ES2304814A1 - Metodo para el ensayo de la expresion del genoma de una muestra biologica y kit para su realizacion. - Google Patents
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Abstract
Método para el ensayo de la expresión del genoma de una muestra biológica y kit para su realización. El objeto de la presente invención consiste en un método y un conjunto de útiles para el ensayo de la distribución intragénica de las RNA polimerasas que se encuentran transcribiendo el genoma de manera efectiva. El método aplica técnicas de localización genómica de las RNA polimerasas, basadas en procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos, y las extiende a escala multigénica mediante el diseño de matrices de ácidos nucleicos (DNA arrays) donde cada gen está representado al menos por una sonda de la zona inicial (5¿) de la unidad transcripcional y por otra situada en la zona final (3¿). La relación de intensidades de hibridación entre la sonda 5¿ y la 3¿ proporciona un parámetro indicativo de la distribución intragénica de polimerasas, que puede ser detectado simultáneamente en todos los genes representados en la matriz. Los campos de aplicación de la presente invención son aquéllos que se relacionan con la caracterización funcional de muestras biológicas y la producción de bienes útiles para dicha caracterización. Son campos generales de aplicación las siguientes áreas: biología, bioquímica, genética, medicina, farmacia, veterinaria, ingeniería agronómica, entre otros.
Description
Método para el ensayo de la expresión del genoma
de una muestra biológica y kit para su realización.
El objeto de la presente invención consiste en
un método y un conjunto de útiles para el ensayo de la distribución
intragénica de las RNA polimerasas que se encuentran transcribiendo
el genoma de manera efectiva. El método aplica técnicas de
localización genómica de las RNA polimerasas, basadas en
procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos, y las extiende a
escala multigénica mediante el diseño de matrices de ácidos
nucleicos (DNA arrays) donde cada gen está representado al menos
por una sonda de la zona inicial (5') de la unidad transcripcional
y por otra situada en la zona final (3'). La relación de
intensidades de hibridación entre la sonda 5' y la 3' proporciona un
parámetro indicativo de la distribución intragénica de polimerasas,
que puede ser detectado simultáneamente en todos los genes
representados en la matriz.
La localización de las RNA polimerasas que se
encuentran transcribiendo en la fase de elongación puede realizarse
mediante run-on nuclear, es decir, mediante el
marcaje in situ del RNA transcrito por polimerasas ya
situadas en la fase de elongación transcripcional, tanto en células
permeabilizadas como en núcleos aislados. Alternativamente, la
localización de las polimerasas puede conseguirse mediante técnicas
de precipitación selectiva de los fragmentos de DNA en los que se
encuentran localizadas las RNA polimerasas que se encuentran
transcribiendo de manera efectiva.
Mediante la presente invención es posible
obtener una medida simultánea de la distribución intragénica de las
RNA polimerasas que se encuentren transcribiendo los genes
representados en la matriz.
Los campos de aplicación de la presente
invención son aquellos que se relacionan con la caracterización
funcional de muestras biológicas y la producción de bienes útiles
para dicha caracterización. Son campos generales de aplicación las
siguientes áreas: Biología, Bioquímica, Genética, Medicina,
Farmacia, Veterinaria, Ingeniería agronómica, y de forma más
específica campos como:
Diagnóstico molecular
Detección y cuantificación de la expresión
génica
Farmacogenómica
Diseño de drogas
Mejora genética
La presente invención sería asimismo de
aplicación en todos aquellos campos donde sea de utilidad el
conocimiento de la distribución intragénica de las RNA polimerasas
en un genoma.
La actividad transcripcional de un gen puede ser
estudiada de diversas formas. La más extendida de todas es la
cuantificación de los niveles estacionarios de RNA mensajero
mediante procedimientos de northern blot, hibridación in
situ, protección frente a nucleasas y otros basados en técnicas
de hibridación entre los RNA presentes en la muestra y una sonda
específica. Si bien estos procedimientos son una buena aproximación
para la medida de la expresión génica, no reflejan directamente la
actividad transcripcional, ya que el nivel de RNA mensajero medido
no sólo es función de la actividad transcripcional sino también del
procesamiento del RNA y de su estabilidad.
La actividad transcripcional de un gen es
también estudiada con frecuencia mediante la construcción de
unidades transcripcionales quiméricas que fusionan las regiones
promotoras y reguladoras de la transcripción del gen estudiado con
la región codificante de un gen indicador que expresa una proteína
fácilmente cuantificable. Este procedimiento permite comparar la
actividad transcripcional de distintos genes en el nivel de su
iniciación, siempre que se mantengan secuencias comunes para el
procesamiento de los ARN mensajeros y para su traducción, pero
excluye la influencia que la región transcrita del gen estudiado
ejerce sobre la actividad transcripcional en sus etapas de
elongación y terminación. Este procedimiento es asimismo
difícilmente aplicable a escala genómica.
Una alternativa eficiente para medir
directamente la actividad transcripcional es el procedimiento de
run-on nuclear, que permite medir la densidad de RNA
polimerasas que se encuentran transcribiendo el gen en un momento
concreto (Figura 1).
Este procedimiento se basa en la capacidad que
conservan las RNA polimerasas que se encuentran transcribiendo para
continuar la transcripción de dicho gen en condiciones en las que
se destruye la integridad celular por permeabilización o aislamiento
de núcleos. Una vez que una RNA polimerasa supera la fase de
iniciación de la transcripción en la región promotora de un gen y ha
entrado en una fase de elongación competente, conserva su capacidad
de transcribir aun en condiciones donde nuevas polimerasas son
incapaces de iniciar la transcripción. La permeabilización de una
célula o el aislamiento de su núcleo implica una parada de las RNA
polimerasas que se encuentran trascribiendo debido a la ausencia de
nucleótidos-trifosfato (NTPs). La presencia de
detergentes suaves como el sarcosil
(N-laurilsarcosina sódica), que puede emplearse a su
vez como agente permeabilizante, impide la formación de complejos
de inicio de la transcripción. Si en esas condiciones se suministra
una concentración adecuada de NTPs las RNA polimerasas continúan
elongando en el punto donde estaban detenidas. La presencia de
sarcosil, en concentraciones tan altas como 0,6%, no inhibe la
elongación de la transcripción. Los procedimientos de
run-on nuclear, descritos originalmente en 1974
(véase Gariglio, Buss and Green, FEBS Lett 44, p.
