ES2305570T3 - Estructura cristalina de clutamato racemasa (muri). - Google Patents

Abstract

Un cristal de MurI de Helicobacter pylori (H. pylori) formando un complejo con un inhibidor y/o un sustrato.

Description

Estructura cristalina de glutamato racemasa (MurI).

Antecedentes de la invención

Determinadas especies de bacterias Gram negativas son patógenos humanos importantes y la frecuencia de su asociación con enfermedades humanas está aumentando. Se ha desarrollado una amplia resistencia a antibióticos en bacterias gram-negativas a través de tres mecanismos básicos, alteración de la diana del fármaco, inactivación del fármaco y, en tercer lugar, reducción de la permeabilidad de la membrana celular debido a poros alterados o a la adquisición o inducción de bombas de salida (Waterer, Ibid.). Especies tales como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophila y miembros de Enterobacteriaceae son particularmente problemáticas en unidades de cuidado intensivo (Waterer y Wunderink, Crit. Care Med. 29: 75-81 (2001)).

La infección pulmonar crónica con Pseudomonas aeruginosa es la causa principal de la disminución de la función pulmonar y de la mortalidad en pacientes con fibrosis quística y también es un problema importante en víctimas con quemaduras graves (Lyczak et al. Clin. Microbiol. Rev., 15: 194-222 (2002); y Lyczak et al. Microbes Infect. 2: 1051-1060 (2000)).

Se ha determinado claramente la etiología microbiana de las infecciones del tracto urinario. Escherichia coli es el uropatógeno predominante (80%) aislado en infecciones agudas sin complicaciones adquiridas en la comunidad, seguida de Staphylococcus saprophyticus (10-15%) y especies de Klebsiella, Enterobacter y Proteus (Ronald, A. Am. J. Med. 8; 113 (Supl.) 1A:14S-19S (2002)).

Determinadas especies de bacterias Gram positivas son patógenos humanos importantes y el desarrollo reciente de resistencia a antibióticos de amplio espectro entre estos organismos se ha identificado como un problema crítico para la salud humana (McDevitt y Rosenberg, Trends in Microbiol. 9: 611-617 (2001)). Miembros de Enterococci, incluyendo Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium, son agentes de endocarditis e infección del tracto urinario, de la sangre y de heridas (Harbath et al. Antimicrob. Agents Chemo. 46: 1619-1628 (2002)). Especies tales como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes son causas importantes de infecciones del tracto respiratorio, incluyendo sinusitis, otitis media, meningitis bacteriana y neumonía adquiridas en la comunidad y representan una causa principal de morbilidad y mortalidad en todo el mundo (Paradisi et al. Clin. Micro. Inf. 7(Sup14): 34-42 (2001); y McIntosh, K N. Engl. J. Med., 346: 429 437 (2002)). El desarrollo de resistencia frente a los antibióticos comunes utilizados habitualmente se ha incrementado regularmente en las dos últimas décadas con proporciones que superan el 60-80% en algunos países (Applebaum, P.C. Clin. Infect. Diseases, 34: 1613-1620 (2002)). La frecuencia de estos organismos resistentes ha limitado las opciones de tratamiento en la clínica y, como resultado, se ha incrementado dramáticamente la utilización de antibióticos de "último recurso " tales como vancomicina. La aparición de especies de Enterococci que contienen genes de resistencia capaces de producir una alta resistencia a glicopéptidos (Harbath et al. Ibid; y Linares, H. Clin. Micro. Inf. 7(Supl. 4): 8-15 (2001)) ha demostrado que los patógenos Gram positivos son capaces de desarrollar resistencia frente a todas las terapias conocidas y que las infecciones futuras pueden ser imposibles de tratar sin el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos.

Las infecciones por Helicobacter (H.) pylori son unas de las infecciones bacterianas más habituales en los seres humanos y son el agente causal de úlceras pépticas, linfoma gástrico MALT, dispepsia, enfermedad de reflujo gastroesofágico y otras enfermedades del tracto gastrointestinal superior y se han asociado al desarrollo de adenocarcinoma gástrico. El establecimiento de bacterias en el tracto gastrointestinal superior causa una inflamación gástrica continua e induce una respuesta vigorosa sistémica y mucosal humoral que causa daño tisular pero que no erradica las bacterias (Sauerbaum y Michetti, N. Engl. J. Med. 347(15): 1175-1186 (2002)). Sería beneficioso un método para inactivar o matar a H. pylori.

Hwang et al. (Nature Structural Biology, 6(5): 422-426 (1999)) muestran la estructura del cristal de MurI de Aquifex pyrophilus, determinada a una resolución de 2,3 \ring{A}.

Sumario de la invención

La estructura de las bacterias incluye una capa de péptidoglicano, localizada entre las membranas citoplásmica y externa de la pared celular que es crucial para la integridad estructural. El péptidoglicano es un polímero grande cuyo componente esencial es el D aminoácido, D-glutamato. La enzima glutamato racemasa (MurI) cataliza la interconversión reversible de L-glutamato en D-glutamato y, así, juega un papel importante en la síntesis de la pared celular y en el crecimiento bacteriano. Debido a que el péptidoglicano sólo está presente en las bacterias, tanto él como las enzimas implicadas en su biosíntesis son dianas para diseñar o identificar fármacos antibacterianos.

En la presente memoria se describe la estructura tridimensional de MurI (MurI) de bacterias Gram negativas, Gram positivas y atípicas tales como Escherichia (E.) coli; Enterococcus (E.) faecalis; Enterococcus (E.) faecium; Staphylococcus (S.) aureus; y Helicobacter (H.) pylori; dominios de unión de MurI; secuencias conservadas de MurI; métodos para identificar o diseñar agentes que se unen a MurI (por ejemplo, agentes de unión, ligandos, fármacos o inhibidores que inhiben parcialmente o totalmente la actividad de MurI, proteínas, moléculas orgánicas pequeñas); métodos para cristalizar MurI; métodos asistidos por ordenador para identificar, cribar y/o diseñar agentes que se unen a MurI; la utilización de los cristales en la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas, composiciones farmacéuticas y envases; métodos para tratar infecciones bacterianas en sujetos que comprenden administrar inhibidores de MurI; y métodos para su aplicación.

Las bacterias Gram negativas incluyen, por ejemplo, especies de Escherichia, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Vibrio cholerae, Proteus mirablis, Pasteruella multocida, Acinetobacter baumanii, Bacteroides fragilis, especies de Treponemas, especies de Borrelias, especies de Deinococcas, especies de Pseudomonas, especies de Salmonella, especies de Shigella, especies de Yersinia y Porphyromonas gingivalis.

Las bacterias Gram positivas incluyen las bacterias de especies de Bacillus, Staphylococcus spp., especies de Streptococcus, especies de Enterococcus, Lactobacilli, Pediococcus, y especies de Micobacterias. Más específicamente, las bacterias Gram positivas incluyen, por ejemplo, B. subtilis, S. aureus, E. faecalis y E. faecium.

Las bacterias atípicas incluyen, por ejemplo, especies de Helicobacter, Campylobacter jejuni y Aquifex aeolicus.

Descripción breve de las figuras

Las Figuras 1A-1H presentan la topología del plegamiento de MurI y varias conformaciones de la enzima. La Figura 1A ilustra la estructura tridimensional de un dominio de MurI mediante la representación de los elementos estructurales e ilustra la topología del plegamiento de MurI. Las Figuras 1B y 1C proporcionan una representación mediante un dibujo de MurI en una conformación abierta (1B; negro) y cerrada (1C; gris). Las Figuras 1D y 1F representan la estructura cola-cola de MurI de Gram positivas en diferentes conformaciones. La Figura 1E representa la estructura cabeza-cabeza de MurI atípica. La Figura 1G representa la estructura de MurI de Gram negativas que tiene tanto un sitio de unión a sustrato (lado izquierdo de 1G) como un sitio de unión a un activador (lado derecho de 1G).

La Figura 2A-2O representa los elementos estructurales que están conservados en MurI en todas las MurI, en las bacterias Gram-positivas y atípicas o en todas las bacterias Gram-positivas por restos de aminoácidos específicos. Se indican los restos estructurales tales como hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T).

La Figura 3 muestra la distancia (\ring{A}) entre las cisteínas del sitio activo de estructuras de cristal de MurI en diferentes conformaciones. Las medidas del movimiento conformacional se muestran en las columnas 3-5 y los ángulos asociados con el movimiento conformacional se muestran en las columnas 6-7.

Las Figuras 4A-4ZZZ muestran el listado de las coordenadas atómicas tridimensionales de un modelo derivado a partir de una estructura de cristal de MurI (MurI) de H. pylori. Las coordenadas presentadas son las de las dos cadenas de la proteína dimérica. En las figuras, el listado atómico está precedido del encabezamiento CRYST1, que continúa con las 3 dimensiones (véase la Figura 4A) de la celda unidad cristalográfica. Los tres valores siguientes definen una matriz que convierte coordenadas de coordenadas ortogonales Angstrom en coordenadas fraccionarias de la celda unidad. Cada fila marcada como ATOM proporciona el número atómico (arbitrario), asignándose la marca a cada cadena principal de aminoácido, cada tipo de átomo, el tipo de resto de aminoácido, la marca de la cadena proteica (A comprende la primera molécula (cadena) y B comprende la segunda molécula (cadena)) y el número del resto de aminoácido. Los tres primeros números de la fila proporcionan las coordenadas ortogonales X, Y, Z del átomo. El número siguiente es un número de ocupación y debería ser menor de 1,0 si el átomo puede observarse en más de una posición (el aminoácido puede observarse en más de una orientación). El número final es un factor de temperatura que está relacionado con la amplitud térmica de las vibraciones del átomo. Al final de la lista, hay tres líneas de datos que indican las moléculas de agua ordenadas (TIP o WAT) incluidas en el modelo.

Las Figuras 5A-5ZZZ muestran el listado de las coordenadas atómicas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de H. pylori formando un complejo con D-glutamato.

Las Figuras 6A-6AAAA muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI de H. pylori formando un complejo con glutamato y el inhibidor pirimidinadiona, compuesto A.

Las Figuras 7A-7AAAA muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI de H. pylori formando un complejo con el inhibidor pirimidinadiona, compuesto A.

Las Figuras 8A-8OO muestran el listado de las coordenadas atómicas tridimensionales de una estructura de cristal de MurI (MurI) de E. coli formando un complejo con glutamato.

Las Figuras 9A-9OO muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de E. coli formando un complejo con activador.

Las Figuras 10A-10NN muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de un modelo derivado a partir de una estructura de cristal de MurI (MurI) de E. coli.

Las Figuras 11A-11OO muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de E. coli formando un complejo con glutamato y activador.

Las Figuras 12A-12OOO muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de un modelo derivado a partir de una estructura de cristal de MurI (MurI) de E. faecalis. Las coordenadas son ambas cadenas de la proteína dimérica.

Las Figuras 13A-13OOO muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de E. faecalis formando un complejo con D,L-glutamato.

Las Figuras 14A-14MMM muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de un modelo derivado a partir de una estructura de cristal de MurI (MurI) de S. aureus.

Las Figuras 15A-15MMM muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de S. aureus formando un complejo con D-glutamato.

Las Figuras 16A-16JJ muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de un modelo derivado a partir de una estructura de cristal de MurI (MurI) de E. faecium.

Las Figuras 17A-17II muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de E. faecium formando un complejo con tartrato.

Las Figuras 18A-18JJ muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de E. faecium formando un complejo con citrato.

Las Figuras 19A-19JJ muestran el listado de las coordenadas tridimensionales de la estructura de cristal de MurI (MurI) de E. faecium formando un complejo con fosfato.

La Figura 20A proporciona un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear (RMN) [^{15}N, ^{1}H] de 0,3 mM de proteína MurI de H. pylori marcada con ^{15}N.

La Figura 20B proporciona un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear (RMN) [^{15}N, ^{1}H] de 0,3 mM de proteína MurI de H. pylori marcada con ^{15}N, a la que se ha añadido 0,6 mM de D-glutamato.

La Figura 20C proporciona un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear (RMN) [^{15}N, ^{1}H] de 0,3 mM de proteína MurI de H. pylori marcada con ^{15}N, a la que se ha añadido 1,8 mM de D-glutamato. La caja 1 muestra los dos grupos amida de la cadena lateral del triptófano. En este espectro con condiciones saturantes del D-glutamato, los triptófanos adoptan sólo una conformación. En las Figuras 20A y 20B, son visibles múltiples conformaciones (es decir, más de dos picos). La caja 2 muestra señales que están desplazadas a frecuencias de RMN de bajo campo. Dichas señales son indicativas de un alto grado de contenido estructural.

La Figura 21A proporciona un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear (RMN) [^{15}N, ^{1}H] de 0,3 mM de proteína MurI de H. pylori marcada con ^{15}N, a la que se ha añadido una cantidad saturante del compuesto A.

La Figura 21B proporciona un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear (RMN) [^{15}N, ^{1}H] de 0,3 mM de proteína MurI de H. pylori marcada con ^{15}N, a la que se ha añadido una cantidad saturante de D-glutamato.

La Figura 21C proporciona un espectro de correlación de resonancia magnética nuclear (RMN) [^{15}N, ^{1}H] de 0,3 mM de proteína MurI de H. pylori marcada con ^{15}N, a la que se han añadido cantidades saturantes de D-glutamato y del compuesto A.

La Figura 21D proporciona una superposición de los espectros mostrados en las Figuras 21B y 21C.

La Figura 22 proporciona un análisis pilogenético de ortólogos de MurI indicando las estructuras diméricas (Gram positiva), monoméricas (Gram negativa) y atípicas por género y especie.

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Descripción detallada de la invención I. Visión Global

Un experto en la técnica reconocerá que la resolución de las estructuras de los cristales de proteínas tales como MurI requiere una fuente estable de proteína de alta calidad.

Como se describe en la presente memoria, se han cristalizado MurI de tres clases de bacterias (Gram negativa, Gram positiva y atípica) y se han determinado las estructuras de los cristales (estructura tridimensional).

II. Polipéptidos, Cristales y Grupos Espaciales

Describimos un polipéptido aislado de una parte de MurI que funciona como un sitio de unión cuando se pliega en la orientación 3-D apropiada.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria. Estos términos se refieren a cadenas de aminoácidos sin modificar y también incluyen modificaciones pequeñas, tales como fosforilación, glicosilación y modificación con lípidos. "Aislado" (utilizado indistintamente con "sustancialmente puro") cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o una parte de éste, en virtud de su origen o manipulación. Por "aislado" también se quiere decir una proteína que: (i) se sintetiza químicamente; (ii) se expresa en una célula anfitriona y se purifica de proteínas asociadas y contaminantes. El término significa generalmente un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los que está naturalmente. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de sustancias tales como antibióticos o matrices de gel (poliacrilamida) que se utilizan para purificarlo.

Cada una de las secuencias polipeptídicas aisladas puede ser una secuencia nativa de MurI o una secuencia que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga respecto a la secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de SEQ ID NOS: 2-34, 40, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 y 74.

A. Gram negativas - E. coli

Un experto en la técnica reconocerá que la resolución de las estructuras de cristales de proteínas tales como MurI (también referida como MurI) requiere una proteína estable de alta calidad.

Una realización se refiere a un cristal de MurI. En una realización, es MurI cristalizada de E. coli formando un complejo con L-glutamato. Una realización es MurI cristalizada de E. coli formando un complejo con glutamato caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 8. Una realización es MurI cristalizada de E. coli formando un complejo con activador caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 9. Una realización es MurI cristalizada de E. coli caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 10. Una realización es MurI cristalizada de E. coli formando un complejo con glutamato y activador caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 11.

Una realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico C222_{l} y tiene las dimensiones de celda a = 83,05 \ring{A}, b = 112,82 \ring{A} y c = 74,12 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Otra realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P21 y tiene las dimensiones de celda a = 70,04 \ring{A}, b = 74,13 \ring{A} y c = 70,10 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 107,25º y \gamma = 90º.

Una realización es un cristal de MurI de E. coli en la que la MurI es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 40 o partes de ésta. Los cristales pueden difractar de aproximadamente 0,8 \ring{A} a aproximadamente 3,5 \ring{A}.

La proteína MurI existe como un monómero, pero la inspección del mapa de densidad electrónica identificó una simetría molecular adicional. Cada monómero tiene una simetría de plegamiento pseudo doble que divide el monómero en dos dominios con unos tipos de plegamiento muy similares alfa/beta. El sitio de unión se encuentra en la interfaz entre los dos dominios. En el lado opuesto del monómero, pero todavía en la interfaz, está el sitio de unión para un activador, tal como UDP-N-acetilmuramil-L-alanina (UDP-MurNAc-Ala), en el que el activador actúa como una cuña para estabilizar una conformación activa en la que los dos dominios están orientados apropiadamente para promover la unión del sustrato.

En la presente invención, un sustrato puede ser un compuesto tal como L-glutamato, D-glutamato compuestos que MurI convierte reversiblemente del enantiómero R al S. Así, un sustrato también puede actuar como un producto. El sustrato puede ser un compuesto natural o artificial.

En la presente invención, un inhibidor puede ser un compuesto que también puede someterse a una reacción catalítica o que se une al sitio de unión del sustrato o a otro sitio en MurI y que compite con la velocidad de recambio del sustrato del glutamato. Los inhibidores de la presente invención pueden ser compuestos tales como L-serina-O-sulfato, D-serina-O-sulfato, D-aspartato, L-aspartato, tartrato, citrato, fosfato, sulfato, aziridino-glutamato, N-hidroxiglutamato ó 3-cloroglutamato. El inhibidor puede ser un compuesto natural o artificial.

En la presente invención, un activador puede ser un compuesto tal como UDP-MurNAc-Ala. El activador puede ser un compuesto natural o artificial.

El activador tiene una estructura compacta cuando se une a la proteína. Se pliega hacia sí mismo en una estructura de dos capas en la que dos grupos fosfato actúan como un puente conector. El anillo de uridina se apila con el anillo de ácido murámico. Existe un emparejamiento con una forma casi perfecta entre la proteína y el activador ya que reside en la parte superior de los dos bucles conectores entre los dos dominios, correspondiendo en la secuencia a los restos 112-116 y 225-228. En ausencia del activador, los dos bucles actúan como una interfaz entre los dos dominios.

Sin embargo, la unión no está totalmente dirigida por interacciones de van der Waal favorables. Existen varias interacciones polares y al menos un puente salino fuerte entre Arg104 y el grupo carboxilato del resto de alanina del activador. Este último puente salino podría ser una interacción clave para que el activador sea capaz de fijar los dos dominios en la orientación apropiada, lo que explica la necesidad del resto de alanina terminal con el fin de que la molécula pueda funcionar como un activador.

Se encuentran otras interacciones polares amplias entre el anillo de uracilo y los átomos de la cadena principal de la proteína, restos 113-115. También hay varios enlaces de hidrógeno de los grupos hidroxilo de los dos anillos de azúcar. Muchas interacciones entre el inhibidor y la proteína están mediadas por moléculas de agua. Por el contrario, los dos grupos fosfato tienen poco contacto con la proteína ya que están situados hacia la disolución. Sin embargo, a cada lado del grupo difosfato hay un resto cargado positivamente, Lys 119 en un dominio y Arg233 en el otro dominio, lo que proporciona otro ejemplo de interacción estabilizadora dominio-dominio.

Una realización adicional se refiere a una MurI de E. coli en la que el sitio de unión al sustrato comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys92 y Cys204 en la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 40. Una realización adicional comprende un sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli en el que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 8. En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys92 y Cys204 así como los restos de aminoácidos en 5 \ring{A} de los restos Cys92 y Cys204 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 9. En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glul70, Thr205 e His206. En esta realización, el sitio de unión al sustrato forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys92 y Cys204 y al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión al sustrato incluye los restos de aminoácidos Phe27, Asp28, Ser29, Gly30, Va131, Gly32, Gly33, Ser35, Val36, Asp54, Ala57, Ala57, Phe58, Pro59, Tyr60, Gly61, Glu62, Lys63, Ile68, Val90, Ala91, Cys92, Asn93, Thr94, Ala95, Ser96, Thr97, Val114, Val115, Leu133, Ala134, Thr135, Arg136, Gly137, Thr138, Val139, Thr144, Ala163, Val166, Glu167, Glu170, Leu202, Gly203, Cys204, Thr205, His206, Phe207 y Ser227 de SEQ ID NO: 40.

En una realización adicional, el sitio de unión al sustrato de MurI comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys204) del sitio de unión, la TRIADA es Glu170-Thr205-His206 y en el otro lado (Cys92), la TRIADA es Thr94-Thr135-Thr138. Así, en una realización específica, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys92 y Cys204 e incluye adicionalmente al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de MurI de E. coli. En un lado (Cys204) del sitio de unión al sustrato, Thr205 está unida por H a His206 e His206 está unida adicionalmente por H a GIu170. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr205 está a una distancia de 2,8 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (es decir, glutamato) y a 5,3 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys204, que está a una distancia de 4,3 \ring{A} de la His206. En el otro lado del sitio de unión al sustrato (Cys92), Thr94 está unida por H a Thr135 y unida adicionalmente por H a Thr138. El O del hidroxilo de Thr94 está unido por H a uno de los átomos de oxígeno del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 3,3 \ring{A} del átomo de S de Cys92. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo forman un triángulo y que todos están a menos de 3,2 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión al sustrato (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

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B. Gram positivas 1.E. faecalis

Un experto en la técnica reconocerá que la resolución de las estructuras de cristales de proteínas tales como la glutamato racemasa (MurI) de E. faecalis, E. faecium y S. aureus requiere una fuente estable de proteína de alta calidad.

Una realización se refiere a un cristal de MurI de una bacteria Gram positiva.

Una realización se refiere a MurI cristalizada de E. faecalis caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 12. Una realización describe MurI cristalizada de E. faecalis formando un complejo con D y/o L-glutamato caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 13.

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Una realización del complejo cristalizado de MurI de E. faecalis y D o L-glutamato se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 60,29 \ring{A}, b = 82,08 \ring{A} y c = 115,57 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Esta realización está englobada por las coordenadas estructurales de la Figura 12 o en complejo con D y/o L-glutamato como se engloba por las coordenadas estructurales de la Figura 13.

Una realización es un cristal de MurI de E. faecalis formando un complejo con el producto (sustrato) D y/o L-glutamato en el que la MurI es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44 o partes de ésta. Los cristales pueden difractar de aproximadamente 0,8 \ring{A} a aproximadamente 3,5 \ring{A}.

Una realización del complejo cristalizado de E. faecalis con D y/o L-glutamato se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 60,29 \ring{A}, b = 82,08 \ring{A} y c = 111,57 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º, donde el complejo cristalizado se produce por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de TCEP, aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4, aproximadamente 10 mg/ml de MurI de E. faecalis; preparar una segunda disolución de aproximadamente 100 mM de Tris pH 7,5, aproximadamente 0,2 mM de MgCl_{2} y aproximadamente 20-25% de PEG 4000; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen los cristales de MurI, mediante el cual se producen los cristales de MurI.

Una realización adicional se refiere a una glutamato racemasa de E. faecalis en la que el sitio de unión comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys74 y Cys185 en la secuencia representada como SEQ ID NO: 44. Una realización adicional comprende un sitio de unión de la glutamato racemasa de E. faecalis en la que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 12. En una realización, el sitio de unión de la glutamato racemasa de E. faecalis forma un complejo con D y/o L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys74 y Cys185 así como los restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys74 y Cys185 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 13. En una realización, el sitio de unión de la glutamato racemasa de E. faecalis comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187. En esta realización, el sitio de unión forma un complejo con D o L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys74 y Cys185 y al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión incluye los restos de aminoácidos Ile10, Asp11, Ser12, Glyl3, Val14, Gly15, Gly16, Thr18, Val19, Tyr34, Asp37, Arg40, Cys41, Pro42, Tyr43, Gly44, Pro45, Arg46, Val51, Glu53, Ile72, Ala73, Cys74, Asn75, Thr76, Ala77, Ser78, Ala79, Val96, Ile116, Gly117, Thr118, Leu119, Gly120, Thr121, Ile122, Tyr127, Cys145, Pro146, Val149, Pro150, Leu183, Giy184, Cys185, Thr186, His187, Tyr188 y Ser208 de SEQ ID NO: 44.

En una realización adicional, el sitio de unión de la glutamato racemasa comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys185) del sitio de unión, la TRIADA es Glu153-Thr186-His187 y en el otro lado (Cys74), la TRIADA es Thr76-Thr118-Thr121. Así, en una realización específica, el sitio de unión de la glutamato racemasa de E. faecalis forma un complejo con D y/o L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys74 y Cys185 y, adicionalmente, comprende al menos uno (uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de la glutamato racemasa de E. faecalis. En un lado (Cys185) del sitio de unión, Thr186 está unida por H a His187 e His187 está unida adicionalmente por H a GIu153. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr186 está a una distancia de 2,9 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (glutamato) y a 4,3 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys185, que está a una distancia de 4,1 \ring{A} del nitrógeno (N) de His187.

En el otro lado del sitio de unión (Cys74), Thr76 está unida por H a Thr118 y unida adicionalmente por H a Thr121. El O del hidroxilo de Thr76 está unido por H a uno de los átomos de oxígeno del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 4,3 \ring{A} del átomo de S de Cys74. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo forman un triángulo y que todos están a menos de 3,4 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

Otra realización es un cristal de glutamato racemasa, que comprende un sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos Cys74, Cys185, Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44. En una realización, es un cristal de glutamato racemasa formando un complejo con D o L-glutamato. Adicionalmente, el sitio de unión del cristal que forma un complejo con D-glutamato puede comprender los restos de aminoácidos: Cys74, Cys185 y uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp11, Gly13, Val14, Gly15, Gly16, Arg40, Cys41, Pro42, Arg46, Ala73, Asn75, Ala77, Va196, Gly117, Val149, Gly184 y Tyr188. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Ile10, Thr18, Val19, Tyr34, Tyr43, Gly44, Pro45, Asp37, Val51, Ile72, Ser78, Ala79, Ile116, Leu119, Gly120, Ile122, Tyr127, Cys145, Pro146, Pro150, Leu183 y Ser208 de SEQ ID NO: 44. Los cristales que comprenden los sitios de unión representados por los restos de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 44; o una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% homóloga a la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 44.

