ES2305014T3 - Metodo automatizado para deteccion, cuantificacion y monotorizacion de hemoglobina de hemoglobina en sangre entera, plasma y suero. - Google Patents
Metodo automatizado para deteccion, cuantificacion y monotorizacion de hemoglobina de hemoglobina en sangre entera, plasma y suero. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para la determinación, cuantificación y monitorización de hemoglobina extracelular en una muestra de sangre entera, plasma o suero ejecutada sobre un analizador de hematología automatizado que tiene al menos dos canales analíticos para mediciones de hemoglobina donde la hemoglobina extracelular en la muestra es debida a la presencia de un producto de hemoglobina libre de células un sustituto de hemoglobina portador de oxígeno en la sangre y se selecciona de entre hemoglobina purificada, hemoglobina recombinante, hemoglobina entrecruzada, hemoglobina polimerizada y hemoglobina acoplada a polietilenglicol (PEG-HGB), comprendiendo el método: (a) el determinar la concentración de hemoglobina total en un alícuota de la muestra en un canal analítico de hemoglobina del analizador; (b) el determinar la concentración de hemoglobina celular en la alícuota en la muestra en un canal analítico de glóbulos rojos del analizador; y (c) calcular la diferencia entre la concentración de hemoglobina total determinada mediante el canal de hemoglobina y la concentración de hemoglobina celular determinada mediante el canal de glóbulos rojos del analizador para atender la concentración de hemoglobina en la muestra de sangre entera, plasma o suero, donde el canal analítico de hemoglobina de la etapa (a) mide la concentración total de hemoglobina en la muestra por hemolisis y extracción de los hemes de su complejo biológico con la globulina formando una especie heme férrica ligada capturable en un micelio surfactante según se determine a partir de absorbancia colorimétrica en el canal de hemoglobina del analizador, y adicionalmente donde el canal analítico de glóbulos rojos de la etapa (b) mide la concentración de glóbulos rojos, el volumen de glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina de las células de glóbulos rojos individuales a medida que pasan a través de e dos detectores de luz dispersa virtualmente una célula a la vez.
Description
Método automatizado para detección,
cuantificación y monitorización de hemoglobina en sangre entera,
plasma y suero.
Método automatizado para detección,
cuantificación y monitorización de hemoglobina exógena en sangre
entera, plasma y suero.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
solicitud de patente de los Estados Unidos de serie 60/210,625,
presentada el 9 de junio de 2000.
La presente invención se relaciona en general
con nuevos métodos para detectar, cuantificar y monitorizar
hemoglobina añadida extracelular o de manera exógena, incluyendo
sustitutos de la hemoglobina, en una muestra de sangre,
particularmente una muestra de sangre entera, así como en muestras
de plasma y suero. La presente invención se relaciona además con el
uso de analizadores de hematología automatizados para determinar y
cuantificar la concentración de hemoglobina extracelular y exógena,
incluyendo sustitutos de hemoglobina libres de células, en sangre,
plasma o suero, y es particularmente ventajoso para el uso médico
durante trauma o cirugía del paciente, así como también para
monitorizar los niveles de hemoglobina durante la recuperación.
Los sustitutos de la sangre entera han sido
buscados desde hace tiempo como alternativas a la sangre entera
para su uso en el campo médico, particularmente después de cirugías
y/o traumas, cuando se requieren transfusiones. Motivados por la
necesidad de suministrar grandes cantidades de sangre a los
militares en el campo de batalla, pero limitados por los recursos
para asegurar la seguridad del suministro de sangre frente a la
contaminación por patógenos y virus humanos, principalmente virus
de la hepatitis y VIH, los bancos de sangre abandonaron sus
programas de suministro de sangre entera al comienzo de los 80. Sin
embargo, la búsqueda por sustitutos de sangre, por ejemplo
sustitutos de sangre sintéticos, que son libres de contaminantes y
que pueden ser utilizados en el tratamiento de los pacientes, ha
continuado.
Actualmente, hay un interés renovado para
producir y/o aislar un sustituto de la sangre. Sin embargo, debido
a la complejidad de la sangre y a los diversos componentes que
comprende la sangre entera, así como a las estrictas regulaciones
federales que gobiernan la prueba y el uso de tales productos
sintéticos, la industria se ha enfocado en cuanto a sus esfuerzos
de investigación en el desarrollo de productos que liberan
temporalmente el oxígeno, en vez de en el desarrollo de una
variedad de productos que tengan otras funciones que provee la
sangre usada en una transfusión.
La hemoglobina (HGB) aislada a partir de la
sangre humana o animal, o un portador de oxígeno producido
sintéticamente, tal como él el fluorocarbono, son dos tipos de
sustitutos de la hemoglobina que están actualmente en pruebas
clínicas. Otros sustitutos de los glóbulos rojos, por ejemplo
sustitutos de la hemoglobina que portan oxígeno, también ha sido
desarrollados y caracterizados para su uso en pacientes. (Véase, por
ejemplo Red Blood Cell Substitutes, 1998, (Eds.) A.S. Rudolph, R.
Rabinovici, and G.Z. Feuerstein, Dekker, New York, New York.). Tales
sustitutos de la hemoglobina portadores de oxígeno pueden ser
utilizados en conjunción con terapias médicas estándar, tales como
productos de transfusión de sangre o sangre.
A manera de un ejemplo específico pero no
limitante, Enzon, Inc. (Piscataway, New Jersey), ha desarrollado
una hemoglobina bovina modificada con polietilenglicol (PE),
abreviada PEG-HGB. La PEG-HGB es
producida mediante un proceso en el cual cadenas de PEG son
entrecruzadas sobre las superficies de moléculas de HGB, por
ejemplo, como se describe en las patentes de los Estados Unidos
números 5,386,014 y 5,234,903 de Nho et al. Otros ejemplos
específicos no limitantes incluyen Hemopure® y Oxyglobin (biopure,
Cambride, MA).
La primera generación de sustitutos de HGB
estaba proyectada en general para tratamientos a corto plazo de
pérdidas de sangre/oxígeno durante la cirugía o después de traumas.
Una desventaja de los sustitutos de HGV es la corta vida media de
circulación atribuida a estos productos. Por ejemplo, los sustitutos
de HGB que son añadidos a la sangre tienen una vida media de
circulación de hasta 36 horas en comparación con la vida media de
circulación de hasta 30 días para la sangre por transfusión. Sin
embargo, esta vida media relativamente corta es no es típicamente
un problema serio asociado con el uso de tales sustitutos de la
sangre, porque estos productos son predominantemente indicados para
objetivos de tratamiento a corto plazo.
Para determinar si se hace o no una transfusión
a un paciente que tiene una baja concentración de hemoglobina en
sangre, el "disparador" de la transfusión está entre
aproximadamente 6 y 8 g/dL de hemoglobina en sangre entera y
depende de un cierto número de factores específicos, tales como el
estado del volumen sanguíneo, estado pulmonar, cardíaco y
cerebrovascular, cronicidad o severidad de la anemia, síntomas del
paciente relativos a la pérdida de sangre, pérdida de sangre
esperada para un procedimiento particular, riesgo de resangrado a
partir de la cirugía, pacientes de alto riesgo (por ejemplo los
ancianos), y trombocitopenia.
