ES2305144T3 - Metodo para la determinacion de un acido nucleico utilizando un control. - Google Patents
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Abstract
Un método para la amplificación de una región del ácido nucleico diana en una muestra, que comprende el paso de amplificar una cantidad conocida de ácido nucleico control y dicho ácido nucleico diana, y dicho ácido nucleico control cubre esencialmente dicha región de dicho ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicha región del ácido nucleico diana, que se caracteriza porque - los ácidos nucleicos amplificados se detectan en la mezcla de reacción de amplificación durante la reacción de amplificación utilizando sondas específicas, - la hibridación de las sondas con los ácidos nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se monitoriza, - una primera sonda utilizada para el procesado de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicho ácido nucleico diana, - al menos una secuencia contigua de al menos 8 nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido nucleico diana, - la región del ácido nucleico control consiste en una o más partes, y - la secuencia de cada parte es idéntica en más del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar o de la cadena complementaria.
Description
Método para la determinación de un ácido
nucleico utilizando un control.
Esta invención va dirigida a un método para la
determinación de un ácido nucleico diana utilizando un ácido
nucleico control especial, un método para la amplificación de una
secuencia parcial de dicho ácido nucleico diana utilizando
cebadores y un ácido nucleico control especial, y un equipo que
contiene dicho ácido nucleico control.
La determinación de ácidos nucleicos se ha
convertido en una herramienta importante en la química analítica,
especialmente en el cuidado de la salud. Por ejemplo, las
enfermedades infecciones y el estado genético pueden determinarse
fácilmente en base a la presencia o cantidad de un ácido nucleico
indicativo de dicha enfermedad o estado en muestras recibidas de
ese individuo. Por este motivo se establecieron métodos que utilizan
una hibridación específica de secuencia de un ácido nucleico,
preferiblemente un oligonucleótido, con un ácido nucleico diana
indicativo de tal enfermedad o estado genético. Técnicas sensibles
como el método de DNA ramificado (Patentes estadounidenses Nº
5.681.702, 5.597.909, 5.545.730, 5.594.117, 5.591.584, 5.571.670,
5.580.731, 5.571.670, 5.591.584, 5.624.802, 5.635.352, 5.594.118,
5.359.100, 5.124.246 y 5.681.697), o los métodos de detección de
ácidos nucleicos rRNA diana (PE 0 272 009), que están presentes en
números de copia elevados en el organismo, pueden utilizarse para
la detección directa de un ácido nucleico diana en una muestra de
ese organismo. Pero muchos ácidos nucleicos diana están presentes en
un organismo en tan baja concentración, que una detección directa
en una muestra derivada de ese organismo no es posible. Tales dianas
han de ser amplificadas previamente a su detección. Son métodos de
amplificación adecuados por ejemplo la LCR (Patentes
estadounidenses Nº 5.185.243, 5.679.524 y 5.573.907; PE 0 320 308
B1; WO 90/01069; WO 89/12696 y WO 89/09835), tecnología de ciclado
de sondas (Patentes estadounidenses Nº 5.011.769, 5.403.711,
5.660.988 y 4.876.187, y las solicitudes PCT publicadas WO
95/05480, WO 95/1416 y WO 95/00667), tecnología Invader TM (Patentes
estadounidenses Nº 5.846.717, 5.614.402, 5.719.028, 5.541.311 y
5.843.669), tecnología de replicasa QBeta (Patente estadounidense
Nº 4.786.600), NASBA (Patente estadounidense Nº 5.409.818;
PE-0 329 822), TMA (Patentes estadounidenses Nº
5.399.491, 5.888.779, 5.705.365 y 5.710.029), SDA (Patentes
estadounidenses Nº 5.455.166 y 5.130.238) y PCR
(US-A-4.683.202).
Para minimizar los resultados erróneos en las
determinaciones de ácido nucleico, las autoridades de varios países
exigen la utilización de ácidos nucleicos control. Especialmente
cuando se utilizan métodos de amplificación tales ácidos nucleicos
control son muy importantes, ya que el proceso de amplificación
puede verse fuertemente influenciado por las condiciones de
reacción, lo que puede conducir a resultados erróneos. En ocasiones,
una muestra puede contener sustancias inhibitorias, que pueden dar
lugar a resultados negativos falsos.
En general se puede distinguir entre controles
externos e internos. Los controles externos, como los controles
positivo y negativo clásicos normalmente se utilizan para comprobar
si el ensayo ha funcionado adecuadamente o si están presentes
contaminantes. Un control interno por ejemplo es útil para reconocer
sustancias inhibitorias que pueden contener una muestra o pueden
utilizarse como un estándar de cuantificación en un ensayo
cuantitativo. Al contrario que un control externo, que normalmente
se analiza en un recipiente de reacción separado, el control
interno preferiblemente se incuba en el mismo recipiente de reacción
junto con el analito a analizar. Por lo tanto, el control o el
producto amplificado de ese control debe de ser distinguible del
analito o del producto amplificado de ese analito. Cuando se
utiliza un método de amplificación, el ácido nucleico control
interno se está coamplificando esencialmente bajo las mismas
condiciones de reacción que el ácido nucleico diana. Estas
condiciones incluyen las concentraciones de reactivo, temperatura,
concentración de inhibidor o actividades enzimáticas. Las
secuencias frecuentemente utilizadas como controles se derivan de
genes de mantenimiento ("housekeeping") (véanse Chelly et
al. (1990) Eur. J. Biochem. 187:691-698 y Mallet
et al. (1995) J. Clin. Microbiol.
33:3201-3208), pero también se utilizan secuencias
sintéticas (Besnard et al. (1995) J. Clin. Microbiol.
32:1887-1893; Gilliland et al. (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:2725-2729; Wang et
al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
9717-9721).
El ácido nucleico amplificado derivado del
control interno puede distinguirse del ácido nucleico amplificado
derivado del ácido nucleico diana, por ejemplo, mediante las
diferencias en la longitud o capacidad de hibridación con una sonda
distinta (para una revisión véanse: Clementi et al. (1990)
PCR Methods Applic. 2:191-196; Clementi et
al. (1995) Arch. Virol. 140:1523-1539). La US 5
840 487 describe la utilización de ácidos nucleicos como secuencias
control internas en reacciones de amplificación isotérmicas, en las
que las secuencias diana y control tienen sustancialmente la misma
longitud y sustancialmente el mismo contenido en G+C, pero sin
embargo difieren al menos parcialmente de la secuencia diana. En
todos los casos la secuencia de nucleótidos del control interno es
parcialmente o totalmente diferente de la secuencia del ácido
nucleico diana. Sin embargo la secuencia y la longitud de un ácido
nucleico determinan su contenido GC, estructuras secundarias y la
temperatura de fusión, y por lo tanto es esencial para su
comportamiento en una reacción de hibridación y amplificación. Una
secuencia diferente en un control interno en casi todos los casos
resulta en un comportamiento diferente del ácido nucleico control
comparado con el del ácido nucleico diana. Por el contrario, el
control interno ideal debería imitar exactamente al ácido nucleico
diana para permitir una adecuada monitorización de la reacción.
Uno de los aspectos más críticos en una reacción
de amplificación es la unión del cebador al ácido nucleico diana.
Por lo tanto se están utilizando controles internos que poseen los
mismos puntos de unión de cebador que el ácido nucleico diana
(véase por ejemplo Gilliland et al. (1990) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:2725-2729; Wang et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9717-9721; US 5.219.727).
Esto puede conducir a una competición en la reacción por los
cebadores y puede resultar en una disminución de la sensibilidad del
ensayo.
Gilliland et al. (1990) Proc, Natl. Acad,
Sci, USA 87:2725-2729 describe controles internos
que tienen casi la misma secuencia de nucleótidos que el ácido
nucleico diana, pero contienen un nuevo punto de corte por una
enzima de restricción o la secuencia de una región intrónica no
contenida en el ácido nucleico diana. Debido a la muy elevada
homología del control interno con la diana, ambos ácidos nucleicos
así como las amplificaciones pueden hibridar de forma cruzada entre
ellos. En función del método de detección utilizado, esto puede
conducir a resultados erróneos especialmente en los ensayos
cuantitativos. Además, los métodos descritos requieren técnicas
elaboradas como la digestión con enzimas de restricción y la
electroforesis en gel de agarosa de los productos amplificados.
Epplen et al. (1997) Human Genetics,
99:834-836 describe el análisis cuantitativo de un
motivo (GAA)n en individuos portadores de repeticiones del
motivo. El DNA de la repetición (GAA) se amplifica mediante PCR y a
continuación se somete a electroforesis en gel de agarosa. El gel
de electroforesis se transfiere a un filtro y una sonda
(TCT)_{6} marcada radiactivamente se hibrida para detectar
las bandas de DNA que contienen repeticiones GAA. El número de
repeticiones (GAA) se infiere a partir del tamaño del fragmento de
DNA en relación a los marcadores de tamaño.
Ginzinger et al. (2000) Cancer Research,
60:5405-5409 describe el análisis cuantitativo de
microsatélites en un formato de ensayo homogéneo. Se describe un
método basado en la PCR en el que el número relativo de copias de
la secuencia de DNA se mide utilizando una sonda fluorogénica
Taqman^{TM} específica de las repeticiones CA que se hibrida
sobre una secuencia diana amplificada que contiene una repetición
CA.
