante como se ha mencionado antes. En una realización particular de la invención, dicho vector de expresión es pNOV2819 ó pNOV2819. Además se proporcionan vectores de expresión de ADN que comprenden una primera secuencia de ADN de acuerdo con la invención ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, y una segunda secuencia de ADN de acuerdo con la invención ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. En una realización específica de la invención los vectores de expresión de ADN mencionados anteriormente son capaces de alterar la expresión de un genoma vírico.

En una realización incluso más específica, el vector de expresión de ADN mencionado anteriormente comprende una primera secuencia de ADN capaz de expresar en una célula un fragmento de ARN sentido de dicho genoma vírico o una porción del mismo, y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar en una célula un fragmento de ARN antisentido de dicho genoma vírico o una porción del mismo, en donde dicho fragmento de ARN sentido y dicho fragmento de ARN antisentido son capaces de formar un ARN de cadena doble.

Se proporcionan vectores de expresión como los mencionados anteriormente en los que

-: dicho virus se selecciona del grupo que consiste en tospovirus, potivirus, potexivirus, tobamovirus, luteovirus, cucumovirus, bromovirus, closteorvirus, tombusvirus y furovirus

-: dichas secuencias de ADN comprenden una secuencia de nucleótidos derivada de un gen de proteína de membrana vírica, un gen de proteína de nucleocápsida vírica, un gen de replicasa vírica, o un gen de proteína de movimiento vírica, o porciones de los mismos

-: dicha secuencia de ADN deriva de un virus de marchitamiento y manchado de tomate (TSWV)

-: dicho ADN deriva de un gen de proteína de nucleocápsida.

La invención proporciona además células anfitrionas transformadas de forma estable con una secuencia de ADN, una molécula de ADN recombinante o un vector de expresión de ADN de acuerdo con la invención. En particular, en donde

-: la célula anfitriona es una bacteria

-: la célula anfitriona es una célula vegetal

-: la célula anfitriona es una célula vegetal seleccionada del grupo que consiste en arroz, maíz, trigo, cebada, centeno, batata, maíz dulce, alubia, guisante, escarola, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, calabaza, cáñamo, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano, semilla de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, patata, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana, y plantas leñosas tales como árboles coníferos y de hoja caduca, pero particularmente células de arroz, maíz, trigo, cebada, col, coliflor, pimiento, calabaza, melón, semilla de soja, tomate, remolacha, girasol o algodón, arroz, maíz, trigo, Sorghum bicolor, hierba, remolacha y semilla de soja

-: la célula hospedante es una célula vegetal procedente de una planta dicotiledónea

-: la célula hospedante es una célula vegetal procedente de una planta dicotiledónea seleccionada del grupo que consiste en semilla de soja, algodón, tabaco, remolacha y colza de semilla de aceite

-: la célula hospedante es una célula vegetal procedente de una planta monocotiledónea

-: la célula hospedante es una célula vegetal procedente de una planta monocotiledónea seleccionada del grupo que consiste en maíz, trigo, sorgo, centeno, avena, hierba, arroz y cebada.

Además, se proporcionan plantas, y la progenie de las mismas, transformadas de forma estable con una secuencia de ADN, una molécula de ADN recombinante o un vector de expresión de ADN de acuerdo con la invención. En particular, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en arroz, maíz, trigo, cebada, centeno, batata, maíz dulce, alubia, guisante, escarola, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, calabaza, cáñamo, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano, semilla de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, patata, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana, y plantas leñosas tales como árboles coníferos y de hoja caduca, pero particularmente arroz, maíz, trigo, cebada, col, coliflor, pimiento, calabaza, melón, semilla de soja, tomate, remolacha, girasol o algodón, arroz, maíz, trigo, Sorghum bicolor, hierba, remolacha y semilla de soja.

La presente invención describe además

-: el uso de la secuencia de ADN de acuerdo con la invención para expresar una secuencia de nucleótidos de interés

-: un método para producir una secuencia de ADN de acuerdo con la invención, en donde el ADN es producido mediante una reacción en cadena de polimerasa en la que al menos uno de los oligonucleótidos usados comprende una secuencia de nucleótidos que representa una tira consecutiva de 15, 18, 20, 22, 24 ó más pares base de la SEC ID Nº:1.

A fin de asegurar un entendimiento claro y consistente de la especificación y de las reivindicaciones, se proporcionan las siguientes definiciones:

CmYLCV: virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum.

Barajado de ADN: el barajado de ADN es un método para introducir rápida, fácil y eficientemente reestructuraciones, preferiblemente de forma aleatoria, en una molécula de ADN, o para generar intercambios de secuencias de ADN entre dos o más moléculas de ADN, preferiblemente de forma aleatoria. La molécula de ADN resultante del barajado de ADN es una molécula de ADN barajada que es una molécula de ADN que no existe de forma natural derivada de al menos una molécula molde de ADN.

Expresión: se refiere a la transcripción y/o a la traducción de un gen endógeno o de un transgén en plantas. En el caso de construcciones antisentido, por ejemplo, la expresión puede referirse únicamente a la transcripción del ADN antisentido.

Secuencia funcionalmente equivalente: se refiere a una secuencia de ADN que tiene una actividad promotora sustancialmente similar a la del promotor de longitud completa de CmYLCV, o de partes del mismo, y que en condiciones severas de hibridación se hibrida con dichas secuencias de promotor.

Gen: se refiere a una secuencia codificadora y a la secuencia reguladora asociada, en donde la secuencia codificadora se transcribe en ARN tal como mARN, rARN, tARN, snARN, ARN sentido o ARN antisentido. Ejemplos de las secuencias reguladoras son las secuencias promotoras, las secuencias 5' y 3' no traducidas y las secuencias de finalización. Otros elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, intrones.

Gen de interés: se refiere a cualquier gen que, cuando es transferido a una planta, confiere en la planta una característica deseada tal como resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, valor nutricional mejorado, mejores propiedades para su procesado industrial o capacidad reproductora alterada. El "gen de interés" también puede ser uno que sea transferido a plantas para la producción en la planta de enzimas o metabolitos de valor comercial.

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Heterólogo, tal como se usa en la presente memoria, significa de origen natural o sintético diferente. Por ejemplo, si una célula hospedante es transformada con una secuencia de ácido nucleico que no existe en la célula hospedante no transformada, se dice que dicha secuencia de ácido nucleico es heteróloga respecto a la célula hospedante. El ácido nucleico transformante puede comprender un promotor heterólogo, una secuencia codificadora heteróloga, o una secuencia de finalización heteróloga. Alternativamente, el ácido nucleico transformante puede ser completamente heterólogo o puede comprender cualquier combinación posible de secuencias de ácido nucleico heterólogas y endógenas.

Región líder: la región en un gen que se encuentra entre la posición de inicio de la transcripción y la posición de inicio de la traducción.

Gen marcador: se refiere a un gen que codifica un rasgo seleccionable o monitorizable.

Ligado operativamente a/asociado a: se dice que una secuencia de ADN reguladora está "ligada operativamente a" ó "asociada a" una secuencia de ADN que codifica para un ARN o una proteína si las dos secuencias están situadas de tal modo que la secuencia de ADN reguladora afecta a la expresión de la secuencia de ADN codificadora.

Planta: se refiere a cualquier planta, particularmente a plantas de semilla

Célula vegetal: unidad estructural y fisiológica de la planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una única célula aislada o de una célula cultivada, o como parte de una unidad superior organizada tal como, por ejemplo, un tejido vegetal o un órgano de la planta.

Material vegetal: se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de la flor, frutas, polen, tubos de polen, óvulos, sacos de embriones, células huevo, zigotos, embriones, semillas, esquejes, cultivos de células o de tejidos, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Promotor: se refiere a una secuencia de ADN que inicia la transcripción de una secuencia de ADN asociada. La región promotora también puede incluir elementos que actúan como reguladores de la expresión génica tal como activadores, potenciadores, y/o represores, y puede incluir toda o parte de la secuencia líder 5' no traducida.

Molécula de ADN recombinante: una combinación de secuencias de ADN que se unen usando tecnología de ADN recombinante.

Tecnología de ADN recombinante: procedimientos usados para unir secuencias de ADN tal como los descritos en, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Gen marcador monitorizable: se refiere a un gen cuya expresión no confiere una ventaja selectiva a una célula transformada, pero cuya expresión hace que la célula transformada sea fenotípicamente diferente de las células no transformadas.

Gen marcador seleccionable: se refiere a un gen cuya expresión en una célula vegetal proporciona a la célula una ventaja selectiva. La ventaja selectiva que poseen las células transformadas con el gen marcador seleccionable puede deberse a su capacidad para crecer en presencia de un agente selectivo negativo, tal como un antibiótico o un herbicida, en comparación con el crecimiento de células no transformadas. La ventaja selectiva que poseen las células transformadas, en comparación con las células no transformadas, también puede deberse a su capacidad nueva o mejorada para utilizar un compuesto añadido como nutriente, factor de crecimiento o fuente de energía. El gen marcador seleccionable también se refiere a un gen o a una combinación de genes cuya expresión en una célula vegetal en presencia del agente selectivo, en comparación con la ausencia del agente selectivo, tiene un efecto positivo en la célula vegetal transformada y un efecto negativo sobre la célula vegetal no transformada, por ejemplo con respecto al crecimiento, y por tanto proporciona a la célula vegetal transformada una ventaja selectiva positiva.

Identidad de secuencia: el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando programas de ordenador que se basan en algoritmos de programación dinámica. Los programas de ordenador preferidos dentro del alcance de la presente invención incluyen el programa de búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) diseñado para explorar todas las bases de datos de secuencias disponibles independientemente de si la búsqueda es de una proteína o de un ADN. La versión BLAST 2.0 (Gapped BLAST) de esta herramienta de búsqueda ha sido puesta a disposición del público en Internet (actualmente en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Usa un algoritmo heurístico, que busca alineamientos locales en lugar de globales, y por tanto es capaz de detectar relaciones entre secuencias, que comparten únicamente regiones aisladas. Las puntuaciones asignadas en una búsqueda BLAST tienen una interpretación estadística bien definida. Dichos programas se ejecutan preferiblemente fijando los parámetros opcionales en sus valores por defecto.

Transformación: se refiere a la introducción de un ácido nucleico en una célula. En particular, se refiere a la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

TSWV: virus de marchitamiento y manchado de tomate (del inglés "tomato spotted wilt virus").

La presente invención se refiere a secuencias de ADN que pueden obtenerse del genoma del virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum (CmYLCV). Se prefieren las secuencias de ADN que pueden obtenerse a partir del promotor de longitud completa de CmYLCV que sean capaces de conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos asociada de interés. Las secuencias de ADN que comprenden equivalentes funcionales y/o estructurales de las mismas también quedan abarcadas por la invención. Por tanto, la presente invención se refiere a secuencias de ADN que actúan como promotores de transcripción de secuencias de nucleótidos asociadas. La región promotora también puede incluir elementos que actúan como reguladores de la expresión génica tal como activadores, potenciadores, y/o represores, y puede incluir toda o parte de la secuencia líder 5' no traducida del mARN transcrito. En una realización preferida de la invención, dicha secuencia de ADN confiere expresión constitutiva a una secuencia de nucleótidos asociada. La expresión constitutiva significa que la secuencia de nucleótidos de interés se expresa en todo momento en la mayoría de los tejidos y órganos. Cuando se evalúa en asociación con un gen informador GUS o CAT en ensayos de expresión transitoria, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención confiere un elevado nivel de expresión del gen informador GUS o CAT. Por tanto, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención es útil para un elevado nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos asociada de interés, que preferiblemente es una secuencia codificadora. El especialista en la técnica puede apreciar que la secuencia codificadora asociada de interés puede expresarse en orientación sentido o antisentido. Además, la secuencia codificadora de interés puede ser de origen heterólogo u homólogo con respecto a la planta que se va a transformar. En el caso de una secuencia codificadora homóloga, la secuencia de ADN de acuerdo con la invención es útil para la expresión ectópica de dicha secuencia. En una realización particular de la invención, la expresión de la secuencia codificadora de interés bajo el control de una secuencia de ADN de acuerdo con la invención suprime su propia expresión y la de la copia original del gen mediante un proceso denominado
cosupresión.

Los promotores de la presente invención pueden obtenerse a partir de ADN genómico de virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum (CmYLCV), que puede aislarse, por ejemplo, de plantas Cestrum parqui infectadas. Las plantas Cestrum parqui infectadas con CmYLCV se identifican por malformaciones de arrugas en las hojas y por sus mosaicos de hojas. A continuación el ADN es secuenciado y analizado. La comparación de secuencia con secuencias de las bases de datos muestra que la organización genómica del CmYLCV está relacionada con uno de los otros miembros de la familia de Caulimovirus. El CmYLCV contiene 8 marcos de lectura abiertos. La comparación de secuencia de los productos génicos de CmYLCV muestra que el producto génico I está implicado en los movimientos intracelulares: el gen A codifica una pequeña proteína de función desconocida, el gen B codifica el factor de transmisión áfida; el gen C codifica una proteína asociada a virión; el gen IV es la proteína principal de la cápsida; el gen V codifica una transcriptasa inversa y el gen VI activa en trans la traducción de genes víricos en el tránscrito de longitud completa. De especial interés es el denominado promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV.

El especialista en la técnica apreciará que pueden usarse varias regiones del promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV de acuerdo con la invención. Una realización particular de la invención es la región de promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV mostrada en la SEC ID Nº:1, denominada promotor CmpD. Esta secuencia contiene 350 pb de promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV y 320 pb de la secuencia líder 5' no traducida del tránscrito de longitud completa de CmYLCV. Esta secuencia se obtiene mediante secuenciamiento de ADN genómico de CmYLCV. Las secuencias promotora y líder, respectivamente, se identifican por comparación con secuencias de la base de datos. En la SEC ID Nº:19 se muestra una variante de la SEC ID Nº:1, denominada CmpE, en la que la secuencia líder 5' no traducida del tránscrito de longitud completa de CmYLCV es de 318 pb en lugar de 320 pb.

