ES2305502T3 - Metodo para la identificacion de especies biologicas. - Google Patents
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Abstract
La presente invención aporta un método de identificación de especies y subespecies en una muestra biológica mediante la amplificación selectiva de segmentos de ácido nucleico que codifican una región target de la proteína beta-actina citoplasmática, presente en todos los organismos de interés. El método comprende la extracción del DNA de la muestra; la amplificación por PCR o técnica equivalente de segmentos divergentes del gen de la beta-actina citoplasmática, a partir de primers de regiones con alta conservación evolutiva entre especies y subespecies; y la identificación del segmento amplificado por comparación de su tamaño en pares con un patrón de tamaños preestablecido y/o identificación del segmento amplificado por secuenciación de DNA y comparación de la secuencia resultante con la secuencia especificada de cada especie o subespecie presente en una base de datos informática.
Description
Método para la identificación de especies
biológicas.
La presente solicitud se refiere al campo del
análisis taxonómico de muestras biológicas, basado en el uso de la
secuencia de ADN de una proteína evolutivamente muy conservada.
El análisis taxonómico de muestras es aplicable
a un amplio espectro de industrias y actividades. Las tres áreas
principales de aplicación del análisis taxonómico son:
\vskip1.000000\baselineskip
La demanda de pruebas que proporcionen la
trazabilidad del origen taxonómico de muestras biológicas o de
productos alimenticios se ha incrementado desde la crisis en el
sector alimenticio desencadenada por el brote epidemiológico de la
encefalopatía espongiforme bovina en el Reino Unido y la tendencia
creciente a mezclar ilegalmente carnes de diferentes orígenes
taxonómicos, sin etiquetar en consecuencia el producto final. Por
ejemplo, se ha descrito que se ha añadido sistemáticamente carne de
origen bovino a productos avícolas importados desde todo el mundo a
Holanda y posteriormente distribuidos por toda Europa. También se
ha informado de otras formas de adulteración y se cree que la
práctica puede estar ampliamente extendida en industrias de este
sector. No obstante, esto es difícil de detectar sin desarrollar
técnicas avanzadas basadas en el análisis de ADN.
Las pruebas de seguridad en productos
alimenticios normalmente se llevan a cabo en laboratorios del
gobierno, plantas de procesamiento de alimentos y compañías de
servicios asociadas a estas industrias. Actualmente, los usuarios de
este sector buscan cada vez más procedimientos de control en
respuesta a las demandas crecientes de los clientes. A este
aspecto, ciertas cadenas de supermercados han establecido
asociaciones con firmas tecnológicas para desarrollar
procedimientos de rastreo del origen taxonómico de productos
cárnicos usando técnicas genéticas.
En una solicitud relacionada, el análisis de
alimentos para animales es una de las prioridades de la Agenda
agrícola europea, particularmente después de la crisis de las
"vacas locas" que concierne a los alimentos para animales. El
análisis de productos alimenticios es muy deseable y podría ser
obligatorio en un futuro cercano. Los procedimientos de control
actualmente están basados en el mantenimiento de registros pero
estos no cubren las prácticas de adulteración ilegal o diluciones
que se llevan a cabo indiscriminadamente en muchas partes del
mundo.
\vskip1.000000\baselineskip
La biodiversidad es el resultado de las
interacciones entre la historia filogenética de la vida en la Tierra
y los procesos evolutivos. Como tal, la biodiversidad es la suma de
toda la vida en la tierra e incluye la diversidad genética y
funcional y la diversidad de especies.
Una de las primeras etapas en los programas de
control de la biodiversidad es la recopilación de un inventario
taxonómico, especificando todos los taxones, y su sistematización en
un ecosistema específico que incluye animales, plantas y
microorganismos. Estos inventarios proporcionan la base de control
de la biodiversidad y de los programas de conservación. La
biodiversidad global es extremadamente vasta: hasta ahora se han
descrito 52.629 especies diferentes de vertebrados, 4,63 millones
de especies de invertebrados y 265.876 especies de plantas y hongos
(cifras tomadas de la Lista roja).
El ADN se acepta cada vez más como medio de
control de la biodiversidad. Por ejemplo, el ADN obtenido del
pelaje encontrado en los bosques canadienses en 2002 se usó para
confirmar que aún existe el lince salvaje en la región de los
grandes lagos.