La WO 00/29613 describe un método para la
amplificación/ cuantificación de un ácido nucleico diana, utilizando
una cantidad conocida de un ácido nucleico calibrador. El método se
basa en la utilización del calibrador durante los pasos de
extracción de la muestra, de amplificación del ácido nucleico diana
y la subsiguiente detección con sondas adecuadas capaces de
hibridar de forma diferencial con el calibrador y la secuencia
diana. El calibrador tiene una secuencia idéntica a la secuencia
del ácido nucleico diana con la excepción de una o más regiones
cuya secuencia es diferente de las correspondientes regiones del
ácido nucleico diana, con una secuencia aleatoria y una Tm similar
respecto de este último. Es objeto de la presente invención mejorar
los métodos para la determinación de ácidos nucleicos, especialmente
evitando la totalidad o una parte de las desventajas de los métodos
conocidos.
El aspecto principal de la invención es
proporcionar ácidos nucleicos que imitan las propiedades de un ácido
nucleico diana en relación a su longitud, contenido G/C, estructura
secundaria, cinética de plegamiento y otras características, pero
que pueda distinguirse fácilmente del respectivo ácido nucleico
diana por su secuencia. Para conseguirlo, se construye una
secuencia, que cubre esencialmente la región de dicho ácido nucleico
diana a determinar o la cadena complementaria de dicha región del
ácido nucleico diana y cuya secuencia es al menos en parte
complementaria en paralelo con una cadena del ácido nucleico diana o
una cadena complementaria de la misma. La parte o partes
complementarias en paralelo de la secuencia de ácido nucleico
control puede extenderse de pequeños tramos por ejemplo de al menos
8 nucleótidos, preferiblemente al menos 10 nucleótidos, a la región
completa del ácido nucleico diana a determinar en el caso más
extenso. En un aspecto preferible de la presente invención, la
parte o partes complementarias en paralelo contienen la(s)
secuencia(s) del punto de unión de la sonda.
En otro aspecto preferible, en particular, si la
región del ácido nucleico diana a determinar se amplifica para la
determinación, el ácido nucleico control de acuerdo con la presente
invención también puede contener puntos de unión al cebador que son
complementarios en paralelo a los respectivos puntos de unión al
cebador de la región del ácido nucleico diana.
Tales ácidos nucleicos control pueden utilizarse
por ejemplo como controles internos en métodos de hibridación y
amplificación y por lo tanto son útiles en el campo del análisis
químico y diagnóstico médico.
La invención también está relacionada con un
método para la amplificación de una región del ácido nucleico diana
en una muestra que comprende los pasos de:
amplificar dicha región del ácido nucleico diana
y una cantidad conocida de ácido nucleico control, en el que dicho
ácido nucleico control cubre esencialmente dicha región del ácido
nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicha región del
ácido nucleico diana, y los ácidos nucleicos amplificados se
detectan en la mezcla de reacción de amplificación durante la
reacción de amplificación utilizando sondas específicas, la
hibridación de las sondas a los ácidos nucleicos amplificados
durante la reacción de amplificación se monitoriza, una primera
sonda utilizada para el procesado de dicho ácido nucleico control es
esencialmente complementaria en paralelo con una segunda sonda
utilizada para el procesado de dicho ácido nucleico diana a
amplificar o la complementaria de dicho ácido nucleico diana y al
menos una secuencia contigua de al menos 8 nucleótidos de dicho
ácido nucleico control no pueden unirse a la diana y es
complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido nucleico
diana o de la cadena complementaria de dicho ácido nucleico diana,
la región del ácido nucleico control consiste en una o más partes,
y la secuencia de cada parte es idéntica en más del 80% o
complementaria en paralelo en más del 80% de la parte
correspondiente de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
Respecto a los métodos de amplificación, los
ácidos nucleicos control de la invención aportan ventajas
adicionales. Si un punto de unión de cebador de estos ácidos
nucleicos es complementario en paralelo al punto de unión del
cebador de la diana, estos controles mimetizan las propiedades de
unión del cebador a la diana, aunque las secuencias de los puntos
de unión del cebador y los cebadores del ácido nucleico control son
diferentes de los del ácido nucleico diana. Se evita una
competición de los cebadores por la amplificación de la diana y el
control, y la sensibilidad y el rango lineal del ensayo pueden
mejorarse.
Un control como el mencionado puede utilizarse
en cualquier método de hibridación y amplificación para la
determinación de ácidos nucleicos. La utilización de este ácido
nucleico control es potenciada por la necesidad de un control que
refleje las características del ácido nucleico diana a determinar,
pero que aun así puede detectarse separadamente.
La Fig. 1 muestra un ejemplo de una secuencia de
ácido nucleico y su secuencia complementaria en paralelo así como
sus capacidades de formar estructuras secundarias similares. (QS:
ácido nucleico control para su utilización en un ensayo
cuantitativo o cualitativo).
La Fig. 2 muestra la predicción de estructuras
secundarias realizada con Mfold versión 3.0 (copyright 1996 Dr. M.
Zuker, M. Zuker, D.H. Mathews & D.H. Turner, Algorithms and
Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical
Guide, en RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski &
B.F.C. Clark, Ed., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers,
(1999)) para las sondas ST650 (sonda específica de HCV), ST650pc
(complementaria en paralelo de ST650) y ST2535 (secuencia no
relacionada).
La Fig. 3 muestra la predicción de estructuras
secundarias realizada con Mfold versión 3.0 para los cebadores
ST280 (específico de HCV), ST280pc (complementaria en paralelo de
ST280), ST778 (específico de HCV) y ST778pc (complementaria en
paralelo de ST778).
La Fig. 4 muestra la predicción de estructuras
secundarias realizada con Mfold versión 3.0 para el amplicón HCV,
amplicón QS(pc)HCV (complementaria en paralelo del
amplicón HCV) y amplicón QSHCV (amplicón control que contiene una
secuencia de nucleótidos desordenada, una secuencia de unión a la
sonda ST2535, un punto de unión de los cebadores ST280 y ST778, y
del mismo tamaño que el amplicón HCV).
La Fig. 5 muestra las curvas de hibridación del
ácido nucleico amplificado derivado de diferentes estándares
internos, la amplificación QSHCV (Id. de Sec. Nº 14) y la
amplificación QS(pc)HCV (Id. de Sec. Nº 13), comparado
con la amplificación HCV-1b.
La invención principalmente se basa en la
observación de que un primer ácido nucleico con una secuencia que
es complementaria en paralelo de una segunda secuencia de ácido
nucleico tienen propiedades de hibridación muy similares definidas
por su longitud, contenido GC, Tm y estructuras secundarias
comparadas con la primera secuencia de ácido nucleico, aunque la
secuencia sea completamente diferente. Tal ácido nucleico puede
utilizarse como ácido nucleico control para la determinación de un
ácido nucleico diana, ya que el ácido nucleico control y los ácidos
nucleicos diana y sus amplificaciones tienen un comportamiento de
hibridación muy similar, pero siguen siendo detectables de forma
separada por sus diferentes secuencias.
Un ácido nucleico control preferible de acuerdo
con la presente invención cubre esencialmente la región del ácido
nucleico diana a determinar que se caracteriza porque la región de
dicho ácido nucleico control que cubre esencialmente la región de
dicho ácido nucleico diana a determinar o la complementaria de dicho
ácido nucleico diana contiene al menos una secuencia contigua de al
menos 8 nucleótidos que son esencialmente complementarios en
paralelo de dicho ácido nucleico diana o de la cadena complementaria
de dicho ácido nucleico diana y no puede unirse a la secuencia
diana.
En este contexto, cubrir esencialmente la región
del ácido nucleico diana a determinar significa que esta región del
ácido nucleico control consiste en una o más partes, en las que la
secuencia de cada parte es esencialmente idéntica o esencialmente
complementaria en paralelo de la respectiva parte de la región del
ácido nucleico diana a determinar o de la cadena complementaria.
Por lo tanto, esta región del ácido nucleico control es
esencialmente idéntica, esencialmente complementaria en paralelo o
en parte esencialmente complementaria en paralelo, mientras que la
otra parte es esencialmente idéntica a la región relevante de la
región del ácido nucleico diana a determinar o a la cadena
complementaria del ácido nucleico diana. Por lo tanto esta región
del ácido nucleico control tiene unas propiedades de hibridación
esencialmente idénticas comparado con la región del ácido nucleico
diana a determinar o la cadena complementaria del ácido nucleico
diana. Pequeños cambios en el comportamiento de la estructura
secundaria pueden aparecer si se combinan demasiadas partes
esencialmente complementarias en paralelo y esencialmente idénticas
en el ácido nucleico control, mientras que esto no afecte el
contenido GC. Para garantizar que el comportamiento del control
sigue mimetizando el comportamiento de la diana, es preferible que
la región del ácido nucleico control que cubre la región del ácido
nucleico diana a determinar consista en menos de 10, más
preferiblemente menos de 6 partes que sean esencialmente
complementarias en paralelo o esencialmente idénticas.
Como las secuencias esencialmente idénticas o
idénticas no se pueden distinguir fácilmente, es muy importante que
la región del ácido nucleico control que cubre la región del ácido
nucleico diana a determinar contenga al menos una secuencia
contigua de al menos 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos una
secuencia de al menos 10 nucleótidos que sea esencialmente
complementaria en paralelo de dicha secuencia de ácido nucleico
diana para permitir una determinación diferencial del ácido nucleico
diana y de los ácidos nucleicos control o sus amplificaciones, por
ejemplo mediante la hibridación de una sonda.