También se definen la localización y geometría de un sitio de unión de la enzima. Se identificaron dos restos de cisteína (Cys) conservados como los restos responsables de la (des)protonación del carbono alfa del sustrato durante la catálisis, lo que es consistente con el mecanismo de dos bases propuesto para la función de la enzima en su papel como una racemasa. Las dos cisteínas del sitio de unión son Cys74 y Cys185, que están a una distancia entre sí de aproximadamente 7,0 Angstroms (\ring{A}) (distancia C\alpha-C\alpha, que es la distancia entre átomos C\alpha). Otros restos de aminoácidos identificados en la cercanía del sitio de unión incluyen Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187. El sustrato/producto unido, D o L-glutamato, está localizado entre los dos restos de cisteína conservados. Más detalles del sitio de unión son los siguientes: hacia abajo del eje definido por G1u153 junto con el carbono \gamma y \alpha, las dos cisteínas exhiben un entorno bastante simétrico; cada una tiene un núcleo hidrofóbico detrás, respecto al sustrato y un resto de treonina cercano que no está lejos del C-alfa del sustrato (3,7-3,4 \ring{A} cuando el L-Glu está unido; y 3,4-4,3 \ring{A} cuando el D-Glu está unido). Aquí, el producto está presente en un sitio y un sustrato en el otro. Hay cambios conformacionales que hacen que las cisteínas estén más cerca en la subunidad con el sustrato.

Los análisis de la estructura del cristal de la glutamato racemasa de E. faecalis indican que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 10 \ring{A} del D o L-glutamato unido: 10-19, 34-46, 51, 72-78, 96-97, 116-122, 124, 127, 183-189, 208-209. El análisis de la estructura del cristal también muestra que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 4 \ring{A} del D o L-glutamato unido: 11-12 41-44, 74-76, 118, 121 y 186-187. Es interesante el hecho de que un sólo resto de aminoácido ácido (Asp11) está presente en la estructura circundante de la Cys74 del sitio de unión, que sirve como un punto de anclaje para el grupo amino del sustrato/producto con una interacción polar (cargada) entre el átomo de nitrógeno del amino del D o L-glutamato y el átomo de oxígeno delta de Asp11.

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2.E. faecium

Proporcionamos un método para hacer un cristal de complejos de MurI de E. faecium. El método comprende preparar una primera disolución de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM de D,L-glutamato; de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mM de agente reductor; de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal pH 6,5-9,4; y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de E. faecium, en el que el glutamato, agente reductor y sal están cada uno presente en una concentración suficiente para unirse a MurI, inhibir la oxidación de la proteína y estabilizar a la proteína e impedir la agregación; preparar una segunda disolución de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal pH 4,5-9,0; en la que la sal está presente en una concentración suficiente para estabilizar a la proteína, impedir la agregación y controlar el pH de la disolución; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en condiciones en las que se producen los cristales de MurI.

En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. faecium incluye los restos de aminoácidos: Ser15, Gly16, Va117, Gly18, Pro45, Tyr46, Gly47, Cys77, Asn78, Thr79, Thr121, Ile122, Gly123, Thr124, Lys150, Phe151, Val152, Gly187, Cys188, Thr189 e His190 de SEQ ID NO: 48.

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3.S. aureus

En una realización, proporcionamos MurI cristalizada de S. aureus caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 14.

En una realización, proporcionamos MurI cristalizada de S. aureus formando un complejo con D-glutamato caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 15.

En una realización proporcionamos un cristal de MurI de S. aureus formando un complejo con el producto (sustrato) D-glutamato, en la que la MurI es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 o partes de ésta. Los cristales pueden difractar de aproximadamente 0,8 \ring{A} a aproximadamente 3,5 \ring{A}.

Una realización del complejo de cristal de S. aureus está caracterizado por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico C2 con las dimensiones de celda a = 96,43 \ring{A}, b = 88,87 \ring{A}, c = 96,56 \ring{A}, \alpha = 90º, \beta = 109.00º y \gamma= 90º, en la que el complejo cristalizado se produce por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4; y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de S. aureus; preparar una segunda disolución de aproximadamente 0,17 M de sulfato de amonio y aproximadamente 25% de PEG 9000; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en condiciones en las que se producen los cristales de MurI.

Una realización adicional se refiere a una glutamato racemasa de S. aureus en la que el sitio de unión comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys72 y Cys184 en la secuencia representada como SEQ ID NO: 46. Una realización adicional comprende un sitio de unión de la glutamato racemasa de S. aureus en la que el sitio de unión incluye los restos de aminoácidos: Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Cys72, Asn73, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Cys184, Thr185 e His186 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 14. En una realización, el sitio de unión de la glutamato racemasa de S. aureus forma un complejo con D-glutamato y comprende las coordenadas estructurales relativas de los restos de aminoácidos Cys72 y Cys184 así como restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys72 y Cys184 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 15. En una realización, el sitio de unión de la glutamato racemasa de S. aureus comprende adicionalmente al menos uno (uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Asn73, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186. En esta realización, el sitio de unión forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys72 y Cys184 y al menos uno (uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Asn73, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186, que pueden estar presentes en cualquier combinación.

En una realización adicional, el sitio de unión de la glutamato racemasa comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys184) del sitio de unión, la TRIADA es Gly151-Thr185-His186 y en el otro lado (Cys72), la TRIADA es Thr74-Thr116-Thr119. Así, en una realización específica, el sitio de unión de la glutamato racemasa de S. aureus forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys72 y Cys184 y, adicionalmente, comprende al menos uno (uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Asn73, Thr74, Thr1 16, Thr119, Glu151, Thr185 e His186.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de la glutamato racemasa de S. aureus. En un lado (Cys184) del sitio de unión, Thr185 está unida por H a His186 e His186 está unida adicionalmente por H a GIu151. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr185 está a una distancia de 2,9 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (es decir, glutamato) y a 4,4 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys184, que está a una distancia de 4,1 \ring{A} del nitrógeno de His186.

En el otro lado del sitio de unión (Cys72), Thr74 está unida por H a Thr116 y unida adicionalmente por H a Thr119. El O del hidroxilo de Thr74 está unido por H a uno de los átomos de oxígeno del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 4,3 \ring{A} del átomo de S de Cys72. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo forman un triángulo y que todos están a menos de 3,4 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

Otra realización es un cristal de la glutamato racemasa de S. aureus, que comprende un sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos Cys72, Cys184, Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46. Este cristal puede estar además formando un complejo con D-glutamato. Adicionalmente, el sitio de unión del cristal que forma un complejo con D-glutamato comprende los restos de aminoácidos: Cys72, Cys184 y al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Asn73, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp9, Gly11, Val12 Gly13, Gly14, Arg38, Cys39, Pro43, Arg44, Ala71, Ala75, Val94, Gly115, Val147, Gly183 y Tyr187. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: He8, Thr16, Val17, Tyr32, Asp35, Va149, He70, Ser76, Ala77, Leu114, Gly118, Ile120, Tyr125, Pro144, Pro148, Leu182 y Ser207. Los cristales que comprenden los sitios de unión representados por los restos de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 46; o una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 46.

También se definen la localización y geometría de un sitio de unión de la enzima. Se identificaron dos restos de cisteína (Cys) conservados como los restos responsables de la (des)protonación del carbono alfa del sustrato durante la catálisis, lo que es consistente con el mecanismo de dos bases propuesto para la función de la enzima en su papel como una racemasa. Las dos cisteínas del sitio de unión son Cys72 y Cys184, que están a una distancia entre sí de aproximadamente 7,3 Angstroms (\ring{A}) (distancia C\alpha-C\alpha, que es la distancia entre átomos C\alpha). Otros restos de aminoácidos identificados en la proximidad del sitio de unión incluyen Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186. El sustrato/producto unido, D-glutamato, está localizado entre los dos restos de cisteína conservados. Más detalles del sitio de unión son los siguientes: hacia abajo del eje definido por Glu151 junto con el carbono \gamma y \alpha, las dos cisteínas exhiben un entorno bastante simétrico; cada una tiene un núcleo hidrofóbico detrás, respecto al sustrato y un resto de treonina cercano que no está lejos del C-alfa del sustrato (3,4-4,3 \ring{A}), respectivamente.

El análisis de la estructura del cristal de la glutamato racemasa de S. aureus indica que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 10 \ring{A} del D-glutamato unido: 8-17, 32-44, 49, 52, 71-79, 94-95, 114-120, 122, 125, 184-190 y 207-208. El análisis de la estructura del cristal también muestra que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 4 \ring{A} del D-glutamato unido: 9-10, 39-42, 72-74, 116, 119 y 184-186. Es interesante el hecho de que un sólo resto de aminoácido ácido (Asp9) está presente en la estructura circundante de la Cys72 del sitio de unión, que sirve como un punto de anclaje para el grupo amino del sustrato/producto con una interacción polar (cargada) entre el átomo de nitrógeno del amino del D-glutamato y el átomo de oxígeno delta de Asp9.

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C. Bacterias gram negativas atípicas

La MurI (MurI) de H. pylori se ha cristalizado y se han determinado estructuras de cristal (estructura tridimensional). Las estructuras determinadas representan las de MurI sola o formando un complejo con el sustrato de la enzima, glutamato. Los datos de RMN sugieren que pueden existir múltiples conformaciones plegadas de MurI en ausencia del sustrato.

Los resultados muestran que la unidad asimétrica del cristal consiste en dos copias de la cadena polipeptídica correspondientes a un dímero; la forma activa de MurI (MurI) de H. pylori es un dímero. Cada monómero consiste en dos dominios claros y muy similares de tipo alfa/beta que se mantienen juntos por una bisagra situada en un extremo de la interfaz del dominio (alrededor de los restos de aminoácidos 92 y 210).

Los dos dominios juntos forman el sitio activo que incluye restos de uno solo de los monómeros, a pesar del hecho de que el sitio activo está situado cerca de la interfaz del dímero. Los dos dominios contribuyen con restos de aminoácidos importantes al sitio de unión. Por ejemplo, las dos cisteínas conservadas son de diferentes dominios.

El dímero de MurI de H. pylori se mantiene unido mediante un núcleo hidrofóbico estable y conservado creado por un haz de cuatro hélices (por ejemplo, dos hélices de cada monómero, restos 143 a 169) que une los dos dominios y, como resultado, los dos monómeros bastante rígidamente entre sí. Esta organización deja a los otros dos dominios de cada monómero más libres para moverse lo que proporciona acceso a los dos sitios activos en la interfaz del dímero. Los resultados muestran que la proteína es un dímero también en ausencia de un ligando y es más flexible en este estado.

Los restos de aminoácidos que forman el sitio de unión de MurI están conservados en diecisiete cepas de H. pylori que se han secuenciado y cuyas secuencias de aminoácidos se han determinado.

Un experto en la técnica reconocerá que la resolución de las estructuras de cristal de proteínas tales como MurI (MurI) de H. pylori requiere una proteína estable de alta calidad.

Una realización se refiere a un cristal de MurI. En una realización, proporcionamos MurI cristalizada de H. pylori caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 4. En una realización, proporcionamos MurI cristalizada de H. pylori formando un complejo con D-glutamato caracterizada por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 5. Una realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,14 \ring{A}, b = 81,07 \ring{A} y c = 113,82 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Otra realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 59,20 \ring{A}, b = 82,40 \ring{A} y c = 106,50 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta= 92,15º y \gamma = 90º. Otra realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,28 \ring{A}, b = 78,96 \ring{A} y c = 59,14 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta= 92,64º y \gamma = 90º. Otra realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,02 \ring{A}, b = 80,66 \ring{A} y c = 59,18 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta= 92,65º y \gamma = 90º. Otra realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,61 \ring{A}, b = 78,40 \ring{A} y c = 59,43 \ring{A} y donde \alpha = 90º, \beta= 92,33º, \gamma = 90º. Otra realización del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,9 \ring{A}, b = 81,8 \ring{A} y c = 113,6 \ring{A} y donde \alpha = 90º, \beta= 90º, \gamma = 90º. Cada una de estas realizaciones está englobada por las coordenadas estructurales de la Figura 4 o en complejo con D-glutamato como se engloba por las coordenadas estructurales de la Figura 5.

Una realización es un cristal de MurI de H. pylori formando un complejo con el producto (sustrato) D-glutamato en la que la MurI es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o partes de ésta. En la presente invención, los cristales difractan de aproximadamente 0,8 \ring{A} a aproximadamente 3,5 \ring{A}.

Una realización se refiere a un cristal de MurI formando un complejo con un inhibidor (por ejemplo, un agente de unión antibacteriano, fármaco, etc.). En una realización, proporcionamos MurI cristalizada de H. pylori formando un complejo con el sustrato, D-glutamato. En una realización adicional, el complejo cristalizado se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 4, en la que las estructuras determinadas presentadas representan las de MurI formando un complejo con D-glutamato. En una realización, la presente invención muestra MurI cristalizada de H. pylori formando un complejo con un inhibidor y sustrato (por ejemplo, glutamato). En una realización adicional de la presente invención, el complejo cristalizado se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 5, en la que las estructuras determinadas presentadas representan las de MurI formando un complejo con un inhibidor y glutamato. En una realización adicional, el agente de unión antibacteriano es una pirimidinadiona. En una realización de la presente invención, el complejo de cristal se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 4.

Una realización adicional del complejo cristalizado se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 61,41 \ring{A}, b = 76,31 \ring{A} y c = 108,92 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º, en la que el complejo cristalizado se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 5.

Una realización adicional es MurI cristalizada de H. pylori. En una realización adicional de la presente invención, la MurI cristalizada se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 6, en la que las estructuras determinadas presentadas representan las de MurI formando un complejo con glutamato y el inhibidor pirimidinadiona, compuesto A.

Una realización adicional es MurI cristalizada de H. pylori formando un complejo con un inhibidor (por ejemplo, una agente de unión antibacteriano, fármaco, etc.). En una realización adicional de la presente invención, el complejo cristalizado se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 7, en las que las estructuras determinadas presentadas representan las de MurI formando un complejo con el compuesto A. En una realización adicional, el inhibidor es una pirimidinadiona, tal como una imidazolil pirimidinadiona, una tiofenil-pirimidinadiona, una furanil-pirimidinadiona, una pirazolo-pirimidinadiona o una pirrolil pirimidinadiona.

En una realización adicional, la pirimidinadiona es el compuesto A, compuesto B, compuesto C, compuesto D, compuesto E, compuesto F, compuesto G, compuesto H, compuesto I, compuesto J, compuesto K, compuesto L, compuesto M, compuesto N, compuesto O, compuesto P, compuesto Q, compuesto R, compuesto S, compuesto T, compuesto U, compuesto V, compuesto W, compuesto X, compuesto Y, compuesto Z, compuesto AA, compuesto AB, compuesto AC, compuesto AD, compuesto AE, compuesto AF, compuesto AG, compuesto AH, compuesto AI, compuesto AJ o compuesto AK, en el que los complejos cristalinos se caracterizan por los grupos espaciales y las dimensiones de celda representadas en la Tabla 5.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a un cristal de MurI de H. pylori formando un complejo con una pirimidinadiona que tiene el grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2 y que tiene las dimensiones de celda a = 60,7 \ring{A}, b = 77,5 \ring{A}, c = 56,6 \ring{A} y \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Una realización adicional engloba este cristal formado por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de D-L Glutamato; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio; aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 500 micromolar del compuesto A; y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 20-25% de PEG 3350; aproximadamente 15-25% de glicerol; y aproximadamente 0,2 mM de acetato de amonio; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en condiciones en las que se producen los cristales de MurI.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a un cristal de MurI de H. pylori formando un complejo con una pirimidinadiona que tiene el grupo espacial monoclínico P2_{1} y que tiene las dimensiones de celda a = 57,1 \ring{A}, b = 78,0 \ring{A}, c = 58,55 \ring{A} y \alpha = 90º, \beta = 97,91º y \gamma = 90º. Una realización adicional engloba este cristal formado por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de D-L Glutamato; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio; aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 500 micromolar del compuesto A; y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución con aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 20-25% de PEG 3350; aproximadamente 15-25% de glicerol; y aproximadamente 0,2 mM de acetato de amonio; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen los cristales de MurI, mediante el cual se producen los cristales de MurI.

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III. Variantes

Las variantes de la presente invención pueden tener una secuencia de aminoácidos que es diferente por una o más sustituciones de aminoácidos de la secuencia mostrada en SEQ ID NOS: 2 ó 44, por ejemplo. También se contemplan las realizaciones que comprenden deleciones y/o adiciones de aminoácidos. La variante puede tener cambios conservativos (similitud de aminoácidos), en la que un aminoácido sustituyente tiene propiedades estructurales o químicas similares a las del resto de aminoácido que reemplaza (por ejemplo, el reemplazamiento de leucina con isoleucina). Las directrices para determinar qué y cuantos restos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad biológica o farmacológica pueden inferirse razonablemente a la vista de esta descripción y pueden encontrarse además utilizando programas informáticos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, el programa DNAStar®.

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Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, por ejemplo, tomando como base la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los restos siempre que se retenga la actividad biológica y/o farmacológica de la molécula nativa.

Los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; los aminoácidos con grupos alifáticos incluyen glicina, alanina; asparagina, glutamina, serina; y los aminoácidos con cadenas laterales aromáticas incluyen treonina, fenilalanina y tirosina.

Los ejemplos de sustituciones se muestran en la Tabla 1 como sigue:

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TABLA 1

1

En la presente invención, la "homología de aminoácidos" es una medida de la identidad de las secuencias primarias de aminoácidos. Con el fin de caracterizar la homología, se alinean secuencias sujeto de manera que se obtiene el mayor porcentaje de homología (coincidencia), después de introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de homología. No debe considerarse que las extensiones N o C-terminales afectan a la homología. "Identidad" per se tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse utilizando técnicas publicadas. Los métodos basados en programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, por ejemplo, el programa DNAStar® (DNAStar Inc. Madison, WI); el paquete informático GCG® (Devereux, J., et al. Nucleic Acids Research (1984) 12(1): 387); BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec Biol (1990) 215: 403). La homología (identidad), tal y como se define en la presente memoria, se determina utilizando el programa informático que es muy conocido, BESTFIT® (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI, 53711). Cuando se utiliza BESTFIT® o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias (tal como el algoritmo Clustal del programa MegAlign (DNAStar®) para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, aproximadamente 90% homóloga respecto a una secuencia de referencia, según la presente invención, los parámetros se ajustan de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos de referencia y de manera que se permiten huecos en la homología de hasta aproximadamente el 90% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.

Por lo tanto, se determina una homología del noventa por ciento, por ejemplo, utilizando el programa BESTFIT® ajustando los parámetros de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de referencia, por ejemplo, SEQ ID NOS: 2 ó 44 y hasta el 10% de los aminoácidos de la secuencia de referencia puede estar sustituido por otro aminoácido. Los porcentajes de homologías de determinan de manera similar, por ejemplo, para identificar especies preferidas, en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas a la presente memoria, que residen en el intervalo de aproximadamente 70% a 100% de homología respecto a SEQ ID NOS: 2 ó 4, así como el sitio de unión de éstas. Como se ha indicado anteriormente, no debe considerarse que las extensiones N o C-terminales afectan a la homología. Cuando se comparan dos secuencias, la secuencia de referencia es generalmente la más corta de las dos secuencias. Esto significa, por ejemplo, que si una secuencia de 50 nucleótidos de longitud tiene una identidad exacta con una región de 50 nucleótidos en un polinucleótido de 100 nucleótidos, existe un 100% de homología para esta región comparado con sólo un 50% de homología.

Aunque los polipéptidos naturales de una secuencia tal como SEQ ID NO: 2 y una variante polipeptídica pueden ser sólo 90% idénticos, en realidad tendrán probablemente un grado de similitud más alto, dependiendo del número de codones distintos que son cambios conservativos. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden realizarse frecuentemente en una proteína sin alterar ni la conformación ni la función de la proteína. La similitud entre dos secuencias incluye las coincidencias directas, así como sustituciones de aminoácidos conservados que tienen propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, carga similar como se describe en la Tabla 1.

El porcentaje de similitud (sustituciones conservativas) entre dos polipéptidos también puede valorarse comparando las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos utilizando programas muy conocidos en la técnica, incluyendo el programa BESTFIT, utilizando ajustes por defecto para determinar la similitud.

Una realización adicional es un cristal de MurI que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de SEQ ID NOS: 2-34, 40, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 y 74. Una realización adicional es un cristal de MurI, en el que la secuencia de aminoácidos es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga respecto a la secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de SEQ ID NOS: 2-34, 40, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 y 74.

Las mutaciones/sustituciones en la presente invención pueden realizarse utilizando técnicas muy conocidas en la técnica (por ejemplo, mutagénesis dirigida) utilizando métodos moleculares.

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IV. Homología Estructural y Elementos Estructurales Conservados

Los solicitantes han determinado que MurI de bacterias Gram negativas, Gram positivas y atípicas tienen elementos estructurales comunes que son constantes incluso a la vista de las secuencias primarias de aminoácidos que se diferencian respecto a su longitud de secuencias y contenido global. Estos elementos estructurales comunes se representan en las Figuras 1 y 2. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "homología estructural" se refiere a restos estructurales conservados que pueden variar respecto a la secuencia primaria de aminoácidos hasta un 75% pero que tienen estructuras terciarias similares o idénticas.

La Figura 1A ilustra un monómero de MurI representando los elementos estructurales conservados. La topología de los elementos estructurales conservados se ilustra en la Figura 1B. Un experto en la técnica reconocerá que todas las MurI comparten determinadas características estructurales como se indica en la columna con el encabezamiento: "Todas". Las características estructurales específicas se conservan entre las bacterias atípicas y Gram positivas ("MurI - G-") y otras están conservadas en los géneros de las bacterias Gram positivas ("G+"). Los subconjuntos de elementos estructurales conservados (por ejemplo, cadenas y hélices) se representan por las abreviaturas H (hélices), E (cadenas), S (bucles) y T (giros). Los elementos estructurales conservados en todos las MurI se indican por un número en la columna titulada "Todas las MurI"; los elementos estructurales conservados en MurI de las bacterias Gram positivas y atípicas se indican por un número en la columna con el encabezamiento "MurI - E. coli"; y los elementos estructurales conservados en MurI de las bacterias Gram positivas se indican por un número en la columna con el encabezamiento "G+". El número "1" indica que el resto de aminoácido reside en el dominio 1 de MurI, mientras que el número "2" indica que el resto de aminoácido reside en el dominio 2 de MurI.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio accesorio" significa una combinación de cualquiera de los elementos estructurales conservados, un subconjunto de cualquiera de los elementos estructurales conservados o parte o todo de un sitio de unión de la presente invención.

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A. Gram negativas

La topología y los elementos estructurales conservados de MurI de E. coli se ilustran en las Figuras 1A y 2, respectivamente. Una realización son los elementos estructurales conservados de MurI de E. coli representados por hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T). Los ejemplos ejemplares de los elementos estructurales conservados de las bacterias Gram negativas de la presente invención son S1: 24V-28D; H1: 36V-43L; S2: 49Y-53F; H2: 65E-80Q; S3: 87L-90V; H3: 93A-98V; H4: 100L-105E; S4: 111V-112V; H5: 118I-124L; S5: 130V-134A; H6: 136R-141R; H7: 143Y-150R; 56: 157I-161G; H8: 165M-170E; H9: 180L-186I; 57: 199T-202L; H10: 211Q-217V; S8: 223R-225V; HII: 228G-238L; 59: 2531-256C; H12: 261P-271Q; y S10: 227T-279E.

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B. Gram positivas 1.E. faecalis

Los elementos estructurales conservados de MurI de E. faecalis se ilustran en las Figuras 1A, 1B y 2. Una realización son los elementos estructurales conservados de MurI de E. faecalis representados por hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T). Los ejemplos ejemplares de elementos estructurales conservados de la presente invención son S1: 7I-11D; H1: 19V-26Q; S2: 32L-36G; H2: 48A-63L; S3: 69M-72I; H3: 75N-80V; H4: 82L-87A; S4: 93V-94V; H5: 98L-107V; S5: 113I-117G; H6: 119L-124S; H7: 126S-133S; 56: 140V-144A; H8: 148F-153E; H9: 162A-169T; S7: 180T-183L; H10: 192r-198v; S8: 204T-206I; H11: 209G-219L; S9: 237E-240T; y H12: 245K-255L.

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2.E. faecium

Los elementos estructurales conservados de MurI de E. faecium se ilustran en las Figuras 1A, 1B y 2. Una realización son los elementos estructurales conservados de MurI de E. faecium representados por hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T). Los ejemplos ejemplares de elementos estructurales conservados de la presente invención son S1: 101-14D; H1: 22V-29Q; S2: 351-39G; H2: 51A-66V; S3: 72M-751; H3: 78N-83V; H4: 85L-90A; S4: 96V-97I; H5: 101L-110A; S5: 116V-120G; H6: 122I-127S; H7: 129A-136E; S6: 143V-147A; H8: 151F-156E; H9: 166K-172T; S7: 183T-186L; H10: 195R-201V; S8: 207Q-209I; H11: 212G-222L; S9: 240Q-243T; H12: 248K-258L; y S10: 264E-266E.

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3.S. aureus

Los elementos estructurales conservados de MurI de S. aureus se ilustran en las Figuras 1A, 1B y 2. Una realización son los elementos estructurales conservados de MurI de S. aureus representados por hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T). Los ejemplos ejemplares de elementos estructurales conservados de la presente invención son S1: 51-9D; H1: 17V-24Q; S2: 301-34C; H2: 46G-61M; S3: 67M-70I; H3: 73N-78V; H4: 80L-85K; S4:91V-92I; H5:96E-105T; S5: 111V-115G; H6:117E-122S; H7: 124A-131R; S6: 138V-142A; H8: 146F-151E; H9: 162S-168T; S7:179T-182L; H10: 191Y-197Y; S8: 203T-205I; y H11: 208G-218L.