\vskip1.000000\baselineskip
Actualmente hay aproximadamente 8000 especies de
animales y plantas en las listas oficiales de especies en peligro
de extinción, y este número aumenta cada año. Esta tendencia apunta
a la necesidad de pruebas directas usables "universalmente"
para la identificación del origen taxonómico de muestras
biológicas.
El comercio de productos procedentes de especies
en peligro de extinción está controlado por la Convención para el
comercio internacional de especies de fauna y flora salvaje en
peligro de extinción (CITES) y actualmente se están desarrollando
pruebas de ADN bajo el patrocinio de esta organización para
controlar este comercio ilegal. Es particularmente importante ser
capaz de detectar productos de animales o plantas procesados, tales
como productos alimenticios o cosméticos, más que materiales en
bruto derivados de animales tales como pieles, que no requieren
pruebas de ADN para su identificación. Un ejemplo de esto es el uso
de dientes de tigre pulverizados, que se usan en medicinas
tradicionales, a pesar de que se ha declarado que la supervivencia
de la especie está en grave peligro. Las pruebas de ADN se han
usado para identificar el material procedente de tigres basándose
en la secuencia genética del citocromo b en ADN amplificado y se
han descrito pruebas similares para localizar carne de ballena
procedente de grupos protegidos en productos procesados que
aparentemente contienen carne de ballena "legal". Se han
aplicado soluciones similares para proteger orquídeas, serpientes y
cocodrilos en productos destinados al consumo humano y el origen de
caviar procedente de esturiones protegidos, etc. Es muy probable que
el uso de este tipo de tecnologías para el control de especies en
peligro de extinción esté mucho más extendido en un futuro
próximo.
La metodología usada para determinar el origen
animal de muestras biológicas procede principalmente de la
industria alimenticia y del sector de productos cárnicos. Desde los
procedimientos tradicionales basados en el análisis electroforético
y/o inmunoquímico de proteínas, la tecnología ha progresado hacia
el análisis del contenido en ADN de muestras alimenticias para
identificar inequívocamente la naturaleza del producto. Estos
procedimientos identifican los ácidos nucleicos mediante la
hibridación de sondas específicas para una especie específica y/o
la amplificación selectiva de las secuencias diana usando la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La amplificación hace diana en segmentos de ADN
mitocondrial (véase Bartlett y col. BioTechniques 1992 vol. 12
págs. 408-411; Unseld y col. Genome Research 1995
vol. 4 págs. 241-243; Palumbi y col. J. Hered. 1998
vol. 89 págs. 459-464; Wolf y col. J. Agricult. and
Food Chem. 1999 vol. 47 págs. 1350-1355; Partis y
col. Meat Science 2000 vol. 54 págs. 369-376). Este
procedimiento no es adecuado para determinar muestras con un origen
taxonómico doble o heterogéneo. La amplificación también hace diana
en el ADN nuclear (véase Janssen y col. J. Ind. Microbiol. and
Biotech. 1998 vol. 21 págs. 115-120, Matsunaga y
col. Meat Science 1999 vol. 51 págs. 143-148; Wolf y
Lüthy, Meat Science 2001 vol. 57 págs. 161-168).
Algunas de las proteínas más importantes han sido la topoisomerasa
de ADN de tipo II (véase Pat. de EE.UU. Nº 5.645.994) y la actina
a-cardiaca (véase Bartlett y col. Meat Science 1998
vol. 50 págs. 105-114; Fairbrother y col. Animal
Biotech. 1998 vol. 9 págs. 89-100; Lockley y
Bardsley, Meat Science 2002 vol. 61 págs.
163-168).
Algunos procedimientos se basan en una PCR en la
que un cebador de oligonucleótidos es genérico y el otro depende de
la especie a identificar, lo que tiene utilidad en la
identificación de especies cárnicas consumidas de forma
generalizada (véase Matsunaga y col. Meat Science 1999 vol. 51 págs.
143-148). Se han diseñado otros procedimientos para
confirmar la presencia de ADN procedente de especies porcinas
(véase Montiel-Sosa y col. J. Agric. Food Chem.
2000 vol. 48 págs. 2829-2832), bovinas, de
avestruces y emúes (véase Colombo y col. Meat Science 2000 vol. 56
págs. 15-17) en muestras biológicas, pero el
problema surge cuando su presencia fracasa en ser confirmada, puesto
que esta tecnología no proporciona datos de la identidad taxonómica
de la muestra analizada.