\newpage
En general, la medición de la hemoglobina en
muestras de sangre entera se lleva a cabo mediante analizadores de
hematología automatizados disponibles comercialmente. Hasta la
fecha, con la excepción de ciertos analizadores de hematología,
tales como los disponibles de Bayer Corporation, por ejemplo el
analizador de hematología ADVIA 120®, otros analizadores de sangre
comercialmente disponibles son capaces de medir solamente la
hemoglobina total, la que incluye no solamente la hemoglobina
añadida de manera exógena, sino también la hemoglobina intracelular
que es derivada de los glóbulos rojos en la muestra de sangre. La
presente invención proporciona la capacidad de determinar y medir
la hemoglobina exógena en una muestra de sangre entera, plasma o
suero de una manera confiable, reproducible y automatizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un objeto de la presente invención proveer
métodos para detectar, cuantificar y monitorizar específica y
exactamente diferentes tipos de hemoglobina en una muestra de
sangre, plasma o suero, preferiblemente una muestra de sangre
entera, bajo análisis, por ejemplo (i) hemoglobina derivada de
glóbulos rojos (esto es, hemoglobina intracelular, o hemoglobina
celular, según se usa aquí); (ii) hemoglobina extracelular, o un
producto o sustituto de hemoglobina, particularmente un derivado de
hemoglobina libre de células, por ejemplo de
PEG-HGB, una forma sintética de hemoglobina, por
ejemplo Hemopure® (Biopure, Cambridge, MA); Oxyglobin (Biopure,
Cambridge, MA),, la cual ha sido tras fusionada hace un paciente que
requiere de HGB añadida, o añadida de alguna otra forma a una
muestra de sangre, plasma o suero (por ejemplo de hemoglobina
exógena); y (iii) hemoglobina total (esto es, la combinación de
hemoglobina intracelular y exógena).
Es otro objeto de la presente invención proveer
la capacidad para monitorizar, durante el transcurso o régimen de
tratamiento, hemoglobina o un producto de hemoglobina, derivado o
sustituto de la misma, tal como un derivado de hemoglobina libre de
células, que haya sido añadido a la sangre de un paciente o de un
individuo que así lo requiera. También, de acuerdo con la presente
invención, la hemoglobina o un producto, derivado o sustituto de la
hemoglobina, tal como un derivado de hemoglobina libre de células,
puede ser monitorizado, determinado o cuantificado como hemoglobina
exógena en sangre, plasma o suero de un paciente, después de que el
paciente ha recibido la transfusión con tal producto de hemoglobina,
o una sustancia que contiene el producto (por ejemplo una solución
o composición fisiológicamente estable, y similares).
Es aun otro objeto en la presente invención
proveer un método para diferenciar y medir exactamente la
contribución de un producto de hemoglobina exógena o sustituto de
sangre añadida o exógena, por ejemplo de PEG-HGB,
separada y distintamente de la contribución de la HGB celular que
se deriva de los glóbulos rojos de un paciente. De acuerdo con la
presente invención, el método analítico automatizado según se
describe calcula una concentración específica de la hemoglobina
extracelular en una muestra de sangre de la que se ha hecho
transfusión con un producto de hemoglobina, o en una muestra de
sangre, plasma o suero que contienen hemoglobina extracelular que
va a ser detectada. Así, la invención permite la detección y
monitorización de un componente de hemoglobina extracelular, aún en
la presencia de un componente de hemoglobina celular derivado de los
glóbulos rojos en una muestra dada. Además, a través del presente
método, son detectables hasta aproximadamente 0. 5 g/dL de
hemoglobina en un total de aproximadamente 6. 0 g/dL de hemoglobina
extracelular se llevaron a cabo experimentos en el rango de
concentración de HGB que es relevante para las transfusiones, por
ejemplo un punto de decisión de aproximadamente 6-7
g/dL de la HGB total en sangre. Además, la hemoglobina fue
recuperable y cuantifica en muestras de sangre de más de 24 horas, y
que había sido almacenada temperaturas de 2ºC hasta 8ºC.
Objetivos y ventajas adicionales permitidos por
la presente invención serán evidentes a partir de la descripción
detallada que sigue a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un método de
acuerdo con la reivindicación 1 para detectar y cuantificar
específica y exactamente diferentes tipos de hemoglobina en una
muestra de sangre entera, plasma o suero. Los analizadores de
hematología automatizados producidos por Bayer Corporation, el
titular de la presente, se ha encontrado que son capaces de
determinar directamente y medir la concentración de hemoglobina
exógena, esto es extracelular, en una muestra. Instrumentos
adecuados para llevar a cabo los análisis de la presente invención
poseen dos canales analíticos que miden la concentración de la
hemoglobina en una muestra de sangre específicamente, y a manera de
ejemplo, la serie Bayer H*^{TM} de instrumentos analizadores de
hematología y la serie Bayer ADVIA® de sistemas de instrumentos
analizadores de hematología (por ejemplo, (e.g. ADVIA 120®), así
como los analizadores de hematología con diseño o función similares,
tienen la capacidad de llevar a cabo análisis cuantitativos del
contenido de hemoglobina en sangre plasma y suero que contengan
hemoglobina exógena.
Otros analizadores de sangre disponibles en el
mercado miden actualmente sólo la hemoglobina total (esto es la
combinación de la HGB celular y la HGB extracelular añadidas de
manera exógena) en una muestra de sangre. Sin embargo, instrumentos
de hematología automatizados para su uso en la presente invención,
por ejemplo los analizadores de hematología de Bayer antes
mencionados, son capaces de determinar de manera separada e
independiente la HGB celular (reportada como "HGB calculada"),
así como la hemoglobina total (reportada como "HGB") en una
muestra de sangre entera. Hasta la fecha, los analizadores de
hematología disponibles actualmente no pueden detectar
simultáneamente la hemoglobina celular y la hemoglobina no celular,
es decir la hemoglobina añadida de manera exógena, en una muestra
de sangre entera, plasma o suero, y por lo tanto, no pueden reportar
los valores separados para estas mediciones.
Además, la monitorización del progreso de los
pacientes en aquellos pacientes que han recibido hemoglobina
exógena, por ejemplo PEG-HGB, un sustituto de la
hemoglobina libre de células portador de oxígeno, tal como
Hemopure® u Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA), a través de
transfusiones, por ejemplo, no es posible con otros analizadores
disponibles comercialmente, puesto que estos analizadores no son
capaces de distinguir entre la hemoglobina aportada por el
sustituto de HGB provisto de manera exógena y la hemoglobina
provista por los glóbulos rojos en una muestra de sangre entera,
particularmente en los casos de pérdida aguda de sangre o
autolisis.
En contraste con los analizadores sanguíneos
utilizados en la actualidad, los analizadores automatizados y los
métodos de acuerdo con la presente invención pueden diferenciar y
medir con exactitud la contribución del sustituto de HGB exógeno
separadamente indistintamente de la contribución del HGB celular
derivado de los glóbulos rojos como se describe aquí, los
analizadores automatizados calculan una concentración específica de
la hemoglobina extracelular en una muestra de sangre entera, plasma
o suero de la que se ha hecho transfusión con un producto de
hemoglobina, permitiendo por lo tanto la detección y monitorización
de la hemoglobina exógena en ausencia de componentes de la
hemoglobina celular derivada de los glóbulos rojos en una muestra
dada. Además, los analizadores descritos aquí proveen valores de
hemoglobina celular y total para una muestra de sangre que contiene
un producto de hemoglobina añadida.
La presente invención es particularmente
ventajosa porque se ha desarrollado cierto número de derivados de
hemoglobina libres de células para su uso en lugar de la sangre
entera, especialmente en casos de trauma. Así la presente invención
provee un método viable para la determinación, medición y
monitorización de los niveles de tales productos de hemoglobina en
sangre, plasma o suero cuando tales productos han sido añadidos de
manera exógena a la sangre, introducidos (por ejemplo por
transfusión) en pacientes como sustitutos para la sangre
entera.