Una realización preferida de la invención es la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº:2, denominada promotor CmpC. El promotor CmpC es un fragmento de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº:1 y contiene 346 pb de promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV, correspondientes a las bases 5 a 350 de la SEC ID Nº:1. Esta secuencia de ADN puede obtenerse mediante PCR con ADN genómico procedente de virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum o de plantas Cestrum parqui infectadas con virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum usando el cebador de dirección hacia adelante Cmp1 (SEC ID Nº:13) y el cebador inverso CmpC2 (SEC ID Nº:14). La caja TATA putativa del promotor CmpC está localizada entre las bases 308 y 315 de la SEC ID Nº:2. El promotor CmpC contiene al menos 3 regiones putativas potenciadoras. La región potenciadora 1 que tiene la secuencia de nucleótidos CAAT está localizada entre las bases 232 y 235 de la SEC ID Nº:2, y la región potenciadora que también tiene la secuencia de nucleótidos CAAT está localizada entre las bases 243 y 246 de la SEC ID Nº:2. La región potenciadora 3 está localizada entre las bases 246 y 253 de la SEC ID Nº:2 y tiene la secuencia de nucleótidos TGACGTAA.

Otra realización preferida de la invención es el ADN mostrado en la SEC ID Nº:3, denominado promotor CmpS. El promotor CmpS también es un fragmento de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1 y contiene los 346 pb de la SEC ID Nº:2 más los 54 pb de la región líder del promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV. La región líder es una secuencia de nucleótidos que precede a la región codificadora que está transcrita pero no traducida en la proteína. El especialista en la técnica apreciará que la región líder puede contener elementos reguladores con funciones importantes en la expresión génica. El promotor CmpS puede obtenerse mediante PCR con ADN genómico procedente de virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum o de plantas Cestrum parqui infectadas con virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum usando el cebador de dirección hacia adelante Cmp1 (SEC ID Nº:13) y el cebador inverso CmpS2 (SEC ID Nº:15). El promotor CmpS contiene al menos 2 regiones putativas potenciadoras en la región líder. La región potenciadora 4 (GAGAGA) está localizada entre las bases 354 y 359 de la SEC ID Nº:3 y la región potenciadora 5 (GAGAGAGA) está localizada entre las bases 368 y 375 de la SEC ID Nº:3.

Otra realización adicional de la invención es la secuencia mostrada en la SEC ID Nº:4, denominada promotor CmpL. Como los promotores precedentes, el promotor CmpL es un fragmento de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1 y contiene los 346 pb de la SEC ID Nº:2 más los 288 pb de la secuencia líder 5' no traducida del promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV. El promotor CmpL puede obtenerse mediante PCR con ADN genómico procedente de virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum o de plantas Cestrum parqui infectadas con virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum usando el cebador de dirección hacia adelante Cmp1 (SEC ID Nº:13) y el cebador inverso CmpL2 (SEC ID Nº:16). En la SEC ID Nº:20 se muestra una variante de la SEC ID Nº:4, denominada CmpF, en la que la secuencia líder 5' no traducida del tránscrito de longitud completa de CmYLCV es de 286 pb en lugar de 288 pb. El especialista en la técnica apreciará que las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEC ID Nºs: 1, 2, 3, 4, 19 y 20 pueden extenderse en sus extremos 5' y 3' con secuencias de nucleótidos homólogas o heterólogas. Por ejemplo, el extremo 5' de las SEC ID Nºs: 1, 2, 3, 4, 19 y 20 pueden extenderse con todos o con parte de los nucleótidos mostrados en la SEC ID Nº:6. La SEC ID Nº:6 se encuentra de forma natural por encima de las SEC ID Nºs: 2, 3, 4 y 20, y contiene parte del ORF (marco de lectura abierto del inglés "open reading frame") VI de CmYLCV (de la base 1 a la base 100 de la SEC ID Nº:6), así como parte del promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV (de la base 101 a la base 104 de la SEC ID Nº:6). Asimismo, los extremos 3' de las SEC ID Nºs: 2, 3, 4 y 20 pueden ser extendidos con todos o con parte de los nucleótidos mostrados en la SEC ID Nº:5, que representan la secuencia de nucleótidos encontrada de forma natural en el extremo 3' de las SEC ID Nºs: 4 y 20, y que comprende parte de la secuencia líder de tránscrito de longitud completa de CmYLCV.

Tal como se ha descrito anteriormente, las secuencias de ADN de la invención pueden obtenerse, por ejemplo, mediante PCR con ADN genómico procedente de virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum o de plantas Cestrum parqui infectadas con el virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum. Alternativamente, las secuencias de ADN de la invención pueden obtenerse a partir de cualquier otro virus de la familia Caulomovirus que comprenda homólogos de la secuencia de ADN de la invención, usando cebadores específicos de secuencia. En base a las secuencias de nucleótidos mostradas de la SEC ID Nº:1 a la SEC ID Nº:6 y en las SEC ID Nºs 19 y 20, será evidente para el especialista en la técnica que se puede elegir cualquier combinación de cebador de interés para amplificar mediante PCR los fragmentos de diversas longitudes que pueden usarse de acuerdo con la invención. Por tanto, la invención incluye fragmentos derivados de los promotores de tránscrito de longitud completa de CmYLCV que funcionan de acuerdo con la invención, es decir, que son capaces de conferir expresión de una secuencia de nucleótidos asociada. Esto puede evaluarse generando dichos fragmentos de promotor, fusionándolos a un gen marcador monitorizable y ensayando la retención de actividad promotora de las construcciones resultantes de la fusión. Dichos ensayos están dentro de las capacidades de una persona especialista en la técnica. Los fragmentos de ADN preferidos de la invención tienen una longitud de al menos aproximadamente 50 bases, preferiblemente de entre aproximadamente 400 y aproximadamente 650 bases, más preferiblemente de entre aproximadamente 200 y aproximadamente 400 bases, y aún más preferiblemente de aproximadamente 350 bases.

También será evidente para el especialista en la técnica la posibilidad de introducir mutaciones, inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de uno o más nucleótidos en las secuencias de ADN de las SEC ID Nºs: 1, 2, 3, 4, 5 y 6 o de fragmentos más largos o más cortos derivados de la información de secuencia de las mismas usando métodos conocidos en la técnica. Además, se puede variar una secuencia de nucleótidos modificada o no modificada barajando la secuencia de la invención. Para evaluar la función de secuencias de ADN variante de acuerdo con la invención, la secuencia de interés se liga operativamente a un gen marcador seleccionable o monitorizable y se ensaya la expresión del gen marcador en ensayos de expresión transitoria con protoplastos o en plantas transformadas de forma estable. El especialista en la técnica apreciará que las secuencias de ADN capaces de conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos asociada se construyen de forma modular. Por consiguiente, los niveles de expresión de fragmentos de los ADN más cortos pueden ser diferentes del correspondiente al fragmento más largo, y pueden ser diferentes unos de otros. Por ejemplo, la eliminación de un elemento que regula a la baja antes del extremo 5' conducirá a un aumento de los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos asociada, mientras que la eliminación de un elemento que regule al alza disminuirá los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos asociada. El especialista en la técnica también apreciará que la eliminación de un elemento específico del desarrollo o específico de un tejido conducirá a un perfil de expresión temporal o espacialmente alterado de la secuencia de nucleótidos asociada. La presente invención también abarca equivalentes funcionales de los promotores de la presente invención, es decir, secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones severas con una cualquiera de SEC ID Nº:1, SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:3, SEC ID Nº:4, SEC ID Nº:5 ó SEC ID Nº:6, tal como, por ejemplo, las secuencias mostradas en SEC ID Nº:19 y SEC ID Nº:20. Se lleva a cabo una hibridación severa a una temperatura de 65ºC, preferiblemente 60ºC y aún más preferiblemente 55ºC en disolución salina tamponada de citrato (SSC) de doble fuerza (2X) que contiene un 0,1% de SDS, seguido de un enjuague del soporte a la misma temperatura pero con un tampón que tiene una concentración de SSC reducida. Dichos tampones de concentración reducida normalmente tienen un décimo de fuerza (0,1X SSC) con un 0,1% de SDS, preferiblemente 0,2X SSC con un 0,1% de SDS, y aún más preferiblemente SSC de media fuerza (0,5X SSC) con un 0,1% de SDS. De hecho, se pueden encontrar equivalentes funcionales de todo o de parte del promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV en otros organismos mediante hibridación de una cualquiera de SEC ID Nº:1, SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:3, SEC ID Nº:4, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:6, SEC ID Nº:19 ó SEC ID Nº:20 con ADN genómico aislado de un organismo de interés, particularmente de otro Caulimovirus. El especialista en la técnica sabe cómo proceder para descubrir dichas secuencias, puesto que existen múltiples modos conocidos en la técnica para identificar secuencias homólogas en otros organismos. Dichas moléculas de ADN recién identificadas pueden ser secuenciadas entonces y la secuencia se puede comparar con una cualquiera de SEC ID Nº:1, SEC ID Nº:2, SEC ID Nº:3, SEC ID Nº:4, SEC ID Nº:5, SEC ID Nº:6, SEC ID Nº:19 ó SEC ID Nº:20, y se puede evaluar su actividad de promotor. El alcance de la presente invención abarca moléculas de ADN que tienen al menos un 75%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, y aún más preferiblemente un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEC ID Nºs:1, 2, 3, 4 ó 6 por una longitud de al menos 50 nucleótidos. el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando programas de ordenador que se basan en algoritmos de programación dinámica. Los programas de ordenador preferidos dentro del alcance de la presente invención incluyen el programa de búsqueda BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) diseñado para explorar todas las bases de datos de secuencias disponibles independientemente de si la búsqueda es de una proteína o de un ADN. La versión BLAST 2.0 (Gapped BLAST) de esta herramienta de búsqueda ha sido puesta a disposición del público en Internet (actualmente en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Usa un algoritmo heurístico, que busca alineamientos locales en lugar de globales, y por tanto es capaz de detectar relaciones entre secuencias, que comparten únicamente regiones aisladas. Las puntuaciones asignadas en una búsqueda BLAST tienen una interpretación estadística bien definida. Preferiblemente dichos programas se ejecutan con los parámetros opcionales fijados en los valores por defecto. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar moléculas de ADN recombinante que comprenden una secuencia de ADN de acuerdo con la invención ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. La secuencia de nucleótidos de interés puede, por ejemplo, codificar un ARN ribosomal, un ARN antisentido o cualquier otro tipo de ARN que no esté traducido en la proteína. En otra realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos de interés se traduce en un producto de proteína. La secuencia de nucleótidos asociada a la secuencia promotora puede ser de origen homólogo o heterólogo con respecto a la planta que se va a transformar. La secuencia también puede ser completa o parcialmente sintética. Independientemente del origen, la secuencia de ADN asociada se expresará en la planta transformada de acuerdo con las propiedades de expresión del promotor al que está ligado. En caso de secuencias de nucleótidos homólogas asociadas a la secuencia de promotor, el promotor de la invención es útil para la expresión ectópica de dichas secuencias homólogas. Expresión ectópica significa que la secuencia de nucleótidos asociada a la secuencia de promotor se expresa en tejidos y órganos y/o en momentos en los que dicha secuencia no puede ser expresada bajo el control de su propio promotor. En una realización particular de la invención, la expresión de secuencia de nucleótidos asociada a la secuencia de promotor suprime su propia expresión y la de la copia original del gen mediante un proceso denominado cosupresión.

En una realización preferida de la invención la secuencia de nucleótidos asociada puede codificar una proteína que se desee que sea expresada en la planta en todo momento y en la mayoría de los tejidos y órganos. Preferiblemente, dichas secuencias codifican proteínas que confieren un rasgo fenotípico deseable a la planta transformada. Los ejemplos son secuencias de nucleótidos que codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, valor nutricional mejorado, mejor aprovechamiento en un proceso industrial o capacidad reproductora alterada. La secuencia de nucleótidos asociada también puede ser una que sea transferida a plantas para la producción en la planta de enzimas o metabolitos de valor comercial. La presente invención también abarca genes marcadores seleccionables o monitorizables, es decir, genes que comprenden una secuencia de ADN de la invención ligada operativamente a una región codificadora que codifica un rasgo seleccionable o monitorizable.

Más adelante se describen ejemplos de genes marcadores seleccionables o monitorizables. Para determinadas especies diana, pueden preferirse diferentes marcadores de selección antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección usados de forma rutinaria en la transformación incluyen el gen nptII, que confiere resistencia a canamicina, paromomicina, geneticina y antibióticos relacionados (Vieira y Messing, 1982, Gene 19: 259-268; Bevan y col., 1983, Nature 304: 184-187) el gen bacteriano aadA (Goldschmidt-Clermont, 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089), que codifica aminoglicósido 3'-adenililtransferasa y confiere resistencia a estreptomicina o a espectinomicina, el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochlinger y Diggelmann, 1984, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931), y el gen dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Bourouis y Jarry, 1983, EMBO J. 2: 1099-1104). Otros marcadores que se van a usar incluyen un gen de fosfinotricina acetiltransferasa, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y col., 1990, Nucl. Acids Res. 18: 1062; Spencer y col. 1990, Theor. Appl. Genet. 79: 625-631), un gen mutante de EPSP sintasa que codifica resistencia a glifosato (Hinchee y col., 1988, Bio/Technology 6: 915-922), un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinona o a sulfonilurea (Lee y col., 1988, EMBO J. 7: 1241-1248), un gen mutante psbA que confiere resistencia a atracina (Smeda y col., 1993, Plant Physiol. 103: 911-917), o un gen mutante de protoporfirinógeno oxidasa como el descrito en el documento EP 0 769 059. La identificación de células transformadas también puede llevarse a cabo mediante la expresión de genes marcadores monitorizables tales como los genes que codifican cloramfenicol acetil transferasa (CAT), \beta-glucuronidasa (GUS), luciferasa (LUC), y proteína verde fluorescente (GFP) o cualquier otra proteína que confiera un rasgo fenotípicamente distinto a la célula transformada. También se usan marcadores de selección que dan lugar a selección positiva, tal como el gen de fosfomanosa isomerasa, tal como se describe en la solicitud de patente WO 93/05163. Otros genes que pueden usarse para la selección positiva se describen en el documento WO 94/20627 y codifican xiloisomerasas y fosfomano-isomerasas tales como la manosa-6-fosfato isomerasa y la manosa-1-fosfato isomerasa; fosfomano mutasa; manosa epimerasas tales como las que convierten carbohidratos en manosa o manosa en carbohidratos tales como glucosa o galactosa; fosfatasas tales como manosa o xilosa fosfatasa, manosa-6-fosfatasa y manosa-1-fosfatasa, y permeasas que están implicadas en el transporte de manosa, o de un derivado o precursor de la misma al interior de la célula. El agente que reduce la toxicidad del compuesto para las células normalmente es un derivado de glucosa tal como metil-3-O-glucosa o floridzin. Las células transformadas son identificadas sin dañar o matar a las células no transformadas de la población, y sin co-introducción de genes de resistencia a antibióticos o a herbicidas. Tal como se describe en el documento WO 93/05163, además del hecho de que se elimina la necesidad de genes de resistencia frente a antibióticos o herbicida, se ha demostrado que el método de selección positiva a menudo es más eficiente que la selección negativa tradicional.