Una parte de un primer ácido nucleico es
complementaria en paralelo a un segundo ácido nucleico o una parte
de éste, si la secuencia de ese primer ácido nucleico es idéntica a
la secuencia de la cadena complementaria de la secuencia del
segundo ácido nucleico o una parte de la misma cuando la secuencia
de la cadena complementaria de la secuencia del ácido nucleico
diana se lee en orientación inversa. Para los ácidos nucleicos
naturales esto significa leer la secuencia del extremo 3' al
extremo 5'. Se proporciona un ejemplo en la Figura 1. La secuencia
complementaria en paralelo de la secuencia de ácido nucleico
5'-AGCGCATGCCAGATTACTGGC-3' (Id. de
Sec. Nº 1) es
5'-TCGCGTACGGTCTAATGACCG-3' (Id. de
Sec. Nº 2). La secuencia complementaria en paralelo de la cadena
complementaria es
5'-CGGTCATTAGACCGTACGCGA-3' (Id. de
Sec. Nº 17).
Las partes de los ácidos nucleicos control de
acuerdo con la presente invención no han de ser necesariamente un
100% idénticas o 100% complementarias en paralelo del ácido nucleico
diana, aunque este caso es preferible. Es suficiente, si estas
partes son esencialmente idénticas o esencialmente complementarias
en paralelo. Esencialmente idéntica significa que la homología de
esta parte o estas partes del ácido nucleico control lo son en más
del 80%, más preferiblemente en más del 90% comparado con las partes
relevantes del ácido nucleico diana. Esencialmente complementaria
en paralelo significa que la homología de esta parte o estas partes
del ácido nucleico control lo son en más del 80%, más
preferiblemente en más del 90% complementarias en paralelo comparado
con las partes relevantes del ácido nucleico diana.
Para la determinación exacta de homología y
complementariedad es preferible utilizar programas informáticos
adecuados como el FastA (Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85; 2444-2448 (1988); versión de FastA del
Wisconsin Package(^{TM}), parámetros por defecto: tamaño de
palabra 2 (p-p), 6 (n-n); no mostrar
puntuaciones cuyo valor de E() supere 10,0 (p-p),
2,0 (n-n)).
Los ácidos nucleicos control de acuerdo con la
presente invención también son útiles en reacciones de hibridación
y amplificación para la determinación de ácidos nucleicos diana con
secuencias relacionadas como las formas alélicas. Con este
propósito no es necesario sintetizar un muevo control para cada
forma alélica de un ácido nucleico diana.
Un ácido nucleico control de acuerdo con la
presente invención para su utilización en un método de hibridación
como un control puro para monitorizar por ejemplo un paso de
hibridación de sonda cubre esencialmente la región del ácido
nucleico diana a determinar caracterizada porque la región de dicho
ácido nucleico control que cubre esencialmente la región de dicho
ácido nucleico diana a determinar o la complementaria de dicho ácido
nucleico diana contiene al menos una secuencia contigua de al menos
8 nucleótidos que es esencialmente complementaria en paralelo de
dicho ácido nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho
ácido nucleico diana y no puede unirse a la secuencia diana. La
región más importante en tales métodos es la región del ácido
nucleico diana que se une realmente a la sonda específica de la
diana, que es la región del ácido nucleico diana que realmente se
está determinando. Por lo tanto, en la mayoría de casos es
suficiente que esta región esté cubierta por el control interno. En
el caso de que esta región sea inferior a 15 nucleótidos, más
preferiblemente inferior a 10 nucleótidos es preferible que la
región relevante del ácido nucleico control sea esencialmente
complementaria en paralelo a la región de hibridación de la sonda
del ácido nucleico diana. Si la región de hibridación de la sonda
del ácido nucleico diana es superior a 15 nucleótidos, más
preferiblemente superior a 10 nucleótidos, la región relevante del
ácido nucleico control puede ser totalmente complementaria en
paralelo a la región de hibridación de la sonda del ácido nucleico
diana o la región puede ser en parte esencialmente complementaria
en paralelo, mientras el resto de partes son esencialmente
idénticas. Utilizando una sonda esencialmente complementaria,
preferiblemente una sonda complementaria para la hibridación con tal
ácido nucleico control es posible mimetizar la hibridación del
ácido nucleico diana con su sonda, paro aun así permite una
determinación separada de ambos complejos de hibridación.
Un control de amplificación permite la
monitorización de un proceso de amplificación. Si por ejemplo se
observa un ensayo típico de PCR, este puede incluir pasos de
hibridación de cebadores, de elongación de los cebadores, de
eficiencia de la amplificación y/o también otros pasos de
hibridación de sondas. Un control de amplificación preferible de
acuerdo con la presente invención puede contener regiones que
flanquean la región que cubre esencialmente la región del ácido
nucleico diana a amplificar, ya que los cebadores preferibles
utilizados para la amplificación del control son esencialmente
complementarios en paralelo o esencialmente idénticos, más
preferiblemente complementarios en paralelo o idénticos a los
cebadores de la amplificación de la diana, dependiendo de la
secuencia del control. Así, la amplificación del ácido nucleico
control no contiene las regiones flanqueantes del control sino sólo
la región que cubre esencialmente la región del ácido nucleico
diana a amplificar y la longitud de ambas amplificaciones es
esencialmente idéntica.
La región del ácido nucleico control que
esencialmente cubre la región del ácido nucleico diana a amplificar
puede construirse de varias partes que son esencialmente
complementarias en paralelo o esencialmente idénticas a la
respectiva parte del ácido nucleico diana como se ha descrito
anteriormente. Las combinaciones preferibles del ácido nucleico
control que cubre la región del ácido nucleico diana a amplificar se
listan en la tabla 1:
De acuerdo con la invención sólo es importante
la secuencia de bases, mientras que el esqueleto no necesariamente
ha de ser el esqueleto natural de azúcar-fosfato.
Por lo tanto también es posible utilizar ácidos nucleicos como
controles de acuerdo con la presente invención con un esqueleto
modificado o un esqueleto sintético como un ácido nucleico
peptídico (WO 92/20702). Cuando se utilizan ácidos nucleicos control
que contienen análogos de base se debe tener cuidado de que esas
bases tengan propiedades similares a las de la base natural
complementaria situada en la posición relevante de la secuencia del
ácido nucleico diana para mimetizar tanto como sea posible el
comportamiento de hibridación del ácido nucleico diana. También se
debe tener cuidado de que cuando se utilice un ácido nucleico
control como ácido nucleico control de amplificación, la naturaleza
del ácido nucleico control permita la amplificación del ácido
nucleico control con el método de amplificación utilizado.
Un ácido nucleico control de acuerdo con la
presente invención puede obtenerse en base a la secuencia de la
cadena codificante de RNA o DNA, o su cadena complementaria. Los
controles, por ejemplo, pueden sintetizarse químicamente y clonarse
en vectores adecuados como plásmidos, ácidos nucleicos fágicos, o en
el genoma de bacterias o virus o utilizarse tal y como se obtienen.
Tales ácidos nucleicos control pueden amplificarse in vitro
o producirse en bacterias transfectadas con los vectores que
contienen la secuencia de ácido nucleico de los controles. Tales
ácidos nucleicos control pueden utilizarse directamente en el ensayo
o empaquetarse, por ejemplo como RNA blindado (Patente
estadounidense 5.677.124) o empaquetarse en liposomas.
El ácido nucleico diana es el ácido nucleico a
determinar. Este puede tener cualquier origen, por ejemplo de
origen viroide, vírico, bacteriano o celular. Puede ser derivado de
soluciones, como sangre, suero, plasma u orina, de suspensiones,
fijadas en sólidos, medios con células, frotis de células, células
fijadas, secciones de tejido u organismos fijados. Preferiblemente
el ácido nucleico a determinar esta en solución. El ácido nucleico
a determinar también puede ser un ácido nucleico derivado de los
ácidos nucleicos diana, por ejemplo mediante recombinación,
fragmentación, amplificación y/o formación de cDNA a partir de
RNA.
El ácido nucleico diana normalmente se lleva a
una forma disponible mediante el procesado de la muestra original
con uno de varios métodos. Éstos comprenden por ejemplo, el cambio
de pH (alcalino), calentamiento, cambios cíclicos de temperatura
(congelación/ descongelación), cambios de las condiciones de
crecimiento fisiológicas, utilización de detergentes, sales
caotrópicas o enzimas (por ejemplo proteasas o lipasas), solos o en
combinación. Si el ácido nucleico control de acuerdo con la
presente invención se añade a una muestra previamente o durante el
paso de preparación de la muestra, estos ácidos nucleicos control
también pueden utilizarse como controles de la preparación de la
muestra además de los subsiguientes pasos de amplificación y/o
hibridación. Con este propósito puede añadirse el ácido nucleico
control a la muestra como DNA o RNA, dependiendo de la naturaleza
del ácido nucleico diana. También puede empaquetarse de forma
similar a la del ácido nucleico diana, que a menudo se encuentra en
el muestra unido a proteínas o otros componentes celulares o
víricos. Para mimetizar al máximo el ácido nucleico diana, el ácido
nucleico control puede empaquetarse por ejemplo en una cubierta de
proteínas, como por ejemplo en el RNA blindado.
Los ácidos nucleicos control de acuerdo con la
presente invención pueden utilizarse por ejemplo como controles,
preferiblemente como controles internos en métodos de hibridación,
como el método de DNA ramificado, o en la determinación de dianas
de RNA ribosomal, o también puede ser útil en los métodos de
hibridación de array.
