ES2305009T5 - Antígenos de superficie de células de mamíferos; reactivos relacionados - Google Patents

Abstract

Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante que exhibe por lo menos 85% de identidad de secuencia en una longitud de por lo menos aproximadamente 12 aminoácidos con la SEQ ID NO: 2.

Description

Antígenos de superficie de células de mamíferos; reactivos relacionados.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por tanto se refiere a proteínas que funcionan en el control de la activación y expansión de células de mamíferos, por ejemplo células del sistema inmunitario de mamíferos. En particular, proporciona genes, proteínas, anticuerpos y reactivos relacionados purificados, útiles por ejemplo, para regular la activación, el desarrollo, la diferenciación y la función de diversos tipos de células que incluyen las células hematopoyéticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La activación de los linfocitos T en reposo es crítica para la mayoría de las respuestas inmunitarias y permite a estas células ejercer sus capacidades reguladoras o efectoras. Véase Paul (ed; 1993) Fundamental Immunology 3rd. ed., Raven Press, N.Y. El aumento de la adhesión entre los linfocitos T y las células presentadoras de antígenos (denominadas en lo sucesivo abreviadamente APC por la expresión inglesa Antigen Presenting Cells) u otras formas de estímulos primarios, por ejemplo anticuerpos monoclonales (mAb) inmovilizados, puede potenciar las señales de los receptores de los linfocitos T. La activación de los linfocitos T y la expansión de los linfocitos T, depende del acoplamiento de los receptores de los linfocitos T (abreviadamente en lo sucesivo TCR por la expresión inglesa T-Cell Receptors) y señales co-estimuladoras provistas por células accesorias. Véase, por ejemplo, Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-367; Bierer and Hahn (1993) Semin. Inmunol. 5:249-261; June et al. (1990) Immunol. Today 11:211-216; y Jenkins (1994) Immunity 1:443-446. Una interacción co-estimulatoria principal y bien estudiada para los linfocitos T implica CD28 o CTLA-4 sobre los linfocitos T con B7 o con B70 (Jenkins (1994) Immunity 1:443-446). Estudios recientes sobre ratones deficientes en CD28 (Shahinian et al. (1993) Science 81:609612; Green et al. (1994) Immunity 1:501-508 y ratones transgénicos que expresan la inmunoglobulina CTLA-4 (Ronchese et al. (1994) J. Exp. Med. 179:809-817) han revelado deficiencias en algunas respuestas de los linfocitos T, aunque estos ratones tiene respuestas inmunitarias primarias normales y respuestas de CTL normales al virus de la coriomeningitis linfocítica y al virus de la estomatitis vesicular. Como resultado, ambos estudios llegan a la conclusión que otras moléculas co-estimuladoras deben estar apoyando la función de los linfocitos T. Sin embargo, ha sido difícil la identificación de estas moléculas que median distintas señales co-estimuladoras.

El factor de necrosis tumoral (abreviadamente en lo sucesivo TNF por sus iniciales en inglés Tumoral Necrosis Factor) es el miembro prototípico de una familia emergente de citoquinas que funcionan como mediadores prominentes de la regulación inmunitaria y la respuesta inflamatoria. Estos ligandos son típicamente proteínas de membrana del tipo II, con homología en el extremo carboxilo. Se produce frecuentemente una proteína soluble procesada proteolíticamente. Véase, por ejemplo, Smith et al. (1994) Cell 76:959-962; Armitage (1994) Current Opinion in Immunology 6:407-413; Gruss and Dower (1995) Blood 85:3378-3404; Wiley et al. (1995) Immunity 3:873682) y Baker and Reddy (1996) Oncogene 12:1-9. Las funciones cruciales de estos miembros de la familia son puestas de manifiesto por diversos estudios, y están implicados en la regulación de la apoptosis, la tolerancia periférica, la maduración de Ig y la conmutación de isotipos, y las funciones generales de los linfocitos B y los linfocitos T. Véase, por ejemplo, Thomson (ed. 1994) The Cytokine Handbook, Academic Press, San Diego, CA. Esto implica funciones fundamentales en los retículos inmunitarios y de desarrollo.

La incapacidad pare modular las señales de activación evita el control de respuestas de desarrollo o fisiológicas inapropiadas en el sistema inmunitario. La presente invención proporciona por lo menos una molécula coestimuladora alternativa, cuyos agonistas y antagonistas serán útiles en modular un gran número de respuestas inmunitarias.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está basada en parte, en el descubrimiento de un antígeno que exhibe homología de secuencia con proteínas que actúan como inductores de la apoptosis. En particular, proporciona un gen que codifica una proteína de 316 aminoácidos, denominada 499E9, que es expresada en linfocitos T del tipo Th1 altamente polarizados. El acoplamiento de 499E9 puede modular la proliferación específica de antígenos y la producción de citoquinas por células efectoras. La 499E9 es una nueva molécula de la superficie celular, que cuando se acopla puede potenciar la expansión de células del sistema inmunitario o la apoptosis. Se describe la realización de ratón que facilita la obtención de genes, proteínas y anticuerpos de mamíferos y sus usos. Están disponibles equivalentes funcionales que presentan al menos 80% de identidad de secuencia con otros mamíferos, por ejemplo, ser humano y especies que no son mamíferos. Además el receptor de 499E9 puede funcionar como pareja (o socio) de unión para estimular otras células que expresan el receptor.

Más particularmente la presente invención proporciona un polipéptido de 499E9 sustancialmente puro o recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; un polipéptido de la familia de ligandos del TNF que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o una proteína de fusión que comprende dichos polipéptidos. Otras realizaciones incluyen una composición, en donde la 499E9 comprende una secuencia madura de la Tabla 1; o una proteína o péptido: es de un animal de sangre caliente seleccionado de un mamífero, incluyendo un roedor; comprende al menos un segmento polipeptídico de SEQ ID NO: 2; exhibe una pluralidad de porciones que exhiben la identidad; es una variante alélica natural de 499E9; está glicosilado; es un polipéptido sintético; se une a un sustrato sólido; se conjuga con otro resto químico; tiene un sustitución de 5 veces o menos respecto a la secuencia natural; o es una variante de inserción o deleción de una secuencia natural. También se proporcionan varias composiciones, por ejemplo, que comprenden: una proteína 499E9 estéril o la proteína 499E9 y un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. Se proporcionan proteínas de fusión, por ejemplo, que comprenden: la secuencia de proteína madura de la Tabla 1; una cola (o marbete) o marcador de detección o purificación que incluye una secuencia FLAG, His6 o Ig; o secuencia de otra proteína TNF-ligando. Se proporcionan realizaciones de kits, por ejemplo, que comprende dicha proteína o polipéptido, y: un compartimento que comprende la proteína o polipéptido y/o instrucciones para uso o desecho de los reactivos del kit.

La invención se refiere también a un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno que específicamente se une a un polipéptido sustancialmente puro o recombinante seleccionado del grupo que consiste en: (a) el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y un polipéptido de la familia de ligandos del TNF que consiste en una secuencias de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

2. El compuesto de unión es un fragmento Fv, Fab o Fab2; el compuesto de unión se conjuga con otro reto químico;

o el anticuerpo: es producido contra una secuencia peptídica de un polipéptido maduro que comprende la secuencia de la Tabla 1; es producido contra una secuencia 499E9 madura; es producido contra 499E9 purificada: es inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a una 499E9 desnaturalizada; exhibe una Kd para el antígeno de al menos 30 µM; se une a un sustrato sólido, incluyendo una bolita o membrana de plástico; está en una composición estéril; o se marca detectablemente, incluyendo un marcador radiactivo o fluorescente. Otras realizaciones incluyen un kit que comprende el compuesto de unión, es decir, el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno, y: un compartimento que comprende el compuesto de unión; y/o instrucciones para el uso o desecho de los reactivos en el kit. Otras formas incluyen, por ejemplo una composición que comprende: un compuesto de unión estéril; o el compuesto de unión es decir, el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno y un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso incluyendo agua, solución salina y/o tampón, y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral. Tales características también permiten métodos de purificar una proteína o péptido 499E9 de otros materiales de una mezcla, que comprende poner en contacto la mezcla con dicho anticuerpo y separar la 499E9 unida de otros materiales.

Las realizaciones de ácidos nucleicos incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en (a): el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y (b) un polipéptido de la familia de ligandos del TNF que consiste en una secuencias de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una de sus proteínas de fusión. La proteína 499E9 es de un mamífero, incluyendo un roedor. También se describen ácidos nucleicos que codifican una secuencia de péptido antigénico de la Tabla 1; codifican una pluralidad de secuencias de péptidos antigénicos de la Tabla 1; exhiben al menos aproximadamente 80% de identidad con un cDNA natural que codifica el segmento. El ácido nucleico es un vector de expresión que comprende además un origen de replicación; procede de una fuente natural; comprende un marcador detectable; comprende una secuencia nucleotídica sintética; tiene un tamaño menor de 6 kb, preferiblemente menor que 3 kb; es de un mamífero, incluyendo un roedor; comprende una secuencia codificadora natural de longitud completa; es una sonda de hibridación para un gen que codifica la proteína 499E9; o es un cebador de PCR, producto de PCR o cebador de mutagénesis. Una célula o tejido que comprende dicho ácido nucleico recombinante están también abarcados dentro de la invención, por ejemplo, en donde la célula es: una célula procariota; una célula eucariota; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de roedor; o una célula humana. Las formas de kit incluyen las que comprenden el ácido nucleico, y: un compartimento que comprende el ácido nucleico; un compartimento adicional que comprende una proteína o polipéptido 499E9; y/o instrucciones para uso o desecho de los reactivos del kit. También se describen en la presente memoria otras realizaciones de ácidos nucleicos incluyendo aquellas que: se hibridan en condiciones de lavado de: 30ºC y menos de sal 2M, 45ºC y/o sal 500 mM, o a 35ºC y/o sal 150 mM a la SEQ ID NO: 1; o exhiben al menos aproximadamente 85% de identidad en un tramo de al menos de 30 nucleótidos, al menos 90% y/o el tramo es al menos de 55 nucleótidos, o al menos 95% y/o el tramo es al menos de 75 nucleótidos con una 499E9 de roedor.