El documento más cercano a la presente invención
es la patente de EE.UU. 5.645.994, que describe un procedimiento
para amplificar selectivamente segmentos de ADN de uno o más
organismos en una muestra mediante el uso de secuencias génicas de
topoisomerasa de ADN de tipo II.
No obstante, actualmente, todos estos
procedimientos son de uso limitado cuando la muestra comprende una
mezcla de organismos. Sólo confirmaría la presencia de un organismo
conocido previamente o de un organismo sospechoso y no sería
posible identificar cada uno de los organismos presentes en la
muestra.
Es deseable encontrar un modo de identificar una
pluralidad de organismos en una sola muestra sin tener que usar
múltiples sondas y sin un conocimiento previo de los organismos que
pudieran estar presentes. Otro aspecto que se podría mejorar es la
capacidad de distinguir especies muy similares o
interrelacionadas.
La presente solicitud pertenece al análisis
taxonómico de muestras que comprende la amplificación del gen de la
beta-actina citoplasmática. La estructura molecular
del gen de la beta-actina citoplasmática humana ha
sido descrita por Nakajima-iijima (PNAS, vol. 22,
nº 18, 1985, págs. 6133-37).
Las siguientes definiciones se proporcionan para
los propósitos de la presente descripción:
Proteína ubicua: proteínas con estructura y
función similares que están presentes en muchos o en todos los
organismos. Una proteína con estas características será igual que la
proteína equivalente del resto de las especies.
Segmento conservado: usado para ref erirse a
segmentos de aminoácidos y segmentos de nucleótidos. Segmentos
presentes que son sustancial o completamente comunes a las
diferentes especies. El "alto" grado de conservación indica que
la proporción de segmentos que tienen en común las diversas especies
es elevada. Esto se denomina secuencia consenso.
Segmento divergente: usado para referirse tanto
a segmentos de aminoácidos como segmentos de nucleótidos. Segmentos
presentes que son sustancialmente diferentes entre especies
diferentes. En este documento el término "diana" también se
usará para referirse a estas secuencias.
La presente solicitud soluciona muchas de las
limitaciones anteriormente mencionadas. En este aspecto, los
inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente
que el gen que codifica la proteína beta-actina
citoplasmática y sus productos derivados se puede aplicar a la
identificación taxonómica usando muestras de material biológico que
procede de una sola especie o de una mezcla heterogénea de especies
y/o subespecies.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la identificación de especies y subespecies en
una muestra biológica que procede de una sola especie o de una
mezcla heterogénea de especies y/o subespecies, por medio de la
amplificación selectiva de segmentos de ácidos nucleicos que
codifican una región diana de una macromolécula presente en todos
los organismos implicados, por lo que, según un primer aspecto, el
objeto de la presente invención es un procedimiento que comprende
una etapa en la que se extrae ADN de la muestra; una etapa donde se
amplifican segmentos génicos de beta-actina
citoplasmática mediante PCR o una técnica equivalente con pares de
cebadores de oligonucleótidos seleccionados del grupo de pares de
cebadores de oligonucleótidos constituidos por: P1 y P2; P3 y P4;
P5 y P6; y P7 y P8; y una etapa donde el segmento amplificado se
identifica comparando su tamaño en pares de bases con un patrón de
un tamaño pre-establecido y/o identificando el
segmento amplificado por secuenciación de ADN y la comparación de
la secuencia resultante con la secuencia específica de cada una de
las especies o subespecies presentes en una base de datos.
La etapa donde se amplifica el ADN de partida no
está restringida al uso de la PCR; es posible usar cualquier
técnica equivalente que se pueda llevar a cabo por una persona
experta en la materia usando las herramientas disponibles
actualmente. Asimismo, por ejemplo, a la vista de los resultados la
PCR no está restringida al uso de electroforesis en gel de agarosa;
también es posible usar electroforesis capilar, una electroforesis
automatizada o cualquier técnica equivalente con una resolución
mínima que sea suficiente para llevar a cabo con éxito el
experimento.
Las regiones a amplificar son segmentos génicos
divergentes procedentes del gen de la beta-actina
citoplasmática con secuencias de ADN con una conservación evolutiva
elevada entre especies y subespecies. Y más particularmente, las
regiones a amplificar son aquellas que están entre la secuencia 3'
del exón aguas arriba y la secuencia 5' del exón aguas abajo que
comprenden la secuencia intrónica completa y parte de las
secuencias exónicas flanqueantes.