Éstos también son útiles por ejemplo como
controles, preferiblemente como controles internos, en los métodos
de amplificación de la diana, como la TMA, SDA, NASBA, LCR y PCR. El
método preferible es la PCR. En principio, un ácido nucleico diana,
por ejemplo, indicativo de un agente infeccioso o un estado genético
se utiliza como molde al cual se puede unir un cebador de forma
específica de secuencia, bajo las condiciones de reacción
adecuadas. Dependiendo del método utilizado, el cebador por ejemplo
puede extenderse con monómeros de nucleótido utilizando una
polimerasa o ligarse con otro cebador hibridado cerca. En el caso de
que tal producto de amplificación pueda servir por sí mismo
directamente o indirectamente como molde, se puede amplificar el
ácido nucleico diana exponencialmente. También son conocidos los
métodos de amplificación lineal. Los productos de amplificación
pueden detectarse directamente, por ejemplo mediante una
electroforesis en gel de agarosa o realizando otra reacción de
hibridación con al menos una sonda específica de secuencia.
Un cebador de acuerdo con la presente invención
es una molécula que puede extenderse o modificarse preferiblemente
mediante enzimas, más preferiblemente por una polimerasa por ejemplo
de origen procariota, cuando hibrida con un molde de ácido
nucleico.
Cuando se utiliza la PCR son preferibles las
polimerasas termoestables, como la polimerasa de DNA de T.
aquaticus. La extensión añade unidades de mononucleótido a partir
de monodesoxiribonucleósidos trifosfato a un extremo de dicho
primer, preferiblemente el extremo 3'-OH terminal.
La longitud total y la secuencia de bases de un cebador es dictada
por la especificidad requerida de la reacción de amplificación. Las
longitudes preferibles de cebador para realizar una PCR están entre
10 y 40, más preferiblemente entre 15 y 30 subunidades que contienen
bases, seleccionadas de entre mononucleótidos y/o monómeros
análogos de ácido nucleico. En general, los cebadores de esa
longitud también son útiles en otros métodos de amplificación. Si se
utiliza más de un cebador para la amplificación, por ejemplo cuando
se utiliza la PCR o se amplifican múltiples ácidos nucleicos diana
en una reacción, preferiblemente se utilizan cebadores que no
pueden hibridar entre ellos, ya que no contienen ninguna porción de
más de 5 bases complementarias consecutivas.
Para la PCR las localizaciones de hibridación de
los cebadores se eligen normalmente de tal forma que hay una
porción de al menos 10, pero de no mucho más de 1000,
preferiblemente entre 100 y 500 nucleótidos entre sus extremos
originales 3', en el híbrido de los productos de extensión.
Generalmente, es importante que un cebador se
una suficientemente fuerte al ácido nucleico diana para permitir la
amplificación bajo las condiciones de reacción, pero se debe tener
cuidad o de que el cebador sólo se una preferiblemente al ácido
nucleico diana y debe evitarse la unión a otros ácidos nucleicos que
puedan estar presentes en una muestra. Por lo tanto, son
preferibles los cebadores de entre 10 y 40 nucleótidos de longitud,
más preferiblemente de entre 15 y 30 nucleótidos de longitud.
Preferiblemente los cebadores son oligonucleótidos.
Una sonda es una molécula utilizada para la
determinación de un ácido nucleico diana o un ácido nucleico diana
amplificado. También puede utilizarse para determinar la secuencia
de un ácido nucleico diana o ácido nucleico diana amplificado. Con
este propósito pueden utilizarse sondas con diferentes secuencias.
Tales sondas también pueden utilizarse por ejemplo para la
determinación de diferentes formas alélicas de un ácido nucleico
diana o para la determinación específica del género y especie de
una diana. Las sondas son preferiblemente oligonucleótidos, pero
también pueden utilizarse análogos, por ejemplo PNA. Para permitir
la hibridación específica de secuencia, preferiblemente las sondas
son de una longitud superior a 10 nucleótidos, más preferiblemente
son de una longitud de entre 10 y 40 nucleótidos. Para permitir la
detección del ácido nucleico diana, los productos de amplificación
y los respectivos complejos de hibridación con la sonda, las sondas
y/o los cebadores utilizados pueden acoplarse a grupos que pueden
detectarse directamente o indirectamente, o que permiten una
inmovilización del ácido nucleico diana, los productos de
amplificación y los respectivos complejos de hibridación con la
sonda en una fase sólida.
Un marcaje es generalmente conocido para un
experto en la materia como un grupo que es detectable o puede
hacerse detectable para determinar la presencia de un analito. Los
marcajes bien conocidos son los marcajes fluorescentes, como la
fluoresceína, marcajes electroquimioluminiscentes, como los
complejos de rutenio, o matrices que pueden ser reconocidas por
otras entidades moleculares, como los haptenos que pueden ser
reconocidos por un anticuerpo generado contra ese hapteno, o
matrices que pueden inmovilizarse, como la biotina (en fases
sólidas recubiertas de estreptavidina, como tubos o cuentas). Los
marcajes, por ejemplo, pueden estar unidos a la(s)
sonda(s) o cebador(es), o pueden incorporarse en los
ácidos nucleicos amplificados como unidades nucleósido trifosfato
marcadas. También pueden utilizarse marcajes que permitan la
detección del ácido nucleico diana o ácido nucleico diana
amplificado mediante otros medios, por ejemplo por intercalado del
marcaje o un intercalante marcado en un DNA de doble cadena. Los
marcajes pueden utilizarse para la detección de cebadores o sondas
o cualquier producto que ha incorporado dicho cebador, para
determinar el híbrido formado por dicho cebador o sonda con un
ácido nucleico a determinar o los nucleótidos marcados incorporados
a un ácido nucleico diana amplificado.
Una fase sólida es un sólido sustancialmente
insoluble en la mezcla de reacción, por ejemplo en forma de una
cuenta, una red, la superficie interna de un tubo, una placa
microtitulada o una cámara de un dispositivo. Se utiliza
esencialmente para contener la mezcla de reacción, pero en el caso
de tener la intención de unir una sonda, cebador o ácido nucleico
control inmovilizable a ésta, puede contener en su superficie
reactivos o un recubrimiento capaz de reconocer y unir una porción
de dicha sonda, cebador o ácido nucleico control.
Utilizando métodos de detección heterogéneos, la
determinación, por ejemplo mediante la hibridación de una sonda, se
realiza tras el paso de amplificación. El complejo de hibridación
puede detectarse en solución o tras la inmovilización sobre una
fase sólida. También son conocidos los formatos de detección
homogéneos, que permiten la determinación del ácido nucleico
amplificado en la mezcla de reacción sin más pasos de separación o
lavado. Con este propósito se conocen varios formatos de hibridación
de sonda, como el Taqman (patentes estadounidenses Nº 5210015 y
5487972), transferencia de la energía de resonancia de la
fluorescencia (US 4.996.143), balizas moleculares
(WO-95/13399, patentes estadounidenses Nº 5.119.801
y 5.312.728), Sunrise (patente estadounidense Nº 5.866.336) y
Scorpions (PCT/ GB98/03521). Tales métodos pueden utilizarse para
detectar el nivel de amplificación sintetizada a lo largo de la
reacción de amplificación completa. Cuando se utiliza un control
interno, por ejemplo un control interno de acuerdo con la presente
invención, en una reacción o para la determinación de múltiples
dianas las señales medidas para cada diana y el control pueden
distinguirse unas de otras. Por esa razón se pueden utilizar, por
ejemplo, diferentes marcajes unidos a las diferentes sondas o
cebadores, lo que permite una medida simultanea de las diferentes
dianas y controles o ácidos nucleicos amplificados derivados de
estos ácidos nucleicos en la mezcla de reacción.
El ácido nucleico control de acuerdo con la
presente invención es un ácido nucleico, que puede haberse
sintetizado químicamente, puede haberse clonado, amplificado o
aislado mediante otros medios conocidos en la materia. Está formado
preferiblemente por monómeros de RNA o DNA, pero también puede
contener análogos naturales o no naturales de bases o azúcares.
Debido a la(s) parte(s) complementarias en paralelo
los ácidos nucleicos control tienen una secuencia diferente
comparado con la secuencia del ácido nucleico diana y en la mayoría
de los casos tales secuencias se han de obtener sintéticamente al
menos una vez mediante métodos conocidos, como la tecnología de la
fosforamidita.
Para permitir la producción de ácidos nucleicos
de mayor longitud de acuerdo con la presente invención se pueden
sintetizar oligonucleótidos cortos, de alrededor de 40 a 120 bases
de longitud que solapen ambas cadenas del ácido nucleico control
deseado de forma escalonada. Tras la hibridación de estos
oligonucleótidos y el siguiente paso de ligación el ácido nucleico
puede clonarse, por ejemplo, en un vector o puede utilizarse
directamente como se ha descrito aquí. El ácido nucleico clonado
puede amplificarse por ejemplo en bacterias y aislarse utilizando
métodos estándar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A
laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laborator, 2001, ISBN
0879695765). Si el ácido nucleico es un RNA, éste puede
sintetizarse, por ejemplo, mediante la trascripción in vitro
utilizando un vector, que contiene una secuencia promotor adecuada,
como la secuencia promotor del fago T7. Los ácidos nucleicos pueden
utilizarse como ácido nucleico desnudo o empaquetarse en
partículas, por ejemplo, como un RNA blindado (US 5.677.124), o
incluirse en un organismo viroide, vírico, bacteriano o
celular.