Por lo tanto, los promotores de la presente invención preferiblemente están ligados operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una región que: (a) codifica una proteína que está implicada en el metabolismo del compuesto, y/o (b) regula la actividad del gen que codifica la proteína, en donde el compuesto es manosa o xilosa o un derivado o precursor de las mismas, o un sustrato de la proteína, o es capaz de ser metabolizado por las células transformadas en un sustrato de ese tipo. Dicha secuencia de nucleótidos puede codificar una manosa-6-fosfato isomerasa y el compuesto puede ser manosa. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos puede codificar una fosfoazúcar-isomerasa, una fosfoazúcar-mutasa tal como la fosfomano mutasa, una fosfatasa tal como la manosa-6-fosfatasa, una azúcar-epimerasa, una azúcar-permeasa, una fosfoazúcar-permeasa o una xilosa isomerasa, y el compuesto puede ser manosa, manosa-6-fosfato, D-manosamina o xilosa.

En una realización preferida de la invención, los promotores de la invención están ligados operativamente a la región codificadora del gen manA de E. coli (Joersbo y Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto y col., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803), que codifica una fosfomanosa isomerasa (PMI), y un terminador Nos (nopalina sintetasa) obtenido de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y col., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982)). El especialista en la técnica apreciará que el terminador Nos puede ser sustituido por cualquier otro terminador que funcione en plantas. El promotor de la invención puede ser el promotor CmpD, CmpC, CmpS, CmpL, CmpB, CmpA, CmpE o CmpF, mostrados en las SEC ID Nºs 1 a 6 y 19 a 20, o cualquier otro promotor derivado de ellas. En una realización incluso más preferida de la invención, el promotor es el promotor CmpS mostrado en la SEC ID Nº:3.

Los promotores de la presente invención también pueden usarse para proporcionar resistencia o tolerancia a virus ligando operativamente los promotores de la invención a regiones codificadoras de genes de los virus que se pretenda controlar.

Para el control de virus de cadena negativa tal como el virus de marchitamiento y manchado de tomate (TSWV), la proteína vírica de nucleocápsida (NP) y la proteína del movimiento (MP), se pueden usar secuencias de genes, y para virus que pertenezcan al supergrupo tipo Alfa, tal como el TMV y el CMV, se pueden usar secuencias de genes de ARN-polimerasa ARN-dependiente (RdRp) y de proteína del movimiento (MP). Para virus que pertenecen al supergrupo tio Picorna, que incluye los potivirus, se puede ligar cualquier secuencia vírica a los promotores de la invención. Finalmente, para todos los demás virus, incluyendo los virus de ADN, se pueden usar secuencias génicas de ARN-polimerasa ARN-dependiente (RdRp) o secuencias asociadas a replicasa. Dichas construcciones para el control de virus pueden construirse tal como se muestra en el Ejemplo 8 y en el Ejemplo 9 del documento WO 00/68374. El especialista en la técnica tiene la capacidad de sustituir los promotores descritos en el documento WO 00/68374 por los promotores de la presente invención. Siguiendo lo mostrado en WO 00/68374 el especialista en la técnica también sabría cómo preparar construcciones que comprenden los promotores de la invención ligados operativamente a secuencias víricas como las mencionadas anteriormente en la presente memoria para conferir resistencia o tolerancia a dicho virus.

En lugar de expresar ARN vírico de doble cadena en plantas transgénicas, como se describe en el documento WO 00/68374, el ARN vírico también puede expresarse como ARN no traducible más molécula de ARN vírica sentido tal como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente US 558.302 o en los Ejemplos 12 y 13 de la presente invención.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ADN de la invención fusionada con una secuencia de nucleótidos de interés. En estos vectores, se puede insertar ADN ajeno en una región de poliligadura de tal modo que se pueden expresar secuencias exógenas en una célula hospedante adecuada que, por ejemplo, puede ser de origen bacteriano o vegetal. Por ejemplo, el plásmido pBI101 derivado del vector binario pBIN19 de Agrobacterium tumefaciens permite la clonación y la evaluación de promotores usando la señal de expresión de beta-glucuronidasa (GUS) (Jefferson y col., 1987, EMBO J 6: 3901-3907). El tamaño del vector es 12,2 kb. Tiene un origen de replicación RK2 de copia baja y confiere resistencia a canamicina tanto en bacterias como en plantas. Existen otros muchos vectores de expresión que el especialista en la técnica conocerá y que pueden ser usados de acuerdo con la invención.

Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar plantas transgénicas que comprenden las secuencias de ADN recombinante de la invención. Por tanto, la invención se refiere a células vegetales, a plantas que derivan de dichas células, a material vegetal, a la progenie y a las semillas derivadas de dichas plantas, y los productos agrícolas con propiedades mejoradas obtenidos mediante uno cualquiera de los métodos de transformación descritos más adelante. Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, aunque sin limitación, arroz, maíz, trigo, cebada, centeno, batata, maíz dulce, alubia, guisante, escarola, calabaza, cáñamo, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano, semilla de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, patata, berenjena, pepino, Arabidopsis thaliana, y plantas leñosas tales como árboles coníferos o de hoja caduca. Las plantas preferidas para ser transformadas son arroz, maíz, trigo, cebada, col, coliflor, pimiento, escarola, melón, semilla de soja, tomate, remolacha, girasol o algodón, pero especialmente arroz, maíz, trigo, Sorghum bicolor, hierba, remolacha y semilla de soja. Las secuencias de ADN recombinante de la invención pueden introducirse en la célula vegetal siguiendo una serie de métodos bien conocidos. Los especialistas en la técnica apreciarán que la elección de dicho método podría depender del tipo de planta que se está tratando para la transformación, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen la microinyección (Crossway y col., 1986, Bio Techniques 4: 320-334), la electroporación (Riggs y Bates, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (Hinchee y col., 1988, Bio/Technology 6: 915-922; EP 0 853 675), la transferencia directa de genes (Paszkowski y col., 1984, EMBO J. 3: 2717-2722), y aceleración de partícula balística usando dispositivos disponibles en Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. nº 4.945.050 y McCabe col., 1988, Bio/Technology 6: 923-926). Las células que se van a transformar pueden ser células de hoja diferenciadas, células embriogénicas, o cualquier otro tipo de célula. En la transformación directa de protoplastos, la captación de material genético exógeno dentro de un protoplasto puede potenciarse mediante el uso de un agente químico o de un campo eléctrico. El material exógeno puede integrarse entonces en el genoma nuclear. El trabajo previo se ha llevado a cabo en plantas de tabaco dicotiledóneas, que dio como resultado el que el ADN ajeno se incorporase y se transfiriese a las plantas de la progenie (Paszkowski y col., 1984, EMBO J. 3: 2712-2722; Potrykus y col., 1985, Mol. Gen. Genet 199: 169-177). Los protoplastos monocotiledóneos, por ejemplo, de Triticum monococcum, Lolium multiflorum (hierba de centeno italiana), maíz y maíz dulce Mejicano Negro, son transformados mediante este procedimiento. Una realización adicional preferida es el método de transformación de protoplastos para maíz descrito en la solicitud de patente EP 0 292 435, así como en la EP 0 846 771. Para la transformación de maíz véase también Koziel y col., 1993, Bio/Technology 11: 194-200. La transformación de arroz se puede llevar a cabo mediante técnicas de transferencia génica directa utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por protoplastos se ha descrito para los tipos Japonica e Indica (Zhang y col., 1988, Plant Cell Rep., 7: 379-384; Shimamoto y col., 1989, Nature 338: 274-276; Datta y col., 1990, Bio/Technology 8: 736-740). Los dos tipos descritos antes también pueden transformarse de forma rutinaria usando bombardeo de partículas (Christou y col., 1991, Bio/Technology 9: 957-962). La solicitud de patente nº EP 0 332 581 describe técnicas para la generación, transformación y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de todas las plantas Pooideae, incluyendo la Dactylis y el trigo. Además, la transformación de trigo se describe en la solicitud de patente nº EP 0 674 715; y en Weeks y col., 1993 (Plant Physiol. 102: 1077-1084). El vector de expresión vegetal así construido puede, por ejemplo, ser introducido en el callo de arroz de acuerdo con el método de transformación de plantas convencional, y a partir de ahí se induce la diferenciación de raíces y hojas, y entonces se puede transferir a un tiesto para su cultivo, obteniendo con ello el arroz transformado.

Las plantas resultantes de la transformación con las secuencias o vectores de ADN de la presente invención expresarán una secuencia de nucleótidos de interés por toda la planta y en la mayoría de tejidos y órganos.

Las propiedades genéticas modificadas en las plantas transgénicas descritas anteriormente son transferidas mediante reproducción sexual o crecimiento vegetal, y por tanto pueden mantenerse y propagarse en plantas de progenie. Generalmente dicho mantenimiento y propagación hace uso de métodos agrícolas conocidos desarrollados para adecuarse a propósitos específicos tales como labranza, siembra o cosecha. También se pueden aplicar procesos especializados tales como tecnologías hidropónicas o de invernadero. El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas transgénicas de acuerdo con la invención también puede efectuarse en el cultivo de plantas dirigido al desarrollo de plantas con propiedades mejoradas tales como tolerancia a plagas, herbicidas, o estrés, valor nutricional mejorado, rendimiento mejorado, o estructura mejorada que cause una menor pérdida en el alojamiento o por aplastamiento. Las diversas etapas de cultivo se caracterizan por una intervención humana bien definida tal como seleccionar las líneas que se van a cruzar, dirigir la polinización de las líneas parentales, o seleccionar plantas de progenie apropiadas. Dependiendo de las propiedades deseadas se toman diferentes medidas de cultivo. Las técnicas relevantes son bien conocidas en la técnica e incluyen, sin limitación, hibridación, reproducción interna, reproducción retrocruzada, reproducción multilínea, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. Las técnicas de hibridación también incluyen la esterilización de plantas para producir plantas estériles macho o hembra por medios mecánicos, químicos o bioquímicos. La polinización cruzada de una planta macho estéril con polen de una línea diferente asegura que el genoma de la planta macho estéril pero hembra fértil obtendrá uniformemente propiedades de ambas líneas parentales. Por tanto, las plantas transgénicas de acuerdo con la invención pueden usarse para la reproducción de líneas vegetales mejoradas que, por ejemplo, aumenten la eficacia de métodos convencionales tales como el tratamiento con herbicida o pesticida, o que permitan su tratamiento con dichos métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas. Alternativamente, se pueden obtener nuevos cultivos con tolerancia al estrés mejorada que, debido a su "equipamiento" genético optimizado, dan lugar a un producto cosechado con mejor calidad que los productos que no fueron capaces de tolerar una condiciones adversas comparables durante el desarrollo.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar secuencias de ADN que pueden ser usadas para expresar una secuencia de nucleótidos de interés en un organismo deseado. Dicho organismo puede ser una bacteria, una planta o cualquier otro organismo de interés.

Además, la descripción de las SEC ID Nºs:1 a 6 permite al especialista en la técnica diseñar oligonucleótidos para reacciones en cadena de polimerasa que pretendan amplificar fragmentos de ADN a partir de moldes que comprenden una secuencia de nucleótidos que se caracteriza por cualquier secuencia continua de 15, y preferiblemente de 20 a 30 o más, pares base en las SEC ID Nºs: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Dichos nucleótidos comprenden una secuencia de nucleótidos que representa 15, y preferiblemente de 20 a 30 o más, pares base de las SEC ID Nºs: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Las reacciones en cadena de polimerasa llevadas a cabo usando al menos un oligonucleótido y sus productos de amplificación constituyen otra realización de la presente invención.

Breve descripción de las secuencias del listado de secuencias

SEC ID Nº:1: CmpD

SEC ID Nº:2: CmpC

SEC ID Nº:3: CmpS

SEC ID Nº:4: CmpL

SEC ID Nº:5: CmpB

SEC ID Nº:6: CmpA

SEC ID Nº:7: cebador directo S1

SEC ID Nº:8: cebador inverso S2

SEC ID Nº:9: cebador directo GUS

SEC ID Nº:10: cebador inverso GUS

SEC ID Nº:11: cebador directo CAT

SEC ID Nº:12: cebador inverso CAT

SEC ID Nº:13: cebador directo Cmp1

SEC ID Nº:14: cebador inverso CmpC2

SEC ID Nº:15: cebador inverso CmpS2

SEC ID Nº:16: cebador inverso CmpL2

SEC ID Nº:17: cebador directo PA

SEC ID Nº:18: cebador inverso PA

SEC ID Nº:19: CmpE

SEC ID Nº:20: CmpF

SEC ID Nº:21: cebador directo de terminador NOS

SEC ID Nº:22: cebador inverso de terminador NOS

SEC ID Nº:23: cebador directo de gen NP de TSWV

SEC ID Nº:24: cebador inverso de gen NP de TSWV

SEC ID Nº:25: cebador directo de promotor de CmYLCV

SEC ID Nº:26: cebador inverso de promotor de CmYLCV

SEC ID Nº:27: posición de multiclonación AGLINK

SEC ID Nº:28: posición de multiclonación BIGLINK

SEC ID Nº:29: cebador de Cmpf-B

SEC ID Nº:30: cebador de CmpS-B

SEC ID Nº:31: pNOV2804; vector binario, contiene una caja de expresión de terminador nos y PMI sin promotor

SEC ID Nº:32: pNOV3604; vector para transformación mediante biolística, contiene una caja de expresión de terminador nos y PMI sin promotor

SEC ID Nº:33: cebador inverso CmpMr

SEC ID Nº:34: cebador directo CmpMf

SEC ID Nº:35: cebador inverso CmpMrs

SEC ID Nº:36: cebador directo CmpMfs

SEC ID Nº:37: synGFPI; gen vegetal GFP optimizado con intrón

SEC ID Nº:38: GIG; gen GUS con intrón

SEC ID Nº:39: cebador inverso Cmp-C

SEC ID Nº:40: caja de expresión CmpS-synGFPI-nos

SEC ID Nº:41: caja de expresión CmpS-GIG-nos

SEC ID Nº:42: caja de expresión CmpC-synGFPI-nos

SEC ID Nº:43: caja de expresión CmpC-GIG-nos

SEC ID Nº:44: vector pNOV2117

SEC ID Nº:45: vector pNOV4200

SEC ID Nº:46: caja de expresión de término ZmUbi-GFP-35S

SEC ID Nº:47: caja de expresión ZmUbi-GlG-nos

SEC ID Nº:48: caja de expresión Ubq3(At)-synGFPI-nos

SEC ID Nº:49: caja de expresión Ubq3(At)-GIG-nos

Ejemplos

Las técnicas estándares de clonación molecular y de ADN recombinante usadas aquí son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, y en Ausubel y col.,1994, "Current protocols in molecular biology", John Wiley and Sons, Nueva York.