Las regiones a amplificar son aquellas que están
entre las posiciones 1130-1473,
1452-2063, 2438-2680 y/o
2642-2960 (numeración en relación con la secuencia
de ADN del locus humano HUMACCYBB con número de acceso M10277
Genebank). En particular, las muestras consisten en tejido animal,
más específicamente tejido de caballo, cabra, conejo, perro, gato,
chimpancé, humano y/u oso pardo. En otra forma de realización, las
muestras consisten en tejido de plantas.
En otra forma de realización particular de este
procedimiento, en la etapa de identificación, el segmento o
segmentos amplificados se comparan con la secuencia humana M10277
y/o con las secuencias de estas mismas regiones génicas de especies
incluidas en una base de datos. Los segmentos amplificados muestran
las áreas conservadas en los extremos de cada segmento amplificado y
la divergencia en la región central correspondiente mayormente a la
región intrónica del gen.
La presente invención proporciona el medio de
identificación de una pluralidad de organismos en una sola muestra
sin tener que usar múltiples sondas que sean específicas para cada
una de las especies y subespecies que pudieran estar presentes en la
muestra. El procedimiento usa cebadores universales, que son
válidos para identificar cualquier especie o subespecie presente en
la muestra sin conocimiento previo de los organismos que pudieran
estar presentes. Según la invención, se usa una composición de
cebadores universales, que se hibridan con las regiones conservadas
del gen de la beta-actina citoplasmática,
preferentemente 5 con las secuencias que están entre las posiciones
130-1191 y 1453-1473;
1453-1473 y 2041-2065;
2433-2459 y 2643-2680 y/o
2643-2680 y 2940-2960 (numeración en
relación con la secuencia de ADN del locus humano HUMACCYBB con
número de acceso M10277). Los pares particulares de cebadores
universales usados son P1 (1132-1151)
5TCCGGCATGTGCAAGGCCGG3' y P2 (1474-1454)
5'CTCCATGTCGTCCCAGTTGG3'; P3 (1453-1484) 5
5'ACCAACTGGGAC
GACATGGAGAAGATCTGGC3' y P4 (2063-2034) 5TACATGGCNGGGGTGTTAAAGGTCTCAAAC3', P5 (2434-2463) 5TGOOCTGAGGCCCTCTTCCAGCCTTCCTTC3' Y P6 (2681-2643) 5'GGGTACATGGTGGTGCCGCCA
GACAGCACNGTGTTGGC3'; y P7 (2643-2681) 5'GCCAACACNGTGCTGTCTGGCGGCACCACCATGTACC
C3' y P8 (2952-2932) D 5TCGTACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG3'.
GACATGGAGAAGATCTGGC3' y P4 (2063-2034) 5TACATGGCNGGGGTGTTAAAGGTCTCAAAC3', P5 (2434-2463) 5TGOOCTGAGGCCCTCTTCCAGCCTTCCTTC3' Y P6 (2681-2643) 5'GGGTACATGGTGGTGCCGCCA
GACAGCACNGTGTTGGC3'; y P7 (2643-2681) 5'GCCAACACNGTGCTGTCTGGCGGCACCACCATGTACC
C3' y P8 (2952-2932) D 5TCGTACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG3'.
Según un segundo aspecto, otro objeto de la
presente invención es el uso de secuencias de ADN del gen de la
beta-actina citoplasmática en muestras biológicas
que proceden de una sola especie o de una mezcla heterogénea de
especies y/o subespecies, obtenidas mediante PCR con pares de
cebadores de oligonucleótidos seleccionados del grupo constituido
por: P1 y P2; P3 y P4; P5 y P6; y P7 y P8; para identificar las
especies biológicas a las cuales pertenecen las muestras.