Tales ácidos nucleicos son por ejemplo útiles
para controlar las reacciones de hibridación y amplificación de
ácidos nucleicos. Estos pueden utilizarse para identificar
resultados falsos negativos debidos a inhibidores presentes en una
muestra o como estándares en un ensayo cuantitativo. El control
puede procesarse en una reacción paralela en diferentes recipientes
(control externo) o coprocesado en el mismo recipiente de reacción
(control interno) que la diana, siendo el último caso
preferible.
La(s) parte(s) esencialmente
complementaria(s) en paralelo en la construcción del control
puede(n) incluir uno o más puntos de unión de la sonda y/o
uno o más puntos de unión del cebador y/o uno o más regiones
flanqueantes del cebador/ sonda, y en el caso más extenso la
secuencia completa del correspondiente ácido nucleico diana.
Esto significa que durante el procesado de un
ácido nucleico control de acuerdo con la presente invención pueden
utilizarse cebadores y/o sondas, que son esencialmente
complementarios en paralelo, preferiblemente complementarios en
paralelo a los utilizados para procesar el ácido nucleico diana. Los
correspondientes cebadores y sondas muestran el mismo contenido en
GC y propiedades de hibridación, que principalmente reflejan las
eficiencias de hibridación de la sonda y del cebador, y las
eficiencias de amplificación, pero no muestran competición respecto
a estos componentes de reacción, ya que los cebadores y/o sondas que
se unen al ácido nucleico control no pueden unirse al ácido
nucleico diana y viceversa. Sólo en el caso de bajas cantidades de
ácido nucleico diana en una muestra tal competición podría llegar a
dar lugar a una ausencia de amplificación de la diana o una unión
de la sonda reducida. Por lo tanto, la utilización de cebadores y
sondas complementarias en paralelo puede aumentar la sensibilidad y
rango lineal de un ensayo. Aunque debe notarse que la utilización de
cebadores idénticos para la amplificación del ácido nucleico diana
y el ácido nucleico control tiene la ventaja de que un juego de
cebadores es suficiente y es posible un control directo de los
cebadores específicos de la diana.
En un análisis cualitativo, el ácido nucleico
control de la presente invención puede utilizarse para identificar
los resultados falsos negativos, preferentemente se utiliza como
ácido nucleico control interno. Debido a su capacidad de mimetizar
de forma muy parecida a la diana, responde a los inhibidores del
mismo modo. Especialmente, cuando se añade el ácido nucleico
control a la reacción en baja concentración, ya que en este caso el
sistema reacciona de forma muy sensible a la aparición de
sustancias inhibidoras. Tales ácidos nucleicos control también
pueden utilizarse como estándares, preferiblemente como estándares
internos, por ejemplo como método para estandarizar los resultados
de experimentos paralelos.
En un análisis cuantitativo, el ácido nucleico
control de la presente invención puede utilizarse como un estándar
cuantitativo para determinar el nivel de partida de ácido nucleico
diana contenido en una muestra. Una cantidad conocida del ácido
nucleico estándar se coamplifica esencialmente bajo las mismas
condiciones de reacción junto con el ácido nucleico diana,
preferiblemente como un estándar interno cuantitativo. Tras la
amplificación o, en el caso de una detección homogénea, durante la
reacción de amplificación, se determina la cantidad de ácido
nucleico diana amplificado y la cantidad de ácido nucleico estándar
amplificado. Utilizando estas y conociendo la cantidad inicial de
ácido nucleico estándar en la reacción es posible calcular la
cantidad inicial de ácido nucleico diana, que estaba presente en la
muestra previamente a la amplificación. Son conocidos en la materia
varios métodos para la cuantificación, lo que incluye por ejemplo
conceptos que utilizan una curva de estándar interno, curva de
estándar externo y el modelo Payan (véase por ejemplo Haberhausen
et al., Journal of Clinical Microbiology, Vol 36, pág. 628 a
633). Debe notarse que no es necesario medir las cantidades
absolutas de las amplificaciones sintetizadas. Para la mayoría de
propósitos las cantidades relativas son suficientes, que pueden
determinarse por ejemplo mediante hibridación de las amplificaciones
con sondas marcadas y la medida de la intensidad de la señal de los
complejos de hibridación.
En una realización preferible, los ácidos
nucleicos control de la presente invención se utilizan en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descrita en las patentes
estadounidenses Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188, Saiki et
al., Science 230:1350-1354; Mullis et
al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
51:263-273; y Mullis y Faloona, 1987, Methods
Enzymol. 155:335-350. Sin embargo la invención no se
limita a ningún método de hibridación o amplificación.
El ácido nucleico control puede añadirse en
determinados momentos de la reacción. Normalmente los ácidos
nucleicos de una muestra, por ejemplo muestra de sangre, suero,
esputo o tejido se purifican al menos parcialmente mediante un
método de preparación de muestras conocido en la materia. El método
particular utilizado no es una parte crítica de la presente
invención. El ácido nucleico control puede añadirse previamente a la
preparación de la muestra permitiendo que el ácido nucleico control
se coprocese con el ácido nucleico diana contenido en la muestra.
Esto permite monitorizar el paso de preparación de la muestra además
de los siguientes pasos de amplificación y/o hibridación de la
sonda.
Como alternativa, el ácido nucleico control
también puede añadirse a la mezcla de reacción de amplificación
tras la preparación de la muestra para permitir la monitorización de
la coamplificación del ácido nucleico diana y del ácido nucleico
control, pero también puede añadirse tras la amplificación en el
paso de hibridación de la sonda, para monitorizar el paso de
hibridación.
Preferiblemente, para la amplificación del ácido
nucleico control se utilizan cebadores que son esencialmente
idénticos o esencialmente complementarios en paralelo a los
cebadores utilizados para la amplificación del ácido nucleico
diana. Como tales cebadores específicos del control tienen
esencialmente la misma temperatura de fusión que los respectivos
cebadores específicos de la diana, es más fácil encontrar el perfil
de ciclos de temperatura apropiado para la amplificación del ácido
nucleico diana y del ácido nucleico control comparado con otras
reacciones de amplificación multiplex. Esto mismo aplica si se
utilizan sondas para la determinación de ácidos nucleicos control o
ácidos nucleicos control amplificados, ya que las sondas son
esencialmente complementarias en paralelo comparadas con las sondas
utilizadas para la determinación del ácido nucleico diana o del
ácido nucleico diana amplificado.
Cuando se amplifican ácidos nucleicos diana y
ácidos nucleicos control utilizando la PCR, normalmente la mezcla
de reacción además del ácido nucleico diana contiene el ácido
nucleico control, cebadores específicos y opcionalmente sondas para
la detección homogénea, y otros componentes de reacción como los
tampones apropiados (por ejemplo tricina), cationes divalentes como
Mg^{2+} o Mn^{2+}, una polimerasa, preferiblemente una
polimerasa termoestable, y los cuatro desoxiribonucleótidos (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP). La reacción de amplificación puede realizarse
con un termociclador conocido en la materia, por ejemplo un PE 9600
(o ABI Prism 7700) (Perkin Elmer Corp.) utilizando un perfil de
ciclos de temperatura que permite la desnaturalización del ácido
nucleico de doble cadena, hibridación específica de secuencia de
los cebadores a la diana y control, y la elongación de los
cebadores por la polimerasa. Este ciclo de temperatura puede
repetirse tantas veces como sea necesario para permitir la síntesis
de una cantidad suficiente de ácido nucleico amplificado para la
determinación. Normalmente se realizan de 30 a 40 ciclos.
En el caso de que los ácidos nucleicos
amplificados se determinen mediante la hibridación de una sonda tras
la amplificación, los ácidos nucleicos amplificados se
desnaturalizan por ejemplo mediante calor o álcali, se neutralizan
(si es necesario), se añade(n) la(s) sonda(s) y
se realiza la hibridación de la sonda con los ácidos nucleicos
amplificados bajo condiciones adecuadas (temperatura y medio
químico). Tales condiciones pueden ser fácilmente determinadas por
un experto realizando algunos experimentos comparativos. Los
complejos de hibridación específicos pueden detectarse utilizando
marcajes y otros medios de detección como se describen aquí.
En el caso de un formato de determinación
homogéneo, los ácidos nucleicos amplificados se detectan en la
mezcla de reacción de amplificación preferiblemente durante la
reacción de amplificación. Si los ácidos nucleicos amplificados se
determinan utilizando sondas específicas, las sondas se añaden a la
reacción de amplificación previamente al inicio de la reacción de
amplificación. Además, tal formato de determinación tiene la ventaja
de que normalmente el tubo no necesita abrirse tras la
amplificación y los riesgos de contaminación se minimizan. La
hibridación de sondas a los ácidos nucleicos amplificados durante la
reacción de amplificación puede monitorizarse utilizando diferentes
métodos. A menudo las sondas están marcadas con marcajes
fluorescentes, que pueden detectarse durante la reacción si hay
detectores adecuados integrados en el termociclador (es decir un ABI
Prism 7700, Perkin Elmer). Para permitir la detección sólo de
sondas que han hibridado o que hibridan con el ácido nucleico
amplificado específicamente, se han establecido varios formatos, a
los que se hace referencia aquí. Utilizando el formato TaqMan la
sonda hibridada es parcialmente digerida por la polimerasa cortando
un primer marcaje de bloqueo del extremo 5' de la sonda, lo que
permite la medida de la señal emitida por un segundo marcaje,
preferiblemente fluorescente, unido a la sonda. Esta señal
fluorescente se utiliza como medida de la cantidad de ácido
nucleico amplificado específicamente sintetizado en la reacción.