Será evidente que el método de la presente
invención abarca el análisis de muestras de sangre, preferiblemente
muestras de sangre entera, así como muestras de plasma y suero, de
pacientes que han recibido sustitutos de glóbulos rojos libres de
células, por ejemplo que tienen productos sustitutos de hemoglobina
añadidos o portadores de oxígeno en su sangre, por una variedad de
razones médicas. Se ha evidente además que hay un cierto número de
sustitutos de glóbulos rojos libres de células basados en la
hemoglobina que puede ser añadidos a la sangre, o utilizados como
sustitutos de la sangre, para tratar pacientes que requieren tales
sustitutos de los glóbulos rojos o de la sangre portadores de
oxígeno, para diversas terapias y condiciones de tratamiento, tales
como transfusión, restauración del volumen sanguíneo, tratamiento
de pérdida aguda de sangre, cirugía, choques (por ejemplo choques
hemorrágicos, u oxigenación de tumores, por ejemplo.
Ejemplos no limitantes de sustitutos de los
glóbulos rojos libres de células basados en hemoglobina, o
sustitutos portadores de oxígeno, que pueden ser determinados,
medidos y/o monitorizados en muestras de sangre entera, plasma o
suero de acuerdo con los métodos presentes, particularmente
productos de hemoglobina humana químicamente entrecruzados (e.g.
D.J. Nelson, 1998, "HemAssist: Development and Clinical
profile", En: red Blood Cell Substitutes, 1998, (Eds.) A.S.
Rudolph, R. Rabinovici, and G.Z. Feuerstein, Dekker, New York, New
York, pp. 353-400; J. Adamson et al., 1998,
Ibid., pp. 335-351; and T.M.S. Chang, 1998, Ibid.,
pp. 465-473); productos de hemoglobina
recombinante, particularmente hemoglobina humana recombinante (e.g.
J.H. Siegel et al., 1998, Ibid., pp. 119-164
y J.W. Freytag and D. Templeton, 1998, Ibid., pp.
222-325) o hemoglobina de bovinos recombinante;
productos de hemoglobina animal purificados preferiblemente
ultrapurificados, por ejemplo hemoglobina bovina ultrapurificada y
hemoglobina humana ultrapurificada; y productos portadoresl de
oxígeno de origen animal, por ejemplo productos portadores de
oxígeno basados en hemoglobina bovina (HBOC), por ejemplo
"Hemopure®" y Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA); (W.R. Light
et al., 1998, Ibid., pp. 421-436; T. Standl
et al., 1998, Br. J. Anaesth., 80(2):
189-194; y Palaparthy et al., 2000, Adv. Drug
Delivery Reviews, 40:185-198). Los productos de
hemoglobina purificada o ultrapurificada son libres de células y
pueden ser entrecruzados o pulverizados, por ejemplo Hemopure® y
Ozyglobin (biopure, Cambridge, MA).
El uso de analizadores de hematología
automatizados en los métodos de acuerdo con la presente invención
provee ventajas adicionales, que se describen aquí y se demuestra
mediante los ejemplos que se presentan más abajo. Más
específicamente, y a manera de ejemplo, el uso de analizadores
automatizados de hematología de acuerdo con esta invención permite
la detección y medición de PEG-HGB extracelular (o
no derivado de células) PEG-HGB (e.g. \geq0.2 a
5.6 g/dL de sangre) que se añade a muestras de sangre entera
anticoagulada. La recuperación de PEG-HGB es lineal
(e.g. >0.2 a 5.6 g/dL de sangre) cuando se adiciona a plasma o
muestras de sangre entera. También la PEG-HGB es
recuperable en muestras de 24 horas que ha sido almacenadas a
2-8ºC. Además, los productos de hemoglobina bovina
Hemopure (Biopure, Cambridge, MA) y Oxyglobin han sido añadidos a
muestras de sangre entera y plasma y detectados de manera exacta
así como sustitutos de la sangre portadores de oxígeno de acuerdo
con los métodos de la presente invención (ejemplos 5 y 6).
El componente PEG-HGB añadido en
una muestra de sangre se obtiene determinando la diferencia entre el
PEG-HGB total (calculado a partir de la absorbancia
colorimétrica en el canal de la hemoglobina del analizador de
hemoglobina) y la PEG-HGB celular calculada
(derivada del citograma de glóbulos rojos (RBC) en el canal de
glóbulos rojos del analizador de hematología) lo que se calcula
mediante la fórmula (RBC x MCV x CHCM/1000) donde MCV significa del
volumen celular y CHCM es la Concentración Media de Hemoglobina
Celular, la cual mide la misma propiedad celular como MCHC, o
Concentración Media de Hemoglobina Celular, en sangre no lisada. El
valor CHCM es obtenido a partir del canal de glóbulos rojos del
analizador de hematología tal como el sistema ADVIA 120®.
El particular, el CHCM se obtiene a partir de
mediciones de dispersión de la luz de acuerdo con la Teoría de Mie
(véase Tycko et al., 1985, Appl. Opticsm
24:1355-1365, y la patente de los EEUU No. 4,736,504
de Tycko). En contraste, el MCHC se obtiene dividiendo la
PEG-HGB total por el producto (MCV x RCB. Hablando
de manera práctica, MCHC no es exactamente igual a CHCM para una
muestra de sangre normal pero estos valores preferiblemente
concuerdan de manera cercana. Por ejemplo el valor MCHC asociado con
el componente de hemoglobina añadida está preferiblemente dentro de
un rango de aproximadamente 0-5 g/dL de sangre, mas
preferiblemente entre aproximadamente 0.2 g/dL de sangre, del valor
CHCM La diferencia entre la hemoglobina total y la hemoglobina
intracelular se denomina "HGB Delta" ("HGB\Delta") y
representa la concentración de hemoglobina añadida de manera
exógena, por ejemplo PEG-HGB en una muestra de
sangre.
Una explicación relacionada con la ya mencionada
falta de igualdad completa entre los valores MCHC y CHCM es como
sigue. Después de una comida típica, por ejemplo no es infrecuente
que el plasma sanguíneo desarrolle un pequeño grado de lipemia (es
decir, una suspensión de pequeñas partículas submicroscópicas y
microscópicas de lípidos, llamados quilomicrones). La presencia de
las partículas causa que una menor cantidad de la luz sea
dispersada, disminuyendo por tanto la cantidad de luz trasmitida a
través de la solución de hemoglobina en un hemoglobinómetro.
Consecuentemente, la solución parece contener ligeramente más
hemoglobina de la que realmente tiene. Las mediciones célula a
célula de la concentración de hemoglobina llevadas a cabo en el
ADVIA 120® son libres de este error. El ADVIA 120® se calibró de
tal manera que si \DeltaHGB es mayor de 1.9 g/dL, una muestra es
catalogada como normal; esto es un grado de lipemia en exceso de
esta cantidad es considerado anormal. También si parte de la muestra
de sangre ha sufrido hemolisis, bien in vivo en el paciente o
en el tubo de recolección, se produce también un valor \BoxHGB.
Las dos mediciones de HGB mediante la analizador ADVIA 120® alertan
al médico o al clínico de la existencia de cualquier lipidemia o
hemolisis anormal en una muestra de paciente.
Hasta la presente invención ningún otro
analizador de hematología automatizado disponible comercialmente era
capaz de detectar de manera simultánea la hemoglobina intracelular
(o celular) (HGB calculada) y la HGB extracelular ("HGB
Calculada") en una muestra de sangre entera. De acuerdo con ello,
la presente invención provee la capacidad para monitorizar
sustitutos de hemoglobina añadidos a la sangre determinando la
cantidad de hemoglobina añadida independientemente de la
hemoglobina aportada por el componente de glóbulos rojos de la
sangre. Para muestras normales no sometidas a lisis y para muestras
anormales de sangre, con un sistema apropiadamente calibrado, HGB
Delta es igual a cero.