La descripción se refiere además a métodos de modular la fisiología o desarrollo de un cultivo de una célula o tejido que comprenden introducir en la célula un agonista o antagonista de 499E9. Otros métodos incluyen modular la fisiología de una célula que comprenden poner en contacto la célula con: una 499E9 o fragmento de la misma sustancialmente puro; un anticuerpo o pareja de unión que se une específicamente a 499E9, o un ácido nucleico que codifica una 499E9 o uno de sus péptidos. Preferiblemente la célula es un linfocito T y la modulación de la fisiología es: apoptosis del linfocito T; o activación del linfocito T.

La descripción se refiere también a un método de tratar un paciente que tiene una respuesta inmunitaria anómala, administrándole una dosis eficaz de un anticuerpo o pareja de unión específica para 499E9; una proteína o polipéptido de 499E9; o un ácido nucleico qua codifica un péptido de 499E9. La respuesta inmunitaria anómala se caracteriza por una deficiencia inmunitaria de linfocitos T; inflamación crónica; o rechazo de tejidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

I. Generalidades

La presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y secuencias de DNA quo codifican varias proteínas de mamífero que son antígenos encontrados en muchos subtipos de linfocitos T, por ejemplo, Th1, Th2, linfocitos Th1 polarizados y linfocitos Th2 polarizados. Entre estas proteínas están los antígenos que modulan, por ejemplo, inducen o evitan la proliferación o diferenciación de células que interactúan entre sí, entre otros efectos fisiológicos. Los antígenos de longitud completa, y sus fragmentos o antagonistas serán útiles en la modulación fisiológica de células que expresan receptores contrarios para el antígeno. Las proteínas también serán útiles como antígenos, por ejemplo inmunógenos, para producir anticuerpos para diversos epítopos situados en la proteína, tanto epítopos lineales como conformacionales. La molécula puede ser de utilidad en definir subconjuntos funcionales de linfocitos T o de células asesinas naturales (abreviadamente células NK por la expresión inglesa natural killer).

Un cDNA que codifica 499E9 se aisló de una genoteca de linfocitos Th1 polarizados, véase Openshaw et al. (1995)

J. Exp. Med. 182:1357-1367. El cDNA de 499E contiene un tramo de una longitud de aproximadamente 2191 pb y contenía un marco de lectura abierto grande que codifica una proteína transmembranal del tipo II. El análisis del material transcrito ha identificado múltiples transcritos, siendo los más prevalentes los de 2,1 a 2,3 kb. Las características estructurales incluyen una secuencia de dominio intracelular de aproximadamente 52 aminoácidos, una región extracelular de aproximadamente 246 aminoácidos y una porción que abarca la membrana, presuntamente hidrófoba de aproximadamente 20 aminoácidos. Véase la Tabla 1 y la SEQ. ID NO: 2. La proteína 499E9 exhibe restos estructurales característicos de un miembro de la familia de ligandos del TNF. Compárese, por ejemplo, con el ligando para CD40, el ligando para OX40, TNF, NGF y FAS. La Tabla 1 ilustra las secuencias de ácidos nucleicos y la secuencia predicha de aminoácidos para 499E9 de ratón.

Tabla 1 Secuencia de nucleótidos y secuencia predicha de aminoácidos para 499E9 de ratón. La secuencia del dominio intracelular predicho se extiende aproximadamente desde met1 a met49; los residuos 8 y 11 son sitios potenciales de fosforilación de tirosina; una secuencia transmembranal se extiende probablemente aproximadamente desde phe50 a leu69; y el dominio extracelular se extiende probablemente aproximadamente desde tyr70 a asp316. Véanse las SEQ ID NO: 1 y 2.

Los miembros de la familia de ligandos del TNF han conservado un residuo de leucina correspondiente al residuo 205; un residuo de glicina conservado correspondiente al residuo 211; un residuo de tirosina conservado correspondiente el residuo 216; un residuo de glicina conservado correspondiente al residuo 277; un residuo de leucina conservado correspondiente al residuo 282; un residuo de fenilalanina conservado correspondiente al residuo 307; y un residuo de glicina conservado correspondiente al residuo 308. El dominio de ligandos de TNF parece extenderse aproximadamente desde 205 (leu) hasta 316 (asp). Los sitios de glicosilación pueden estar en 197 y 262. Este clon exhibe estrecha homología con una TRAIL de ratón, que está implicada en la inducción de la apoptosis. Miembros relacionados de la familia incluyen los ligandos para CD40 y FAS y beta-linfotoxina, factor de necrosis tumoral. etc.

Por medio de análisis Southern de cDNA es claro que 499E9 es expresada en muchos linfocitos T. incluyendo Th1. Th2, linfocitos Th1 o Th2 polarizados de 3 semanas, pre-linfocitos T, y en genotecas de cDNA de timo desactivadas (knock-out) en el gen Rag. Puede haber sido detectada alguna señal débil procedente de células dendríticas. Las células que expresan 499E9 contienen típicamente un transcrito principal de aproximadamente 2,1 a 2,3 kb, pero también contienen otros transcritos. El análisis de distribución en tejidos sugiere una señal positiva en cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, bazo y testículos. No se han detectado transcritos para 499E9 en fibroblastos (células L), monocitos (RAW264), linfocitos T naturales (naive) (células CD4+, MEL14+, Br), células de macrófagos, pulmón/hígado/bazo infectados con Nippo, u órganos desactivados (knock-out) en el gen Rag (cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, bazo o testículos).

La homología estructural de 499E9 con la familia de ligandos del TNF, sugiere la función de esta molécula. La 499E9, como una molécula de superficie de linfocitos T, probablemente modula respuestas proliferantes específicas de Ag sobre células efectoras o la inducción de la apoptosis en estas células. Los agonistas o antagonistas de 499E9 pueden actuar también como una molécula co-estimuladora para la regulación de la activación celular mediada por linfocitos T, y de hecho pueden causar un cambio de los tipos de linfocitos T coadyuvantes, por ejemplo entre Th1 y Th2. Por tanto, la 499E9 o sus antagonistas deben ser de utilidad en el tratamiento de trastornos inmunitarios anómalos, por ejemplo deficiencias inmunitarias de linfocitos T, inflamación crónica o rechazo de tejidos.

Las moléculas ligandos del TNF modulan típicamente la proliferación, la viabilidad y la diferenciación celulares. Por ejemplo, TNF y FAS pueden destruir células que expresan sus receptores respectivos incluyendo fibroblastos, células hepáticas y linfocitos. Algunos miembros de esta clase de ligandos exhiben efectos sobre la proliferación celular de las células que expresan sus receptores respectivos, por ejemplo linfocitos B que expresan CD40. Estos efectos sobre la proliferación pueden también efectuar subsiguiente etapas de diferenciación, y pueden conducir, directa o indirectamente, a cambios en los perfiles de expresión de citoquinas.

Los miembros de la familia de ligandos del TNF exhiben también efectos de co-estimulación, que también pueden regular la diferenciación celular o la apoptosis. Las células que expresan receptores pueden ser protegidas de lo muerte celular inducida por activación (abreviadamente AICD por las iniciales en inglés Activation Induced Cell Death) o apoptosis. Por ejemplo, el ligando de CD40 puede tener efectos sobre los linfocitos T y B.

La realización caracterizada en la presente memoria es de ratón, pero existirán otras variantes de primates, por ejemplo, de seres humanos. También estarán disponibles secuencias adicionales para proteínas en otras especies de mamíferos, por ejemplo primates y roedores. Véase más adelante. Las descripciones que siguen están dirigidas, con fines ilustrativos, a 499E9 de ratón, pero son igualmente aplicables a realizaciones relacionadas de otras especies.

La proteína 499E9 de ratón es una proteína qua exhibe rasgos estructurales característicos de un antígeno de la superficie celular, por ejemplo un miembro de la familia de ligandos del TNF. La proteína es detectada fácilmente en tipos celulares particulares, otras expresan cantidades menores. El antígeno de 499E9 debe estar presente en los tipos de tejidos identificados y la interacción del antígeno con su pareja de unión debe ser importante para mediar varios aspectos de fisiología o desarrollo celular, tal como se ha descrito.

II. 499E9 purificada

La secuencia de aminoácidos de 499E9 de ratón se muestra en la SEQ ID NO: 2. Estas secuencias de aminoácidos, provistas de los extremos amino hasta carboxilo, son importantes en proporcionar información de secuencias en el antígeno, permitiendo distinguir la proteína de otras proteínas e ilustrar como ejemplos numerosas variantes. Además, las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer dichos segmentos, y las secuencias de nucleótidos permiten la preparación de sondas de oligonucleótidos, siendo las dos estrategias para detección o aislamiento, por ejemplo, clonación de genes o los cDNA que codifican dichas secuencias.