La proteína beta-actina
citoplasmática cumple con una serie de criterios para conseguir una
identificación fiable. Es una proteína ubicua en todos los
organismos implicados. La beta-actina citoplasmática
es una de las seis isoformas diferentes de la actina identificadas
hasta ahora. Específicamente, la beta-actina
citoplasmática es una de las dos actinas citoesqueléticas no
musculares. Su función es permitir la movilidad y proporcionar
estructura e integridad a la célula, siendo un componente
mayoritario del aparato contráctil celular. Por esta razón, es una
proteína fundamental para la supervivencia de la célula, lo que
significa que presenta segmentos exónicos con una elevada
conservación evolutiva entre especies. El grado de equivalencia en
su secuencia de aminoácidos entre especies está entre el 98% y el
100%, suficiente para presentar segmentos muy conservados pero
también segmentos divergentes en las partes no codificantes del gen
para distinguir correctamente entre especies que están muy
relacionadas entre sí. La divergencia de nucleótidos
correspondientes, por ejemplo, al intrón B de las especies
estudiadas (1216-1347 pb, numeración en relación con
la secuencia de ADN del locus humano HUMACCYBB, número de acceso
M10277) es inferior al 25%. Los segmentos que están muy conservados
entre las diferentes especies y subespecies hacen posible usar
cebadores que sean comunes a todas las especies y subespecies,
mientras que los segmentos divergentes son objeto de la
amplificación usando dichos cebadores, que resulta en un patrón de
amplificación diferente para cada una de las especies y
subespecies.
Además de la identificación cualitativa de las
especies presentes en una muestra desconocida, un aspecto de la
presente invención se refiere al análisis cuantitativo de las
especies presentes. Esta característica es importante, por ejemplo,
en la determinación de los niveles de contaminación de una muestra
por un material que procede de otra especie. En muchos casos, un
resultado cualitativo será suficiente (por ejemplo, ¿se ha
adulterado la carne de pollo usando productos bovinos?), pero en
otros casos será necesaria una respuesta cuantitativa (¿cuánto
producto bovino se ha añadido a la carne de pollo?). Esto es
particularmente importante cuando se aceptan ciertos aditivos dentro
de límites específicos.
A lo largo de toda la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
implican la exclusión de otras características técnicas, aditivos,
componentes o etapas. El resumen de esta solicitud está incluido
aquí a modo de referencia.
Para personas expertas en la materia, aparecerán
otros objetos, ventajas y características de la invención en parte
a partir de la descripción y en parte cuando la invención se lleve
a la práctica. Las siguientes formas de realización y figuras
particulares se proporcionan a modo de ejemplo ilustrativo no
limitante de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra un diagrama de la estructura
del gen de la beta-actina citoplasmática humana.
Las cajas representan los exones (exón 1 a 6) y la línea negra
continua representa los intrones (I, intrón A a E). Las regiones W,
X, Y y Z corresponden a regiones que están dentro de los pares de
cebadores P1 y P2, P3 y P4, P5 y P6, y, P7 y P8, respectivamente.
Estos fragmentos (W, X, Y y Z) incluyen secuencias de ADN que son
divergentes entre diferentes especies biológicas y se pueden
amplificar usando PCR usando los cebadores P1 a P8 como se muestra
en la Figura 2.
La Figura 2 muestra los detalles de los
cebadores de oligonucleótidos mostrados en la Figura 1. La
numeración corresponde a su posición en la secuencia del genoma del
gen de la beta-actina humana (número de acceso,
Genebank: M10277; Locus: HUMACCYBB). A: Adenina, C: Citosina, G:
Guanina: T: Timina. N: posición con degeneración de nucleótido.
Figura 3 Parte superior de la Figura: muestra la
secuencia parcial de aminoácidos de la proteína
beta-actina citoplasmática de tres especies
diferentes, Homo sapiens (hombre), Mus musculus
(ratón) y Caenorhabditis eledans (nematodo). El alineamiento
entre estas secuencias muestra el alto grado de conservación de la
proteína beta-actina citoplasmática entre especies.
Los asteriscos indican una equivalencia del 100% en esa posición
entre las especies comparadas. La numeración corresponde al último
aminoácido mostrado según la secuencia de referencia en el GeneBank
(refs: Hs: X00351. Mm: NM - 007393.1. Ce: NM - 073416.1). Mitad de
la Figura: especifica la secuencia de nucleótidos de los extremos
de los exones 2 y 3 que flanquean al intrón B (región W) en dichas
especies. Los exones muestran la secuencia de nucleótidos en las
tres especies comparadas, divididos en sus codones correspondientes
y el residuo aminoácido que codifican se muestra a continuación.
Los asteriscos corresponden a las posiciones de los nucleótidos que
están conservadas un 100% entre las especies comparadas. Parte
inferior de la Figura: especifica la secuencia de nucleótidos
completa del intrón B (región W divergente) en las tres especies
comparadas, para ilustrar la divergencia usada para la
identificación de las especies en esta invención.