De acuerdo con una modalidad de la presente
invención, los analizadores de hematología adecuados para su uso en
la presente invención por ejemplo la serie Bayer ADVIA 120® y el
sistema Bayer H*^{TM} de analizadores de hematología, son capaces
de medir de manera directa la concentración de hemoglobina
extracelular exógena puesto que estos instrumentos poseen dos
canales analíticos o de detección, cada uno de los cuales mide un
tipo diferente de concentración de hemoglobina en una muestra de
sangre entera o plasma.
En tales instrumentos, uno de los canales
analíticos o de detección es el canal de hemoglobina (HGB) que mide
la concentración de la hemoglobina total en la sangre por medio de
hemolisis y extracción de los hemes de sus complejos biológicos con
la globulina, formando una especie de heme férrico ligado, la cual
es capturada en un micelio surfactante y medida
espectrofotométricamente (véase, por ejemplo la patente de los EEUU
No. 5,858,794 de M. Malin; M. Malin et al., 1992, Anal.
Chim. Acta., 262:67-77; y M. Malin et al.,
1989, Am. J. Clin. Path., 92:286-294). El segundo
canal analítico o de detección de tal instrumento es el canal de
glóbulos rojos (RBC) y de la concentración de glóbulo rojos y el
volumen celular medio (MCV) y la concentración media de hemoglobina
(MCHC) de aproximadamente 10000 eritrocitos individuales a medida
que pasan a través de los dos detectores de luz dispersa.
La presencia y diseño de analizadores de
hematología que tienen tanto el canal HGB como el canal RBC, junto
con los dos detectores de luz dispersa que detectan la luz
dispersada sobre una muestra de sangre en base célula a célula que
contiene RBCs pasa a través del canal óptico RBC, permitiendo
diferenciar entre la hemoglobina intracelular y la hemoglobina
extracelular para ser determinadas y calculadas, proporcionando así
el rendimiento del método descrito. Para una descripción de los
mecanismos ópticos de los analizadores automatizados adecuados que
son capaces de llevar a cabo el método de la presente invención,
véase Kim and Ornstein, 1983, Cytometry, 3:419-427;
Patente de los EEUU No. 4,412,004 de Omstein y Kim; Tycko et
al., 1985, Appl. Optics, 24:1355-1365; Patente
de los EEUU No. 4,735,504 de Tycko; y Mohandas et al., 1986,
Blood, 68:506-513.
A manera de un ejemplo específico pero no
limitante, el analizador de hematología Bayer ADVIA 120® es capaz
de calcular la diferencia ("HGB Delta", o "HGB\Delta")
entre las concentraciones total e intracelular HGB (las
concentraciones de HGB están en gramos por decilitro, g/dL, de
sangre entera) crema como sigue:
HGB\Delta,
g/dL = HGB \ Total, g/dL_{\ Canal \ HGB} - HGB \ Intracelular,
g/dL_{\ Canal \ de \ glóbulos \
rojos}
En la ecuación anterior HGB\Delta representa
la concentración de la HGB extracelular en la muestra de sangre,
plasma o sueroB bajo condiciones ordinarias, HGB (HGB\Delta) =
0.
Así, de acuerdo con la presente invención la
hemoglobina total se mide y se monitoriza utilizando el canal HGB
del instrumento de hematología, mientras que el canal RBC detecta
solamente la HGB intracelular contenida en los glóbulos rojos de
una muestra de sangre. Estas dos mediciones son restadas para
producir HGB Delta, que representa la HGB extracelular.
En un sistema que podría ser utilizado para la
presente invención, HGB Delta se introdujo como un parámetro de
lectura con el fin de proveer una revisión de los resultados de HGB
obtenidos en el canal de HGB con ciertos tipos de muestras de
sangre anormales o patológicas, incluyendo muestras de sangre
lipémicas e ictéricas y muestras que tienen recuentos elevados de
glóbulos blancos. Tales muestras de sangre anormales o patológicas,
incluyendo muestras de sangre lipémicas e ictéricas y muestras que
tienen elevados conteos de glóbulos blancos. Tales muestras de
sangre anormales han mostrado producir resultados de HGB elevados
artificialmente en el canal del H*^{TM} System HGB (véase, M.
Malin et al., 1989, Am. J. Clin. Path.,
92:286-294). Por ejemplo, ciertas muestras de
sangre dispersan la luz, y tales interferencias de luz dispersa
producen alguna parte de la luz que no es detectada. Esta
interferencia de luz dispersa produce un aparente incremento, o
elevación artificial, en la luz absorbida, u en el valor de
absorbancia de la muestra debido a que puede obtenerse una
concentración de HGB a partir del canal de glóbulos rojos de un
analizador de hematología (Tycko et al., 1985, Appl. Optics,
(24:1355-1365), HGB\Delta (o HGB Delta) fue
encontrado de manera novedosa por los presentes inventores como
capaz de ser introducida como un parámetro de lectura para el
analizador, donde el valor de la hemoglobina intracelular derivado
a partir del canal de los glóbulos rojos del analizador era restado
del valor para la hemoglobina total derivada del canal de
hemoglobina del analizador con el fin de producir el valor de HGB
Delta (g/dL en sangre).
El presente método de medición y terminación de
la concentración de HGB intracelular versus la extracelular o
añadida de manera exógena en una muestra de sangre entera, así como
la concentración total de HGB, puede ser usado y desarrollado en
cualquiera de los instrumentos analizadores de hematología
disponibles comercialmente Bayer H*^{TM} System o ADVIA 120®. Sin
embargo será entendido por los expertos en la materia pertinente
que otros instrumentos de hematología que tengan un sistema de canal
para la medición de la concentración de HGB en sangre pueden ser
diseña-
dos para llevar a cabo el método de determinación y monitorización de concentración de HGB como se describe aquí.
dos para llevar a cabo el método de determinación y monitorización de concentración de HGB como se describe aquí.
También abarca el presente método una serie o
combinación de analizadores de hematología que están diseñados y/o
programados para operar sobre la base de un sistema de análisis de
hemoglobina de dos canales.
Así, la presente invención proporciona un método
para determinar y monitorizar de manera directa la concentración de
hemoglobina extracelular en una muestra de sangre, preferiblemente
una muestra de sangre entera, y se lleva a cabo sobre un analizador
de hematología automatizado, que tiene preferiblemente dos canales
analíticos para la medición de la hemoglobina. El método involucra
la determinación de la concentración de hemoglobina total de una
alícuota de la muestra de sangre alícuota en el analizador, es
adecuado para determinar, detectar y/o medir la hemoglobina por
medio del presente método, concentraciones de hemoglobina total de
aproximadamente 0.5-1 g/dL, o
1.1 g/dL, hasta aproximadamente 25 g/dL of blood, preferiblemente aproximadamente 1 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL, más preferiblemente aproximadamente 2 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL of blood, and most preferiblemente, aproximadamente 6 g/dL hasta aproximadamente 22 g/dL pueden ser determinadas en una muestra de sangre, plasma o suero, o alícuota de los mismos. Como será evidente al practicante experto en la técnica que un valor de hemoglobina normal está en el rango de aproximadamente 11-18 g/dL de sangre. Para mujeres, el rango normal de hemoglobina es de 11-10 6 g/dL de sangre; para varones, el rango normal de hemoglobina es aproximadamente 13-18 g/dL de sangre, y para recién nacidos el rango normal de hemoglobina es aproximadamente 16-20 g/dL de sangre (Fundamentals of Clinical Chemistry, Eds. N. Tietz, W. B. Saunders Co., 1960, P. 944). También a manera de ejemplo, un individuo anémico típicamente tendrá con probabilidad un valor de hemoglobina en el rango de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 g/dL.