Como se usa en la presente memoria, el término "499E9 de ratón" abarcará cuando se use en un contexto de proteínas, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, o un fragmento significativo de dicha proteína, u otra proteínas altamente homólogas derivadas de ratón. Estos componentes de unión, por ejemplo anticuerpos, se unen típicamente a 499E9 con alta afinidad, por ejemplo al menos aproximadamente 100 nM, usualmente más de aproximadamente 30 nM, preferiblemente más de aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente como lo mejor aproximadamente 3 nM. Proteínas homólogas se encontrarían en especies de mamífero diferentes de ratón, por ejemplo primates o roedores. Las especies que no son de mamífero deben poseer genes y proteínas relacionados estructuralmente o funcionalmente por ejemplo, aves y anfibios.

El término "polipéptido" tal y como se usa en la presente memoria incluye un fragmento o segmento significativo, y abarca un tramo de residuos de aminoácidos al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente al menos aproximadamente 12 aminoácidos, típicamente al menos aproximadamente 16 aminoácidos, de preferencia al menos aproximadamente 20 aminoácidos y en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos.

El término "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a 499E9, por ejemplo, en una forma de tipo de apareamiento por adhesión celular o una interacción antígeno-anticuerpo. También incluye compuestos` por ejemplo, proteínas, que se asocian específicamente con 499E9, incluyendo una interacción natural proteína-proteína fisiológicamente relevante, covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero o reactivo químico. Un análogo funcional puede ser un antígeno con modificaciones estructurales o puede ser una molécula que tenga una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión apropiados. Los compuestos pueden servir como agonistas o antagonistas de la interacción de unión, véase por ejemplo Goodman et al. (eds) (1990) Goodman & Gilman’s: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics (8th ed.), Pergamon Press.

Sustancialmente pura significa típicamente que la proteína está exenta de otras proteínas contaminantes derivadas del organismo fuente original. La pureza puede ser determinada por métodos estándares típicamente en peso, y ordinariamente será al menos aproximadamente 40% pura, generalmente al menos aproximadamente 50% pura, frecuentemente al menos aproximadamente 60% pura, típicamente al menos aproximadamente 80% pura, de preferencia al menos aproximadamente 90% pura, y en realizaciones muy preferidas será al menos aproximadamente 95% pura. Frecuentemente se añadirán vehículos o excipientes.

La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno o ambiente del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido incluyendo la temperatura, medio o ambiente de electrolitos, características moleculares del polipéptido y naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la que se usa el polipéptido varía desde aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Usualmente, la temperatura de uso es mayor que aproximadamente 18ºC. Para fines de diagnóstico la temperatura será aproximadamente la temperatura ambiente o más caliente, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes en el ensayo. Para fines terapéuticos la temperatura será usualmente la temperatura corporal, típicamente alrededor de 37ºC para seres humanos y ratones, aunque en ciertas situaciones la temperatura puede elevarse o disminuirse in situ o in vitro.

El tamaño y estructura del polipéptido debe ser por lo general el correspondiente a un estado sustancialmente estable y usualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad o asociado con lípidos o detergentes de un modo que se aproxime a las interacciones de la bicapa lipídica natural.

El disolvente y los electrolitos serán usualmente un tampón fisiológicamente compatibles, de un tipo usado para la conservación de las actividades biológicas, y usualmente se aproximará a un disolvente acuoso fisiológico. Usualmente el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente alrededor de 7,5. En algunas ocasiones se añadirá uno o más detergentes, típicamente uno no desnaturalizante suave. por ejemplo CHS (hemisuccinato de colesterilo) o CHAPS (sulfonato de (3[3-(colamidoropil)dimetilamonio]-1propano en una concentración suficientemente baja para evitar la perturbación significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

III. Variantes físicas

Esta invención también abarca proteínas de la familia de ligandos del TNF que tienen al menos 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de 499E9. Las variantes incluyen variantes de especies, polimórficas o alélicas.

La homología de secuencia de aminoácidos o identidad de secuencia se determina optimizando apareamientos de residuos, si es necesario introduciendo huecos según se requiera. Véase también Needleham et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff et al. (1983), Chapter One in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA ; y los paquetes de programas de ordenador de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y de University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. La identidad de secuencias cambia cuando se consideran, las sustituciones conservativas como igualdades o apareamientos. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparraguina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias homólogas de aminoácidos están típicamente destinadas a incluir variaciones polimórficas o alélicas e interespecies en cada secuencia de proteína respectiva. Más preferiblemente dicha identidad de secuencia de aminoácidos es al menos aproximadamente 90%.

El DNA aislado de 499E9 puede ser modificado fácilmente por sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de DNA que codifican estos antígenos, sus derivados o proteínas que tienen similares actividades fisiológicas, inmunógenas, antigénicas u otra actividad funcional. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir antígenos mutantes o para aumentar la expresión. El aumento de la expresión puede implicar la amplificación de genes, el aumento de la transcripción, el aumento de la traducción y otros mecanismos. “Mutante 439E” abarca un polipéptido que de otra manera cae dentro de la definición de identidad de secuencia de la 499E9, como se ha indicado antes, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de 499E9 como se encuentra normalmente en la naturaleza, yo sea por medio de deleción, sustitución o inserción. Esto incluye por lo general proteínas que tienen al menos 80% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO: 2, y que comparten diversas actividades biológicas, por ejemplo antigénicas o inmunógenas con dichas secuencias, y en realizaciones preferidas contienen la mayoría de las secuencias de longitud completa descritas. Las secuencias de longitud completa serán preferidas típicamente, aunque también serán de utilidad versiones truncadas, por ejemplo construcciones solubles y dominios intactos, así mismo son más deseados análogamente genes o proteínas encontrados en fuentes naturales. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas 499E, particularmente las encontradas en diversos animales de sangre caliente, por ejemplo mamíferos y aves. Estas descripciones son generalmente significativas en abarcar todas las proteínas 499E9, y no limitadas a las realizaciones particulares de ratón específicamente estudiadas.

La mutagénesis de 499E9 también se realizar haciendo inserciones o deleciones de aminoácidos. Pueden generarse sustituciones, deleciones, inserciones o cualesquiera combinaciones para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino-terminales y carboxi-terminales. Se puede realizar mutagénesis al azar en un codón diana y los mutantes expresados pueden ser cribados para la actividad deseada. Los métodos para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en DNA que tiene una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, por ejemplo por mutagénesis del cebador M13 o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo Sambrook et al. (1988); Ausubel et al., (1987 and Supplements); y Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:867-382.

La presente invención también proporciona proteínas recombinantes, por ejemplo proteínas de fusión heterólogas, usando segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no están fusionadas de manera normal de la misma forma. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácidos nucleicos heterólogos. Las proteínas de fusión serán de utilidad como fuentes para escindir, separar y purificar porciones de las mismas.

Además, pueden prepararse nuevas construcciones combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, pueden "intercambiarse" segmentos de unión a dianas u otros segmentos entre diferentes polipéptidos

o fragmentos. Véase, por ejemplo Cunningham et al. (1989) Science 243:1330-1336; y O’Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 283:15985-15992.

El método de la fosforamidita descrito por Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1858-1862, producirá fragmentos de DNA sintéticos adecuados. Se obtendrá frecuentemente un fragmento bicatenario ya sea sintetizando la cadena complementaria y asociándole la cadena bajo condiciones apropiadas, o añadiendo la cadena complementaria usando DNA-polimerasa con una secuencia de cebador apropiado, por ejemplo por técnicas de PCR.

IV. Variantes funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a las 499E9 puede dar como resultado la inhibición de la unión del antígeno a su pareja de unión, por ejemplo otra de sí misma, probablemente a través de inhibición competitiva. Así, ensayos in vitro de la presente invención, frecuentemente usarán proteínas aisladas, membranas procedentes de células que expresan una 499E9 recombinante asociada a membrana, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión al antígeno de estas proteínas, o fragmentos unidos a sustratos en fase sólida. Estos ensayos también podrán permitir la determinación diagnóstica de los efectos de cualesquiera mutaciones y modificaciones de segmentos, o mutaciones y modificaciones de antígenos, por ejemplo análogos de 499E9.

Esta invención también contempla el uso de ensayos competitivos de cribado de fármacos, por ejemplo, en donde anticuerpos neutralizantes para el antígeno o fragmentos de unión compiten con un compuesto de ensayo para unirse a la proteína, por ejemplo una secuencia de proteína natural.

“Derivados” de antígenos de 499E9 incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos procedentes de formas que se presentan de modo natural, variantes de glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Se pueden preparar derivados covalentes por enlace de funcionalidades a grupos que se encuentran en cadenas laterales de aminoácidos de 499E9 o en los extremos N ó C, por ejemplo, por métodos estándares. Véase por ejemplo, Lundblad and Noyes (1988) Chemical Reagents for Protein Modification, vols. 1-2, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Hugli (ed.) (1989) Techniques in Protein Chemistry, Academic Press, San Diego, CA; y Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL.