Ejemplo 1 Clonación de virus

1. Extracción de ADN Se extrae ADN genómico vírico de plantas Cestrum parqui infectadas con virus del rizado de hoja amarilla de Cestrum. Se homogenizan cinco gramos de hojas infectadas en 30 mL de tampón de molienda (Tris 0,2 M pH 7,0; EDTA 0,02 M; Urea 2 M) durante 60 segundos a máxima velocidad en un homogeneizador Brinkman Polytron con sonda PT10, y se agitan suavemente a 4ºC durante una noche con Triton X-100 (concentración final del 2%). El virus se purifica a partir del homogenato bruto mediante centrifugación a baja velocidad (10.000 rpm durante 20 minutos en un rotor Sorvall SS-34) y a partir del sobrenadante obtenido mediante centrifugación a alta velocidad (27.000 rpm durante 2 horas en un rotor Beckman SW-28) a través de una amortiguación de sacarosa (3 mL de sacarosa al 15%). La partícula que contiene el virus se vuelve a suspender entonces en Tris 0,1 M, pH 7,4; MgCl_{2} 2,5 mM. Se añaden ADNasa I (Sigma) y ARNasa A (Sigma) en una concentración de 10 mg/mL cada una. Después de 30 minutos a 37ºC, la reacción se detiene mediante la adición de EDTA a 10 mM. El ADN de virus se aísla de partículas de CmYLCV mediante tratamiento con proteasa K (E. Merck, concentración final de 0,5 mg/mL) en presencia de SDS al 1% a 65ºC durante 15 minutos. A continuación el ADN vírico se purifica mediante extracción con fenol y mediante precipitación en etanol. El ADN vírico que contiene el precipitado de etanol final se disuelve en agua.

2. Amplificación y clonación de ADN Se usan cien nanogramos del ADN obtenido como molde para amplificación PCR en un volumen de reacción de 50 pL que contienen 10 uM de cada cebador, 25 mM de cada dNTP, 5 pL de pfu de tampón de reacción (Stratagene) y 2,5 unidades de pfu turbo ADN polimerasa (Stratagene). Se usó un cebador directo S1 (gaccacaaacatcagaag, SEC ID Nº:7) y un cebador inverso S2 (caaacttattgggtaatc, SEC ID Nº:8) para la reacción PCR. Los parámetros del ciclo de PCR son: 1x (94ºC durante 1 minuto); 30x (94ºC durante 1 minuto, 50ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto); 1x (72ºC durante 10 minutos). Cada fragmento individual de ADN es clonado en plásmido pPCR-Script^{TM} Amp SK(+) (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 2 Secuenciamiento de ADN

El secuenciamiento de clones víricos de ADN se lleva a cabo usando el secuenciador de ADN automatizado ABI PRISM 377 (Perkin Elmer) y el kit de secuenciamiento de ciclo terminador ABI PRISM dRhodamine (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores S1 y S2 descritos (Ejemplo 1) se usan para las reacciones de secuenciamiento como cebadores Inverso y M13-20 universales.

Ejemplo 3 Construcción de plásmidos para expresión transitoria

Todas las reacciones PCR se llevan a cabo con Pfu polimerasa (Stratagene) tal como se describe en el Ejemplo 1.

1. Amplificación de genes informadores Los genes informadores beta-glucuronidasa (GUS) y cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) son amplificados. Para la amplificación del gen GUS se usan oligonucleótidos GUS hacia adelante (cagggtaccactaaaatcacc, SEC ID Nº:9) y GUS inverso (aggggatccccaattcccc, SEC ID Nº:10) a la temperatura de maduración de 60ºC. Los oligonucleótidos CAT hacia adelante (aggggtaccatcgatatggag, SEC ID Nº:11) y CAT inverso (ttaggatccgccctgccac, SEC ID Nº: 12) se maduran a 62ºC. Los cebadores hacia adelante se diseñan para contener una posición de reconocimiento KpnI y los inversos una posición BamHI.

2. Amplificación de promotor de CmULCV Se seleccionan tres fragmentos de promotor diferentes. CmpC (SEC ID Nº:2), CmpS (SEC ID Nº:3), y CmpL (SEC ID Nº:4). El cebador directo Cmp1 (cttctagacaaagtggcagac, SEC ID Nº:13) se usa para las tres amplificaciones a la temperatura de maduración de 52ºC. Se modifica la secuencia original (mostrado en negrita) para contener una posición de reconocimiento XbaI. El cebador inverso CmpC2 (ttggtaccttaacaatgaggg, SEC ID Nº:14) se usa para la amplificación del fragmento CmpC y el cebador inverso CmpS2 (ctacttctaggtaccttgctc, SEC ID Nº: 15) se usa para el fragmento CmpS. Ambos están modificados para contener una posición de reconocimiento KpnI. El cebador inverso CmpL2 (ttggtaccttaacaatgaggg, SEC ID Nº:16) se usa para la amplificación del fragmento CmpL y está modificado para contener una posición de restricción ClaI.

3. Amplificación de la señal de poliadenilación Los fragmentos de la señal de poliadenilación son amplificados a partir del clon infeccioso de virus de mosaico de coliflor (CaMV) (Franck y col., Cell 21 (1), 285-294, 1980). Se usan oligonucleótidos PA hacia adelante de PA (amplificación de señal de poliadenilación) (ggggatccccagtctctctc, SEC ID Nº:17) y PA inverso (gtgaattcgagctcggta, SEC ID Nº:18) para PCR y se maduran a 60ºC. El cebador directo se diseña para contener una posición de reconocimiento BamHI y el inverso una posición EcoRI.

4. Construcciones producidas

\bullet pCmpCG (fragmento de promotor de CmpC + gen GUS + polyA)

\bullet pCmpSG (fragmento de promotor de CmpS + gen GUS + polyA)

\bullet pCmpCC (fragmento de promotor de CmpC + gen CAT + polyA)

\bullet pCmpSC (fragmento de promotor de CmpS + gen CAT + polyA)

\bullet pCmpLC (fragmento de promotor de CmpL + gen CAT + polyA)

Las cajas que contienen el fragmento de promotor, los genes informadores y la señal de poliadenilación son insertados en un vector pUC19 (Stratagene) restringido con XbaI y EcoRI.

5. Construcciones usadas para comparación

\bullet pCapG (fragmento de promotor de Cap + gen GUS + polyA)

\bullet pCapSG (fragmento de promotor de CapS + gen GUS + polyA)

\bullet pCapC (fragmento de promotor de Cap + gen CAT + polyA)

Los fragmentos de promotor contenidos en estas construcciones se obtienen a partir de CaMV (Franck y col., Cell 21 (1), 285-294,1980, véase el número de acceso de GenBank V00141). Los fragmentos GUS, CAT y polyA son idénticos a los usados en las construcciones de CmYLCV. Cap se corresponde con el fragmento entre la base -227 y la base + 33 de la caja TATA (de la base 7175 a la base 7438 del genoma de CaMV, véase el número de acceso de GenBank V00141) y CapS se corresponde con el fragmento entre la base -227 y la base + 82 de la caja TATA (de la base 7175 a la base 7486 del genoma de CaMV, véase el número de acceso de GenBank V00141). Estas posiciones se corresponden aproximadamente con las elegidas para los fragmentos de CmYLCV.

Ejemplo 4 Experimentos de expresión transitoria 1. Cultivos de suspensión y preparación de protoplasto

Orychophragmus violaceus. Los cultivos de suspensión se mantienen en 40 mL de medio MS (Murashige y Skoog, Physiol Plant 15, 474-497, 1962) que incluye 100 mg/mL de inositol, un 2% de sacarosa, y 0,1 mg/mL de 2.4D. Los protoplastos se aíslan de cultivos con una antigüedad de 4 a 5 días. Las paredes celulares son digeridas a 26ºC durante 1 hora en pectoliasa Y23 al 0,1% (Seishin Pharmaceutical Co., Japón), celulosa Onozuka R10 al 1% (Yakult Honsha Co., Japón), D-manitol 0,4 M y MES al 0,1%, pH 5,5. Los protoplastos se filtran a través de un tamiz de 50 um y se lavan dos veces con disolución de electroporación (EP) (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM y manitol 0,2 M, pH 7,1).

Nicotiana plumbaginifolia. Las plantas se mantienen axenicalmente en medio RPM2 (Blonstein y col., Mol Gen Genet 211, 252-259, 1988) más 7 g/L de bactoagar, pH 5,6. Para la preparación de los protoplastos se cortan las hojas y se incuban durante la noche a 26ºC en una disolución de driselasa al 0,5% (Fluka), PVP 10 0,25 mM (polivinilpirrolidona PM 10.000), CaCl_{2} 3,85 mM, 6 mg/L de NAA, 2 mg/L de BAP y sacarosa 0,5 M, pH 5,7. Los protoplastos se filtran a través de un tamiz de 100 um. Se añade disolución de sacarosa (sacarosa 0,6 M, MES al 0,1% y CaCl_{2} 15 mM, pH 5,7) a la suspensión de protoplastos para la primera etapa de purificación, y la suspensión se extiende sobre disolución W5 (NaCl 150 mM, CaCl_{2} 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 6 mM; Menczel y col., Theor Appl Genet 59, 191-195, 1981). A continuación, los protoplastos son lavados una vez con disolución W5 y finalmente con disolución EP.

Oryza sativa. Los protoplastos se preparan a partir de un cultivo de suspensión de arroz morfogénico establecido a partir de O. sativa cv. Nipponbare tal como se ha descrito previamente (Datta y col., 1990, Bio/Technology 8: 736-740).

2. Experimento de expresión transitoria Se lleva a cabo la transfección mediante electroporación de 2x10^{6} protoplastos de Orychophragmus violaceus en 0,66 mL de tampón EP descargando un capacitor de 960 \muF a través de una distancia de 4 mm de suspensión de protoplastos. El capacitor se carga a 450 voltios. La electroporación se lleva a cabo en presencia de 5-10 \mug de ADN de plásmido, entonces se cultivan los protoplastos de 16 a 24 horas a 25ºC. La transfección de 2x10^{6} protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia en 0,3 mL de suspensión se lleva a cabo en presencia de 0,3 mL de PEG (40% de polietilenglicol 6000) y 5-10 ug de ADN de plásmido. Los protoplastos son cultivados en 0,4 mL de medio K3 (Godall y col., Methods Enzymol 181, 148-161, 1990) durante de 16 a 24 horas a 25ºC, y se añaden con 10 mL de tampón W5 antes de la recolección.

Los extractos de proteína se preparan mediante al menos tres ciclos de congelación y descongelación, y se clarifican mediante centrifugación.

Ejemplo 5 Ensayos de CAT y GUS

Para la detección de la expresión de gen CAT se lleva a cabo un doble sándwich de anticuerpos (DAS)-ELISA usando un kit CAT ELISA (Boehringer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de CAT se mide con un aparato Dynex MRXII. Las muestras para el ensayo de GUS se diluyen en tampón GUS (NaPO_{4} 0,05 M, pH 7; EDTA 0,01 M, 0,1% de Triton-X-100, 0,1% de Sarkosyl). La reacción se lleva a cabo en presencia de una cantidad igual de tampón de reacción GUS (100 mL/L 10x tampón GUS, 200 mg/L de BSA, 705 mg/L de 4-metilumbeliferil-glucurónido) a 37ºC y se detiene con Ammediol 2 M. La actividad se mide en un Titertek Fluoroskan II.

Los resultados de ambos ensayos, CAT y GUS, se normalizan a un valor de clon estándar. Los resultados obtenidos a partir de diez experimentos diferentes muestran que los diversos fragmentos de promotor de CmYLCV funcionan como promotores altamente activos.

Expresión transitoria de protoplasto de N. plumbaginifolia

Gen informador GUS

1

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Gen informador CAT

2

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Expresión transitoria de protoplasto de O.violaceus

Gen informador GUS

3

\vskip1.000000\baselineskip

Gen informador CAT

4

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Expresión transitoria de protoplasto de O. sativa

Gen informador GUS

5

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Ejemplo 6 Preparación de Disoluciones y Medios para la Regeneración y Transformación de Plantas

Los medios de cultivo GM, CIM y SIM son los medios descritos por Valvekens y col. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85; 5536-5540).

El medio de cultivo GM contiene las sales minerales de Murashige y Skoog (1962, Physiol. Plant. 15: 473-497), 1,0 mg/L de tiamina (reserva de 1 mg/mL), 0,5 mg/L de piridoxina HCl (reserva de 1 mg/mL), 0,5 mg/L de ácido nicotínico (reserva de 1 mg/mL), 0,5 g/L de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), 10 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, ajustando el pH a 5,8 con KOH 1 N. El CIM contiene las sales minerales y las vitaminas del medio B5 (Gamborg y col., 1968, Exp. Cell Res. 50: 151-158), 0,5 g/L de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), 20 g/L de glucosa, 0,5 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (reserva de 10 mg/mL en DMSO), 0,05 mg/L de quinetina (reserva de 5 mg/mL en DMSO), pH 5,8. El medio CIM sólido contiene 8 g/L de agar. El medio SIM contiene las sales minerales y las vitaminas del medio B5 (Gamborg y col., 1968, ver anterior), 0,5 g/L de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), 20 g/L de glucosa, 5 mg/L de N6-(2-isopentenil)adenina (2iP) (reserva de 20 mg/mL en DMSO), 0,15 mg/L de ácido indol-3-acético (IAA) (reserva de 1,5 mg/mL en DMSO), 8 g/L de agar, pH 5,8. El SIM V750 K100 es medio SIM suplementado con 750 mg/L de vancomicina y 100 mg/L de canamicina. El SIM V500 K100 es medio SIM suplementado con 500 mg/L de vancomicina y 100 mg/L de canamicina. El GM K50 es medio GM suplementado con 50 mg/L de canamicina.