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C. Atípicas 1.H. pylori

Los elementos estructurales conservados de MurI de H. pylori se ilustran en las Figuras 1A, 1B y 2. Una realización de la presente invención son los elementos estructurales conservados de MurI de H. pylori representados por hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T). Los ejemplos ejemplares de elementos estructurales conservados de la presente invención son S1: 3I-7D; H1: 15V-22A; S2: 28I-32G; H2: 44P-59K; S3: 65L-68V; H3: 71N-76L; H4: 78L-83K; S4: 89I-90V; H5: 94E-103Q; S5: 111I-115G; H6: 117K-122S; H7: 124A-131Q; S6: 137I-141A; H8: 145F-150E; H9: 160E-166Y; S7: 176V-179L; H10: 188A-194Y; S8: 206L-208F; H11: 211G-221K; S9: 235E-238A; y H12: 243I-253L.

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2.A. pyrophilus

Los elementos estructurales conservados de MurI de A. pyrophilus se ilustran en las Figuras 1A, 1B y 2. Una realización son los elementos estructurales conservados de MurI de A. pyrophilus representados por hélices (H), láminas beta (E), bucles (S) y giros (T). Los ejemplos ejemplares de elementos estructurales conservados de la presente invención son S1: 3I-7D; H1: 15V-22R; S2: 28I-32G; H2: 44K-59K; S3: 65I-68V; H3: 71N-76Y; H4: 78L-83K; S4: 89V-90F; H5: 94E-103K; S5: 109I-113G; H6: 115P-120S; H7: 122A-129E; S6: 134V-138A; H8: 142F-147E; H9: 157R-163Y; S7:173T-176L; H10: 185K-191F; S8: 196E-198V; H11: 201S-211F; S9: 221E-224F; H12: 229P-239L; y S10: 245V-247L.

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C. Elementos estructurales comunes para MurI de Gram positivas y atípicas

El análisis de las coordenadas atómicas con referencia a la estructura tridimensional de MurI mostró que MurI de las bacterias Gram positivas y atípicas comparten elementos y fragmentos estructurales conservados independientemente de las diferencias en la secuencia primaria de aminoácidos. Los elementos compartidos se ilustran a continuación en la Tabla 2. Los trece elementos compartidos de cada elemento conservado se proporcionan en términos de la secuencia primaria de aminoácidos representada en la Figura 2.

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3

D. Elementos estructurales comunes de todas las MurI

El análisis de las coordenadas atómicas con referencia a la estructura tridimensional de MurI mostró que todas las MurI comparten elementos y fragmentos estructurales conservados independientemente de las diferencias en la secuencia primaria de aminoácidos. Los elementos compartidos se ilustran a continuación en la Tabla 3. Los trece elementos compartidos de cada elemento conservado se proporcionan en términos de la secuencia primaria de aminoácidos representada en la Figura 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

4

E. Elementos estructurales comunes para MurI de Gram positivas

El análisis de las coordenadas atómicas con referencia a la estructura tridimensional de MurI mostró que MurI de las bacterias Gram positivas comparten elementos y fragmentos estructurales conservados independientemente de las diferencias en la secuencia primaria de aminoácidos. Los elementos compartidos se ilustran a continuación en la Tabla 4. Los siete elementos compartidos de cada elemento conservado se proporcionan en términos de la secuencia primaria de aminoácidos representada en la Figura 2.

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TABLA 4

5

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V. Sitios de Unión

MurI es altamente flexible y dependiendo de su conformación puede unirse a una amplia variedad de estructuras. Se han cristalizado las MurI de las bacterias Gram positivas, tales como E. faecalis, E. faecium y S. aureus; de las bacterias Gram negativas, tales como E. coli; y de bacterias atípicas, tales como H. pylori y A. pyrophilus.

Un estudio de las coordenadas estructurales y de la bioquímica ha revelado una interfaz molecular a lo largo de un eje de MurI que es altamente flexible y permite a la enzima existir en múltiples conformaciones que están determinadas por las sustancias que se unen al sitio activo, interfaz intradominio o interfaz intermolecular del dímero y, en el caso de MurI de las bacterias Gram negativas, el sitio del activador. Como tal, la enzima se une a múltiples sustratos e inhibidores con una amplia variedad de características estructurales y tamaños.

Las MurI de las bacterias Gram positivas y atípicas comprenden una estructura dimérica de dos monómeros, cada uno de los cuales está comprendido por 2 dominios. La "interfaz molecular" de MurI en las bacterias Gram positivas y atípicas tiene tres dominios: un sitio de unión al sustrato, una interfaz intermolecular del dímero y una interfaz intradominio.

La MurI de las bacterias Gram negativas es un monómero que tiene tres dominios a lo largo de la interfaz molecular: un sitio de unión al sustrato, un sitio de unión al activador y una interfaz intradominio. Todas las MurI descritas en la presente memoria tienen una "interfaz intradominio". Cuando un inhibidor se une a la interfaz intradominio, impide el movimiento de la enzima, inhibiendo, de esta manera, a la enzima.

Las MurI de las bacterias Gram positivas son dímeros, teniendo cada monómero del dímero dos dominios. Las bacterias Gram positivas tienen una interfaz intermolecular del dímero en la que los dos sitios de unión al sustrato están hacia el exterior en extremos opuestos de la enzima, de manera que MurI puede unirse simultáneamente a dos restos de sustrato.

Las MurI de las bacterias atípicas, tal como H. pylori, son dímeros que tienen dos monómeros, teniendo cada monómero dos dominios y teniendo cada dominio un sitio de unión al sustrato. El sitio de unión al sustrato de MurI de A. pyrophilus es ligeramente diferente porque el sustrato está en contacto con restos de cada monómero, conteniendo cada uno elementos clave del sitio activo.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio de unión" se refiere a una región (o átomo) específica de MurI que interacciona con una molécula que se une a MurI. Un sitio de unión puede ser, por ejemplo, un elemento estructural conservado o una combinación de varios elementos estructurales conservados, un sitio de unión al sustrato, un sitio de unión al activador, un sitio de unión al inhibidor, una interfaz intradominio o una interfaz intermolecular del dímero.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio de unión al sustrato" se refiere a una región (o átomo) específica de MurI que interacciona con un sustrato, tal como D-glutamato. En la presente solicitud, los términos sitio de unión al sustrato y sitio activo se utilizan indistintamente. Un sitio de unión al sustrato puede comprender, o estar definido por, la disposición tridimensional de dos o más restos de aminoácidos en un polipéptido plegado.

En la presente invención, un sustrato puede ser un compuesto tal como L-glutamato o D-glutamato que MurI convierte reversiblemente del enantiómero R al S. Así, un sustrato también puede actuar como un producto. El sustrato puede ser un compuesto natural o artificial.

En la presente invención, un inhibidor puede ser un compuesto que también puede someterse a una reacción catalítica, unirse al sitio de unión al sustrato o a otro sitio en MurI y que compite con la velocidad de recambio del sustrato del glutamato. Los inhibidores de la presente invención pueden ser compuestos tales como L-serina-O-sulfato, D-serina-O-sulfato, D-aspartato, L-aspartato, tartrato, citrato, fosfato, sulfato, aziridino-glutamato, N-hidroxiglutamato ó 3-cloroglutamato. El inhibidor puede ser un compuesto natural o artificial.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio de unión al activador" se refiere a una región (o átomo) específica de MurI que interacciona con un activador, tal como UDP-MurNAc-Ala. Un sitio de unión al activador puede comprender, o estar definido por, la disposición tridimensional de uno o más restos de aminoácidos en un polipéptido plegado. Un activador puede ser un compuesto, tal como UDP-MurNAc-Ala. El activador puede ser un compuesto natural o un compuesto artificial. La estructura del activador es compacta cuando se une a MurI de las bacterias Gram negativas. Cuando forma un complejo con MurI, el activador (tal como UDP-MurNAc-Ala) se pliega en sí mismo en una estructura de dos capas en la que dos grupos fosfato actúan como una conexión puente. El anillo de uridina de UDP-MurNAc-Ala se apila sobre el anillo de ácido murámico. Existe un emparejamiento con una forma casi perfecta entre la MurI y el activador ya que el activador reside en la parte superior de los dos bucles conectores entre los dos dominios, correspondiendo en la secuencia a los restos 112-116 y 225-228. En ausencia del activador, los dos bucles actúan como una bisagra entre los dos dominios. La unión de MurI y el activador no está completamente dirigida por interacciones de van der Waal favorables; existen varias interacciones polares y al menos un puente salino fuerte entre Arg104 y el grupo carboxilato del resto de alanina del activador. El puente salino podría ser una interacción clave para que UDP-MurNAc-Ala sea capaz de bloquear a los dominios en la orientación apropiada. Esto explica la necesidad del resto de alanina terminal con el fin de que la molécula funcione como un activador. Se encuentran otras interacciones polares extensas entre el anillo de uracilo de UDP-MurNAc-Ala y los átomos de la cadena principal de MurI, restos 113-115, así como varios enlaces de hidrógeno de los grupos hidroxilo de los dos anillos de azúcar de UDP-MurNAc-Ala. Muchas interacciones entre el activador y MurI están mediadas por moléculas de agua. Al contrario que los restos de uracilo y azúcar, dos grupos fosfato de UDP-MurNAc-Ala presentan muy poco contacto con la proteína ya que están orientados hacia la disolución. A cada lado del grupo difosfato hay un resto cargado positivamente, Lys119 en un dominio y Arg233 del otro, lo que proporciona otro ejemplo de interacción estabilizadora dominio-dominio.

Una parte de la interfaz molecular es una "interfaz intermolecular del dímero" que está presente sólo en los dímeros de MurI (bacterias Gram positivas y atípicas) y se produce en la interfaz de los monómeros que forman el dímero. El análisis de esta interfaz intermolecular del dímero de varias MurI ha revelado que la interfaz es altamente flexible y también permite la rotación de los monómeros entre sí. La distancia entre c\alpha-c\alpha de las cisteínas del sitio activo presentes en el monómero y la magnitud del ángulo de la abertura puede variar mucho (Véase la Figura 1C y la Figura 3, columna 3). Éstas determinan la estructura del sustrato o inhibidor que se une a diferentes regiones o componentes de la enzima. Los solicitantes han determinado, para cada especie que se ha cristalizado, los restos de aminoácidos presentes en la interfaz intermolecular del dímero y han comparado la secuencia primaria de aminoácidos en las especies de MurI de bacterias Gram positivas y atípicas. De acuerdo con esto, los Solicitantes han sido capaces de determinar el grado (en \ring{A}) de flexibilidad de MurI cuando se une a varios sustratos o inhibidores de manera que sería de esperar que MurI de todas las bacterias Gram positivas y atípicas se comportaran de una manera similar, flexible (Véase la Figura 3, columna 7). Los Solicitantes han descubierto varios inhibidores o sustratos nuevos de MurI que se unen al sitio activo. El sitio activo de MurI no es estático y, de hecho, es altamente flexible haciendo posible que distintos tipos de estructuras se unan a él e inhiban la función de la enzima.

Como se muestra en la Figura 3, los Solicitantes han calculado la distancia en \ring{A} entre las cisteínas del sitio activo de MurI cuando diferentes compuestos se unen al sitio de unión del sustrato. Por ejemplo, la distancia entre los restos de cisteína de E. faecium puede variar de 7,5 \ring{A} a 8,7 \ring{A}, dependiendo de que se una tartrato, citrato o
fosfato.

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A. Gram negativas - E. coli

Las coordenadas determinadas representan las de MurI sola y MurI formando un complejo con el sustrato (L-glutamato), formando un complejo con el activador (UDP-MurNAc-Ala) y formando un complejo con el sustrato (L-glutamato) y el activador (UDP-MurNAc-Ala). La cristalización de MurI de E. coli se describe en el Ejemplo 2 y en las Figuras 8-11. Los resultados muestran que la unidad del cristal consiste en una molécula que corresponde a un monómero; la forma nativa de MurI de las bacterias Gram negativas es un monómero. El monómero tiene dos dominios, que tienen plegamientos tipo alfa/beta similares. La unión del sustrato identifica claramente el sitio de unión que está situado entre los dos dominios (Véase el lado izquierdo de la Figura 1H). El activador, UDP-MurNAc-Ala, se une al lado opuesto de la proteína (Véase el lado derecho de la Figura 1H), actuando posiblemente como un modulador de la actividad mediante la inducción de la conformación correcta del sitio de unión modulando la posición relativa de los dos dominios de la proteína. Así, la región bisagra localizada entre los dos dominios es flexible de manera que cuando el activador se une, la conformación de la proteína cambia en la región bisagra para que el sitio de unión al sustrato esté disponible.

Las bacterias Gram negativas incluyen, por ejemplo, especies de Escherichia, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Vibrio cholerae, Proteus mirablis, Pasteruella multocida, Acinetobacter baumanii, Bacteroides fragilis, especies de Treponemas, especies de Borrelias, especies de Deinococcus, especies de Pseudomonas, especies de Salmonella, especies de Shigella, especies de Yersinia y Porphyromonas gingivalis.

La estructura del cristal de MurI de E. coli revela la estructura tridimensional de los dominios de unión formados por los átomos de los restos de aminoácidos listados en la Figura 10.

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1. Sitio de Unión al Sustrato

Una realización adicional se refiere a una MurI de E. coli en la que el sitio de unión al sustrato comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys92 y Cys204 en la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 40. Una realización adicional comprende un sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli en la que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 10. En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys92 y Cys204 así como los restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys92 y Cys204 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 8. En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206. En esta realización, el sitio de unión al sustrato forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys92 y Cys204 y al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión del sustrato incluye los restos de aminoácidos Phe27, Asp28, Ser29, Gly30, Va131, Gly32, Gly33, Ser35, Va136, Asp54, Ala57, Ala57, Phe58, Pro59, Tyr60, Gly61, Glu62, Lys63, IIe68, Va190, Ala91, Cys92, Asn93, Thr94, Ala95, Ser96, Thr97, Val114, Va1115, Leu133, Ala134, Thr135, Arg136, Gly137, Thr138, Va1139, Thr144, Ala163, Va1166, Glu167, Glu170, Leu202, Gly203, Cys204, Thr205, His206, Phe207 y Ser227.

En una realización adicional, el sitio de unión al sustrato de MurI comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys204) del sitio de unión, la TRIADA es Glu170-Thr205-His206 y en el otro lado (Cys92), la TRIADA es Thr94-Thr135-Thr138. Así, en una realización específica, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. coli forma un complejo con L-glutamato y comprende las coordenadas estructurales relativas de los restos de aminoácidos Cys92 y Cys204 y comprende adicionalmente las coordenadas estructurales relativas de al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de MurI de E. coli. En un lado (Cys204) del sitio de unión al sustrato, Thr205 está unida por H a His206 e His206 está unida adicionalmente por H a GIu170. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr205 está a una distancia de 2,8 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (es decir, glutamato) y a 5,3 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys204, que está a una distancia de 4,3 \ring{A} de la His206. En el otro lado del sitio de unión al sustrato (Cys92), Thr94 está unida por H a Thr135 y unida adicionalmente por H a Thr138. El O del hidroxilo de Thr94 está unido por H a uno de los átomos de oxígeno del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 3,3 \ring{A} del átomo de S de Cys92. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo forman un triángulo y que todos están a menos de 3,2 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión al sustrato (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

Otra realización es un cristal de MurI de E. coli, que comprende un sitio de unión al sustrato que comprende los restos de aminoácidos Cys92, Cys204, Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206. Este cristal también puede comprender MurI formando un complejo con L-glutamato. Adicionalmente, el sitio de unión al sustrato del cristal que forma un complejo con L-glutamato puede comprender los restos de aminoácidos: Cys92, Cys204 y uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión al sustrato comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp28, Gly30, Val131, Gly32, Gly33, Ala57, Phe58, Pro59, Tyr60, Gly61, Glu62, Lys63, Ala91, Asn93, Ala95, Val114, Ala134, Val166, Gly203 y Phe207. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión al sustrato comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Phe27, Ser35, Val36, Tyr51, Asp54, De68, Val90, Ser96, Thr97, Val115, Leu133, Thr135, Arg136, Gly137, Val139, Thr144, Ala163, Glu167, Leu202 y Ser227. Los cristales que comprenden los sitios de unión al sustrato englobados por los restos de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 40; o una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 40.

También se definen la localización y geometría del sitio de unión al sustrato de la enzima. Se identifican dos restos de cisteína (Cys) conservados como los restos responsables de la (des)protonación del carbono alfa del sustrato durante la catálisis, lo que es consistente con el mecanismo de dos bases propuesto para la función de la enzima en su papel como una racemasa. Las dos cisteínas del sitio de unión al sustrato son Cys92 y Cys204, que están a una distancia entre sí de aproximadamente 7,6 Angstroms (\ring{A}) (distancia C\alpha-C\alpha, es decir la distancia entre átomos Ca). Otros restos de aminoácidos identificados cerca del sitio de unión al sustrato incluyen Ser29, Thr94, Thr135, Thr138, Glu170, Thr205 e His206. El sustrato/producto unido, L-glutamato, está localizado entre los dos restos de cisteína conservados. Más detalles del sitio de unión son los siguientes: hacia abajo del eje definido por Glu170 junto con el carbono \gamma y \alpha, las dos cisteínas exhiben un entorno bastante simétrico; cada una tiene un núcleo hidrofóbico respecto al sustrato y un resto de treonina cercano que no está lejos del C-alfa del sustrato (4,5-3,4 \ring{A}), respectivamente.

El análisis de la estructura del cristal de MurI de E. coli indica que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 10 \ring{A} del L-glutamato unido: 27-36, 51-63, 69, 52, 90-98, 227-228, 205-208, 133-139, 141, 114-118, 144, 58, 60, 61 y 65. El análisis de la estructura del cristal también muestra que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 4 \ring{A} del L-glutamato unido: 28-29, 58-61, 92-94, 135, 138 y 204-206. Es interesante el hecho de que un sólo resto de aminoácido ácido (Asp28) está presente en la estructura circundante de la Cys92 del sitio de unión del sustrato, que sirve como un punto de anclaje para el grupo amino del sustrato/producto con una interacción polar (cargada) entre el átomo de nitrógeno del amino del L-glutamato y el átomo de oxígeno delta de Asp28.

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2. Sitio de Unión al Activador

Una realización se refiere a un sitio de unión al activador de MurI de E. coli. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio de unión al activador" se refiere a una región (o átomo) específica de MurI que interacciona con un activador, tal como LTDP-MurNAc-Ala. En determinadas realizaciones, un sitio de unión puede comprender, o estar definido por, la disposición tridimensional de uno o más restos de aminoácidos en un polipéptido plegado.

Una realización adicional se refiere a MurI de E. coli en la que el sitio de unión al activador comprende los restos de aminoácidos Arg104, Gly113, Val114, Val115, Pro116, Lys119, Ser227, Ala230, Ile231, Arg233 y Arg234 de SEQ ID NO: 40. Una realización adicional comprende un sitio de unión al activador de MurI de E. coli en el que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Leu100, Va1112, Ala117 y Pro120 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 8. En una realización adicional, el sitio de unión al activador comprende al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Thr97, Pro101, Ala102, Glu105, Lys106, Phe107, Asp108, Phe109, Pro110, Val1 11, Gly113, Ile118, Arg123, Leu124, Ser142, Tyr143, Thr144, Glu146, Leu147, Arg150, Phe151, Asp226, Gly228, Ala229, Trp237, Leu238, Glu240 e His241.

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3. Sitio de Unión Intradominio

En una realización, MurI de E. coli tiene una interfaz intradominio del dímero en la que interaccionan los dos dominios del monómero. La interfaz intradominio del dímero de MurI de E. coli comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Asp28, Ser29, Gly30, Va131, Gly32, Gly33, Leu34, Ser35, Val36, Asp38, Glu39, His42, Leu43, Val56, Ala57, Phe58, Pro59, Tyr60, Gly61, Glu62, Lys63, Ser64, Glu65, Ala66, Phe67, Ile68, Ala91, Cys92, Asn93, Thr94, Ala95, Ser96, Thr97, Va198, Va1114, Ala230, Ile231, Ala232, Arg233, Arg234, Trp237, Leu238, Pro261, Gly262, Gin265, Leu266, Pro268, Va1269, Leu270, Arg272 y Tyr273 de un primer dominio y los restos de aminoácidos Va1115, Pro116. Ala117, Ile118, Lys119, Pro120, A1a121, Arg123, Leu124, Thr135, Arg136, Gly137, Thr138, Va1139, Lys140, Arg141, Ser142, Tyr143, Thr144, Glu146, Leu147, Arg150, Ser162, Ala163, Va1166, Gly167, Ala169, Glu170, Ala171, Lys172, Leu173, His174, Va1201, Leu202, Gly203, Cys204, Thr205, His206, Phe207, Pro208, Leu209, Leu210, Val225, Asp226, Ser227, Gly228 y Leu229 de un segundo dominio, en el que los restos de aminoácidos están representados por SEQ ID NO: 40.

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B. Gram positivas

Como se describe en los ejemplos siguientes, MurI de E. faecalis, S. aureus y E. faecium se han cristalizado y se ha determinado la estructura del cristal (estructura tridimensional) de cada una. Las estructuras determinadas representan la de MurI sola, formando un complejo con el producto (sustrato) de la enzima, tal como D-glutamato o L-glutamato o formando un complejo con un inhibidor. La cristalización de MurI de E. faecalis, E. faecium y S. aureus se describe en los Ejemplos 3-5 y en las Figuras 12-18. Los resultados muestran que la unidad asimétrica del cristal consiste en un dímero que puede existir en formas simétricas (véase la Figura 1G) o no simétricas (véase la Figura 1H), dependiendo de si uno o ambos sitios de unión del sustrato están ocupados o abiertos. La proteína MurI es una estructura con cuatro dominios en términos de plegamiento global; cada dominio tiene plegamientos de tipo alfa/beta. La interfaz molecular de las bacterias Gram positivas existe entre dos de los dominios y funciona como un elemento flexible mediante el cual un cambio en la conformación abre el sitio de unión al sustrato, permitiendo que el sustrato se una a MurI.

Las bacterias Gram positivas incluyen las bacterias de especies de Bacillus, Staphylococcus spp., especies de Streptococcus, especies de Enterococcus, Lactobacilli, Pediococci y especies de Micobacterias. Más específicamente, las bacterias Gram positivas incluyen, por ejemplo, B. subtilis, S. aureus, E. faecalis y E. faecium.

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1.E. faecalis a. Sitio de Unión al Sustrato

Una realización adicional se refiere a una MurI de E. faecalis en la que el sitio de unión comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys74 y Cys185 en la secuencia representada como SEQ ID NO: 44. Una realización adicional comprende un sitio de unión de MurI de E. faecalis en la que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 12. En una realización, el sitio de unión de MurI de E. faecalis forma un complejo con D o L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys74 y Cys185 así como los restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys74 y Cys185 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 13. En una realización, el sitio de unión de MurI de E. faecalis comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187. En esta realización, el sitio de unión forma un complejo con D o L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys74 y Cys185 y al menos uno (uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión incluye los restos de aminoácidos Ile10, Asp11, Ser12, Gly13, Val14, Gly15, Gly16, Thr18, Val19; Tyr34, Asp37, Arg40, Cys41, Pro42, Tyr43,Gly44, Pro45, Arg46, Val51, Glu53, Ile72, Ala73, Cys74, Asn75, Thr76, Ala77, Ser78, Ala79, Val96, Ile116, Gly117, Thr118, Leu119, Gly120, Thr121, Ile122, Tyr127, Cys145, Pro146, Val149, Pro150, Leu183, Gly184, Cys185, Thr186, His187, Tyr188 y Ser208.

En una realización adicional, el sitio de unión de MurI comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys185) del sitio de unión, la TRIADA es Glu153-Thr186-His187 y en el otro lado (Cys74), la TRIADA es Thr76-Thr118-Thr121. Así, en una realización específica, el sitio de unión de MurI de E. faecalis forma un complejo con D o L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys74 y Cys185 y, adicionalmente, comprende al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de MurI de E. faecalis. En un lado (Cys185) del sitio de unión, Thr186 está unida por H a His187 e His187 está unida adicionalmente por H a GIu153. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr186 está a una distancia de 2,9 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (es decir, glutamato) y a 4,3 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys185, que está a una distancia de 4,1 \ring{A} del nitrógeno (N) de His187.

En el otro lado del sitio de unión (Cys74), Thr76 está unida por H a Thr118 y unida adicionalmente por H a Thr121. El O del hidroxilo de Thr76 está unido por H a uno de los átomos de oxígeno del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 4,3 \ring{A} del átomo de S de Cys74. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo forman un triángulo y que todos están a menos de 3,4 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

Otra realización es un cristal de MurI, que comprende un sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos Cys74, Cys185, Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44. Este cristal puede estar además formando un complejo con D o L-glutamato. Adicionalmente, el sitio de unión del cristal que forma un complejo con D-glutamato puede comprender los restos de aminoácidos: Cys74, Cys185 y uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp11, Gly13, Val14, Gly15, Gly16, Arg40, Cys41, Pro42, Arg46, Ala73, Asn75, Ala77, Val96, Gly117, Val149, Gly184 y Tyr188. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Ile10. Thr18, Va119, Tyr34, Asp37, Tyr43, Gly44, Pro45, Va151, De72, Ser78, Ala79, Ile116, Leu119, Gly120, Ile122, Tyr127, Cys145, Pro146, Pro150, Leu183 y Ser208. Los cristales que comprenden los sitios de unión representados por los restos de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 44; o una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% homóloga a la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 44.