La Figura 4 muestra un diagrama que ilustra el
proceso de identificación taxonómica propuesto en esta invención,
usando una mezcla biológicamente heterogénea. La muestra biológica
se procesa para extraer el ADN y someterlo a amplificación por PCR.
En el caso que se ilustra aquí, se amplifica la región W con los
cebadores P1 y P2. El resultado de la PCR se visualiza usando
electroforesis normal en gel de agarosa (véase gel de
electroforesis, hilera a la izquierda: marcador de peso molecular,
escalera de 100 pb. Hilera a la derecha: bandas (A y B, con un peso
molecular aproximado expresado en pares de bases, pb, que resulta
de la PCR de la muestra biológica). Las bandas se aíslan del gel y
se purifican antes de someterlas a secuenciación de ADN mediante
procedimientos normales. Las secuencias de ADN obtenidas a partir
de cada una de las bandas se usan para interrogar una base de datos
que incluye las secuencias de la región W de especies biológicas. La
comparación de las secuencias obtenidas usando las secuencias
existentes en la base de datos da el resultado de la identificación
de la especie (o especies) contenida en la muestra biológica de
origen.
La Figura 5 muestra un diagrama de flujo que
ilustra el proceso computerizado para la identificación de las
especies contenidas en una muestra biológica sometida a análisis.
Las secuencias de ADN obtenidas a partir de los dos fragmentos de
la región W en el experimento mostrado en la Figura 4 se usan para
interrogar una base de datos de secuencias de ADN de la región W en
especies específicas. La base de datos mostrada en este caso se
resume y contiene 11 especies diferentes a modo de ejemplo
(Secuencia 3: Cf, Canis familiaris, perro. Secuencia 4: Us,
Ursus species, oso. Secuencia 5: Oa, Ovis aries,
cabra. Secuencia 6: Fc, Fells catus, gato. Secuencia 7: Hs,
Homo sapiens, hombre. Secuencia 8: Ec, Equus caballus,
caballo. Secuencia 9: Oc, Oryctolaqus cuniculus, conejo.
Secuencia 10: Rn, Rattus norvegicus, rata. Secuencia 11: Mm,
Mus musculus, ratón. Secuencia 12: Dm, Drosophila
melanogaster, mosca del vinagre. Secuencia 13: Ce,
Caenorhabditis elegans, nematodo). Las comparaciones
resultantes con una equivalencia del 100%, que en este caso son 1:5
y 2:8, presentan una identidad con las secuencias incluidas en la
base de datos y confirman que la muestra biológica de origen
procede de una mezcla de cabra y caballo.
La Figura 6 muestra una ilustración de la
divergencia en el peso molecular y en la secuencia de nucleótidos
de la región W de parte de las especies biológicas incluidas en la
base de datos. Us, Ursus species. Oa, Ovis aries. Cf,
Canis familiaris. Hs, Homo sapiens. Ec, Equus
caballus. Oc, Oryctolaqus cuniculus. Rn, Rattus
norvegicus. Mm, Mus musculus.
La Figura 7 muestra un ejemplo experimental de
una electroforesis en gel de agarosa correspondiente a 10
amplificaciones separadas por PCR de la región W que está entre los
cebadores P1 y P2 de sangre periférica de ocho especies diferentes
de animales . Los números a cada lado indican el peso molecular
aproximado, expresado en pares de bases (pb), obtenido para la
región W en cada una de las amplificaciones. Es posible observar la
diferencia en el peso molecular de esta región entre las especies
animales incluidas. Oc: Orvctolaqus cuniculus, conejo. Cf:
Canis familiares, perro. Fc: Felis catus, gato. Us:
Ursus species, oso. Ec: Equus caballus, caballo. Pt:
Pan troglodytes, chimpancé. Oa: Ovis aries, cabra.
Hs: Homo sapiens, hombre. Las hileras a la izquierda del gel
corresponden a la escalera patrón de pesos moleculares de 100 pb
(Invitrogen). En este patrón, la banda más baja corresponde a 100 pb
y a medida que ascienden, cada banda es 100 pb mayor que la
inmediatamente por debajo de ella.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento desarrollado para la
identificación taxonómica de una muestra biológica heterogénea de
composición desconocida se describe a continuación. El
procedimiento sería el mismo para una muestra homogénea, puesto que
siempre se presume que no se conoce absolutamente nada sobre el
número de especies y/o subespecies diferentes presentes o sobre la
naturaleza taxonómica misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo ADN genómico a partir de una muestra
de 200 \mul de sangre completa venosa en EDTA, que era compatible
con cualquier kit comercial para la extracción rápida de ADN, para
su posterior amplificación por PCR.