Los medios de cultivo se esterilizan todos en autoclave (20 minutos a 121ºC). Antes del tratamiento en autoclave se disuelven en agua las vitaminas y se añaden al medio. Las hormonas se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO). Los antibióticos se disuelven en agua y se esterilizan mediante filtración (0,22 \mum). Las hormonas y los antibióticos se añaden después del tratamiento en autoclave y de enfriar el medio hasta 65ºC. En todos los casos se usan placas Petri de 9 cm (Falcon, 3003), excepto para el GM y el GM K50 que normalmente se vierten en placas Petri de 15 cm (Falcon, 3025).

Las placas con medio sólido se secan antes de su uso en flujo laminar para eliminar los condensados.

Ejemplo 7 Cepa de Arabidopsis y condiciones de crecimiento

Se compran semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0) naturales a Lehle Seeds, EE.UU. (1102 South Industrial Blvd. Suite D, Round Rock TX 78681, EE.UU.). Las plantas se cultivan a 22ºC en ciclos de luz/oscuri-
dad de 16/8 horas en tarros con 4 partes de arena, 4 partes de suelo de jardín y 1 parte de agrilit.

Ejemplo 8 Cepa de Agrobacterium y cultivo

Se introducen plásmidos vector en la cepa receptora de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clontech) mediante reproducción triparental de acuerdo con le protocolo descrito por Walkerpeach y Velten ("Agrobacterium-mediated gene transfer to plant cells: Cointegrate and binary vector systems", en: Plant Molecular Biology Manual, B1: 1-19, 1994, Ed.: S.B. Gelvin, R.A., Schilperoort, Kluvers Acad. Publishers). La cepa de movilización usada es E. coli HB101 que aloja el plásmido de conjugación pRK2013 (Ditta y col., 1980, Broad host range DNA cloning system from Gram-negative bacteria. Construction of gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351). Las agrobacterias usadas para la transformación de raíces se cultivan en medio LB (Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) sin antibióticos a 28ºC y 200 rpm.

Ejemplo 9 Esterilización de semillas

Las semillas se colocan en EtOH 70)/Tween 20 0,05% durante 1 minuto en un tubo Eppendorf de 2 mL. Se elimina la mezcla EtOH 70%/Tween 20 0,05% con una pipeta y se sustituye por NaOCl 5%/Tween 20 0,05% durante 15 minutos. Las semillas se agitan regularmente. La disolución se elimina en condiciones estériles y las semillas se lavan 3 veces con agua destilada esterilizada, durante 10 minutos cada vez. Después del último lavado las semillas se mantienen en 0,5 - 1 mL de agua. Las semillas pueden usarse inmediatamente o pueden almacenarse a 4ºC durante dos - tres semanas. Las semillas esterilizadas (20-30) se transfieren con forceps a medio GM en placas Petri de 15 cm. Las plantas de semillero se cultivan en placas dispuestas verticalmente en una cámara de cultivo (22ºC; ciclos de luz/oscuridad de 16/8 horas).

Ejemplo 10 Transformación de explantes de raíz de Arabidopsis thaliana

Se usan raíces de plantas de semillero de tres semanas de edad para el procedimiento de transformación. Las semillas no deberían ser verdes o marrones. Las partes verdes de las plantas de semillero se eliminan con un escalpelo y un forceps. Las raíces restantes se recogen y se disponen aproximadamente 5 sistemas de raíz completos por placa con medio sólido CIM. Las raíces son presionadas suavemente contra la superficie de la placa para asegurar un contacto total con el medio, aunque no deberían mojarse en el agar. Las raíces son incubadas durante tres días en una cámara de cultivo (22ºC; ciclos de luz/oscuridad de 16/8 horas). A continuación las raíces son transferidas a una placa Petri esterilizada con papel de filtro humedecido en medio CIM líquido y se cortan con un escalpelo en trozos de 0,5 a 1 cm. A continuación se transfieren los explantes de raíces a un tubo Falcon esterilizado de 50 mL que contiene 10 mL de medio CIM líquido. A éste, se añaden 0,5 mL de un cultivo de una noche de Agrobacterium (DO 0,6-1) y se incuba durante 1-2 minutos a la vez que se agita suavemente. El líquido se extrae del tubo por vertido a través de tamiz de metal esterilizado (mesh 50, Sigma, S-0895), que se sujeta con forceps. Normalmente, las raíces permanecen en la pared del tubo cerca del borde. A continuación, los explantes de raíces son transferidos a una placa Petri esterilizada con papel de filtro y se secan ligeramente para eliminar el exceso de líquido. Los explantes de raíces se colocan sobre placas con medio CIM sólido y se incuban en una cámara de cultivo durante 2 días con luz tenue (1,5-2 klux). Tras el periodo de co-cultivo deberían poder verse pequeñas trazas de sobrecrecimiento con Agrobacterium. A continuación, los explantes de raíces son transferidos a tubos Falcon de 50 mL esterilizados con 20 mL de medio CIM líquido, suplementado con 1000 mg/L de vancomicina. Entonces los tubos Falcon son sometidos a un vórtice suave para eliminar la Agrobacteria. El líquido se extrae vertiéndolo como se ha descrito antes y los explantes son secados ligeramente con papel de filtro. A continuación se transfieren los explantes a placas que contienen medio SIM V750 K100. Las raíces deberían estar en íntimo contacto con el medio. Los explantes se incuban en una cámara de cultivo en condiciones normales durante una semana y a continuación se transfieren a medio SIM V500 K100 y se incuban durante otra semana más. Entonces se reduce la cantidad de vancomicina a 250 mg/L. Los primeros brotes deberían aparecer al final de la tercera semana de cultivo sobre medio SIM. Se extraen los brotes por escisión cuando tienen una longitud de 0,3-0,5 cm, se elimina cualquier callo residual y se transfieren los brotes a placas de 15 cm que contienen medio GM K50. Por placa se dispone un máximo de 3 brotes. Para conseguir más brotes, se puede transferir el resto de explantes de raíz a placas con SIM fresco suplementado con 125 mg/L de vancomicina y 100 mg/L de canamicina durante otras dos semanas más. Los brotes que hayan echado raíces pueden transferirse a suelo para permitir que el asentamiento. Los brotes que no echan raíces son transferidos a recipientes Magenta (uno por recipiente) que contienen medio GM para producir semillas in vitro.

Las semillas procedentes de plantas transgénicas individuales son germinadas en medio GM K50 en una cámara de cultivo durante 2 semanas. Las plantas de semillero fenotípicamente resistentes a canamicina, que forman hojas verdes y un sistema de raíces ramificado, son seleccionadas para posteriores análisis.

Ejemplo 11 Ensayo histoquímico de \beta-glucuronidasa (GUS)

Para los ensayos GUS se usan plantas o plantas de semillero cultivadas in vitro en suelo. Se sumergen en disolución de tinción de GUS tanto plantas de semillero enteras como órganos diseccionados. La disolución de tinción de GUS contiene glucurónido de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo 1 mM (X-Gluc, Duchefa, disolución reserva 20 mM en DMSO), tampón de fosfato sódico 100 mM pH 7,0, EDTA 10 mM pH 8,0 y Triton X-100 al 0,1%. Las muestras de tejido se incuban a 37ºC durante 1-16 horas. Si es necesario, las muestras pueden aclararse con varios lavados de EtOH al 70% para eliminar la clorofila.

Ejemplo 12 Construcción de vector de transformación pZU627 de tabaco

Todas las reacciones PCR se llevan a cabo con Polimerasa de ADN Platinum Pfx (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Amplificación y clonación de terminador NOS

El terminador NOS se amplifica a partir de pBIN19 (Bevan y col. 1984) usando el cebador directo de terminador NOS (SEC ID Nº:21) y el cebador inverso de terminador NOS (SEC ID Nº:22). El cebador directo se modifica para que contenga una posición PstI y el cebador inverso se modifica para contener una posición HindIII. El producto de amplificación de terminador NOS se clona como fragmento PstI/HindIII en las mismas posiciones de pBluescript (Stratagene) dando como resultado el plásmido pZU400A.

2. Amplificación y clonación del gen de la proteína de nucleocápsida de virus de marchitamiento y manchado del tomate (TSWV NP)

A fin de obtener un gen de TSWV NP no traducible, se usan cebadores de gen TSWV NP modificados para amplificar el gen de TSWV NP. El cebador directo de gen de TSWV NP introduce un codón BamHI, uno SphI, uno de inicio y uno de parada (SEC ID Nº:23). El cebador inverso se modifica para introducir una posición PstI (SEC ID Nº:24). El producto de amplificación se clona como fragmento BamHI/PstI en la posición BamHI/PstI del pZU400A antes del extremo 5' y en la misma dirección que el terminador NOS. En el clon pZU400b resultante, la posición PstI entre el gen de TSWV NP y el terminador NOS se elimina usando un tratamiento con polimerasa de ADN T4 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A partir del clon resultante denotado pZU400C, se clonan el gen de TSWV NP y el terminador NOS como un fragmento SphI/HindIII en la posición SphI/HindIII del vector lanzadera pZO1560, dando como resultado el plásmido pZU400. pZO1560 es un derivado pBluescript en el que la posición de multiclonación original es reemplazada por la posición de multiclonación AGLINK (SEC ID Nº:27).

3. Amplificación y clonación de promotor de CmYLCV

El promotor vírico de CmYLCV se amplifica usando el cebador directo del promotor de CmYLCV (SEC ID Nº:25) y el cebador inverso de promotor de CmYLCV (SEC ID Nº:26). El cebador directo se modifica para que contenga una posición SstI y el cebador inverso se modifica para contener una posición PstI. El promotor vírico de CmYLCV amplificado se clona como fragmento SstI/PstI, en la misma dirección y antes del extremo 5' del gen de TSWV NP, en la posición SstI/PstI del pZU400. Esto da como resultado el clon pZU625 que contiene una caja génica vírica que produce un ARN de TSWV NP no traducible.

4. Clonación de caja génica vírica a pVictorHiNK

La caja génica vírica se clona como fragmento AscI/Pad a partir de pZU625 en la posición AscI/Pad del vector pZU494 de pVictorHiNK. Esto da como resultado el vector de transformación de plantas pZU627. pVictorHiNK es un vector binario que comprende un origen de replicación (ORI) derivado del plásmido pVS1 de Pseudomonas aeruginosa, que es conocido por ser altamente estable en A. tumefaciens (Itoh y col., 1984. Plasmid 11: 206-220; Itoh y Haas, 1985, Gene 36: 27-36).

El ORI pVS1 sólo es funcional en Agrobacterium y puede ser movilizado mediante el plásmido colaborador pRK2013 de E.coli a A. tumefaciens por medio de un procedimiento de reproducción triparental (Ditta y col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 7347-7351).

Este vector binario también comprende un origen de replicación ColEI que es funcional en E. coli y que deriva de pUC19 (Yannisch-Perron y col., 1985, Gene 33: 103-119).

Para mantenimiento en E.coli y A. tumefaciens este vector contiene un gen de resistencia bacteriana a espectomicina y estreptomicina codificado por un gen de 0,93 kb del transposón Tn7 (Fling y col., 1985, Nucl. Acid Res. 13: 7095) que funciona como marcador de selección para el mantenimiento del vector en E. coli y A. tumefaciens. El gen se fusiona al promotor tac para una expresión bacteriana eficaz (Amman y col., 1983, Gene 25: 167-178).

Los fragmentos fronterizos de T-ADN derecho e izquierdo de 1,9 kb y 0,9 kb, respectivamente, que comprenden las repeticiones de borde de 24 pb, derivan del plásmido Ti de las cepas pTil37 de tipo nopalina de A. tumefaciens (Yadev y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6322-6326). Por consiguiente, la región T-ADN entre los límites es modificada mediante la eliminación de las secuencias derivadas de M13 y, para mejorar su versatilidad de clonación, se introduce la posición de multiclonación BIGLINK (SEC ID Nº:28) produciendo el pVictorHiNK.

PVictorHiNK contiene una caja génica NPTII para la selección de transformantes durante el proceso de transformación de la planta. Esta caja génica contiene un promotor NOS, el gen NPTII y el terminador NOS, obtenidos de A. tumefaciens.

Ejemplo 13 Transformación de la planta y escrutinio de resistencia 1. Transformación de vectores binarios en materia vegetal

Los métodos para transferir vectores binarios a materia vegetal están bien establecidos y son conocidos por el especialista en la técnica. Existen variaciones en los procedimientos debido a, por ejemplo, diferencias en las cepas de Agrobacterium usadas, diferentes fuentes de material de explante, diferencias en los sistemas de regeneración dependiendo tanto del sistema de cultivo como de la especie vegetal usada. El vector binario pZU627 se usa en experimentos de transformación de plantas de acuerdo con los siguientes procedimientos. Se transfiere el PZU627 mediante reproducción triparental a una cepa receptora de Agrobacterium tumefaciens, seguido de análisis de transferencia Southern de los ex-conjugantes como comprobación de una transferencia apropiada de la construcción a la cepa aceptora, inoculación y co-cultivo de material de explante axénico con la cepa recombinante de Agrobacterium tumefaciens, eliminación selectiva de la cepa de Agrobacterium tumefaciens usando los antibióticos apropiados, selección de células transformadas mediante cultivo en medio selectivo que contiene canamicina, transferencia de las plantas a suelo, determinación de la integridad del T-ADN integrado mediante análisis de transferencia Southern de ADN cromosomal aislado de la planta.