También se definen la localización y geometría de un sitio de unión de la enzima. Se identificaron dos restos de cisteína (Cys) conservados como los restos responsables de la (des)protonación del carbono alfa del sustrato durante la catálisis, lo que es consistente con el mecanismo de dos bases propuesto para la función de la enzima en su papel como una racemasa. Las dos cisteínas del sitio de unión son Cys74 y Cys185, que están a una distancia entre sí de aproximadamente 7,0 Angstroms (\ring{A}) (distancia C\alpha-C\alpha, es decir, la distancia entre átomos C\alpha). Otros restos de aminoácidos identificados en la cercanía del sitio de unión incluyen Ser12, Thr76, Thr118, Thr121, Glu153, Thr186 e His187. El sustrato/producto unido, D o L-glutamato, está localizado entre los dos restos de cisteína conservados. Más detalles del sitio de unión son los siguientes: hacia abajo del eje definido por Glu153 junto con el carbono \gamma y \alpha, las dos cisteínas exhiben un entorno bastante simétrico; cada una tiene un núcleo hidrofóbico detrás, respecto al sustrato y un resto de treonina cercano que no está lejos del C-alfa del sustrato (3,7-3,4 \ring{A} cuando L-Glu está unido; y 3,4-4,3 \ring{A} cuando D-Glu está unido). Aquí tenemos el producto en un sitio y un sustrato en el otro. Los cambios conformacionales hacen que las cisteínas estén más cerca en la subunidad \alpha del el sustrato), respectivamente.

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El análisis de la estructura del cristal de MurI de E. faecalis indica que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 10 \ring{A} del D o L-glutamato unido: 10-19, 34-46, 51, 72-78, 96-97, 116-122, 124, 127, 183-189 y 208-209. El análisis de la estructura del cristal también muestra que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 4 \ring{A} del D o L-glutamato unido: 11-12 41-44, 74-76, 118, 121 y 186-187. Es interesante el hecho de que un solo resto de aminoácido ácido (Asp11) está presente en la estructura circundante de la Cys74 del sitio de unión, que sirve como un punto de anclaje para el grupo amino del sustrato/producto con una interacción polar (cargada) entre el átomo de nitrógeno del amino del D o L-glutamato y el átomo de oxígeno delta de Asp11.

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b. Interfaz Intermolecular del Dímero

Una realización es un cristal de MurI de E. faecalis que tiene una interfaz intermolecular que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Gln26, Leu27, Pro28, Asn29, Glu83, Lys86, Ala87, Ala88, Leu89, Pro90, Ile91, Pro92, Val93, Val94, Gly95, Val96, Ile97, Leu98, Pro99, Arg102, Ala103, Lys106, Ala130, Ser133, Lys134, Ala135, Pro136, Ala210, Glu211, Gly214, Glu215, Glu216, Ser217, Met218, Leu219, Asp221, Tyr222, Phe223, Asp224, Ile225, Ala226, His227, Thr228 y Pro229 de SEQ ID NO: 44.

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c. Sitio de Unión Intradominio

Una realización es MurI cristalizada de E. faecalis que tiene una interfaz intradominio del dímero que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Asp11, Ser12, Gly13, Val14, Gly15, Gly16, Leu17, Thr18, Val19, Lys21, Glu22, Lys25, Ala39, Arg40, Cys41, Pro42, Tyr43, Gly44, Pro45, Arg46, Pro47, Val51, Ala73, Cys74, Asn75, Thr76, Ala79, Val80, Val96, Ile97, Glu211, Thr212, G1y214, Glu215, Met218, Leu219, Asp221 y Tyr222 de un primer dominio y los restos de aminoácidos Ile97, Leu98, Pro99, Gly100, A1a101, Arg102, Ala103 , Ala104, Val105 , Lys106, Va1107, Thr118, Leu119, Gly120, Thr121, Lys123, Ser124, Ala125, Ser126, Tyr127, Ile129, Ala130, Ser133, Lys134, Cys145, Pro146, Lys147, Phe148, Val149, Pro150, Ile151, Val152, Glu153, Ser154, Asn155, Ile182, Leu183, Gly184, Cys185, Thr186, His187, Tyr188, Pro189, Leu190, Ile206, Asp207, Ser208, Gly209 y Ala210 de un segundo dominio, en el que los restos de aminoácidos están representados por SEQ ID NO: 44.

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2.E. faecium a. Sitio de Unión al Sustrato

Una realización adicional se refiere a una MurI de E. faecium en la que el sitio de unión al sustrato comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys77 y Cys188 en la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 48. Una realización adicional comprende un sitio de unión al sustrato de MurI de E. faecium en el que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser15, Thr79, Thr121, Thr124, Glu156, Thr189 e His190 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 16. En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. faecium incluye restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys77 y Cys188 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 16. En una realización, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. faecium comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser15, Thr79, Thr121, Thr124, Glu156, Thr189 e His190. En esta realización, el sitio de unión al sustrato forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys77 y Cys188 y al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser15, Thr79, Thx121, Thr124, Glu156, Thr189 e His190, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión al sustrato incluye los restos de aminoácidos Ile13, Asp14, Ser15, Gly16, Va117, Gly18, Gly19, Thr21, Va122, Asp40, Arg43, Cys44, Pro45, Tyr46, Gly47, Phe48, Arg49, Va154, Met72, Ala76, Cys77, Asn78, Thr79, Ala80, Thr81, Ala82, Va199, Ile100, Ile119, Gly120, Thr121, Ile122, Gly123, Thr124, Val125, Tyr130, Phe149, Val152, Ser153, Glu156, Leu186, Gly187, Cys188, Thr189, His190, Tyr191 y Ser211 de SEQ ID NO: 48.

En una realización adicional, el sitio de unión al sustrato de MurI comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys188) del sitio de unión, la TRIADA es Glu156-Thr189-His190 y en el otro lado (Cys77), la TRIADA es Thr79-Thr121-Thr124. Así, en una realización específica, el sitio de unión al sustrato de MurI de E. faecium forma un complejo con L-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys77 y Cys188 e incluye adicionalmente al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser15, Thr79, Thr121, Thr124, Glu156, Thr189 e His190.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de MurI de E. faecium. En un lado (Cys188) del sitio de unión al sustrato, Thr189 está unida por H a His190 e His190 está unida adicionalmente por H a GIu156. En el otro lado del sitio de unión al sustrato (Cys77), Thr79 está unida por H a Thr121 y unida adicionalmente por H a Thr124. Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión al sustrato (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

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b. Interfaz Intermolecular del Dímero

Una realización es MurI cristalizada de E. faecium que tiene una interfaz intermolecular que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Gln29, Leu30, Pro31, Asn32, Glu86, Lys89, Ala90, Ala91, Leu92, Ser93, Ile94, Pro95, Val96, Ile97, Gly98, Val99, Ile100, Leu101, Pro102, Arg105, Lys109, Glu136, Lys137, Val138, Pro139, Glu214, Gly217, Glu218, Ser220, Met221, Leu222, Asp224, Tyr225, Phe226, Asn230, Ser231 y Pro232 de SEQ ID NO: 48.

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c. Sitio de Unión Intradominio

Una realización es MurI cristalizada de E. faecium que tiene una interfaz intradominio del dímero que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Asp14, Ser15, Gly16, Val17, Gly18, Gly19, Leu20, Thr21, Val22, Glu25, Lys28, Gln29, Arg43, Cys44, Pro45, Tyr46, Gly47, Pro48, Arg49, Pro50, Ala51, Val54, Ala76, Cys77, Asn78, Thr79, Ala82, Val83, Val99, Glu214, Thr215, Val216, Gly217, Glu218, Met221, Leu222, Leu249, Phe250, Glu252, Ile253, Asp256 y Trp257 de un primer dominio y los restos de aminoácidos Ile100, Leu101, Pro102, Gly103, Thr104, Arg105, Ala106,Ala107, Val108, Arg109, Lys110, Thr121, Ile122, Gly123, Thr124, Ser127, Gln128, Ala129, Tyr130, Leu132, Ala133, Leu134, Gly136, Lys137, Pro149, Lys150, Phe151, Va1152, Va1155, Glu156, Ser157, Asn158, Ile185, Leu186, Gly187, Cys188, Thr189, His190, Tyr191, Pro192, Leu193, Ile209, Asp210, Ser211, Gly212 y Ala213 de un segundo dominio, en el que los restos de aminoácidos están representados por SEQ ID NO: 48.

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3.S. aureus a. Sitio de Unión al Sustrato

Una realización adicional se refiere a MurI de S. aureus en la que el sitio de unión comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys72 y Cys184 en la secuencia representada como SEQ ID NO: 46. Una realización adicional comprende un sitio de unión de MurI de S. aureus en el que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, G1u151, Thr1 85 e His186 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 14. En una realización, el sitio de unión de MurI de S. aureus forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys72 y Cys184 así como restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys72 y Cys184 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 15. En una realización, el sitio de unión de MurI de S. aureus comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186. En esta realización, el sitio de unión forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys72 y Cys184 y al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, G1u151, Thr185 e His186, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión incluye los restos de aminoácidos Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Cys72, Asn73, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Cys184, Thr185 e His186.

En una realización adicional, el sitio de unión de MurI comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys184) del sitio de unión, la TRIADA es Gly151-Thr185-His186 y en el otro lado (Cys72), la TRIADA es Thr74-Thr116-Thr119. Así, en una realización específica, el sitio de unión de MurI de S. aureus forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys72 y Cys184 y, adicionalmente, comprende al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186.

Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de MurI de S. aureus. En un lado (Cys184) del sitio de unión, Thr185 está unida por H a His186 e His186 está unida adicionalmente por H a GIu151. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr185 está a una distancia de 2,9 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (es decir, glutamato) y a 4,4 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys184, que está a una distancia de 4,1 \ring{A} del nitrógeno de His186.

En el otro lado del sitio de unión (Cys72), Thr74 está unida por H a Thr116 y unida adicionalmente por H a Thr119. El O del hidroxilo de Thr74 está unido por H a uno de los átomos de oxígeno del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 4,3 \ring{A} del átomo de S de Cys72. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo forman un triángulo y que todos están a menos de 3,4 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

Otra realización es MurI cristalizada de S. aureus, que comprende un sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos Ser10, Pro40, Tyr41, Gly42, Cys72, Asn73, Thr74, Thr116; Thr1 19, Glu151, Cys184, Thr185 e His186 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46. Este cristal puede estar además formando un complejo con D-glutamato. Adicionalmente, el sitio de unión del cristal que forma un complejo con D-glutamato puede comprender los restos de aminoácidos: Cys72, Cys184 y al uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser10, Thr74, Thr116, Thr119, Glu151, Thr185 e His186. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp9, Gly11, Val12, Gly13, Gly14, Arg38, Cys39, Pro40, Tyr41, Gly42, Pro43, Arg44, Ala71, Asn73, Ala75, Va194, Gly115, Val147, Gly183 y Tyr187. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Ile8, Thr16, Val17, Tyr32, Asp35, Va149, Ile70, Ser76, Ala77, Lew114, Gly118, Ile120, Tyr125, Pro144, Pro148, Leu182 y Ser207. Los cristales que comprenden los sitios de unión representados por los restos de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 46; o una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 46.

También se definen la localización y geometría de un sitio de unión de la enzima. Se identificaron dos restos de cisteína (Cys) conservados como los restos responsables de la (des)protonación del carbono alfa del sustrato durante la catálisis, lo que es consistente con el mecanismo de dos bases propuesto para la función de la enzima en su papel como una racemasa. Las dos cisteínas del sitio de unión son Cys72 y Cys184, que están a una distancia entre sí de aproximadamente 7,3 Angstroms (\ring{A}) (distancia C\alpha-C\alpha, es decir la distancia entre átomos C\alpha). Otros restos de aminoácidos identificados en la proximidad del sitio de unión incluyen Ser10, Thr74, Thr116; Thr119, Glu151, Thr185 e His186. El sustrato/producto unido, D-glutamato, está localizado entre los dos restos de cisteína conservados. Más detalles del sitio de unión son los siguientes: hacia abajo del eje definido por Glu151 junto con el carbono \gamma y \alpha, las dos cisteínas exhiben un entorno bastante simétrico; cada una tiene un núcleo hidrofóbico respecto al sustrato y un resto de treonina cercano que no está lejos del C-\alpha del sustrato (3,4-4,3 \ring{A}), respectivamente.

El análisis de la estructura del cristal de MurI de S. aureus indica que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 10 \ring{A} del D-glutamato unido: 8-17, 32-44, 49, 52, 71-79, 94-95, 114-120, 122, 125, 184-190 y 207-208. El análisis de la estructura del cristal también muestra que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 4 \ring{A} del D-glutamato unido: 9-10, 39-42, 72-74, 116, 119 y 184-186. Es interesante el hecho de que un sólo resto de aminoácido ácido (Asp9) está presente en la estructura circundante de la Cys72 del sitio de unión, que sirve como un punto de anclaje para el grupo amino del sustrato/producto con una interacción polar (cargada) entre el átomo de nitrógeno del amino del D-glutamato y el átomo de oxígeno delta de Asp9.

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b. Interfaz Intermolecular del Dímero

Una realización es MurI cristalizada de S. aureus que tiene una interfaz intermolecular que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Gln24, Leu25, Pro26, Asn27, Glu81, Glu84, Ser90, Va191, Ile92, Glu96, Pro97, Arg100, Thr101, Met104, Arg131, Ile132, Asn133, Pro134, Arg213, Glu214, Ser216, Ala217, Leu218, Thr220, Phe221, Ala226, Ser227 y Tyr228 de SEQ ID NO: 46.

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c. Sitio de Unión Intradominio

Una realización es MurI cristalizada de S. aureus que tiene una interfaz intradominio del dímero que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos: Asp9, Ser10, Gly11, Val12, Gly13, Gly14, Leu15, Thr16, Val17, Glu20, Cys39, Pro40, Tyr41, Gly42, Pro43, Arg44, Pro45, Gly46, Val49, Ala71, Cys72, Asn73, Thr74, Ala77, Val78, Val94, Ile95, Glu210, Thr211, Ala212, Arg213, Glu214, Ala217, Leu218, His244, Asn247, Ile248, Glu251 y Trp252 de un primer dominio y los restos de aminoácidos Ile95, Glu96, Pro97, Gly98, Ala99, Arg100, Thr101, Ala102, Ile103, Met104, Thr105, Thr116, Glu117, Gly118, Thr119, Ser122, Glu123, Ala124, Tyr125, His128, Arg131, De132, Pro144, Gly145, Phe146, Val147, Val150, Glu151, Gln152, Met153, De181, Leu182, Gly183, Cys184, Thr185,
His186, Tyr187, Pro188, Leu189, Ile205, Ser206, Ser207, Gly208 y Leu209 de un segundo dominio, en el que los restos de aminoácidos están representados por SEQ ID NO: 46.

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C. Bacterias Gram negativas atípicas

Como se describe en los ejemplos siguientes, MurI de H. pylori se ha cristalizado y se han determinado las estructuras de los cristales (estructura tridimensional). Las estructuras determinadas representan la de MurI sola y MurI formando un complejo con un inhibidor o formando un complejo con el sustrato de la enzima, glutamato, en el que el glutamato puede estar en la forma L o D. Los datos de RMN sugieren que MurI tiene elementos estructurales estables en ausencia del sustrato. La cristalización de MurI de H. pylori se describe en el Ejemplo 1 y en las Figuras 4-7.

Los resultados experimentales muestran que la celda unidad de los cristales de MurI de H. pylori puede ser un monómero, un dímero simétrico o no simétrico o un multímero, dependiendo de las condiciones de cristalización y que la forma activa de MurI de bacterias atípicas es un dímero. Cada monómero consiste en dos dominios claros de tipo alfa/beta muy similares que interaccionan en una interfaz molecular.

El dímero de MurI de H. pylori se mantiene unido mediante un núcleo hidrofóbico estable y conservado creado por un haz de cuatro hélices (por ejemplo, dos hélices de cada monómero, restos 143 a 169) que une los dos dominios y, de esta manera, los dos monómeros bastante rígidamente entre sí. Esta organización deja a los otros dos dominios de cada monómero libres para moverse con el fin de proporcionar acceso a los dos sitios activos que están presentes en la interfaz del dímero. Los datos de RMN muestran que la proteína también es un dímero en ausencia de un ligando y que es más flexible en este estado que cuando el ligando está unido. Así, la interfaz molecular de MurI de una bacteria atípica existe en las uniones de dos dominios y funciona como un elemento flexible mediante el cual un cambio en la conformación abre el sitio de unión del sustrato, permitiendo que el sustrato se una a MurI. El grado de movimiento de la interfaz molecular de MurI de H. pylori es menos flexible que el de las bacterias Gram negativas típicas debido al requerimiento estricto de un activador para la unión del sustrato y la actividad de la enzima en las bacterias Gram negativas típicas.

Los restos de aminoácidos que comprenden el sitio de unión de MurI (MurI) están conservados en diecisiete cepas de H. pylori que se han secuenciado.

Una realización se refiere a un sitio de unión de una MurI de H. pylori. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sitio de unión" se refiere a una región (o átomo) específica de MurI que interacciona con otra entidad molecular. En determinadas realizaciones, un sitio de unión puede comprender, o estar definido por, la disposición tridimensional de uno o más restos de aminoácidos en un polipéptido plegado.

En la presente invención, un sustrato puede ser un compuesto tal como L-glutamato o D-glutamato que MurI convierte reversiblemente del enantiómero R al S. Así, un sustrato también puede actuar como un producto. El sustrato puede ser un compuesto natural o artificial.

En la presente invención, un inhibidor puede ser un compuesto que también puede someterse a una reacción catalítica, unirse al sitio de unión al sustrato o a otro sitio en MurI y que compite con la velocidad de recambio del sustrato del glutamato. Los inhibidores de la presente invención pueden ser compuestos tales como L-serina-O-sulfato, D-serina-O-sulfato, D-aspartato, L-aspartato, tartrato, citrato, fosfato, sulfato, aziridino-glutamato, N-hidroxiglutamato ó 3-cloroglutamato. El inhibidor puede ser un compuesto natural o artificial.

Una realización se refiere a un sitio de unión de MurI de H. pylori, en la que el sitio de unión comprende dos restos de cisteína conservados, indicados como Cys70 y Cys181 como se representa por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Una realización adicional comprende un sitio de unión de MurI de H. pylori en la que el sitio de unión comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser8, Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 4. En una realización, el sitio de unión de MurI de H. pylori forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys70 y Cys181 así como los restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A} de los restos Cys70 y Cys181 como se representa por las coordenadas estructurales de la Figura 5. En una realización, el sitio de unión de MurI de H. pylori comprende adicionalmente uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser8, Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150. En esta realización, el sitio de unión forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys70 y Cys181 y al menos uno (es decir, uno o más) de los restos de aminoácidos siguientes: Ser8, Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150, que pueden estar presentes en cualquier combinación. En una realización adicional, el sitio de unión incluye los restos de aminoácidos Asp7, Ser8, Gly9, Val10, Gly11, Gly12, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Ala69, Cys70, Asn71, Thr72, Ala73, Gly115, Thr116, Lys117, Ala118, Thr119, Val146, Ile149, Glu150, Gly180, Cys181, Thr182 e His183.

En una realización adicional, el sitio de unión de MurI comprende dos TRIADAS unidas por hidrógeno, que están cerca de los restos de cisteína conservados del sitio de unión. Específicamente, en un lado (Cys181) del sitio de unión, la TRIADA consiste esencialmente en Thr182-His183-Glu150 y en el otro lado (Cys70), la TRIADA consiste esencialmente en Thr72-Thr116-Thr119. Así, en una realización específica, el sitio de unión de MurI de H. pylori forma un complejo con D-glutamato y comprende los restos de aminoácidos Cys70 y Cys181 y, adicionalmente, comprende al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Ser8. Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150.

Además, las dos TRIADAS implican restos conservados en todas las secuencias de MurI de H. pylori disponibles. Los restos de treonina tienen características interesantes ya que están relacionados con el sitio de unión de MurI de H. pylori. En un lado (Cys181) del sitio de unión, Thr182 está unida por H a His183 e His183 está unida adicionalmente a Glu150. Los tres restos están conservados en todas las proteínas MurI de las cepas de H. pylori ensayadas. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr182 está a una distancia de 3 \ring{A} del nitrógeno (N) del amino del sustrato (es decir, glutamato) y a 4,4 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys181.

En el otro lado del sitio de unión (Cys70), Thr72 está unida por H a Thr116 y unida adicionalmente por H a Thr119. El oxígeno (O) del hidroxilo de Thr72 está a una distancia de 3,4 \ring{A} de uno de los átomos de oxígeno (O) del carboxilato del sustrato y está a una distancia de 4,5 \ring{A} del átomo de azufre (S) de Cys70. Los análisis mostraron que los tres oxígenos del hidroxilo de las treoninas forman un triángulo y que todos están a menos de 3,2 \ring{A} unos de otros.

Las dos TRIADAS pueden jugar papeles importantes alterando el pKa de los dos restos de cisteína del sitio de unión (además del del núcleo hidrofóbico colindante), facilitando la transferencia de protones durante la catálisis o ambos.

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Otra realización es MurI cristalizada, que comprende un sitio de unión que comprende los restos de aminoácidos Asp7, Ser8, Gly9, Val10, Gly11, Gly12, Val37, Pco38, Tyr39, Gly40, Thr41, Ala69, Cys70, Asn71, Thr72, Ala73, Gly115, Thr116, Lys117, Ala118, Thr119, Val146, Ile149, Glu150, Gly180, Cys181, Thr182 e His183 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2. Este cristal puede estar además formando un complejo con D-glutamato. Adicionalmente, el sitio de unión del cristal que forma un complejo con D-glutamato puede comprender los restos de aminoácidos: Cys70, Cys181 y uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser8, Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp7, Gly9, Va110, Gly11, Gly12, Arg36, Va137, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Ala69, Asn71, Ala73, Val92, Glyl15. Va1146, Gly180, Phe184. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Phe6, Asp7, Gly9, Val10, Gly11, Gly12, Ser14, Val15, Tyr30, Asp33, Arg36, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Ile47, Val68, Ala69, Asn71, Ala73, Ser74, Ala75, Va192, Leul14, Glyl15, Lysl17, Alal18, Ilel20, Tyrl25, Ser143, Val146, Prol47, Leu179, Gly180, Phe184 y Ser210.

Los cristales con sitios de unión que comprenden los restos de aminoácidos anteriores comprenden la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 2; o una secuencia de aminoácidos que es al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% homóloga a la secuencia de aminoácidos que está representada por SEQ ID NO: 2.

Los cristales de la presente invención difractan de aproximadamente 1,86 \ring{A} a aproximadamente 3,0 \ring{A} y podrían refinarse hasta aproximadamente 1,5 \ring{A}.

También se definen la localización y geometría de un sitio de unión de la enzima. Se identifican dos restos de cisteína (Cys) conservados como los restos responsables de la (des)protonación del carbono alfa del sustrato (D-glutamato) durante la catálisis, lo que es consistente con el mecanismo de dos bases propuesto para explicar cómo funciona la enzima en su papel como una racemasa. Las dos cisteínas del sitio de unión son Cys70 y Cys181, que están a una distancia entre sí de aproximadamente 7,5 Angstroms (\ring{A}) (distancia C\alpha-C\alpha, es decir la distancia entre átomos C\alpha). Otros restos de aminoácidos identificados en la proximidad del sitio de unión incluyen Ser8, Thr72, Thr182, His183 y Glu150. El sustrato/producto unido, D-glutamato, está localizado entre los dos restos de cisteína conservados. Más detalles del sitio de unión son los siguientes: hacia abajo del eje definido por Glu150 junto con el carbono \gamma y \alpha, las dos cisteínas exhiben un entorno bastante simétrico; cada una tiene un núcleo hidrofóbico detrás, respecto al sustrato y un resto de treonina cercano que no está lejos del C-alfa del sustrato (3,7-4 \ring{A}), respectivamente.

El análisis de la estructura del cristal de MurI de H. pylori indica que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 10 \ring{A} del D-glutamato unido: 6-15, 30-42, 47, 50, 68-76, 210-211, 179-185, 114-120, 122, 92-93, 125, 35, 37, 38 y 42. Obsérvese que los restos 35, 37, 38 y 42 son de la otra molécula del dímero. El análisis de la estructura del cristal también muestra que los restos de aminoácidos siguientes están a una distancia de 4 \ring{A} del D-glutamato unido: 7-8, 37-40, 70-72, 116, 119 y 181-183. Es interesante el hecho de que un sólo resto de aminoácido ácido (Asp7) está presente en la estructura circundante de la Cys70 del sitio de unión, que sirve como un punto de anclaje para el grupo amino del sustrato/producto con una interacción polar (cargada) entre el átomo de nitrógeno del amino del D-glutamato y el átomo de oxígeno delta de Asp7.

También se definieron la localización y geometría del sitio activo de la enzima. Se identificaron dos restos clave como los restos responsables de crear un bolsillo para el inhibidor, interaccionando con el sistema de anillo del núcleo en su nueva posición y fijando la posición del núcleo central. Cuando el inhibidor está unido, C\gamma de Leu186 y C\beta de Trp252 están a una distancia de 8,9 Angstroms (\ring{A}).

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1. Sitio de Unión al Sustrato

Una realización es MurI cristalizada de H. pylori que tiene un sitio de unión al sustrato que comprende los restos de aminoácidos Cys70, Cys181, Ser8, Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2. Adicionalmente, el sitio de unión del cristal que forma un complejo con D-glutamato puede comprender los restos de aminoácidos: Cys70, Cys181 y uno o más de los restos de aminoácidos siguientes: Ser8, Thr72, Thr116, Thr119, Thr182, His183 y Glu150. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Asp7, Gly9, Val10, Gly11, Gly12, Arg36, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Ala69, Asn71, Ala73, Val92, Gly115, Val146, Gly180, Phe184. Una realización adicional es una en la que el sitio de unión comprende adicionalmente al menos uno de los restos de aminoácidos siguientes: Phe6, Asp7, Gly9, Va110, Gly11, Gly12, Ser14, Val15, Tyr30, Asp33, Arg36, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Ile47, Va168, Ala69, Asn71, Ala73, Ser74, Ala75, Va192, Leul14, Gly115, Lys117, Ala118, Ile120, Tyr125, Ser143, Val146, Pro147, Leu179, Gly180, Phe184 y Ser210.

