ES2304511T3

ES2304511T3 - Compuestos de pirazolo(1,5-a)pirimidina como agentes antivirales.

Info

Publication number: ES2304511T3
Application number: ES03731496T
Authority: ES
Inventors: Gerald W. Shipps, Jr.; Kristin E. Rosner; Janeta Popovici-Muller; Yongqi Deng; Tong Wang; Patrick J. Curran
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2002-06-04
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2023-06-02
Also published as: US20040038993A1; DE60319820D1; EP1511751B1; ATE389656T1; AU2003240488A1; DE60319820T2; CA2487211C; WO2003101993A1; JP4602076B2; US7196111B2; CA2487211A1; JP2005533040A; EP1511751A1; CN1671710A; MXPA04012245A

Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: (Ver fórmulas) o uno de sus esteroisómeros o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto.

Description

Compuestos de pirazolo[1,5-a]pirimidina como agentes antivirales.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la inhibición de la replicación del virus de hepatitis C (abreviadamente en lo sucesivo HCV por la expresión inglesa hepatitis C virus). En particular, la invención se refiere a compuestos y métodos para inhibir la RNA polimerasa dependiente del RNA del HCV.

Antecedentes de la invención

El virus de hepatitis C (HCV) es un virus de RNA de la cadena positiva de la familia Flaviviridae. Su genoma de 9,6 kb codifica aproximadamente 10 proteínas, incluyendo las proteínas estructurales de la cápsida y de la envolvente, así como las proteínas no estructurales NS3 (proteasa y helicasa) y NS5B (polimerasa). Ishii et al., Hepatology, 1227 (1999), enseñan que la RNA polimerasa dependiente de RNA viral (RdRp), es responsable tanto de la generación del molde de RNA de cadena negativa intermedia, como de la síntesis del RNA genómico de la cadena positiva de la progenie. Los autores señalan que la RdRp se usa sólo en la replicación de virus de RNA, y que tiene especificidades de molde muy estrictas. Los autores concluyen que las enzimas RNA polimerasa dependientes de RNA, incluyendo la RdRp del HCV, son dianas ideales para fármacos antivirales.

El HCV es un agente patógeno importante de los seres humanos, y se piensa que ha infectado a aproximadamente al 3% de la población mundial. Bressanelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 13034-13039 (1999), enseñan que el HCV es capaz de establecer una infección persistente que puede causar hepatitis crónica que conduce a cirrosis y carcinoma hepatocelular.

Las terapias existentes para el HCV son limitadas, y sólo se conocen unos cuantos inhibidores de la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV, por ejemplo, por el documento EP-A-1162196. Por tanto, existe la necesidad de identificar inhibidores adicionales de la RdRp del HCV, y de identificar los rasgos estructurales que se requieren para la potente actividad inhibidora de la RdRp del HCV.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona compuestos que son útiles para la profilaxis o el tratamiento de la infección por el HCV, así como estereoisómeros y sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. La invención proporcionada además composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos o sales farmacéuticamente aceptables, el uso de los compuestos o sales para la fabricación de un medicamento para inhibir la replicación del HCV en una célula para tratar o prevenir la infección, y a métodos in vitro para inhibir la replicación del HCV en una célula que comprende poner en contacto las células que están infectadas por el HCV con los compuestos o sales farmacéuticamente aceptables.

En un primer aspecto, la invención proporciona también un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

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y

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o uno de sus estereoisómeros, o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto. Otros aspectos de la invención se recogen en las reivindicaciones anexas.

En particular, las realizaciones de la invención proporcionan composiciones de compuestos, medicamentos y métodos in vitro para inhibir la actividad enzimática la RNA polimerasa dependiente del RNA del HCV (RdRp).

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En la presente memoria se describen inhibidores de la RdRp del HCV de la fórmula (I):

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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

\quad: G^{1} se selecciona del grupo que consiste en -OH, ciano, -C(O)-OH, -C(O)-OR^{8}, -C(O)-NR^{2}R^{3}, -N(R)-C(O)R^{8}, -S(O)_{2} NR^{2}R^{3}, -N(R)-S(O)_{2}R^{8}, heteroarilo, arilo, halo, amino, formilo, heterocicloalquenilo, heterociclilalquilo, CH(N)OH, CH(N)OR^{8}, hidroxialquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, en donde:

\quad: R^{8}, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, carboalcoxialquilo, carboalcoxi, aciloxialquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado;

\quad: R^{2} y R^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado; o

\quad: R^{2} y R^{3}, juntos forman un anillo heterocíclico heteroaromático o saturado o parcialmente insaturado de 5 ó 6 miembros; o

\quad: -NR^{2}R^{3} juntos forman un alfa-, beta- o gamma-aminoácido, en donde R^{2} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}, y R^{3} tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en acilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, alcoxialquilo, hidroxialquilo, ciano, arilsulfonilo, alquilsulfonilo, hidroxi, alcoxi -C(R^{6})(R^{6})CO_{2}H,

\quad: -CH_{2}CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, -CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CO_{2}alquilo, -SO_{2}aralquilo, -SO_{2}fluoroalquilo, -CH(R^{6}) CONH_{2}, -CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H, -CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CH_{2}CO_{2}H, -CH_{2}CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H y -CH_{2}CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H;

en donde R^{6} se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, aminoalquilo, alquiltioalquilo, carbamoilo, hidroxi y -CH_{2}R^{7}, en donde R^{7} se selecciona del grupo que consiste en arilo, aralquilo, cicloalquilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, hidroxi, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, tio, alquiltio, ariltio y aralquiltio;

G^{1} está unido a cualquiera de las posiciones C3 o C4 del anillo de pirazol, estando la otra posición sustituida opcionalmente con alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi, o ciano; y

G^{2} se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, trifluorometilo, carboxialquilamino, alquilamino, carboxi, alquenilo, alcoxialquilo, heterociclilalquilo, cicloalquilalquilo, arilalquilo y -W-Cy, en donde:

W se selecciona del grupo que consiste en O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)_{2}-N(R), -N(R)-S(O)_{2}- y -N(R)-C(O)-N(R)-, en donde R, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado,

Cy se selecciona del grupo que consiste en cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado;

G^{3} puede estar ausente o se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, y -W-Cy, en donde:

Cy se selecciona del grupo que consiste en cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, y

G^{2} y G^{3}, conjuntamente, están unidos en cualquier par de posiciones C7, C8 y C9 del anillo de pirimidina, estando la posición restante sustituida opcionalmente con alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi o ciano;

en donde el resto del anillo de cualquiera de dichos cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, o radical heterocíclico en G^{1}, G^{2} o G^{3}, puede estar opcionalmente sustituido.

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También se describen en la invención inhibidores de la RdRp del HCV de fórmula (I):

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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

\quad: G^{1} se selecciona del grupo que consiste en -OH, ciano, -C(O)-OH, -C(O)-OR, -C(O)-NR^{2}R^{3}, -N(R)-C(O)R, -S(O)_{2} NR^{2}R^{3}, -N(R)-S(O)_{2}R, heteroarilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, en donde:

\quad: R, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado;

\quad: R^{2} y R^{3}, considerados juntos, forman un anillo heterocíclico heteroaromático o saturado o parcialmente insaturado de 5 ó 6 miembros; o

\quad: -NR^{2}R^{3} juntos forman un alfa-, beta- o gamma-aminoácido, en donde R^{2} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}, y R^{3} tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H, -CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CH_{2}CO_{2}H, -CH_{2}CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H y -CH_{2}CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H;

en donde R^{6} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, y -CH_{2}R^{7}, en donde R^{7} se selecciona del grupo que consiste en arilo, aralquilo, cicloalquilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, hidroxi, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, tio, alquiltio, ariltio y aralquiltio;

G^{1} está unido a cualquiera de las posiciones C3 o C4 del anillo de pirazol, estando la otra posición opcionalmente sustituida con alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi o ciano; y

G^{2} y G^{3} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, y -W-Cy, en donde:

G^{2} y G^{3}, conjuntamente, están unidos a cualquier par de posiciones C7, C8 y C9 del anillo de pirimidina, estando la posición restante sustituida opcionalmente con alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi o ciano;

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También se describe en la presente memoria un compuesto de fórmula (V):

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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

R^{9} es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está opcional e independientemente sustituido;

R^{10} es OH, heteroarilo, NHR o NR^{2}R^{3};

R, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado; y

-NR^{2}R^{3} juntos forman un alfa- o beta-aminoácido, en donde R^{2} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}, y R^{3} tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H y -CH(R^{6})CO_{2}H.

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También se describe en la presente memoria un compuesto de fórmula (VI):

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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

R^{9} es arilo o heteroarilo, cada uno de los cuales está sustituido opcional e independientemente;

R^{10} es OH, heteroarilo, NHR o NR^{2}R^{3};

-NR^{2}R^{3} juntos forman un alfa- o beta-aminoácido, en donde R^{2} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}, y R^{3} tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H y CH(R^{6})CO_{2}H.

NR^{2}R^{3} juntos forman un alfa- o beta-aminoácido.

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También se describen en la presente memoria:

i): Una composición farmacéutica que comprenden por lo menos un compuesto de fórmula (I), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

ii): Un método para inhibir la replicación del HCV en una célula, que comprende poner en contacto una célula que está infectada por el HCV con por lo menos un compuesto de fórmula (I), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

iii): El uso de por lo menos un compuesto de fórmula (I), en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de infección por el HCV; y

iv): Un método para la profilaxis o el tratamiento de infección por el HCV, que comprende administrar a un sujeto humano o animal una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto de fórmula (I), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Descripción de la invención

Las realizaciones de la invención proporcionan compuestos y métodos in vitro para inhibir la actividad enzimática de la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV. La invención también proporciona composiciones dichos compuestos para la profilaxis o el tratamiento de infección por el HCV y el uso de dichos compuestos para la fabricación de un medicamento para inhibir la replicación en una célula o para tratar o prevenir la infección por EL HCV. Las literaturas de patentes y científicas citadas en la presente memoria, establecen el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica. Las patentes expedidas, las solicitudes de patentes y las referencias que se citan en la presente memoria, se incorporan de esta manera en la misma como referencia en la misma extensión como si se indicara que cada una se incorpora específicamente e individualmente en la presente como referencia. En el caso de inconsistencias, prevalecerá la presente descripción.

Para los propósitos de la presente invención, se usarán las siguientes definiciones:

Las expresiones "inhibidor de RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV", "inhibidor de RdRp del HCV", "inhibidor de la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV" e "inhibidor de la RdRp del HCV", se usan para identificar un compuesto que tiene una estructura como se define en la presente memoria, que es capaz de interactuar con la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV e inhibir su actividad enzimática. La inhibición de la actividad enzimática de la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV, significa reducir la capacidad de la RdRp del HCV de incorporar ribonucleótidos en una cadena de RNA del HCV en crecimiento. En algunas realizaciones preferidas, dicha reducción de la actividad de la RdRp del HCV es por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 75%, y aún más preferiblemente por lo menos 90%. En otras realizaciones preferidas, la actividad de RdRp del HCV se reduce por lo menos 95%, y más preferiblemente por lo menos 99%.

Preferiblemente, dicha inhibición es específica, es decir, el inhibidor de RdRp del HCV reduce la capacidad de la RdRp del HCV de incorporar ribonucleótidos en una cadena de RNA del HCV en crecimiento, a una concentración que es menor que la concentración del inhibidor que se requiere para producir otro efecto biológico no relacionado. Preferiblemente, la concentración requerida del inhibidor para la actividad inhibidora de la RdRp del HCV, es por lo menos dos veces menor, más preferiblemente por lo menos 5 veces menor, aún más preferiblemente por lo menos 10 veces menor, y más preferiblemente por lo menos 20 veces menor, que la concentración requerida para producir un efecto biológico no relacionado.

Los términos "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo", como se usan en la presente memoria, se refieren a grupos alifáticos de cadena lineal y ramificada que tienen de 1 a 12 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 8 átomos de carbono, y más preferiblemente 1 a 6 átomos de carbono, los cuales pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos o tres sustituyentes. Para los propósitos de la presente invención, el término "alquilo" se usará cuando el átomo de carbono que une el grupo alifático al resto de la molécula, es un átomo de carbono saturado. Sin embargo, un grupo alquilo puede incluir insaturación en otros átomos de carbono. Por tanto, grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, alilo, propargilo, butilo, pentilo, hexilo, 2-propinilo, 2-butinilo, 3-butenilo y
3-metil-buten-2-ilo.

Para los propósitos de la presente invención, el término "alquenilo" se usará cuando el átomo de carbono que une el grupo alifático al resto de la molécula forma parte de un doble enlace de carbono-carbono. Los grupos alquenilo incluyen, sin limitación, vinilo, 1-propenilo, 1-butenilo, 1-pentenilo y 1-hexenilo. Para los propósitos de la presente invención, el término "alquinilo" se usará cuando el átomo de carbono que une el grupo alifático al resto de la molécula, forma parte de un triple enlace de carbono-carbono. Los grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo, 1-pentinilo y 1-hexinilo.

El término "cicloalquilo", como se usa en la presente memoria, incluye grupos hidrocarbonados cíclicos saturados y parcialmente insaturados que tienen de 3 a aproximadamente 12 carbonos, preferiblemente de 3 a aproximadamente 8 carbonos, y más preferiblemente de 3 a alrededor de 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo puede estar además opcionalmente sustituido. Los grupos cicloalquilo incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

Un grupo "arilo" es un resto aromático de C_{6}-C_{14} que comprende uno a tres anillos aromáticos, los cuales pueden estar opcionalmente sustituidos. Preferiblemente, el grupo arilo es un grupo arilo de C_{6}-C_{10}. Los grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, antracenilo y fluorenilo. Un grupo "aralquilo" o "arilalquilo" comprende un grupo arilo unido covalentemente a un grupo alquilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido opcional en independientemente o no sustituido. Preferiblemente, el grupo aralquilo es aril de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, sin limitación, bencilo, fenetilo y naftilmetilo.

Como se usa en la presente memoria, el término "heteroarilo" se refiere a grupos que tienen de 5 a 14 átomos de anillo, preferiblemente 5, 6, 9 ó 10 átomos de anillo, que tienen 6, 10 ó 14 electrones pi compartidos en una disposición cíclica, y que tienen, además de átomos de carbono, de uno a cuatro heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S. Los grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, tienilo, benzotienilo, furanoilo, benzofuranoilo, dibenzofuranoilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, indolilo, quinolilo, isoquinolilo, quinoxalinilo, tetrazolilo, oxazolilo, tiazolilo e isoxazolilo. Un grupo "heteroaralquilo" o "heteroarilalquilo" comprende un grupo heteroarilo unido covalentemente a un grupo alquilo, cualquiera de los cuales puede estar sustituido opcional e independientemente o no sustituido. Preferiblemente, el grupo heteroaralquilo es heteroaril de C_{6}-C_{14}-alquilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, sin limitación, piridilmetilo, tiazolilmetilo y similares.

Como se usa en la presente, las expresiones "radical heterocíclico" y "heterociclilo" se refieren a un resto heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros o bicíclico de 7 a 10 miembros estable, que es saturado o parcialmente insaturado y que tiene, además de átomos de carbono, de 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y los átomos de nitrógeno pueden opcionalmente estar cuaternizados, e incluyendo cualquier grupo bicíclico en el cual cualquiera de los anillos heterocíclicos definidos anteriormente está fusionado a un anillo de benceno. El anillo heterocíclico puede estar unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que de cómo resultado una estructura estable. Ejemplos de dichos radicales heterocíclicos saturados o parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranoilo, tetrahidrotienilo, pirrolidinilo, pirrolidonilo, piperidinilo, pirrolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, diazepinilo, oxazepinilo, tiazepinilo y morfolinilo.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "parcialmente insaturado" se refiere a un resto de anillo que incluye por lo menos un doble o triple enlace entre átomos del anillo. Se pretende que el término "parcialmente insaturado" abarque anillos que tienen sitios de insaturación múltiples, pero no se pretende que incluya restos de arilo o heteroarilo, como se definen en la presente memoria.

La expresión "radical heterocíclico parcialmente insaturado" se refiere a un resto de anillo heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros o bicíclico de 7 a 10 miembros estable, que incluye por lo menos un doble enlace entre átomos del anillo. Se pretende que la expresión abarque múltiples anillos que tengan sitios de insaturación, pero no se pretende que incluya restos de arilo o heteroarilo como se definen en la presente memoria. Además de los átomos de carbono, el resto de anillo heterocíclico tiene de 1 a 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O y S, en donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y los átomos de nitrógeno pueden estar opcionalmente cuaternizados, e incluyendo cualquier grupo bicíclico en el cual cualquiera de los anillos heterocíclicos definidos anteriormente esté fusionado a un anillo de benceno. El anillo heterocíclico puede estar unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que de cómo resultado una estructura estable. Ejemplos de dichos radicales heterocíclicos parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidrobenzotiofeno, tetrahidroindol y tetrahidrobenzofurano.

El término "heterocicloalquenilo" se refiere a un grupo heterociclilo en donde un carbono de anillo y un carbono exo forman un doble enlace carbono-carbono (por ejemplo, ejemplificado en el compuesto 449 de la Tabla de compuestos de la presente memoria), el cual a su vez está unido al armazón del núcleo de interés. Las designaciones -CH(N)OH y -CH(N)OR se refieren a grupos en donde los átomos de carbono y nitrógeno están unidos por un doble enlace, formando de esta manera una oxima o éter alquílico de oxima, respectivamente.

Como se usa en la presente memoria, un grupo cicloalquilarilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo o heterociclilo "sustituido", es uno que tiene de uno a cuatro, preferiblemente de uno a tres, más preferiblemente uno o dos, sustituyentes que no son hidrógeno. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, halo, hidroxi, oxo, nitro, fluoroalquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, arilo, (aril)alquilo, heteroarilo, (heteroaril)alquilo, (heteroaril)alquiloxi, (heteroaril)alquilamino, (heteroaril)alquiltio, heteroariloxi, heteroarilamino, heteroariltio, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, (heterociclil)alquilo, (heterociclil)oxi, (heterociclil)amino, (heterociclil)tio, (heterociclil)alquiloxi, (heterociclil)alquiltio, fluoroalquiloxi, cicloalquilalcoxi, cicloalcoxi, alcoxialquilo, alcoxi, (aril)alcoxi, ariloxi, amino, acilamino, carbamoilo, aminoalquilo, hidroxialquilo, carboalcoxi, carboariloxi, carboxi, alquiltio, ariltio, aralquiltio, alquilsulfinilo, arilsulfinilo, aralquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, aralquilsulfonilo, alquilsulfonamido, arilsulfonamido, aralquilsulfonamido, acilo, aciloxi, ciano, y grupos ureido.

El término "sustituido", como se usa en la presente, significa que uno o más hidrógenos del resto designado están reemplazados, siempre que no se exceda la valencia normal del átomo, y siempre que la sustitución de cómo resultado un compuesto estable.

Las expresiones "compuesto estable" y "estructura estable" se refieren a un compuesto que es suficientemente robusto para resistir al aislamiento a un grado de purificación y formulación útil en un agente terapéutico eficaz.

El término "halógeno" o "halo", como se usa en la presente, se refiere a cloro, bromo, flúor o yodo.

Como se usa en la presente memoria, el término "acilo" se refiere a un sustituyente de alquilcarbonilo o arilcarbonilo.