2. Resistencia de plantas frente a infecciones de TSWV

Las plantas transformadas se cultivan en el invernadero en condiciones estándar de cuarentena a fin de evitar cualquier infección por patógenos. En una etapa de cuatro-hojas, se infectan las plantas con TSWV mediante inoculación mecánica. Tejidos procedentes de plantas infectadas sistemáticamente con TSWV son molidos en 5 volúmenes de tampón de inoculación enfriado con hielo (tampón fosfato 10 mM suplementado con Na_{2}SO_{3} al 1%) y engomados en presencia de polvo de carborundum sobre las dos primeras nuevas hojas extendidas completamente. Las plantas inoculadas son escrutadas para estudiar el desarrollo de síntomas durante tres semanas después de la inoculación. Las plantas que contienen secuencias de pZU627 no muestran síntomas de TSWV, mientras que las plantas de control no transformadas muestran graves síntomas sistémicos de TSWV a los 7 días de la inoculación. Las plantas resistentes se auto-polinizan y se recolectan las semillas. Se analizan las plantas de la progenie para evaluar la segregación del gen insertad, y se vuelven a escrutar para determinar la resistencia contra la infección de TSWV tal como se ha descrito antes.

Ejemplo 14 Construcción de construcciones de CmpS-fosfomanosa isomerasa-nos para la transformación de plantas

El promotor CmpS es amplificado mediante PCR usando los cebadores Cmpf-B (cgc gga tec tgg cag aca aag tgg cag a; SEC ID Nº:29) y CmpS-B (cgc gga tec tac ttc tag get act tg, SEC ID Nº:30) que tienen posiciones BamHI a los lados. El fragmento PCR resultante se clona en la posición BamHI del pBluescript KS (+) para formar pNOV4211.

Para crear un vector binario para la transformación vía Agrobacterium tumefaciens, se escinde el promotor CmpS del pNOV4211 usando BamHI y se inserta en pNOV2804 digerido con BamHI (SEC ID Nº:31) antes del extremo 5' del gen PMI, y el vector resultante se denomina pNOV2819. El pNOV2804 (SEC ID Nº:31) es un vector binario con origen replicación VS1, una copia del gen VirG de Agrobacterium en la cadena principal, y una caja de expresión de terminador PMI-nos sin promotor entre las fronteras izquierda y derecha del T-ADN. PMI (fosfomanosa isomerasa) es la región codificadora del gen man A de E.coli (Joersbo y Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto y col., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). El terminador nos (nopalina sintasa) se obtiene a partir de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y col., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573). La región codificadora de fosfomanosa isomerasa y el terminador nos están localizados entre los nucleótidos 290 y 1465 y entre el 1516 y el 1789, respectivamente, del pNOV2804 (SEC ID Nº:31). Para crear un vector para transformación biolística, el promotor CmpS se escinde del pNOV4211 usando BamHI y se inserta en pNOV3604 digerido con BamHI (SEC ID Nº:32) para formar pNOV2820, creando de este modo una caja de expresión PMI conducida por el promotor CmpS. El pNOV3604 es un vector para preparar fragmentos biolísticos y se basa en pUC19 con un origen de replicación ColEI y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina. Como el pNOV2804, el pNOV3604 también contiene una caja de expresión PMI-terminador nos sin promotor (ver más arriba). La región codificadora de fosfomanosa isomerasa y el terminador nos están localizados entre los nucleótidos 42 y 1217 y entre el 1268 y el 1541, respectivamente, del pNOV3604 (SEC ID Nº:32).

El vector binario pNOV2819 se usa para la transformación vía Agrobacterium tumefaciens y el vector pNOV2820 se usa para la transformación biolística.

Ejemplo 15 Construcción de plásmidos CmpC-GUS para expresión estable en las plantas 1. Construcción del vector binario

El vector pCambia 1302 (Cambia, Canberra, Australia; Roberts, C.S., Rajagopal, S., Smith, L., Nguyen, T., Yang, W., Nugroho, S., Ravi, K.S. Cao, M.L., Vijayachandra, K., y col. A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulation and efficient transformation of plants. Presentado en la Reunión de la Fundación Rockefeller del Programa Internacional sobre Biotecnología del Arroz, Malacca, Malaisia, 15-19 de Septiembre, 1997) se elige y se modifica para los experimentos: El promotor CaMV 35S al frente del gen GFP es eliminado por digestión en la posición 9788 con endonucleasa HindIW y en la posición 1 con endonucleasa NcoI y el vector es relegado a los dos extremos compatibles. La digestión con endonucleasa XhoI en la posición 7613 y con BstXI en la posición 9494 escinde el gen de higromicina y el promotor CaMV 35S al frente de él. Las secuencias del promotor 35S son eliminadas del vector para excluir cualquier riesgo de silenciamiento génico mediado por homología. El gen de barra conducido por el promotor 1' (Mengiste y col., Plant J, 1997, 12(4): 945-948) se introduce en la posición EcoRI en la posición 9737 como marcador seleccionable. El vector obtenido se denomina pCamBar.

2. Construcciones producidas

Las cajas de CmpCG y CapG descritas en el Ejemplo 3 se insertan en el vector pCamBar entre el centro XbaI de la posición 9764 y el EcoRI de la posición 9737 para obtener los plásmidos pCamBarCmpCG y pCamBarCapG, respectivamente. Las dos construcciones son usadas para transformar células de Agrobacterium tumefaciens.

Ejemplo 16 Expresión estable en Arabidopsis thaliana 1. Producción y transfección de la planta

Se cultivan semillas de Arabidopsis thaliana (Columbia 0), se tratan en frío durante 3 días a 4ºC a oscuras para sincronizar la germinación, y se transfieren a un cuarto de cultivo (22ºC/ luz 24 h). Las plantas germinadas se infiltran cuando han producido un número máximo de brotes no abiertos. La infiltración se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo descrito por Clough y Bent, Plant J. 16: 735-743, 1987.

2. Selección de plantas transgénicas

Las plantas de semillero obtenidas a partir de semillas de generación T1 se seleccionan aplicándoles con pulverizador el herbicida BASTA (Pluss-Staufer AG/SA) (150 mg/L) cada cinco días y por tres veces. Se recolectan veinte plantas resistentes pCamBarCmpCG y nueve pCamBarCapG después de la selección. Se cultivan en las condiciones descritas para obtener semillas de generación T2. Estas semillas se someten al mismo procedimiento descrito antes para el wt, se seleccionan las plantas de semillero de T2 mediante pulverización de BASTA, y se analizan los mutantes resistentes para detectar la expresión de gen GUS.

3. Expresión histoquímica de GUS en plantas Arabidopsis transformadas establemente La tinción histoquímica de GUS se realiza tal como se describe en el Ejemplo 11. El análisis se lleva a cabo en tubos de cultivo de 15 mL por inmersión de las plantas de semillero transformadas en la disolución X-gluc, mediante aplicación de una presión de 130 mBar durante 10 minutos e incubación a 37ºC durante una noche. Los resultados obtenidos con plantas de Arabidopsis transformadas con pCamBarCmpCG indican una expresión constitutiva del gen informador GUS conducida por el promotor CmpC en todos los órganos vegetativos.

4. Ensayos GUS enzimáticos cuantitativos en plantas de Arabidopsis transformadas establemente A. Preparación de muestras

Para el ensayo se seleccionan cuatro plantas por línea transgénica y una hoja por cada una de dichas plantas. Las cuatro hojas se recogen en el mismo tubo eppendorf, se congelan con nitrógeno líquido y se muelen hasta obtener un polvo fino con morteros desechables. Éste se diluye en 150 \muL de tampón GUS (NaPO_{4} 0,05 M, pH 7, EDTA 0,01 M, Triton-X-100 al 0,1%, Sarkosyl al 0,1%), se incuba 5 minutos a 37ºC y se gira en una microcentrífuga durante 5 minutos a máxima velocidad. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo eppendorf y estas muestras se usan para el ensayo enzimático. Se estiman las proteínas en estos extractos de planta de acuerdo con el método Bradford (Bradford, M.M. Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) usando BSA como patrón. La presencia del promotor y del gen GUS en las líneas mutantes se confirma mediante análisis PCR usando las muestras extraídas como patrón.

B. Ensayo GUS fluorométrico

El ensayo GUS fluorométrico se realiza tal como se describe en el Ejemplo 5. Para la detección de expresión de gen GUS se diluyen las muestras en tampón GUS. La reacción se lleva a cabo en presencia de una cantidad igual de tampón de reacción GUS a 37ºC y se detiene con Ammediol 2 M. La actividad se mide en un Titertek Fluoroskan II.

Quince de las veinte líneas seleccionadas transformadas con pCamBarCmpCG, y ocho de las nueve líneas transformadas con pCamBarCapG, muestran actividad enzimática de GUS en las hojas. El nivel de actividad en varias líneas transformadas con CmpCG es comparable a las de CapG. Sin embargo, los resultados son variables para las diferentes líneas transgénicas debido a la diferencia en sus genotipos (número de localizaciones y número de inserciones de transgén por localización).

Ejemplo 17 Construcción de variantes de promotor CmpC

1. Amplificación y clonación de ADN Se producen dos variantes, pCmpMG y pCmpMsG, del plásmido pCmpCG (Ejemplo 3). La primera elimina la secuencia "GTGGTCCC" del promotor CmpC y la última la muta para generar la secuencia "GTGCTCGC". Para obtener el pCmpMG se amplifican tres productos de PCR:

CmpM1 usando el cebador directo Cmp1 (véase el Ejemplo 3, SEC ID Nº:13), el cebador inverso CmpMr (CCATC
GTGGTATTTGGTATTG, SEC ID Nº:33) y el plásmido pCmpCG como patrón.

CmpM2 usando el cebador directo CmpMf (CAATACCAAATACCACGATGG; SEC ID Nº:34), el cebador inverso CmpC2 (véase el Ejemplo 3; SEC ID Nº:14) y el plásmido pCmpCG como patrón.

CmpM usando el cebador directo Cmp1, el cebador inverso CmpC2 y una mezcla equimolar de productos PCR de CmpM1 y CmpM2 como patrón.

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Para obtener el pCmpMsG se amplifican tres productos de PCR:

CmpMs1 usando el cebador directo Cmp1, el cebador inverso CmpMrs (CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT, SEC ID Nº:35) y el plásmido pCmpCG como patrón.

CmpMs2 usando el cebador directo CmpMfs (AAGTGCTCGCTACCACGATGG, SEC ID Nº:36), el cebador inverso Cmp2 y el plásmido pCmpCG como patrón. CmpsM usando el cebador directo Cmp1, el cebador inverso Cmp2 y una mezcla equimolar de productos PCR de CmpMs1 y CmpMs2 como patrón.

Para obtener los plásmidos pCmpMG y pCmpMsG el plásmido original pCmpCG es restringido con endonucleasas XbaI y BamHI para eliminar el fragmento CmpC y para insertar en su lugar los productos PCR CmpM y CmpMs.

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Ejemplo 18 Experimentos de expresión transitoria con construcciones pCmpM y pCmpMs 1. Cultivos de suspensión y preparación de protoplasto

Los cultivos de suspensión y los protoplastos se producen como se describe en el Ejemplo 4.

2. Ensayos GUS

La transfección y la preparación de extracto de proteína se llevan a cabo tal como se describe en el Ejemplo 4, y el ensayo GUS se lleva a cabo tal como se describe en el Ejemplo 5.

Los resultados del ensayo GUS se obtienen a partir de la media de diez experimentos diferentes y se normalizan a un valor de clon estándar. La eliminación de la secuencia "GTGGTCCC" en la construcción CmpCG reduce la expresión del gen informador GUS aproximadamente hasta el 50% de la expresión de gen informador GUS de CmpC en todas las especies de protoplastos (ver más adelante). El efecto inducido por la mutación "GTGCTCGC" depende de la especie de la planta. En los protoplastos de O. violaceus y O. sativa el nivel de expresión de gen GUS disminuye hasta el 65,2% y el 73,6%, respectivamente. En los protoplastos de N. plumbaginifolia la actividad de promotor CmpMs es similar a la del promotor CmpM.

N. plumbaginifolia

6

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O. violaceus

7

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O. sativa

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Ejemplo 19 Construcción de vectores de transformación de plantas que contienen fragmentos de promotor 5' ligados operativamente a genes informadores GFP o GUS 1. Amplificación y clonación de promotor

Se construye un gen quimérico que incluye una secuencia de ADN del promotor de tránscrito de longitud completa de CmYLCV (SEC ID Nº:1) fusionada al GFP optimizado de la planta con un intrón (synGFPI, SEC ID Nº:37) o con un gen informador GUS con secuencia de intrón (GIG; SEC ID Nº:38). El gen GIG contiene el intrón ST-LS1 de Solanum tuberosum entre los nucleótidos 385 y 576 de la SEC ID Nº: 38 (obtenido del Dr. Stanton Gelvin, Purdue University, y descrito en Narasimhulu, y col. 1996, Plant Cell, 8: 873-886). El SynGFPI es un gen GFP optimizado de planta en el que se introduce el intrón ST-LS1 (del nt 278 al nt 465 de la SEC ID Nº:37). Para los promotores, se usa el ADN genómico de CmYLCV como molde para la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se diseñan cebadores específicos de gen para amplificar la secuencia de ADN. Se aísla un fragmento de gen correspondiente a CmpC (SEC ID Nº:2) usando el cebador directo Cmpf-B (SEC ID Nº:29) en combinación con el cebador de 5' a 3' CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG (SEC ID Nº:39) como cebador inverso. Se aísla un fragmento de gen correspondiente a CmpS (SEC ID Nº:3) usando el cebador directo Cmpf-B (SEC ID Nº:29) en combinación con el cebador inverso CmpS-B (SEC ID Nº:30). Los tres cebadores contienen la posición de reconocimiento de enzima de restricción BamHI CGCGGA en su extremo 5'. Todas las reacciones se llevan a cabo con polimerasa Pfu de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Stratagene). Se usa un termociclador (DNA Engine, MJResearch, Inc. Waltham, MA EE.UU.) para amplificar los fragmentos de promotor usando las siguientes condiciones de PCR: [(94ºC:10s):(94ºC:10 s/56ºC:30 s/72ºC:1 min) X 20]:(72ºC:1,5 m)]. Tras la digestión de restricción con BamHI se ligan los fragmentos de promotor en vectores basados en pUC con el gen GIG o con el gen synGFPI para crear las fusiones promotor-gen informador ligadas operativamente a un terminador nos.