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2. Interfaz Intermolecular del Dímero

Una realización es MurI cristalizada de H. pylori que tiene una interfaz intermolecular del dímero que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos Ser34, Ala35, Arg36, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Asp43, Pro44, Thr46, Phe50, Lys117. Asn121, Ser143, Leu144, Pro147, Leu148, Glu150, Glu151, Ser152, Ile153, Gly157, Leu158, Thyr161, Cys162, Tyr165, Tyr166, Ser239, Gly240, Asp241 y Trp244 de SEQ ID NO: 2.

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3. Sitio de Unión Intradominio

Una realización es MurI cristalizada de H. pylori que tiene una interfaz intradominio que comprende al menos uno de los restos de aminoácidos Asp7, Ser8, Gly9, Val10, Gly11, Gly12, Phe13, Ser14, Val15, Ser18, Lys21, Ala22, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Asp43., Pro44, Ile47, Ala69, Cys70, Asn71, Thr72, Ser74, Ala75, Leu76, Gly91, Val92, Gly211, Asp212, Ala213, Ile214, Val215, Glu216, Tyr217, Leu218; Gln219, Gln220, Lys221, Glu251, Trp252, Leu253, Lys254 y Leu255 de un primer dominio y los restos de aminoácidos Ile93, Glu94, Pro95, Ser96, Ile97, Leu98, Ala99, Ile100, Arg102, Gln103, Thr116, Lys117, Ala118, Thr119, Ser122, Asn123, Ala124, Tyr125, Ala128, Gln131, Gln132, Ser143, Val146, Pro147, Ile149, Glu150, Glu151, Ser152, Ile178, Leu179, Gly180, Cys181, Thr182, His183,
Phe184, Pro185, Leu186, Ile208, His209, Ser210, Gly211 y Asp212 de un segundo dominio de SEQ ID NO: 2.

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4. Sitio de Unión al Inhibidor

En la presente invención, los restos de aminoácidos a los que se une el inhibidor son el sitio de unión al inhibidor.

Una realización es un sitio de unión al inhibidor de MurI de H. pylori, en el que el sitio de unión al inhibidor comprende dos restos clave, indicados como Leu186 y Trp252, en la secuencia de aminoácidos representada como SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, el sitio de unión de la MurI de H. pylori forma un complejo con un inhibidor y comprende los restos de aminoácidos Leu186 y Trp252 así como los restos de aminoácidos a una distancia de 5 \ring{A}, 7 \ring{A}, 8 \ring{A}, 10 \ring{A}, 15 \ring{A} ó 20 \ring{A} de los restos Leu186 y Trp252 de SEQ ID NO: 2.

En una realización de la presente invención, el sitio de unión al inhibidor de MurI de H. pylori forma un complejo con un inhibidor y el sitio de unión al inhibidor comprende los restos de aminoácidos Leu186 y Trp252 y, adicionalmente, comprende al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos Val10, Gly11, Phe13, Ile149, Glu151, Ser152, Trp244 y Gln248 de SEQ ID NO: 2. En una realización adicional, el sitio de unión al inhibidor comprende adicionalmente los restos de aminoácidos de al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos: Gly12, Ser14, Lys17, Glu150, Leu154, Thr182 e His183. En una realización adicional, el sitio de unión al inhibidor comprende adicionalmente los restos de aminoácidos de al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes: restos de aminoácidos: Phe13, Trp244 y Leu253. Alternativamente, proporcionamos un cristal de MurI, que comprende un sitio de unión al inhibidor que comprende los restos de aminoácidos Val10, Gly11, Gly12, Phe13, Ser14, Lys17, Ile149, Glu150, Glu151, Ser152, Thr182, His183, Leu186, Trp244, Gln248, Trp252 y Leu253.

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VI. Inhibidores

Los inhibidores (tales como pequeñas moléculas, proteínas, polipéptidos y péptidos, etc.) pueden utilizarse para unirse a un dominio de unión de MurI o a la zona más cercana e impedir el movimiento de MurI de manera que los sustratos no puedan unirse al sitio de unión al sustrato (SBS). Mediante esto, el bloqueo de MurI impedirá la formación de la pared celular bacteriana de una manera similar a la de los antibióticos. Sin embargo, como MurI es ubicua en todas las bacterias, es de esperar que un inhibidor que bloquea la interfaz molecular será un inhibidor de amplio espectro que puede bloquear un género completo de bacterias. Los inhibidores de la presente invención bloquean parcialmente o totalmente la interfaz molecular de MurI.

Los términos "molécula pequeña" y "compuesto pequeño" tal y como se utilizan en la presente memoria, se pretende que se refieran a la composición que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 2,5 kD. Moléculas pequeñas y compuestos pequeños se utilizan indistintamente en la presente memoria. Las moléculas pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas (que contienen carbono) o inorgánicas. Muchas empresas farmacéuticas tienen bibliotecas extensas de mezclas químicas y/o biológicas que comprenden conjuntos de moléculas pequeñas, frecuentemente extractos fúngicos, bacterianos o de algas, que pueden cribarse para identificar un inhibidor de MurI.

Un ejemplo es MurI cristalizada formando un complejo con un inhibidor (por ejemplo, un agente de unión antibacteriano, fármaco, etc.). Un ejemplo específico es MurI cristalizada de H. pylori formando un complejo con un inhibidor. En una realización adicional, el complejo cristalizado se caracteriza por las coordenadas estructurales representadas en la Figura 7, en la que las estructuras determinadas presentadas representan las de MurI formando un complejo con un inhibidor. En una realización adicional, el inhibidor es una pirimidinadiona, tal como una imidizolil pirimidinadiona, una tiofenil pirimidinadiona, una furanil pirimidinadiona, una pirazolo pirimidinadiona o una pirrolil pirimidinadiona.

En realizaciones adicionales, la pirimidinadiona es el compuesto A, compuesto B, compuesto C, compuesto D, compuesto E, compuesto F, compuesto G, compuesto H, compuesto I, compuesto J, compuesto K, compuesto L, compuesto M, compuesto N, compuesto O, compuesto P, compuesto Q, compuesto R, compuesto S, compuesto T, compuesto U, compuesto V, compuesto W, compuesto X, compuesto Y, compuesto Z, compuesto AA, compuesto AB, compuesto AC, compuesto AD, compuesto AE, compuesto AF, compuesto AG, compuesto AH, compuesto AI, compuesto AJ o compuesto AK. Los complejos cristalizados se caracterizan por los grupos espaciales y las dimensiones de celda representados en la Tabla 5.

TABLA 5

6

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9

10

11

12

Un ejemplo ejemplar de la presente invención es un cristal de MurI de H. pylori formando un complejo con un agente de unión antibacteriano y el producto (sustrato) D-glutamato en el que la MurI es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% homóloga a la secuencia de aminoácidos representada por una cualquiera de SEQ ID NOS: 2-34, 40, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 y 74 o una parte de ésta. En la presente invención, los cristales difractan de aproximadamente 0,8 \ring{A} a aproximadamente 3,5 \ring{A}.

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VII. Métodos Asistidos por Ordenador para Identificar Inhibidores de MurI

También es objeto de la presente invención un método informático para identificar un modificador potencial, particularmente un inhibidor potencial, de la actividad de MurI. El método comprende proporcionar a una aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales relativas de MurI, o un sitio de unión de ésta, en el que el conjunto de coordenadas estructurales relativas se selecciona de un conjunto de coordenadas estructurales relativas de MurI; suministrar a la aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales de un inhibidor candidato de MurI; comparar los dos conjuntos de coordenadas y determinar si el inhibidor candidato puede unirse, o interferir con, la MurI o un sitio de unión de ésta. La unión a, o la interferencia con MurI, o un sitio de unión de ésta, es indicativa de un inhibidor de la actividad de MurI y, por lo tanto, indicativa de un agente antibacteriano. En la mayoría de los casos, la determinación de si se espera que el inhibidor candidato se una, o interfiera con, la MurI, o un sitio de unión de ésta, incluye realizar una operación o comparación de ajuste entre el inhibidor candidato y la MurI, o sitio de unión de ésta, seguido de análisis informáticos del resultado de la comparación con el fin de determinar la asociación entre, o la interferencia con, el inhibidor candidato y MurI o el sitio de unión. Un inhibidor candidato identificado mediante dichos métodos es un fármaco antibacteriano candidato. Opcionalmente, un fármaco candidato puede sintetizarse u obtenerse de otra manera y evaluarse (por ejemplo, in vitro, en células o en un modelo animal apropiado) para ensayar su capacidad de inhibir MurI.

En una realización específica, el método asistido por ordenador para identificar un agente que es un agente de unión de MurI comprende las etapas de (1) suministrar a la aplicación informática de modelado las coordenadas de un agente conocido que se une a una interfaz molecular de MurI y las coordenadas de MurI; (2) cuantificar el ajuste de un agente que se une a la interfaz molecular de MurI a MurI; (3) suministrar a la aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales de un agente que se va a evaluar para determinar si se une a una interfaz molecular de MurI; (4) cuantificar el ajuste del agente ensayado en la interfaz molecular utilizando una función de ajuste; (5) comparar el cálculo del ajuste para el agente conocido con el del agente ensayado; y (6) seleccionar un agente ensayado que tenga un ajuste mejor que, o que se aproxime a, el ajuste del agente conocido.

En una realización específica, el método asistido por ordenador para identificar un agente que es un agente de unión de MurI comprende las etapas de (I) suministrar a la aplicación informática de modelado las coordenadas de un activador y/o un sustrato y una MurI, (2) cuantificar el ajuste de un agente de unión conocido de MurI a MurI, (3) suministrar a la aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales de un agente que se va evaluar para determinar si se une a un dominio de unión de MurI, (4) cuantificar el ajuste del agente ensayado en el sitio de unión utilizando una función de ajuste, (5) comparar el cálculo del ajuste para el agente conocido con el del agente ensayado, y (6) seleccionar un agente ensayado que tiene un ajuste que es mejor que, o se aproxima a, el ajuste del agente conocido.

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Una realización se refiere a un proceso que puede utilizarse para identificar inhibidores de MurI que tiene las etapas de:

(1)

proporcionar una o más estructuras moleculares individualmente o como miembros de cualquier base de datos accesible comercial o patentada adecuada de compuestos químicos;

(2)

seleccionar las estructuras moleculares de la etapa (1) para convertirlas en estructuras tridimensionales y situarlas en un sitio de unión/accesorio de MurI de manera que el resto está obligado a realizar las interacciones con enlaces de hidrógeno apropiadas;

(3)

analizar el resto de la estructura molecular incluida para determinar si contiene cualquier otro resto o restos situados adecuadamente que permitan confirmar si el grupo o grupos se ajustan apropiadamente al sitio de unión o accesorio de MurI;

(4)

analizar las estructuras moleculares seleccionadas en la etapa (3) para determinar si las distancias y las áreas superficiales polares/no polares se han comprobado para determinar si están en los intervalos especificados.

Resultará evidente para un experto en la técnica que no es necesario realizar las etapas anteriores en el orden anterior. Alternativamente, un experto en la técnica reconocerá que los fragmentos del resto o restos descritos anteriormente podrían ser suficientes para inhibir la actividad de MurI si llenan sustancialmente el dominio de unión (sitio) o el sitio accesorio y dichos fragmentos podrían ensayarse in vitro para determinar su actividad inhibidora. Estos fragmentos pueden obtenerse por referencia a los ejemplos genéricos y específicos proporcionados en esta solicitud o investigando otras estructuras que tienen las distancias inter-grupo y las áreas superficiales polares y no polares requeridas.

Los inhibidores de MurI bacterianas también pueden obtenerse modificando estructuras de compuestos para incluir las características farmacóforas descritas anteriormente.

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VIII. Métodos Asistidos por Ordenador para Cribar Inhibidores de MurI

Un experto en la técnica puede utilizar varios métodos para cribar entidades químicas o fragmentos para determinar su capacidad de asociarse con MurI y, más particularmente, con los dominios de unión individuales de MurI. Este proceso puede empezar, por ejemplo, por la inspección visual del sitio de unión al sustrato en la pantalla del ordenador tomando como base las coordenadas de MurI. Después, pueden posicionarse los fragmentos o entidades químicas seleccionados respecto al sitio de unión al sustrato de MurI. El acoplamiento puede conseguirse utilizando programas informáticos tales como Quanta y Sybyl, seguido de minimización de la energía y dinámicas moleculares con campos de fuerza de mecánica molecular estándar, tales como CHARMM y AMBER.

Los programas informáticos especializados también pueden ser útiles en el proceso de seleccionar fragmentos o entidades químicas. Éstos incluyen:

-

GRID [P.J. Goodford, "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28:849-857 (1985)]. GRID está disponible en Oxford University, Oxford, UK.

-

MCSS [A. Miranker y M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method", Proteins: Structure. Function and Genetics, 11:29-34 (1991)]. MCSS está disponible en Molecular Simulations, Burlington, Mass.

-

AUTODOCK [D. S. Goodsell y A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Structure. Function and Genetics, 8:195-202 (1990)]. AUTODOCK está disponible en Scripps Research Institute, La Jolla, Calif.

-

DOCK [I. D. Kuntz et al, "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol., 161:269-288 (1982)]. DOCK está disponible en University of California, San Francisco, Calif.

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Las bases de datos informáticas adicionales disponibles comercialmente para compuestos moleculares pequeños incluyen Cambridge Structural Database y Fine Chemical Database, para una revisión véase Rusinko, A., (Chem, Des. Auto. News 8, 44-47 (1993)).

Una vez que se han seleccionado las entidades químicas o fragmentos adecuados pueden ensamblarse en un único compuesto o inhibidor. El ensamblaje puede realizarse por inspección visual de la relación de los fragmentos entre sí en la imagen tridimensional mostrada en una pantalla de ordenador respecto a las coordenadas de estructura de MurI. A esto le seguirá la construcción manual de un modelo utilizando programas informáticos tales como Quanta o Sybyl.

Los programas útiles para permitir a un experto en la técnica conectar las entidades químicas o fragmentos individuales incluyen:

-

CAVEAT [P.A. Bartlett et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules", en "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., Royal Chem. Soc. 78, p. 182-196 (1989)]. CAVEAT está disponible en University of California, Berkeley, Calif.

-

Sistemas de bases de datos 3D tales como MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, Calif). Este campo se revisa en Y.C. Martin, "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35:2145-2154 (1992).

-

HOOK (disponible en Molecular Simulations, Burlington, Mass.).

En lugar de realizar la construcción de un inhibidor de MurI por etapas, un fragmento o entidad química cada vez como se ha descrito anteriormente, pueden diseñarse compuestos inhibidores u otro tipo de compuestos de unión como un todo o "de novo" utilizando un sitio activo vacío o incluyendo, opcionalmente, alguna(s) parte(s) de un inhibidor o inhibidores conocidos. Estos métodos incluyen:

-

LUDI [H.-J. Bohm, "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Molec. Design 6:61-78 (1992). LUDI está disponible en Biosym Technologies, San Diego, Calif.

-

LEGEND [Y. Nishibata y A. Itai, Tetrahedron, 47:8985 (1991). LEGEND está disponible en Molecular Simulations, Burlington, Mass.

-

LeapFrog (disponible en Tripos Associates, St. Louis, Mo.)

También pueden utilizarse otras técnicas de modelado molecular para el cribado de inhibidores de MurI. Véase, por ejemplo, N.C. Cohen et al, "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem., 33:883-894 (1990). Véase también, M. A. Navia y M. A. Murcko, "'The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2:202-210 (1992). Por ejemplo, cuando se conocen las estructuras de los compuestos ensayados, puede superponerse un modelo del compuesto ensayado sobre el modelo de la estructura de la invención. En la técnica se conocen numerosos métodos y técnicas para llevar a cabo esta etapa. Puede utilizarse cualquiera de éstas. Véase, por ejemplo, P.S. Farmer, Drug Design, Ariens, E. J., ed., Vol. 10, p 119-143 (Academic Press, Nueva York, 1980); Pat. EEUU No. 5.331.573; Pat. EEUU No. 5.500.807; C. Verlinde, Structure, 2:577-587 (1994); e I. D. Kuntz, Science, 257:1078-1082 (1992). Las técnicas de construcción de modelos y los sistemas informáticos de evaluación descritos en la presente memoria no son una limitación de la presente invención.

Puede utilizarse una variedad de técnicas convencionales para llevar a cabo cada una de las evaluaciones anteriores así como las evaluaciones necesarias para cribar un compuesto candidato para determinar su capacidad de inhibir MurI. Generalmente, estas técnicas implican la determinación de la localización y proximidad de unión de un resto dado, el espacio ocupado por un inhibidor unido, la cantidad de superficie de contacto complementaria entre el inhibidor y la proteína, la energía de deformación de la unión de un compuesto dado y alguna estimación de la fuerza del enlace de hidrógeno y/o de las energías electrostáticas de interacción. Los ejemplos de técnicas útiles en las evaluaciones anteriores incluyen: métodos de mecánica cuántica, mecánica molecular, dinámica molecular, muestreo Monte Carlo, búsquedas sistemáticas y distancia geométrica [G.R. Marshall, Ann. Rev. Pharmacal. Toxicol., 1987, 27: 193]. Se han desarrollado programas informáticos específicos para utilizarse en la realización de estos métodos. Los ejemplos de programas diseñados para dichas utilizaciones incluyen:

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Gaussian 92 [M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA. ©1993]

-

AMBER [P.A. Kollman, University of California en San Francisco, ©1993]

-

QUANTA/CHARMM [Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA, ©1992]

Otros sistemas informáticos y paquetes de programas informáticos serán muy conocidos y con una aplicabilidad evidente para los expertos en la técnica.

El concepto del farmacóforo se ha descrito bien en la bibliografía [D. Mayer, C.B. Naylor, I. Motoc, y G.R. Marshall, J. Comp. Aided Molec. Design, 1987, 1:; A. Hopfinger y B.J. Burke, en Concepts and Applications of Molecular Similarity, 1990, M.A. Johnson y G.M. Maggiora, Ed., Wiley]. Las diferentes clases de inhibidores de MurI de esta invención también pueden utilizar diferentes construcciones o estructuras de núcleo aunque todos estos núcleos permitirán que los restos necesarios estén situados en el sitio activo de manera que se produzcan las interacciones específicas necesarias para la unión. Estos compuestos se definen mejor en términos de su capacidad de coincidencia con un farmacóforo, es decir, su identidad estructural respecto a la forma y propiedades del dominio de unión de la MurI.

Las distancias a o desde cualquier grupo dado se calculan desde el centro de la masa de ese grupo. El término "centro de masa" se refiere a un punto en el espacio tridimensional que representa una posición media ponderada de las masas que forman un objeto. Las distancias entre los grupos pueden determinarse fácilmente utilizando cualquier programa informático de modelado y otro programa informático adecuado de estructura química. Además, los programas informáticos de modelado de farmacóforos especializados disponibles comercialmente permiten determinar modelos de farmacóforos a partir de una variedad de información y datos estructurales. Los programas informáticos también pueden utilizarse para buscar en bases de datos de estructuras tridimensionales con el fin de identificar a los compuestos que cumplen los requerimientos específicos del farmacóforo. Los ejemplos de estos programas informáticos incluyen:

-

DISCO [Martin, Y.C., Bures, M.G., Danaher, E.A., DeLazzer, J, Lico, A., Pavlik, P.A., J. Comput. Aided Mol. Design, 1993, 7:83] DISCO está disponible en Tripos Associates, St. Louis, MO.

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CHEM-X, que ha desarrollado y distribuye Chemical Design Ltd., Oxon, UK y Mahwah, NJ.

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APEX-3D, que es parte del programa Insight de modelado molecular, distribuido por Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA.

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CATALYST [Sprague, P.W., Perspectives in Drug Discovery and Design, 1995, 3:1; Müller, K., Ed., ESCOM, Leiden] CATALYST está distribuido por Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA.

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UNITY, que está disponible en Tripos Associates, St. Louis, MO.

Un aceptor típico de un enlace de hidrógeno (HBA) es un oxígeno o nitrógeno, especialmente un oxígeno o nitrógeno que está hibridado en sp^{2} o un oxígeno de un éter. Un donante típico de un enlace de hidrógeno (HBD) es un oxígeno o nitrógeno que lleva un hidrógeno. Durante la unión, las características del farmacóforo de los compuestos ocuparán determinadas regiones o bolsillos del sitio de unión. En esta región, la interacción de los compuestos con el entorno circundante es principalmente de naturaleza hidrofóbica.

Las características de farmacóforo de los presentes compuestos no están limitadas a restos químicos distintos en el mismo compuesto. Un resto químico puede servir como parte de dos farmacóforos.

Así, utilizando estos sistemas informáticos de evaluación, puede examinarse un gran número de compuestos de manera rápida y fácil y evitarse los ensayos bioquímicos largos y caros. Además, se elimina efectivamente la necesidad real de síntesis de muchos compuestos.

Un método de diseño es probar MurI de la invención con moléculas compuestas por una variedad de entidades químicas diferentes para determinar los sitios óptimos de interacción entre los agentes de unión a MurI candidatos y la enzima. Por ejemplo, los datos de difracción de rayos X de alta resolución recogidos a partir de cristales saturados con disolvente permiten la determinación del lugar de unión de cada tipo de molécula. Pueden diseñarse moléculas pequeñas que se unen fuertemente a estos sitios y sintetizarse y ensayarse para determinar su actividad de unión a MurI. (Bugg et al., Scientific American, Diciembre: 92-98 (1993); West et al., TIPS, 16: 67-74 (1995)).

Esto también permite el desarrollo de compuestos que pueden isomerizarse en intermedios de reacción de vida corta en la reacción química de un sustrato u otro compuesto que se une a MurI. Así, es posible llevar a cabo análisis dependientes del tiempo de los cambios estructurales de MurI durante su interacción con otras moléculas. Los intermedios de reacción de MurI también pueden deducirse a partir del producto de la reacción en co-complejo con MurI. Dicha información es útil para diseñar análogos mejorados de inhibidores de MurI conocidos o para diseñar nuevas clases de agentes de unión tomando como base los intermedios de reacción de la enzima MurI y del co-complejo MurI agente de unión.

Otro método es cribar informáticamente bases de datos de moléculas pequeñas para buscar entidades químicas o compuestos que puedan unirse totalmente, o en parte, a un sitio de unión o a un sitio accesorio de MurI. En este cribado, puede juzgarse la calidad del ajuste de dichas entidades o compuestos respecto al sitio de unión por complementariedad de forma [R.L. DesJarlais et al., J. Med. Chem. 31; 722-729 (1988)] o por la energía estimada de la interacción [E. C. Meng et al., J. Comp. Chem., 13;505-524 (1992)].

Así, la estructura de MurI proporcionada en la presente memoria permite el cribado de moléculas conocidas y/o el diseño de nuevas moléculas que se unen a la estructura de MurI, particularmente en el sitio activo, mediante la utilización de sistemas informáticos de evaluación. En un ejemplo, la secuencia de MurI y la estructura de MurI (por ejemplo, las coordenadas atómicas de MurI y/o la coordenada atómica de la cavidad del sitio de unión; ángulos de unión, ángulos diédricos, distancias entre los átomos en la región del sitio de unión, etc. como se proporcionan en la Figura 4 pueden ser datos de entrada. Así, un medio legible por una máquina puede codificarse con datos que representan las coordenadas de la Figura 7 en este proceso. El ordenador genera detalles estructurales del sitio al que debería ajustarse un compuesto de ensayo, permitiendo de esta manera la determinación de los detalles estructurales de complementariedad del compuesto/inhibidor ensayado.

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En una realización, el inhibidor pertenece a la clase de compuestos conocida como pirimidinadionas que se ha visto que inhiben MurI de H. pylori. En realizaciones específicas, la pirimidinadiona es el compuesto A, compuesto B, compuesto C, compuesto D, compuesto E, compuesto F, compuesto G, compuesto H, compuesto I, compuesto J, compuesto K, compuesto L, compuesto M, compuesto N, compuesto O, compuesto P, compuesto Q, compuesto R, compuesto S, compuesto T, compuesto U, compuesto V, compuesto W, compuesto X, compuesto Y, compuesto Z, compuesto AA, compuesto AB, compuesto AC, compuesto AD, compuesto AE, compuesto AF, compuesto AG, compuesto AH, compuesto AI, compuesto AJ o compuesto AK. Los complejos cristalinos se caracterizan por los grupos espaciales y las dimensiones de celda representados en la Tabla 5.

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IX. Métodos Asistidos por Ordenador para Diseñar y Hacer Inhibidores de MurI

En una realización, proporcionamos el diseño asistido por ordenador de agentes de unión de MurI, incluyendo moléculas que se ajustan a o se unen al sitio de unión de MurI, o a una parte de MurI que actúa como un sitio de unión o sitio accesorio. Un agente de unión de la presente invención puede ser un agente de unión antibacteriano, tal como una pirimidinadiona, que inhibe parcialmente o totalmente la actividad enzimática de MurI.

Una realización es un disco en el que se almacenan las coordenadas estructurales de MurI, en la que las coordenadas estructurales pueden utilizarse en una amplia variedad de métodos asistidos por ordenador, tales como los descritos en la presente memoria.

La estructura del cristal de MurI y el sitio de unión de ésta descrito en la presente memoria son útiles para el diseño de agentes, particularmente agentes inhibidores selectivos, que inhiben MurI y, por lo tanto, podrían actuar como agentes antibacterianos. En una realización relacionada, proporcionamos un método para el diseño de fármacos basado en la estructura para un agente que inhibe la actividad de MurI.

Más particularmente, el diseño de compuestos que inhiben MurI según esta invención implica generalmente la consideración de dos factores. En primer lugar, el compuesto debe ser capaz de asociarse físicamente y estructuralmente con MurI a través de interacciones covalentes y/o no covalentes. Las interacciones moleculares no covalentes importantes en la asociación de MurI con su sustrato, o inhibidor, incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals e hidrofóbicas.