330-333) aprovechan esa circunstancia para marcar el
RNA transcrito incorporando UTP marcado radiactivamente,
normalmente con ^{32}P o ^{33}P en posición \alpha. El RNA
así marcado es un indicador directo del número de polimerasas que
se encontraban transcribiendo ese gen en una población de células y
de la posición donde esas RNA polimerasas se localizaban en el
momento de la permeabilización o el aislamiento nuclear. Para
cuantificar la cantidad de RNA marcado correspondiente a un
determinado gen debe recurrirse a procedimientos de hibridación con
sondas frías inmovilizadas en un soporte sólido. Si se usan varias
sondas para cada gen, correspondientes a diferentes regiones del
mismo, y se somete al RNA marcado a un álcali en condiciones
controladas para lograr su fraccionamiento parcial, se consigue
identificar la distribución de las RNA polimerasas que se
encontraban transcribiendo el gen en el momento de la
permeabilización o el aislamiento nuclear. Para una descripción
detallada de los procedimientos de run-on nuclear
véase Hirayoshi and Lis, Methods in Enzymology, 304, p.
351-362 (1999).
Un procedimiento alternativo al
run-on nuclear para medir el número de polimerasas
que se encuentran transcribiendo un gen y su distribución a lo largo
de la unidad transcripcional consiste en la inmunoprecipitación de
cromatina utilizando anticuerpos que reconocen alguna de las
subunidades de la RNA polimerasa (Figura 2). La radiación
ultravioleta o agentes entrecruzadores como el formaldehido pueden
lograr la formación de enlaces covalentes entre la RNA polimerasa y
el DNA que se encuentran transcribiendo. La posterior precipitación
selectiva de estos complejos RNA polimerasa- DNA permite localizar
las regiones donde se encontraban unidas las polimerasas y
cuantificar la densidad de estas en genes determinados. Para mejor
comprender los procedimientos de inmunorprecipitación de cromatina
véase por ejemplo Orlando y Paro, Cell, 75, p.
1187-1198 (1993). La inmunoprecipitación de
complejos RNA polimerasa-DNA no requiere la
permeabilización de células o el aislamiento de núcleos con carácter
previo al entrecruzamiento y permite por tanto reflejar la
distribución de RNA polimerasas sin las interferencias que estos
procedimientos de rotura de la integridad celular puedan causar.
Sin embargo, la utilización de esta técnica para la cuantificación
de las RNA polimerasas que se encuentran transcribiendo una región
del genoma adolece de que no discrimina entre aquellas RNA
polimerasas que se encuentran transcribiendo efectivamente, en fase
de elongación productiva, de aquellas otras que están iniciando la
transcripción o se encuentran bloqueadas y no son por tanto
competentes para la transcripción. En este sentido la técnica de
run-on nuclear es mucho más precisa.
La visión más simple y predominante de la fase
de elongación transcripcional asume que una vez que una RNA
polimerasa inicia la transcripción y adquiere competencia para
elongar, su tasa de elongación es constante. Numerosas
publicaciones sin embargo han puesto de manifiesto que esta no es la
situación general y que la distribución de RNA polimerasas en un
gen dado no es homogénea. Es conocido que al menos un cierto número
de genes presentan de forma constante RNA polimerasas competentes
para elongar en la región del gen adyacente al sitio de inicio de
la transcripción, incluso en condiciones en las que operan
mecanismos que impiden la completa transcripción del gen. Véase por
ejemplo Bentley and Groudine, Nature 321, p. 702-706
(1986) y Rougvie and Lis, Cell 54, p. 795-804
(1988). De forma aún más general, aquellos genes que están siendo
expresados de manera efectiva, mantienen una mayor densidad de RNA
polimerasas en fase de elongación en su región adyacente al inicio
de la transcripción como consecuencia de mecanismos de control de
la calidad del transcrito que operan en ese nivel. Véase a este
respecto Morillon et al, Science 300, p.
492-495 (2003). En consecuencia, la distribución
intragénica de RNA polimerasas es algo que puede diferenciar unas
unidades transcripcionales de otras (Figura 3). El cociente entre
las RNA polimerasas situadas en la región inmediatamente anterior
al término de la transcripción (región 3') y las situadas en la
región adyacente al inicio de la transcripción (región 5') es un
parámetro que permite estimar la distribución intragénica de RNA
polimerasas. Un bajo cociente 3'/5' indica una acumulación de RNA
polimerasas en la región 5', lo que puede ser consecuencia de
mecanismos de represión de la expresión génica que operan en ese
nivel o de fenómenos de interferencia con la elongación
transcripcional y/o de los procesos asociados a ésta. Una
diferencia del cociente 3'/5' de un determinado gen entre, por
ejemplo, dos condiciones fisiológicas o dos tejidos pone de
manifiesto una relación directa o indirecta entre la distribución de
RNA polimerasas en dicho gen y la variable que diferencia a ambas
muestras.
El ensayo de la expresión de un gen aislado
proporciona información valiosa sobre dicho gen pero no suministra
una información generalizada sobre la expresión del genoma, ya que
la expresión de cada gen responde a mecanismos muy específicos que
integran las señales regulatorias que lo controlan. La
disponibilidad de matrices (arrays) de sondas específicas para el
conjunto de los genes que conforman el genoma, o al menos para un
amplio subconjunto de los mismos, permite el análisis simultáneo de
la expresión de todos los genes representados en la matriz.
Las matrices de genes
(gene-arrays) han sido utilizadas para investigar
diversos estadios de la expresión génica. La versión más clásica de
los métodos de análisis de la expresión génica basados en matrices
de genes utilizan procedimientos de marcaje de los RNA mensajeros y
su posterior hibridación con la matriz, siguiendo métodos análogos
a los de la hibridación northern. Buenos ejemplos de ello son las
patentes
US2003157529-WO03050312-EP1453973-AU2002346717
de Gingeras y otras afines registradas por Affymetrix Inc. Con este
método se consigue una medida de los niveles estacionarios de RNA
en la célula en el momento de la toma de la muestra, siempre en
términos relativos con los niveles presentes en otra muestra de
referencia.
Este tipo de procedimientos, cuando se aplica a
muestras procedentes de enfermos, permite realizar diagnósticos de
las patologías presentes en el paciente. Su utilización ha avanzado
de forma importante en el campo de la anatomía patológica. Sirva
como ejemplo el método de clasificación de gliomas descrito en las
patentes
AU2003225851-WO03078603-US2004053277
de Dougherty et al.