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Los términos "acilamino" y "amido" se refieren a un grupo amida unido en el átomo de nitrógeno. El término "carbamoilo" se refiere a un grupo amida unida en el átomo de carbono del carbonilo. El átomo de nitrógeno de un sustituyente de acilamino o carbamoilo puede estar sustituido adicionalmente. El término "sulfonamido" se refiere a un sustituyente de sulfonamida unido por el átomo de azufre o nitrógeno. A menos que se limite explícitamente de otra manera, el término "amino" se usa para incluir NH_{2}, alquilamino, dialquilamino, arilamino, aralquilamino, y grupos amino cíclicos.

El término "ureido", como se usa en la presente memoria, se refiere a un resto de urea sustituido o no sustituido.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se usa en la presente memoria, para indicar un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico, tal como una célula, cultivo de células, tejido u organismo.

En la presente invención se describen inhibidores de la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV de fórmula (I):

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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:

\quad: G^{1} se selecciona del grupo que consiste en -OH, ciano, -C(O)-OH, -C(O)OR^{8}, -C(O)-NR^{2}R^{3}, -N(R)-C(O)R^{8}, -S(O)_{2}NR^{2}R^{3}, -N(R)-S(O)_{2}R^{8}, heteroarilo y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, en donde:

\quad: R^{8}, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado;

G^{1} está unido a cualquiera de las posiciones C3 o C4 del anillo de pirazol, estando la otra posición sustituida opcionalmente con alquilo, alquenilo, alquinilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi o ciano; y

W se selecciona del grupo que consiste en O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R), -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R), -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)_{2}-N(R)-, -N(R)-S(O)_{2}- y -N(R)-C(O)-N(R)-, en donde R, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado,

en donde el resto de anillo de cualquiera de dichos cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, o radical heterocíclico en G^{1}, G^{2} o G^{3}, puede estar opcionalmente sustituida.

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Los grupos cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterocíclico sustituidos, están preferiblemente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo, preferiblemente Cl, Br ó F; hidroxi; nitro; fluoroalquilo, preferiblemente (fluoro)_{1-5}-alquilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente (fluoro)_{1-5}-alquilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, CH_{2}F, CF_{3}, CH_{2}CH_{2}F y CF_{2}CF_{3}; alquilo, preferiblemente alquilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente alquilo de C_{1}-C_{4}; alquenilo, preferiblemente alquenilo de C_{2}-C_{8}, más preferiblemente alquenilo de C_{2}-C_{6}; alquinilo, preferiblemente alquinilo de C_{2}-C_{8}, más preferiblemente alquinilo de C_{2}-C_{6}; cicloalquilo, preferiblemente cicloalquilo de C_{3}-C_{8}, más preferiblemente cicloalquilo de C_{3}-C_{6}; (cicloalquil)alquilo, preferiblemente cicloalquilo de C_{3}-C_{8}-alquilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente cicloalquilo de C_{3}-C_{6}-alquilo de C_{1}-C_{6}; arilo, preferiblemente arilo de C_{6}-C_{14}, más preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenilo y naftilo; (aril)alquilo, preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, bencilo y fenetilo; heteroarilo; (heteroaril)alquilo, preferiblemente heteroarilalquilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente heteroarilalquilo de C_{1}-C_{4}; (heteroaril)alquiloxi (por ejemplo, (furil)alcoxi, (tiofenil)alcoxi, (piridil)alcoxi, etc.); (heteroaril)alquilamino (por ejemplo, (furil)alquilamino, (tiofenil)alquilamino, (piridil)alquilamino, etc.); (heteroaril)alquiltio (por ejemplo, (furil)alquiltio, (tiofenil)alquiltio, (piridil)alquiltio, etc.); alquilamino (por ejemplo, alquilamino de C_{1}-C_{6}; heteroariloxi (por ejemplo, furiloxi, tiofeniloxi, piridiloxi, etc.); heteroarilamino (por ejemplo, furilamino, tiofenilamino, piridilamino, etc.); heteroariltio (por ejemplo, furiltio, tiofeniltio, piridiltio, etc.); radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado; (heterociclil)alquilo; (heterociclil)oxi; (heterociclil)amino; (heterociclil)tio; (heterociclil)alquiloxi; (heterociclil)alquiltio; alcoxi, preferiblemente alcoxi de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, metoxi y etoxi; (aril)alcoxi, preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, benciloxi, ariloxi, preferiblemente ariloxi de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenoxi; amino, incluyendo: NH_{2}; alquilamino, preferiblemente alquilamino de C_{1}-C_{6}; más preferiblemente alquilamino de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, metilamino, etilamino y propilamino; dialquilamino, preferiblemente dialquilamino de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente dialquilamino de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, dimetilamino y dietilamino; arilamino, preferiblemente arilamino de C_{6}-C_{14}, más preferiblemente arilamino de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenilamino; diarilamino, preferiblemente diarilamino de C_{6}-C_{14}, más preferiblemente diarilamino de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, difenilamino; (aril)alquilamino, preferiblemente aril de C_{6}-C_{10}-alquilamino de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente aril de C_{6}-C_{10}-alquilamino de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, bencilamino; y di(aril)alquilamino, preferiblemente diaril de C_{6}-C_{10}-alquilamino de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente diaril de C_{6}-C_{10}-alquilamino de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, dibencilamino; acilamino incluyendo: alcanoacilamino, preferiblemente alcanoacilamino de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente alcanoacilamino de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, acetamido y propionamido; arenoacilamino, preferiblemente arenoacilamino de C_{6}-C_{14}, más preferiblemente arenoacilamino de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, benzamido; y arilalcanoacilamino, preferiblemente aril de C_{6}-C_{10}-alcanoacilamino de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente aril de C_{6}-C_{10}-alcanoacilamino de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, fenilacetamido; carbamoilo incluyendo: -C(O)NH_{2}; alquilcarbamoilo, preferiblemente alquilcarbamoilo de C_{1}-C_{6} o dialquilcarbamoilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, metilcarbamoilo y dimetilcarbamoilo; arilcarbamoilo, preferiblemente arilcarbamoilo de C_{6}-C_{10} o diarilcarbamoilo de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenilcarbamoilo y difenilcarbamoilo; y arilalquilcarbamoilo, preferiblemente aril de C_{6}-C_{10}-alquilcarbamoilo de C_{1}-C_{6} o diaril de C_{6}-C_{10}-alquilcarbamoilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, bencilcarbamoilo y dibencilcarbamoilo; aminoalquilo, preferiblemente aminoalquilo de C_{1}-C_{6}; hidroxialquilo, preferiblemente hidroxialquilo de C_{1}-C_{6}; carboalcoxi, preferiblemente carboalcoxi de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, carbometoxi y carboetoxi; carboariloxi, preferiblemente carboariloxi de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, carbofenoxi, carboaralcoxi, preferiblemente carboaril de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, carbobenciloxi, carboxi; alquiltio, preferiblemente alquiltio de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente alquiltio de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, metiltio; ariltio, preferiblemente ariltio de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, feniltio y toliltio; aralquiltio, preferiblemente ar de C_{6}-C_{10}-alquiltio de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, benciltio; alquilsulfinilo, preferiblemente alquilsulfinilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente alquilsulfinilo de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, metilsulfinilo; arilsulfinilo, preferiblemente arilsulfinilo de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenilsulfinilo y tolilsulfinilo; aralquilsulfinilo, preferiblemente ar-alquil de C_{6}-C_{10}-sulfinilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, bencilsulfinilo; alquilsulfonilo, preferiblemente alquilsulfonilo de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente alquilsulfonilo de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, metilsulfonilo; arilsulfonilo, preferiblemente arilsulfonilo de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenilsulfonilo y tolilsulfonilo; aralquilsulfonilo, preferiblemente ar-alquil de C_{6}-C_{10}-sulfonilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, bencilsulfonilo; alquilsulfonamido, preferiblemente alquilsulfonamido de C_{1}-C_{6}, más preferiblemente alquilsulfonamido de C_{1}-C_{4} incluyendo, por ejemplo, metilsulfonamido; arilsulfonamido, preferiblemente arilsulfonamido de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, fenilsulfonamido y tolilsulfonamido; ar-alquilsulfonamido, preferiblemente ar de C_{6}-C_{10}-alquilsulfonamido de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, bencilsulfonamido; acilo, incluyendo: alcanoilo, preferiblemente alcanoilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, acetilo; aroilo, preferiblemente aroilo de C_{6}-C_{10} incluyendo, por ejemplo, benzoilo; y aralcanoilo, preferiblemente ar de C_{6}-C_{10}-alcanoilo de C_{1}-C_{6} incluyendo, por ejemplo, fenilacetilo; aciloxi, incluyendo, por ejemplo, acetoxi; ciano, y grupos ureido. Uno o más átomos de carbono de un grupo cicloalquilo, y uno o más átomos de carbono o heteroátomos de un radical heterocíclico, pueden estar también sustituidos opcionalmente con un grupo oxo. El prefijo o sufijo "ar" se refiere a arilo.

En algunos compuestos, por lo menos uno de G^{2} y G^{3} es arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido como se describió anteriormente. En algunos compuestos, por lo menos uno de G^{2} y G^{3} es fenilo sustituido. En algunos compuestos, por lo menos uno de G^{2} y G^{3} es fenilo sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, arilo de C_{6}-C_{10}, ar de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6}, radical heterocíclico, halo, (fluoro)_{1-5}-alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, ariloxi de C_{6}-C_{10} y ar de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{6}. En ciertos compuestos preferidos, cada uno de G^{2} y G^{3} es arilo o heteroarilo, opcionalmente sustituido como se describió anteriormente. En algunos compuestos, G^{2} y G^{3} no son preferiblemente fenilo no sustituido cuando G^{2} y G^{3} están en las posiciones C7 y C9. En otros compuestos, uno de G^{2} o G^{3} es fenilo sustituido cuando G^{2} y G^{3} están en las posiciones C7 y C9. En otros compuestos, G^{2} y G^{3} son independientemente fenilo sustituido cuando G^{2} y G^{3} están en las posiciones C7 y C9.

En algunos compuestos, por lo menos uno de G^{2} y G^{3} es -W-Cy, en donde Cy se selecciona del grupo que consiste en cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, cualquiera de los cuales puede estar sustituido opcionalmente como se describió anteriormente. En ciertos compuestos, Cy es arilo, preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10}, el cual puede estar no sustituido o sustituido opcionalmente. En algunos compuestos preferidos, Cy es fenilo no sustituido o fenilo sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, arilo de C_{6}-C_{10}, ar de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6}, radical heterocíclico, halo, (fluoro)_{1-5}-alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, ariloxi de C_{6}-C_{10} y ar de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{6}.

En ciertos otros compuestos, Cy es cicloalquilo, preferiblemente cicloalquilo de C_{5}-C_{6}, en donde el cicloalquilo puede estar no sustituido u opcionalmente sustituido. En algunos compuestos preferidos, Cy es cicloalquilo de C_{5}-C_{6} no sustituido, o cicloalquilo de C_{5}-C_{6} sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, arilo de C_{6}-C_{10}, ar de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6}, radical heterocíclico, halo, (fluoro)_{1-5}-alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, ariloxi de C_{6}-C_{10} y ar de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{6}.

En algunos compuestos, el heterociclilo en G^{1} está opcionalmente sustituido como se describió anteriormente. En algunos compuestos, el heterociclilo en G^{1} o G^{3} está opcionalmente sustituido como se describió anteriormente.

En incluso otros compuestos, Cy es aralquilo, preferiblemente arilo de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6}, en donde la porción arilo del aralquilo puede estar sustituida opcionalmente como se describió anteriormente. En algunos compuestos preferidos, Cy es bencilo o fenetilo, o un bencilo o fenetilo sustituido, en donde el anillo de fenilo está sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo de C_{1}-C_{6}, arilo de C_{6}-C_{10}, ar de C_{6}-C_{10}-alquilo de C_{1}-C_{6}, radical heterocíclico, halo, (fluoro)_{1-5}-alquilo de C_{1}-C_{6}, alcoxi de C_{1}-C_{6}, ariloxi de C_{6}-C_{10} y arilo de C_{6}-C_{10}-alcoxi de C_{1}-C_{6}.

En cada una de las posibilidades descritas anteriormente para Cy, W se selecciona del grupo que consiste en O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)_{2}-N(R)-, -N(R)-S(O)_{2}- y -N(R)-C(O)-N(R)-, en donde R, cada vez que se presenta, se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, y radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado. En algunos compuestos preferidos, W es N(R), en donde R es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}. En algunos compuestos preferidos, W es NH o NCH_{3}.

En algunos compuestos, G^{1} se selecciona del grupo que consiste en OH, -C(O)OH y heteroarilo. El heteroarilo es preferiblemente un heteroarilo ácido incluyendo, por ejemplo, tetrazolilo.

En algunos otros compuestos, G^{1} es -C(O)NR^{2}R^{3}, en donde -NR^{2}R^{3} juntos forman un alfa-, beta- o gamma-aminoácido. En estos compuestos, R^{2} es hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{6}, y R^{3} tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en -CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H, -CH(R^{6})CO_{2}H, -CH(R^{6})CH_{2}CH_{2}CO_{2}H, -CH_{2}CH(R^{6})CH_{2}CO_{2}H y -CH_{2}CH_{2}CH(R^{6})CO_{2}H, en donde R^{6} se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, y -CH_{2}R^{7}, en donde R^{7} se selecciona del grupo que consiste en arilo, aralquilo, cicloalquilo, heteroarilo, radical heterocíclico saturado o parcialmente insaturado, hidroxi, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, tio, alquiltio, ariltio y aralquiltio. El sustituyente R^{6} puede estar en cualquiera de las configuraciones (R) o (S). En algunos compuestos, -NR^{2}R^{3} juntos forman un aminoácido natural. En algunos otros compuestos, -NR^{2}R^{3} juntos forman un aminoácido no natural.

Se apreciará que los anillos heteroaromáticos que poseen un sustituyente de hidroxi en una posición adyacente a un átomo de nitrógeno del anillo, pueden existir en la forma hidroxi o la forma tautómera ceto, o pueden existir como una mezcla de ambas. Por ejemplo, los compuestos de fórmula (I) que tienen un sustituyente hidroxi en C3, pueden existir como el tautómero hidroxi (1) o como el tautómero ceto (2):

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Similarmente, los compuestos de fórmula (I) que tienen un sustituyente hidroxi en C7, pueden existir en forma del tautómero hidroxi (3) o el tautómero ceto (4):

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Se entenderá que todas las formas tautómeras de los compuestos de fórmula (I), así como todas sus mezclas posibles en cualquier proporción, se incluyen dentro del alcance de la invención, como también se indica más adelante.

Además, se entenderá que la descripción abarca también todas las formas hidratadas, deshidratadas y solvatadas de los compuestos de fórmula (I):

En algunos compuestos, G^{1} está unido en C3, y G^{2} y G^{3} están unidos en C9 y C7, respectivamente. De esta manera, los compuestos de estas realizaciones tienen la fórmula (II):

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en donde G^{1}, G^{2} y G^{3} son como se describieron anteriormente, y R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi y ciano. En algunos compuestos preferidos, R^{4} y R^{5} son ambos hidrógeno.

En algunos otros compuestos, G^{1} está unido en C3, y G^{2} y G^{3} están unidos en C8 y C7, respectivamente. Por tanto, los compuestos tienen la fórmula (III):

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en donde G^{1}, G^{2} y G^{3} son como se describieron anteriormente, y R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, halo, fluoroalquilo, hidroxi, alcoxi y ciano. En algunos compuestos preferidos, R^{4} y R^{5} son hidrógeno.

En incluso otros compuestos, G^{1} está unido en C4, y G^{2} y G^{3} están unidos en C9 y C8, respectivamente. Por tanto, estos compuestos tienen la fórmula (IV):

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Las fórmulas (II)-(IV) ilustran ciertos compuestos preferidos. Sin embargo, otros regioisómeros también son posibles, y se incluyen dentro del alcance de la invención.

La expresión "opcionalmente sustituido", significa sustitución opcional con los grupos, radicales o restos especificados.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que el término "composición" abarque un producto que comprenda los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas

También se contemplan profármacos y solvatos de los compuestos descritos en la presente memoria. El término "profármaco", como se usa en la presente memoria, designa un compuesto que es un precursor de fármaco el cual, tras administración a un sujeto, sufre conversión química por procesos metabólicos o químicos para dar un compuesto de fórmula I, o una de sus sales y/o solvatos. Una estudio de profármacos se proporciona en T. Higuchi y V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) volumen 14, de la A.C.S. Symposium Series, y en Bioreversible Carriers in Drug Design (1987), Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, citas que se incorporan en la presente memoria como referencia.

"Solvato" significa una asociación física de un compuesto descrito de esta invención con una o más moléculas de disolvente. Esta asociación física incluye grados variables de unión iónica y covalente, incluyendo unión por enlaces de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato será capaz de aislamiento, por ejemplo, cuando una o más moléculas de disolvente se incorporan en la red cristalina del sólido cristalino. "Solvato" abarca solvatos de fase en solución y aislables. Ejemplos no limitativos de solvatos adecuados incluyen etanolatos, metanolatos, y similares. "Hidrato" es un solvato en donde la molécula de disolvente es H_{2}O.

Los compuestos de fórmula I forman sales (por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables), las cuales están también dentro del alcance de esta invención. Se entiende que la referencia a un compuesto de fórmula I en la presente memoria, incluye referencia a sus sales, a menos que se indique de otra manera. El término "sal(es)", como se usa en la presente, denota sales ácidas formadas con ácidos orgánicos y/o inorgánicos, así como sales básicas formadas con bases orgánicas y/o inorgánicas. Además, cuando un compuesto de fórmula I contiene un resto básico tal como, pero sin limitación, piridina o imidazol, y un resto ácido, tal como, pero sin limitación, un ácido carboxílico, pueden formarse híbridos ("sales internas"), y se incluyen dentro del término "sal(es)" como se usa en la presente memoria. Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente aceptables), aunque otras sales son también útiles. Las sales de los compuestos de fórmula I pueden formarse, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de fórmula I con una cantidad del ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el cual precipite la sal, o en un medio acuoso, seguido por liofilización.

Ejemplos de sales ácidas de adición incluyen acetatos, adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforatos, alcanforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, hidrocloruros, hidrobromuros, hidroyoduros, 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, maleatos, metanosulfonatos, 2-naftalensulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pamoatos (es decir, 1,1-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoatos)), pectinatos, persulfatos, 3-fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos, sulfonatos (tales como los mencionadas en la presente memoria), tartratos, tiocianatos, toluensulfonatos (conocidos también como tosilatos), undecanoatos, y similares. Además, los ácidos que en general se consideran adecuados para la formación de sales farmacéuticamente útiles a partir de compuestos farmacéuticos básicos están descritos, por ejemplo, por S. Berge et al, Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1-19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201-217; Anderson et al, The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York; en The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C. en su página web), y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vigésima edición, ed. A. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000. Estas descripciones se incorporan en la presente memoria como referencia.

Ejemplos de sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino tales como sales de sodio, litio y potasio, sales de metal alcalino-térreo, tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) tales como benzatinas, diciclohexilaminas, hidrabaminas (formadas con N,N-bis(deshidroabietil)-etilendiamina), N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butil-aminas, y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, y similares. Los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden cuaternizarse con agentes tales como halogenuros de alquilo inferior (por ejemplo, cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo), dialquil-sulfatos (por ejemplo, dimetil-, dietil-, dibutil- y diamil-sulfatos), halogenuros de cadena larga (por ejemplo, cloruros, bromuros e yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo), halogenuros de aralquilo (por ejemplo, bromuros de bencilo y fenetilo), y otros.

Se pretende que dichas sales ácidas y sales básicas sean sales farmacéuticamente aceptables dentro del alcance de la invención, y se considera que todas las sales básicas y ácidas son equivalentes a las formas libres de los compuestos correspondientes para los propósitos de esta descripción.