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2. Cajas promotor-informador producidas

\bullet Fragmento de promotor CmpS + gen synGFPI + nos (SEC ID Nº:40)

\bullet Fragmento de promotor CmpS + gen GIG + nos (SEC ID Nº:41)

\bullet Fragmento de promotor CmpC + gen synGFPI + nos (SEC ID Nº:42)

\bullet Fragmento de promotor CmpC + gen GIG + nos (SEC ID Nº:43)

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3. Subclonación en un vector binario de Agrobacterium

Las cajas promotor-informador (SEC ID Nº:40 a 43) que contienen el fragmento promotor, el gen informador y el terminador nos son insertadas en el vector binario pNOV2117 correspondiente a maíz y en el vector binario pNOV4200 correspondiente a la transformación de tomate. El pNOV2117 (SEC ID Nº:44) es un vector binario con origen de replicación VS1, una copia del gen virG de Agrobacterium en la cadena principal, y una caja de expresión de promotor de Ubiquitina de Maíz - gen PMI - terminador nos entre los extremos izquierdo y derecho del T-ADN. PMI (fosfomanosa isomerasa) es la región codificadora del gen manA de E.coli (Joersbo y Okkels, 1996, Plant Cell Reports 16: 219-221, Negrotto y col., 2000, Plant Cell Reports 19: 798-803). El terminador nos (nopalina sintasa) se obtiene a partir de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens (Depicker y col., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573). El promotor de ubiquitina de maíz, la región codificadora de fosfomanosa isomerasa y el terminador nos están localizados entre el nt 31 y el nt 2012, entre el nt 2109 y el nt 3212 y entre el nt 3273 y el nt 3521, respectivamente, del pNOV2117 (SEC ID Nº:44). Las cajas de informador - promotor se insertan lo más cerca posible al extremo derecho. La caja de expresión de marcador seleccionable de los vectores binarios está lo más cerca posible del extremo izquierdo. Para la transformación de tomate, se usa pNOV4200 (SEC ID Nº:45) como vector binario, que contiene el origen de replicación VS1, una copia del gen virG de Agrobacterium en la cadena principal, y una caja de marcador seleccionable de higromicina entre las secuencias de los extremos izquierdo y derecho. La caja de marcador seleccionable de higromicina comprende el promotor de Ubiquitina 3 de Arabidopsis (Ubq3(At), Callis y col., J. Biol. Chem. 265: 12486-12493 (1990)) ligado operativamente al gen que codifica la resistencia a higromicina (denonato en la presente memoria como "HYG", gen sintético de higromicina B fosfotransferasa de E.coli, Patente: JP 1986085192-A 1 30-APR-1986) y al terminador nos (Depicker y col., J. Mol. Appl. Genet. 1 (6), 561-573 (1982). El promotor de ubiquitina de Arabidopsis, el gen HYG y el terminador nos están localizados entre el nt 162 y el nt 11494, entre el nt 1897 y el nt 2939, y entre el nt 2939 y el nt 3236, respectivamente, de pNOV4200 (SEC ID Nº:45). Las cajas de informador - promotor (SEC ID Nº:40 a 43) se insertan lo más cerca posible del extremo derecho. La caja de expresión de marcador seleccionable de los vectores binarios está lo más cerca posible del extremo izquierdo.

A continuación se muestran las orientaciones de las cajas de marcador seleccionable y de promotor - informador de las construcciones de vector binario.

4. Construcciones de Vector Binario

\bullet: NOV4215 (fragmento de promotor RB CmpS + gen synGFPI + nos - ZmUbi + gen PMI + nos LB)

\bullet: NOV4216 (RB nos + gen synGFPI + fragmento de promotor CmpS - ZmUbi + gen PMI + nos LB)

\bullet: NOV4217 (fragmento de promotor RB CmpS + gen synGFPI + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB)

\bullet: NOV4220 (fragmento de promotor RB CmpS + gen GIG + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB)

\bullet: NOV4224 (fragmento de promotor RB CmpC + gen GIG + nos - ZmUbi + gen HYG + nos LB)

\bullet: NOV4226 (fragmento de promotor RB CmpC + gen synGFPI + nos - ZmUbi + gen PMI + nos LB)

Se construyen cajas adicionales con promotores conocidos para ser usadas a modo de comparación. A este fin, se construye una caja de promotor, ZmUbi-GFP-terminador 35S (SEC ID Nº:46), que comprende el promotor de Ubiquitina de maíz (Christensen y col. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)) ligado operativamente a synGFP y el terminador 35S (35S term), y también se construye una caja de promotor que comprende el promotor de ubiquitina de maíz ligado operativamente al gen GIG y al terminador nos (NOV 3612, SEC ID Nº:47). El promotor ZmUbi, el gen GFP y el terminador 35S están localizados entre el nt 1 y el nt 2019, entre el nt 2020 y el nt 2751, y entre el nt 2876 y el nt 2949, respectivamente, de la SEC ID Nº:46. El promotor ZmUbi, el gen GIG y el terminador nos están localizados entre el nt 1 y el nt 1982, entre el nt 2015 y el nt 4015, y entre el nt 4069 y el nt 4341, respectivamente, de la SEC ID Nº:47. La caja ZmUbi-GIG-nos (SEC ID Nº: 47) se clona en un vector basado en pUC. La caja ZmUbi- GFP-nos (SEC ID Nº:46 ) se clona en el vector binario pNOV2117 para transformación de maíz, tal como se ha descrito anteriormente. Se construyen las cajas de promotor que comprenden el promotor de Ubiquitina 3 de Arabidopsis (Ubq3(At)) ligado operativamente a synGFPI y al terminador nos (SEC ID Nº:48), y el promotor de Ubiquitina 3 de Arabidopsis ligado operativamente a gen GIG y al terminador nos (SEC ID Nº:49). El promotor de Ubiquitina 3, el synGFPI y el terminador nos están localizados entre el nt 1 y el nt 1332, entre el nt 1738 y el nt 2658, y entre el nt 2670 y el nt 2943, respectivamente, de la SEC ID Nº: 48. El promotor de Ubiquitina 3, el gen GIG y el terminador nos están localizados entre el nt 1 y el nt 1335, entre el nt 1746 y el nt 3746, y entre el nt 3800 y el nt 4072, respectivamente, de la SEC ID Nº: 49. Tal como se ha descrito antes, las cajas de promotor son clonadas en el vector binario pNOV4200 que contiene una caja de marcador seleccionable de higromicina para la transformación de tomate. A continuación se muestran las orientaciones de las cajas de marcador seleccionable y de promotor - informador de las construcciones de vector binario.

5. Construcciones de vector binario

\bullet: NOV2110 (promotor RB ZmUbi + gen synGFP + 35S term - ZmUbi + gen PMI + nos LB)

\bullet: NOV4209 (promotor RB Ubq3(At) + gen synGFPI + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB)

\bullet: NOV4208 (promotor RB Ubq3(At) + GUS - Intrón - gen GUS + nos - Ubq3(At) + gen HYG + nos LB)

Ejemplo 20 Transformación de maíz mediada por Agrobacterium

La transformación de embriones inmaduros de maíz se lleva a cabo esencialmente como se describe en Negrotto y col., (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803. Para este ejemplo, todos los medios constituyentes son como se describen en Negrotto y col., ver anterior. Sin embargo, se pueden sustituir algunos medios constituyentes descritos en bibliografía.

1. Plásmidos de transformación y marcador seleccionable

Los genes usados para la transformación son clonados en un vector adecuado para la transformación de maíz tal como se describe en el Ejemplo 19. Los vectores usados contienen el gen de fosfomanosa isomerasa (PMI) (Negrotto y col. (2000) Plant Cell Reports 19: 798-803).

2. Preparación de Agrobacterium tumefaciens

La cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSB1), que contiene el plásmido de transformación de la planta, se cultiva en medio sólido YEP (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10g/L), NaCl (5g/L),15 g/L de agar, pH 6,8) durante de 2 a 4 días a 28ºC. Aproximadamente 0,8 X 10^{9} Agrobacteria son suspendidas en medio LS-inf suplementado con acetosiringona (As) 100 \muM (Negrotto y col.,(2000) Plant Cell Rep 19: 798-803). Las bacterias se pre-inducen en este medio durante 30-60 minutos.

3. Inoculación

Se escinden embriones inmaduros de A188 o de otros genotipos de maíz adecuados a partir de espigas de 8-12 días de edad en LS-inf líquido + As 100 \muM. Los embriones se enjuagan una vez con medio de infección fresco. A continuación se añade la disolución de Agrobacterium y los embriones son sometidos a vórtice durante 30 segundos, y se dejan reposar con las bacterias durante 5 minutos. A continuación los embriones son transferidos con el lado del escutelo hacia arriba a medio LSAs y se cultivan a oscuras durante de dos a tres días. Posteriormente, se transfieren entre 20 y 25 embriones por placa petri a medio LSDc suplementado con cefotaxima (250 mg/L) y nitrato de plata (1,6 mg/L), y se cultivan a oscuras a 28ºC durante 10 días.

4. Selección de células transformadas y regeneración de plantas transformadas Se transfieren embriones inmaduros que producen callos embriogénicos a medio LSD1M0.5S. Los cultivos se seleccionan sobre este medio durante 6 semanas con una etapa de subcultivo a las 3 semanas. Los callos supervivientes se transfieren a medio LSD1M0.5S para hacerlos crecer o a medio Reg1. Después de un cultivo bajo luz (régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad), se transfieren tejidos verdes a medio Reg2 sin reguladores del crecimiento y se incuban durante 1-2 semanas. Las plantas pequeñas son transferidas a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) que contienen medio Reg3 y se cultivan bajo luz. Las plantas que son positivas en PCR para la caja promotor - informador son transferidas a suelo y cultivadas en el invernadero.

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Ejemplo 21 Transformación estable de tomate

La transformación de tomate se lleva a cabo esencialmente como se describe en Meissner y col., The Plant Journal 12: 1465-1472, 1997.

1. Plásmidos de transformación y marcador seleccionable

Los genes usados para la transformación son clonados en un vector binario adecuado para la transformación de tomate tal como se describe en el Ejemplo 19. Los vectores contienen el gen de resistencia a higromicina para la selección.

2. Preparación de Agrobacterium tumefaciens

La cepa de Agrobacterium GV3101, que contiene el plásmido de transformación de la planta, se cultiva en medio líquido LB (extracto de levadura (5 g/L), peptona (10g/L), NaCl (5g/L),15 g/L de agar, pH 6,8) durante 2 días a 22ºC. Se suspenden aproximadamente 0,8 X 10^{9} Agrobacteria en medio de inoculación KCMS (sales MS (4,3g/L), Myo-Inositol, Tiamina (1,3 \mug/mL), 2,4-D (0,2 \mug/mL), Quinetina 0,1\mug/mL y un 3% de Sacarosa, pH 5,5) suplementado con acetosiringona 100 \muM. Las bacterias se pre-inducen en este medio durante 60 minutos.

3. Esterilización y germinación de semillas

Las semillas de cultivo de tomate Micro-Tom (Meissner y col., The Plant Journal 12: 1465-1472,1997) y de cultivos ZTV-840 son empapadas en disolución de lejía al 20% con Tween durante 20 minutos. A continuación las semillas son lavadas tres veces con agua esterilizada y se colocan en medio TSG (½ sales MS, 1% de Sacarosa, 1% de FitoAgar, pH 5,8) en cajas Magenta (Magenta Corp, Chicago III) durante la germinación. Se escinden los cotiledones y se cortan los petiolos de cotiledones en segmentos de 5 mm de 7 a 10 días después de la germi-
nación.

4. Inoculación

Los cotiledones y los segmentos de petiolos cotiledonales de siete a diez días de edad son incubados durante 24 horas en placas de células alimentadoras BY-2 de tabaco (sales MS, Myo-inisitol 0,1 mg/mL, Hidrosilato de Caseína 0,2 mg/mL, HCl de Tiamina 1,3 \mug/mL, 3% de Sacarosa, pH 5,5) antes de la inoculación co Agrobacterium.

Los cotiledones se sumergen en suspensión líquida de Agrobacterium en KCMS durante 5 minutos. A continuación se transfieren entre 20 y 25 cotiledones con el lado abaxial hacia arriba a las mismas placas de células alimentadoras y se cultivan a oscuras durante de dos a tres días.

5. Selección de cotiledones y petiolos transformados y regeneración de plantas transformadas

Los cotiledones y los fragmentos de petiolo se transfieren a medio de selección TSM-1 (4,3 g/L de sales MS, 1 X Vitaminas B5, 2% de Sacarosa, 1% de Glucosa, 1 \mug/mL de Zeatina, 0,05 \mug/mL de IAA, 5 \mug/mL de Higromicina y 250 \mug/mL de Carbenicilina, pH 5,8) de dos a tres días después de la inoculación con Agrobacterium en condiciones de luz. Los cotiledones y los segmentos de petiolo que producen callos embriónicos son transferidos a medio TSM-2 (sales MS 4,3 g/L, 1 X Vitaminas MS, 2% de Sacarosa, 1 \mug/mL de Zeatina, 5 \mug/mL de Higromicina y 250 \mug/mL de Carbenicilina, pH 5,8). Los callos supervivientes que forman plantas son transferidos a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago III.) que contienen medio TRM (4,3 g/L de sal MS, 1 X Vitaminas MS, 2% de Sacarosa, pH 5,8) y cultivados en condiciones de luz.

Tras la formación de raíces, los transformantes primarios son transferidos a suelo.

Ejemplo 22 Ensayo fluorométrico de Proteína Fluorescente Verde (GFP)

Para la detección de la expresión de gen synGFP se lleva a cabo el ensayo fluorométrico.

Se toman discos de hoja de maíz y de tomate transformadas establemente y se congelan en hielo seco. El tejido congelado es molido intensamente y se mezcla con 300 \muL de Tampón de Extracción de GFP (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, MgCl_{2} 1 mM, DTT 10 mM y 0,1% de Sarcosyl). Los extractos se separan de los restos de hoja mediante centrifugación seguida de transferencia a placas negras de 96 pocillos con fondo claro (Costar 3615). Se miden las unidades de fluorescencia relativas (RFU) mediante un lector Spectra Fluor Plus Plate Reader a 465 nm de excitación y 512 nm de emisión. La actividad GFP se normaliza a proteína total medida usando el Ensayo BCA (según Pierce).