Como la sonda específica del ácido nucleico control preferiblemente
tiene otro marcaje fluorescente del de la sonda específica del ácido
nucleico diana, que emite luz con otra longitud de onda, las
señales de ambas sondas pueden medirse de forma separada dentro del
mismo tubo de reacción. Las dos señales pueden utilizarse para
calcular, por ejemplo, la cantidad inicial de ácido nucleico diana
presente en la muestra.
Un objeto preferible de la presente invención es
un método para la cuantificación de un ácido nucleico diana que
comprende los pasos de
\vskip1.000000\baselineskip
a) amplificar una región de dicha región del
ácido nucleico diana y una cantidad conocida del ácido nucleico
control, cubriendo dicho ácido nucleico control esencialmente dicha
región del ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de
dicha región del ácido nucleico diana, en el que la región de dicho
ácido nucleico control cubre esencialmente dicha región del ácido
nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicha región del
ácido nucleico diana contiene al menos una secuencia contigua de al
menos 8 nucleótidos que es esencialmente complementaria en paralelo
de dicho ácido nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho
ácido nucleico diana, que no puede unirse a la secuencia diana;
b) detectar una señal indicativa de la cantidad
de producto de amplificación obtenido a partir de dicho ácido
nucleico control y detectar una señal indicativa de la cantidad de
producto de amplificación obtenido a partir de dicho ácido nucleico
diana
c) calcular la cantidad de dicho ácido nucleico
diana utilizando la cantidad conocida de dicho ácido nucleico
control, la señal indicativa de la cantidad de producto de
amplificación obtenido a partir de dicho ácido nucleico control
determinado en el paso b) y la señal indicativa de la cantidad de
producto de amplificación obtenido a partir de dicho ácido nucleico
diana determinado en el paso b), en el que los ácidos nucleicos
amplificados se detectan en la mezcla de reacción de amplificación
durante la reacción de amplificación que utiliza sondas
específicas, en el que la hibridación de las sondas con los ácidos
nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se
monitoriza, en el que se utiliza una primera sonda para el procesado
de dicho ácido nucleico control que es esencialmente complementaria
en paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de la
región de dicho ácido nucleico diana a amplificar o la
complementaria de dicho ácido nucleico diana, y al menos una
secuencia contigua de al menos 8 nucleótidos de dicho ácido nucleico
control, que no puede unirse a la diana y es complementaria en
paralelo en más del 80% de dicho ácido nucleico diana o de la
cadena complementaria de dicho ácido nucleico diana, en el que la
región del ácido nucleico control consiste en una o más partes, y
en el que la secuencia de cada parte es idéntica en más del 80% o
complementaria en paralelo en más del 80% de la respectiva parte de
la región del ácido nucleico diana a determinar o de la cadena
complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro objeto de la presente invención es un ácido
nucleico control en una reacción para la amplificación de una
región de ácido nucleico diana, cubriendo dicho ácido nucleico
control esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a
amplificar o la complementaria de dicha región del ácido nucleico
diana, en el que la región de dicho ácido nucleico control que
cubre esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a
amplificar o la complementaria de dicho ácido nucleico diana
contiene al menos una secuencia contigua de al menos 8 nucleótidos
y es esencialmente complementaria en paralelo de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana que no puede unirse a la secuencia diana.
Otro objeto de la presente invención es una
composición que comprende un ácido nucleico diana, un ácido nucleico
control, una primera sonda para el procesado de dicho ácido
nucleico control, una segunda sonda para el procesado de dicho
ácido nucleico diana, cebadores para la amplificación de dicho ácido
nucleico diana, y cebadores para la amplificación de dicho ácido
nucleico control, cuya composición está presente en una mezcla de
reacción de hibridación o amplificación para detectar la región del
ácido nucleico diana y en la que dicho ácido nucleico control cubre
esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a determinar o
la complementaria de dicha región del ácido nucleico diana que se
caracteriza porque la región de dicho ácido nucleico control que
cubre esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a
determinar o la complementaria de dicho ácido nucleico diana
contiene al menos una secuencia contigua de al menos 8 nucleótidos y
es esencialmente complementaria en paralelo de dicho ácido nucleico
diana o de la cadena complementaria de dicho ácido nucleico diana,
en la que la secuencia contigua de al menos 8 nucleótidos no puede
unirse a la diana.
Otro objeto de la presente invención es un
equipo para la amplificación de un ácido nucleico diana que
comprende un manual de instrucciones y al menos un contenedor que
contiene al menos un ácido nucleico control, sondas específicas de
la diana y del control, cebadores específicos de la diana y del
control, tampones de reacción, nucleósidos trifosfato, y una
polimerasa, en el que dicho ácido nucleico control cubre
esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a amplificar
o la complementaria de la región de dicho ácido nucleico diana, que
se caracteriza porque una primera sonda para el procesado de dicho
ácido nucleico control es esencialmente complementaria en paralelo
de una segunda sonda para el procesado de la región de dicho ácido
nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicho ácido
nucleico diana, al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido nucleico
diana, en el que la región del ácido nucleico control consiste en
una o más partes, y en el que la secuencia de cada parte es
idéntica en más del 80% o complementaria en paralelo en más del 80%
de la respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a
determinar o de la cadena complementaria. Los equipos más
preferibles contienen además del manual y el ácido nucleico
control, otros componentes de la reacción como sondas específicas de
la diana o del control, cebadores específicos de la diana o del
control, tampones de reacción, nucleósidos trifosfato o enzimas
como una polimerasa. Estos componentes pueden empaquetarse en el
primer contenedor de tal equipo, pero también pueden estar
contenidos en uno o más contenedores adicionales. También es
preferible un equipo útil para la detección de un ácido nucleico
diana utilizando métodos de hibridación, que contiene un manual de
instrucciones y al menos un ácido nucleico control de acuerdo con la
presente invención.
Otro objeto de la presente invención es la
utilización de un ácido nucleico control como control en una
reacción de amplificación de una región del ácido nucleico diana o
en una reacción de hibridación para la determinación de una región
de un ácido nucleico diana, en la que dicho ácido nucleico control
cubre esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a
amplificar o hibridar, o la complementaria de la región de dicho
ácido nucleico diana, que se caracteriza porque los ácidos
nucleicos amplificados se detectan en la mezcla de reacción de
amplificación durante la reacción de amplificación utilizando sondas
específicas y en la que la hibridación de las sondas a los ácidos
nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se
monitoriza, en la que la primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho
ácido nucleico diana a amplificar o hibridar, o la complementaria
de dicho ácido nucleico diana, al menos una secuencia contigua de al
menos 8 nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse
a la diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de la
sonda para el procesado de dicho ácido nucleico diana o de la sonda
para el procesado de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana.
La presente invención se ejemplifica mediante
los siguientes ejemplos:
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección del ácido nucleico de HCV en
el ensayo Taqman puede utilizarse la siguiente sonda, que se une al
amplicón HCV (Id. de Sec. Nº 10):
\vskip1.000000\baselineskip
ST650 (Id. de Sec. Nº 3):
5'(Cy5-)CGG TGT ACT CAC CG(FAMs) TTC CGC
AGA CCA CTA TGG C-PO4-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Cy5: Derivatización de oligonucleótidos con
pentametin-di-indocarbocianina
utilizando un enlazante alquilfosfatidilo (Pharmacia Biotech
Cy5-N-etil-fosforamidita),
Fams: Derivatización de oligonucleótidos con
6-carboxi-fluoresceína utilizando
un enlazante
2-(amino-ciclohexil-)propan-1,3-diol
(Biogenex CX-FAM-fosforamidita).
Todas las secuencias específicas de HCV
incluidas en esta solicitud se derivan de la secuencia del genoma
del HCV tipo I (NCBI, Nº entrada de Genbank AF054249 o
AJ000009).
En el mejor de los casos la sonda para la
detección del control interno mimetiza la sonda de la diana
exactamente, pero es distinguible de la sonda de la diana. La
secuencia complementaria en paralelo de la sonda de la diana,
denominada ST650pc (Id. de Sec. Nº 5), puede utilizarse como sonda
del control interno. ST650pc tienen el mismo contenido GC,
secuencia GC/AT, longitud, estructura secundaria y por lo tanto la
misma temperatura de fusión que la sonda de la diana. Además, como
G y A se sustituyen por C y T, respectivamente, y viceversa, es
distinguible de la sonda de la diana. La ST2535 (Id. de Sec. Nº 4)
contiene una secuencia que no está relacionada con la secuencia de
HCV, por ejemplo no es esencialmente idéntica o esencialmente
complementaria en paralelo de la secuencia de HCV. Un control
interno que contiene una secuencia de unión para ST2535 puede
utilizarse junto con la sonda ST2535 para controlar la reacción de
determinación del ácido nucleico diana. Las sondas y controles que
contienen una secuencia no relacionada con la secuencia del ácido
nucleico diana a menudo se han utilizado previamente en la materia.
Al contrario que éstas, ST650pc (Id. de Sec. Nº 5) tiene el
potencial de mimetizar la sonda de la diana perfectamente.
La sonda ST650pc (Id. de Sec. Nº 5) puede
utilizarse con todas las construcciones de control interno o
estándar de cuantificación que contienen una secuencia de unión de
ST650pc.