Los compuestos de fórmula I, y sus sales, solvatos y profármacos, pueden existir en su forma tautómera (por ejemplo, como una amida o imino-éter). Todas dichas formas tautómeras se contemplan en la presente invención como parte de la presente descripción.

Todos los estereoisómeros (por ejemplo, isómeros geométricos, isómeros ópticos, y similares) de los presentes compuestos (incluyendo los de las sales, solvatos y profármacos de los compuestos, así como las sales y los solvatos de los profármacos), tales como los que pueden existir debido a carbonos asimétricos en varios sustituyentes, incluyendo formas enantiómeras (las cuales pueden existir aún en ausencia de carbonos asimétricos), formas rotámeras, atropisómeros y formas diestereisómeras, se contemplan dentro del alcance de esta descripción. Los estereoisómeros individuales de los compuestos de la invención pueden estar, por ejemplo, sustancialmente libres de otros isómeros, o pueden estar mezclados, por ejemplo, como racematos o con todos los demás estereoisómeros u otros estereoisómeros seleccionados. Los centros quirales de la presente invención pueden tener la configuración S ó R definida por las recomendaciones de la IUPAC de 1974. Se pretende que el uso de los términos "sal", "solvato", "profármaco", y similares, se aplique igualmente a la sal, solvato o profármaco de enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, racematos o profármacos de los compuestos de la presente descripción.

En otros aspectos de esta descripción, los compuestos (incluyendo sales, profármacos, composiciones y métodos de los mismos) tienen las fórmulas siguientes, en donde las variables son como se definen en la presente memoria:

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En otro aspecto, los compuestos descritos en la presente memoria proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de la RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV de conformidad con cualquiera de las fórmulas (I)-(IV), y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los valores preferidos para G^{1}, G^{2}, G^{3}, W, Cy, R, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son como se describieron anteriormente para el primer aspecto de la invención. Los compuestos descritos en la presente memoria pueden formularse por cualquier método bien conocido en la técnica, y pueden prepararse para administración por cualquier vía que incluye, sin limitación, parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica o intrarrectal. En algunas realizaciones, se prefiere la administración oral.

Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden contener, además del inhibidor de RdRp del HCV, diluyentes, cargas, sales, tampones (soluciones amortiguadoras de pH), estabilizantes, solubilizantes, y otros materiales bien conocidos en la técnica, siempre que dichos materiales no interfieran con la eficacia de la actividad biológica del (de los) ingrediente(s) activo(s). La composición puede estar en cualquier forma adecuada, dependiendo de la vía de administración deseada que incluye, por ejemplo, formas de comprimidos, cápsulas o líquidos para administración oral, o formas en solución o suspensión para administración parenteral. La preparación de formulaciones farmacéuticamente aceptables se describe, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vigésima edición, ed. A. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000.

En algunos casos, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria incluyen también uno o más de otros agentes para el tratamiento de infecciones virales incluyendo, por ejemplo, agentes antivirales o agentes inmunomoduladores. En ciertos casos, el otro agente es un inhibidor de la RdRp del HCV, helicasa del HCV, proteasa del HCV, u otra proteína objetivo del HCV. En algunos otros casos, el otro agente es un agente antiviral o inmunomodulador de amplio espectro, por ejemplo, ribavirina, interferón o uno de sus derivados.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para inhibir la replicación del HCV en una célula. Los métodos comprenden poner en contacto una célula que esté infectada por el HCV, con un compuesto o composición descritos en la presente memoria. En algunos casos, la célula es un hepatocito. Sin embargo, el HCV es capaz de mostrar replicación en tipos de células diferentes de hepatocitos, y los métodos descritos en la presente memoria son también eficaces en dichos otros tipos de células.

En ciertos casos, la célula es una célula cultivada que es capaz de sustentar la replicación del HCV. Los sistemas de cultivo de células que sustentan la replicación del HCV pueden prepararse por infección de cultivos de células o líneas de células primarias, o por cultivo de células primarias de un mamífero crónicamente infectado. Ejemplos de dichos sistemas de replicación del HCV pueden encontrarse descritos, por ejemplo, en Lohmann et al., Science 285: 110-113 (1999), Blight et al., Science 290: 1972 (2000), y Barenschlager and Lohmann, J. Gen. Virology 81: 8631-1648 (2000). En algunos otros casos, la célula se localiza en un sujeto humano o animal. Preferiblemente, el animal es un mamífero. En algunas realizaciones, el animal es un primate.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de por lo menos un compuesto de fórmula (I), en la preparación de un medicamento para su uso en profilaxis o tratamiento de infección por el HCV.

En otro aspecto, la descripción proporciona métodos para tratar o prevenir una enfermedad o estado asociado con infección por el HCV, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto humano o animal infectado con el HCV, una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de por lo menos un compuesto o composición descritos en la presente memoria. Por "enfermedad o estado asociado con infección por el HCV", se entiende cualquier enfermedad o estado causado directamente o indirectamente por infección con el HCV. Preferiblemente, el animal es un mamífero. En algunas realizaciones, el animal es un primate.

El HCV se caracteriza por variabilidad genómica pronunciada, y la replicación del HCV lleva a la generación rápida de variantes del virus. Holland et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 176: 1-20 (1992), enseñan que el HCV existe, aún dentro de un paciente individual, como una multitud de microvariantes, un fenómeno que los autores definen como cuasiespecies. Por lo tanto, se pretende que los términos "virus de hepatitis C" y "HCV", como se usan en la presente memoria, se refieran a cualquiera de dichas variantes del virus o sus mezclas.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad suficiente para causar un beneficio al sujeto, o suficiente para causar cualquier cambio benéfico en cualquier síntoma o marcador asociado con la infección por el HCV. Por "marcador asociado con la infección por el HCV", se entiende cualquier medida biológica que se correlaciona con la infección por el HCV, y/o que predice el pronóstico clínico. Dichos marcadores incluyen, sin limitación, virus activos y antígenos virales.

La expresión "cantidad profilácticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad suficiente para prevenir o reducir la gravedad de síntomas causados por el HCV en un sujeto humano o animal expuesto a, o infectado por, el HCV. En algunos casos, el tratamiento profiláctico incluye administrar un compuesto o composición de conformidad con la invención a un sujeto humano o animal que se encuentra que lleva el HCV, pero que no exhibe síntomas de enfermedad por hepatitis C. El tratamiento profiláctico incluye también administrar un compuesto o composición de conformidad con la invención a un sujeto humano o animal que muestra un estado de enfermedad mejorado, pero que lleva aún el HCV y está en riesgo de recidiva de enfermedad sintomática.

La cantidad (por ejemplo, terapéuticamente o profilácticamente) eficaz del inhibidor de la RdRp del HCV administrado se determinará empíricamente, y se basará en consideraciones tales como el inhibidor particular usado, la edad, peso corporal y estado del individuo, el efecto del tratamiento deseado, la vía de administración, y similares. Se espera que el intervalo de dosis típica sea de alrededor de 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por dosis, la cual puede darse una a varias veces al día.

En algunos casos, los métodos de conformidad con este aspecto de la invención incluyen además la administración de uno o más de otros agentes para tratar infecciones virales, por ejemplo, agentes antivirales o agentes inmunomoduladores. En ciertos casos, el otro agente es un inhibidor de la RdRp del HCV, helicasa del HCV, proteasa del HCV, u otra proteína diana del HCV. En ciertos otros casos, el otro agente es un agente antiviral o inmunomodulador de amplio espectro, por ejemplo, ribavirina, interferón, o uno de sus derivados.

El otro agente o los otros agentes pueden administrarse al mismo tiempo que el inhibidor de la RdRp del HCV, o pueden administrarse en un tiempo diferente. Regímenes terapéuticos secuenciales o alternativos también se contemplan dentro del alcance de esta descripción.

Ejemplos

Aunque más adelante en la presente memoria se describen cierto número de compuestos diferentes los compuestos de la presente invención se muestran en la reivindicación 1 del apéndice.

Síntesis química

Los espectros de NMR se obtuvieron en un espectrómetro de NMR Mercuryplus de 400 MHz (Varian), usando CDCl_{3} o DMSO-d_{6} como disolventes. Se obtuvieron datos de LC-MS usando un aparato Agilent 1100 serie LC/MSD (cuadripolo, API-ES (electropulverización de interfaz a presión atmosférica)) con un voltaje capilar ajustado a 3500 V, y funcionando en modo positivo.

La purificación por cromatografía en fase inversa, se logró usando una columna de fase inversa C18 con un gradiente del ácido trifluoroacético al 0,1% en agua a una relación acetonitrilo:agua 95:5, a un caudal de 20 mL/min. Las muestras se recogieron usando una señal de radiación UV (Gilson, 254 nm) o espectros de masas (Agilent 1100 serie LC/MSD modelo SL).

La cromatografía sobre gel de sílice en fase normal en un instrumento Biotage, se logró usando un sistema de luz UV Quad (P/N 07052), usando columnas KP-SIL 32-63 um 60A, con cartuchos de destello 12+M o 25+M.

Abreviaturas usadas en los ejemplos

AcOH: Ácido acético

DCM: Diclorometano

DIAD: Azodicarboxilato de diisopropilo

DIEA: Diisopropiletilamina

DMAP: 4-Dimetilaminopiridina

DME: Dimetoxietano

DMF: Dimetilformamida

DMFDMA: Dimetilacetal de N,N-dimetilformamida

DMSO: Dimetilsulfóxido

EtOAc: Acetato de etilo

EtOH: Etanol

HATU: Hexafluorofostato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(7-azabenzotriazol-1-il)uronio

Hex: Hexanos

HPLC: Cromatografía de líquidos a alta presión

mCPBA: Acido meta-cloroperoxibenzoico

MeOH: Metanol

Pyr: Piridina

rt: Temperatura ambiente

THF: Tetrahidrofurano

TLC: Cromatografía en capa delgada

NMR: Resonancia magnética nuclear

Se prepararon compuestos representativos de fórmula (I), en donde G^{1} es -(CO)-OH, de acuerdo con la vía de síntesis descrita en el esquema 1.

Esquema 1

18

Ejemplo 1 Éster etílico del ácido 7-bifenil-4-il-5-(4-clorofenil)pirazol[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

Etapa 1

Éster etílico del ácido 5-(4-clorofenil)-7-oxo-4,7-dihidropirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

19

Una mezcla de 4-clorobenzoilacetato de metilo (2,13 g, 10 mmol) y 5-amino-3-pirazol-carboxilato de etilo (1,55 g, 10 mmol) en ácido acético glacial, se calentó a reflujo durante 20 horas. Se formó un precipitado brillante durante la reacción. La mezcla de reacción se enfrió, se diluyó con acetato de etilo y se filtró. El precipitado se lavó con acetato de etilo, para dar un sólido blancuzco brillante (1,92 g, 60%).

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 12,8 (bs, 1H), 7,87 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 7,67 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 6,55 (s, 1H), 6,21 (s, 1H), 4,34 (q, 2H, J = 6,8 Hz), 1,35 (t, 3H, J = 6,8 Hz), MS calculado para C_{15}H_{13}ClN_{3}O_{3} [M+H]^{+} 318,057, encontrado 318,0.

Etapa 2

Éster etílico del ácido 7-cloro-5-(4-clorofenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

20

A una suspensión del éster etílico del ácido 5-(4-cloro-fenil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (1,92 g, 6,04 mmol) y N,N-dietilanilina (2,4 mL, 15,1 mmol), se añadió oxicloruro de fósforo (6 mL). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3 horas. La mezcla de reacción se solidificó tras enfriamiento. La mezcla de reacción se disolvió en diclorometano y se concentró. El sólido se disolvió en diclorometano, y se lavó sucesivamente con agua fría (3 x 100 mL), solución saturada de bicarbonato de sodio (1 x 100 mL) y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La purificación por cromatografía de columna (SiO_{2}, acetato de etilo al 1%/diclorometano), dio un sólido amarillo (1,53 g, 75%).

^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,04 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,52 (s, 1H), 7,51 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,33 (s, 1H), 4,53 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,49 (t, 3H, J = 6,8 Hz), MS calculado para C_{15}H_{12}Cl_{2}N_{3}O_{2} [M+H]^{+} 336,023, encontrado 336,0.

Etapa 3

Éster etílico del ácido 7-bifenil-4-il-5-(4-clorofenil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

21

A un tubo de reacción que contenía éster etílico del ácido 7-cloro-5-(4-cloro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (50 mg, 0,15 mmol), ácido 4-(fenil)fenil-borónico (36 mg, 0,18 mmol), carbonato de sodio (35 mg, 0,33 mmol) y tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (17 mg, 0,015 mmol), se añadieron tolueno (5 mL) y agua (1 mL). El tubo de reacción se sometió a vacío y se inundó con argón. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche. Después de enfriamiento, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (10 mL) y agua (15 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con solución de cloruro de sodio saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. La purificación por cromatografía de columna (SiO_{2}, diclorometano), dio un sólido amarillo claro (53 mg, 78%).

^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,23 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 8,12 (d, 2H, J = 6,8 Hz), 7,81 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 7,68 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 7,55-7,40 (m, 8H), 7,31 (s, 1H), 6,90 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,49 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,47 (t, 3H, J = 6,8 Hz), MS calculado para C_{27}H_{21}ClN_{3}O_{2} [M+H]^{+} 454,12, encontrado 454,0.

Ejemplo 2 Éster etílico del ácido 5-(4-clorofenil-7-(2-clorofenil)pirazol[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

22

A un tubo de reacción que contenía éster etílico del ácido 7-cloro-5-(4-cloro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (50 mg, 0,15 mmol) y tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (17 mg, 0,015 mmol) en dimetilformamida (2 mL), se añadieron yoduro de zinc y 2-clorofenilo 0,5 M en THF (0,38 mL, 0,19 mmol). El tubo de reacción se sometió a vacío y se inundó con argón. La mezcla de reacción se calentó a 60ºC durante la noche. Después de enfriamiento, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (10 mL) y solución de cloruro de amonio saturado (10 mL). La capa orgánica se separó, se lavó con agua y solución de cloruro de sodio saturado, se secó sobre sulfato de sodio, y se concentró. La purificación por cromatografía en columna (SiO_{2}, diclorometano), dio un sólido amarillo claro (51 mg, 66%) con una pureza de 80%.

^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,08 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,70-7,45 (m, 6H), 7,40 (s, 1H), 7,30 (s, 1H), 4,45 (q, 2H, J = 6,8 Hz), 1,43 (t, 3H, J = 6,8 Hz), MS calculado para C_{21}H_{16}Cl_{2}N_{3}O_{2} [M+H]^{+} 412,05, encontrado 412,0.

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Ejemplo 3 Ácido 5-(4-clorofenil-7-(2-clorofenil)pirazol[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

23

Al éster etílico del ácido 5-(4-cloro-fenil-7-(2-cloro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (50 mg, 0,12 mmol) en tetrahidrofurano (3 mL), se añadió hidróxido de benciltrimetilamonio (2,2 M en metanol, 222 \muL, 0,49 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 1,5 horas antes de que se añadiera resina del ácido p-toluensulfónico (275 mg, \sim 4,5 equivalentes). La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora. La mezcla se filtró y se concentró. La purificación por cromatografía HPLC preparativa, dio un sólido blancuzco (25 mg, 54%). Este compuesto corresponde a la entrada 106 de la Tabla 1.

^{1}H NMR (400 MHz, DMSO-d_{6}) \delta 13,45 (bs, 1H), 8,33 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 7,99 (s, 1H), 7,80-7,6 (m, 6H), 7,25 (s, 1H), MS calculado para C_{19}H_{12}Cl_{2}N_{3}O_{2} [M+H]^{+} 384,02, encontrado 384,0.

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Ejemplo 4 Síntesis de derivados de pirazolo[1,5-a]pirimidinil-amino

Etapa 1

24

Una mezcla de la 7-cloropirazolo[1,5-a]pirimidina (0,05 mmol), amina (0,05 mmol) y carbonato de potasio (0,1 mmol) en DMF (1,5 mL), se agitó durante 16 horas a 60ºC.

La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente, y luego se diluyó con acetato de etilo (10 mL). La mezcla resultante se extrajo con agua (x2) y salmuera saturada. La capa de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró.

MS(+, 30V) calculado para C_{23}H_{21}ClN_{4}O_{2} [M+H]^{+} 421,14, encontrado 421,2.

Etapa 2

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25

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Al compuesto de pirazolo[1,5-a]pirimidina-amino (0,05 mmol) en THF (1,5 mL) y agua (0,5 mL), se añadió LiOH 1M (200 \muL, 0,2 mmol), y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (10 mL) y se acidificó a pH 2, se transfirió a un embudo de separación, y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con salmuera saturada, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró.

Para el caso anterior, en donde el grupo amino era DL-alfa-metilbencilamina (Entrada 78): MS (+, 30V) calculado para C_{21}H_{17}ClN_{4}O_{2} [M+H]^{+} 393,10, encontrado 393,0.

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Ejemplo 5 Síntesis de derivados de amino- y anilino-pirazolo[1,5-a]pirimidina

Etapa 1

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26

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Una mezcla de la 7-cloropirazolo[1,5-a]pirimidina (0,05 mmol), anilina (0,05 mmol) y carbonato de potasio (0,1 mmol) en DMF (1,5 mL), se agitó durante 16 horas a 60ºC.

La mezcla reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente, y luego se diluyó con acetato de etilo (10 mL). La mezcla resultante se extrajo con agua (x2) y salmuera saturada. La capa de acetato de etilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró.

MS (+, 30V) calculado para C_{21}H_{17}ClN_{4}O_{2} [M+H]^{+} 393,10, encontrado 393,0.

\newpage

Etapa 2

27

Para X=H (entrada 76): (+, 30V) calculado para C_{19}H_{13}ClN_{4}O_{2} [M+H]^{+} 365,07, encontrado 365,0.

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Ejemplo 6 Síntesis de carboxilatos de 6,7-diarilpirazolo[1,5-a]pirimidina

Etapa 1

28

A una solución de bencil-4-clorofenil-cetona (230 mg, 1 mmol) en tolueno seco (10 mL) bajo argón, se añadió gota a gota dimetilacetal de N,N-dimetilformamida (DMFDMA) (159 \mul, 1,2 mmol) a temperatura ambiente. Después de 12 horas, se añadió DMFDMA (4 \mul, 0,03 mmol), y la mezcla se calentó a 50ºC durante otras 24 horas. Luego, durante 5 días, se añadió DMFDMA (4 \mul, 0,03 mmol) cada día, y la temperatura se incrementó aproximadamente 15ºC cada día. Al quinto día, cuando la reacción había concluido (monitorización por TLC), el disolvente se separó para dar la enaminocetona (285 mg, 100%) en forma de un aceite rojo/pardo.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 7,35 (s, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,25 (m, 6H), 7,16 (m, 2H), 2,8 (s, 6H).

MS (+, 30V) calculado para C_{17}H_{16}ClNO [M+H]^{+} 286,09, encontrado 286,05.

Etapa 2

29

Al compuesto de enaminocetona (285 mg, 1 mmol) en ácido acético (10 mL), se añadió 3-amino-5-carbometoxi-pirazol (141 mg, 1 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 118ºC y se agitó a 118ºC durante 16 horas. La mezcla de reacción se concentró. El producto de pirazolopirimidina se purificó por cromatografía en columna (SiO_{2}, acetato de etilo al 5%/DCM), dando un sólido blanco (335 mg, 89%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 8,66 (s ancho, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,35 (m, 6H), 7,17 (m, 2H), 3,98 (s, 3H).