En algunas patentes registradas las matrices
están formadas por regiones del genoma que se corresponden con
elementos singulares de los genes representados en la matriz. Por
ejemplo en las patentes
WO0157251-AU200133114-GB2373500-EP1290217
de Hanzel et al. cada sonda presente en la matriz se
corresponde con un exón del genoma. De forma similar, en las
patentes
US6716579-WO0077257-AU200054766-EP1185701
de Baidya et al. las sondas son complementarias a las
regiones no traducidas de RNA mensajeros en posición 3'.
En todos los métodos anteriores los patrones de
expresión génica obtenidos reflejan los niveles de RNA mensajero
presentes en las células en el momento de obtención de la muestra.
Como se ha discutido supra, dichos niveles sólo reflejan
parcialmente la actividad transcripcional del genoma, al existir
fenómenos no transcripcionales, como la degradación de RNA, que
afectan a su abundancia. Las matrices de genes permiten sin embargo
la medida directa de las tasas transcripcionales siempre que se
utilicen procedimientos de marcaje de los RNAs durante la propia
transcripción de los genes por las RNA polimerasas, es decir, en
caso de que se acoplen procedimientos de run-on
nuclear y análisis genómico por matrices de genes. Este es el caso
de la patente US6617112 de Beals, cuyo método permite cuantificar
las tasas transcripcionales de los genes representados en el array,
así como, mediante comparación con los niveles estacionarios de RNA
mensajeros, calcular las vidas medias de los RNA transcritos a
partir de dichos genes. Un método similar es el descrito por
García-Martínez et al, Mol Cell 15, p.
303-313 (2004).
Con las salvedades antes descritas, la técnica
de run-on puede ser sustituida por la
inmunoprecipitación de cromatina mediante anticuerpos que
inmunoprecipitan RNA polimerasas. Si se combina esta técnica de
inmunoprecipitación con la hibridación del DNA precipitado frente a
sondas inmovilizadas en una matriz, puede conseguirse asimismo
obtener un patrón de la actividad transcripcional del genoma. Véase
e este respecto Sandoval et al. Nucleic Acids Res 32, e82
(2004). La generalidad de los procedimientos de medida de la
expresión génica sobre matrices de genes descritos anteriormente
implican la comparación de la muestra problema con una muestra de
referencia. Alternativamente, otros métodos reivindicados en
patentes se basan en la comparación de varias medidas realizadas
sobre una misma matriz. Sirvan como ejemplo Bao et al.
(US2001018183) que describe un método para la medida simultánea de
expresión génica y anormalidades genómicas, y Shi and Huang
(WO03087774) que presentan métodos para medir sobre una misma
matriz de islas CpG la expresión génica, la metilación del DNA y la
acetilación de histonas. En estos casos, el resultado se obtiene
tras hibridar con distintas poblaciones de ácidos nucleicos,
aportando cada una de ellas una información biológica
específica.
La presente invención ofrece un método para
obtener información precisa sobre el estado transcripcional del
genoma al permitir una medida de la distribución de RNA polimerasas
en cada uno de los genes representados en una matriz.
El método implica la obtención de una población
de ácidos nucleicos marcados a partir de la muestra que reflejan
directamente la distribución de RNA polimerasas a lo largo de cada
gen (RNA marcado in situ por run-on nuclear o
DNA inmunoprecipitado con anticuerpos anti-RNA
polimerasa) y su hibridación con una matriz de sondas de ácidos
nucleicos que se corresponden con las regiones de cada gen situadas
tras el inicio de la transcripción (región 5') y antes de la
terminación de la transcripción (región 3') (Figura 4). Los
cocientes de 3'/5' de las hibridaciones proporciona una medida de
distribución intragénica de las RNA polimerasas. La medida
simultánea de los cocientes 3'/5' de RNA polimerasas de todos los
genes representados en la matriz permite obtener una nueva visión
del estado de expresión del genoma, que complementa las
perspectivas existentes en genómica funcional.
A diferencia de los procedimientos de análisis
transcripcional descritos en el estado de la técnica, el cociente
3'/5' es un parámetro que se obtiene aisladamente para cada
muestra, sin necesidad de comparar con una muestra de referencia.
Las valores del cociente 3'/5' obtenidos para una muestra dada son a
su vez comparables con los obtenidos para otras muestras.
El cociente 3'/5' implica la comparación de dos
medidas (los valores de hibridación para las sondas 3' y 5' de cada
gen), pero ambas son obtenidas simultáneamente en una misma
hibridación. Adicionalmente es necesario un procedimiento de
hibridación con DNA genómico. Esta segunda hibridación sin embargo
no aporta información biológica sobre la muestra y sirve únicamente
para normalizar las cantidades de sonda presentes en la matriz. De
hecho, en caso de reutilización de la matriz para nuevas medidas de
muestras diferentes, es innecesario proceder a una nueva
hibridación con DNA genómico.
La matriz de ácidos nucleicos contiene una
pluralidad de elementos plurinucleotídicos que actúan como sonda
(entre 100 y 1000000 para permitir estimar suficientemente el
estado transcripcional del genoma) inmovilizados sobre un soporte
sólido y accesibles, que pueden ser oligonucleótidos de al menos 20
monómeros o fragmentos de polinucleótidos, mono o bicatenarios, de
mayor longitud. Los elementos plurinucleotídicos inmovilizados
pueden ser DNA, RNA o bien ácidos nucleicos peptídicos (PNA); estos
últimos permiten hibridaciones estables con sondas más cortas. En
todos los casos cada gen está representado en la matriz por al
menos un fragmento correspondiente a su región 5' y otro
correspondiente a su región 3'. En el caso de genes eucarióticos
divididos por intrones, esto puede corresponderse con regiones
situadas en el primer y último exón respectivamente.
El método de marcaje de las poblaciones de
ácidos nucleicos que se manipulan puede ser radiactivo. El uridín
trifosfato marcado con ^{32}P o ^{33}P en su fosfato alfa es la
posibilidad más sencilla de incorporar selectivamente un marcaje
radiactivo al RNA naciente en procedimientos de
run-on nuclear. Alternativamente el uridín
trifosfato puede ser marcado con un grupo fluorescente, con un grupo
químico como la digoxigenina, que sea reconocido como antígeno
mediante un método inmunológico o sea utilizado como sustrato por
una enzima; alternativamente el nucleótido puede estar modificado
con un grupo reactivo como el aminoalilo, que permita su marcaje
radiactivo o fluorescente in vitro tras su extracción.
El marcaje del DNA genómico, necesario para
normalizar las cantidades de sonda inmovilizadas en la matriz de
genes, puede ser marcado mediante análogos procedimientos
radiactivos, fluorescentes, inmunoquímicos o bioquímicos.