Ejemplo 23 Análisis de expresión de plantas de maíz y de tomate transformadas establemente 1. Plantas transgénicas To Zea mays

La expresión de GFP es de 10 a 20 veces mayor bajo el control del promotor CmpS (NOV4215, NOV4216) en comparación con el promotor ZmUbi (NOV2110). Estos resultados se obtienen a partir de muestras de hojas de 42 líneas To independientes, que representan un total de 93 plantas To.

2. Ensayo Elisa de GFP

Se lleva a cabo un inmunoensayo tipo sándwich cuantitativo para la detección de proteína fluorescente verde (GFP). Se usan dos anticuerpos policlonales comercialmente disponibles. Se purifica por inmunoafinidad el IAP anti-GFP de cabra (Rockland, Nº 600-1-1-215) y el anticuerpo anti-GFP de conejo (Torrey Pines Biolabs, Nº TP401) se purifica con proteína A. La proteína GFP del extracto de planta es capturada en un microtítulo de fase sólida mediante el anticuerpo de conejo. Entonces se forma un "sándwich" entre el anticuerpo de conejo de fase sólida, la proteína GFP, y el anticuerpo secundario de cabra que está en el pocillo. Después de una etapa de lavado, en la que se elimina el anticuerpo secundario no ligado, el anticuerpo ligado es detectado usando un anticuerpo alcalino marcado con fosfatasa. Se añade sustrato para la enzima y se mide el desarrollo de color a través de la lectura de la absorbancia de cada pocillo. A continuación se ajusta la lectura a una curva patrón para representar las concentraciones de GFP frente a la absorbancia

Gen informador synGFP

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2. Plantas To Lycopersicon escufentum

El fragmento CmpS del promotor CmYLCV (NOV 4217) da como resultado un nivel de expresión de synGFP que es significativamente mayor que el nivel de expresión del promotor Ubq3 de Arabidopsis (NOV 4209).

Gen informador synGFP

Los resultados se obtienen de la evaluación de la intensidad de fluorescencia de synGFP mediante microscopia de callos y brotes primarios de 5 líneas independientes de callos transformadas establemente con la caja NOV4217 y de 2 líneas independientes de callos transformadas establemente con la caja NOV4209.

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Gen informador Gus-lntrón-GUS

Los resultados se obtienen de la evaluación de la intensidad de tinción GUS en 11 líneas independientes de callos transformados establemente que contienen las cajas promotor CmpS-informador (líneas de la NOV4220-1 a la NOV4220-11). Se evalúan dos líneas de callos transformadas establemente que contienen el fragmento de promotor CmpC del promotor CmYLCV (NOV4224-1, NOV4224-2). A modo de comparación, se evaluaron dos líneas de callos transformados establemente que contienen el promotor de Ubiquitina de Arabidopsis (Ubq3) (NOV4208-1, NOV4208-2).

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Ejemplo 24 Experimentos de expresión transitoria en maíz 1. Preparación de embriones

Los embriones inmaduros de A188 o de otros genotipos de maíz adecuados son extraídos de espigas de 8-12 días de edad e introducidas en líquido 2DG4 + 0.5d (Medio de Duncan modificado para que contenga 20 mg/L de glucosa y que está suplementado con 10 g/L de manosa) y se cultivan entre 1 y 2 días.

2. Plasmolisis

Se incubaron embriones inmaduros en una disolución al 12% de sacarosa durante 3-4 horas antes del bombardeo. Los embriones se disponen en círculos de 8-10 nm sobre una placa.

3. Bombardeo

Se lleva a cabo la transfección mediante Bombardeo con Partículas de embriones de Maíz en presencia de 5 pg de ADN de plásmido a aproximadamente 44 bar (650 psi) tal como se ha descrito (Wright y col., 2001, Plant Cell Reports, En Prensa). En caso de que no sea válida una referencia "en prensa", se presentan los detalles destacados de dicho artículo: El fragmento de ADN se precipita en microportadores de oro (<1 um), tal como se describe en el Manual de Biolística de DuPont. Los genes se administran a las células de tejido seleccionadas usando el dispositivo Biolistics PDS-1000He. Los parámetros fijados en el dispositivo son los siguientes: 8 mm entre el disco de rotura y el microportador, 10 mm entre el microportador y la pantalla de detención y 7 cm entre la pantalla de detención y el objetivo. Las placas son atacadas dos veces con partículas recubiertas con ADN usando discos de rotura de 44 bares. Para reducir el daño a tejidos debido a la onda de choque del chorro de helio, se coloca una malla de acero inoxidable, con 200 aberturas por pulgada lineal horizontalmente y verticalmente (McMaster-Carr, New Brunswick, NJ) entre la pantalla de detención y el tejido objetivo. Los embriones se cultivan sobre las placas durante 48 horas a oscuras y a 25ºC. Se preparan extractos de proteína lisando células en tampón de lisis GUS y se clarifica mediante
centrifugación.

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Ejemplo 25 Ensayos GUS

Para la detección de expresión génica GUS se llevan a cabo ensayos histoquímicos y quimioluminiscentes.

1. Ensayo histoquímico de \beta-glucuronidasa (GUS)

En los ensayos GUS se usan líneas de callos in vitro de tomate y embriones de maíz. Se sumergen en disolución de tinción GUS los embriones enteros o pequeños trozos de callos. La disolución de tinción de GUS contiene glucurónido de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo 1 mM (X-Gluc, Duchefa, disolución reserva 20 mM en DMSO), tampón de fosfato sódico 100 mM pH 7,0, EDTA 10 mM pH 8,0 y Triton X-100 al 0,1%. Las muestras de tejido se incuban a 37ºC durante 1-16 horas. Si es necesario, las muestras se aclaran con varios lavados de EtOH al 70% para eliminar la clorofila.

2. Ensayo quimioluminiscente de \beta-glucuronidasa (GUS)

Para el análisis cuantitativo de la expresión de Gus se lleva a cabo el ensayo quimioluminiscente GUS usando el kit GUS-Light (Tropix. Inc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad se mide en un
Luminómetro.

Los resultados GUS con las construcciones pCmpS y pCmpMG (Ejemplo 17) se normalizan a un valor de clon de comparación (pNOV3612, Ejemplo 19). Los resultados obtenidos a partir de dos experimentos diferentes muestran que la eliminación de 8 pb en el promotor CmYLCV (pCmpMG, Ejemplo 17) no afecta significativamente a los niveles de expresión de los informadores GUS en comparación con el pCmpS.

\newpage

Expresión transitoria en embriones de Z.mays

Actividad GUS a 48 y 72 horas de la transfección

14

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<110> Syngenta Participations AG

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<120> Promotores del virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

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<130> S-31359A

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<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0007427.8

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-03-27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0010486.9

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 01101802.5

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-01-26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2001-02-28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 49

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 670

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<212> DNA,

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<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 346

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<212> DNA

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<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 400

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<212> DNA,

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 634

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaaacataa acaattataa tctgttaaaa ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccacaaac atcagaag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaacttatt gggtaatc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagggtacca ctaaaatcac c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggatccc caattcccc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggtacca tcgatatgga g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaggatccg ccctgccac

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctagaca aagtggcaga c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggtacctt aacaatgagg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacttctag gtaccttgct c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggtacctt aacaatgagg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatcccc agtctctctc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaattcga gctcggta

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 668

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 632

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de rizado de hoja amarilla de Cestrum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgctgcag atcgttcaaa catttggc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgaagctt tctagagatc tagtaac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcggatcc gcatgcatgt cttaaggtaa gctcactaag g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcgctgca ggctgctttc aagcaagttc tgcg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgagagctc gtttaattac tggcagacaa agtgg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

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<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgactgcag gtttatgttt ttacaaacga ctcc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sitio de clonación múltiple AGLINK

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 216

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sitio de clonación múltiple BIGLINK

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

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23

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<210> 29

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct ggcagacaaa gtggcaga

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggatcct acttctaggc tacttg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

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<211> 7195

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: vector pNOV2804

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

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24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

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<211> 4224

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: vector pNOV3604

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

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27

28

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<210> 33

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcgtggt atttggtatt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caataccaaa taccacgatg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtggtagcg agcactttgg t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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<400> 36

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagtgctcgc taccacgatg g

\hfill

21

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<210> 37

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<211> 912

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: gen GFP sintético con intrón

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<400> 37

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29

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<210> 38

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<211> 2001

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia Artificial: gen GUS con intrón

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<400> 38

30

31

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<210> 39

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: cebador PCR

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<400> 39

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggattgc tcccttaaca atgagg

\hfill

26

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<210> 40

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<211> 1618

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial : casete de expresión CmpS-synGFPI-nos

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<400> 40

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32

33

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<210> 41

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<211> 2730

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial : casete de expresión CmpS-GIG-nos

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<400> 41

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34

35

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<210> 42

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<211> 1577

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: casete de expresión CmpC-synGFPI-nos

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<400> 42

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36

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<210> 43

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<211> 2725

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial : casete de expresión CmpC-GIG-nos

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<400> 43

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37

38

39

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<210> 44

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<211> 9172

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial:vector pNOV2117

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<400> 44

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40

41

42

43

44

45

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<210> 45

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<211> 8849

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: vector pNOV4200

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<400> 45

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46

47

48

49

50

51

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<210> 46

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<211> 2949

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: casete de expresión terminal ZmUbi-GFP-35S

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<400> 46

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52

53

54

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<210> 47

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<211> 4341

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: casete de expresión ZmUBi-GIG-nos

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<400> 47

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55

56

57

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<210> 48

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<211> 2943

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: casete de expresión Ubq3(At)-synGFPI-nos

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<400> 48

58

59

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<210> 49

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<211> 4072

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Secuencia artificial: casete de expresión Ubq3(At)-GIG-nos

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<400> 49

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60

61

62

Claims

1. Secuencia de ADN que comprende

a): una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 19 y SEC ID Nº: 20, o

b): el complemento de una secuencia de ADN que se hibrida en condiciones severas con una cualquiera de SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3 ó SEC ID Nº: 4, en donde dicho complemento actúa como promotor de transcripción de una secuencia de nucleótidos asociada,

c): una secuencia de ADN que comprende una tira consecutiva de al menos 50 nt de la SEC ID Nº: 1, en donde dicha secuencia de ADN actúa como promotor de transcripción de una secuencia de nucleótidos asociada.

2. La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 20 y en donde dicha secuencia de ADN comprende adicionalmente en su extremo 3' la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 5.

3. La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó con la reivindicación 2, que además comprende en su extremo 5' la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 6.

4. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ligadas operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés.

5. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 4, en la que la secuencia de nucleótidos de interés comprende una secuencia codificadora.

6. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 5, en la que la secuencia codificadora codifica un rasgo fenotípico deseable.

7. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 6, en la que la secuencia codificadora codifica una proteína que confiere una ventaja selectiva positiva a las células que han sido transformadas con dicha secuencia codificadora.

8. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 6 ó 7, en la que la secuencia codificadora codifica una proteína que confiere una ventaja metabólica a las células que han sido transformadas con dicha secuencia codificadora que consiste en ser capaz de metabolizar un compuesto, en donde dicho compuesto es (i) manosa o xilosa o un derivado o un precursor de las mismas, o (ii) un sustrato de la proteína, o (iii) es capaz de ser metabolizado por células transformadas con dicha secuencia codificadora en dicho sustrato.

9. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 8, en la que dicha secuencia codificadora codifica una enzima seleccionada del grupo de xiloisomerasas, fosfomano-isomerasa, manosa-6-fosfato isomerasa, manosa-1-fosfato isomerasa, fosfomano mutasa, manosa epimerasa, manosa o xilosa fosfatasa, manosa-6-fosfatasa, manosa-1-fosfatasa y manosa o xilosa permeasa.

10. La molécula recombinante de la reivindicación 9, en la que la secuencia codificadora codifica una fosfomano isomerasa.

11. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la región codificadora no es traducible.

12. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la región codificadora no traducible procede de un gen vírico.

13. El ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el gen vírico deriva de TSWV, en particular del gen NP de TSWV.

14. La molécula de ADN recombinante de la reivindicación 5, en la que la secuencia codificadora se encuentra en orientación antisentido.

15. Un vector de expresión de ADN que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14.

16. Un vector de expresión de ADN de la reivindicación 15, que comprende una primera secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, y una segunda secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ligada a una secuencia de nucleótidos de interés.

17. Un vector de expresión de ADN de acuerdo con la reivindicación 16, que es capaz de alterar la expresión de un genoma vírico.

18. El vector de expresión de ADN de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende una primera secuencia de ADN capaz de expresar en una célula un fragmento de ARN sentido de dicho genoma vírico o una porción del mismo, y una segunda secuencia de ADN capaz de expresar en una célula un fragmento de ARN antisentido de dicho genoma vírico o una porción del mismo, en donde dicho fragmento de ARN sentido y dicho fragmento de ARN antisentido son capaces de formar un ARN de cadena doble.

19. El vector de expresión de ADN de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicho virus se selecciona del grupo que consiste en tospovirus, potivirus, potexvirus, tobamovirus, luteovirus, cucumovirus, bromovirus, closteovirus, tombusvirus y furovirus.

20. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 19, en el que dichas secuencias de ADN comprenden una secuencia de nucleótidos derivada de un gen de proteína de membrana vírica, un gen de proteína de nucleocápsida vírica, un gen de replicasa vírica, o un gen de proteína de movimiento vírica, o porciones de los mismos.

21. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 20, en el que dicha secuencia de ADN deriva del virus del marchitamiento y manchado de tomate (TSWV).

22. El vector de expresión de ADN de la reivindicación 21, en el que dicho ADN deriva de un gen de proteína de nucleocápsida.

23. Una célula hospedante transformada establemente con una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14 o un vector de expresión de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22.

24. La célula hospedante de la reivindicación 23, en la que dicha célula hospedante es una célula vegetal.

25. Una planta, y la progenie de la misma, transformada establemente con una secuencia de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una molécula de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14 o un vector de expresión de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22.

26. La planta de la reivindicación 25, en la que dicha planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, trigo, sorgo, centeno, avena, hierba, arroz, cebada, soja, algodón, tabaco, remolacha y colza.

27. El uso de la secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para expresar una secuencia de nucleótidos de interés

28. Un método para producir una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN es producido mediante una reacción en cadena de polimerasa en la que al menos uno de los oligonucleótidos usados comprende una secuencia de nucleótidos que representa una tira consecutiva de 15 ó más pares base de la SEC ID Nº: 1.