MS (+, 30V) calculado para C_{20}H_{14}ClN_{3}O_{2} [M+H]^{+} 364,08, encontrado 364,05.

Etapa 3

30

Al éster metílico del ácido 7-(4-cloro-fenil)-6-fenil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (98 mg, 0,27 mmol) en THF (5 mL), se añadió hidróxido de benciltrimetilamonio (solución al 40% en peso en metanol) (491 \mul, 1,1 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La TLC (DCM/MeOH/AcOH 90:10:1) indicó que la reacción había concluido. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (10 mL), y se acidificó a pH 2 con HCl 1N. Transferida a un embudo de separación y separadas las capas, la capa orgánica se lavó con salmuera (x1), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El producto de pirazolopirimidina se purificó por cromatografía de líquidos preparativa, dando un sólido amarillo claro (46 mg, 49%). Este corresponde a la entrada 236 de la Tabla 1.

^{1}H NMR (DMSO, 400 MHz): \delta 8,74 (s, 1H), 7,49 (s, 4H), 7,28 (m, 6H).

MS (+, 30V) calculado para C_{19}H_{11}ClN_{3}O_{2} [M+H]^{+} 350,08, encontrado 350,05.

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Ejemplo 7 Síntesis de 6,7-diarilpirazolo[1,5-a]pirimidina-tetrazoles

Etapa 1

31

A una solución de bencil-3-fenoxifenil-cetona (523 mg, 1,8 mmol) en tolueno seco (5 mL) bajo argón, se añadió gota a gota terc.butoxi-bis(dimetilamino)metano (524 \mul, 2,54 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se calentó a 60ºC durante 16 horas. La TLC indicó que la reacción había concluido. El disolvente se separó para dar la enaminocetona (617 mg, 100%) en forma de un aceite rojo/pardo.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 7,39 (s, 1H), 7,25 (m, 12H), 6,99 (dd, 2H), 2,75 (s ancho, 6H).

MS (+, 30V) calculado para C_{23}H_{21}NO_{2} [M+H]^{+} 344,16, encontrado 344,05.

\newpage

Etapa 2

32

Al compuesto de enaminocetona (150 mg, 0,44 mmol) en ácido acético (5 mL), se añadió 3-aminopirazol-4-carbonitrilo (48 mg, 0,44 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 118ºC y se agitó a 118ºC durante 16 horas. La mezcla de reacción se concentró. El producto de pirazolopirimidina se purificó por cromatografía en columna (SiO_{2}, acetato de etilo al 5%/DCM), dando un sólido blanco (117 mg, 68%).

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 8,82 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,45 (m, 4H), 7,31 (m, 3H), 7,15 (m, 4H), 6,85 (t, 1H), 6,78 (dd, 2H).

MS (+, 30V) calculado para C_{25}H_{16}N_{4}O [M+H]^{+} 389,13, encontrado 389,05.

Etapa 3

33

Al compuesto de pirazolopirimidina-nitrilo (102 mg, 0,26 mmol) en xilenos (5 mL), se añadió azidotributilestaño (144 \mul, 0,52 mmol). La mezcla resultante se calentó a 110ºC bajo argón durante 60 horas. Después de 60 horas, el disolvente se retiró por evaporación, se añadió acetonitrilo (10 mL), y la solución se lavó con hexanos (8 x 10 mL). La fase de acetonitrilo se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar el tetrazol protegido con pirazolopirimidina-estaño deseado, en forma de una goma amarilla (187 mg, 98%).

Esta goma amarilla se recogió en metanol (5 mL). A la solución resultante, se añadió cloruro de hidrógeno (solución a 1,0M en éter dietílico) (1 mL, 1 mmol), y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (10 mL), y se lavó con bicarbonato de sodio saturado acuoso (x2) y salmuera (x1). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El residuo se trituró con hexano, para dar el producto de tetrazol libre en forma de un sólido amarillo (10,7 mg, 10%). Este corresponde a la entrada 250 de la Tabla 1.

^{1}H NMR (CDCl_{3}, 400 MHz): \delta 8,85 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 7,4 (m, 6H), 7,28 (m, 1H), 7,15 (m, 5H), 6,95 (t, 1H), 6,82 (dd, 2H).

MS (+, 30V) calculado para C_{23}H_{17}N_{7}O [M+H]^{+} 432,15, encontrado 432,05.

Ejemplo 8 Síntesis del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico

34

A una solución de 25,8 g (164 mmol) del ácido 5-nitro-1H-pirazol-3-carboxílico en 250 mL de metanol (MeOH) anhidro, se añadieron gota a gota 10,3 mL (141 mmol) de cloruro de tionilo, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche, se enfrió luego a temperatura ambiente, y se concentró para dar 27,6 g (98% de rendimiento) del éster metílico del ácido 5-nitro-1H-pirazol-3-carboxílico en forma de un sólido. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 6,08 (s, 1H), 3,91 (s, 3H).

Se disolvieron 10,25 g (60 mmol) del éster metílico del ácido 5-nitro-1H-pirazol-3-carboxílico en 75 mL del ácido acético (AcOH) y 75 mL de tetrahidrofurano (THF). Después de un ciclo de vacío y argón, se añadieron 2,05 g (20% en peso) de paladio sobre carbono (Pd/C, 10% en peso), la mezcla se desgasificó de nuevo, y se cargó con hidrógeno desde una botella. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de hidrógeno durante 2 días. El análisis por cromatografía de capa delgada (TLC), mostró conversión completa del material de partida en el producto. La mezcla se concentró luego, el aceite de color púrpura resultante se recogió en 300 mL de éter, la impureza púrpura finamente dispersada se retiró por filtración, y el filtrado de éter se evaporó, para dar 7,23 g (85% de rendimiento) del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico en forma de un sólido blancuzco, según se indica por ^{1}H NMR, cuya estructura se confirmó usando ^{1}H NMR.

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Ejemplo 9 Síntesis del ácido 2-{[5-(4-cloro-fenil)-7-(4-fenoxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil]-amino}-3-hidroxi-propiónico

35

A una solución de 10 mg (0,023 mmol) del ácido 5-(4-cloro-fenil)-7-(4-fenoxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 1 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 0,016 mL (0,068 mmol) de hidrocloruro de diisopropiletilamina (DIEA), 6,3 mg (0,025 mmol) de hidrocloruro de L-serina-(tBu)OtBu y unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina (DMAP, catalizador), seguido por 10,3 mg (0,027 mmol) de HATU, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, se lavó con solución de hidróxido de sodio 0,1N, agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar el éster terc.butílico del ácido 3-terc.butoxi-2-{[5-(4-cloro-fenil)-7-(4-fenoxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil]-amino}-propiónico, el cual se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

Una muestra del éster terc.butílico del ácido 3-terc.butoxi-2-{[5-(4-cloro-fenil)-7-(4-fenoxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil]-amino}-propiónico, se trató con 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA):H_{2}O 95:5, y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas, tiempo después del cual la reacción se detuvo por la adición de 2 mL de acetonitrilo:agua 1:1. La mezcla se concentró luego y se liofilizó para dar 11,2 mg (93% de rendimiento en 2 etapas) del ácido 2-{[5-(4-cloro-fenil)-7-(4-fenoxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil]-amino}-3-hidroxi-propiónico deseado en forma de un sólido, cuyo espectro de ^{1}H NMR fue consistente con su estructura. Para la entrada 260: LC-MS calculado para C_{28}H_{21}ClN_{4}O_{5} [M + H]^{+}: 529,12; encontrado: 529,1.

Ejemplo 10 Síntesis del ácido 7-oxo-5-fenil-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico y del ácido 5-(2-cloro-fenil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico

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Una solución de 0,56 mL (3,22 mmol) del éster etílico del ácido 3-oxo-3-fenil-propiónico y 0,50 g (3,22 mmol) del éster etílico del ácido 5-amino-2H-pirazol-3-carboxílico en 4 mL del ácido acético (HOAc) se calentó a reflujo durante 4 horas, tiempo durante el cual se formó un precipitado. El precipitado se retiró por filtración, se lavó con acetato de etilo y se secó, para dar 0,51 g (56% de rendimiento) del éster etílico del ácido 7-oxo-5-fenil-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en forma de un sólido, según se indicó por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{15}H_{13}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]: 284,1, encontrado: 284,1.

A una solución de 50 mg (0,18 mmol) del éster etílico del ácido 7-oxo-5-fenil-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 4 mL de etanol (EtOH), se añadieron 26 mg (0,40 mmol) de hidróxido de potasio (KOH), y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 60 horas. La mezcla de reacción se acidificó luego con HCl 4M en solución de dioxano, y se diluyó con acetato de etilo. El extracto orgánico se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar el ácido 7-oxo-5-fenil-4,7-dihidropirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{13}H_{9}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 256,06, encontrado: 256,1. Este corresponde a la entrada 619.

Se sintetizó ácido 5-(2-cloro-fenil)-7-oxo-4,7-dihidropirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (entrada 620) siguiendo la misma secuencia de síntesis, partiendo del éster etílico del ácido 3-(2-cloro-fenil)-3-oxo-propiónico, y realizando la ciclización con éster etílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-4-carboxílico.

Ejemplo 11 Síntesis de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-isobutil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

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Se logró la síntesis de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-isobutil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (410) como se indicó anteriormente, por transformaciones que se describen en otra parte en este documento para compuestos estructuralmente similares. De forma similar, se sintetizaron otros compuestos con modificaciones en la posición 7.

Ejemplo 12 Síntesis de 7-isopropil-6-metil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

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Se logró la síntesis de la 7-isopropil-6-metil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (390) como se representa anteriormente, partiendo de la 2-metil-pentan-3-ona disponible comercialmente, por transformaciones conocidas que se describieron anteriormente para compuestos estructuralmente similares. Se prepararon 7-etil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (392), 7-ciclohexil-6-metil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (391), y ácido 7-ciclohexil-6-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (394), siguiendo la misma secuencia de síntesis.

Ejemplo 13 Síntesis de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-(tetrahidro-tiopiran-4-il)-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

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De acuerdo con una modificación de un procedimiento de la bibliografía (Helv. Chim. Acta 1997, 80, 1528), a una solución enfriada con hielo de 2,0 g (17,2 mmol) de tetrahidro-tiopiran-4-ona y 3,69 g (18,9 mmol) de 1-isocianometanosulfonil-4-metil-benceno en 100 mL de 1,2-dimetoxietano (DME), se añadieron 34,4 mL (34,4 mmol) de t-butóxido de potasio (solución 1M en t-butanol), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se diluyó con éter dietílico, se lavó con solución de bicarbonato de sodio saturado, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar 2,05 g (93% de rendimiento) del tetrahidro-tiopiran-4-carbonitrilo deseado, según se indica por ^{1}H NMR.

Se añadió una solución de 1,97 g (15,5 mmol) de tetrahidro-tiopiran-4-carbonitrilo en 5 mL de etanol (EtOH) a una solución de 6,2 g (155 mmol) de hidróxido de sodio (NaOH) en 30 mL de EtOH y 15 mL de agua, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo, se acidificó con ácido clorhídrico concentrado a pH 2, y se concentró luego para dar un precipitado el cual se filtró para dar 1,36 g (60%) del ácido tetrahidro-tiopiran-4-carboxílico deseado, en forma un sólido cristalino pardo, según se indica por ^{1}H NMR.

A una solución enfriada con hielo de 1,36 g (9,32 mmol) del ácido tetrahidro-tiopiran-4-carboxílico en 25 mL de diclorometano (DCM), se añadieron gota a gota 1,1 mL (12,6 mmol) de cloruro de oxalilo, y la mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 2 horas. Luego se añadieron 2 \muL de dimetilformamida (DMF, catalizador), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y se concentró, para dar 1,43 g (93%) del cloruro de tetrahidro-tiopiran-4-carboxílico deseado en forma de un aceite pardo, según se indica por ^{1}H NMR. El producto se usó sin más purificación en la siguiente etapa para la preparación de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-(tetrahidro-tiopiran-4-il)-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (más adelante, entrada 375).

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Ejemplo 14 Síntesis de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-(tetrahidro-piran-4-il)-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

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Ejemplo 15 Síntesis de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-morfolin-4-il-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

A una solución de 15 g (90,3 mmol) de 4-hidroxifenilacetato de metilo en 25 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 32,4 g (99,3 mmol) de carbonato de cesio, seguido por 13,4 mL (112,9 mmol) de bromuro de bencilo (BnBr), y la mezcla heterogénea resultante se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas. La mezcla de reacción se filtró, los sólidos se lavaron con acetato de etilo, y los extractos orgánicos reunidos se concentraron para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (hexano al 25% en diclorometano), para dar 19,1 g (83% de rendimiento) del éster metílico del ácido (4-benciloxi-fenil)-acético deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{16}H_{16}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 257,11, encontrado: 257,2.

De acuerdo con un procedimiento modificado de la bibliografía (Wasserman, H. H.; Ives, J. L. J. Org. Chem. 1985, 50, 3573-3580), una solución de 1,0 g (3,9 mmol) del éster metílico del ácido (4-benciloxi-fenil)-acético en 4 mL de tolueno, se inundó con argón. A esta solución, se añadió 0,842 mL g (5,5 mmol) de metoxi bis(dimetilamino)metano, y la mezcla resultante se agitó a 65ºC bajo argón durante la noche. La mezcla de reacción se concentró para dar 1,21 g del éster metílico del ácido 2-(4-benciloxi-fenil)-3-dimetilamino-acrílico deseado, según se indica por ^{1}H NMR (conteniendo trazas de material de partida). El producto se usó sin más purificación en la siguiente
etapa.

Una solución de 1,21 g (3,9 mmol) del éster metílico del ácido 2-(4-benciloxi-fenil)-3-dimetilamino-acrílico y 0,422 g (3,9 mmol) de 5-amino-1H-pirazol-4-carbonitrilo en 5 mL del ácido acético (HOAc), se calentó a reflujo durante la noche, tiempo durante el cual se formó un precipitado. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con acetato de etilo al 20% en solución de hexano, y se filtró para dar 0,86 g (65% en 2 etapas) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en forma de un sólido de color canela, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{20}H_{14}N_{4}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 343,11, encontrado: 343,1.

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Una suspensión de 0,86 g (2,5 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo, 1,0 mL (6,3 mmol) de N,N-dietilanilina y 2 mL (21,5 mmol) de oxicloruro de fósforo (POCl_{3}) se calentó a reflujo durante 7 horas, tiempo durante el cual la mezcla de reacción cambió a color oliva. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre hielo, y se extrajo con diclorometano/cloroformo. Los extractos reunidos se lavaron con agua (3 veces), solución de bicarbonato de sodio saturado (2 veces), salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, y se evaporó para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (diclorometano), para dar 0,637 (70% de rendimiento) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-cloro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{20}H_{13}ClN_{4}O [M^{+}+H]^{+}: 361,07, encontrado: 361,1.

A una solución de 50 mg (0,138 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-cloro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en 2 mL de dimetilformamida en un recipiente de microondas de 5 mL, se añadieron 25 mg (0,18 mmol) de carbonato de potasio, seguido por 15 mg (0,166 mmol) de morfolina, y la mezcla se calentó en un sintetizador de microondas (sistema Emrys de Personal Chemistry, 300 W) a 160ºC durante 5 minutos. Puesto que el análisis por LC-MS indicó la formación de producto, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con salmuera (2 veces), se secó sobre sulfato de sodio, y se concentró para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, usando Gilson para dar (después de liofilización) el 6-(4-benciloxi-fenil)-7-morfolin-4-il-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo deseado (90% de pureza), según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{24}H_{21}N_{5}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 412,17, encontrado: 412,1.

De acuerdo con una modificación de un procedimiento de la bibliografía (Herr, R. J. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3379-3393), a una solución de 35 mg (0,085 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-morfolin-4-il-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en 1,5 mL de tolueno y 0,5 mL de dimetilformamida, se añadieron 71 mg (0,513 mmol) de hidrocloruro de trietilamina (Et_{3}N-HCl) y 33 mg (0,513 mmol) de azida de sodio, y la mezcla heterogénea resultante se calentó a reflujo durante 72 horas, tiempo durante el cual se añadieron 71 mg (0,513 mmol) de hidrocloruro de trietilamina (Et_{3}N-HCl) y 33 mg (0,513 mmol) de azida de sodio, a la mezcla de reacción después de cada 24 horas. La mezcla se enfrió luego a temperatura ambiente, se filtró y se concentró hasta obtener un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 15 mg (38% de rendimiento) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-morfolin-4-il-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (370) en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR. LC-MS calculado para C_{24}H_{22}N_{8}O_{2} [M^{+}+H]^{+}455,18; encontrado 455,2.

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Ejemplo 16 Síntesis de 7-ciclohexil-6-(4-yodo-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo

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A una solución de 5 g (19 mmol) del ácido (4-yodo-fenil)-acético en 50 mL de metanol (MeOH), se añadieron gota a gota 3,5 mL (48 mmol) de cloruro de tionilo (SOCl_{2}), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 36 horas, tiempo durante el cual el análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) indicó la formación de producto. La mezcla se concentró, para dar 4,5 g (86% de rendimiento) del éster metílico del ácido (4-yodo-fenil)-acético en forma de un aceite beige claro, según se indica por ^{1}H NMR.

Una solución de 2,88 mL (20,5 mmol) de diisopropilamina (iPr_{2}NH) en 50 mL de tetrahidrofurano (THF) se inundó con argón, y se enfrió a -78ºC. A esta solución, se añadieron gota a gota 8,2 mL (20,5 mmol) de solución de n-butil-litio (nBuLi) 2,5 M en hexano, y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante 20 minutos, tiempo durante el cual se añadió gota a gota una solución de 4,5 g (16,3 mmol) del éster metílico del ácido (4-yodo-fenil)-acético en 25 mL de THF. La mezcla se dejó calentando a temperatura ambiente durante 40 minutos, y luego se enfrió de nuevo a -78ºC, y se añadieron gota a gota 2,62 mL (19,6 mmol) de cloruro de ciclohexanocarbonilo, y la mezcla resultante se dejó calentando a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo argón. La reacción se detuvo enfriándola sobre hielo por la adición de solución de cloruro de amonio saturado, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar 7 g de un aceite de color vino tinto, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; acetato de etilo al 10% en hexano), para dar 5,06 g (80% de rendimiento) del éster metílico del ácido 3-ciclohexil-2-(4-yodo-fenil)-3-oxo-propiónico deseado en forma de un sólido amarillo claro, según se indica por ^{1}H NMR (relación ceto:enol 1:2,6). LC-MS - calculado para C_{16}H_{19}IO_{3} [M^{+}+H]^{+}: 387,04, encontrado: 387,0.