En caso de que se utilice el mismo tipo de
marcaje para las dos hibridaciones -tanto la de la población de
ácidos nucleicos indicadora de la actividad transcripcional como la
de DNA genómico para normalizar las cantidades de sonda- ambas
hibridaciones han de realizarse secuencialmente, procediendo a la
deshibridación de la primera población antes de realizar la segunda
hibridación. Por contra, si el método de marcaje utilizado para
cada población es diferente, ambas hibridaciones pueden realizarse
simultáneamente, permitiendo una mayor rapidez en la obtención de
los resultados finales.
El procedimiento de localización de las RNA
polimerasas mediante run-on nuclear implica la
accesibilidad a la cromatina por parte de los nucleótidos, marcados
y no marcados, empleados como sustratos en la reacción de
transcripción (Figura 1). En el caso de que se proceda a aislar
núcleos celulares o cromatina transcripcionalmente activa, la
accesibilidad de los nucleótidos está garantizada. Si por el
contrario se realiza el método con células enteras, es necesario
proceder a permeabilizar la membrana plasmática de las células para
permitir el acceso de los nucleótidos empleados como sustratos.
Este efecto permeabilizante puede conseguirse con detergentes
suaves a baja concentración tales como el sarcosil. Este detergente
consigue además evitar la formación de complejos de preiniciación
de la transcripción, impidiendo por tanto que nuevas RNA polimerasas
inicien la transcripción durante el ensayo y distorsionen el
resultado. Otra alternativa para permeabilizar las células es el
uso de agentes permeabilizadores no detergentes como la nistatina.
En este caso, es necesario añadir algún agente que impida la
iniciación de la transcripción, como por ejemplo sarcosil a
concentraciones insuficientes para una permeabilización óptima pero
adecuadas para impedir la iniciación de la transcripción.
La localización de las RNA polimerasas en el
genoma, en lugar de emplear procedimientos de
run-on nuclear, puede realizarse mediante la
inmunoprecipitación de fragmentos de DNA unidos a las RNA
polimerasas o a factores de elongación asociados a éstas (Figura
2). En este caso, ha de emplearse un anticuerpo que reconozca
específicamente alguna subunidad de las RNA polimerasasas o de los
factores de elongación asociados a éstas, o algún otro
procedimiento de afinidad que permita aislar selectivamente éstas
proteínas del resto de la cromatina. Una posibilidad factible es
utilizar anticuerpos que reconocen la forma fosforilada del dominio
carboxi-terminal de la subunidad mayor de la RNA
polimerasa II de los eucariontes. La forma fosforilada de la RNA
polimerasa II es la que adopta esta enzima cuando se encuentra en
fase de elongación transcripcional, lo que permite distinguirla de
las polimerasas que se encuentran en el complejo de preiniciación,
aún sin fosforilar.
Las matrices de genes utilizadas en este método
pueden ser muy variadas y su naturaleza no es un requerimiento
rígido, aunque se ve influida por el procedimiento de marcaje de
los ácidos nucleicos. En caso de que se utilicen procedimientos
radiactivos de marcaje, están especialmente indicadas las matrices
sobre filtros de nailon, normalmente conocidas como macroarrays. En
estos casos la densidad de sondas por unidad de superficie no suele
superar los 10 elementos por centímetro cuadrado. Si se utilizan
por el contrario procedimientos de marcaje fluorescente, es posible
el empleo de matrices de alta densidad (microarrays) donde se
pueden alcanzar los 10000 elementos-sonda por
centímetro cuadrado.
El método de análisis de la expresión génica
aquí descrito es de aplicación a toda muestra biológica que
contenga células transcripcionalmente competentes. Ello incluye
cultivos microbianos, vegetales, animales, líneas celulares de
dichas procedencias, muestras humanas. En este último caso, el
método es de aplicación tanto a células sanguíneas como a otro tipo
de tejidos, patológicos o no. En el caso de muestras procedentes de
tejidos patológicos, como los procedentes de un tumor, es
especialmente relevante la comparación de los resultados obtenidos
con los procedentes de tejidos sanos análogos, lo que puede permitir
la realización de un diagnóstico.
La realización del método aquí descrito implica
la utilización de diversos materiales:
En todos los casos es necesaria una matriz de
ácidos nucleicos con elementos sonda correspondientes a las
regiones 5' y 3' de diferentes unidades transcripcionales de un
genoma.
También se requiere una forma marcada de un
desoxinucleótido-trifosfato o alguno de sus
derivados, para el marcaje del DNA genómico con el que normalizar
las cantidades de las sondas inmovilizadas en la matriz.
Si se emplean procedimientos de
run-on nuclear para localizar las RNA polimerasas
que se encuentran transcribiendo el genoma, y no se recurre al
aislamiento de núcleos celulares, se necesita una sustancia
permeabilizadora de las células de la muestra biológica, como el
sarcosil o la nistatina.
En todos los casos de run-on
nuclear se requiere una sustancia inhibidora de la iniciación de la
transcripción, como el sarcosil y una forma marcada de un
ribonucleótido, preferentemente el uridín-trifosfato
(UTP).
Si se utiliza un procedimiento de precipitación
del DNA asociado a las RNA polimerasas como forma de localizar la
posición de las mismas en el genoma, es necesario un anticuerpo que
reconozca alguna de las subunidades de las RNA polimerasas o de
factores auxiliares de elongación de la transcripción que acompañan
a las RNA polimerasas durante la transcripción, o en su defecto otro
elemento que permita su purificación selectiva.
Figura
1
A: La adición de sarcosil a las células impide a
la polimerasa iniciar nuevas rondas de transcripción, permitiendo
sin embargo a las polimerasas elongantes continuar
transcribiendo.
B: La incorporación de UTP marcado por tanto se
producirá solamente en aquellos lugares donde se halle una
polimerasa elongante.
C: Se procede a la extracción del RNA marcado y
a su fragmentación, para que el marcaje tenga la mayor resolución
posible
D: El RNA marcado se hibrida con la matriz de
ácidos nucleicos.
Figura
2
A: Las proteínas que están en contacto con el
DNA se unen covalentemente a este gracias a la adición de una
molécula capaz de reaccionar con ellos, como el formaldehído.
B: se procede a la extracción del DNA y a su
fragmentación mediante sonicación.
C: La proteína de interés, en este caso la RNA
polimerasa, es purificada mediante un procedimiento de afinidad, en
este caso, precipitación mediante anticuerpos específicos. La
proteína purificada lleva unidos aquellos fragmentos de DNA en los
que se encontrase en el momento de producirse la unión covalente. Se
revierte esta unión y se purifica el DNA.