En particular, están incluidas las alteraciones por glicosilación, por ejemplo las realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas posteriores del proceso. Véase por ejemplo Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:497-534. También se incluyen versiones de los péptidos con la misma secuencia primaria de aminoácidos que tienen otras modificaciones secundarias que incluyen, residuos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre las 499E9 y otras proteínas homólogas o heterólogas. Muchos receptores de citoquinas u otras proteínas de superficie son multímeros, por ejemplo entidades homodímeras, y una construcción repetitiva puede tener diversas ventajas, incluyendo susceptibilidad reducida a la escisión proteolítica. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido informador, por ejemplo luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo un segmento de unión a un receptor, de tal manera que pueda ser determinada fácilmente la presencia o localización del ligando fusionado. Véase por ejemplo, Dull et al., patente de EE.UU. Nº

4.859.609. Otras parejas de unión de genes incluyen: β-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, β-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol-deshidrogenasa, factor alfa de apareamiento de levadura, y colas o marbetes de detección o purificación, tales como una secuencia FLAG de secuencia His6. Véase. por ejemplo, Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.

Los péptidos de fusión típicamente se prepararán por cualesquiera métodos de ácidos nucleicos recombinantes o por métodos de polipéptidos sintéticos. Las técnicas para manipulación y expresión de ácidos nucleicos se describen en general por ejemplo en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y Ausubel et al. (eds) (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley,

N.Y. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; Atherton et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Grant (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman, N.Y.

Esta invención también contempla el uso de otros derivados de 499E9 distintos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación. Dichos derivados pueden implicar asociación covalente o agregativa con restos químicos. Los derivados covalentes o agregativos serán útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de purificación, tales como purificación por afinidad de parejas de unión, por ejemplo otros antígenos. Una 499E9 puede ser inmovilizada por unión covalente a un soporte sólido, tal como SEPHAROSE activada por bromuro de cianógeno, por métodos que son bien conocidos en la técnica, o puede ser adsorbida sobre superficies de poliolefinas, con o sin reticulación con glutaraldehído, para uso en el ensayo o purificación de anticuerpos anti-499E9 o una composición de unión alternativa. Las 499E9 también pueden ser marcadas con un grupo detectable, por ejemplo para uso en ensayos de diagnóstico. La purificación de 499E9 puede ser efectuada por un anticuerpo inmovilizado o una pareja de unión complementaria.

Una 499E9 o fragmento solubilizado de esta invención puede ser usado como inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos para unirse al antígeno o sus fragmentos. El antígeno purificado puede ser usado para cribar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígenos, abarcando fragmentos de unión a antígenos de anticuerpos naturales, por ejemplo, Fab, Fab’, F(ab)2, etc. La 499E9 purificada también se puede usar como un reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados del antígeno

o fragmentos celulares que contengan el antígeno, ambos de los cuales pueden ser el diagnóstico de un estado morboso anómalo o fisiológico específico o enfermedad. Esta invención contempla anticuerpos producidos contra secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, o fragmentos de de proteínas que las contienen. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión para, o que se producen contra fragmentos específicos que se predice que están fuera de la bicapa lipídica, tanto extracelulares como intracelulares.

La presente invención contempla el aislamiento de variantes de especies que son un polipéptido de la familia de ligandos del TNF que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Las técnicas de análisis por transferencia de Southern y Northern deben establecer que entidades genéticas similares existen en otros mamíferos. Es probable que las 499E9 estén extendidas ampliamente en variantes de especies, por ejemplos roedores, lagomorfos, carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos y primates.

La descripción también proporciona medios para aislar un grupo de antígenos relacionados quo exhiben tanto características distintas como similares en estructura, expresión y función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de las moléculas será desarrollada en gran medida mediante el aislamiento y caracterización de variantes de especies distintas adicionales de los mismos. En particular, la presente invención proporciona sondas útiles para identificar entidades genéticas homólogas adicionales en diferentes especies.

Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una 499E9 correspondiente, por ejemplo cualesquiera tipos de especie o células que carezcan de antígenos correspondientes y exhiban actividad de fondo negativa. Esto debe permitir el análisis de la función de 499E9 en comparación con células de control no transformadas.

Es posible la disección de elementos estructurales críticos que afectan a las diversas funciones de activación y diferenciación mediadas a través de estos antígenos, utilizando técnicas estándares de biología molecular moderna, particularmente en comparar miembros de la clase relacionada. Véase, por ejemplo, la técnica de mutagénesis por exploración de homólogos descrita en Cunningham et al. (1989) Science 243:1339-1336; y las propuestas usadas en O’Dowd et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992; y Lechleiter et al. (1990) EMBO J. 9:4381-4390.

Las funciones intracelulares implicarían probablemente segmentos del antígeno que normalmente son accesibles al citosol. Sin embargo, puede ocurrir internalización de proteínas bajo ciertas circunstancias e interacción entre componentes intracelulares y segmentos "extracelulares". Los segmentos específicos de interacción de 499E9 con otros componentes intracelulares, pueden ser identificados por mutagénesis o medios bioquímicos directos, por ejemplo métodos de reticulación o de afinidad. También será aplicable el análisis estructural por análisis cristalográfico u otros métodos físicos. La investigación adicional del mecanismo de la transducción de señales incluirá el estudio de componentes asociados qua pueden ser aislables por métodos de afinidad o por medios genéticos, por ejemplo, análisis de complementación de mutantes.

Se continuará el estudio adicional de la expresión y control de 499E9. Los elementos de control asociados con los antígenos deben exhibir diferenciales patrones fisiológicos, de desarrollo, específicos de tejidos u otros patrones de expresión. Son de interés las regiones genéticas del extremo 3’ o del extremo 5’, por ejemplo elementos de control. En particular, se han encontrado variantes fisiológicas o de desarrollo, por ejemplo, formas múltiples alternativamente procesadas del antígeno. Véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. Así, el corte y empalme diferencial del mensaje puede conducir a una clasificación de formas unidas a membranas, formas solubles y versiones modificadas del antígeno.

Estudios estructurales de los antígenos conducirán al diseño de nuevos antígenos, particularmente análogos que exhiban propiedades agonistas o antagonistas sobre la molécula. Esto se puede combinar con los métodos de cribado previamente descritos para aislar antígenos que exhiban un espectro deseado de actividades.

V. Anticuerpos

Se pueden producir anticuerpos contra diversas 499E9, incluyendo variantes de especies polimorfas o variantes alélicas y sus fragmentos, tanto en sus formas naturales como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, se pueden producir anticuerpos para 499E9 en cualquiera de sus formas activas o en sus formas inactivas, incluyendo versiones naturales o desnaturalizadas. También se contemplan anticuerpos-anti-idiotípicos.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones monocatenarias, contra fragmentos predeterminados de los antígenos, se pueden producir por inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunógenas. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden cribar para unirse a 499E9 normales o defectuosas, o se pueden cribar para actividad agonista o antagonista, por ejemplo mediada a través del antígeno o su pareja de unión. Los anticuerpos pueden ser agonistas o antagonistas, por ejemplo, por unión de ligandos estéricamente bloqueados. Estos anticuerpos monoclonales se unirán por lo menos con una KD de aproximadamente 1 mM, usualmente al menos aproximadamente 300 µM, típicamente al menos aproximadamente 100 µM, más típicamente al menos aproximadamente 30 µM, de preferencia al menos aproximadamente 10 µM y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 µM o inferior.

Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes pueden ser cribados por su capacidad de unión a los antígenos sin inhibir la unión a una pareja de unión. Como anticuerpos neutralizantes pueden ser útiles en ensayos de unión no competitivos. También serán de utilidad en la detección o cuantificación de proteínas 499E9 o sus parejas de unión. Véase por ejemplo Chan (ed.) (1987) Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FLA; Price and Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N. Y.; y Ngo (ed.) (1988) Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N.Y. Las absorciones cruzadas u otros ensayos identificarán anticuerpos que exhiben diversos espectros de especificidades, por ejemplo especificidades de especies únicas o compartidas.

Además, los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno de esta invención pueden ser potentes antagonistas que se unen al antígeno e inhiben la unión funcional o inhiben la capacidad de una pareja de unión de producir una respuesta biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y pueden ser acoplados a toxinas o radionúclidos de modo que cuando el anticuerpo se une al antígeno, se mata una célula que lo expresa, por ejemplo, en su superficie. Además, estos anticuerpos pueden conjugarse con fármacos u otros agentes terapéuticos, bien directamente o bien indirectamente por medio de un fragmento enlazador, y pueden efectuar el envío del fármaco a su diana.

Los fragmentos de antígenos pueden unirse a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para ser usados como inmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos pueden ser fusionados o unidos covalentemente a una variedad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa bocallave, seroalbúmina bovina, toxoide del tétano, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry vol. 1, Academic Press, New York; y Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, N.Y., para descripciones de métodos para preparar antisueros policlonales.

En algunos casos es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios hospedantes mamíferos tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Una descripción de las técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales puede encontrarse, por ejemplo, en Stites et al., (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en dicho texto; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1988) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (2nd ed.), Academic Press, New York; y particularmente en Kohler and Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que describen el método de generar anticuerpos monoclonales.

Otras técnicas adecuadas incluyen la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente seleccionar colecciones de anticuerpos en vectores fagos o similares. Véase, Huse, et al. (1989)

"Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda ". Science 248:1275-1281 y Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y los anticuerpos estarán marcados por unión, covalente o no covalente, a una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad 'de marcadores y técnicas de conjugación y se describen extensamente en la literatura tanto científica como de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, co-factores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de EE.UU. Nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. También se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly, patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Moore et al., patente de EE.UU. Nº 4.642.334; y Queen, et al., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA. 86:10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención también se pueden usar para cromatografía de afinidad en el aislamiento de la proteína. Se pueden preparar columnas en las cuales los anticuerpos se unen a un soporte sólido. Véase por ejemplo Wilchek et al. (1984) Meth. Enzvmol. 104:3-55.