De acuerdo con un procedimiento de la bibliografía modificado (Collins, I. et al J. Med. Chem. 2002, 45, 1887-1900), a una solución de 5,06 g (13,1 mmol) del éster metílico del ácido 3-ciclohexil-2-(4-yodo-fenil)-3-oxo-propiónico en 80 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO), se añadió una solución de 1,53 g (26,2 mmol) de cloruro de sodio (NaCl) en 5,8 mL de agua (H_{2}O), y la mezcla resultante se calentó a 150ºC durante 3 horas, tiempo durante el cual se formó un sólido blanco. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en 500 mL de agua, y se extrajo completamente con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua (3 veces), salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar 4,13 g (96% de rendimiento) de la 1-ciclohexil-2-(4-yodo-fenil)-etanona deseada en forma de un sólido amarillo, según se indica por ^{1}H NMR (conteniendo pequeñas trazas de impurezas). El producto se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

De acuerdo con un procedimiento de la bibliografía modificado (Wasserman, H. H.; Ives, J. L. J. Org. Chem. 1985, 50, 3573-3580), una solución de 4,13 g (12,6 mmol) de 1-ciclohexil-2-(4-yodo-fenil)-etanona en 20 mL de tolueno se inundó con argón. A esta solución, se añadieron 2,7 mL (17,6 mmol) de metoxi-bis(dimetilamino)metano, y la mezcla resultante se agitó a 70ºC bajo argón durante la noche. La mezcla de reacción se concentró para dar 5,07 g de 1-ciclohexil-3-dimetilamino-2-(4-yodo-fenil)-propenona en bruto, según se indica por ^{1}H NMR (conteniendo trazas de material de partida). El producto se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

Una solución de 2,55 g (6,32 mmoles, máximo) de 1-ciclohexil-3-dimetilamino-2-(4-yodofenil)-propenona en bruto y 0,98 g (6,32 mmol) del éster etílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-4-carboxílico en 30 mL del ácido acético (HOAc), se calentó a reflujo durante 66 horas, tiempo durante el cual se formó un precipitado. El precipitado se filtró y se desechó, y el filtrado del ácido acético se concentró hasta obtener un residuo sólido, el cual se lavó con acetato de etilo:hexano 1:1 y se secó, para dar 1,67 g (55% de rendimiento) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(4-yodo-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en forma de un sólido amarillo claro.

^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,57 (s, 1H), 8,53 (s, 1H), 7,86-7,83 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,1-7,06 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,46 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 3,31-3,21 (m, 1H), 2,62-2,41 (m, 2H), 1,87-1,82 (m, 2H), 1,74-1,66 (m, 3H), 1,44 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,41-1,21 (m, 3H)

Una solución de 1,66 g (4,1 mmoles, máximo) de 1-ciclohexil-3-dimetilamino-2-(4-yodo-fenil)-propenona en bruto y 0,44 g (4,1 mmol) de 5-amino-1H-pirazol-4-carbonitrilo en 20 mL del ácido acético (HOAc), se calentó a reflujo durante 66 horas, tiempo durante el cual se formó un precipitado finamente dispersado. Puesto que todos los intentos por filtrar el precipitado fueron infructuosos, la mezcla de reacción se concentró para dar un residuo pardo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; acetato de etilo al 2% en diclorometano), para dar 1,09 g (62% de rendimiento) de 7-ciclohexil-6-(4-yodo-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en forma de un sólido amarillo.

^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,49 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 7,88-7,86 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,07-7,05 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,13 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 3,28-3,21 (m, 1H), 2,59-2,47 (m, 2H), 1,87-1,84 (m, 2H), 1,75-1,65 (m, 3H), 1,28 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,39-1,20 (m, 3H).

Ejemplo 17 Síntesis del ácido 7-ciclohexil-6-(3'-metoxi-bifenil-4-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico, 7-ciclohexil-6-(4'-metanosulfonil-bifenil-4-il)-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina, y ácido 6-(4-bencil-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico

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Una mezcla de 60 mg (0,126 mmol) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(4-yodo-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico, 29 mg (0,19 mmoles, 1,5 equivalentes) de ácido 3-metoxifenilborónico, 5 mg (0,0063 mmoles, 5% en moles) de catalizador de paladio, y 80 mg (0,378 mmoles, 3 equivalentes) de fosfato de potasio, se colocó en un tubo de un carrusel. Después de un ciclo de vacío y argón, se añadió 1,4-dioxano (3 mL), y la mezcla resultante se calentó a 80ºC bajo argón durante 14 horas. Puesto que el análisis por LC-MS reveló que aún estaba presente material de partida sin reaccionar, se añadieron 29 mg (0,19 mmoles, 1,5 equivalentes) de ácido 3-metoxifenilborónico, 10 mg (0,012 mmoles, 10% en moles) de catalizador de paladio y 80 mg (0,378 mmoles, 3 equivalentes) de fosfato de potasio, y se continuó el calentamiento durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un residuo pardo (producto de acoplamiento en bruto), el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; elución en gradiente, acetato de etilo al 2%-5% en diclorometano) para dar 47 mg (82% de rendimiento) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(3'-metoxi-bifenil-4-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{28}H_{29}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 456,22, encontrado: 456,2.

A una solución de 47 mg (0,103 mmol) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(3'-metoxi-bifenil-4-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 3 mL de tetrahidrofurano, se añadieron 0,62 mL (0,62 mmol) de solución de LiOH 1M, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se acidificó luego con solución de HCl 1M a pH 2, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se secaron sobre sulfato de sodio y se concentró para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 15 mg (34% de rendimiento) del ácido 7-ciclohexil-6-(3'-metoxi-bifenil-4-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (446) en forma de un sólido (90% de pureza), según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{26}H_{25}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 428,19, encontrado: 428,2.

Una mezcla de 65 mg (0,15 mmol) de 7-ciclohexil-6-(4-yodo-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo, 45 mg (0,225 mmoles, 1,5 equivalentes) del ácido 4-(metanosulfonil)fenilborónico, 6 mg (0,0075 mmoles, 5% en moles) de catalizador de paladio y 95 mg (0,45 mmoles, 3 equivalentes) de fosfato de potasio, se colocó en un tubo de un carrusel. Después de un ciclo de vacío y argón, se añadió 1,4-dioxano (3 mL), y la mezcla resultante se calentó a 80ºC bajo argón durante 14 horas. Puesto que el análisis por LC-MS reveló que aún estaba presente material de partida sin reaccionar, se añadieron 45 mg (0,225 mmoles, 1,5 equivalentes) del ácido 4-(metanosulfonil)fenilborónico, 12 mg (0,015 mmoles, 10% en moles) de catalizador de paladio y 95 mg (0,45 mmoles, 3 equivalentes) de fosfato de potasio, y se continuó el calentamiento durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un residuo pardo (producto de acoplamiento en bruto), el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; elución en gradiente, acetato de etilo al 2%-10% en diclorometano), para dar 42 mg (62% de rendimiento) del 7-ciclohexil-6-(4'-metanosulfonil-bifenil-4-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{26}H_{24}N_{4}O_{2}S [M^{+}+H]^{+}: 457,16, encontrado: 457,1.

A una solución de 42 mg (0,092 mmol) de 7-ciclohexil-6-(4'-metanosulfonil-bifenil-4-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en 1 mL de tolueno y 1,2 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 76 mg (0,55 mmol) de hidrocloruro de trietilamina (Et_{3}N-HCl) y 36 mg (0,55 mmol) de azida de sodio, y la mezcla heterogénea resultante se calentó a 120ºC durante 72 horas, tiempo durante el cual se añadieron 76 mg (0,55 mmol) de hidrocloruro de trietilamina (Et_{3}N-HCl) y 36 mg (0,55 mmol) a la mezcla de reacción después de cada 24 horas. La mezcla se enfrió luego a temperatura ambiente, se filtró y se concentró hasta un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 7 mg (15% de rendimiento) de 7-ciclohexil-6-(4'-metanosulfonil-bifenil-4-il)-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina en forma de un sólido blanco (90% de pureza, entrada 443), según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{26}H_{25}N_{7}O_{2}S [M^{+}+H]^{+} 500,18; encontrado 500,2.

De acuerdo con una modificación de un procedimiento de la bibliografía (Suzuki, A. et al Tetrahedron Lett. 1986, 27, 6369-6372), una mezcla de 57 mg (0,12 mmol) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(4-yodo-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico y 5 mg (0,006 mmoles, 5% en moles) de catalizador de paladio, se colocó en un tubo de un carrusel. Después de un ciclo de vacío y argón, se añadió tetrahidrofurano (THF) (2 mL), seguido por 0,29 mL (0,144 mmoles, 1,2 equivalentes) de solución 0,5M de B-bencil-9-BBN en THF y 0,12 mL (0,36 mmoles, 3 equivalentes) de solución de NaOH 3N, y la mezcla resultante se calentó a reflujo bajo argón durante la noche. Puesto que el análisis por LC-MS reveló que aún estaba presente material de partida sin reaccionar, se añadieron 0,12 mL (0,06 mmol) de B-bencil-9-BBN, 5 mg (0,006 mmoles, 5% en moles) de catalizador de paladio y 0,12 mL (0,36 mmol) de solución de NaOH 3N, y se continuó el calentamiento durante 24 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio, se hizo pasar a través de una pequeña almohadilla de Celite, y se evaporó para dar un residuo pardo (producto de acoplamiento crudo), el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; acetato de etilo al 2% en diclorometano) para dar 36 mg (68% de rendimiento) del éster etílico del ácido 6-(4-bencil-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico deseado, según se indica por ^{1}H NMR (conteniendo trazas de impurezas); LC-MS - calculado para C_{28}H_{29}N_{3}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 440,23,
encontrado: 440,2.

A una solución de 36 mg (0,082 mmol) del éster etílico del ácido 6-(4-bencil-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 3 mL de tetrahidrofurano, se añadieron 0,5 mL (0,5 mmol) de solución de LiOH 1M, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se acidificó luego con solución de HCl 1M a pH 2, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se secaron sobre sulfato de sodio, y se concentró para dar un residuo el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 7 mg (21% de rendimiento) de ácido 6-(4-bencil-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en forma de un sólido (90% de pureza, entrada 444), según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{26}H_{25}N_{3}O_{2}
[M^{+}+H]^{+}: 412,19, encontrado: 412,3.

Ejemplo 18 Síntesis del ácido 7-ciclohexil-6-(4-furan-3-il-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico

45

De acuerdo con una modificación de un procedimiento de la bibliografía (Savarin C.; Liebeskind, L. S. Org. Lett. 2001, 3, 2149-2152), una mezcla de 24 mg (0,05 mmol) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(4-yodofenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico, 7 mg (0,06 mmoles, 1,2 equivalentes) de ácido 3-furilborónico, 3 mg (0,0025 mmol, 5% en moles) de Pd(PPh_{3})_{4} y 12 mg (0,06 mmoles, 1,2 equivalentes) de tiofen-2-carboxilato de cobre (I) (CuTC), se colocó en un matraz de Schlenk. Después de un ciclo de vacío y argón, se añadió tetrahidrofurano (1,2 mL), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente bajo argón durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo reunidos se lavaron con salmuera, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar 28 mg de un aceite amarillo (producto de acoplamiento crudo), el cual se usó en la siguiente reacción sin más purificación; LC-MS - calculado para C_{25}H_{25}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 416,19, encontrado: 416,2.

El residuo anterior se recogió en tetrahidrofurano (2 mL), y se añadieron 0,3 mL (0,3 mmoles, 5 equivalentes) de una solución de LiOH 1M, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, y se acidificó con solución de HCl 1N a pH 2. El extracto orgánico se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un residuo el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 4 mg (20% de rendimiento) del ácido 7-ciclohexil-6-(4-furan-3-il-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (445) en forma de un sólido blanco (90% de pureza), según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{23}H_{21}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 388,16, encontrado: 388,1.

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Ejemplo 19 Síntesis de 7-ciclohexil-6-[4-(3-metoxi-fenoxi)-fenil]-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

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46

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El material de partida en esta secuencia se sintetizó siguiendo el mismo procedimiento experimental que se usó para preparar un producto intermedio relacionado, en donde se reemplazó el grupo benciloxi (OBn) por yodo (I).

Una solución de 800 mg (1,95 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en 5 mL de diclorometano (DCM) se enfrió a -78ºC. A la solución fría anterior, se añadieron 2,93 mL (2,93 mmol) de solución 1M de tricloruro de boro (BCl_{3}) en DCM, y la mezcla resultante se agitó a -78 ºC durante 90 minutos. Puesto que el análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) reveló que aún estaba presente material de partida, se añadió exceso de tricloruro de boro (BCl_{3}) (3 equivalentes), y la reacción se detuvo a -78ºC con 5 mL de metanol. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente, se añadió solución de bicarbonato de sodio saturado, y la mezcla se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, y se evaporó para dar 754 mg de un sólido blancuzco, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (acetato de etilo al 5% en DMC), para dar 560 mg (90% de rendimiento) del 7-ciclohexil-6-(4-hidroxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo deseado en forma de un sólido blanco. LC-MS - calculado para C_{19}H_{18}N_{4}O [M^{+}+H]^{+}: 319,15, encontrado: 319,1. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 8,53 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,20-7,18 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,00-6,98 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,43 (s, 1H, OH), 3,34-3,28 (m, 1H), 2,58-2,44 (m, 2H), 1,86-1,82 (m, 2H), 1,74-1,68 (m, 3H), 1,41-1,18
(m, 3H).

Una mezcla de color verde agua de 50 mg (0,157 mmol) de 7-ciclohexil-6-(4-hidroxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo, 43 mg (0,235 mmol) de acetato de cobre (II) (Cu(OAc)_{2}), 48 mg (0,314 mmol) de ácido 3-metoxifenilborónico, 0,025 mL (0,31 mmol) de piridina y 5 mL de DCM, se agitó a temperatura ambiente durante 68 horas, mientras se abría a la atmósfera. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, mientras se lavó la almohadilla de Celite con acetato de etilo y cloroformo. Los filtrados orgánicos reunidos se concentraron para obtener un residuo sólido verde, el cual se repartió entre acetato de etilo y agua y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua (3 veces), salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar 74 mg de un residuo pardo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; DCM), para dar 38 mg (58% de rendimiento) del 7-ciclohexil-6-[4-(3-metoxi-fenoxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo deseado en forma de un aceite incoloro, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{26}H_{24}N_{4}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 425,19, encontrado: 425,1.

La conversión de 7-ciclohexil-6-[4-(3-metoxi-fenoxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en el tetrazol correspondiente 7-ciclohexil-6-[4-(3-metoxi-fenoxi)-fenil]-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina (301), se logró por un procedimiento experimental descrito en otra parte en este documento.

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Ejemplo 20 Síntesis de 7-ciclohexil-6-[4-(2,4-dimetil-tiazol-5-ilmetoxi)-fenil]-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidina

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47

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A una mezcla enfriada con hielo de 40 mg (0,13 mmol) de 7-ciclohexil-6-(4-hidroxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en 3 mL de tetrahidrofurano (THF), se añadieron 74 mg (0,52 mmol) de (2,4-dimetil-tiazol-5-il)-metanol, 136 mg (0,52 mmol) de trifenilfosfina (PPh_{3}), seguido por 0,102 mL (0,52 mmol) de azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD), y la mezcla se dejó calentando a temperatura ambiente, y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró luego, y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; acetato de etilo al 10% en DCM), para dar el 7-ciclohexil-6-[4-(2,4-dimetil-tiazol-5-ilmetoxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{25}H_{25}N_{5}OS [M^{+}+H]^{+}: 444,18, encontrado: 444,2.

La conversión del 7-ciclohexil-6-[4-(2,4-dimetil-tiazol-5-ilmetoxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en el tetrazol correspondiente 7-ciclohexil-6-[4-(2,4-dimetil-tiazol-5-ilmetoxi)-fenil]-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo
[1,5-a]pirimidina (358), se logró por un procedimiento descrito en otra parte.

Ejemplo 21 Síntesis de 7-ciclohexil-3-(1H-tetrazol-5-il)-6-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidina

48

A una solución de 53 mg (0,17 mmol) de 7-ciclohexil-6-(4-hidroxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en 3 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 72 mg (0,22 mmol) de carbonato de cesio (Cs_{2}CO_{3}), seguido por 0,034 mL (0,22 mmol) de bromuro de 3-(trifluorometil)-bencilo, y la mezcla heterogénea resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo, y los extractos orgánicos reunidos se concentraron para dar un residuo el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; DCM), para dar 65 mg (80% de rendimiento) del 7-ciclohexil-6-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{27}H_{23}F_{3}N_{4}O [M^{+}+H]^{+}: 477,18, encontrado: 477,1.

La conversión del 7-ciclohexil-6-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo en el tetrazol correspondiente 7-ciclohexil-3-(1H-tetrazol-5-il)-6-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-pirazolo[1,5-a]pirimidina (331), se logró por un procedimiento descrito en otra parte en este documento.

Ejemplo 22 Síntesis del éster etílico del ácido 6-bromo-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico

49

Una mezcla de 3,0 g (23,8 mmol) de ciclohexil-metil-cetona y 4,56 g (26,2 mmol) de t-butoxibis(dimetilamino)metano (reactivo de Bredereck), se agitó a 60ºC durante la noche. La mezcla de reacción se concentró luego, para dar 4,0 g (93% de rendimiento) de 1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona en forma de un aceite anaranjado, según se indica por ^{1}H NMR. Este producto se usó en la siguiente reacción sin más purificación.

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A una solución enfriada con hielo de 1,18 g (6,51mmol) de 1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona en 8 mL de diclorometano, se añadieron gota a gota 1,04 g (6,51 mmol) de bromo por un embudo de adición. La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 0,5 horas, y luego se añadieron gota a gota 0,9 mL (6,51 mmol) de trietilamina en 10 mL de éter. La mezcla se agitó a 0ºC durante 1 hora, y se dejó calentando a temperatura ambiente. Un sólido amarillo claro precipitó en la solución, y se separó por filtración. El filtrado se concentró luego, para dar 1,69 g de 2-bromo-1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona en forma de un sólido pardo, según se indica por ^{1}H NMR. El producto se usó en la siguiente reacción sin más purificación.

A una mezcla de 1,69 g (6,50 mmol) de 2-bromo-1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona y 1,01 g (6,50 mmol) del éster etílico del ácido 3-amino-1H-pirazol-4-carboxílico en 6 mL de etanol, se añadió 1,0 mL de bromuro de hidrógeno al 30% en solución en ácido acético, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 1 hora. Luego, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (elución en gradiente con acetato de etilo al 25% en diclorometano), para dar 620 mg (27% en dos etapas) del éster etílico del ácido 6-bromo-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico, según se indica por ^{1}H NMR (\delta 8,70 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 4,44 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 2,70-2,57 (b, 1H), 1,98-1,90 (m, 2H), 1,87-1,78 (m, 2H), 1,78-1,69 (m, 2H), 1,59-1,42 (m, 4H), 1,43 (t, J = 6,8 Hz, 3H)); LC-MS - calculado para C_{15}H_{18}BrN_{3}O_{2} [M++H]^{+}: 352,06, encontrado: 352,0.

Ejemplo 23 Síntesis del ácido 7-ciclohexil-6-(4-metansulfanil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico y del ácido 7-ciclohexil-6-furan-3-il-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico

50

Una mezcla de 14 mg (0,085 mmol) del ácido 4-metilsulfanil-fenilborónico, 2 mg (0,0028 mmol) de catalizador de paladio y 45 mg (0,213 mmol) de fosfato de potasio, se colocó en un vial de 4 mL. A esta mezcla, se añadieron 25 mg (0,077 mmol) del éster etílico del ácido 6-bromo-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 1,5 mL de 1,4-dioxano, y la mezcla resultante se inundó con argón y se agitó a 80ºC (baño de aceite) durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, y se evaporó (savant), para dar un residuo (producto de acoplamiento en bruto). Este residuo se disolvió en 1 mL de tetrahidrofurano (THF) y se trató con 0,5 mL (0,5 mmol) de solución de LiOH 1M, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Puesto que el análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) reveló que la reacción no había finalizado, la mezcla se agitó luego a 55ºC (baño de arena) durante 15 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, y se acidificó con solución de HCl 1M a pH 2. La capa orgánica se separó y se concentró (savant) para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (usando Gilson), para dar (después de liofilización) 14 mg (56% de rendimiento general) del ácido 7-ciclohexil-6-(4-metilsulfanil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (472) en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{20}H_{21}N_{3}O_{2}S [M^{+}+H]^{+}: 368,14, encontrado: 368,2.