El ADN genómico obtenido a continuación se
amplificó por PCR. La región W (Figura 1) se amplificó con los
cebadores diseñados frente a las posiciones de los nucleótidos
1132-1151 (P1, cebador de sentido directo directo,
5TCCGGCATGTGCAAGGCCGG3' y 1474-1454 (P2, cebador de
sentido directo opuesto, 5'CTCCATGTCGTCC
CAGTTGG3'), de acuerdo con la secuencia M10277 humana. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: reactivos habituales, etapa de desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos seguido por 35 ciclos de dos etapas cada una a 94ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 2 minutos.
CAGTTGG3'), de acuerdo con la secuencia M10277 humana. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: reactivos habituales, etapa de desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos seguido por 35 ciclos de dos etapas cada una a 94ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 2 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El resultado de la PCR se visualizó mediante
electroforesis en gel de agarosa horizontal normal al 3% en tampón
TBE. Las bandas obtenidas se compararon con un marcador de pesos
moleculares patrón de 100 pb de Invitrogen. La Figura 4 muestra los
resultados obtenidos. La comparación de la movilidad de los
fragmentos amplificados en el gel usando el marcador de pesos
moleculares muestra un peso molecular de 371 y 304 pares de bases
aproximadamente. Si los pesos moleculares de las bandas obtenidas
se comparan con una base de datos de tamaños moleculares obtenidos
a priori, es posible realizar una primera aproximación en la
identificación de las especies presentes en la muestra de partida.
La Figura 7 muestra un grupo de 10 amplificaciones separadas por PCR
de la región W que está entre los cebadores P1 y P2 de sangre
periférica procedente de ocho especies de animales diferentes. Es
posible observar la diferencia en el peso molecular de esta región
entre las especies animales incluidas. Oc: Oryctolagus
cuniculus, conejo. Cf: Canis familiaris, perro. Fc:
Felis catus, gato. Us: Ursus species, oso. Ec:
Equus caballus, caballo. Pt: Pan troplodvtes,
chimpancé. Oa: Ovis aries, cabra. Hs: Homo sapiens,
hombre. Las hileras a la izquierda del gel corresponden a la
escalera patrón de pesos moleculares de 100 pb (Invitrogen). En una
primera aproximación por comparación con esta base de datos de pesos
moleculares, las bandas obtenidas en la Figura 4 corresponderían a
cabra (banda de 371 pb) y caballo (banda de 304 pb).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, una segunda aproximación
identifica las dos bandas obtenidas por secuenciación de su ADN.
Las bandas se purificaron usando el kit Concert Rapid PCR
Purification System de Life Technologies, de manera que a
continuación se pudo secuenciar su ADN. La secuenciación se llevó a
cabo cíclicamente en ambas direcciones con los mismos cebadores
usados en la PCR inicial de acuerdo con los protocolos y reactivos
del sistema de secuenciación automático ABI-Prism
310 de Applied Biosystems. Las dos secuencias obtenidas se usaron
para interrogar una base de datos de secuencias de ADN de la región
W del gen de la beta-actina citoplasmática de
diversas especies usando el programa ClustalW desarrollado por el
European Bioinformatic Institute del EMBL (www.ebi.ac.uk) o un
programa equivalente que está disponible en Internet (Figura 5).
Las comparaciones dieron como resultado una equivalencia del 100% de
1:5 y 2:8 en este caso, confirmando la fuente de la muestra
biológica de origen, una mezcla de cabra y caballo.
<110> Laboratorios Echevarne
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la identificación
de especies biológicas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Beta-actina
\vskip0.400000\baselineskip
<140> ---
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
27-10-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccggcatgt gcaaggccgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccatgtcg tcccagttgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaactggg acgacatgga gaagatctgg c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
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<223> "n" significa cualquier
nucleótido
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskiptacatggcng gggtgttaaa ggtctcaaac
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccctgagg ccctcttcca gccttccttc
\hfill30
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (30) . . (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" significa cualquier
nucleótido
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtacatgg tggtgccgcc agacagcacn gtgttggc
\hfill38
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<210> 7
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" significa cualquier
nucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaacacng tgctgtctgg cggcaccacc atgtaccc
\hfill38
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtactcct gcttgctgat ccacatctg
\hfill29
\newpage
Según la solicitud de patente
titulada:
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento para la
identificación de especies
biológicas
\vskip1.000000\baselineskip
Con fecha de solicitud de 27 de
octubre de 2003, y con el Nº de solicitud
PCT/ES03/00547.