En segundo lugar, el compuesto debe ser capaz de asumir una conformación que le permita asociarse con MurI. Aunque determinadas partes del compuesto no participarán directamente en esta asociación con MurI, estas partes pueden influir aún así en la conformación global de la molécula. Esto, a su vez, puede tener un impacto significativo en la potencia. Dichos requerimientos conformacionales incluyen la estructura tridimensional global y la orientación de la entidad química o compuesto respecto a todo o parte de un sitio de unión, por ejemplo, un sitio de unión al sustrato, un sitio de unión al activador, una interfaz intradominio, una interfaz intermolecular del dímero, o un sitio accesorio de éstos, de MurI, o el espacio entre los grupos funcionales de un compuesto que comprende varias entidades químicas que interaccionan directamente con MurI.

El efecto inhibidor potencial de un compuesto químico sobre MurI puede estimarse antes de su síntesis y ensayarse mediante la utilización de técnicas informáticas de modelado. Si la estructura teórica del compuesto dado sugiere una interacción y asociación insuficientes entre él y MurI, se obvian la síntesis y ensayo del compuesto. Sin embargo, si el modelado informático indica una interacción fuerte, la molécula puede sintetizarse y ensayarse para determinar su capacidad de unirse a MurI en un ensayo adecuado. De esta manera, puede evitarse la síntesis de compuestos inactivos.

En otra realización, la invención es un método asistido por ordenador para diseñar un modificador candidato, particularmente un inhibidor candidato, de MurI. En el método, se suministra a una aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales relativas de MurI o un dominio de unión de ésta, y un conjunto de coordenadas estructurales de un inhibidor candidato de MurI. El conjunto de coordenadas estructurales relativas se selecciona de conjuntos de coordenadas estructurales relativas de una MurI como se representa en las Figuras 4-19 y con un conjunto de coordenadas estructurales de un inhibidor candidato de MurI. La interferencia potencial del inhibidor candidato con la actividad de MurI se evalúa y el inhibidor candidato se modifica estructuralmente según se necesite para producir un conjunto de coordenadas estructurales para un inhibidor candidato modificado. El inhibidor candidato modificado se evalúa adicionalmente utilizando técnicas asistidas por ordenador y, opcionalmente, con ensayos in vitro y/o in vivo y se modifica adicionalmente, si es necesario, para producir un inhibidor candidato modificado con propiedades incrementadas (por ejemplo, una actividad inhibidora mayor que el inhibidor candidato de partida).

También permitimos el desarrollo de compuestos que pueden isomerizarse en intermedios de reacción de vida corta en la reacción química de un sustrato u otro compuesto que se une a o con MurI. Esto hace posible llevar a cabo análisis dependientes del tiempo de los cambios estructurales de MurI durante su interacción con otras moléculas. Los intermedios de reacción de MurI también pueden deducirse a partir del producto de la reacción en complejo con MurI. Dicha información es útil para diseñar análogos mejorados de inhibidores de racemasa conocidos o para diseñar nuevas clases de inhibidores tomando como base los intermedios de reacción de la enzima MurI y del co-complejo MurI-inhibidor. Esto proporciona una nueva vía para diseñar inhibidores de MurI con alta especificidad y
estabilidad.

Un compuesto inhibidor u otro compuesto de unión de MurI puede evaluarse y diseñarse informáticamente mediante una serie de etapas en las que se criban entidades químicas o fragmentos y se seleccionan por su capacidad de asociarse con los dominios de unión individuales (bolsillos) u otras zonas de MurI.

En una realización relacionada, se engloba un método para el diseño de fármacos basado en la estructura para un agente que inhibe la actividad de MurI, que comprende generar la estructura de un compuesto utilizando una forma cristalina de MurI que puede utilizarse para estudios de rayos X o de resonancia magnética nuclear (RMN). En una realización, se utilizan las coordenadas de la Figura 4. Alternativamente, las coordenadas que tienen una desviación cuadrática media de las coordenadas de la Figura 4 respecto a los átomos conservados de la estructura central de la secuencia de aminoácidos listada de no más de 1,0 \ring{A}, una desviación cuadrática media de no más de 1,5 \ring{A}, una desviación cuadrática media de no más de 2,0 \ring{A}, o una desviación cuadrática media de no más de 2,5 \ring{A}. En una realización adicional, el método comprende adicionalmente generar una superficie conservada de la forma cristalina de MurI en una pantalla de ordenador, generar la estructura espacial de los compuestos de ensayo en una pantalla de ordenador y determinar si los compuestos que tienen una estructura espacial se ajustan a la superficie conservada. En el ejemplo, la superficie conservada de la forma cristalina de MurI tiene un sitio de unión con una estructura del cristal que se crea por átomos de los restos de aminoácidos siguientes: Asp7, Ser8, Gly9, Val10, Gly11, Gly12, Va137, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Ala69, Cys70, Asn71, Thr72, Ala73, Gly115, Thr116, Lys117, Ala118, Thr119, Va1146, Ile149, Glu150, Gly180, Cys181, Thr182 e His183 de SEQ ID NO: 2.

En otra realización, proporcionamos un método asistido por ordenador para diseñar un modificador candidato, particularmente un inhibidor candidato, de MurI. El método comprende suministrar a una aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales relativas de MurI, o un sitio de unión de ésta, y un conjunto de coordenadas estructurales de un inhibidor candidato de MurI; fabricar informáticamante un agente que se va evaluar para determinar su capacidad de interferir con la MurI o un sitio de unión de ésta, en el que el agente resultante está representado por un conjunto de coordenadas estructurales; y determinar si el agente se espera que se una a, o interfiera con, la MurI, o el sitio de unión, en el que si el agente se espera que se una a, o interfiera con, la MurI o el sitio de unión, se ha diseñado un inhibidor candidato.

En determinadas realizaciones, proporcionamos un método para generar coordenadas atómicas 3-D de un homólogo o variante proteico de MurI utilizando las coordenadas de rayos X de MurI descritas en una cualquiera de las Figuras 4-19, que comprende,

a.

identificar una o más secuencias polipeptídicas homólogas a MurI;

b.

alinear las secuencias con la secuencia de MurI que comprende un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NOS: 2-34, 40, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 y 74;

c.

identificar regiones estructuralmente conservadas y estructuralmente variables entre la o las secuencias homólogas y MurI;

d.

generar coordenadas 3-D para los restos estructuralmente conservados de la o las secuencias homólogas de las de MurI utilizando coordenadas de MurI, tales como las listadas en una cualquiera de las Figuras 4-19;

e.

generar conformaciones para hélices, cadenas, bucles y/o giros en las regiones estructuralmente variables de la o las secuencias homólogas;

f.

fabricar conformaciones de cadena lateral para la o las secuencias homólogas; y

g.

combinar las coordenadas 3-D de las conformaciones de los restos conservados, bucles y cadena lateral para generar coordenadas 3-D totales o parciales para las secuencias homólogas. En determinadas realizaciones el método comprende además refinar y evaluar las coordenadas 3-D totales o parciales para determinar el porcentaje de homología con MurI.

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Una realización se refiere a cualquier método asistido por ordenador que utiliza agentes de unión conocidos de MurI, tales como L-glutamato, D-glutamato, L-serina-O-sulfato y D-serina-O-sulfato, tartrato, citrato, fosfato, sulfato, D-aspartato, L-aspartato, aziridino-glutamato, N-hidroxiglutamato, 3-cloroglutamato, una pirimidinadiona o UDP-MurNAc-Ala, para determinar el ajuste de un agente conocido para compararlo con un inhibidor candidato.

Una realización es un disco en el que se almacenan las coordenadas estructurales de una cualquiera de las Figuras 4-19, en la que las coordenadas estructurales pueden utilizarse en una variedad de métodos asistidos por ordenador, tales como los descritos en la presente memoria.

En una realización específica, el método asistido por ordenador para diseñar un agente que se une a MurI comprende las etapas de (1) suministrar a una aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales relativas de un cristal de MurI; (2) fabricar informáticamente un agente representado por un conjunto de coordenadas estructurales; y (3) determinar si el agente se espera que se una a, o interfiera con MurI, en el que si el agente se espera que se una a MurI, se ha diseñado un agente que se une a MurI. En una realización adicional de la presente invención, el agente de unión se ha diseñado de manera que se une directamente a los restos de aminoácidos que forman un sitio de unión de MurI o una zona circundante de manera que la enzima tiene dificultades conformacionales y el sustrato no puede unirse al sitio de unión al sustrato. La MurI puede ser de una bacteria Gram negativa, una bacteria Gram positiva o una bacteria atípica.

En una realización relacionada, se engloba un método para el diseño de fármacos basado en la estructura de un agente que se une a MurI, que comprende generar la estructura de un compuesto utilizando una forma cristalina de MurI en el que la forma cristalina de la MurI puede utilizarse para estudios de rayos X. En una realización, se utilizan las coordenadas de la Figura 4. Alternativamente, las coordenadas que tienen una desviación cuadrática media de las coordenadas de la Figura 4 respecto a los átomos conservados de la estructura central de la secuencia de aminoácidos listada de no más de 1,0 \ring{A}, una desviación cuadrática media de no más de 1,5 \ring{A}, una desviación cuadrática media de no más de 2,0 \ring{A}, o una desviación cuadrática media de no más de 2,5 \ring{A}. En una realización adicional, el método comprende adicionalmente generar una superficie conservada de la forma cristalina de MurI en una pantalla de ordenador, generar la estructura espacial de los compuestos de ensayo en una pantalla de ordenador y determinar si los compuestos que tienen una estructura espacial se ajustan a la superficie conservada. En una realización adicional, el método comprende adicionalmente generar una superficie conservada de la forma cristalina de MurI en una pantalla de ordenador, generar la estructura espacial de los compuestos de ensayo en una pantalla de ordenador y determinar si los compuestos que tienen una estructura espacial se ajustan a la superficie conservada.

En otro aspecto, la estructura de MurI permite el diseño e identificación de compuestos sintéticos y/o otras moléculas que tienen una complementariedad de forma con la conformación de un sitio de unión de MurI descrita en la presente memoria. Utilizando sistemas informáticos conocidos, pueden proporcionarse las coordenadas de la estructura de MurI de la invención en una forma legible por una máquina, diseñarse y/o cribarse los compuestos de ensayo y superponerse sus conformaciones en la estructura de la MurI de la invención. Posteriormente, pueden cribarse los candidatos adecuados identificados como se ha descrito anteriormente para determinar la unión a MurI, bioactividad y estabilidad.

En otra realización, proporcionamos un método para hacer un modificador candidato de MurI mediante un método químico, enzimático u otro método sintético. Los modificadores candidatos identificados o diseñados como se describe en la presente memoria pueden hacerse utilizando técnicas conocidas para los expertos en la técnica.

En otro aspecto, la estructura de MurI permite el diseño e identificación de compuestos sintéticos y/o otras moléculas que tienen una complementariedad de forma con la conformación del sitio de unión de MurI de la invención. Utilizando sistemas informáticos conocidos, pueden proporcionarse las coordenadas de la estructura de MurI de la invención en una forma legible por una máquina, diseñarse y/o cribarse los compuestos de ensayo y superponerse sus conformaciones en la estructura de la MurI. Posteriormente, pueden cribarse los candidatos adecuados identificados como se ha descrito anteriormente para determinar la bioactividad inhibidora de MurI deseada y la estabilidad.

Una vez identificados y cribados para determinar su actividad biológica, estos inhibidores pueden utilizarse terapéuticamente o profilácticamente para bloquear la actividad de MurI y para tratar infecciones bacterianas en un sujeto mamífero.

Una vez identificado por técnicas de modelado, el inhibidor puede ensayarse para determinar su bioactividad utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, la estructura de MurI puede utilizarse en ensayos de unión utilizando formatos convencionales para cribar inhibidores. Los ensayos adecuados que pueden utilizarse incluyen, pero no están limitados a, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) o un ensayo de fluorescencia apantallada. Pueden utilizarse otros formatos de ensayo; estos formatos de ensayo no son una limitación de la presente invención.

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X. MAPS/Reemplazamiento Molecular/Dyndom

MurI puede cristalizar en más de una forma. Por lo tanto, las coordenadas estructurales de MurI como se describen en la presente memoria son particularmente útiles para resolver la estructura de formas adicionales de cristales de MurI o dominios de unión de formas adicionales de cristales de MurI. Hay partes de MurI que funcionan como el sitio activo (sitio de unión al sustrato). También pueden utilizarse para resolver la estructura de mutantes de MurI, complejos de MurI o la forma cristalina de otras proteínas con una homología de secuencia de aminoácidos u homología estructural significativa, con un dominio funcional de MurI. En una realización, la homología significativa en la secuencia de aminoácidos comprende al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% de homología con cualquier dominio funcional de MurI.

Un método que puede utilizarse para este propósito es el reemplazamiento molecular. En este método, la estructura del cristal desconocida, ya sea otra forma de cristal de MurI, una MurI, o un co-complejo de MurI o el cristal de alguna otra proteína con una homología significativa en la secuencia de aminoácidos respecto a cualquier dominio funcional de MurI, puede determinarse utilizando las coordenadas de la estructura de MurI de esta invención. Este método proporcionará una forma estructural precisa para el cristal desconocido más rápidamente y eficazmente que si se intenta determinar dicha información ab initio.

MOLREP es un programa integrado de reemplazamiento molecular que encuentra soluciones de reemplazamiento molecular utilizando un procedimiento de dos etapas: (1) función de rotación (RF) busca la orientación del modelo y (2) función de traslación (TF) y función de compactibilidad (PF) buscan la posición del modelo orientado. La función de traslación evalúa varios picos de la función de rotación calculando un coeficiente de correlación para cada pico y clasificando el resultado. La función de compactibilidad es importante para eliminar soluciones incorrectas que corresponden a simetría superpuesta. MOLREP puede ajustarse para buscar numerosas moléculas por unidad asimétrica y se detendrá automáticamente cuando no pueda conseguirse una mejora adicional de la solución mediante la adición de moléculas adicionales. Los programas informáticos para el reemplazamiento molecular son parte de un paquete de programas CCP4 (Computer Computational Project, Número 4, 1994; "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50: 760-763).

DynDom es un programa completamente automatizado que determina los dominios proteicos, ejes de bisagras y restos de aminoácidos implicados en el movimiento de la enzima. DynDom puede utilizarse con dos conformaciones de la misma proteína. Las estructuras pueden ser dos estructuras de rayos X o estructuras generadas utilizando técnicas de simulación tales como dinámica molecular o análisis en modo normal. La aplicación de DynDom proporciona una visión del cambio conformacional y visualiza el movimiento de dominios como cuerpos cuasi rígidos. DynDom se utilizó para mostrar que MurI experimenta un cambio conformacional que corresponde con dos dominios rígidos que se mueven uno respecto al otro mediante un movimiento de interfaz molecular. Las dos conformaciones observadas en la estructura de E. faecalis proporcionó el caso más convincente como se observa en la Figura 3. DynDom ilustró las diferentes conformaciones observadas con D-Glutamato frente a L-Glutamato unido a la misma proteína y sugirió que existe un movimiento de dominio asociado con el ciclo catalítico de la enzima. El programa DynDom es parte de un paquete de programas CCP4 (Computer Computational Project, Número 4, 1994; "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50: 760-763).

MAPS (Alineamiento Múltiple de Estructuras Proteicas) es un programa automatizado para comparaciones de múltiples estructuras de proteínas basado en las estructuras terciarias de las coordenadas del cristal. Cuando están disponibles proteínas homólogas con elementos estructurales comunes, el programa MAPS puede superponer automáticamente los modelos tridimensionales, detectar qué restos son equivalentes estructuralmente entre todas las estructuras y proporcionar el alineamiento resto-resto. Los restos equivalentes estructuralmente se definen por el programa según la posición aproximada de los átomos de la cadena principal y de la cadena lateral de todas las proteínas. Así, en los casos en los que están presentes diferentes secuencias primarias de aminoácidos, el programa selecciona las estructuras terciarias comunes de las proteínas. (Véase la Figura 2, por ejemplo). Tomando como base la similitud de la estructura, el programa calcula una valoración de la diversidad de estructura que puede utilizarse para construir un árbol filogenético.

En otro aspecto, proporcionamos un método que implica el reemplazamiento molecular para obtener información estructural de una molécula o complejo molecular con una estructura desconocida utilizando los programas informáticos descritos anteriormente y las coordenadas descritas en la presente memoria.

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XI. Métodos de Ensayo A.In vitro

Otro aspecto implica un método para identificar inhibidores de MurI caracterizado por la estructura del cristal y los dominios de unión nuevos descritos en la presente memoria y los inhibidores en sí mismos. La estructura del cristal de MurI nueva de la invención permite la identificación de inhibidores de la actividad de MurI. Dichos inhibidores pueden unirse a todo, o a un dominio de unión, de MurI, y pueden ser inhibidores competitivos o no competitivos. Una vez identificados y cribados para determinar su actividad biológica, estos inhibidores pueden utilizarse terapéuticamente o profilácticamente para bloquear el crecimiento y dispersión bacterianos.

Un método de diseño es probar la MurI de la invención con moléculas compuestas por una variedad de entidades químicas diferentes para determinar los sitios óptimos de interacción entre los inhibidores de MurI candidatos y la enzima. Por ejemplo, los datos recogidos de difracción de rayos X de alta resolución y de RMN de cristales saturados con disolvente hace posible la determinación de donde reside cada tipo de molécula de disolvente en la proteína. Pueden diseñarse moléculas pequeñas que se unen fuertemente a estos sitios y sintetizarse y ensayarse para determinar su actividad inhibidora de MurI.

Una realización de la presente invención se refiere a un método para identificar un agente que inhibe MurI que comprende combinar la bacteria con un agente de ensayo en condiciones adecuadas para la unión de un agente al sitio activo y determinar si el agente de ensayo inhibe la actividad de MurI, en el que, si se produce la inhibición, el agente de ensayo es un inhibidor de la actividad de MurI.

La presente invención engloba un ensayo in vitro para identificar un inhibidor de MurI. El ensayo puede ser un ensayo de actividad enzimática único o doble como se describe con detalle en los Ejemplos o un sistema de ensayo in vitro equivalente en el que se añaden moléculas pequeñas, proteínas o fragmentos de éstas a la bacteria antes de la adición del activador (en el caso de bacterias Gram negativas) y/o del sustrato. Cuando se inhibe el crecimiento de la pared celular bacteriana comparado con el control (que no tiene inhibidor) se ha identificado un inhibidor de MurI.

Una realización incluye un método para ensayar inhibidores que se unen al dominio de unión identificado o producido por los modelos asistidos por ordenador en un ensayo in vitro que comprende cultivar bacterias.

En una realización representativa, se ensayó MurI de H. pylori para determinar la inactivación con un inhibidor suicida, L-serina-O sulfato, que se sabe que inhibe MurI de E. coli. La enzima se incubó en presencia de 20 mM de L-serina-O sulfato y, a diferentes tiempos, se tomaron alicuotas para determinar la actividad residual. La velocidad inicial de la proteína MurI purificada recombinante de H. pylori se determinó en el ensayo único de acoplamiento de enzima después de la incubación con el inhibidor L-serina-O-sulfato (LSOS). El control se incubó de una manera idéntica pero sin LSOS.

En otra realización representativa, el ensayo tiene las etapas de cultivar una colección control de bacterias Gram negativas, tal como E. coli, en el líquido o agar sólido apropiado en presencia de activador y sustrato, cultivar una colección de ensayo de las bacterias Gram negativas en el líquido o agar sólido apropiado en presencia de activador, sustrato e inhibidor y comparar el crecimiento de las bacterias en el cultivo de ensayo respecto al cultivo control en el que, si el crecimiento está inhibido, se ha identificado un inhibidor de MurI.

En una realización ejemplar, el ensayo tiene las etapas de cultivar una colección control de una bacteria Gram positiva o atípica, tal como S. aureus o H. pylori, cultivar una colección control de bacterias en el líquido o agar sólido apropiado en presencia de sustrato, cultivar una colección de ensayo de las bacterias en el líquido o agar sólido apropiado en presencia de sustrato e inhibidor y comparar el crecimiento de las bacterias en el cultivo de ensayo respecto
al cultivo control en el que, si el crecimiento está inhibido, se ha identificado un inhibidor de la región bisagra de MurI.

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B.In vivo

Una realización se refiere a un análisis in vivo de la actividad antibacteriana de los agentes de unión que comprende infectar a un sujeto mamífero (preferiblemente un primate no humano o un roedor) con una cantidad de bacterias relevante clínicamente suficiente para producir una infección en el sujeto. Después de que las bacterias hayan producido una infección, el inhibidor (por ejemplo, agente de unión antibacteriano) se administrará al sujeto. A un grupo control distinto se le administrará placebo. A diferentes tiempos pueden recogerse tejidos, sangre y productos sanguíneos para determinar el curso de la infección y aquellos inhibidores que reducen (parcialmente o totalmente) la magnitud de la infección se determinan como inhibidores eficaces de las infecciones.

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XII. Composiciones Farmacéuticas/Preparaciones/Envases

Los inhibidores de la invención pueden formularse como una composición farmacéutica para la administración a sujetos mamíferos como un terapéutico de amplio espectro para las infecciones bacterianas. En una realización preferida, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa u oral.

El inhibidor puede estar presente en una composición, tal como una composición farmacéutica, que también comprende, por ejemplo, un vehículo aceptable farmacéuticamente, un agente saporífero o adyuvante. Los vehículos aceptables farmacéuticamente y sus formulaciones son muy conocidos y se describen de manera general, por ejemplo, en Remington's pharmaceutical Sciences (18a Edición, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). Un vehículo aceptable farmacéuticamente ejemplar es disolución salina fisiológica. Otros ejemplos aceptables de vehículos aceptables farmacéuticamente incluyen, pero no están limitados a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tamponadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos saturados vegetales, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógenofosfato de disodio, hidrógenofosfato de potasio, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilen glicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque polietilen-polioxipropileno, grasa de lana y sistemas de administración de fármacos auto emulsionantes (SEDDS) tales como \alpha-tocoferol, succinato de polietilenglicol 1000 u otras matrices poliméricas de administración similares. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse a un paciente junto con un compuesto de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas y métodos serán útiles de manera general para controlar, tratar o reducir el avance, gravedad o efectos de infecciones bacterianas in vivo. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender dos o más agentes antibacterianos como se describe en la presente memoria.

Los compuestos/composiciones también son útiles como reactivos comerciales que se unen eficazmente a MurI. Como reactivos comerciales, los compuestos y sus derivados, pueden utilizarse para bloquear la actividad de MurI en ensayos bioquímicos o celulares para MurI bacteriana o sus homólogos o pueden derivatizarse para unirse a una resina estable como sustrato unido para aplicaciones de cromatografía de afinidad. Éstas y otras utilizaciones que caracterizan a los inhibidores comerciales de MurI serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los compuestos/composiciones pueden utilizarse de una manera convencional para controlar niveles de infección bacteriana in vivo y para tratar enfermedades o reducir el avance o gravedad de los efectos que están mediados por bacterias. Dichos métodos de tratamiento, sus niveles de dosificación, modos de administración y requerimientos pueden seleccionarse por un experto en la técnica a partir de métodos y técnicas disponibles.

Alternativamente, los compuestos/composiciones pueden utilizarse en composiciones y métodos para tratar o proteger a individuos frente a infecciones o enfermedades bacterianas durante periodos de tiempo amplios. Los compuestos pueden utilizarse en dichas composiciones bien solos o junto con otros compuestos de esta invención de una manera consistente con la utilización convencional de inhibidores de enzimas en las composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, un compuesto puede combinarse con adyuvantes aceptables farmacéuticamente que se utilizan convencionalmente en las vacunas y administrarse en cantidades eficaces profilácticamente para proteger a individuos durante un periodo de tiempo amplio frente a infecciones o enfermedades bacterianas.

Una realización es un envase farmacéutico que comprende una composición farmacéutica de un inhibidor de MurI que se une a la región bisagra e instrucciones para su utilización en el tratamiento de una infección bacteriana.

Una realización es una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de MurI para el tratamiento de infecciones bacterianas.

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XIII. Métodos para Tratar Infecciones Bacterianas

Una realización comprende un método para tratar a un sujeto que tiene una infección bacteriana que comprende administrar una composición farmacéutica del inhibidor de MurI. En una realización, la infección bacteriana está causada por una bacteria Gram negativa, Gram positiva o atípica. Esta estructura es útil evidentemente en el diseño basado en la estructura de los inhibidores de MurI, que pueden utilizarse como agentes terapéuticos frente a infecciones bacterianas. En una realización, la infección bacteriana está causada por una infección por Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Deinococcus radiodurans, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Shewanella putrefaciens, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Lactobacillus fermentum, Pediococcus, pentosacceus, Enterococcus fecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Bacillus spaericus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Bacillus anthracis o Bacillus subtilus.

Las composiciones farmacéuticas también incluyen composiciones (formulaciones) que pueden administrarse por vía oral, parenteral, por un pulverizador para inhalación, tópica, mediante una disolución oftálmica o pomada, rectal, intranasal, bucal, vaginal, mediante un reservorio implantado, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa al sujeto. Un paciente es preferiblemente un mamífero. En una realización adicional, el mamífero es un ser humano, un primate, un perro, un caballo, una vaca, una oveja, una rata, un ratón, un cerdo, etc.

En una realización, el inhibidor de MurI se administra continuamente al sujeto. En una realización, el inhibidor de MurI se administra al sujeto cada 1-24 horas. En una realización, la administración continúa hasta que se ha erradicado la infección bacteriana.

Los niveles de dosificación serán evidentes para el experto en la técnica y se determinarán tomando como base varios factores, tales como el peso corporal del individuo, estado general de salud, edad, la actividad del compuesto específico utilizado, sexo, dieta, momento de la administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad y curso de la enfermedad y la disposición del paciente a la enfermedad y el criterio del médico responsable del tratamiento. La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con los materiales vehiculares para producir una única dosificación variará dependiendo del anfitrión tratado y del modo de administración particular. Una preparación del compuesto típica contendrá de aproximadamente 5% a aproximadamente 95% del compuesto activo (p/p). Preferiblemente, dichas preparaciones contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% del compuesto activo.