El mismo procedimiento experimental se usó para la síntesis del ácido 7-ciclohexil-6-furan-3-il-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (465), el cual se obtuvo en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{17}H_{17}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 312,13, encontrado: 312,1.

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Ejemplo 24 Síntesis del ácido 7-ciclohexil-6-(4-metanosulfonil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico y del ácido 7-ciclohexil-6-(4-metanosulfinil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico

51

A una solución turbia de 14 mg (0,038 mmol) del ácido 7-ciclohexil-6-(4-metilsulfanil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 2 mL de cloroformo, se añadieron 9 mg (1,5 equivalentes) de ácido m-cloroperoxibenzoico (mCPBA), y la solución turbia se hizo transparente. Puesto que después de 5 minutos de agitación a temperatura ambiente la TLC indicó la desaparición del material de partida, la mezcla se concentró hasta obtener un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (usando Gilson), para dar (después de liofilización) 10 mg (69% de rendimiento) del ácido 7-ciclohexil-6-(4-metansulfinil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (491) en forma de un sólido, según se indica por LC-MS - calculado para C_{20}H_{21}N_{3}O_{3}S [M^{+}+H]^{+}: 384,13, encontrado: 384,2.

Nótese que cuando se llevó a cabo el mismo procedimiento experimental con 2,2 equivalentes de mCPBA, se obtuvo ácido 7-ciclohexil-6-(4-metanosulfonil-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (493).

Ejemplo 25 Ácido 2-{[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-amino}-3-(4-hidroxi-fenil)-propiónico

52

Se obtuvo ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (461) por una reacción de Suzuki que se describió anteriormente en otra sección. Los datos analíticos para este compuesto se dan a continuación: \delta CDCl_{3} 8,66 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,30-7,27 (m, 2H), 7,26-7,21 (m, 2H), 3,26 (m, 1H), 2,59-2,53 (m, 2H), 1,87-1,84 (m, 2H), 1,75-1,68 (m, 3H), 1,40-1,22 (m, 3H). LC-MS calculado para C_{19}H_{18}FN_{3}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 340,15; encontrado: 340,1.

A una solución de 15,0 mg (0,044 mmol) de ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 2 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 0,019 mL (0,132 mmol) de diisopropiletilamina (DIEA), unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina (DMAP, catalizador), 17,4 mg (0,053 mmol) de H-Tyr(tBu)-OtBu.HCl, seguido por 20 mg (0,053 mmol) de HATU, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, y se lavó con solución de hidróxido de sodio 0,1N (2 veces) y salmuera. La capa orgánica separada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar éster terc.butílico del ácido 3-(4-terc.butoxi-fenil)-2-{[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-amino}-propiónico, el cual se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

Una muestra del éster terc.butílico del ácido 3-(4-terc.butoxi-fenil)-2-{[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-amino}-propiónico crudo se trató con 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA):H_{2}O 95:5, y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, la reacción se detuvo añadiendo a la mezcla 2 mL de acetonitrilo:agua 1:1, se concentró, y el residuo se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 10 mg (45% de rendimiento en dos etapas) del ácido 2-{[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-amino}-3-(4-hidroxi-fenil)-propiónico deseado (505) en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{28}H_{27}FN_{4}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 503,2; encontrado: 503,2.

Nótese que en los casos en donde se usaron ésteres metílicos o etílicos, se usó una segunda etapa de desprotección, una saponificación típica por LiOH acuoso, para generar el ácido carboxílico requerido.

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Ejemplo 26 Síntesis de N-[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-C-fenil-metansulfonamida

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53

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A una solución de 20 mg (0,059 mmol) de ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 2 mL de diclorometano (DCM), se añadieron unos cuantos cristales de DMAP (catalizador) y 12 mg (0,071 mmol) de toluensulfonamida, seguido por 0,071 mL (0,071 mmol) de solución de diciclohexilcarbodiimida (DCC) 1M en DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se concentró, y el residuo resultante se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar (después de liofilización) 15 mg (51% de rendimiento) de la N-[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-C-fenil-metanosulfonamida deseada (533) en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{26}H_{25}FN_{4}O_{3}S [M^{+}+H]^{+}: 493,16; encontrado: 493,1.

Ejemplo 27 Síntesis del ácido 6-(4-benciloxi-fenil)-3-bromo-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

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54

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Una solución de 0,718 g (1,97 mmol) de 2-(4-benciloxi-fenil)-1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona y 0,28 g (1,97 mmol) del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico en 20 mL del ácido acético (HOAc), se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (acetato de etilo al 5% en diclorometano), para dar 0,643 g (74% de rendimiento) del éster metílico del ácido 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en forma de un sólido beige, según se indica por ^{1}H NMR.

A una solución enfriada con hielo de 50 mg (0,113 mmol) del éster metílico del ácido 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 2 mL de diclorometano (DCM), se añadió una solución de 21 mg (0,118 mmol) de N-bromosuccinimida (NBS) en 1 mL de DCM, y la mezcla resultante se dejó calentando a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (acetato de etilo al 5% en diclorometano), para dar 7 mg (11% de rendimiento) del éster metílico del ácido 6-(4-benciloxi-fenil)-3-bromo-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en forma de un aceite incoloro, según se indica por ^{1}H NMR (90% de pureza); LC-MS - calculado para C_{27}H_{26}BrN_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 520,12, encontrado: 520,0.

La saponificación del éster metílico del ácido 6-(4-benciloxi-fenil)-3-bromo-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico para obtener el ácido carboxílico (477), se llevó a cabo usando un procedimiento descrito anteriormente.

Ejemplo 28 Síntesis de [6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-metanol

55

Una solución de 4,37 g (12 mmol) de 2-(4-benciloxi-fenil)-1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona y 1,0 g (12 mmol) de 1H-pirazol-3-ilamina en 40 mL del ácido acético (HOAc) se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para dar un residuo sólido beige, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (acetato de etilo al 2% en diclorometano), para dar 3,38 g (74% de rendimiento) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidina en forma de un sólido blanco, según se indica por ^{1}H NMR.

A una solución enfriada en hielo de 300 mg (0,78 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidina en 2 mL de dimetilformamida (DMF) y 1 mL de diclorometano (DCM), se añadieron 0,085 mL (0,9 mmol) de oxicloruro de fósforo (POCl_{3}), y la mezcla resultante se dejó calentando a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, cuando el análisis por cromatografía en capa delgada (TLC) indicó la conversión completa del material de partida a producto. La mezcla de reacción se vertió en agua con hielo y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar 335 mg de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbaldehído (436) en forma de un sólido beige, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{26}H_{25}N_{3}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 412,19, encontrado: 412,1.

A una solución agitada de 4,4 mg (0,115 mmol) de borohidruro de sodio (NaBH_{4}) en 2 mL de metanol (MeOH), se añadió una solución de 35 mg (0,104 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbaldehído en 3 mL de tetrahidrofurano (THF), y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, cuando el análisis por TLC indicó la conversión completa del material de partida en producto. La reacción se detuvo añadiendo a la mezcla solución de cloruro de amonio saturado y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar (después de liofilización) 20 mg (47% de rendimiento) de [6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-metanol (479) en forma de un sólido blanco (85% de pureza), según se indica por ^{1}H NMR (conteniendo pequeñas trazas de material de partida); LC-MS - calculado para C_{26}H_{27}N_{3}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 414,21, encontrado: 414,2.

Ejemplo 29 Síntesis de la [6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-amida del ácido ciclopropanocarboxílico y de la [6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-amida del ácido etanosulfónico

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A una mezcla de 25 mg (0,109 mmol) de dihidrato de nitrato de cobre (II) (Cu(NO_{3})_{2}-2,5 H_{2}O) en 1,5 mL del ácido acético y 3 mL de anhídrido acético a 35ºC, se añadieron en porciones (durante 15 minutos) 40 mg (0,104 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidina, y la mezcla resultante se agitó a 35ºC durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano, y se lavó con solución de hidróxido de sodio 0,1N, agua y salmuera. El extracto orgánico se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar 43 mg de residuo púrpura, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; diclorometano), para dar 18 mg (41%) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina en forma de un residuo blancuzco (90% de pureza), según se indica por H NMR; LC-MS - calculado para C_{25}H_{24}N_{4}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 429,18, encontrado: 429,2.

A una solución de 18 mg (0,042 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-3-nitro-pirazolo[1,5-a]pirimidina en 3 mL de acetato de etilo (EtOAc), se añadieron 40 mg (0,21 mmol) de cloruro de estaño (II) (SnCl_{2}), y la mezcla resultante se agitó a 80ºC bajo argón durante 8 horas, cuando el análisis por TLC indicó sólo 75% de conversión del material de partida en producto. Por lo tanto, se añadieron 40 mg (0,21 mmol) de cloruro de estaño (II) (SnCl_{2}), y la mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante 8 horas tras las cuales el análisis por TLC indicó conversión completa del material de partida en producto. La mezcla se diluyó con acetato de etilo, se lavó con solución de bicarbonato de sodio saturado, agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar (después de liofilización) 6 mg (36% de rendimiento) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-ilamina en forma de un sólido amarillo, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{25}H_{26}N_{4}O [M^{+}+H]^{+}: 399,21, encontrado: 399,2.

A una solución de 30 mg (0,075 mmol) de 6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-ilamina en 2 mL de acetonitrilo (CH_{3}CN), se añadieron 0,018 mL (0,225 mmol) de piridina, seguido por 16 mg (0,2 mmol) de cloruro de ciclopropilcarbonilo o 19 mg (0,15 mmol) de cloruro de etanosulfonilo y 1 mg de dimetilaminopiridina (DMAP), y la mezcla resultante se agitó a 60ºC durante la noche. Puesto que el análisis por LC-MS reveló formación de producto, la mezcla de reacción se concentró para dar un residuo el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 17 mg (49% de rendimiento) de [6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-amida del ácido ciclopropanocarboxílico (415) en forma de un sólido amarillo, o 17 mg (46% de rendimiento) de [6-(4-benciloxi-fenil)-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-amida del ácido etanosulfónico (421) en forma de un sólido amarillo, según se indica por LC-MS - calculado para C_{29}H_{30}N_{4}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 467,24, encontrado: 467,2; calculado para C_{27}H_{30}N_{4}O_{3}S [M^{+}+H]^{+}: 491,2, encontrado: 491,2.

Ejemplo 30 Síntesis del ácido 2-{[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-amino}-3-(4-hidroxi-fenil)-propiónico

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A una solución de 1,04 (4 mmol) de 2-bromo-1-ciclohexil-3-dimetilamino-propenona y 0,676 g (4 mmol) del éster etílico del ácido 5-amino-3-metil-1H-pirazol-4-carboxílico en 10 mL de etanol, se añadieron 0,65 mL de bromuro de hidrógeno al 30% en solución de ácido acético, y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró para dar un residuo pardo, el cual se trató con ultrasonidos disuelto en acetato de etilo al 30% en hexano, para dar un precipitado el cual se filtró y se lavó luego dos veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se evaporaron para dar 1,32 g de un sólido anaranjado, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (elución en gradiente con diclorometano, seguida de acetato de etilo al 2%-10% en diclorometano), para dar 0,756 g (52%) del éster etílico del ácido 6-bromo-7-ciclohexil-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en forma de un sólido amarillo, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{16}H_{20}BrN_{3}O_{2} [M++H]^{+}: 366,07, encontrado: 366,1.

Una mezcla de 187 mg (0,5 mmol) del éster etílico del ácido 6-bromo-7-ciclohexil-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico, 105 mg (0,75 mmoles, 1,5 equivalentes) del ácido 4-fluorofenilborónico, 20 mg (0,025 mmoles, 5% en moles) de catalizador de paladio y 318 mg (1,5 mmoles, 3 equivalentes) de fosfato de potasio, se colocó en un tubo de un carrusel. Después de un ciclo de vacío y argón, se añadió 1,4-dioxano (7 mL), y la mezcla resultante se calentó a 80ºC bajo argón durante 14 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar un residuo pardo el cual se cromatografió sobre gel de sílice (elución en gradiente con acetato de etilo al 2%, 5% a 10% en diclorometano), para dar 0,178 g (94%) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en forma de un sólido blancuzco, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{22}H_{24}FN_{3}O_{2} [M++H]^{+}: 382,19, encontrado: 382,1.

A una solución de 178 mg (0,46 mmol) del éster etílico del ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 9 mL de tetrahidrofurano, se añadieron 2,8 mL (2,8 mmol) de solución de LiOH 1M, y la mezcla se calentó a reflujo durante 15 horas. Puesto que el análisis por TLC reveló que aún estaba presente material de partida, se añadieron 2,8 mL (2,8 mmol) de solución de LiOH 1M, y se continuó el reflujo durante 60 horas. La mezcla de reacción se enfrió luego a temperatura ambiente, se concentró, se diluyó con agua, se acidificó con solución de HCl al 10% a pH 2, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar 156 mg (96% de rendimiento, 90% de pureza) del ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico (515) en forma de un sólido beige, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{20}H_{20}FN_{3}O_{2} [M++H]^{+}: 354,15, encontrado: 354,2.

Una solución de 36 mg (0,1 mmol) del ácido 7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carboxílico en 2 mL de dimetilformamida, se enfrió a 0ºC. A la solución fría anterior, se añadieron 0,053 mL (0,3 mmol) de N,N-diisopropiletilamina (DIEA), seguido por 38 mg (0,1 mmol) de HATU y 37 mg (0,11 mmol) del éster terc.butílico del ácido 2-amino-3-(4-ter-butoxi-fenil)-propiónico, y unos cuantos cristales de 4-dimetilaminopiridina (DMAP), y la mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó luego con acetato de etilo, se lavó con solución de NaOH 0,1N, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un residuo, el cual se trató con 2 mL de ácido trifluoroacético (TFA):agua 95:5, y se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 horas. La reacción se detuvo por adición a la mezcla de 10 mL de solución de acetonitrilo:agua 1:1 y se concentró para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, usando Gilson, para dar (después de liofilización) 8 mg (16% en dos etapas) del ácido 2-{[7-ciclohexil-6-(4-fluoro-fenil)-2-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonil]-amino}-3-(4-hidroxi-fenil)-propiónico en forma de un sólido blanco (92% de pureza, entrada 517), según se indica por ^{1}H NMR. LC-MS calculado para C_{29}H_{29}FN_{4}O_{4} [M+H]^{+} 517,22; encontrado 517,2.

Ejemplo 31 Síntesis del ácido 4'-cloro-2-{4-[7-ciclohexil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-6-il]-fenoximetil}-bifenil-4-carboxílico

58

Una mezcla de 250 mg (1,09 mmol) del éster metílico del ácido 4-bromo-3-metil-benzoico, 204 mg (1,31 mmol) del ácido 4-clorofenilborónico, 1,06 g (3,27 mmol) de carbonato de cesio (Cs_{2}CO_{3}) y catalizador de PdCl_{2} (dppf) (5% en moles), se inundó con argón. A esta mezcla se añadieron 3 mL de 1,4-dioxano, y la mezcla de reacción se calentó a 80ºC durante la noche. La mezcla se enfrió luego a temperatura ambiente y se filtró a través de una almohadilla de Celite, mientras se lavó la almohadilla con acetato de etilo. El filtrado se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (acetato de etilo al 5% en hexano), para dar 191 mg (67%) del éster metílico del ácido 4'-cloro-2-metil-bifenil-4-carboxílico deseado en forma de un aceite, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{15}H_{13}ClO_{2} [M^{+}+H]^{+}: 261,07, encontrado: 261,1.

A una solución de 191 mg (0,73 mmol) del éster metílico del ácido 4'-cloro-2-metil-bifenil-4-carboxílico en 4 mL de tetracloruro de carbono (CCl_{4}), se añadieron 9,7 mg (0,04 mmol) de peróxido de benzoilo, seguido por 124 mg (0,696 mmol) de N-bromosuccinimida (NBS), y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 6 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con diclorometano, y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar 132 mg (53%) del éster metílico del ácido 2-bromometil-4'-cloro-bifenil-4-carboxílico en forma de un aceite, el cual se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

^{1}H NMR \delta CDCl_{3} 8,10 (s, 1H), 7,91-7,89 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,37-7,35 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,30-7,18 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,22-7,20 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,30 (s, 2H), 3,87 (s, 3H).

Se llevó a cabo la alquilación de 7-ciclohexil-6-(4-hidroxi-fenil)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-carbonitrilo con éster metílico del ácido 2-bromometil-4'-cloro-bifenil-4-carboxílico en dimetilformamida (DMF) usando carbonato de cesio, y siguiendo un procedimiento experimental descrito anteriormente, para dar éster metílico del ácido 4'-cloro-2-[4-(3-ciano-7-ciclohexil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-6-il)-fenoximetil]-bifenil-4-carboxílico. Este compuesto se convirtió en su tetrazol correspondiente, éster metílico del ácido 4'-cloro-2-{4-[7-ciclohexil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-6-il]-fenoximetil}-bifenil-4-carboxílico (475), por un procedimiento descrito anteriormente. Por último, se obtuvo ácido 4'-cloro-2-{4-[7-ciclohexil-3-(1H-tetrazol-5-il)-pirazolo[1,5-a]pirimidin-6-il]-fenoximetil}-bifenil-4-carboxílico (490), siguiendo un protocolo estándar de saponificación por LiOH.

Ejemplo 32 Síntesis del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

59

A una mezcla de 5,0 g (21,9 mmol) del ácido 4-benciloxi-benzoico en 25 mL de diclorometano (DCM), se añadieron gota a gota 10 mL (114 mmol) de cloruro de oxalilo, seguido por 5 \muL de dimetilformamida (DMF, catalizador), y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3 horas y se concentró, para dar 5,32 g (98%) del cloruro de 4-benciloxi-benzoilo deseado en forma de un sólido amarillo, según se indica por ^{1}H NMR. El producto se usó sin más purificación en la siguiente etapa.

Una solución de 0,35 mL (2,5 mmol) de diisopropilamina (iPr_{2}NH) en 7 mL de tetrahidrofurano (THF) se inundó con argón y se enfrió a -78ºC. A esta solución, se añadió gota a gota 1 mL (2,5 mmol) de solución de N-butil-litio (nBuLi) 2,5 M en hexano, y la mezcla resultante se agitó a -78ºC durante 20 minutos, tiempo después del cual se añadieron gota a gota 0,33 mL (2 mmol) de ciclohexilacetato de metilo. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante 40 minutos, luego se enfrió de nuevo a -78ºC, y se añadió gota a gota una solución de 0,592 g (2,4 mmol) de cloruro de 4-benciloxi-benzoilo en 8 mL de THF, y la mezcla resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche bajo argón. La reacción se detuvo añadiendo a la mezcla solución de cloruro de amonio saturado, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar 0,83 g de un residuo sólido amarillo el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; hexano al 25% en diclorometano), para dar 0,306 g (42% de rendimiento) del éster metílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-2-ciclohexil-3-oxo-propiónico deseado en forma de un sólido blanco, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{23}H_{26}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 367,18, encontrado: 367,2.

Una mezcla de 274 mg (0,747 mmol) del éster metílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-2-ciclohexil-3-oxo-propiónico, 106 mg (0,747 mmol) del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico, 15 mg (10% en moles) de monohidrato del ácido p-toluensulfónico (PTSA) y 10 mL de tolueno, se calentó a reflujo durante 88 horas. La mezcla de reacción se concentró luego hasta obtener un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; elución en gradiente de acetato de etilo al 2%-20% en diclorometano), para dar 55 mg (16% de rendimiento) del éster metílico del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{27}H_{27} N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 458,2, encontrado: 458,2.