1.1 g/dL, hasta aproximadamente 25 g/dL of blood, preferiblemente aproximadamente 1 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL, más preferiblemente aproximadamente 2 g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL of blood, and most preferiblemente, aproximadamente 6 g/dL hasta aproximadamente 22 g/dL pueden ser determinadas en una muestra de sangre, plasma o suero, o alícuota de los mismos. Como será evidente al practicante experto en la técnica que un valor de hemoglobina normal está en el rango de aproximadamente 11-18 g/dL de sangre. Para mujeres, el rango normal de hemoglobina es de 11-10 6 g/dL de sangre; para varones, el rango normal de hemoglobina es aproximadamente 13-18 g/dL de sangre, y para recién nacidos el rango normal de hemoglobina es aproximadamente 16-20 g/dL de sangre (Fundamentals of Clinical Chemistry, Eds. N. Tietz, W. B. Saunders Co., 1960, P. 944). También a manera de ejemplo, un individuo anémico típicamente tendrá con probabilidad un valor de hemoglobina en el rango de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 12 g/dL.
El método involucra adicionalmente la
determinación de la concentración intracelular de la alícuota de la
muestra de sangre en un canal del analizador que sea adecuado para
determinar, detectar y/o medir los glóbulos rojos. Las cantidades
de hemoglobina intracelular que pueden ser determinadas y medidas
por medio del presente método incluyen concentraciones de HGB desde
aproximadamente 0.5-1 g/dL, o 1.1 g/dL, hasta
aproximadamente 25 g/dL de sangre, preferiblemente aproximadamente 1
g/dL hasta aproximadamente 25 g/dL, más preferiblemente
aproximadamente
4 g/dL hasta aproximadamente 24 g/dL de sangre y lo más preferiblemente, aproximadamente 5 g/dL hasta aproximadamente 23 g/dL de sangre. Un rango más preferido de concentraciones de HGB para la detección es aproximadamente 6 g/dL hasta aproximadamente 18 g/dL de sangre. Una concentración de hemoglobina total crítica que puede ser medida por el método de esta invención es aproximadamente 6 g/dL, más preferiblemente 5.6 g/dL, y son concentraciones de hemoglobina que son relevantes para las transfusiones, donde el punto de decisión para realizar una transfusión a un paciente es aproximadamente 6-7 g/dL de hemoglobina.
4 g/dL hasta aproximadamente 24 g/dL de sangre y lo más preferiblemente, aproximadamente 5 g/dL hasta aproximadamente 23 g/dL de sangre. Un rango más preferido de concentraciones de HGB para la detección es aproximadamente 6 g/dL hasta aproximadamente 18 g/dL de sangre. Una concentración de hemoglobina total crítica que puede ser medida por el método de esta invención es aproximadamente 6 g/dL, más preferiblemente 5.6 g/dL, y son concentraciones de hemoglobina que son relevantes para las transfusiones, donde el punto de decisión para realizar una transfusión a un paciente es aproximadamente 6-7 g/dL de hemoglobina.
Cuando las concentraciones de hemoglobina total
e intracelular han sido determinadas, estos valores son utilizados
para calcular la diferencia entre las concentraciones de hemoglobina
total e intracelular de manera que se llega al valor para la
concentración de la hemoglobina extracelular de la muestra de
sangre, un valor que es calculado automáticamente por el analizador
de hematología. De acuerdo con la presente invención el canal de
glóbulos rojos del analizador de hematología mide la concentración
de hemoglobina en la sangre entera como sigue:
[HGB]_{Sangre, \
Canal \ Glóbulos \ Rojos/Intracelular} \ (g/dL) = [CHCM (g/dL) \ x \
RBC \ Recuento \ (células/mm^{3}) \ x MCV \
(femtolitros/célula)/1000]
El canal HGB mide esa concentración total de
hemoglobina, esto es
[HGB]_{Intracelular}
+
[HGB]_{Extracelular}
De acuerdo con el método descrito el analizador
de hematología automatizado ADVIA® 120 calcula la diferencia entre
la concentración de HGB total y la concentración de HGB intracelular
para producir el HGB Delta, el cual corresponde a la concentración
de HGB extracelular o exógena.
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Los siguientes ejemplos son incluidos aquí con
el propósito de ilustrar y ejemplificar los diversos aspectos de
discusión de la presente invención y no pretenden limitar la
invención de manera alguna.
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PEG-HGB (Enzon, Inc.,
Piscataway, N.J.) fue recibida congelada y almacenada congelada en
el congelador. La bolsa congelada fue descongelada antes de su uso
y transferida en 6 tubos de ensayo de polipropileno de 50 ml. Tres
tubos de ensayo fueron congelados para uso posterior; los otros dos
tubos fueron almacenados en el refrigerador. Una alícuota apropiada
para cada experimento fue sometida a decantación en un tubo de
ensayo y se permitió que se equilibrara a la temperatura ambiente
antes de su uso.
El experimento descrito aquí fue llevado a cabo
en un instrumento analizador de hematología automatizado ADVIA 120®
((Bayer Corporation). El canal de hemoglobina de este instrumento
utiliza un reactivo para la hemoglobina que contiene cianuro, tal
como se describe en la patente de los Estados Unidos número
5,858,794 de D. Zelmanovic et al. y la Serie EEUU No.
08/884,595, presentada el 27 de junio de 1997 a D. Zelmanovic et
al.)
Para calibrar el sistema de hematología ADVIA
120®, el material de calibración (calibrador ADVIA 120®
Setpoint^{TM}) fue aspirado 10 veces y luego se determinó el valor medio de HGB. El factor del sistema calibrador fue definido entonces de tal manera que el valor medio del calibrador correspondiera con el valor de la etiqueta para la HGB del calibrador (g/dL). Para estimar la precisión del canal de HGB se aspiró veinte veces una muestra de sangre entera recientemente extraída y la media y la desviación estándar (SD) fueron calculadas. Una precisión aceptable fue como sigue: SD < 0.11 g/dL.
Setpoint^{TM}) fue aspirado 10 veces y luego se determinó el valor medio de HGB. El factor del sistema calibrador fue definido entonces de tal manera que el valor medio del calibrador correspondiera con el valor de la etiqueta para la HGB del calibrador (g/dL). Para estimar la precisión del canal de HGB se aspiró veinte veces una muestra de sangre entera recientemente extraída y la media y la desviación estándar (SD) fueron calculadas. Una precisión aceptable fue como sigue: SD < 0.11 g/dL.
Las muestras de sangre obtenidas a partir de
voluntarios normales fueran sometidas a anticoagulación,
preferiblemente utilizando K\cdot EDTA (\equiv12.15
mg/tubo).
La mayor parte de los experimentos descritos en
los ejemplos aquí fueron llevados a cabo a niveles de concentración
de HGB de aproximadamente 6 g/dL, dado que PEG-HGB
(Enzon, Inc.) se reporta con un contenido de 6 g/dL de hemoglobina
bovina. El valor de HGB recuperada fue 5.4 \pm 2 g/dL, que se
correlaciona apropiadamente con el valor nominal de 6 g/dL de la
sangre. Además, en todo los ejemplos utilizando un analizador de
hematología de Bayer Corporation, la precisión en hemoglobina del
instrumento fue revisada antes de su calibración aspirando dos
veces PEG-HGB a antes de cada experimento.