Después de la mejora de la condición de un paciente, puede administrarse, si es necesario, una dosis de mantenimiento de un compuesto o composición de la presente invención; y puede modificarse la dosificación, la forma de dosificación o la frecuencia de administración o una combinación de éstas. En algunos casos, el sujeto puede requerir un tratamiento intermitente a largo plazo después de la recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

Por "tratar" a un paciente que sufre una infección bacteriana se quiere decir que los síntomas del paciente se alivian parcialmente o totalmente o permanecen estáticos después del tratamiento según la invención. Un paciente que ha sido tratado presentará un alivio parcial o total de los síntomas y/o de la carga bacteriana. El término "tratamiento" se pretende que englobe profilaxis, terapia y cura.

Un "paciente" o "sujeto" que se va a tratar por el método objeto puede significar un animal humano o no humano. El mamífero puede ser un primate (por ejemplo, un ser humano, un chimpancé, un gorila, un mono, etc.), un animal doméstico (por ejemplo, un perro, un caballo, un gato, un cerdo, una vaca) o un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata), etc.

La expresión "cantidad eficaz terapéuticamente" tal y como se utiliza en la presente memoria significa la cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención, que es eficaz para producir un efecto terapéutico deseado mediante el bloqueo de la síntesis de la pared celular de las células bacterianas en un paciente.

Cada una de las composiciones de la presente invención puede utilizarse como una composición cuando se combina con un vehículo o excipiente aceptable farmacéuticamente. "Vehículo" y "excipiente" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

La expresión "aceptable farmacéuticamente" se utiliza en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del criterio médico, son adecuados para utilizarse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin provocar toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otros problemas o complicaciones, en proporción a una relación beneficio/riesgo razonable. "Vehículo aceptable farmacéuticamente" se define en la presente memoria como un vehículo que es aceptable fisiológicamente para el receptor y que no interfiere con, o destruye, las propiedades terapéuticas del inhibidor de MurI con el que se administra.

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XIV. Métodos de Realización Industrial

Una realización engloba un método para realizar una actividad industrial farmacéutica que tiene las etapas de aislar uno o más inhibidores de MurI que se unen a MurI expresada en bacterias; generar una composición que comprende un inhibidor de MurI, composición que tiene una concentración inhibidora mínima (MIC) de 8 \mug/mL o menos; realizar un perfil terapéutico de la composición, para la eficacia y toxicidad en animales; preparar una etiqueta del envase que describa la composición para el tratamiento de infecciones bacterianas; y comercializar la composición para el tratamiento de infecciones bacterianas.

Una realización engloba un método para realizar una actividad industrial en ciencias de la vida que tiene las etapas de aislar uno o más inhibidores de MurI que se unen a MurI expresada en bacterias; generar una composición que comprende un inhibidor de MurI, composición que tiene una concentración inhibidora mínima (MIC) de 8 \mug/mL o menos; conceder, conjuntamente el desarrollo o la comercialización, a una tercera parte, los derechos para comercializar la composición.

Una realización engloba un método para realizar una actividad industrial farmacéutica que tiene las etapas de (a) aislar uno o más inhibidores de MurI que se unen a MurI expresada en bacterias con una K_{d} de 1 \muM o menos; (b) generar una composición que comprende dichos inhibidores de MurI, composición que tiene una concentración inhibidora mínima (MIC) de 8 \mug/mL o menos; (c) realizar un perfil terapéutico de la composición para la eficacia y toxicidad en animales; (d) preparar una etiqueta del envase que describa la utilización de la composición para la terapia antibacteriana; y (e) comercializar la composición para utilizarse como un agente antibacteriano.

Una realización engloba un método para realizar una actividad industrial en ciencias de la vida que tiene las etapas de (a) aislar uno o más inhibidores de MurI que se unen a MurI expresada en bacterias con una K_{d} de 1 \muM o menos; (b) generar una composición que comprende dichos inhibidores de MurI, composición que tiene una concentración inhibidora mínima (MIC) de 8 \mug/mL o menos; y (c) conceder, conjuntamente el desarrollo o la comercialización, a una tercera parte, los derechos para comercializar la composición.

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XV. Equivalentes

Será evidente para los expertos en la técnica que pueden hacerse varias modificaciones y variaciones en la presente invención sin alejarse del alcance de la invención. Otras realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación y de la práctica de la invención descrita en la presente memoria. Se pretende que la especificación y ejemplos se consideren sólo como ejemplares indicándose el verdadero alcance por las reivindicaciones.

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Ejemplos

La presente invención se ilustra con los ejemplos siguientes que no se deben considerar limitativos de ninguna forma. Los contenidos de todas las referencias citadas (incluyendo referencias bibliográficas, patentes expedidas, solicitudes de patentes publicadas citadas a lo largo de esta solicitud) se incorporan por la presente expresamente por referencia.

La práctica de la presente invención utilizará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología y ADN recombinante, cristalografía de rayos X y modelado molecular que están al alcance del experto en la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de EEUU No: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models (Gale Rhodes, 2a Ed. San Diego: Academic Press, 2000).

Ejemplo 1 Clonación, Cristalización y Caracterización de MurI de H. pylori A. Clonación, purificación y caracterización del gen que codifica la MurI de H. pylori

La clonación y purificación de MurI se han descrito previamente en las Solicitudes Provisionales de EEUU 60/435.087 y 60/435.527.

El genoma de H. pylori contiene un marco de lectura abierto (ORF) de 255 aminoácidos que se ha visto que tiene homología con el gen de MurI de Staphylococcus haemolyticus (dga) (Número de registro NCBI U12405) y con el gen murI de E. coli que codifica la actividad MurI en ese organismo. Para evaluar si este ORF de H. pylori codifica una proteína con actividad MurI, se aisló el gen mediante clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se sobreexpresó en E. coli y se purificó la proteína hasta una homogeneidad aparente. Se desarrolló un ensayo sencillo para detectar la actividad MurI que resulta en la isomerización de ácido D-glutámico en ácido L-glutámico para facilitar la purificación y para utilizarse en el futuro como un cribado de fármacos de alto rendimiento. Mediante estudios de disrupción génica se ha visto que el ORF de H. pylori es esencial para la viabilidad de las células de H. pylori en cultivos de laboratorio.

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Clonación del gen murI de H. pylori que codifica MurI

Se aisló una secuencia de ADN de 765 pares de bases que codifica el gen murI de H. pylori mediante clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AAATAGTCATATGAAAATAGGCGTTTTTG-3' (SEQ ID NO: 35)) que codifica un sitio de restricción NdeI y el extremo 5' del gen murI y un cebador (5'-AGAATTCTATTACAATTTGAGCCATTCT-3' (SEQ ID NO: 36)) que codifica un sitio de restricción EcoRI y el extremo 3' del gen murI para amplificar el gen murI de H. pylori utilizando ADN genómico preparado a partir de la cepa J99 de H. pylori como ADN molde para las reacciones de amplificación por PCR. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., editores, 1994). Para amplificar una secuencia de ADN que contiene el gen murI, se introdujo ADN genómico (25 nanogramos) en cada uno de los dos viales de reacción que contienen 1,0 micromol de cada cebador oligonucleotídico sintético, 2,0 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y 1,25 unidades de polimerasas de ADN estables en calor (Amplitaq, Roche Molecular Systems. Inc., Branchburg, NJ, EEUU) en un volumen final de 50 microlitros. Se utilizaron las condiciones de ciclo térmico siguientes para obtener productos de ADN amplificados para el gen murI utilizando un termociclador Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System
9600:

Condiciones para la amplificación de murI de H. pylori (SEQ ID NO: 1):

Desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos;

2 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 30ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 15 segundos;

23 ciclos a 94ºC durante 15 segundos, 53ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 15 segundos.

Las reacciones se terminaron a 72ºC durante 20 minutos.

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Después de terminar las reacciones del ciclo térmico, el ADN amplificado se lavó y se purificó utilizando el kit de purificación Qiaquick Spin PCR (Qiagen, Gaithersburg, MD EEUU). La muestra de ADN amplificada se sometió a digestión con las endonucleasas de restricción NdeI y EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA EEUU) (Current Protocols in Molecular Biology, Ibid). Las muestras de ADN de cada una de las dos mezclas de reacción se juntaron y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% SeaPlaque (FMC BioProducts, Rockland, ME, EEUU). El ADN se visualizó exponiéndolo a bromuro de etidio e irradiación UV cercana. El ADN amplificado que codifica el gen murI de H. pylori se aisló a partir de los cortes del gel de agarosa y se purificó utilizando el protocolo del Bio 101 GeneClean Kit (Bio 101 Vista, CA EEUU).

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Clonación de secuencias de ADN de H. pylori en el vector de expresión procariota pET-23

El vector pET-23b puede propagarse en cualquier cepa K-12 de E. coli, por ejemplo, HMS174, HB101, JM109, DH5\alpha, etc., para el propósito de clonar o de preparar plásmidos. Los anfitriones para la expresión incluyen cepas de E. coli que contienen una copia cromosómica del gen para la 17 ARNpolimerasa. Estos anfitriones son lisógenos del bacteriófago DE3, un derivado lambda que posee el gen lacI, el promotor lacUV5 y el gen para la T7 ARNpolimerasa. La T7 ARN polimerasa se induce mediante la adición de isopropil-B-D-tiogalactosidasa (IPTG) y la T7 ARN polimerasa transcribe cualquier plásmido diana tal como pFT-28b, que posee su gen de interés. Las cepas utilizadas en nuestro laboratorio incluyen: BL21(DE3) (Studier, F,W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., y Dubendorff, LW. Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990). El vector pET-23b (Novagen, Inc., Madison, WI, EEUU) se preparó para la clonación mediante digestión con NdeI y EcoRI (Current Protocols in Molecular Biology, ibid). Después de la digestión, el fragmento de ADN amplificado y purificado mediante gel de agarosa que posee el gen murI se clonó (Current Protocols in Molecular Biology, ibid) en el vector de expresión pET-23b previamente digerido. Los productos de la ligación se utilizaron para transformar la cepa BL21(DE3) de E. coli.

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Transformación de bacterias competentes con plásmidos recombinantes

Se transformaron bacterias competentes, cepa BL21 o cepa BL21(DE3) de E. coli, con el plásmido de expresión recombinante pET23-murI que posee la secuencia clonada de H. pylori según métodos estándar (Current Protocols in Molecular, ibid). Brevemente, se mezcló 1 microlitro de la reacción de ligación con 50 microlitros de células electrocompetentes y se sometió a un pulso de alto voltaje, después del cual, las muestras se incubaron en 0,45 mililitros de medio SOC (0,5% de extracto de levadura, 2,0% de triptona, 10 mM de NaCl, 2,5 m de KCl, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de MgSO_{4} y 20 mM de glucosa) a 37ºC con agitación durante 1 hora. Las muestras se distribuyeron en placas de agar LB que contienen 100 microgramos/ml de ampicilina para que crezcan toda la noche. Las colonias transformadas de BL21 se seleccionaron y se analizaron para evaluar los insertos clonados como se describe a continuación. Identificación de plásmidos de expresión recombinantes pET que poseen secuencias de H. pylori:

Se analizaron clones individuales de BL2I transformados con pET-23-murI recombinante mediante amplificación por PCR de los insertos clonados utilizando los mismos cebadores directos e inversos específicos para cada secuencia de H. pylori que se utilizaron en las reacciones originales de clonación por amplificación por PCR. La amplificación exitosa verificó la integración de las secuencias de H. pylori en el vector de expresión (Current Protocols in Molecular Biology, ibid).

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Aislamiento y Preparación de ADN plasmídico de los transformantes BL21

Las colonias que poseen vectores pET-23-murI se seleccionaron y se incubaron en 5 ml de medio LB más 100 microgramos/ml de ampicilina toda la noche. Al día siguiente, el ADN plasmídico se aisló y se purificó utilizando el protocolo de purificación de plásmidos de Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EEUU).

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Clonación y expresión del operón groE de E. coli

Se ha demostrado que la co-expresión del gen murI de E. coli con los genes del operón groE de E. coli reduce la formación de cuerpos de inclusión insolubles que contienen MurI recombinante (Ashiuchi, M., Yoshimura, 1., Kitamura, T., Kawata, Y., Nagai, J., Gorlatov, S., Esaki, N. y Soda, K. 1995, J. Biochem. 117: 495-498). El operón groE codifica dos proteínas, GroES (97 aminoácidos) y GroEL (548 aminoácidos), que son chaperonas moleculares. Las chaperonas moleculares cooperan para facilitar el plegamiento de nuevas cadenas polipeptídicas (F. Ulrich Hartl, 1996, Nature Londres 381: 571-580).

La secuencia de ADN de 2.210 pb que codifica el operón groE de E. coli (Número de registro NCBI X07850) se aisló por clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó un cebador oligonucleotídico sintético (5'-GCGAATTCGATCAGAATTTTTTTTCT (SEQ ID NO: 37)) que codifica un sitio de restricción EcoRI y el extremo 5' del operón groE que contiene la región promotora endógena del operón groE y un cebador (5'-ATAAGTACTTGTGAATCTTATACTAG-3' (SEQ ID NO: 38)) que codifica un sitio de restricción ScaI y el extremo 3' del gen groEL contenido en el operón groE para amplificar el operón groE de E. coli utilizando ADN genómico preparado a partir de la cepa MG1655 de E. coli como el ADN molde para las reacciones de amplificación por PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Ibid). Para amplificar, se introdujo una secuencia de ADN que contiene el ADN genómico del operón groE de E. coli (12,5 nanogramos) en cada uno de los dos viales de reacción que contienen 0,5 micromoles de cada cebador oligonucleotídico sintético, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y 2,6 unidades de polimerasas de ADN estables en calor (Expanded High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) en un volumen final de 50 microlitros. Se utilizaron las condiciones de ciclo térmico siguientes para obtener productos de ADN amplificados para el operon groE de E. coli utilizando un termociclador Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600: cultivo a una concentración final de 1,0 mM. Las células se cultivaron toda la noche para inducir la expresión génica de las construcciones de ADN recombinantes de H. pylori.

Después de la inducción de la expresión génica con IPTG, las bacterias se sedimentaron por centrifugación en una centrífuga Sorvall RC-3B a 3.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos se resuspendieron en 50 mililitros de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M de NaCl y 0,1 mM de EDTA frío (tampón STE). Las células se centrifugaron a 2.000 x g durante 20 min a 4ºC. Los sedimentos se pesaron (peso húmedo medio 6 gramos/litro) y se procesaron para purificar la proteína recombinante como se describe a continuación.

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Purificación de MurI soluble

Todas las etapas se llevaron a cabo a 4ºC. Las células se suspendieron en 4 volúmenes de tampón de lisis (50 mM de Fosfato de potasio, pH 7,0, 100 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 2 mM de EGTA, 10% de glicerol, 10 mM de ácido D,L-glutámico, 0,1% de \beta-mercaptoetanol, 200 microgramos/ml de lisozima, 1 mM de PMSF y 10 \mug/ml de cada una de leupeptina, aprotinina, pepstatina, L-1-cloro-3-(4-tosilamido]-7-amino-2-heptanona (TLCK), L-1-cloro-3-fenil-2-butanona (TPCK) e inhibidor de tripsina de soja y se rompieron pasándolas tres veces a través de un microfluidizador de pequeño volumen (Modelo M-110S, Microfluidics International Corporation, Newton, MA). El homogenado resultante se diluyó con un volumen de tampón A (10 mM de Tris-HCl pH 7,0, 0,1 mM de EGTA, 10% de glicerol, 1 mM de ácido D,L-Glutámico, 1 mM de PMSF, 0,1% de beta-mercaptoetanol) y 0,1% de Brij-35 y se centrifugó (100.000 x g, 1 h) para rendir un sobrenadante claro (extracto crudo).

Después de filtrar a través de un filtro de 0,80-\mum, el extracto se cargó directamente en una columna de 20 ml de Q-Sefarosa pre-equilibrada en tampón A que contiene 100 mM de NaCl y 0,02% de Brij-35. La columna se lavó con 100 ml (5 volúmenes de lecho) de Tampón A que contiene 100 mM de NaCl y 0,02% de Brij-35, se corrió con un gradiente lineal de 100-ml de NaCl en aumento (de 100 a 500 mM) en Tampón A. Una banda de M_{r} = 28.000 kD correspondiente a MurI, el producto del gen murI recombinante de H. pylori, eluyó a una concentración del gradiente de aproximadamente 200-280 mM de NaCl. Las fracciones individuales de la columna se caracterizaron para la actividad MurI (véase más adelante la descripción del ensayo) y los perfiles proteicos de las fracciones se analizaron en SDS-PAGE en geles de acrilamida al 12%.

Las fracciones que contienen MurI se juntaron, se llevaron al 70% de saturación con (NH_{4})_{2}SO_{4} sólido, se agitaron durante 20 minutos y se centrifugaron a 27.000 x g durante 20 minutos. El sedimento resultante se resuspendió en tampón de lisis hasta un volumen final de 8 ml y se cargó directamente en una columna de 350-ml (2,2 x 92 cm) de medio de filtración en gel Sefacril S-100HR equilibrada en tampón B (10 mM de Hepes pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 10% de glicerol, 1 mM de ácido D,L-glutámico, 0,1 mM de PMSF, 0,1% de beta-mercaptoetanol) y se corrió a 30 ml/hora. Las fracciones que se vio que contenían una actividad MurI se juntaron y se añadió un volumen de 0,5 de tampón C (10 mM de Tris pH 7,5, 0,1 mM de EGTA,10% de glicerol, 1 mM de ácido D,L-glutámico, 0,1 mM de PMSF, 0,1% de beta-mercaptoetanol) (para reducir la concentración de NaCl a 100 mM) y se cargaron en una columna MonoQ 10/10 de cromatografía líquida de alta presión equilibrada en tampón C que contiene 100 mM de NaCl. La columna se lavó con 2 volúmenes de lecho de este tampón y se corrió con un gradiente lineal de 40 mL de NaCl en aumento (de 100 a 500). MurI eluyó como un pico definido a 310 mM de NaCl. Las fracciones que contienen una actividad MurI se juntaron, se concentraron por diálisis frente a tampón de almacenamiento [50% de glicerol, 10 mM de ácido 3-(N-morfolino-propanosulfónico (MOPS) pH 7,0,150 mM de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 0,02% de Brij-35, 1 mM de ditiotreitol (DTT)] y se almacenaron a -20ºC.

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Preparación de MurI de H. pylori sin glutamato

Se dializó 1 mL de 1-25 mg/ml de MurI de H. pylori, almacenado en presencia de 1-10 mM de Glutamato y 10-50% de glicerol, 3 veces frente a 1L de 100 mM de KH_{2}PO_{4}, 100 mM de Na_{2}SO_{4}, 5 mM de DTT y 1 mM de EDTA, pH 8,2 durante 3 horas a 4ºC.

No se observó glutamato en la proteína dializada mediante 1D-RMN o utilizando L-glutamato deshidrogenasa en un ensayo enzimático fotométrico. La actividad específica de MurI de H. pylori sin glutamato no estaba alterada (k_{cat} =1,8/min) comparada con una enzima almacenada en presencia de glutamato.

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B. Ensayos para determinar la actividad MurI 1. Conversión de D-glutamato en L-glutamato (ensayo enzimático único acoplado)

En este ensayo, la conversión de ácido D-glutámico en ácido L-glutámico está acoplada a la conversión de ácido L-glutámico y NAD+ por la L-glutamato deshidrogenasa en 2-oxoglutarato, amoniaco. La producción de NADH se mide como un incremento de la absorbancia a 340 nm (la reducción de NAD+ a NADH) a 37ºC. La mezcla de ensayo estándar (adaptada de Choi, S-Y,, Esaki, N., Yoshimura, T., y Soda, K. 1991, Protein Expression and Purification 2: 90-93) contenía 10 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM de NAD+, 5 Unidades/ml de L-glutamato deshidrogenasa, concentraciones variables del sustrato Ácido D-glutámico (0,063 mM a 250 mM) y la enzima MurI recombinante purificada de H. pylori (1 \mug a 50 \mug). La reacción se inició mediante la adición bien del sustrato D-glutamato o de MurI recombinante después de una pre-incubación a 37ºC durante 5 minutos con los demás ingredientes del ensayo. El cambio en la absor-
bancia a 340 nm se midió en un Spectra MAX 250. Las velocidades iniciales se dedujeron de las pendientes iniciales.

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2. Conversión de D-glutamato en L-glutamato (ensayo enzimático doble acoplado)

La actividad de MurI respecto a la interconversión de los enantiómeros del ácido glutámico puede medirse utilizando ácido D-glutámico como sustrato como se describe en los métodos de Gallo y Knowles (Gallo, K.A. y Knowles, J.R., 1993, Biochemistry 32, 3981-3990). El ensayo se utilizó originalmente para medir la actividad MurI de Lactobacillus fermenti y puede adaptarse para la medida de la actividad de MurI del producto génico murI de H. pylori aislado como una proteína recombinante de E. coli. En este ensayo, la medida de la actividad de MurI está asociada a un cambio de DO en el intervalo visible en una serie de reacciones acopladas a las actividades de la L-glutamato deshidrogenasa (reducción de NAD a NADH). Las velocidades iniciales se determinaron siguiendo el incremento de la absorbancia a 340 nm en un volumen de reacción de 200 ml que contiene 50 mM de Tris-HCl pH 7,8, 4% v/v de glicerol, 10 mM de NAD, 60 Unidades/ml de L-glutamato deshidrogenasa y concentraciones variables bien del sustrato (de 0,063 mM a 250 mM de ácido D-glutámico) o de la enzima purificada (de 1 \mug a 50 \mug). Después de una pre-incubación de todos los reactivos, excepto el sustrato (D-glutamato) o la enzima (producto del gen murI), durante un periodo de 5 minutos, las reacciones se iniciaron mediante la adición del ingrediente que falta (es decir, la enzima o el sustrato, según se requiera) y se midió el incremento de la densidad óptica a 500 nm en un Sistema Espectrofotométrico de Microplacas (Molecular Devices, Spectra MAX 250). Las medidas se siguieron durante 20 minutos y se dedujeron las velocidades iniciales calculando la pendiente máxima para los incrementos de absorbancia.

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3. Conversión de L-glutamato en D-glutamato (ensayo enzimático doble acoplado)

La actividad de MurI respecto a la interconversión de los enantiómeros del ácido glutámico se midió utilizando ácido L-Glutámico como sustrato. En este ensayo, la conversión de L-Glutamato en D-Glutamato se evaluó espectrofotométricamente mediante un sistema enzimático doble acoplado en el que la producción de D-glutamato está acoplada a la incorporación de D-Glutamato en UDP-MurNAc-Ala-D-Glu por MurD recombinante de E. faecalis, con la hidrólisis concomitante de ATP a ADP y fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico producido en esta reacción se consume posteriormente por la enzima purina-nucleósido fosforilasa (PNP) al reaccionar con el sustrato cromogénico 2-amino-6-mercapto-7-metilpurina ribonucleósido (MESG) que tiene una banda espectral a 360 nm como se describe en Webb, M.R, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 4884-4887 (1992). Las velocidades iniciales de la reacción se determinaron siguiendo el incremento de la absorbancia a 360 nm en un volumen de reacción de 100 \muL que contiene 85 \muL de tampón de reacción (58 mM de Tris, pH=8,0, 23,5 mM de acetato de amonio, 23,5 mM de acetato de magnesio, 2,94 mM de ditiotreitol, 2,94 mM de adenosina trifosfato, 0,47 mM de UDP-MurNAc-Ala, 0,47 mM de MESG, 1,17 unidades/mL de PNP, 16 \mug/mL de MurD de E. faecalis y 30 nM de MurI) y 15 \muL de disolución madre de L-Glutamato (0,05-10 mM). El incremento de la densidad óptica a 360 nM se midió continuamente en una placa de microtitulación de 96 pocillos en un Sistema Espectrofotomético de Microplacas (Molecular Devices, SpectraMAX 250). Las medidas se siguieron durante 20 min y se dedujeron las velocidades iniciales calculando la pendiente máxima para los incrementos de absorbancia.

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Resultados Propiedades cinéticas de la enzima recombinante de H. pylori

Las constantes cinéticas para MurI recombinante se estimaron ensayando su actividad a diferentes concentraciones de proteína y ácido D-glutámico como se ha descrito anteriormente. La MurI recombinante de H. pylori presenta una Vmax de aproximadamente 300 nanomoles/min/mg de proteína (kcat = 8,6 min -1) y una Km de 100 micromolar para D-glutamato. Se observó una gran inhibición de sustrato. Aunque el valor de Vmax es menor que el observado para MurI altamente purificada a partir de otras especies bacterianas, la Km para el ácido D-glutámico es menor que la observada para la enzima de la mayoría de las demás especies, lo que resulta en una eficacia catalítica (kcat/Km) que es típica de preparaciones purificadas de E. coli y P. pentococcus.

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C. Metodología de cristalización

Un método para cristalizar MurI de H. pylori formando un complejo con glutamato incluye las etapas de: (a) preparar una primera disolución que comprende un agente reductor, sustrato, sal, bactericida, tampón pH 6,5-9,5 y MurI, en el que el agente reductor, sustrato, sal, bactericida y tampón pH 6,5-9,5, está presente cada uno en una concentración suficiente para inhibir la oxidación de la disolución, unirse a la MurI, estabilizar a la proteína e impedir la agregación, inhibir el crecimiento bacteriano y controlar el pH de la disolución; (b) preparar una segunda disolución que comprende sal y tampón pH 6,5-9,5, en el que la sal y tampón pH 6,5-9,5 está cada uno presente en una concentración suficiente para estabilizar a la proteína e impedir la agregación y controlar el pH de la disolución; (c) combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y (d) formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen los cristales de MurI, mediante el cual se producen los cristales de MurI. La primera disolución puede incluir adicionalmente glicerol en una concentración suficiente para facilitar la congelación de los cristales y estabilizar a la proteína y la segunda disolución puede incluir adicionalmente un precipitante, un aditivo orgánico y un agente reductor, cada uno en una concentración suficiente para secuestrar el agua y forzar a las proteínas fuera de la disolución, precipitar la proteína y hacer el dieléctrico de la disolución e inhibir la oxidación de la disolución, respectivamente.

Para cristalizar MurI pueden utilizarse métodos de cristalización discontinuos, por difusión de vapor o de diálisis.