Este material se convirtió luego en ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico por el protocolo bien conocido de saponificación por LiOH (55% de rendimiento, entrada 538); LC-MS - calculado para C_{26}H_{25}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 444,18, encontrado: 444,2.

Ejemplo 33 Síntesis de 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-2-(1H-tetrazol-5-il)-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-ona

60

Una solución de 1,0 g (7 mmol) del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico en 10 mL de metanol (MeOH) en un tubo sellado, se saturó con amoníaco (NH_{3}), y la mezcla del tubo sellado se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Puesto que el análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) reveló que la reacción no había concluido, la mezcla se calentó luego a 80ºC durante un día. La mezcla de reacción se enfrió luego, el tubo sellado se abrió, y el disolvente se evaporó, para dar 0,9 g de la amida del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico deseada, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{4}H_{6}N_{4}O [M^{+}+H]^{+}: 127,05, encontrado: 127,2.

La preparación del éster metílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-2-ciclohexil-3-oxo-propiónico, se describe en otra parte en este documento.

Una mezcla de 1,0 g (2,7 mmol) del éster metílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-2-ciclohexil-3-oxo-propiónico, 340 mg (2,7 mmol) de amida del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico, 51 mg (10% en moles) de monohidrato del ácido p-toluensulfónico (PTSA) y 15 mL de tolueno, se calentó a reflujo durante 72 horas. La mezcla de reacción se concentró luego hasta obtener un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; elución de gradiente de acetato de etilo al 15% en diclorometano a metanol al 6% en diclorometano) para dar un residuo, el cual se purificó adicionalmente por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar (después de liofilización) 22 mg (2% de rendimiento) de la amida del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseada, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{26}H_{26}N_{4}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 443,2, encontrado: 443,2.

A una mezcla de 22 mg (0,05 mmol) de amida del ácido 5-(4-benciloxifenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 1 mL de diclorometano (DCM), se añadieron 0,04 mL (0,3 mmol) de trietilamina (Et_{3}N), y la mezcla resultante se enfrió en un baño de hielo. Luego, se añadieron 0,021 mL (0,15 mmol) de anhídrido trifluoroacético ((CF_{3}CO)_{2}O), tiempo durante el cual la mezcla se volvió homogénea, y se agitó durante 2,5 horas. La reacción se detuvo añadiendo a la mezcla agua, y se concentró hasta obtener un residuo el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 3 mg (14% de rendimiento) del 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonitrilo deseado, según se indica por LC-MS calculado para C_{26}H_{24}N_{4}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 425,19, encontrado: 425,2.

Este material se convirtió luego en el tetrazol correspondiente 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-2-(1H-tetrazol-5-il)-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-ona (551) por un procedimiento experimental descrito anteriormente (azida de sodio, hidrocloruro de trietilamina) (54% de rendimiento); LC-MS - calculado para C_{26}H_{25}N_{7}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 468,21, encontrado: 468,2.

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Ejemplo 34 Síntesis del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-metoxi-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

61

A una mezcla enfriada con hielo de 22 mg (0,048 mmol) del éster metílico del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 3 mL de tetrahidrofurano (THF), se añadieron 0,008 mL (0,192 mmol) de metanol (MeOH), 50 mg (0,192 mmol) de trifenilfosfina (PPh_{3}), seguido por 0,038 mL (0,192 mmol) de azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD), y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, cuando el análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) reveló el consumo completo del material de partida. La mezcla de reacción se concentró luego, y el residuo se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; elución en gradiente, diclorometano (DCM) a acetato de etilo al 10% en DCM), para dar 24 mg del éster metílico del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-metoxi-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado, según se indica por ^{1}H NMR (conteniendo trazas de impurezas).

Nótese que se obtuvo también éster metílico del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-metoxi-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico usando un procedimiento de alquilación (dimetilsulfato, con acetonitrilo como disolvente).

La conversión del éster metílico del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-metoxi-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en el ácido correspondiente, ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-metoxi-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (329), se logró por el protocolo bien conocido de saponificación por LiOH; LC-MS - calculado para C_{27}H_{27}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 458,2, encontrado: 458,2.

Ejemplo 35 Síntesis del ácido 2-{[5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil]- amino}-3-hidroxi-propiónico

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62

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A una solución de 71 mg (0,16 mmol) del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 4 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 0,053 mL (0,48 mmol) de 4-metil-morfolina, 14 mg (0,164 mmol) de 5-aminotetrazol, seguido por 100 mg (0,192 mmol) de PYBOP cuando la solución se tornó amarilla, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 41 horas. La mezcla de reacción se concentró para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar 29 mg (35% de rendimiento) de la (1H-tetrazol-5-il)-amida del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseada (540) en forma de un sólido, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{27}H_{26}N_{8}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 511,21; encontrado: 511,1.

A una solución de 67 mg (0,15 mmol) del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 3 mL de DMF, se añadieron 0,13 mL (0,75 mmol) de diisopropiletilamina (DIEA), unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina (DMAP, catalizador), 50 mg (0,195 mmol) de hidrocloruro del éster terc.butílico del ácido 2-amino-3-terc.butoxi-propiónico, seguido por 74 mg (0,195 mmol) de HATU, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con solución de hidróxido de sodio 0,1N (2 veces) y salmuera. La capa orgánica separada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar un residuo, el cual se trató con 3 mL de ácido trifluoroacético (TFA):agua 95:5, se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y la reacción se detuvo añadiendo a la mezcla acetonitrilo:agua 1:1. La mezcla resultante se concentró para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa, para dar (después de liofilización) 14 mg (17%) del ácido 2-{[5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil]-amino}-3-hidroxi-propiónico deseado (544) en forma de un sólido blanco, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS calculado para C_{29}H_{30}N_{4}O_{6} [M^{+}+H]^{+}: 531,22; encontrado: 531,2.

Ejemplo 36 Síntesis del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-(2-ciclohexil-etil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico y del ácido 6-(2-ciclohexil-etil)-5-furan-3-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

63

A una mezcla a reflujo de 7,0 g (175 mmol) de hidruro de sodio (dispersión al 60% de NaH en aceite mineral) y 10,45 g (88,5 mmol) de carbonato de dietilo (CO(OEt)_{2}) en 100 mL de tolueno, se añadió gota a gota por un embudo de adición, una mezcla de 10 g (44,3 mmol) de 1-(4-benciloxi-fenil)-etanona en 20 mL de tolueno, y la mezcla resultante se calentó a reflujo bajo argón durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió luego a 0ºC, la reacción se detuvo por la adición a la mezcla de 40 mL del ácido acético, tiempo durante el cual se formó un precipitado amarillo, y se disolvió tras la adición subsecuente de agua. La capa orgánica separada se lavó con solución de bicarbonato de sodio saturado, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (hexano al 10% en diclorometano), para dar 9,2 g (70% de rendimiento) del éster etílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-3-oxo-propiónico deseado, según se indica por ^{1}H NMR.

A una solución de 2 g (6,7 mmol) del éster etílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-3-oxo-propiónico en 12 mL de etanol (calentado ligeramente para disolución completa), se añadieron gota a gota 7 mL (7 mmol) de t-butóxido de potasio (solución 1M de KOtBu en t-butanol), tiempo durante el cual se formó un precipitado. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego se añadió éter dietílico, y el precipitado se recogió por filtración, se lavó con éter y se secó, para dar 2,2 g (98% de rendimiento) de la sal de potasio del éster etílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-3-oxo-propiónico deseada, según se indica por ^{1}H NMR.

Una mezcla de 100 mg (0,3 mmol) de sal de potasio del éster etílico del ácido 3-(4-benciloxi-fenil)-3-oxo-propiónico, 86 mg (0,45 mmol) de bromuro de 2-ciclohexiletilo y 17 mg (0,1 mmol) de yoduro de potasio (KI) en 1 mL de dimetilformamida (DMF) en un frasco de 4 mL, se agitó sobre un baño de arena a 80ºC durante la noche. La mezcla se concentró luego para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar (después de liofilización) 85 mg (70% de rendimiento) del éster etílico del ácido 2-(4-benciloxi-benzoil)-4-ciclohexil-butírico en forma de un sólido, según se indica por LC-MS - calculado para C_{26}H_{32}O_{2} [M^{+}+H]^{+}: 409,23, encontrado: 409,2.

Una mezcla de 71 mg (0,171 mmol) del éster etílico del ácido 2-(4-benciloxi-benzoil)-4-ciclohexil-butírico, 24 mg (0,171 mmol) del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico, 7 mg (20% en moles) de monohidrato del ácido p-toluensulfónico (PTSA) y 3 mL de clorobenceno, se calentó a 120ºC durante la noche. La mezcla de reacción se concentró luego hasta obtener un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar (después de liofilización) el éster metílico del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-(2-ciclohexil-etil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado en forma de un sólido, según se indica por LC-MS - calculado para C_{29}H_{31}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 486,23, encontrado: 486,2. Este material se convirtió luego en el ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-(2-ciclohexil-etil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (559) por el protocolo bien conocido de saponificación por LiOH (10% de rendimiento en dos etapas); LC-MS - calculado para C_{28}H_{29}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 472,22, encontrado: 472,2.

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Nótese que la misma secuencia de síntesis se llevó a cabo a partir del éster etílico del ácido 3-furan-3-il-3-oxo-propiónico disponible comercialmente como se ilustró anteriormente, para dar el ácido 6-(2-ciclohexil-etil)-5-furan-3-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (612).

Ejemplo 37 Síntesis del ácido 4-(3-trifluorometil-fenoxi)-benzoico

64

De acuerdo con una modificación de un procedimiento de la bibliografía (J. Org. Chem. 2002, 67, 1699-1702), una mezcla de color verde agua de 2,74 g (18 mmol) del éster metílico del ácido 4-hidroxi-benzoico, 4,9 g (27 mmol) de acetato de cobre (II) (Cu(OAc)_{2}), 6,84 g (36 mmol) del ácido 3-trifluorometil-fenoxi-borónico, 2,92 mL (36 mmol) de piridina y 120 mL de DCM, se agitó a temperatura ambiente durante 68 horas, mientras se abría a la atmósfera. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, mientras la almohadilla de Celite se lavó con acetato de etilo y cloroformo. Los filtrados orgánicos reunidos se concentraron hasta obtener un residuo sólido verde el cual se repartió entre acetato de etilo y agua, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua (3 veces), salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó, para dar 4,6 g de un residuo pardo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; hexano:DCM1:1), para dar 3,56 (67% de rendimiento) del éster metílico del ácido 4-(3-trifluorometil-fenoxi)-benzoico deseado en forma de un aceite amarillo claro, según se indica por ^{1}H NMR y ^{19}F NMR; LC-MS - calculado para C_{15}H_{11}F_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 297,07, encontrado: 297,1.

Una mezcla de 3,56 g (12 mmol) del éster metílico del ácido 4-(3-trifluorometil-fenoxi)-benzoico y 15 mL (60 mmol) de solución de hidróxido de sodio (NaOH) 4N en 45 mL de tetrahidrofurano (THF) y 15 mL de metanol (MeOH), se calentó a 50ºC durante 25 horas, cuando el análisis por cromatografía de capa delgada reveló conversión completa del material de partida en producto. La mezcla de reacción se concentró y se acidificó con solución de HCl 2N mientras se mantenía el matraz en un baño de hielo, cuando se formó un precipitado blanco. El sólido se filtró y se secó para dar 3,02 g (89%) del ácido 4-(3-trifluorometil-fenoxi)-benzoico deseado en forma de un sólido blanco, según se indica por ^{1}H NMR y ^{19}F NMR.

La síntesis del ácido 6-ciclohexil-7-oxo-5-[4-(3-trifluorometil-fenoxi)-fenil]-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (543) se logró como se representa en el esquema anterior, partiendo del ácido 4-(3-trifluorometil-fenoxi)-benzoico por transformaciones que se describieron para la síntesis del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (538). Para la entrada 543: LC-MS - calculado para C_{26}H_{22}F_{3}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 498,16, encontrado: 498,1.

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Ejemplo 38 Síntesis del ácido 6-ciclohexil-7-oxo-5-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

65

A una solución de 2,28 g (15 mmol) del éster metílico del ácido 4-hidroxi-benzoico en 30 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 5,38 g (16,5 mmol) de carbonato de cesio (Cs_{2}CO_{3}), seguido por 2,75 mL (18 mmol) de bromuro de 3-(trifluorometil)-bencilo, y la mezcla heterogénea resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró y se concentró, se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo, y los extractos orgánicos reunidos se lavaron con agua y salmuera y se concentró, para dar 4,75 g del éster metílico del ácido 4-(3-trifluorometil-benciloxi)-benzoico deseado, según se indica por ^{1}H NMR y ^{19}F NMR (conteniendo trazas de bromuro de 3-(trifluorometil)-bencilo residual).

Este producto se usó sin más purificación en la síntesis del ácido 6-ciclohexil-7-oxo-5-[4-(3-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (545), la cual se logró como se describió en el esquema anterior, por transformaciones estándares que se describieron anteriormente para la síntesis del ácido 5-(4-benciloxi-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico.

Ejemplo 39 Síntesis del ácido 6-ciclohexil-5-[4-(3,5-dimetil-isoxazol-4-il)-fenil]-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico, del ácido 5-(4-bencil-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico y del ácido 5-(4-(3-trifluorometoxifenil)-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

66

El producto de la secuencia anterior se sintetizó siguiendo el mismo procedimiento experimental que se usó para preparar un producto intermedio relacionado, en donde se reemplazó el grupo 4-bromo-fenilo por un grupo 2-furilo. Este compuesto de bromuro de arilo se usó en forma de un producto intermedio de síntesis, el cual se transformó usando algunas de las reacciones representativas siguientes:

67

Una mezcla de 42 mg (0,1 mmol) del éster metílico del ácido 5-(4-bromo-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico, 21 mg (0,15 mmol) del ácido 3,5-dimetil-isoxazolborónico, 7,3 mg (0,01 mmol) de catalizador de paladio y 63 mg (0,3 mmol) de fosfato de potasio en 1 mL de 1,4-dioxano, se agitó a 95ºC sobre un baño de arena durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó luego con diclorometano, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar el éster metílico del ácido 6-ciclohexil-5-[4-(3,5-dimetil-isoxazol-4-il)-fenil]-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado en forma de un sólido, según se indica por LC-MS - calculado para C_{25}H_{26}N_{4}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 447,19, encontrado: 447,3. Este material se convirtió luego en ácido 6-ciclohexil-5-[4-(3,5-dimetil-isoxazol-4-il)-fenil]-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (591) por el protocolo bien conocido de saponificación por LiOH (37% de rendimiento en dos etapas); LC-MS - calculado para C_{24}H_{24}N_{4}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 433,18, encontrado: 433,1.

De acuerdo con una modificación de un procedimiento de la bibliografía (Suzuki, A. et al Tetrahedron Lett. 1986, 27, 6369-6372), una mezcla de 43 mg (0,1 mmol) del éster metílico del ácido 5-(4-bromo-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico, 7,3 mg (0,01 mmol) de catalizador de paladio, 0,4 mL (0,2 mmol) de solución 0,5M de B-bencil-9-BBN en THF y 63 mg (0,3 mmol) de fosfato de potasio, se purgó con argón, se añadió 1 mL de 1,4-dioxano, y la mezcla resultante se agitó a 80ºC en un baño de arena durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó luego con diclorometano, se filtró a través de una pequeña almohadilla de Celite, se secó sobre sulfato de sodio y se evaporó para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar el éster metílico del ácido 5-(4-bencil-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado en forma de un sólido, según se indica por LC-MS - calculado para C_{27}H_{27}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 442,21, encontrado: 442,2. Este material se convirtió luego en ácido 5-(4-bencil-fenil)-6-ciclohexil-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (581) por una saponificación por LiOH (33% de rendimiento en dos etapa s); LC-MS - calculado para C_{26}H_{25}N_{3}O_{3} [M^{+}+H]^{+}: 428,19, encontrado: 428,2.

Ejemplo 40 Síntesis del ácido 6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico y del ácido 6-ciclohexil-5-(3-fluoro-fenil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico

68

A una suspensión enfriada con hielo de 0,92 g (23 mmol) de hidruro de sodio (dispersión al 60% de NaH en aceite mineral) (lavada previamente con hexano y secada bajo vacío) en 25 mL de 1,2-dimetoxietano (DME), se añadieron 0,9 g (5,76 mmol) de ciclohexilacetato de metilo, y la mezcla resultante se agitó a 0ºC durante 20 minutos. Luego, se añadieron 1,2 g (8,56 mmol) de 2-furoato de etilo, y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche. La mezcla se enfrió luego a 0ºC, la reacción se detuvo añadiendo solución de HCl 1M a pH 3, y se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos reunidos se lavaron con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, para dar un aceite pardo el cual se cromatografió sobre gel de sílice (Biotage; hexano al 10% en diclorometano), para dar 1,1 g (76% de rendimiento) del éster metílico del ácido 2-ciclohexil-3-furan-2-il-3-oxo-propiónico deseado, según se indica por ^{1}H NMR.

Una mezcla de 1,1 g (4,4 mmol) del éster metílico del ácido 2-ciclohexil-3-furan-2-il-3-oxo-propiónico, 0,592 g (4,2 mmol) del éster metílico del ácido 5-amino-1H-pirazol-3-carboxílico, 76 mg (0,4 mmol, 10% en moles) de monohidrato del ácido p-toluensulfónico (PTSA) y 50 mL de clorobenceno, se calentó a 120ºC durante la noche. La mezcla de reacción se concentró luego hasta obtener un residuo, el cual se cromatografió sobre gel de sílice (metanol al 7% en diclorometano), para dar 0,46 g (32% de rendimiento) del éster metílico del ácido 6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico deseado, según se indica por ^{1}H NMR; LC-MS - calculado para C_{18}H_{19}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 342,14, encontrado: 342,3.

La conversión del éster metílico del ácido 6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en ácido 6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (595), se logró por el protocolo bien conocido de saponificación por LiOH, en donde el rendimiento fue 77%. LC-MS - calculado para C_{17}H_{17}N_{3}O_{4} [M^{+}+H]^{+}: 328,13, encontrado: 328,1. ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 8,06-8,05 (d, J = 2 Hz, 1H), 6,99-6,98 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 6,80-6,78 (d de d, J = 3,6 Hz, J = 2 Hz, 1H), 6,39 (s, 1H), 2,79-2,71 (m, 1H), 2,25-2,16 (m, 2H), 1,77-1,75 (m, 2H), 1,66-1,65 (m, 1H), 1,59-1,55 (m, 2H), 1,25-1,20 (m, 3H).

Nótese que el mismo esquema de síntesis se llevó a cabo para el éster metílico del ácido 3-fluoro-benzoico descrito anteriormente, para producir ácido 6-ciclohexil-5-(3-fluoro-fenil)-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico (598); el rendimiento de la ciclización mejoró ligeramente (54%).

Ejemplo 41 Síntesis del ácido 2-[(6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil)-amino]-3- (1H-indol-2-il)-propiónico

69

A una solución de 8,2 mg (0,025 mmol) del ácido 6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 2 mL de dimetilformamida (DMF), se añadieron 0,009 mL (0,05 mmol) de diisopropiletilamina (DIEA), unos cuantos cristales de dimetilaminopiridina (DMAP, catalizador), 7 mg (0,027 mmol) de hidrocloruro del éster metílico de L-triptófano, seguido por 11 mg (0,03 mmol) de HATU, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se lavó con solución de hidróxido de sodio 0,1N (2 veces) y salmuera. La capa orgánica separada se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar el éster metílico del ácido 2-[(6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil)-amino]-3-(1H-indol-2-il)-propiónico deseado (606). Este compuesto se convirtió luego en ácido 2-[(6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil)-amino]-3-(1H-indol-2-il)-propiónico (599), por el protocolo bien conocido de saponificación por LiOH (39% de rendimiento en dos etapas); LC-MS calculado para C_{28}H_{27}N_{5}O_{5} [M^{+}+H]^{+}: 514,2; encontrado: 514,2.