\vskip1.000000\baselineskip
ST2535 (Id. de Sec. Nº 4):
5' (Cy5-)TGG ACT CAG TCC T(HEXs)T
GGT CAT CTC ACC TTC T-P04 3'
\vskip1.000000\baselineskip
HEXs: Derivatización de oligonucleótidos con
hexacloro-6-carboxi-fluoresceína
utilizando un enlazante
2-(amino-ciclohexil)propan-1,3-diol
(Biogenex CX-HEX-fosforamidita)
\vskip1.000000\baselineskip
ST650pc (Id. de Sec. Nº 5):
5' (Cy5-)GCC ACA TGA GTG GC(HEXs) AAG GCG
TCT GGT GAT ACC G-PO4 3'
\vskip1.000000\baselineskip
La predicción de estructuras secundarias se
realizó utilizando el software Mfold versión 3.0 (copyright 1996
Dr. M. Zuker, M. Zuker, D.H. Mathews & D.H. Turner, Algorithms
and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A
Practical Guide, en RNA Biochemistry and Biotechnology, J.
Barciszewski & B.F.C. Clark, Ed., NATO ASI Series, Kluwer
Academic Publishers, (1999)). Como se puede observar en la Fig. 2 la
predicción de estructuras secundarias es idéntica entre la sonda de
la diana y la sonda complementaria en paralelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la amplificación del ácido nucleico de HCV
se utilizan los siguientes cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
ST280 (Id. de Sec. Nº 6):
5' GCA GAA AGC GTC TAG CCA TGG CGT TA 3'
\vskip1.000000\baselineskip
ST778 (Id. de Sec. Nº 7):
5' GCA AGC ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACA A 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias complementarias en paralelo de
estos cebadores de amplificación son
\vskip1.000000\baselineskip
ST280 pc (Id. de Sec. Nº 8):
5' CGT CTT TCG CAG ATC GGT ACC TCA AT 3'
\vskip1.000000\baselineskip
ST778 pc (Id. de Sec. Nº 9):
5' CGT TCG TGG GAT AGT CCG TCA TGG TGT T 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Estos cebadores internos diseñados se utilizan
para la amplificación del control interno. La amplificación del
control interno es no competitiva, ya que la diana y el control
interno utilizan diferentes cebadores para la amplificación. Sin
embargo, los cebadores complementarios en paralelo diseñados son
estructuralmente muy similares a los cebadores de la diana,
respecto a contenido GC, secuencia GC/AT, longitud, estructura
secundaria y por lo tanto temperatura de fusión. ST280pc y ST778pc
pueden utilizarse como cebadores de amplificación para todas las
construcciones de control interno y estándares de cuantificación que
son no competitivas y contienen puntos de unión del cebador
apropiados.
Las predicciones de estructuras secundarias,
realizadas con Mfold versión 3.0, son idénticas entre los cebadores
de la diana y los cebadores complementarios en paralelo (véase Fig.
3).
\vskip1.000000\baselineskip
Un fragmento de DNA de doble cadena se clonó,
utilizando oligonucleótidos solapados con una longitud de
60-120 b, que es complementario en paralelo de un
fragmento de 5' del genoma del HCV tipo I y que incluye la región
altamente conservada 5'-UTR. El fragmento que se
sintetizó y clonó es de 943 pb de longitud y se clonó en el punto
Bgl II/ Hind III de un vector de expresión de aRNA (AMBION, Austin,
USA). Los resultados de expresión en una partícula de RNA blindado
que contiene un RNA que incluye el gen de la proteína de cubierta
MS-2, la señal de empaquetamiento de
MS-2 y la secuencia complementaria en paralelo del
fragmento de 5' del HCV. Este RNA es distinguible de la diana, pero
la complementariedad en paralelo, contenido GC y secuencia de
nucleótidos G o C y A o T son idénticos a los del correspondiente
fragmento del HCV, lo que influye principalmente en la estructura
secundaria. Esta construcción se coamplifica y detecta en la misma
reacción junto con la diana de HCV (Id. de Sec. Nº 10) de forma no
competitiva utilizando los cebadores y la sonda mencionados en el
ejemplo 2 y 1, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia del fragmento clonado Bgl II/ Hind III
de QS(pc)HCV (Id. de Sec. Nº 11):
Nueva sec.: 943 pb;
Composición 203 A; 287 C; 282 G; 171 T; 0
Otros
Porcentaje: 22% A; 30% C; 30% G; 18% T; 0%
Otros
Peso molecular (kDa): ssDNA: 291,24; dsDNA:
581,5
Origen
Impreso en negrita: amplicón (Id. de Sec. Nº 12)
al utilizar los cebadores ST280pc y ST778pc para la
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido nucleico control desordenado (Id. de
Sec. Nº 13) tiene un punto de unión de los cebadores ST280 y ST778,
un punto de unión de la sonda ST2535 y es de la misma longitud y
contenido GC que el amplicón de la diana HCV. El plegamiento se
realizó con Mfold versión 3.0, véase la Fig. 4.
Los amplicones de HCV y la complementaria en
paralelo QS(pc)HCV tienen el potencial de formar
estructuras secundarias similares. Esta es diferente de la
estructura que forma el amplicón del control interno desordenado
(QSHCV) (Id. de Sec. Nº 13) que es conocida en la materia. Como el
amplicón QS(pc)HCV (Id. de Sec. Nº 12) mimetiza de
forma muy exacta el amplicón de la diana HCV,
QS(pc)HCV (Id. de Sec. Nº 11) es la mejor elección
como control de la amplificación de la diana.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el ejemplo 3 se clonó un
fragmento de DNA sintético de 375 pb, es decir, aparte del punto de
unión del cebador, complementario en paralelo al 5'UTR del HCV tipo
I. Los puntos de unión del cebador son idénticos a los de la
secuencia de la diana para dar lugar a una PCR competitiva entre
diana y control. La secuencia entre ambos cebadores es
complementaria en paralelo para mimetizar la diana. Como el
contenido en GC, longitud y secuencia de G/C y A/T entre los
cebadores es idéntica a la de la diana, esta construcción es muy
parecida al amplicón de la diana. Esta construcción puede
coamplificarse y detectarse en la misma reacción junto con la diana
HCV de forma competitiva utilizando los cebadores de amplificación
de la diana y la sonda complementaria en paralelo mencionada en el
ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
ICSJ620HCV (Id. de Sec. Nº 14)
Nueva sec.: 375 pb;
Composición 76 A; 104 C; 117 G; 78 T; 0
Otros
Porcentaje: 20% A; 28% C; 31% G; 21% T; 0%
Otros
Peso molecular (kDa): ssDNA: 116,05; dsDNA:
231,2
Origen
\vskip1.000000\baselineskip
Impreso en negrita: amplicón (Id. de Sec. Nº 15)
al utilizar los cebadores ST280 y ST778 para la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.950000\baselineskip
Se amplificaron fragmentos relacionados de
HCV-1b salvaje, QSHCV y QS(pc)HCV y a
continuación los productos de amplificación se compararon en
experimentos de hibridación utilizando SybrGreen como agente
intercalante para profundizar en la cinética de plegamiento del
amplicón
- 1000 UI
- RNA de HCV-1b, QSHCV o QS(pc)HCV en concentraciones comparables (UI: Unidad Internacional, Estándar de la WHO)
- 5%
- DMSO
- 5,64%
- Glicerol
- 50 mM
- Tricina (pH = 8,3)
- 100 mM
- KOAc (pH = 7,5)
- 300 \muM
- dNTP (A, C, G)
- 50 \muM
- dTTP
- 500 \muM
- dUTP
- 20 pmol
- NTQ21-46-A (Aptamero, Secuencia: CGA TCA TCT CAG AAC ATT CTT AGC GTT TTG TTC TTG TGT ATG ATC G-PO_{4})
- 40 U
- ZO5 Polimerasa
- 10 U
- UNG (Uracil-N-Glucosilasa)
- 3 mM
- Mn(Ac)_{2}
- 12 \mul
- Sybr-Green (dilución 1:300, de Molecular Probes, Leiden Netherlands; concentrado 10000x en DMSO)
- hasta 100 \mul
- Cebadores en agua tratada con DEPC
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores en la amplificación de
HCV-1b y QSHCV
15 pmol ST280
40 pmol ST778
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores en la amplificación de
QS(pc)HCV
15 pmol ST280pc
40 pmol ST778pc
\vskip1.000000\baselineskip
La polimerasa ZO5 se describe en la patente
estadounidense Nº 5.455.170 y la patente estadounidense Nº
5.674.738.
\vskip1.000000\baselineskip
Ciclos de amplificación:
(50ºC 240 s
59ºC 1800 s) 1x
(95ºC 15 s
58ºC 25 s) 5x
(91ºC 15 s
58ºC 25 s) 55x
\vskip1.000000\baselineskip
Curva de hibridación:
pasos de 0,5ºC iniciándose en 90ºC y enfriando
hasta 70ºC
20 s cada paso
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación y las curvas de hibridación
(detectadas por el Sybr-Green intercalado) se
realizaron en un ABI Prism 7700 (Perkin Elmer Corp.)