D: El DNA se marca y se hibrida con la matriz de
ácidos nucleicos.
Figura
3
Las RNA polimerasas no han de encontrarse
distribuidas uniformemente a lo largo de las unidades
transcripcionales del genoma. Como se representa en esta figura la
distribución de polimerasas dentro de cada unidad transcripcional
puede variar ampliamente, así, en las unidades transcripcionales 1,
3, 5 y 6 las polimerasas son más abundantes en el extremo inicial
(3') de la unidad, en las unidades 2 y 4 la densidad de polimerasas
es mayor en el extremo final (5'), mientras que en las unidades 7 y
8 la distribución es más uniforme en toda la longitud de la unidad
transcripcional.
Figura
4
Se han obtenido sondas para los extremos 5' y 3'
de 76 genes (open reading frames) de la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Las sondas fueron obtenidas por PCR y se fijaron
por duplicado a membranas de nylon en la disposición que se
muestra, incluyendo sondas correspondientes a DNA genómico de S.
cerevisiae como control positivo y de Escherichia coli
como control negativo. Se muestra una hibridación de una de las
membranas con DNA genómico de S. cerevisiae marcado con a
[^{33}P]-dCTP.
Figura
5
Se muestra una imagen de una hibridación de un
run-on de una estirpe silvestre BY4741 de S.
cerevisiae. La media de resultados obtenidos para al menos tres
experimentos independientes se muestra en logaritmo en base 2
mediante un código de colores. Como puede apreciarse la
distribución de polimerasas varía ampliamente entre unas unidades
transcripcionales y otras.
Figura
6
Se muestra una imagen de una hibridación de un
run-on de una estirpe silvestre BY4741 de S.
cerevisiae y un mutante spt4L. La media de resultados obtenidos
para al menos tres experimentos independientes se muestra en
logaritmo en base 2 mediante un código de colores. Puede observarse
cómo el valor para el cociente 3'/5' es menor en la mayoría de los
casos para el mutante, indicando una menor capacidad de la
polimerasa para alcanzar el final de la unidad transcripcional.
El histograma muestra la distribución de
cocientes 3'/5' para el silvestre y el mutante, y las medias de
estos cocientes para ambos en forma de diamantes en el eje
superior. Los recuadros resaltan algunos genes para los que las
diferencias de señal entre las sondas 3' y 5' para el mutante y el
silvestre pueden apreciarse a simple vista.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención esta relacionada con la
detección de la distribución intragénica de las RNA polimerasa II y
comprende:
1. Una matriz compuesta por un soporte sólido en
el que estén depositadas de forma ordenada sondas de ácidos
nucleicos correspondientes a al menos dos fragmentos, inicial y
final, de cada una de una pluralidad de unidades transcripcionales
de uno o varios organismos. Este soporte sólido de la matriz puede
ser una membrana de nylon, nitrocelulosa, o cualquier otro polímero
sintético, un portaobjetos de vidrio, o cualquier otro soporte que
permita la deposición de ácidos nucleicos de forma ordenada en su
superficie. Las sondas de ácidos nucleicos pueden estar compuestas
por fragmentos de DNA o RNA de cadena doble o sencilla, modificados
o no mediante grupos reactivos, con una longitud comprendida entre
20 y 1000 nucleótidos. Estas sondas pueden ser obtenidas por
diversos procedimientos, como por ejemplo, pero no exclusivamente,
PCR, corte por encimas de restricción, síntesis in vitro,
síntesis y purificación a partir de organismos biológicos. La
deposición de las sondas sobre el soporte sólido se realiza
mediante alguna de las tecnologías existentes de fabricación de
matrices de ácidos nucleicos, o bien manualmente. La unión de las
sondas con el soporte sólido se producirá mediante enlace covalente
entre los grupos reactivos presentes en los fragmentos de ácidos
nucleicos, modificados o no, y los grupos reactivos presentes en el
soporte, o bien por
adsorción.
adsorción.
2. Un procedimiento para marcar la localización
de las RNA polimerasa II en el DNA. Preferentemente estos
procedimientos serán:
- a.
- La técnica de run-on, que permite añadir nucleótidos marcados al RNA naciente por las polimerasas elongantes, pero no de polimerasas que aun no han iniciado la elongación o que se encuentran arrestadas (figura 2). Para poder realizar esta técnica es necesario permeabilizar las células para permitir que la molécula marcada penetre en la célula. Esta permeabilización se realiza mediante cualquier detergente, preferentemente el sarcosil, capaz de inhibir la iniciación de la transcripción pero no la elongación de la misma, o mediante cualquier agente biológico que sea capaz de romper la integridad de la membrana plasmática, como la nistatina. El paso de la permeabilización puede ser sustituido por el aislamiento de núcleos celulares o de cromatina transcripcionalmente activa. El marcaje se puede realizar mediante nucleótidos marcados radiactivamente, derivados fluorescentes de ribonucleótidos, un derivado de un ribonucleótido al que posteriormente se une in vitro una molécula radiactiva o fluorescente, o un derivado de un ribonucleótido que posteriormente se detecta mediante un procedimiento inmunológico o enzimático.
- b.
- La técnica de inmunoprecipitación de cromatina (figura 3). Esta técnica consiste en la unión covalente de las proteínas que se encuentren en contacto con el DNA a éste, y la posterior precipitación selectiva de la proteína de interés unida a los fragmentos de DNA en los que esta proteína se encuentra localizada. La unión de las proteínas al DNA se realiza mediante, un agente químico como por ejemplo el formaldehído, o bien mediante un pulso de luz ultravioleta. Una vez unidas covalentemente DNA y proteínas, se procede a la fragmentación del DNA mediante sonicación, y posteriormente se precipita selectivamente mediante anticuerpos, u otros procesos de afinidad, la proteína de interés. Se revierte la unión covalente entre DNA y proteínas, y se purifica el DNA. Este DNA se marca mediante nucleótidos radiactivos, derivados fluorescentes de ribonucleótidos, un derivado de un ribonucleótido al que posteriormente se une in vitro una molécula radiactiva o fluorescente, o un derivado de un ribonucleótido que posteriormente se detecta mediante un procedimiento inmunológico o enzimático.
3. Un procedimiento para poner en contacto el
RNA o DNA marcado con el soporte que contiene las sondas.
Preferentemente se utilizarán procedimientos convencionales de
hibridación de ácidos nucleicos, descritos ampliamente en la
literatura.
4. Un procedimiento para cuantificar la señal.
Este procedimiento dependerá de la forma de marcaje de las
poblaciones de ácidos nucleicos.