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Para determinar la recuperación de hemoglobina
añadida en una muestra de plasma, el experimento descrito del
ejemplo 2 fue llevado a cabo. En este experimento se añadieron
volúmenes variables de PEG hemoglobina (Enzon, Inc.) al plasma, el
cual fue analizado en un Bayer ADVIA 120® de manera que se
estableció la variación de la PEG-HGB exógena en el
plasma.
Diez tubos que contenían alícuotas de una
muestra de sangre normal recolectada en ácido
etilendiaminotetraacético, EDTA (sangre entera EDTA normal) se
sometieron a centrifugación a 750 x g. El plasma fue retirado y
luego se sometió a centrifugación de nuevo para producir plasma
libre de células. A cada uno de siete tubos se añadieron las
cantidades de plasma y PEG-HGB según se indica en la
Tabla 1 para producir un volumen final de 4.0 mL. Cada tubo fue
aspirado 4 veces para determinar valores replicados.
Los cuatro valores replicados de HGB fueron
promediados y la diferencia porcentual entre los resultados
esperados y los observados fue calculada (véase Tabla 1).
Los resultados de experimentos de replicación
muestran que la hemoglobina añadida de manera exógena, esto es,
EG-HGB (Enzon, Inc.), fue detectada a partir del
canal de hemoglobina y no a partir del canal RBC del instrumento
analizador de hematología automatizado, con base en el perfil
obtenido (Tabla 1). Esto es consistente con la presencia de
PEG-HGB enteramente como hemoglobina extracelular.
Además, la recuperación fue lineal de acuerdo con el diseño
experimental. Todos los niveles de HGB coincidieron con las
especificaciones de linealidad de 0.2 g/dL o 2% de los valores
esperados.
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En el ejemplo, se llevaron a cabo los
experimentos en los cuales una concentración constante de
hemoglobina fue añadida a una matriz de sangre entera en la cual la
hemoglobina total era variada, tal como se midió a partir del canal
HGB del analizador de hematología.
Diez tubos de sangre entera normal EDTA se
sometió a centrifugación a 750 x g. Se retiró el plasma libre de
células y se reunieron los glóbulos rojos. Se retiró una alícuota de
glóbulos rojos y se añadió plasma de manera que la concentración
total de hemoglobina fuera 10 g/dL, esto es, aproximadamente 6 ml es
glóbulos rojos empacados más
14 ml de plasma). El volumen total de la alícuota de 10 g/dL requerido fue 15 ml. A cada uno de seis tubos se añadieron la alícuota de 10 g/dL y el plasma libre de células en las cantidades mostradas en la Tabla 3 para producir valores de hemoglobina (HGB) de 6.0, 5.0, 4.0, 3.0, 2.0 y 1.0 g/dL..
14 ml de plasma). El volumen total de la alícuota de 10 g/dL requerido fue 15 ml. A cada uno de seis tubos se añadieron la alícuota de 10 g/dL y el plasma libre de células en las cantidades mostradas en la Tabla 3 para producir valores de hemoglobina (HGB) de 6.0, 5.0, 4.0, 3.0, 2.0 y 1.0 g/dL..
Dos mililitros de las muestras "A" de la
Tabla 2 fueron diluidos con 2 ml de PEG-HGB. Dado
que un volumen igual de PEG-HGB fue añadido a un
volumen igual de cada alícuota (i.e. 6.0 g/dL, 5.0 g/dL, 4.0 g/dL,
3.0 g/dL,
2.0 g/dL y 1.0 g/dL), tanto la HGB celular como la HGB extracelular de cada alícuota fueron reducidas en un 50%. La PEG-HGB, que sin diluir está a una concentración de 5. 6 g/dL, fue reducida a 2.8 g/dL en cada alícuota. La HGB total fue igual a la suma de la PEG-HGB extracelular más la HGB celular. Cada tubo fue aspirado 5 veces para obtener resultados replicados.
2.0 g/dL y 1.0 g/dL), tanto la HGB celular como la HGB extracelular de cada alícuota fueron reducidas en un 50%. La PEG-HGB, que sin diluir está a una concentración de 5. 6 g/dL, fue reducida a 2.8 g/dL en cada alícuota. La HGB total fue igual a la suma de la PEG-HGB extracelular más la HGB celular. Cada tubo fue aspirado 5 veces para obtener resultados replicados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados presentados en la Tabla 3 en este
ejemplo muestran que cuando una concentración constante de
PEG-HGB extracelular se añade a una matriz de sangre
entera en la cual la concentración de HGB intracelular varía, hay
una recuperación aceptable tanto de PEG-HGB
extracelular como de HGB celular. Los resultados en la Tabla 3
indican que la cantidad de PEG-HGB fue recuperable y
medible en el instrumento Bayer ADVIA 120® cuando se añadía
PEG-HGB a muestras de sangre entera con baja HGB
celular. A la vista del rendimiento aceptable del presente método
para la recuperación de valores de HGB exógena, así como HGB
celular, en muestras de sangre humana complementada con
PEG-HGB, el método proporciona una aplicabilidad
similar para su uso con muestras de sangre, plasma o suero de
pacientes que han recibido transfusión, especialmente muestras de
sangre entera, que contienen derivados de HGB libres de células o
sustitutos de HGB portadores de oxígeno, como se describió
anteriormente.
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Este ejemplo presenta datos que muestran la
estabilidad de la PEG-HGB añadida de manera exógena
a muestras de sangre entera. Las muestras fueron preparadas por la
adición de volúmenes variables de sangre entera (6.0 g/dL HGB) a
volúmenes variables de PEG-HGB (5.6 g/dL) (Tabla
4A). Cada muestra fue aspirada 4 veces. Las muestras fueron
probadas una hora después de la preparación y luego 24 horas después
de haber sido almacenadas en refrigeración a 5ºC (Tabla 4B).
A partir de estos experimentos se demostró que
el sustituto de hemoglobina PEG-HGB era recuperable
después de 24 horas cuando las muestras eran almacenadas
2-8ºC. Como se muestra en las Tablas 4A y 4B,
virtualmente no hubo cambios en la HGB total, HGB calculada (esto
es HGB celular), o HGB Delta (esto es, HGB extracelular) en
muestras de sangre almacenadas a 2-8ºC por 24 horas
(Tabla 4B), a partir de valores en el tiempo cero (Tabla 4A). Así,
dado que el conteo glóbulos rojos es estable durante el
almacenamiento, la HGB Delta, debido la presencia de
PEG-HGB, era también constante después de
almacenamiento las 24 horas a 2-8ºC.
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Tablas 4A y
4B
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Este ejemplo describe la medición analítica de
otro sustituto de sangre portador de oxígeno, por ejemplo, un
portador de oxígeno basado en hemoglobina polimerizada con
glutaraldehído (HBOC), Hemopure® obtenido de Biopure Corporation
(Cambridge, MA), según se lleva a cabo de acuerdo con la presente
invención en un instrumento de hematología ADVIA 120® (Bayer
Corporation). Hemopure® es hemoglobina bovina, pulverizada con
glutaraldehído para producir oligómeros con un peso molecular de
500.000. La polimerización fue diseñada en este producto para
disminuir la rata de excreción a través del riñón.
Sello a cabo dos tipos de experimento y se
destinen utilizando el producto Hemopure®: (1) Hemopure® fue
introducido en plasma humano y (2) Hemopure® fue introducido en
sangre humana entera antes del análisis de hematología automatizado
en la determinación de la concentración de hemoglobina exógena.
Los experimentos que miden Hemopure® como una
sustancia de hemoglobina exógena en una muestra de sangre o plasma
fueron llevados a cabo según se describe en los ejemplos anteriores
utilizando el analizador de hematología automatizado ADVIA 120®. De
acuerdo con esta invención el analizador ADVIA 120® calculó la
diferencia entre la hemoglobina total y las concentraciones de
hemoglobina intracelular para producir hemoglobina Delta (esto es,
hemoglobina exógena).