\vskip1.000000\baselineskip
Junto a ella se adjuntan las
secuencias de los cebadores incluidos en dicha
solicitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a la imposibilidad de
modificar el texto original de la solicitud de patente, también se
adjunta una tabla explicativa de equivalencias entre la
identificación de las secuencias de cebadores en el texto de patente
y el listado de
secuencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Procedimiento para la identificación de
especies biológicas usando muestras de material biológico procedente
de una sola especie o de una mezcla heterogénea de especies y/o
subespecies, caracterizado porque comprende: (A) extracción
de ADN de la muestra; (B) amplificación de segmentos del gen de la
beta-actina citoplasmática, con pares de cebadores
de oligonucleótidos seleccionados del grupo de pares de cebadores
de oligonucleótidos constituido por:
por PCR o una técnica equivalente;
(C) identificación del segmento amplificado por comparación de su
tamaño en pares de bases con un patrón de tamaños
pre-establecido y/o la identificación del segmento
amplificado mediante secuenciación de ADN y la comparación de la
secuencia resultante con la secuencia específica de cada especie o
subespecie presente en una base de
datos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en la etapa de amplificación que usa la
PCR o una técnica equivalente, se amplifica cualquier segmento del
gen de la beta-actina citoplasmática.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque en la etapa de amplificación que usa la
PCR o una técnica equivalente, los segmentos génicos de las regiones
divergentes del gen de la beta-actina citoplasmática
se amplifican usando secuencias de ADN con una elevada conservación
evolutiva entre especies y subespecies.
4. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque en la etapa de amplificación que usa la
PCR o una técnica equivalente, los segmentos a amplificar son
aquellos que están entre la secuencia 3' del exón sentido directo y
la secuencia 5' del exón sentido opuesto que comprenden la
secuencia intrónica completa y parte de las secuencias exónicas
flanqueantes.
5. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la región o regiones a amplificar se
seleccionan del grupo constituido por las regiones que están entre
las posiciones 1130-1473, 1452-2063,
2438-2680 y 2642-2960, la
numeración en relación a la secuencia de ADN del locus HUMACCYBB
humano, número de acceso M10277.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque usa una
composición de cebadores universales que se hibridan con las
regiones de nucleótidos más altamente conservadas del gen de la
beta-actina citoplasmática.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque los cebadores se hibridan con las
secuencias que están entre las posiciones 1130-1191
y 1453-1473, la numeración en relación a la
secuencia de ADN del locus HUMACCYBB humano, número de acceso
M10277.
\newpage
8. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque los cebadores se hibridan con la
secuencia que está entre las posiciones 1453-1473 y
2041-2065, la numeración en relación a la secuencia
de ADN del locus HUMACCYBB humano, número de acceso M10277.
9. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque los cebadores se hibridan con la
secuencia que está entre las posiciones 2433-2459 y
2643-2680, la numeración en relación a la secuencia
de ADN del locus HUMACCYBB humano, número de acceso M10277.
10. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque los cebadores se hibridan con la
secuencia que está entre las posiciones 2643-2680 y
2940-2960, la numeración en relación a la secuencia
de ADN del locus HUMACCYBB humano, número de acceso M10277.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque las muestras
son de origen biológico.
12. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque las muestras se obtienen a partir de
tejido de caballo, cabra, conejo, perro, gato, chimpancé, humano
y/u oso pardo.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque en la etapa de
identificación el segmento(s) amplificado se compara con las
secuencias de estas mismas regiones génicas de especies incluidas
en una base de datos.
14. Uso de secuencias de ADN del gen de la
beta-actina citoplasmática en muestras biológicas
que proceden de una sola especie o de una mezcla heterogénea de
especies y/o subespecies, obtenidas por PCR con pares de cebadores
de oligonucleótidos seleccionados del grupo constituido por:
para identificar las especies biológicas a las
cuales pertenecen las muestras.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/ES2003/000547 WO2005040423A1 (es) | 2003-10-27 | 2003-10-27 | Método para la identificación de especies biológicas |
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|---|---|
| ES2305502T3 true ES2305502T3 (es) | 2008-11-01 |
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|---|---|---|---|
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