5. Un procedimiento para normalizar la cantidad
de señal obtenida en cada hibridación El objetivo de esta
normalización es corregir las posibles desviaciones en los
resultados de la hibridación de la primera población de ácidos
nucleicos debido a las diferentes cantidades de sonda depositadas
en cada punto de la matriz, o de la distinta eficiencia de
hibridación de cada una de las sondas. Para ello, tras proceder a
la deshibridación de la matriz nucleicos con la primera población
de ácidos nucleicos marcados, se realiza una segunda hibridación de
la matriz de ácidos nucleicos con una población de DNA genómico
derivado de la muestra biológica, y marcada mediante nucleótidos
radiactivos, derivados fluorescentes de ribonucleótidos, un
derivado de un ribonucleótido al que posteriormente se une in
vitro una molécula radiactiva o fluorescente, o un derivado de
un ribonucleótido que posteriormente se detecta mediante un
procedimiento inmunológico o enzimático. La señal obtenida para esta
segunda hibridación es usada como factor de corrección sobre la
intensidad de la señal obtenida en a primera hibridación.
Alternativamente, las dos hibridaciones pueden realizarse
simultáneamente siempre que el procedimiento de detección permita
distinguir entre las dos poblaciones de ácidos nucleicos, al estar
marcadas de forma diferente.
Se calcula la relación de polimerasas entre el
final (3') y el principio (5') de cada una de las unidades
transcripcionales presentes en la membrana. Esta relación permite
conocer la distribución de las RNA polimerasas dentro de esa unidad
transcripcional (figura 1)
El presente ejemplo muestra la capacidad de la
técnica descrita para determinar simultáneamente la distribución
intragénica de RNA polimerasa II un amplio conjunto de unidades
transcripcionales distintas de un organismo eucarionte. Para
realizar el ejemplo se realizó un ensayo de run-on
sobre cultivos de una estirpe silvestre BY4741 de la levadura S.
cerevisiae en condiciones de crecimiento exponencial en medio de
cultivo rico (YPD). El resultado del experimento de
run-on se hibrida con membranas que portan sondas
correspondientes a los extremos 5' y 3' de 76 genes de S
cerevisiae.
Fabricación de los macroarrays sobre membranas
de Nylon cargadas positivamente:
Sondas de unas doscientas pares de bases de los
extremos 5' y 3' de setenta y seis genes de levadura se obtuvieron
mediante PCR. Estas sondas fueron fijadas a membranas de nylon
cargadas positivamente mediante un robot BioGRID
(BioRobotics). Como se muestra en la figura 4, cada una de
las sondas fue depositada por duplicado en cada una de las
membranas, y se incluyeron varios controles correspondientes a DNA
genómico de E. coli como control negativo y de S.
cerevisiae como control positivo.
Experimento de run-on:.
a. se recogieron células de S. cerevisiae
de un cultivo en medio YPD densidad óptica 0.5 mediante
centrifugación.
b. se lavaron las células con TMN frío (10 mM
tris HCl, pH 7,4, 100 mM Na Cl, 5 mM MgCl_{2}) y se
resuspendieron en 1ml de agua destilada fría.
c. Se añadió sarcosil hasta una concentración de
0,5% para permeabilizar las células, e inhibir la iniciación de la
transcripción, y se incubó en hielo durante 20 minutos.
d. Se recogieron las células por centrifugación,
eliminando todo el sobrenadante, y se resuspendieron en 150 \mul
de tampón de transcripción (50 mM Tris-HCl, pH 7,9,
100 mM KCl, 5 mM MgCl_{2}, 1 mM MnCl_{2}, 2 mM ditiotreitol, 0,5
mM ATP, CTP y GTP, 100 \muCi, \alpha
[^{33}P]-UTP (3000 Ci/mmol) (NUCLIBER), 10 mM
fosfocreatina y 1,2 mg/ml creatín kinasa).
e. Se permitió progresar la elongación de la
transcripción incubando durante dos minutos a 30ºC, de forma que la
incorporación de la radiactividad ocurrió sólo en aquellos lugares
donde se encontrara una polimerasa elongante.
f. Se detuvo la reacción de la elongación
mediante la adición de 1 ml de TMN frío. Se centrifugó la muestra y
se eliminó el sobrenadante con la radiactividad no incorporada
g. Se procedió a la extracción del ARN celular
mediante el procedimiento del fenol ácido caliente: Se
resuspendieron las células en 400 \mul TES
(Tris-HCl 20 mM, pH7.5, EDTA 20 mM pH8, SDS 1%) y
400 \mul fenol ácido. La muestra agitó vigorosamente y se incubó
a 65ºC durante una hora. Tras esta incubación la muestra se
centrifugó a 13000 r.p.m. durante 5 min. y la fase acuosa se
trasvasó a un nuevo tubo de microcentrifuga conteniendo 400 \mul
de fenol ácido. Se agitó vigorosamente, se incubó en hielo 5 min. y
se centrifugó nuevamente a 13.000 r.p.m. durante 5 min. La fase
acuosa se trasvasó a un nuevo tubo de microcentrífuga conteniendo
400 \mul de cloroformo. Se agitó vigorosamente, se incubó en
hielo 5 min. y se centrifugó nuevamente a 13.000 r.p.m. durante 5
min. La fase acuosa se trasvasó a otro tubo de microcentrifuga
conteniendo l ml de etanol 96º y 40 \mul de acetato sódico 3M, pH
5,5. Se precipitó el RNA al menos durante 4 h. a -20ºC. Tras ello
se centrifugó durante 15 min. a 13.000 r.p.m. y se eliminó el
sobrenadante. Se lavó el pellet de RNA con etanol 70º, se centrifugó
5 min a 13.000 r.p.m., se eliminó el sobrenadante. Finalmente se
resuspendió en 40 \mul de H_{2}O libre de RNAsas.
Marcaje de DNA genómico de S. cerevisiae
BY4741:
1 \mug DNA se resuspendió en 35 \mul de
agua destilada. Se incubó a 100ºC durante 5 min. y se depositó en
hielo, para producir la apertura del DNA. Se añadieron 5 \mul de
una mezcla de dATP, dGTP y dTTP 0.5 M cada uno, 5 \mul de una
mezcla de hexanucleótidos aleatorios (Amersham), 4 \mul de
\alpha [^{33}P]-dCTP (3000 Ci/mmol) (NUCLIBER)
y 1 \mul de polimerasa Klenow (2U/ \mul). Se incubó a 37ºC
durante 45 min. Se purifico la sonda marcada centrifugándola en una
columna de sefadex G-50.