Los anticuerpos producidos contra cada 499E9 también serán de utilidad para producir anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán de utilidad en la detección o diagnóstico de diversos estados inmunológicos relacionados con la expresión de los antígenos respectivos.

VI. Ácidos nucleicos

Las secuencias peptídicas descritas y los reactivos relacionados son de utilidad en la detección, aislamiento o identificación de un clon de DNA que codifica 499E9, por ejemplo de una fuente natural. Típicamente serán de utilidad en el aislamiento de un gen de mamífero y procedimientos similares se aplicarán para aislar genes de otras especies, por ejemplo animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de 499E9 de otras especies. Deben estar disponibles varias propuestas diferentes para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado.

La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos por métodos estándares, como se ha descrito anteriormente. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada pueden ser presentados a un sistema inmunitario pare generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo Coligan (1991) Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; y Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Alternativamente, la 499E9 puede usarse como un reactivo de unión específica, y puede aprovecharse su especificidad de unión, de un modo muy similar a como se usaría un anticuerpo.

Por ejemplo, la composición de unión específica podría usarse para cribar una genoteca de expresión hecha de una línea celular que exprese una 499E9. El cribado puede realizarse por tinción estándar del antígeno expresado en superficie o por el método de ronda de cribados (panning). El cribado de la expresión intracelular puede realizarse también por medio de varios procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían usarse para purificar por afinidad o clasificar células que expresen la proteína.

Los segmentos peptídicos también se pueden usar para predecir oligonucleótidos apropiados para cribar una genoteca. El código genético se puede usar para seleccionar oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para cribado. Véase, por ejemplo la SEQ ID NO: 1. En combinación con técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos podrías ser útiles para seleccionar clones correctos a partir de una genoteca. Las secuencias complementarias también serán usadas como sondas, cebadores o cadenas antisentido. En base a la identificación del probable dominio extracelular, diversos fragmentos deben ser particularmente útiles, por ejemplo, acoplados con técnicas de vector anclado o PCR de poli-A complementario o con DNA complementario de otros péptidos.

Esta invención contempla el uso de DNA aislado o fragmentos que codifican un polipéptido 499E9 correspondiente biológicamente activo. Además, esta invención abarca un DNA aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo que es capaz de hibridarse bajo condiciones apropiadas con las secuencias de DNA descritas en la presente memoria. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser un antígeno intacto o fragmento, y tiene una secuencia de aminoácidos que se describe por ejemplo en la SEQ ID NO: 1. Además, esta invención abarca el uso de DNA aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifica(n) proteínas que son homólogas a 499E9 o que se aisló usando cDNA que codifica una 499E9 como sonda. El DNA aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5’ y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición de una cola de poli-A y otros.

Un ácido nucleico “aislado” es un ácido nucleico, por ejemplo un RNA, DNA, o un polímero mixto, que está sustancialmente separado de otros componentes que acompañan de modo natural a una secuencia natural, por ejemplo ribosomas, polimerasas y/o secuencias genómicas flanqueantes a partir de las especies de las que se originan. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido separada de su medio ambiente natural e incluye aislados de DNA recombinantes o clonados y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. En general, el ácido nucleico estará en un vector o fragmento de menos de aproximadamente 50 kb, normalmente menos de aproximadamente 30 kb, típicamente menos de aproximadamente 10 kb, y preferiblemente menos de aproximadamente 6 kb.

Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones contendrá una heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos

o porciones del polímero no críticos para una función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico “recombinante” se define por su método de producción o por su estructura. Con referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto preparado por un proceso que se basa en técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, por ejemplo las que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente en la selección o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico preparado generando una secuencia que comprende una fusión de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos uno respecto al otro, pero se pretende excluir productos naturales, por ejemplo, mutantes que se presentan de modo natural. Así, por ejemplo, están abarcados los productos preparados transformando células con cualquier vector que no se presente naturalmente, como son los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada usando cualquier proceso con oligonucleótidos sintéticos. Eso se hace frecuentemente para reemplazar un codón con un codón redundante que codifique el mismo aminoácido o un aminoácido conservador, introduciendo o eliminando típicamente al mismo tiempo un sitio de reconocimiento de secuencia.

Alternativamente, esto se lleva a cabo para unir segmentos de ácidos nucleicos de funciones deseadas para generar una sola entidad genética que comprenda una combinación deseada de funciones no encontradas en las formas naturales disponibles comúnmente. Los sitios de reconocimiento por enzimas de restricción son frecuentemente la diana de dichas manipulaciones artificiales, pero por diseño pueden ser incorporadas otras dianas específicas del sitio, por ejemplo promotores, sitios de replicación de DNA, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles. Un concepto similar se pretende para un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Están específicamente incluidos los ácidos nucleicos sintéticos, que, debido a la redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de diversas variantes de especies diferentes.

Un “fragmento” significativo en un contexto de ácidos nucleicos es un segmento contiguo de al menos

aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente 22 nucleótidos, ordinariamente al menos aproximadamente 29 nucleótidos, más frecuentemente al menos aproximadamente 35 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 41 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 55 nucleótidos y en las realizaciones particularmente preferidas será de al menos aproximadamente 60 o más nucleótidos.

Un DNA que codifica una proteína 499E9 será particularmente útil para identificar genes, mRNA y especies de cDNA que codifiquen proteínas relacionadas u homólogas, así como diversos DNA que codifiquen proteínas homólogas de especies diferentes. Hay probablemente homólogos en otras especies, incluyendo primates, roedores y aves. Diversas proteínas 499E9 deben de ser homólogas y están abarcadas por la presente invención. Sin embargo, incluso los genes que codifican proteínas que tienen una relación evolutiva más distante al antígeno pueden aislarse fácilmente bajo condiciones apropiadas usando estas secuencias si son lo suficientemente homólogos. Las proteínas 499E9 de primate son de particular interés.

Las clones recombinantes derivados de las secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos, incluyendo, por ejemplo, células y organismos transgénicos, y para terapia de genes. Véase, por ejemplo Goodnow (1992) "Transgenic Animals" en Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn et al., (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology, 10:180-199.

La homologia sustancial en el contexto de comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que los segmentos o sus cadenas complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están óptimamente alineados, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, generalmente al menos aproximadamente 58%, ordinariamente al menos aproximadamente 65%, frecuentemente al menos aproximadamente 71%, típicamente al menos aproximadamente 77%, usualmente al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 95 a 98% o más, y en realizaciones particulares, tanto como aproximadamente 99% o más de .los .nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectiva, a una cadena, o su complemento, usando típicamente una secuencia de 499E9, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 1. Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando haya por lo menos aproximadamente 55% de homología en un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 75% en un tramo de aproximadamente 25 nucleótidos y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% en un tramo de aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de. la comparación de homología, según se describe, puede ser sobre tramos más largos, y en ciertas realizaciones será sobre un tramo al menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 40 nucleótidos y preferiblemente al menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos.

Las condiciones rigurosas, en referencia a la homología en el contexto de hibridación, serán condiciones combinadas rigurosas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, típicamente los controlados en las reacciones de hibridación. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas superiores a aproximadamente 30ºC, usualmente superiores a aproximadamente 37ºC, típicamente superiores a aproximadamente 55ºC, preferiblemente superiores a aproximadamente 70ºC. Las condiciones de sal rigurosas ordinariamente serán inferiores, a aproximadamente 1000 mM, usualmente inferiores a aproximadamente 400 mM, típicamente inferiores a aproximadamente 250 mM., preferiblemente inferiores a aproximadamente 150 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medición de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. La 499E9 de otras especies de mamíferos puede ser clonada y aislada mediante hibridación de especies cruzadas de especies estrechamente relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies poco relacionadas, y por lo tanto es aconsejable la hibridación de especies relativamente muy relacionadas. Alternativamente, la elaboración de una preparación de anticuerpos que exhiba menos especificidad de especie puede ser útil en propuestas de clonación con expresión.

VII. Preparación de 499E9; Miméticos

El DNA que codifica la 499E9 o sus fragmentos puede obtenerse mediante síntesis química, cribando genotecas de cDNA, o cribando genotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas de células o muestras de tejidos. Véase, por ejemplo, Okayama and Berg (1982) Mol. Cell. Biol. 2:161-170; Gubler and Hoffman (1983) Gene 25:263-269; y Glover (ed.) (1984) DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Alternativamente, las secuencias de la presente invención proporcionan cebadores de PCR útiles o permiten la preparación sintética u otra preparación de genes .adecuados que codifican una 499E9; incluyendo las realizaciones que se presentan de modo natural.

Este DNA puede ser expresado en una amplia. variedad de células hospedantes para la síntesis de una 499E9 de longitud completa o fragmentos que puedan a su vez usarse, por ejemplo, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función.

Los vectores, según se usan en la presente memoria, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos integrables de DNA y otros vehículos que hagan posible la integración de fragmentos de DNA en el genoma del hospedante. Véase, por ejemplo, Pouwels et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodríguez et al. (1988) (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Para los propósitos de esta invención, las secuencias de DNA están enlazadas operativamente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el DNA para una pre-secuencia o secuencia delantera secretora está enlazado operativamente a un polipéptido si éste es expresado como una pre-proteína o participa en dirigir el polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor está enlazado operativamente a una secuencia codificadora si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión de ribosoma esta enlazado operativamente a una secuencia codificadora si está colocado para permitir la traducción. Usualmente, enlazado operativamente significa contiguo y en marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos, tales como genes represores no están enlazados contiguamente, sino todavía unidos a secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión. Véase, por ejemplo, Rodríguez et al., Chapter 10, pp. 205-236; Balbas, and .Bolivar (1990) Methods in Enzymology 185:14-37; y Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, N.Y.

Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMClneo Poli-A, véase Thomas et al. (1987) Cell 51:503-512; y un vector de baculovirus, tal como pAC 373 o pAC 610. Véase, por ejemplo, Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177-199.

Frecuentemente se deseará expresar un polipéptido de 499E9 en un sistema que proporcione un patrón de glicosilación específico o definido. Véase, por ejemplo, Luckew and Summers (1988) Bio/Technology 6:47-55; y Kaufman (1990) Meth. Enzymol. 185:487-511.

La 499E9, o uno de sus fragmentos, puede ser manipulada para ser fosfatidil-inositol (PI) enlazado a .una membrana celular, pero puede ser separada de las membranas mediante tratamiento con una enzima de escisión de fosfatidilinositol, por ejemplo, fosfatidil-inositol-fosfolipasa-C. Esta libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos normales de química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989) Biochim. Biophys. Acta, 988:427-454; Tse et al., (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner et al., (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283.

Ahora que la 499E9 ha sido caracterizada, sus fragmentos o derivados pueden ser preparados mediante procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procedimientos, tales como los descritos en Stewart and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; y Villafranca (ed.) (1991) Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, CA.

VIll. Usos

La presente invención proporciona reactivos que encontraran uso en aplicaciones de diagnóstico como las descritas en muchas partes de la presente memoria, por ejemplo, en la descripción general para condiciones mediadas por linfocitos T, o más adelante en la descripción de kits para diagnóstico.

Esta invención proporciona también reactivos con valor terapéutico significativo. La 499E9 (natural o recombinante), sus fragmentos y anticuerpos para los mismos, junto con los compuestos identificados que tienen afinidad de unión a 499E9, deben de ser útiles en el tratamiento de estados asociados con fisiología o desarrollo anómalos, incluyendo la proliferación anómala, por ejemplo, estados cancerosos o estados degenerativos. En particular, la modulación del desarrollo de células linfoides se conseguirá mediante tratamiento terapéutico adecuado usando las composiciones proporcionadas por la presente invención. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anómala o señalización anómala por una 499E9 debe de ser una probable diana para un agonista o antagonista del antígeno. El antígeno desempeña una función en la regulación .o el desarrollo de células hematopoyéticas, por ejemplo, células linfoides, que afectan a las respuestas inmunológicas, por ejemplo, las trastornos autoinmunitarios.

En particular, el antígeno proporcionará probablemente una señal co-estimuladora para la .activación celular. De esta manera, la 499E9 modulará probablemente las interacciones mediadas por los linfocitos T con otros tipos de células, por ejemplo, células que posean un receptor para los mismos. Estas interacciones conducirían, en contextos particulares, a la modulación del crecimiento de la célula, a la síntesis de citoquinas por esas u otras células o al desarrollo de células efectoras particulares.

Además, la 499E9 o sus antagonistas podrían redirigir las respuestas de los linfocitos T, por ejemplo, entre la polarización de Th1 y Th2, o con linfocitos Th0. Entre estos agonistas deben de estar varios anticuerpos que reconozcan los epítopos adecuados, por ejemplo, que simulen la unión de 499E9 a su receptor. Alternativamente, se pueden unir a epítopos que pueden bloquear estéricamente la unión al receptor.

También pueden ser útiles los antagonistas de 499E9, tales como la forma secretada que se presenta naturalmente de 499E9 o anticuerpos de bloqueo. Estos antagonistas pueden proporcionar una vía selectiva y poderosa para modular respuestas inmunitarias en situaciones anómalas, por ejemplo, trastornos auto-inmunitarios, incluyendo artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), tiroiditis auto-inmunitaria de Hashimoto, así como respuestas inflamatorias agudas y crónicas en las cuales la activación y de los linfocitos T, la expansión y/o la memoria de los inmunológica de los linfocitos T jueguen un papel importante. Véase también Samter et al., (eds) Immunological Diseases vols. 1 y 2, Little, Brown and Co. Se puede llevar a cabo la regulación de la activación de los linfocitos T, la expansión y/o la liberación de citoquinas por la forma secretada que se presenta naturalmente de 499E9, o uno de sus antagonistas.

Además, podrían ser útiles ciertas composiciones en combinación con otros moduladores de señalización de linfocitos T. Esas otras moléculas de señalización incluyen los reactivos de TcR, CD40, CD40L, CTLA-8, CD28, SLAM, FAS y sus antagonistas respectivos.

Se conocen varios estados anómalos en cada uno de los tipos de células que muestran poseer mRNA de 499E9 mediante análisis por transferencia Northern. Véase Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn et al., Harrison's Principles of Internal Medicine. McGraw-Hill, N.Y.; y Weatherall et al., (eds.) Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Muchas otras afeccionesy enfermedades implican los linfocitos T o son mediadas por linfocitos T, y muchas de estas serán sensibles al tratamiento por un agonista o antagonista proporcionado en la presente invención. Véase, por ejemplo, Stites and Terr (eds; 1991) Basic and Clinical Immunology, Appleton and Lange, Nowalk, Connecticut y Samter et al., (eds) Immunological Diseases, Little, Brown and Co. Estos problemas deben ser susceptibles de prevención o tratamiento usando las composiciones proporcionadas en la presente invención.

Los anticuerpos de 499E9 pueden ser purificados y después administrados a un paciente, veterinario o humano. Estos reactivos pueden ser combinados para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunógenos, junto con estabilizadores, excipientes o conservantes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser filtradas de modo estéril y colocadas en formas de dosificación, tal como mediante liofilización en viales de dosificación o conservadas en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión, incluyendo formas que no sean de unión al complemento.

El cribado de fármacos usando 499E9 o sus fragmentos puede llevarse a cabo para identificar compuestos que tengan afinidad de unión a 499E9, u otros efectos biológicos relevantes en funciones de 499E9, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Después se pueden utilizar ensayos biológicos subsiguientes para determinar si el compuesto tiene actividad estimulante intrínseca o si es un bloqueador o antagonista porque bloquee la actividad del .antígeno, por ejemplo, antagonistas de muteína. Asimismo, un compuesto que tenga actividad estimulante intrínseca puede activar la .vía de la señal y es de esta manera una agonista porque estimula la actividad de 499E9. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos de bloqueo para 499E9 como antagonistas y de moléculas estimuladoras, por ejemplo, muteínas, como agonistas. Esta propuesta debe ser particularmente útil con otras variantes de especies de 499E9.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, y. otros medicamentos administrados. De esta manera, deberán ser valoradas las dosis de tratamiento, para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para la .administración in situ de estos reactivos. Los ensayos en animales de dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionarán una indicación predictiva adicional de la dosis para seres humanos. Se describen varias consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al., (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para la administración se describen en dichos textos y más adelante, por ejemplo, para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, la difusión transdérmica y otras. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en The Merck Index, Merk & Co., Rahway, New Jersey. Ordinariamente se espera que los intervalos de dosificación estén en cantidades inferiores a concentraciones de 1 mM, típicamente concentraciones inferiores a aproximadamente 10 µm, usualmente inferiores a aproximadamente 100 nM, preferiblemente inferiores a aproximadamente 10 pM (picomolar) y más preferiblemente inferiores a aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo adecuado. Las formulaciones de liberación prolongada o un aparato de liberación prolongada, se utilizaran normalmente para la administración continua o a largo plazo. Véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533.

La 499E9, sus fragmentos y anticuerpos para ella o para sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden administrarse directamente al hospedante que será tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos a proteínas portadoras, tales como ovoalbúmina o seroalbúmina, antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de dosis convencionales. Aunque es posible que el ingrediente activo sea administrado solo, se prefiere presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente al menos un ingrediente activo, como el definido anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables pare el mismo. Cada vehículo debe ser tanto farmacéutica como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y no debe ser perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa. e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualesquiera métodos conocidos en la técnica farmacéutica. Véase por ejemplo, Gilman et al., (eds.) (1990) Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman et al., (Eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, New York; y Lieberman et al., (Eds) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Decker, New York. La terapia de esta invención puede combinarse o usarse en asociación con otros agentes, por ejemplo otros moduladores de la activación de los linfocitos T, por ejemplo CD40, ligandos de CD40, CD28, CTLA-4, B7, B70, SLAM, entidades señalizadoras de linfocitos T o sus respectivos antagonistas.

Tanto la forma que existe en la naturaleza como la recombinante de las 499E9 de esta invención son particularmente útiles en kits y métodos de ensayo que son capaces de cribar compuestos con actividad de unión a las proteínas. En los últimos años se han desarrollado diversos métodos de ensayo automáticos, para permitir el cribado de decenas de miles de compuestos en un corto periodo. Véase, por ejemplo, Fodor et al., (1991) Science 251:767-773, que describe medios para analizar la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados puede ser ampliamente facilitado mediante la disponibilidad de grandes cantidades de 499E9 soluble y purificada como la proporcionada por esta invención.

Se pueden usar otros métodos pare determinar los residuos críticos en las interacciones 499E9-receptor de 499E9. Se puede realizar el análisis mutacional, por ejemplo, véase Somoza et al., (1993) J. Exptl. Med. 178:549-558, para determinar residuos específicos críticos en la interacción y/o señalización. Tanto los dominios extracelulares, implicados en la interacción homofílica, como el dominio intracelular, que proporciona interacciones son importantes en la señalización intracelular.