Nótese que este protocolo se usó para la mayoría de las amidas en esta serie; sin embargo, por conveniencia, en algunos casos, se usó un protocolo de amidación diferente de la manera siguiente: A una solución del ácido en tetrahidrofurano (THF), se añadieron 4 equivalentes de amina (R-NH_{2}), seguido por 2 equivalentes de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y 4 equivalentes de resina de carbodiimida-PS, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se trató luego con 4 equivalentes de resina de carbonato-MP y 4,8 equivalentes de resina de TsOH-PS, y la agitación se continuó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla se filtró luego y se lavó con THF, y los extractos de THF reunidos se concentraron para dar el producto de acoplamiento en bruto.

En la segundo etapa (desprotección), se usó una saponificación típica por LiOH acuoso para aquellos elementos estructurales de amina que contienen ésteres metílicos o etílicos, y para aquellos elementos estructurales de amina que contienen ésteres o éteres t-butílicos; se llevó a cabo un protocolo típico de desprotección con TFA:agua 95:5.

Ejemplo 42 Síntesis de N-(6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil)-C-fenil-metanosulfonamida

70

A una solución de 20 mg (0,06 mmol) del ácido 6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carboxílico en 2 mL de diclorometano (DCM), se añadieron unos cuantos cristales de DMAP (catalizador), 12 mg (0,071 mmol) de toluensulfonamida, seguido por 0,071 mL (0,071 mmol) de solución de diciclohexilcarbodiimida (DCC) 1 M en DCM. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, se concentró, y el residuo resultante se purificó por cromatografía en fase inversa (Gilson), para dar (después de liofilización) 5 mg (17% de rendimiento) de la N-(6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil)-C-fenil-metanosulfonamida deseada (616) en forma de un sólido, según se indica por LC-MS calculado para C_{24}H_{24}N_{4}O_{5}S
[M^{+}+H]^{+}: 481,15; encontrado: 481,1.

Nótese que usando este protocolo también se sintetizó la N-(6-ciclohexil-5-furan-2-il-7-oxo-4,7-dihidro-pirazolo[1,5-a]pirimidin-2-carbonil)-C,C,C-trifluoro-metansulfonamida (617).

Ejemplo 43 Valoración de la actividad de RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV Consideraciones generales

Se valoró RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) del HCV, por el ensayo de proximidad por centelleo (abreviadamente en lo sucesivo SPA por la expresión inglesa Scitillation Proximity Assay), usando un homopolímero de RNA (poliC) complejado con un cebador oligoG_{12} biotinilado. El cebador puede añadirse directamente al molde sin un procedimiento de desnaturalización y asociación. La valoración mide específicamente la incorporación de GTP marcado con [^{3}H] en poliG. El G_{12} biotinilado permite la captura de los productos marcados con [^{3}H] por perlas para SPA revestidas con estreptavidina.

La RdRp de la enzima NS5B del HCV usada en esta valoración, se modificó por la eliminación de una porción de 55 aminoácidos del extremo carboxilo, que contiene un dominio hidrófobo de 21 aminoácidos. La proteína RdRp de la enzima NS5B del HCV se purificó como una proteína de fusión de polihistidina (His_{6}) expresada en E. coli, y la cola de His se eliminó luego por proteólisis específica.

La valoración se llevó a cabo a temperatura ambiente (\sim22ºC) en una placa de 96 pocillos durante 50 minutos. No se requirió preincubación. La reacción se inició añadiendo la enzima al sustrato de RNA en presencia o ausencia de los compuestos de ensayo. Para detener la reacción, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de 10 mg/mL de perlas de SPA revestidas con estreptavidina complementadas con EDTA 100 mM, y la placa se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la recogida y un lavado por filtración, se recontó la radiactividad en cada pocillo usando un contador de luminiscencia/centelleo TopCount.

Las condiciones de la valoración son: 50 \mul de volumen de reacción incubados a temperatura ambiente durante 50 minutos en Hepes 20 mM, pH 7,3, DTT 7,5 mM, 20 unidades/mL de RNasina, 0,5 \mug/mL de oligo (G)_{12}, 5 \mug/mL de poli (C), GTP 0,5 \muM, 1 \muCi/mL de ^{3}H-GTP, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 60 mM, 100 \mug/mL de BSA, enzima NS5B CT55 6 nM.

Materiales Tampón

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Molde de RNA

Se preparó una solución de reserva de 5 mg/mL en Hepes 20 mM, pH 7,3. Se añadió tampón (4 mL) a 5 mg del ácido policitidílico [Sigma, Nº P4903], y la solución se verificó para absorbancia a DO_{260}, y se cuantificó usando la conversión: DO_{260} de 1 = 40 \mug/mL. La solución se corrigió luego a 5 mg/mL en tampón, se distribuyó en partes alícuotas, y se conservó a -80ºC.

Cebador de RNA

Se preparó una solución de reserva de 0,5 mg/mL del cebador en Hepes 20 mM, pH 7,3. La solución se verificó para absorbancia a DO_{260}, y se cuantificó usando la conversión: DO_{260} de 1 = 32 \mug/mL, y luego se distribuyó en partes alícuotas y se conservó a -80ºC.

Sustrato de GTP

Se preparó una solución de reserva (2 mM) en Hepes 20 mM, pH 7,3, y luego se distribuyó en partes alícuotas y se conservó a -80ºC.

RdRp de NS5B\DeltaCT55

Se purificó la enzima NS5B\DeltaCT55 del HCV (de la cepa 1b BK) como una proteína de fusión de polihistidina (His_{6}) expresada en E. coli. Se modificó la proteína eliminándole una porción de 55 aminoácidos del extremo carboxilo que contenía un dominio hidrófobo de 21 aminoácidos, y se fusionó una cola de His_{6} a la proteína en el extremo carboxilo. Después de la purificación, la cola de His se eliminó por proteólisis específica. El peso molecular de la proteína es 60323. Para un material de reserva útil, la enzima se diluyó 1:10, desde 53 \muM hasta 5,4 \muM, luego se distribuyó en partes alícuotas, y se conservó a -80ºC. Se requirieron 6 nM de la enzima para cada reacción.

Tampón de conservación de la enzima

Hepes 25 mM (pH 7,5), DTT 5 mM, NaCl 0,6 M, glicerol al 15%, octilglucósido al 0,1%, 2 mg/L de leupeptina, PMSF 100 \muM.

El tampón se conservó a -20ºC.

Inhibidor de control de acetato de zinc

Se obtuvieron 50X soluciones de reserva de acetato de zinc a una concentración de 16, 8, 4 y 2 mM en DMSO al 100%. Las soluciones de reserva se conservaron a 4ºC.

Tampón de lavado de la placa de filtro

200 mL de tampón de 20X SSC y 80 mL de Hepes 1 M, pH 7,3, se llevaron a 4 litros en agua milli-Q^{R}. La solución se conservó a temperatura ambiente.

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Instrumentos y suministros

Lector de microplaca TopCount NXT: [Packard, A991200]

Recolector 96 Mach 3U: [TomTec, 96-3]

Placa de cultivo de tejidos de fondo en U Microtest: [Falcon, 353077]

Microplaca blanca Unifilter-96, GF/B: [Packard, 6005177]

Microplaca de polipropileno Nunc: [Nunc, 442587]

Película de sellado de microplaca de 96 pocillos TopSeal-A:96: [Packard, 6005185]

Agitador mini orbital: [Bellco, 7744-08096]

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Compuestos químicos

Homopolímero de RNA/poli(C): [Sigma, #P4903]

Biotina-oligo(G)_{12}: [Oligo, Etc., EO-1/22/98]

GTP no marcado: [Novagen, 69176-1]

GTP marcado con [^{3}H]: [Amersham, TRK314]

Hepes 1M (pH 7,3): [USB, 16924]

EDTA 0,5M (pH 8,0): [GibcoBRL, 15575-012]

DTT [ditiotreitol]: [GibcoBRL, 15508-013]

MgCl_{2}: [Sigma, M1028]

BSA (Fracción V): [Boehringer Mannheim, 100350]

Ribonucleasa IN: [Promega, N2515]

Leupeptina: [Sigma, L9783]

n-Octilglucósido: [Boehringer Mannheim, 1359088]

PMSF: [Sigma, 7626]

NaCl 5M: [GibcoBRL, 24740-011]

Glicerol: [GibcoBRL, 15514-011]

Perlas de SPA revestidas de estreptavidina: [Amersham, RPNQ0007]

PBS (Mg^{++} y Ca^{++}, susp. agua en aceite): [GibcoBRL, 14190-144]

DMSO: [Sigma, D5879]

ZnOAc: [Sigma, Z0625]

Agua libre de ribonucleasa: [USB, US70783]

Tampón 20X SSC: [GibcoBRL, 15557-044]

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Métodos de valoración Dilución de los compuestos de ensayo

Se prepararon soluciones de reserva a una concentración de 1 mg/mL en DMSO al 100%. Los compuestos se diluyeron en serie en una microplaca de polipropileno de 96 pocillos [Nunc] usando un pipeteador de canales múltiples, de la manera siguiente:

(1) A las filas B, E y H, se añadieron 15 \mul de DMSO; a las filas C, D, F y G se añadieron 20 \mul de DMSO. Se añadieron 12 compuestos sin diluir a través de la fila A, y luego 5 \mul de cada compuesto se transfirieron de la fila A a la fila B, triturando 10 a 12 veces hasta mezclar. Luego se transfirieron otros 5 \mul de la fila B a la fila C, y así sucesivamente hasta la fila H, produciendo 7 diluciones en serie del material de reserva.

(2) Se transfirió 1 \mul de cada dilución (50x) a placas de valoración como se describe más adelante, produciendo concentraciones finales de 20, 5, 1, 0,2, 0,05, 0,01, 0,002 y 0,0005 \mug/mL.

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Puesta a punto de la valoración: 1 placa Mezcla de enzima/RNA (700 \mul en total, 5 \mul/reacción)

660 \mul de tampón 1X

7 \mul 5 mg/mL de molde de poliC

7 \mul 0,5 mg/mL de iniciador oligoG_{12}

3,5 \mul 40 U/\mul de RNasina

10 \mul DTT 1M

8 \mul de enzima 5,3 \muM (10X para 6 nM final)

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Mezcla de nucleótidos (2 mL en total, 20 \mul/reacción)

2,0 mL de tampón 1X

30 \mul de DTT 1M

5 \mul de 1 mCi/mL de [3H]-GTP

1,3 \mul de GTP frío 2 mM

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Mezcla de reacción

24 \mul de tampón 1X

20 \mul de mezcla de nucleótidos

1 \mul de compuesto

5 \mul de enzima

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Protocolo

(1) Se colocaron 24 \mul de tampón 1X en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (placa de cultivo de tejidos de fondo en U Microtest, de Falcon).

(2) En orden de adición, se mezclaron tampón 1X, DTT, GTP sin marcar y ^{3}H-GTP. Se añadieron a cada pocillo 20 \mul de esta mezcla de nucleótidos en tampón 1X.

(3) Se añadió por triplicado a cada pocillo 1 \mul de cada dilución del compuesto de ensayo, salvo para los pocillos de control de enzima/RNA y RNA solo. Los pocillos de control recibieron 1 \mul de DMSO al 100%.

(4) Se añadió a los pocillos por duplicado 1 \mul de cada solución de reserva de inhibidor de control de acetato de zinc. Las soluciones de reserva usadas de acetato de zinc 50X, fueron 16, 8, 4 y 2 mM para concentraciones finales de 320, 160, 80 y 40 \muM.

(5) En orden de adición, se mezclaron tampón 1X, DTT, RNasina, biotina-oligo(G)_{12} y poliC, y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. La enzima se añadió, se mezcló, y se añadieron a cada pocillo 5 \mul de la mezcla de enzima/RNA/tampón, salvo para los pocillos de control de RNA solo. Se añadieron 5 \mul de la mezcla de RNA/tampón 1X a los pocillos de control de RNA solo.

(6) La placa se agitó durante 1 minuto en un agitador mini-orbital (Bellco), para mezclar completamente los componentes de reacción. La placa se incubó a temperatura ambiente (\sim22ºC) durante 50 minutos.

(7) La reacción se detuvo añadiendo a cada pocillo 50 \mul de perlas de SPA revestidas de estreptavidina (10 mg/mL en PBS, Mg^{++} y Ca^{++} suspensión agua en aceite, complementados con EDTA 100 mM). Luego la placa se agitó de nuevo durante 15 minutos a temperatura ambiente como en (5), para mezclar las perlas.

(8) La placa se recogió luego y se lavó con tampón de lavado de la placa de filtro, por transferencia a una placa de filtro (microplaca blanca Unifilter-96 GF/B de Packard) usando un recolector (Tomtec). La placa se dejó secar durante 30 minutos a 37ºC. Después del secado, se aplicó cinta de refuerzo adhesiva (suministrada por el fabricante) al fondo de la placa Unifilter. La parte superior se cubrió con película de sellado de microplaca TopSeal.

(9) Se hizo el recuento de la radiactividad en cada pocillo, usando un contador de luminiscencia/centelleo TopCount.

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Ejemplo 44 Valoración de alto rendimiento para RNA polimerasa dependiente de RNA del HCV NS5B

La valoración de proximidad por centelleo (SPA) para la RdRp de NS5B del HCV desarrollada por los inventores, usa un homopolímero de RNA (poliC) combinado con un cebador oligoG12 biotinilado. El cebador puede añadirse directamente al molde sin un procedimiento de desnaturalización y asociación. La valoración mide específicamente la incorporación de GMP marcado con [^{3}H] en poliG. El G12 biotinilado permite la captura de los productos marcados con [^{3}H] por perlas de SPA revestidas con estreptavidina.

Las enzimas de NS5B, NS5BCT21-His y NS5BCT55, usadas en esta valoración, se purificaron como proteínas de fusión de polihistidina (His6) expresadas en E. coli. La proteína NS5BCT21-His ha sido modificada eliminándole un dominio hidrófobo de 21 aminoácidos del extremo carboxilo. Se fusionó una cola de His6 a la proteína en el extremo carboxilo, reemplazando el dominio hidrófobo eliminado. La proteína NS5BCT55 ha sido modificada eliminándole un resto de 55 aminoácidos del extremo carboxilo que contiene el dominio hidrófobo de 21 aminoácidos, y una cola de His6 se fusionó a la proteína en el extremo amino. Después de la purificación, la cola de His se eliminó por proteólisis específica.

El sustrato de esta valoración es un molde de homopolímero de RNA (poliC) combinado con un cebador (oligoG12) biotinilado. Se polimerizan las [^{3}H]-GTP en poliG, complementando el molde de poliC.

La valoración se lleva a cabo a temperatura ambiente (\sim22ºC) en una placa de 96 pocillos durante tres horas. No se requiere preincubación. La reacción se inicia mezclando el sustrato de RNA y la enzima en presencia o ausencia de compuestos de ensayo. Se añade EDTA a una concentración final de 50 mM para detener la reacción. Luego se añaden a cada pocillo perlas de SPA revestidas con estreptavidina (0,5 mg). Después de la recogida y un lavado por filtración, se hace el recuento de la radiactividad en cada pocillo usando un contador de luminiscencia/centelleo
TopCount.

Las condiciones de la valoración fueron: 50 \mul de volumen de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas en Hepes 20 mM (pH 7,3), DTT 7,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 121 mM, 100 \mug/ml de BSA, DMSO al 2%, glicerol al 0,05%, GTP 5 \muM, 1,0 \muCi de [^{3}H]-GTP, 0,25 \mug de poli(C)/0,025 \mug de oligo(G)12, una unidad de ribonucleasa IN y NS5BDCT21-His o NS5BDCT55 0,05 \muM.

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Materiales

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73

Tampón de conservación de la enzima NS5BCT21-His

Hepes 50 mM (pH 7,3), DTT 5 mM, NaCl 0,5 M, glicerol al 20%, 200 ng/ml de antipaína, 100 ng/ml de leupeptina, PMSF 50 \muM.

Conservar el tampón a -20ºC.

Tampón de conservación de la enzima NS5BCT55

Hepes 25 mM (pH 7,5), \beta-mercaptoetanol 10 mM, NaCl 0,6 M, glicerol al 15%, octilglucósido al 0,1%, 2 mg/L de leupeptina, PMSF 100 \muM.

Conservar el tampón a -20ºC.

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Métodos de valoración

(1) Se colocan 9 \mul de agua libre de RNsa en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (placa de cultivo de tejidos de fondo en U Microtest, de Falcon).

(2) En orden de adición, se mezclan agua libre de RNsa, tampón de reacción 5X (con BSA), DTT, GTP frío y ^{3}H-GTP. Se añaden a cada pocillo 20 \mul de esta mezcla de nucleótidos en tampón de reacción 1,25X.

(3) En orden de adición, se mezclan agua libre de RNsa, tampón de enzimas 5X (con NaCl), DTT, RNsa IN, oligo(G)_{12} y poliC, y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añade la enzima, se mezclan, y se añaden a cada pocillo 20 \mul de la mezcla de enzima/RNA en tampón de enzimas 1,25X, salvo para los pocillos de control de RNA solo. Se añaden 20 \mul de la mezcla de tampón de conservación de enzima/RNA en tampón 1,25 de enzimas a los pocillos de control de RNA solo.

(4) Se añade a cada pocillo 1 \mul de cada compuesto de ensayo [DMSO al 100%, 100 \mug/ml], salvo para los pocillos de control de RNA solo y enzima/RNA. Los pocillos de control reciben 1 \mul de DMSO al 100%.

(5) La placa se agita suavemente durante 1 minuto en un agitador mini-orbital (Bellco), para mezclar completamente los componentes de reacción, y se incuban luego a temperatura ambiente durante 3 horas.

(6) La reacción se detiene añadiendo 50 \mul de perlas de SPA revestidas con estreptavidina (0,5 mg, resuspendidas en PBS, Mg^{++} y Ca^{++} agua en aceite, complementados con EDTA 100 mM a cada pocillo). La placa se agita de nuevo como se indicó anteriormente para mezclar las perlas, y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.

(7) La placa se recoge, luego se lava y se transfiere a una placa de filtro usando un recolector (Tomtec). Se hace el recuento de la radiactividad en cada pocillo, usando un contador de luminiscencia/centelleo TopCount.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Inhibición de la actividad de la RdRp del HCV^{1}

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Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle para propósitos de claridad y entendimiento, estas realizaciones particulares deberán considerarse como ilustrativas y no como restrictivas. Los expertos en la técnica apreciarán que después de leer esta descripción, pueden hacerse varios cambios en forma y detalle sin apartarse del alcance real de la invención y las reivindicaciones anexas.

Claims

1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

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y

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o uno de sus esteroisómeros o una de sus sales farmacéuticamente aceptables de dicho compuesto.

2. Una composición farmacéutica que comprende por lo menos un compuesto de la reivindicación 1, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. Uso de por lo menos un compuesto de la reivindicación 1 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la fabricación de un medicamento para inhibir la replicación del virus de la hepatitis C ("HCV") en una célula.

4.Uso de por lo menos un compuesto de la reivindicación 1 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir la infección por el HCV.

5. Un método in vitro para inhibir la replicación del HCV en una célula, que comprende poner en contacto una célula que está infectada con el HCV con por lo menos un compuesto de la reivindicación 1 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.