Hibridación del RNA marcado con las membranas.
Las membranas fueron prehibridadas con solución de prehibridación
(Denhart 5X, SSC 5X, SDS 0,5%, tRNA 100 \mug/ml) a 65ºC durante
dos horas. El ARN procedente del experimento de
run-on se fragmentó tratando con NaOH 0,01 M durante
5 min. en hielo, para obtener fragmentos de tamaño similar al de
las sondas depositadas en la membrana, se neutralizó con HCl y se
procedió a la hibridación del RNA marcado con las membranas, en
solución de hibridación (Denhart 5X, SSC 5X, SDS 0,5%, tRNA 100
\mug/ml, RNA marcado), durante 48 horas a 65ºC.
Se lavaron las membranas para eliminar la
radiactividad sobrante, una vez con 100 ml de solución de lavado 1
(2X SSC, 0,1% SDS) durante 20 min. a 65ºC y dos veces con 100 ml de
solución de lavado 2 (0,2X SSC, 0,1% SDS) durante 30 min. a
65ºC
Se expusieron las membranas en un casette FUJI
BAS con una pantalla FUJI BAS IP screen durante 4 días, y se
leyeron mediante un lector FUJI FLA3000.
Las membranas se deshibridaron con vertiendo
sobre ellas tras veces 150 ml de solución de deshibridación (5 mM
KPO_{3}, 0,1% SDS) a 100ºC y se volvieron a hibridar con el DNA
genómico marcado, siguiendo el mismo protocolo de hibridación.
Se obtuvo la relación en la señal en las sondas
3' y 5' de cada una de las unidades transcripcionales representadas
en la membrana, corregidas por el numero de uracilos presentes en
cada sonda, y por la señal de la hibridación con DNA genómico. De
esta forma se consigue obtener un valor absoluto para la relación
de polimerasas situadas en el extremo 3' y en el extremo 5' de cada
una de las unidades transcripcionales para cada experimento. Este
valor se representó en logaritmo en base dos.
En la figura 5 se muestra la media de los
resultados obtenidos para cada unidad transcripcional en al menos
tres experimentos independientes. Como se aprecia, el cociente
3'/5' de distribución de polimerasas varía hasta por un factor de
diez entre unas unidades transcripcionales y otras.
En este ejemplo se muestra la capacidad de la
técnica descrita para detectar alteraciones transcripcionales en un
amplio conjunto de unidades transcripcionales de un organismo
eucarionte. Para realizar el ejemplo se realiza un ensayo de
run-on sobre cultivos de dos estirpes de S.
cerevisiae, una estirpe silvestre BY4741 y un mutante afectado
en elongación transcripcional, spt4\Delta. El experimento
se realiza como en el ejemplo anterior.
Los resultados se muestran en la figura 6. Puede
apreciarse cómo la relación de polimerasas elongantes entre las
sondas de los extremos 3' y 5' disminuye para la gran mayoría de
las unidades transcripcionales, indicando que la mutación
spt4\Delta afecta severamente la distribución de RNA
polimerasas dentro de un amplio número de genes.
Claims (30)
1. Un método para el ensayo de la expresión del
genoma de una muestra biológica basado en la detección de la
distribución intragénica de las RNApolimerasas que se encuentran
transcripcionalmente activas, caracterizado porque comprende
las siguientes etapas:
- a.
- Suministrar una matriz (array), o réplicas de la misma, formada por una pluralidad de elementos polinucleotidicos con capacidad para actuar como sondas inmovilizados en un soporte sólido, siendo todos los elementos sustancialmente complementarios a ácidos nucleicos indicativos de la expresión de un genoma bajo condiciones de hibridación preestablecidas, y donde la representación de cada una de las unidades transcripcionales del genoma presentes en la matriz está compuesta por un elemento cuya secuencia polinucleotídica se corresponde con la secuencia de la región transcrita situada tras el inicio de la transcripción (región 5') y por otro elemento cuya secuencia polinucleotídica se corresponde con la secuencia de la región transcrita situada antes de la terminación de la transcripción (región 3').
- b.
- Suministrar al menos dos poblaciones de ácidos nucleicos marcadas:
- i.
- Una población de RNA marcada in situ dentro de las células de la muestra biológica, gracias a la actividad de las RNA polimerasas que se encuentran transcripcionalmente activas en el genoma, en condiciones donde la iniciación de la transcripción ha sido inhibida.
- ii.
- Una población de DNA genómico derivada de la muestra biológica y marcada
- c.
- Poner en contacto la matriz de elementos con las dos poblaciones de ácidos nucleicos marcados, bajo condiciones de hibridación.
- d.
- Detectar la presencia e intensidad de los marcadores correspondientes a los marcadores de cada población de ácidos nucleicos obtenidos a partir de la muestra biológica.
- e.
- Calcular la proporción entre las RNA polimerasas activas transcripcionalmente localizadas en las regiones 5' y 3' de cada una de las unidades transcripcionales representadas en la matriz, a partir de la intensidad de RNA marcado in situ detectada en cada elemento de la matriz, normalizada según la intensidad de DNA genómico marcado detectada en el mismo elemento.
2. El método de la reivindicación 1,
caracterizado porque la representación de cada una de las
unidades transcripcionales del genoma presentes en la matriz está
compuesta al menos por un ácido nucleico mono- o bicatenario de
entre 20 y 1000 nucleótidos de longitud cuya secuencia
polinucleotídica se corresponde con los 1000 nucleótidos
transcritos situados tras el inicio de la transcripción (región 5')
y por otro ácido nucleico mono- o bicatenario de entre 20 y 1000
nucleótidos de longitud cuya secuencia polinucleotídica se
corresponde con los 1000 nucleótidos transcritos situados antes de
la terminación de la transcripción (región 3').
3. El método de la reivindicación 1,
caracterizado porque la representación de cada una de las
unidades transcripcionales del genoma presentes en la matriz está
compuesta por un ácido nucleico cuya secuencia polinucleotídica se
corresponde con el extremo 5' del primer exón y por otro ácido
nucleico cuya secuencia polinucleotídica se corresponde con el
extremo 3' del último exón.
4. El método de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque
- a.
- las dos poblaciones de ácidos nucleicos se marcan con el mismo marcador,
- b.
- tras la hibridación de la matriz con la población de RNA marcada in situ y la detección de la presencia e intensidad del marcador sobre la matriz, se deshibrida la matriz y se procede a hibridar la población de DNA genómico marcado.