Por ejemplo, se pueden encontrar normalmente antagonistas .una vez que el antígeno ha sido definido estructuralmente, por ejemplo, mediante datos de la estructura terciaria. El análisis de análogos potenciales de interacción es ahora posible gracias al desarrollo de métodos de ensayo altamente automatizados que usan 499E9 purificada. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas usando técnicas de cribado descritas en la presente memoria. De particular importancia son los compuestos que se ha encontrado que tienen una afinidad de unión combinada para un espectro de moléculas de 499E9, por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especie de 499E9.

Un método para el cribado de fármacos utiliza células hospedantes eucariotas o procariotas que son transformadas establemente con moléculas de DNA recombinante que expresan una 499E9. Se pueden aislar células que expresan una 499E9 en el aislamiento de otras moléculas. Dichas células, ya sea en forma viable o fija, pueden usarse para ensayos estándares de unión de pareja de unión. Véase también, Parce et al., (1989) Science 246:243247 ; y Owicki et al., (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares.

Otra técnica pare cribado de fármacos incluye una propuesta que proporciona cribado de alta producción para compuestos que tengan afinidad de unión adecuada a una 499E9 y se describe en detalle en Geysen, Solicitud de patente internacional WO84/03564 publicada el 13 de septiembre de 1984.

Primero, se sintetizan grandes números de diferentes compuestos de ensayo constituidos por pequeños péptidos diferentes sobre un sustrato sólido, por ejemplo, pequeñas varillas de plástico o alguna otra superficie adecuada, véase Fodor et al. (1991). Después todas las varillas son hechas reaccionar con 499E9 purificada, solubilizada o no purificada solubilizada, y se lavan. La siguiente etapa incluye detectar 499E9 unida.

El diseño racional de fármacos también puede basarse en estudios estructurales de las formas moleculares de la 499E9 y otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que medien otras funciones en respuesta a la unión, u otras proteínas que interactúen normalmente con 499E9. Un medio para determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo por cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensional. Estas proporcionarán una guía en cuanto a cuales residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, Blundell and Johnson (1976) Protein Crystalloqraphy, Academic Press, New York.

IX. Kits

Los polipéptidos de la presente invención y sus productos de fusión se pueden usar en una variedad de kits y métodos de diagnóstico para detectar la presencia de otra 499E9 o pareja de unión. Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido o segmento de gen definido de 499E9 o un reactivo que reconozca al uno o al otro, por ejemplo, fragmentos o anticuerpos de 499E9.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo a una 499E9 comprenderá típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo una pareja de unión o anticuerpo que tenga afinidad de unión conocida para 499E9; una fuente de 499E9 (natural o recombinante); y un medio para separar el compuesto unido del marcado libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la molécula. Una vez que los compuestos se hayan cribado, los que tengan afinidad de unión adecuada al antígeno pueden ser evaluados en ensayos biológicos adecuados, como los muy conocidos en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas para la vía de señalización de 499E9. La disponibilidad de polipéptidos de 499E9 recombinantes también proporciona patrones bien definidos para calibrar dichos ensayos.

Un kit preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una 499E9 en una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, por ejemplo, una pareja de unión o anticuerpo, que tenga una afinidad de unión conocida para el antígeno, una fuente de antígeno (natural o recombinante) y medios para separar el compuesto unido del compuesto marcado libre, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar la 499E9. Normalmente se proporcionarán compartimentos que contienen reactivos e instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, específicos para la 499E9 o sus fragmentos son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de 499E9 y/o sus fragmentos. Dichos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos de células, fluidos corporales y además pueden implicar la detección de antígenos relacionados con el antígeno del suero o similares. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre reactivo libre y el complejo antígeno-pareja de unión) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen varios ensayos comerciales, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT), inmunoensayo de fluorescencia de sustrato marcado (SLFIA) y similares, Véanse, por ejemplo, Van Vunakis, et al. (1980) Meth Enzymol. 70:1-525; Harlow and Lane (1980) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, N.Y.; y Coligan et al. (eds.) (1993) Current Protocols in Immunology, Greene and Wiley, N.Y.

Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una 499E9, ya que pueden ser el diagnóstico de varios estados anómalos. Por ejemplo, la sobreproducción de 499E9 puede dar como resultado la producción de varias reacciones inmunológicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anómalos, particularmente en estados de células proliferantes, tales como cáncer o activación o diferenciación anómalas.

Frecuentemente, los reactivos para ensayos de diagnóstico se proporcionan en kits, para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, del protocolo y del marcador, se proporciona un anticuerpo o pareja de unión marcado o no marcado, o 499E9 marcada. Dicho anticuerpo está normalmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de señales, tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el kit contendrá también instrucciones para el uso adecuado y desecho de los contenidos después de dicho uso. Típicamente, el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proporcionan en forma de un polvo liofilizado seco, en donde los reactivos pueden ser reconstituidos en un medio acuoso proporcionando concentraciones adecuadas de reactivos para llevar a cabo el ensayo.

Muchos de los constituyentes anteriormente mencionados del cribado de fármacos y de los ensayos de diagnostico pueden usarse sin modificación o pueden modificarse de una variedad de formas. Por ejemplo, se puede lograr el marcado uniendo covalentemente o no covalentemente una porción que proporciona directamente o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, la pareja de unión, el compuesto de ensayo, 499E9, o anticuerpos para los mismos, pueden estar marcados directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcado directo incluyen grupos marcadores: marcadores radiactivos, tales como 125I, enzimas (patente de EE.UU. Nº 3.645.090), tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de EE.UU. Nº 3.940.475) capaces de monitorizar el cambio en la intensidad de la fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcado indirecto incluyen la biotinización de un constituyente seguida por la unión a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores.

También existen numerosos métodos para separar la 499E9 unida de la libre, o alternativamente el compuesto de ensayo unido del libre. La 499E9 puede ser inmovilizada sobre varias matrices seguido por lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos tales como una placa de ELISA, filtros y bolitas. Véase, por ejemplo, Coligan et al., (eds.) (1993) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Chapter 2, Greene and Wiley, N.Y. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de las partículas magnetizables de anticuerpo con fluoresceína descrito en Rattle et al. (1984) Clin, Chem. 30:1457-1461 y la separación de partículas magnéticas de anticuerpos dobles como la descrita en la patente de EE.UU. Nº 4.659.678.

Los métodos para enlazar proteínas o sus fragmentos a los diferentes marcadores han sido descritos extensamente en la bibliografía y no requieren de una descripción detallada en la presente memoria. Muchas de las técnicas incluyen el uso de grupos carboxilos activados por uso de carbodiimida o ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante la reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo o una olefina activada, tal como maleimida, para el enlace, o similares. También serán útiles en estas aplicaciones las proteínas de fusión.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención incluye el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de, una 499E9. Estas secuencias pueden usarse como sondas para detectar niveles del mensaje de 499E9 en muestras de pacientes que se sospeche que tengan un estado anómalo, por ejemplo, cáncer

o un problema de desarrollo. Puesto que el antígeno es un marcador para la activación, puede ser útil para determinar los números de linfocitos T activados para determinar, por ejemplo, cuando puede necesitarse una supresión adicional. La preparación tanto de secuencias de nucleótidos de RNA como de DNA, el marcado de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias han recibido amplia descripción y estudio en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Langer-Safer et al. (1982) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79:4381-4385; Caskey (1987) Science 236:962-967 y Wilchek et al., (1988) Anal. Biochem. 171:1-32.

Igualmente se contemplan kits de diagnóstico que también pueden analizar la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. La diagnosis o prognosis puede depender de la combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. Así, los kits pueden analizar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet et al., (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97. Se pueden usar otros kits para evaluar subconjuntos de linfocitos T.

X. Métodos para aislar sondas de unión específicas de 499E9

La proteína 499E9 debe interactuar con un receptor en base, por ejemplo, a su similitud en estructura y función con otros antígenos de superficie de células que exhiben estructura y especificidad de expresión del tipo de célula similares. Se dispone de métodos para aislar un receptor por la capacidad de preparar 499E9 purificada para programas de cribado. Las construcciones solubles o de otro tipo que usen las secuencias de 499E9 proporcionadas en la presente descripción permitirán el cribado o aislamiento de receptores específicos de 499E9. Existen muchos métodos para la clonación por expresión, ronda de cribados (panning), aislamiento por afinidad u otros medios para identificar un receptor.

EJEMPLOS

Métodos generales

Algunos de los métodos estándares se describen o referencian, por ejemplo, en Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al. Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel et al., (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, New York; Innis et al., (eds.) (1990) PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y. Los métodos para la purificación de proteínas, incluyen métodos, tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., (1987 and Periodic Supplements); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes de esta serie; y en el texto del folleto del fabricante acerca del uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J. o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos adecuados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente que pueda ser fusionado por medio de una secuencia eliminable por proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow '(ed.) Genetic Engineerinq, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe et al., (1992) OlAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Se describen técnicas de cultivo de células en: Doyle et al., (eds.) (1994) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley and Sons, N.Y.

Se describen análisis FACS en Melamed et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1998) Practical Flow Cytometry, Liss, New York, N.Y; y Robinson et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, New York, N.Y. Se llevó a cabo el marcado fluorescente de reactivos adecuados mediante métodos estándares.