\vskip1.000000\baselineskip
En el ensayo la referencia es la curva de
hibridación del amplicón HCV-1b. La construcción del
control interno que se utiliza en la materia QSHCV muestra una
curva de hibridación con una temperatura de fusión superior,
mientras la curva de hibridación de la secuencia control
complementaria en paralelo QS(pc)HCV encaja con la
curva de hibridación del amplicón HCV-1b casi
perfectamente.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un método para la determinación de
un ácido nucleico utilizando un control
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 18981
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial para ejemplificar un principio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgcatgcc agattactgg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial para ejemplificar un principio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgcgtacgg tctaatgacc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de la sonda específica de HCV ST650
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región N
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa un enlazante básico
((2-amino-ciclohexil)propan-1,3-diol)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtgtactc accgnttccg cagaccacta tggc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de la sonda ST2535
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región N
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa un enlazante básico
((2-amino-ciclohexil)propan-1,3-diol)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggactcagt cctntggtca tctcaccttc t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de la sonda ST650pc (complementaria en
paralelo de ST650)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región N
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n representa un enlazante básico
((2-amino-ciclohexil)propan-1,3-diol)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccacatgag tggcnaaggc gtctggtgat accg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia del cebador específico de HCV ST280
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaaagcg tctagccatg gcgtta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia del cebador específico de HCV ST778
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagcaccc tatcaggcag taccacaa
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador ST280pc, complementario en paralelo de ST280
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtctttcgc agatcggtac ctcaat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador ST778pc, complementario en paralelo de ST778
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttcgtggg atagtccgtc atggtgtt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia de DNA derivada mediante amplificación a
partir de HCV tipo 1 utilizando los cebadores ST280 y ST778
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 943
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: QS(pc)HCV que es complementaria en
paralelo a la respectiva región del genoma del HCV tipo 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: amplicón derivado de QS(pc)HCV utilizando
los cebadores ST280pc y ST778pc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Artificial
Secuencia: secuencia del amplicón derivado de QSHCV (control
amplificación de HCV con puntos de unión de ST280, ST778 y ST2535)
utilizando los cebadores ST280 y ST778
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 375
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ICSJ620HCV (control amplificación específico de HCV con
un punto de unión de ST280 y ST778 y una región interna que es
complementaria en paralelo de HCV)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: amplicón derivado de ICSJ620HCV (control de
amplificación específico de HCV) utilizando ST280 y ST778 como
cebadores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: NTQ21-46-A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatcatctc agaacattct tagcgttttg ttcttgtgta tgatcg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: secuencia artificial para ejemplificar un principio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtcattag accgtacgcg a
\hfill21
Claims (10)
1. Un método para la amplificación de una región
del ácido nucleico diana en una muestra, que comprende el paso de
amplificar una cantidad conocida de ácido nucleico control y dicho
ácido nucleico diana, y dicho ácido nucleico control cubre
esencialmente dicha región de dicho ácido nucleico diana a
amplificar o la complementaria de dicha región del ácido nucleico
diana,
que se caracteriza porque
- los ácidos nucleicos amplificados se detectan
en la mezcla de reacción de amplificación durante la reacción de
amplificación utilizando sondas específicas,
- la hibridación de las sondas con los ácidos
nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se
monitoriza,
- una primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho
ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicho
ácido nucleico diana,
- al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana,
- la región del ácido nucleico control consiste
en una o más partes, y
- la secuencia de cada parte es idéntica en más
del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la
respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un método para la cuantificación de una
región del ácido nucleico diana que comprende los pasos de:
a) amplificar dicha región del ácido nucleico
diana y una cantidad conocida de ácido nucleico control, cubriendo
dicho ácido nucleico control esencialmente dicha región del ácido
nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicha región del
ácido nucleico diana
b) detectar una señal indicativa de la cantidad
de producto de amplificación obtenido a partir de dicho ácido
nucleico control y detectar una señal indicativa de la cantidad de
producto de amplificación obtenido a partir de dicho ácido nucleico
diana
c) calcular la cantidad de dicho ácido nucleico
diana utilizando la cantidad conocida de dicho ácido nucleico
control, la señal indicativa de la cantidad de producto de
amplificación obtenido a partir de dicho ácido nucleico control
detectado en el paso b) y la señal indicativa de la cantidad de
producto de amplificación obtenido a partir de dicho ácido nucleico
diana detectado en el paso b)
que se caracteriza porque
- los ácidos nucleicos amplificados se detectan
en la mezcla de reacción de amplificación durante la reacción de
amplificación utilizando sondas específicas,
- la hibridación de las sondas con los ácidos
nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se
monitoriza,
- una primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho
ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicho
ácido nucleico diana,
- al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana,
- la región del ácido nucleico control consiste
en una o más partes, y
- la secuencia de cada parte es idéntica en más
del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la
respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
\newpage
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el
que dicho ácido nucleico diana y dicho ácido nucleico control se
amplifican utilizando la PCR.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho ácido nucleico diana y
dicho ácido nucleico control se amplifican en el mismo recipiente de
reacción.
5. Un equipo para la amplificación de un ácido
nucleico diana que comprende un manual de instrucciones, cebadores
para la amplificación de dicho ácido nucleico diana, al menos un
contenedor que contiene al menos un ácido nucleico control, sondas
específicas de la diana y del control, cebadores específicos de la
diana y del control, tampones de reacción, nucleósidos trifosfato,
y una polimerasa, en el que dicho ácido nucleico control cubre
esencialmente dicha región del ácido nucleico diana a amplificar o
la complementaria de dicha región del ácido nucleico diana,
que se caracteriza porque
- una primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho
ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicho
ácido nucleico diana,
- al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana,
- la región del ácido nucleico control consiste
en una o más partes, y
- la secuencia de cada parte es idéntica en más
del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la
respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El equipo de la reivindicación 5, en el que
la secuencia de al menos un punto de unión de cebador de dicho
ácido nucleico control es complementaria en paralelo de un punto de
unión de cebador de dicho ácido nucleico diana o de la cadena
complementaria de dicho ácido nucleico diana.
7. Una composición que comprende un ácido
nucleico diana, un ácido nucleico control, una primera sonda, una
segunda sonda, cebadores para la amplificación de dicho ácido
nucleico diana, y cebadores para la amplificación de dicho ácido
nucleico control, en el que dicho ácido nucleico control cubre
esencialmente dicha región del ácido nucleico diana a amplificar o
la complementaria de dicha región del ácido nucleico diana,
que se caracteriza porque
- la primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de la segunda sonda utilizada para el procesado de dicha
región del ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de
dicho ácido nucleico diana,
- al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana,
- la región del ácido nucleico control consiste
en una o más partes, y
- la secuencia de cada parte es idéntica en más
del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la
respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Una composición como la de la reivindicación
7, en la que la secuencia de al menos un punto de unión de sonda de
dicho ácido nucleico control es complementaria en paralelo del punto
de unión de sonda de dicho ácido nucleico diana o la cadena
complementaria del punto de unión de sonda de dicho ácido nucleico
diana.
9. La utilización de un ácido nucleico como
control en una reacción de amplificación del ácido nucleico diana
en la que dicho ácido nucleico control cubre esencialmente la región
de dicho ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de
dicha región del ácido nucleico diana
que se caracteriza porque
- los ácidos nucleicos amplificados se detectan
en la mezcla de reacción de amplificación durante la reacción de
amplificación utilizando sondas específicas,
- la hibridación de las sondas con los ácidos
nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se
monitoriza,
- una primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho
ácido nucleico diana a amplificar o la complementaria de dicho
ácido nucleico diana,
- al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana,
- la región del ácido nucleico control consiste
en una o más partes, y
- la secuencia de cada parte es idéntica en más
del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la
respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
\vskip1.000000\baselineskip
10. La utilización de un ácido nucleico como
control en una reacción de hibridación para la determinación de
dicho ácido nucleico diana, en la que dicho ácido nucleico control
cubre esencialmente la región de dicho ácido nucleico diana a
determinar o la complementaria de dicha región del ácido nucleico
diana
que se caracteriza porque
- los ácidos nucleicos amplificados se detectan
en la mezcla de reacción de amplificación durante la reacción de
amplificación utilizando sondas específicas,
- la hibridación de las sondas con los ácidos
nucleicos amplificados durante la reacción de amplificación se
monitoriza,
- una primera sonda utilizada para el procesado
de dicho ácido nucleico control es esencialmente complementaria en
paralelo de una segunda sonda utilizada para el procesado de dicho
ácido nucleico diana a determinar o la complementaria de dicho
ácido nucleico diana,
- al menos una secuencia contigua de al menos 8
nucleótidos de dicho ácido nucleico control no puede unirse a la
diana y es complementaria en paralelo en más del 80% de dicho ácido
nucleico diana o de la cadena complementaria de dicho ácido
nucleico diana,
- la región del ácido nucleico control consiste
en una o más partes, y
- la secuencia de cada parte es idéntica en más
del 80% o complementaria en paralelo en más del 80% de la
respectiva parte de la región del ácido nucleico diana a determinar
o de la cadena complementaria.
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| EP01105172A EP1236804A1 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | A method for determination of a nucleic acid using a control |
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|---|---|
| ES2305144T3 true ES2305144T3 (es) | 2008-11-01 |
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| ES (1) | ES2305144T3 (es) |
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| US5457027A (en) * | 1993-05-05 | 1995-10-10 | Becton, Dickinson And Company | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions |
| US5837501A (en) * | 1993-07-09 | 1998-11-17 | Akzo Nobel N.V. | Nucleic acid quantitation by co-amplification of target with multiple internal controls |
| IT1303767B1 (it) * | 1998-11-17 | 2001-02-23 | San Raffaele Centro Fond | Metodo di quantificazione di acidi nucleici. |
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- 2002-02-27 EP EP02004483A patent/EP1236805B1/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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