5. El método de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque
- a.
- las dos poblaciones se marcan con diferente marcador
- b.
- las dos poblaciones se hibridan simultáneamente con la matriz
6. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el RNA se marca in situ con un
ribonucleótido, preferentemente uridin-trifosfato
(UTP), marcado radiactivamente.
7. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el RNA se marca in situ con un
derivado fluorescente de un ribonucleótido, preferentemente
uridin-trifosfato (UTP).
8. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el RNA se marca in situ con un
ribonucleótido, preferentemente uridin-trifosfato
(UTP), modificado mediante la incorporación de un grupo
aminoaliilo, al que posteriormente se une in vitro una
molécula radiactiva o fluorescente con capacidad para unirse
covalentemente a dicho grupo.
9. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el RNA se marca in situ con un
nucleótido, preferentemente uridin-trifosfato (UTP),
modificado mediante la incorporación de un grupo químico,
preferentemente digoxigenina, que posteriormente se detecta con un
anticuerpo que reconoce específicamente como antígeno dicho grupo
químico o mediante una enzima que lo usa como sustrato.
10. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el DNA genómico se marca
radiactivamente.
11. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el DNA genómico se marca
fluorescente-
mente.
mente.
12. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque el DNA genómico se marca con un
nucleótido modificado cuya detección se realiza mediante un método
inmunológico o enzimático.
13. El método de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque la muestra biológica se permeabiliza
para el marcaje in situ del RNA con un detergente,
preferentemente sarcosil, capaz de inhibir la iniciación de la
transcripción pero no la elongación de la misma.
14. El método de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque la muestra biológica se permeabiliza
para el marcaje in situ del RNA con cualquier agente químico
o biológico, preferentemente nistatina, que rompa la integridad de
la membrana plasmática.
15. El método de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque se sustituye el paso de
permeabilización de la muestra por el aislamiento de núcleos
celulares o cromatina transcripcionalmente activa.
16. El método de las reivindicaciones 1 a 15,
caracterizado porque la matriz de ácidos nucleicos comprende
entre 100 y 1000000 elementos-sonda inmovilizados
sobre la superficie de un sustrato.
17. El método de las reivindicaciones 1 a 16,
caracterizado porque la matriz de ácidos nucleicos comprende
entre 4 y 10000 elementos-sonda por centímetro
cuadrado.
18. El método de las reivindicaciones 1 a 17,
caracterizado porque la matriz de ácidos nucleicos
inmovilizados comprende al menos un ácido nucleico peptídico
(PNA).
19. El método de las reivindicaciones 1 a 5 , 10
a 13 y 16 a 18, caracterizado porque la población de RNA
marcada in situ se sustituye por fragmentos de DNA genómico
procedentes de un extracto de la muestra biológica precipitados
mediante un sistema de afinidad, preferentemente un anticuerpo, que
reconoce una subunidad de una RNA polimerasa o algunos de los
factores de elongación transcripcional que acompañan a las RNA
polimerasas durante la fase de elongación transcripcional, que son
posteriormente marcados in vitro.
20. El método de las reivindicaciones 1 a 19,
caracterizado porque la muestra biológica es un cultivo
microbiano.
21. El método de las reivindicaciones 1 a 19,
caracterizado porque la muestra biológica es una planta.
22. El método de las reivindicaciones 1 a 19,
caracterizado porque la muestra biológica es de procedencia
animal.
23. El método de las reivindicaciones 1 a 19,
caracterizado porque la muestra biológica es de procedencia
humana.
24. El método de las reivindicaciones 1 a 23,
caracterizado porque la muestra biológica es una línea
celular.
25. El método de las reivindicaciones 1 a 19 y
23, caracterizado porque la muestra biológica son células
sanguíneas.
26. El método de las reivindicaciones 1 a 19, 22
y 23, caracterizado porque la muestra biológica es un tumor
o parte de él.
27. El método de las reivindicaciones 1 a 26,
caracterizado porque el procedimiento se realiza con dos
muestras biológicas diferentes, y se comparan los resultados
obtenidos.
28. El método de la reivindicación 27,
caracterizado porque una de las muestras biológicas es la
problema y la otra es una referencia.
29. El método de la reivindicación 27,
caracterizado porque las dos muestras biológicas proceden de
un tejido sano y otro enfermo.
\newpage
30. Un kit diseñado para la realización del
método de las reivindicaciones 1 a 29, que comprende todos o parte
de los siguientes elementos:
- a.
- Una matriz de ácidos nucleicos con elementos sonda correspondientes a las regiones 5' y 3' de diferentes unidades transcripcionales de un genoma, como la descrita en la reivindicación 1.
- b.
- Una sustancia permeabilizadora de las células de la muestra biológica, preferentemente el sarcosil o la nistatina.
- c.
- Una sustancia inhibidora de la iniciación de la transcripción, preferentemente el sarcosil.
- d.
- Una forma marcada de un ribonucleótido, preferentemente el uridin-trifosfato (UTP).
- e.
- Una forma marcada de un desoxinucleótido-trifosfato o alguno de sus derivados, para el marcaje de DNA genómico.
- f.
- Un elemento, preferentemente un anticuerpo, para la precipitación de RNA polimerasas o de factores auxiliares de elongación de la transcripción que acompañan a las RNA polimerasas durante la transcripción.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ES200402480A ES2304814B1 (es) | 2004-10-14 | 2004-10-14 | Metodo para el ensayo de la expresion del genoma de una muestra biologica y kit para su realizacion. |
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|---|---|---|---|
| ES200402480A ES2304814B1 (es) | 2004-10-14 | 2004-10-14 | Metodo para el ensayo de la expresion del genoma de una muestra biologica y kit para su realizacion. |
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| ES200402480A Expired - Fee Related ES2304814B1 (es) | 2004-10-14 | 2004-10-14 | Metodo para el ensayo de la expresion del genoma de una muestra biologica y kit para su realizacion. |
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|---|---|
| ES (1) | ES2304814B1 (es) |
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| US6617112B2 (en) * | 2000-10-11 | 2003-09-09 | Monsanto Technology Llc | Methods for gene array analysis of nuclear runoff transcripts |
-
2004
- 2004-10-14 ES ES200402480A patent/ES2304814B1/es not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6617112B2 (en) * | 2000-10-11 | 2003-09-09 | Monsanto Technology Llc | Methods for gene array analysis of nuclear runoff transcripts |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2304814B1 (es) | 2009-10-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Grant refused |
Effective date: 20060216 |
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| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20081016 Kind code of ref document: A1 |
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| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20241025 |