EJEMPLO 1: Clonación de 499E9 de ratón

La producción de linfocitos Th1 o Th2 3W se describe en Openshaw et al., (1995) J. Exp. Med 182:1357-1367. Brevemente, se derivaron poblaciones de Th1 o Th2 de linfocitos T CD4+ estimulados con antígeno y células que presentaban antígenos en presencia de IL-12 o IL-4. Las células fueron estimuladas una vez a la semana durante 3 semanas, después se cosecharon y reestimularon, por ejemplo, con PMA e ionomicina durante 4 h. Véase, Murphy et al. (1996) J. Exp. Med. 183:901-913.

El RNA total puede ser aislado, por ejemplo, usando el procedimiento de gradiente de tiocianato de guanidina/CsCI como el descrito por Chigwin et al. (1978) Biochem. 18:5294-5299. Se aísla el RNA de Poli (A)+ usando, por ejemplo, el kit de aislamiento de mRNA de OLIGOTEX (QlAGEN). Dicho RNA de estas células se usa para sintetizar la primera cadena de cDNA, por ejemplo, usando como cebador Notl/Oligo-dT (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). El cDNA de doble cadena se sintetiza, se liga con adaptadores BstXI, se digiere con NotI, se fracciona por tamaños para > 0,5 pares de kilobases (kb) y se liga en los sitios NotI/BstXI de pJFE-14, un derivado del vector pCDSRα. Véase, Takebe et al. (1985) Mol. Cell Biol. 8:466-472. Se usan células DH10α de E. coli electrocompetentes (Gibco-BRL) para la transformación.

Clones independientes fueron escogidos al azar y cribados mediante hibridación usando un cóctel de varios cDNA de citoquinas conocidos. Se prepararon DNA plasmídicos de clones que no se hibridaban a las sondas de citoquinas. Estos clones se agruparon por tamaño de inserto y se caracterizaron adicionalmente por secuenciación de DNA. Se aislaron las clones correspondientes a 499E9.

EJEMPLO 2: Expresión celular de 499E9 de ratón

Una sonda específica para cDNA que codifica 499E9 de ratón se usa para determinar la distribución en tejidos del mensaje que codifica el antígeno. Se pueden usar sondas de hibridación estándares para realizar un análisis Northern de RNA de fuentes adecuadas, en células, por ejemplo, estimuladas o en varios estados fisiológicos, en diversos tejidos, por ejemplo, bazo, hígado, timo, pulmón, etc., o en varias especies. Los análisis Southern de genotecas de cDNA también pueden proporcionar información de distribución valiosa. Las inmunotransferencias de tejidos normales o las inmunotransferencias de especies estándares están disponibles comercialmente. Técnicas similares serán útiles pare evaluar diagnósticos de afecciones que puedan correlacionarse con la expresión en varios tipos de células.

También puede usarse análisis de PCR usando cebadores adecuados. Se puede usar análisis de anticuerpos, incluyendo inmunohistoquímica o FACS, para determinar la distribución en células o en tejidos.

EJEMPLO 3: Purificación de la proteína 499E9

Se cribar líneas de células transfectadas múltiples pare detectar una que exprese el antígeno, formas unida a membranas o solubles, a un alto nivel en comparación con otras células. Se criban varias líneas de células y se seleccionan por sus propiedades favorables en la manipulación. La 499E9 natural puede ser aislada de fuentes naturales o mediante la expresión de una célula transformada usando un vector de expresión adecuado. La purificación de la proteína expresada se logra mediante procedimientos normales, o puede combinarse con medios de ingeniería genética para una purificación eficaz de alta eficiencia a partir de lisados o líquidos sobrenadantes de células. Se pueden usar segmentos FLAG o His6 para dichas características de purificación.

EJEMPLO 4: Aislamiento de genes de 499E9 homólogos

Se puede usar el cDNA de 499E9 como una sonda de hibridación para cribar una genoteca de una fuente deseada, por ejemplo, una genoteca de cDNA de células de primate. Pueden ser cribadas muchas especies diferentes tanto para la rigurosidad necesaria para una fácil hibridación, como para la presencia usando una sonda. Se usaran condiciones de hibridación adecuadas para seleccionar clones que exhiban especificidad de hibridación cruzada.

El cribado mediante hibridación o PCR usando sondas degeneradas en base a las secuencias de péptidos también permitirá el aislamiento de clones apropiados. Alternativamente, el uso de cebadores adecuados para el cribado por PCR proporcionará el enriquecimiento de clones de ácidos nucleicos adecuados.

Métodos similares son aplicables para aislar variantes de especies polimórficas o alélicas. Las variantes de especies se aíslan usando técnicas de hibridación de especies cruzadas basadas en el aislamiento de un aislado de longitud completa o fragmento de una especie como una sonda.

Alternativamente, los anticuerpos producidos contra 499E9 de ratón se usarán para cribar células que expresen proteínas de reacción cruzada partir de por ejemplo una genoteca de cDNA adecuada. La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos estándares como los descritos anteriormente. Los péptidos sintéticos o las proteínas purificadas se presentan a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo Coligan (1991) Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; y Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Los anticuerpos resultantes se usan, por ejemplo, para cribado, ronda de cribados (panning) o clasificación.

EJEMPLO 5: Preparación de anticuerpos esecíficos para la 499E9

Péptidos sintéticos o proteínas purificadas se presentan al sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo Coligan (1991) Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; and Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Spring Harbor Press. Se puede preparar suero policlonal o hibridomas. En situaciones apropiadas, el reactivo de unión está marcado como se ha descrito anteriormente, por ejemplo por fluorescencia o de otro modo, o está inmovilizado en un sustrato para métodos de rondas de cribado (panning).

EJEMPLO 6: Aislamiento de un receptor para 499E9

Se puede usar un producto de expresión de construcción de la 499E9 como un reactivo de unión especifico para identificar su pareja de unión, por ejemplo, se usaría un receptor, aprovechando su especificidad de unión, como un anticuerpo. Un reactivo de 499E9 se marca como se describió anteriormente, por ejemplo, mediante fluorescencia o

5 de otra manera, o se inmoviliza en un sustrato para métodos de ronda de cribados (panning).

La composición de unión se usa para cribar una genoteca de expresión hecha de una línea de células que expresa una pareja de unión, es decir, un receptor. Se usan técnicas de tinción normales pare detectar o clasificar, receptores intracelulares o expresados en superficie, o se criban por rondas de cribado (panning) células transformadas que se expresan en la superficie. El cribado de la expresión intracelular se realiza por diversos métodos de tinción o por

10 inmunofluorescencia. Véase también, McMahan et al., (1991) EMBO J, 10:2821-2832

Alternativamente, se usan reactivos de 499E9 para purificar por afinidad o clasificar células que expresen un receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., o Ausubel et al.

Otra estrategia es cribar un receptor unido a una membrana mediante ronda de cribados. El cDNA que contiene el cDNA del receptor se construye como se describió anteriormente. El ligando puede ser inmovilizado y usado para 15 inmovilizar las .células de expresión. La inmovilización se puede lograr mediante el uso de anticuerpos apropiados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de 499E9, o mediante el uso de anticuerpos producidos contra los primeros anticuerpos. Los ciclos recurrentes de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones adecuados y al eventual aislamiento de clones de expresión del receptor.

Las genotecas de expresión de fagos pueden ser cribadas por 499E9. Las técnicas de marcado adecuadas, por 20 ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcado específico de clones adecuados.

LISTADO DE SECUENClAS

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ácido nucleico de 499E9 de ratón. La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoácidos de 499E9 de ratón,

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: Schering Corporation

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Antígenos de superficie de células de mamíferos; Reactivos relacionados.

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2

(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

(A)

DESTINATARIO: Schering-Plough Corporation

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

(C)

CIUDAD: Kenilworth

(D)

ESTADO: New Jersey

(E)

PAIS: EE.UU. de América

(F)

CODIGO POSTAL: 07033-0530

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete flexible.

(B)

ORDENADOR: Apple Macintosh

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Macintosh 7.5.3

(D)

PROGRAMA: Microsoft Word 6.0

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-DlC-1997

(C)

CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD; US 60/032.896

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-DIC-1996

(vii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE

(A)

NOMBRE: Thampoe, lmmac J.

(B)

NUMERO DE REGISTRO: 36,222

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: DX0686 PCT

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES.

(A)

TELEFONO: (908) 298-5061

(B)

TELEFAX: (908) 298-5388

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 2191 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

(D)

TOPOLOGIA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) LOCALIZACIÓN: 125…1072

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID. NO: 1

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 316 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido sustancialmente puro o recombinante seleccionado del grupo que consiste en:

   (a)

   el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y

   (b)

   un polipéptido de la familia de ligandos del TNF que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

2. 2.

   Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 1.

3. 3.

   Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 o la proteína de fusión de la reivindicación 2.

4. 4.

   El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 3

5. 5.

   El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 4, que codifica la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

6. 6.

   Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5..

7. 7.

   Una célula hospedante que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o el vector de la reivindicación 6.

8. 8.

   Un método para preparar un polipéptido o una proteína de fusión, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 7 en condiciones en las cuales se expresa el ácido nucleico.

9. 9.

   Un anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno, que específicamente se une a un polipéptido sustancialmente puro o recombinante seleccionado del grupo que consiste en:

   (a)

   el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y

   (b)

   un polipéptido de la familia de ligandos del TNF que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

10. 10.

    Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 o la proteína de fusión de reivindicación

11. 2.
12. 11. Un kit que comprende: a) el polipéptido de la reivindicación 1 o la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 2; b) el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 9; o c) el ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.