Se obtuvo plasma a partir de sangre humana
fresca por centrifugación durante 25 minutos en una centrifuga
Sorvall R-3^{R} equipada con un rotor de soporte
horizontal HB4L a 2400 rpm (620 x g). El sobrenadante del plasma
fue recentrifugado durante 10 minutos a 620 x g y se desecho el
residuo. El plasma libre de células fue distribuido en tubos de
vidrio como sigue: 5.00, 4.75, 4.50, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. En
estos tubos se añadió el producto Hemopure® como sigue: 0.00, 0.25,
0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 m, respectivamente, de manera
que el volumen total fue 5.00 ml. Los tubos fueron tapados y
mezclados por inversión 10 veces y luego fueron probados de
30-60 minutos después en ADVIA 120®, utilizando 5
replicados por tuvo. Las concentraciones de la HGB total, HGB
intracelular y HGB Delta fueron tabuladas.
Los resultados se resumen en la Tabla 5, donde
los resultados de los ensayos son las medias de 5 replicados. Para
el producto Hemopure® la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y
HGBDelta_{-de-prueba} fue 0 o 0.1, y por lo tanto
estaba dentro de la especificación de linealidad para HGB del
analizador ADVIA 120® de 0.2 g/dL o un 2% de diferencia relativa.
Para todos los niveles, la concentración de HGB intracelular fue
cero según lo requería el diseño experimental. Los datos ilustran
que la recuperación de la HGB exógena es lineal en la matriz de
plasma en el rango de 0.6 a 13.0 g/dL.
Sangre entera obtenida de voluntarios y sometida
a un proceso de coagulación en K_{3}EDTA, fue manipulada de
manera que la concentración total de HGB era 13.0 g/dL. Se
distribuyó la sangre entera en tubos de vidrio como sigue: 5.00,
4.75, 4.50, 4.00, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. En estos tubos, se
añadió Hemopure® como sigue: 0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00,
4.00 y 5.00 ml, respectivamente, de manera que el volumen total era
de 5.00 ml. Los tubos fueron tapados y mezclados por inversión (10
veces), y luego fueron probados durante 30-60
minutos después en ADVIA 120®, utilizando 5 replicados por tubo. Las
concentraciones de HGB total, HGB intracelular y HGB Delta fueron
tabuladas.
Usando sangre entera y Hemopure®, la
concentración de HGB intracelular disminuyó a medida que aumentó
la HGB extracelular. Los resultados se resumen en la Tabla 6, en la
cual los resultados obtenidos son una media de 5 replicados. Para el
producto Hemopure®, la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y
HGBDelta_{-de-prueba} era en general cero o 0.1,
y no excedía la especificación de linealidad de HGB del analizador
ADVIA 120®. Para todos los niveles la concentración de HGB
intracelular fue cero, según lo requería el diseño experimental.
Los datos ilustran que la recuperación de HGB exógena fue lineal en
una matriz de sangre entera en el rango de 0.09 a 13.0 g/dL.
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Este ejemplo describe la medición analítica de
otro sustituto de sangre libre de células portador de oxígeno.
Oxyglobin (Biopure Corporation, Cambridge, MA) ejecutado de acuerdo
con la presente invención en ADVIA 120® (Bayer Corporation). Al
igual que Hemopure® es también una solución libre de células de
hemoglobina polimerizada con glutaraldehído.
Como en ejemplo 5, se llevaron a cabo dos tipos
de experimentos utilizando el producto Oxyglobin: (1) Oxyglobin fue
introducido en plasma humano y (2) Oxyglobin fue introducido en
sangre humana entera antes del análisis de hematología
automatizado.
Los experimentos que medían Oxyglobin como una
sustancia de hemoglobina exógena en una muestra de sangre o plasma
fueron ejecutados tal como se describe en los ejemplos anteriores
utilizando el analizador de hematología automatizado ADVIA
120®.
\vskip1.000000\baselineskip
El plasma se obtuvo a partir de sangre humana
fresca por centrifugación durante 25 minutos en una centrifuga
Sorvall R-3^{R} equipada un rotor horizontal HB4L
a 2400 rpm (620 x g). El sobrenadante del plasma fue centrifugado
durante 10 minutos a 620 x g y se descartó el residuo. Se distribuyó
plasma libre de células en tubos de vidrio como sigue: 5.00, 4.75,
4.50, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. Se añadió Oxyglobin a estos tubos
como sigue: 0.00, 0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 ml
respectivamente, de manera que el volumen total fuera de 5.00 ml.
Los tubos fueron tapados y mezclados por inversión (10 veces) y
luego se ensayaron durante 30-60 minutos después en
el analizador de hematología ADVIA 120®., utilizando 5 replicados
por tubo. Las concentraciones de HGB total, HGB intracelular y HGB
Delta fueron tabuladas.
Los resultados se resumen en la Tabla 7, donde
los resultados de la prueba son la media de 5 replicados. Como se
observa en el producto Hemopure® (ejemplo 5), la diferencia entre
HGBDelta _{predicho} y HGBDelta_{-de-prueba}
para Oxyglobin fue 0 o 0.1, y por lo tanto estaba dentro de la
especificación de linealidad de HGB del analizador ADVIA 120® de
0.2 g/dL o 2% de diferencia relativa. Para todos los niveles, la
concentración de HGB intracelular fue cero, según era requerido por
el diseño experimental. Los datos ilustran que la recuperación de
HGB exógena fue lineal en una matriz de plasma a lo largo del rango
de 0.6 a 13.0 g/dL.
Sangre entera, obtenida de voluntarios y
sometida a anticoagulación en K_{3}EDTA, fue manipulada de tal
manera que la concentración total de HGB fue 13. 0 g/dL. La sangre
entera fue distribuida en tubos de vidrio como sigue: 5.00, 4.75,
4.50, 4.00, 3.00, 2.00, 1.00 y 0.00 ml. Se añadió Oxyglobin
(Biopure, Cambridge, MA) a los tubos como sigue: 0.00, 0.25, 0.50,
1.00, 2.00, 3.00, 4.00 y 5.00 ml, 60 y respectivamente, de manera
que el volumen total en cada tubo fue de 5.00 ml. Los tubos fueron
tapados y mezclados por inversión (10 veces), y luego se sometieron
a la prueba 30-60 minutos después en ADVIA 120®
utilizando 5 replicados por tubo. Las concentraciones de HGB total,
HGB intracelular y HGB Delta fueron tabuladas.
Utilizando sangre entera y el producto
Oxyglobin, la concentración de HGB intracelular disminuía a medida
que aumentaba la HGB extracelular. Los resultados se resumen en la
Tabla 8, en la cual los resultados de la prueba son la media de 5
replicados. De manera similar a los resultados observados par el
producto Hemopure®, la diferencia entre HGBDelta _{predicho} y
HGBDelta_{-de-prueba} fue en general 0 o 0.1 para
Oxyglobin, y no excedía la especificación de linealidad de HGB del
analizador ADVIA 120®. Para todos los niveles, la concentración de
HGB intracelular era cero, según lo requería el diseño experimental.
Los datos ilustran que la recuperación de HGB exógena es lineal en
una matriz de sangre entera a lo largo del rango de 0.09 a 13.0
g/dL.
Los resultados de los experimentos descritos en
los ejemplos 5 y 6 demuestran que los sustitutos de sangre
portadores de oxígeno Hemopure® y Oxyglobin (Biopure, Cambridge, MA)
pueden ser detectados cuantitativamente de manera directa mediante
un analizador de hematología automatizado tal como el analizador de
hematología ADVIA 120® de Bayer Corporation. El analizador ADVIA
120® fue capaz de detectar de manera directa y cuantitativa los
materiales Hemopure® y Oxyglobin del plasma y en sangre entera en un
rango de 0.6 a 13.0 g/dL. El ADVIA 120® reportó estos sustitutos de
hemoglobina como hemoglobina extracelular.
Según se describe aquí de acuerdo con la
operación del analizador de hematología automatizado de acuerdo con
la presente invención, el canal de hemoglobina mide
colorimétricamente la concentración de hemoglobina total en la
muestra mediante la interacción de HGB en la muestra con cianuro
iónico en presencia de micelios surfactantes (Véase M.J. Malin
et al., 1992, J. Anal. Chim. Acta.,
262:67-77, y M.J. Malin et al., 1989, J.
Amer. Clin. Path., 92:286-294.). Así, la HGB total
es una combinación de HGB intracelular y HGB extracelular. En
contraste, el canal BBC registra típicamente sólo la HGB
intracelular presente en una muestra. El sistema automatizado
calcula la concentración de HGB extracelular obteniendo la
diferencia entre los niveles de HGB total e intracelular. Ambos
materiales fueron recuperados dentro de la especificación en un
experimento de linealidad en matrices de plasma y sangre
entera.
Los aspectos de asociación en agua confirmaron
que los materiales Hemopure® y Oxyglobin eran derivados de
hemoglobina en los cuales los grupos heme eran capaces de
oxigenación. Más específicamente, Hemopure® y Oxyglobin y la sangre
entera fueron diluidos 251 veces en agua destilada, se mezclaron y
se barrieron desde 750 a 450 nanómetros contra agua destilada en un
espectrofotómetro Cary 3. Los espectros de la sangre entera y de los
dos sustitutos de sangre exhibieron máximos espectrales a 541
nanómetros y 577 nanómetros respectivamente, y mínimos espectrales
a 508 nanómetros y 560 nanómetros respectivamente. Estos rasgos son
característicos de la oxihemoglobina (van Kampen and Ziljstra,
1965, Adv. Clin. Chem., 8:141) cuando se compara con sangre entera.
Puesto que los productos párrafo 72 tienen un espectro de vocación
hemoglobina en agua oxigenada, el hierro tiene está en el estado de
oxidación ferroso tal como está en la hemoglobina de la sangre
entera.
Ejemplo los dos productos Hemopure® y Oxyglobin
se comportaron como la hemoglobina en sangre entera cuando se
diluyeron 251 veces con un reactivo de hemoglobina que contenía
cianuro y se analizaron en el analizador de hematología ADVIA 120®.
Específicamente 20 \mul de Hemopure® y Oxyglobin fueron diluidos
cada uno en 5.0 ml reactivo de hemoglobina que contenía cianuro
según se usa en el analizador ADVIA 120®. Las muestras fueron
mezcladas y luego barridas desde 750 nanómetros hasta 450 nanómetros
en un espectrofotómetro Cary 3 y se compararon con el reactivo en
cubetas de longitud de paso de 1 cm. A_{750} fue puesto en 0 como
control, una alícuota de sangre humana fresca fue tratada como se
describió anteriormente para los productos de prueba. Los
resultados se resumen en la Tabla 9 la cual muestra los máximos y
mínimos espectrales de los portadores de oxígeno basados en
hemoglobina y de la sangre entera en el reactivo de hemoglobina con
contenido de cianuro.
Los datos muestran que ambos Biopure HBOCs
recuerdan a la sangre humana con respecto a su reacción con el
reactivo de hemoglobina que contiene cianuro. Todo los espectros
exhibieron un máximo de 550 nanómetros y un mínimo a 514
nanómetros, con una relación similar de absorbancia máxima/mínima.
Este experimento demuestra que ambos productos Hemopure® y
Oxyglobin contienen heme, dado que los productos obtenidos en el
reactivo de HGB es diciano-Fe^{+3} protoporfirina
IX (véase Malin et al., 1992, Anal. Chim. Acta,
262:67-77).
Los contenidos de todas las patentes,
solicitudes de patente, artículos publicados, libros, manuales de
referencia y extractos citados aquí son por lo tanto incorporados
como referencia en su totalidad para describir más completamente el
estado del arte al cual pertenece esta invención.
Puesto que pueden hacerse diversos cambios en el
asunto antes descrito sin apartarse del alcance y espíritu de la
presente invención, se entiende que toda la materia contenida en la
anterior descripción, o definida en las reivindicaciones anexas,
será interpretada como descriptiva e ilustrativa de la presente
invención. Muchas modificaciones y variaciones de la presente
invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores.
Claims (8)
1. Un método para la determinación,
cuantificación y monitorización de hemoglobina extracelular en una
muestra de sangre entera, plasma o suero ejecutada sobre un
analizador de hematología automatizado que tiene al menos dos
canales analíticos para mediciones de hemoglobina donde la
hemoglobina extracelular en la muestra es debida a la presencia de
un producto de hemoglobina libre de células un sustituto de
hemoglobina portador de oxígeno en la sangre y se selecciona de
entre hemoglobina purificada, hemoglobina recombinante, hemoglobina
entrecruzada, hemoglobina polimerizada y hemoglobina acoplada a
polietilenglicol (PEG-HGB), comprendiendo el
método:
(a) el determinar la concentración de
hemoglobina total en un alícuota de la muestra en un canal analítico
de hemoglobina del analizador;
(b) el determinar la concentración de
hemoglobina celular en la alícuota en la muestra en un canal
analítico de glóbulos rojos del analizador; y
(c) calcular la diferencia entre la
concentración de hemoglobina total determinada mediante el canal de
hemoglobina y la concentración de hemoglobina celular determinada
mediante el canal de glóbulos rojos del analizador para atender la
concentración de hemoglobina en la muestra de sangre entera, plasma
o suero, donde el canal analítico de hemoglobina de la etapa (a)
mide la concentración total de hemoglobina en la muestra por
hemolisis y extracción de los hemes de su complejo biológico con la
globulina formando una especie heme férrica ligada capturable en un
micelio surfactante según se determine a partir de absorbancia
colorimétrica en el canal de hemoglobina del analizador, y
adicionalmente donde el canal analítico de glóbulos rojos de la
etapa (b) mide la concentración de glóbulos rojos, el volumen de
glóbulos rojos y la concentración de hemoglobina de las células de
glóbulos rojos individuales a medida que pasan a través de e dos
detectores de luz dispersa virtualmente una célula a la vez.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la muestra es una muestra de sangre entera normal o
anormal.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la muestra es una muestra de plasma o suero.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la concentración de hemoglobina total en la etapa (a) y la
concentración de hemoglobina celular en la etapa (b) es de
aproximadamente 0.5 gl/dl hasta aproximadamente
25 gl/dl de sangre, plasma o suero.
25 gl/dl de sangre, plasma o suero.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde la muestra de sangre entera anormal es derivada de un
individuo que tiene una condición patológica seleccionada de pérdida
de sangre durante cirugía, pérdida de sangre durante trauma y
choque hemorrágico.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la hemoglobina purificada es hemoglobina bovina purificada o
hemoglobina humana purificada.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
donde la hemoglobina recombinante es hemoglobina humana
recombinante.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la hemoglobina celular de la etapa (b) es determinada por la
fórmula RBC x MCV x CHCM/100; donde RBC es el valor de citograma de
glóbulos rojos en el canal de glóbulos rojos del analizador de
hematología; MCV es el volumen celular medio; y CHCM es la
concentración de hemoglobina celular media obtenida del canal de
glóbulos rojos del analizador de hematología.
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