La necesidad de un agente reductor puede obviarse realizando la cristalización en condiciones anaeróbicas; tales como en aceite o en una caja anaeróbica.

Los aditivos orgánicos de la presente invención incluyen, por ejemplo, metanol, etanol ó 2-metil-2,4-pentanodiol (MPD).

Un experto en la técnica reconocerá que podría utilizarse una amplia gama de tampones muy conocidos (por ejemplo, HEPES, Tris, MOPS, etc.) para tamponar las disoluciones en el pH apropiado.

Los ejemplos de un bactericida es ácido etilen glicol bis (2-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o azida sódica.

Las sales en la segunda disolución pueden ser, por ejemplo, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, foramato de magnesio, sulfato de litio, cloruro de litio, acetato de amonio, sulfato de amonio, acetato de litio, citrato de amonio o citrato de litio.

Los agentes reductores en la primera o segunda disolución pueden ser, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), hidrocloruro de Tri(2-carboxietil)fosfina (TCEP) o beta-mercaptoetanol, para impedir o retardar la oxidación de la proteína.

Los precipitantes en la segunda disolución pueden variar de aproximadamente 0% a aproximadamente 55% de polietilen glicol (PEG), o un derivado de éste (por ejemplo, mono-metil-éter-poli-etilen glicol (MME PEG)). Más específicamente, pueden variar de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, más específicamente pueden variar de aproximadamente 15% a aproximadamente 30% de PEG, o de aproximadamente 20% a aproximadamente 25% de PEG. Pueden utilizarse diferentes precipitantes, tales como PEG (por ejemplo, PEG 500 a 20.000, o cualquier PEG intermedio) o un derivado de éste. Más específicamente, el precipitante en la segunda disolución es PEG 1.000-10.000, o PEG 2.000-6.000.

Se preparó un cristal de MurI de H. p. por el proceso de: (a) preparar una primera disolución de aproximadamente uno a aproximadamente 100 mM de ácido D,L-glutámico, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM de agente reductor, aproximadamente 0-30% de glicerol, aproximadamente 1-500 mM de tampón pH 6,5-9,5, aproximadamente 50-500 mM de sal, aproximadamente 0,1 mM de bactericida y de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de MurI de H. pylori; (b) preparar una segunda disolución de aproximadamente 50-150 mM de sal, aproximadamente 0-55% de precipitante, de aproximadamente 0-15% de aditivo orgánico, aproximadamente 0-30% de glicerol, aproximadamente 5-200 mM de tampón pH 6,5-9,5 y aproximadamente 0-50 mM de agente reductor; y (c) combinar la primera disolución y la segunda disolución en gotas produciendo de esta manera una combinación que se utiliza en un método de cristalización.

Una realización de la presente invención se refiere a cristales seleccionados que se congelaron rápidamente en una corriente de nitrógeno frío y se ensayaron en un detector propio.

Se preparó un cristal de MurI de H. pylori de la presente invención por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente uno a aproximadamente 100 mM de ácido D,L-glutámico, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 5 mM de agente reductor, de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de glicerol, de bactericida de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mM de tampón pH 6,5-9,5, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal, aproximadamente 0,1 mM de EGTA y de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 50-150 mM de sal, de aproximadamente 0 a aproximadamente 55% de precipitante, de aproximadamente 0 a aproximadamente 15% de aditivo orgánico, de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de glicerol, de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 mM de tampón pH 6,5-9,5 y de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mM de agente reductor; combinar la primera disolución y la segunda disolución en gotas, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen los cristales de MurI, mediante el cual se produjeron los cristales de MurI.

Un complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,18 \ring{A}, b = 81,07 \ring{A} y c =113,82 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se preparó por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 10 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de DTT, aproximadamente 10% de glicerol, aproximadamente 10 mM de MOPS pH 7,0, aproximadamente 50 mM de NaCl, aproximadamente 0,1 mM de EGTA y aproximadamente 7 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 80 mM de MgCl_{2}, aproximadamente 25% de PEG 3350, de aproximadamente 8% de metanol, aproximadamente 10% de glicerol, aproximadamente 100 mM de Tris pH 8,0 y aproximadamente 5 mM de DTT; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Otro complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 59,20 \ring{A}, b = 82,40 \ring{A} y c =106,50 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92,15º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se preparó por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de TCEP, aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4 y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 0,2 mM de MgCl_{2}, aproximadamente 20-25% de PEG 4000, aproximadamente 20% de glicerol, aproximadamente 100 mM de Tris pH 8,5; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Otro complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,28 \ring{A}, b = 78,96 \ring{A} y c =59,15 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92,64º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se preparó por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de TCEP, aproximadamente 20-25% de PEG 4000, 200 mM de acetato de amonio pH 7,4 y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 200 mM de MgSO_{4}, aproximadamente 100 mM de Tris pH 8,5, aproximadamente 25% de PEG de 4000; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Otro complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,02 \ring{A}, b = 80,66 \ring{A} y c =59,18 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92,65º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se preparó por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de TCEP, aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4 y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 200 mM de acetato de sodio, aproximadamente 100 mM de Tris pH 8,5, aproximadamente 25% de PEG 4000 y aproximadamente 15% de glicerol; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Otro complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,61 \ring{A}, b = 78,40 \ring{A} y c =59,43 \ring{A} y donde \alpha = 90º, \beta = 92,33º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se preparó por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de TCEP, aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4 y aproximadamente 10 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 200 mM de LiSO_{4}, aproximadamente 100 mM de Tris pH 8,5 y aproximadamente 25% de PEG 3350; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Un complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,9 \ring{A}, b = 80,8 \ring{A} y c =113,6 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se preparó por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 10 mM de ácido D,L-glutámico, aproximadamente 1 mM de DTT, aproximadamente 10% de glicerol, aproximadamente 10 mM de MOPS pH 7,0, aproximadamente 50 mM de NaCl, aproximadamente 0,1 mM de EGTA y aproximadamente 7 mg/ml de MurI de H. pylori; preparar una segunda disolución de aproximadamente 80 mM de MgCl_{2}, aproximadamente 25% de PEG 3350, de aproximadamente 8% de metanol, aproximadamente 10% de glicerol, aproximadamente 100 mM de Tris pH 8,0 y aproximadamente 5 mM de DTT; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Los cristales que tienen las coordenadas atómicas de la Figura 5 se obtuvieron por difusión de vapor utilizando el método de la gota colgante. ("Protein Crystallization", Terese M. Bergfors (Ed.), International University Line, páginas 7-15, 1999.) Las proteínas se almacenaron a -80 grados a una concentración de 10 mg/ml en un tampón que contiene 200 mM de acetato de amonio pH 7,4, 5 mM de D,L-glutamato y 1 mM de TCEP. La disolución madre contenía típicamente 25-35% de PEG 4000, 200 mM de sulfato de magnesio, 100 mM de Tris pH 8,0-9,0 y 1 mM de TCEP. Las gotas colgantes se formaron mezclando 4 microlitros de disolución de proteína con 2 o con 4 microlitros de la disolución madre. Durante la noche aparecieron cristales con forma de placa y alcanzaron un tamaño típico de 0,2 x 0,2 x 0,2-0,6 (mm^{3}) en un par de días. Los cristales seleccionados se transfirieron a una disolución madre modificada que contiene 20% de glicerol durante pocos segundos y se congelaron rápidamente en una corriente de nitrógeno frío y se ensayaron en un detector propio Mar345 (MarResearch Hamburg, Alemania) antes de la recogida de datos en un sincrotrón.

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Cristalización de MurI de H. pylori con glutamato e inhibidores pirimidinadiona

Una realización de la presente invención se refiere a un cristal de glutamato racemasa de H. pylori formando un complejo con una pirimidinadiona que tiene el grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y que tiene las dimensiones de celda a = 61,4 \ring{A}, b = 76,3 \ring{A}, c = 108,9 \ring{A} y \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Una realización adicional engloba este cristal formado por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de D-L Glutamato; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio; aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 500 micromolar del compuesto A; y aproximadamente 10 mg/ml de glutamato racemasa de H. pylori; preparar una segunda disolución con aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 20-25% de PEG 3350; aproximadamente 15-25% de glicerol; y aproximadamente 0,2 mM de acetato de amonio; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen cristales de glutamato racemasa.

Una realización de la presente invención es glutamato racemasa cristalizada de H. pylori formando un complejo con una pirimidinadiona que tiene el grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2 y que tiene las dimensiones de celda a = 60,7 \ring{A}, b = 77,5 \ring{A}, c = 56,6 \ring{A} y \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Una realización adicional engloba este cristal formado por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de D-L Glutamato; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio; aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 500 micromolar del compuesto A; y aproximadamente 10 mg/ml de glutamato racemasa de H. pylori; preparar una segunda disolución con aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 20-25% de PEG 3350; aproximadamente 15-25% de glicerol; y aproximadamente 0,2 mM de acetato de amonio; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen cristales de glutamato racemasa.

Otra realización de la presente invención es glutamato racemasa cristalizada de H. pylori formando un complejo con una pirimidinadiona que tiene el grupo espacial monoclínico P2_{1} y que tiene las dimensiones de celda a = 57,1 \ring{A}, b = 78,0 \ring{A}, c = 58,55 \ring{A} y \alpha = 90º, \beta = 97,91º y \gamma = 90º. Una realización adicional engloba este cristal formado por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de D-L Glutamato; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio; aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 500 micromolar del compuesto A; y aproximadamente 10 mg/ml de glutamato racemasa de H. pylori; preparar una segunda disolución con aproximadamente 0,1 M de Tris pH 7,4-8,5; aproximadamente 20-25% de PEG 3350; aproximadamente 15-25% de glicerol; y aproximadamente 0,2 mM de acetato de amonio; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen cristales de glutamato racemasa.

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D. Recogida de Datos

Los cristales difractaron con una resolución de aproximadamente 2,8 \ring{A} utilizando una fuente de rayos X propia (sistema detector image-plate MarResearch 345 mm con rayos X generados en ánodo giratorio Rigaku RU300HB operado a 50 kV y 100 m \ring{A}). Se recogió un conjunto completo de datos en ID2, ESRF con una resolución de 2,3 \ring{A}. Los datos de MAD (MAD = método de fase por Difracción Anómala de Múltiples Longitudes de Onda) (Se-Met) se recogieron en BM14, ESRF. Se recogieron tres conjuntos de datos a tres longitudes de onda diferentes (0,91833 \ring{A}, 0,97804 \ring{A} y 0,97821 \ring{A}). Los datos se procesaron utilizando Denzo (Z. Otwinowski y W. Minor, "Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode", Methods in Enzymology, Volumen 276: Macromolecular Crystallography, parte A, p.307-326, 1997,C.W. Carter, Jr. & R. M. Sweet, Eds., Academic Press, Nueva York). Las estadísticas de la colección de datos de MAD se muestran en la Tabla 6.

Se recogió un conjunto de datos de alta resolución con una difracción de 1,9 \ring{A} de resolución de un cristal crecido en presencia de 0,1 M de Tris pH 8,5, 0,2 M de MgSO_{4} y 25% de PEG 4000 que pertenecía al grupo espacial P2_{1} (a = 52,28 \ring{A}, b = 78,96 \ring{A}, c = 59,14 \ring{A}, \alpha = 90º, \beta = 92.64º y \gamma = 90º) en la línea de luz 711 en MaxLab. Los datos se procesaron, escalaron y se combinaron utilizando MOSFLM, SCALA y TRUNCATE (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta Cryst. D50: 760-763). El conjunto de datos comprendía 144.510 medidas de 34.987 reflexiones únicas que proporcionan una multiplicidad de 4,1, una completitud de 92,3% y una R-merge global de 8,1%. Ciclos adicionales de refinamiento con el programa CNS y fabricación de modelo con el programa ONO proporcionaron un modelo final que consiste en dos cadenas polipeptídicas de 255 restos de aminoácidos (restos 1-255), dos ácidos D-glutámicos y 377 moléculas de agua ordenadas. Los valores R finales fueron R = 0,2061 y R-libre = 0,2458.

Un cristal pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,18 \ring{A}, b = 81,07 \ring{A} y c =113,82 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Un cristal pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 59,20 \ring{A}, b = 82,40 \ring{A} y c = 106,50 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta= 92,15º y \gamma = 90º. Un cristal pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 59,67 \ring{A}, b = 78,82 \ring{A} y c = 59,34 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta= 92,35º y \gamma = 90º. Un cristal pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,02 \ring{A}, b = 80,66 \ring{A} y c = 59,18 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta= 92,65º y \gamma = 90º. Un cristal pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,48 \ring{A}, b = 80,71 \ring{A} y c = 59,42 \ring{A} y donde \alpha = 90º, \beta= 91,68º y \gamma = 90º. Cada uno de estos grupos espaciales está englobado por las coordenadas estructurales de la Figura 6.

TABLA 6 Datos de MAD Recogidos en ESRF.BM14; Resolución 2,8 \ring{A} (detector CCD/DENZO)

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E. Determinación de Fase por MAD

Los sitios de selenio se encontraron con el programa RANTAN (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta. Cryst. D50, 760-763, Yao Jia-xing, (1981). Acta. Cryst. A37, 642-644) y se verificaron por diferencia de Fourier.

El refinamiento y determinación de fase de los átomos pesados se llevaron a cabo con MLPHARE (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta. Cryst. D50, 760-763 Z. Otwinowski: Daresbury Study Weekend proceedings, 1991). Se observó un límite claro de la proteína y del disolvente después de uniformizar el disolvente. Las estadísticas de la determinación de fase utilizando MLPHARE se representan en la Tabla 7.

Se llevó a cabo un refinamiento adicional de átomos pesados utilizando el programa SHARP (de la Fortelle, E. y Bricogne, G. (1997)). Maximum likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. En Carter, C.W. y Sweet, R.M. (ed.) Methods in Enzymology vol. 276, Academic Press, Orlando, Fl: p. 472-494, 1997), que resultó en una mapa de densidad electrónica ligeramente mejorado.

Se conocía con anterioridad que la proteína existe como un homo-dímero pero la inspección del mapa de densidad electrónica identificó una simetría molecular adicional. Cada monómero tiene una simetría de plegamiento pseudo doble que divide el monómero en dos dominios con unos tipos de plegamiento muy similares alfa/beta. El sitio de unión se encuentra entre los dos dominios. Así, la forma activa de la proteína es una estructura de cuatro dominios con dos sitios de unión aparentemente independientes.

La mejora de fase utilizando promedio doble de densidad (DM, The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta. Cryst. D50, 760-763, 1995) rindió un mapa de densidad electrónica con una calidad mucho mejor. La cadena polipeptídica se trazó fácilmente utilizando el mapa mejorado y según los 8 sitios Seleno-metionina. Más del 80% de la secuencia de aminoácidos se trazó con una confianza relativamente alta. La co-localización de los dos restos de cisteína propuestos para el sitio activo (Cys70 y Cys181, distancia C\alpha-C\alpha 7,5 \ring{A}) validó el trazado de la cadena. Análisis adicionales de este sitio activo potencial, confirmaron que, de hecho, un alto número de restos conservados estaban localizados en el mismo sitio. Además, se encontró una parte de densidad electrónica significativa que no pertenecía a ninguna de las cadenas laterales de la proteína. Se interpretó y se confirmó que esta densidad surgía del sustrato unido, D-glutamato.

TABLA 7 Estadísticas de determinación de fase utilizando MLPHARE (3,0 \ring{A})

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F. Refinamiento de la Estructura del Cristal

Un primer ciclo de refinamiento utilizando REFMAC (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta Cryst. D50: 760-763, "Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method". G.N. Murshudov, A.A. Vagin y E.J. Dodson, (1997) en Acta Cryst. D53: 240-255) después de terminar la construcción del modelo para átomos de proteína rindió un valor R de 0,26 y un valor R-libre de 0,37. El valor R describe la discrepancia entre los datos observados y los datos sintéticos calculados a partir del modelo. El valor R-libre es el mismo calculado a partir de un conjunto de reflexiones de ensayo, habitualmente 4% del total, que se pone aparte al comienzo del refinamiento y que sirve como una referencia no sesgada para evitar el sobreajuste de los datos. El valor R depende de la resolución pero debe ser menor de 25 y el R-libre normalmente no más alto del 5%.

En este punto del refinamiento se introdujo un conjunto de datos nativo de alta resolución. El dato no era completamente isomorfo por lo que se realizó reemplazamiento molecular (MR) utilizando el modelo refinado frente a los datos de Difracción Anómala de Múltiples Longitudes de Onda (MAD). MR se realizó utilizando AMORE (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta. Cryst. D50: 760-763, J. Navaza, Acta Cryst. A50: 157-163 (1994) en los datos nativos iniciales (resolución 2,3 \ring{A}) y resultó en una disolución transparente. Se llevó a cabo refinamiento por dominios rígidos y NCS utilizando REFMAC. D-glutamato se acumuló en el sitio activo y se obtuvo R/Rlibre cristalográfica de 0,27/0,34.

En la última etapa de refinamiento, se utilizó recocido simulado con dinámicas de ángulos de torsión utilizando el programa CNS (Crystallography & NMR System, Acta. Cryst. D54: 905-921 (1998)) que rindió un valor menor de R-libre y un mapa de densidad electrónica mejorado.

Las estadísticas de refinamiento para CNS son las siguientes:

Resolución de refinamiento: 50-2,3 \ring{A};

R final = 0,2283 R-libre = 0,2808;

Número total de reflexiones utilizado: 22.893 (87,2%);

Número de reflexiones en el conjunto de trabajo: 21.719 (82,7%); y

Número de reflexiones en el conjunto de ensayo: 1.174 (4,5%).

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G. Resonancia magnética nuclear (RMN) de MurI de H. pylori

La resonancia magnética nuclear (RMN) proporciona un método mediante el que se pueden visualizar en disolución la estructura y la conformación de los restos de aminoácidos de la proteína. Los experimentos de RMN se llevaron a cabo a 303 K en un sistema Bruker Avance 800 MHz equipado con una sonda de triple resonancia (^{1}H/^{13}C/^{15}N) gradiente único de 5-mm. Las muestras tenían pH 7,5 en un tampón fosfato 100 mM que contiene 100 mM de K_{2}SO_{4}, 5 mM de DTT y 1 mM de EDTA. La concentración de proteínas era 0,3 mM. Los experimentos de correlación [^{15}N, ^{1}H] se registraron para seguir la estabilidad de los protones con una concentración creciente de D-glutamato. Los tiempos de evolución fueron aproximadamente 90 minutos en las dimensiones de la proteína y 30 minutos en la dimensión del nitrógeno, con un tiempo total de adquisición de 2,5 horas. Los conjuntos de datos se procesaron y se analizaron con el programa nmrPipe (Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G., Zhu, G., Pfeifer, H., y Bax, A. "NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX Pipes", J. Biomol. NMR 6: 277-293 (1995)).

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Producción de proteína MurI marcada isotópicamente para estudios por RMN Pre-crecimiento en placa y adaptación

Se crecieron transformantes J99 de MurI de H. pylori frescos hasta el tamaño de cabezas de alfiler pequeñas durante 30-36 horas en placas preparadas como sigue:

Se funden 0,2 gramos de agar en 19 mL de D_{2}O por calentamiento suave (por ejemplo, microondas). El agar fundido se enfría hasta aproximadamente 60ºC y se marcaron 2 mL de medio BioExpress®-1000 (U-D, 98%, U-15N, 96-99% para marcajeN/^{2}D o U-13C, 97-98%, U-15N, 96-99%, U-D, 98%, para marcaje ^{15}N/^{2}D/^{13}C; Cambridge lostope Labs, Andover, MA, EEUU) y los anticuerpos respectivos.

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Crecimiento celular e inoculación

Las colonias de la placa se suspendieron utilizando 2 mL de medio de cultivo (preparado como se describe a continuación) y se determinó la DO_{600} de la disolución. Se inoculó 1L de medio de cultivo (preparado como se describe a continuación) con un total de 0,1 DO_{600}. A DO_{600} = 0,5-0,8 (aproximadamente 14-20 horas de tiempo de crecimiento) se indujo la producción de proteína MurI de H. pylori utilizando 0,5 mM de IPTG. En el momento de la inducción, se añadieron 4 mL/L de medio BioExpress®-1000 (U-D, 98%, U-15N, 96-99% para marcaje ^{15}N/^{2}D o U-13C, 97-98%, U-15N, 96-99%, U-D, 98%, para marcaje ^{15}N/^{2}D/^{13}C).

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Preparación del medio de cultivo: Medio Mínimo M9 suplementado con medio BioExpress®-1000 (1L de volumen total)

Na_{2}HPO_{4} (7,26g), KH_{2}PO_{4} (3,0g), NaCl (0,5g), NH_{4}Cl (1,0g; marcado con N), 10 ml de MgSO_{4} (100 mM en D_{2}O), 10 ml de CaCl_{2} (10 mM en D_{2}O), 10 mL de glucosa (20% en D_{2}O), 10 ml de tiamina (0,1% en D_{2}O), 760 mL de D_{2}O, 16 mL de medio BioExpress®-1000 (U-D, 98%, U-15N, 96-99% para marcaje ^{15}N/^{2}D o U-13C, 97-98%, U-15N, 96-99%, U-D, 98%, para marcaje ^{15}N/^{2}D/^{13}C).

La proteína se purificó y se caracterizó como se ha descrito anteriormente.

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Ejemplo 2 Cristalización y Caracterización de MurI de E. coli

La clonación y caracterización de MurI de E. coli se ha descrito con detalle en la Solicitud Provisional EEUU 60/435.167.

La clonación, sobreexpresión, purificación y caracterización bioquímica de MurI de E. coli se ha publicado H.T. Ho et al. (Biochemistry 34: 2464-2470 (1995)).

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A. Condiciones de cristalización y grupos espaciales

Un método para cristalizar MurI de E. coli formando un complejo con glutamato incluye las etapas de: (a) preparar una primera disolución que comprende un agente reductor, un sustrato, un activador, una sal pH 6,5-9,5 y MurI, en el que el agente reductor, sustrato, sal pH 6,5-9,5, está presente cada uno en una concentración suficiente para inhibir la oxidación de la disolución, unirse a la MurI, estabilizar a la proteína e impedir la agregación, mientras se controla el pH de la disolución, respectivamente; (b) preparar una segunda disolución que comprende sal pH 4,5-9,5, en el que la sal 4,5-9,5 está presente en una concentración suficiente para estabilizar a la proteína e impedir la agregación mientras se controla el pH de la disolución; (c) combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y (d) formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen los cristales de MurI, mediante el cual se producen los cristales de MurI.

La primera disolución puede incluir adicionalmente glicerol en una concentración suficiente para facilitar la congelación de los cristales y estabilizar a la proteína y la segunda disolución comprende adicionalmente un precipitante, cada uno en una concentración suficiente para forzar a la proteína fuera de la disolución e inhibir la oxidación de la disolución, respectivamente.

Pueden utilizarse métodos de cristalización discontinuos, por difusión de vapor o de diálisis.

La necesidad de utilizar un agente reductor puede obviarse realizando la cristalización en condiciones anaeróbicas, tales como en aceite o en una caja anaeróbica.

Las sales pueden ser, por ejemplo, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, foramato de magnesio, sulfato de litio, cloruro de litio, acetato de amonio, sulfato de amonio, acetato de litio, citrato de amonio o citrato de litio.

Los agentes reductores en la primera o segunda disolución pueden ser, por ejemplo, hidrocloruro de Tri(2-carboxietil)fosfina (TCEP), beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT), para impedir o retardar la oxidación de la proteína.

En una realización adicional, el precipitante en la segunda disolución es de aproximadamente 0% a aproximadamente 55% de polietilen glicol (PEG), o un derivado de éste (por ejemplo, mono-metil-éter poli-etilen glicol (MME PEG)). En una realización adicional, el precipitante en la segunda disolución comprende de aproximadamente 5% a aproximadamente 40% de PEG. En una realización adicional, el precipitante en la segunda disolución comprende de aproximadamente 15% a aproximadamente 30% de PEG. En otra realización, el precipitante en la segunda disolución comprende de aproximadamente 20% a aproximadamente 25% de PEG.

Pueden utilizarse diferentes precipitantes, tales como PEG (por ejemplo, PEG 500 a 20.000, o cualquier PEG intermedio) o un derivado de éste. En una realización adicional, el precipitante en la segunda disolución es PEG 1.000-10.000. Alternativamente, el precipitante en la segunda disolución es PEG 2.000-6.000.

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Se preparó un cristal de MurI de E. coli por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente uno a aproximadamente 100 mM de ácido D,L-glutámico; de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM de agente reductor; de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de glicerol; de aproximadamente 0 a aproximadamente 500 mM de tampón pH 6,5-9,5; de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal; aproximadamente 0,6 mM de UDP-MurNAc-Ala; y de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de MurI de E. coli; preparar una segunda disolución de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal pH 4,5-7,5; de aproximadamente 0 a aproximadamente 55% de precipitante; y de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de glicerol; y combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Los cristales seleccionados se congelaron rápidamente en una corriente de nitrógeno frío y se ensayaron en un detector propio.

Se preparó un cristal de MurI de E. coli por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente uno a aproximadamente 100 mM de ácido D,L-glutámico; de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM de agente reductor; de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de glicerol; de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal pH 6,5-9,5; aproximadamente 0,6 mM de UDP-MurNAc-Ala; y de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml de MurI de E. coli; preparar una segunda disolución de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mM de sal pH 4,5-7,5; y de aproximadamente 0 a aproximadamente 55% de precipitante; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se producen los cristales de MurI, mediante el cual se produjeron los cristales de MurI.

Una realización de la presente invención comprende preparar un cristal de MurI de E. coli por el proceso descrito en la presente memoria, en el que el cristal se caracteriza por las coordenadas estructurales de la Figura 11. Una realización de la presente invención comprende un método para preparar un cristal de MurI de E. coli formando un complejo con glutamato por el proceso descrito en la presente memoria, en el que el cristal se caracteriza por las coordenadas estructurales de la Figura 8.

Un complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial ortorrómbico C222_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 83,05 \ring{A}, b = 112,82 \ring{A} y c = 74,12 \ring{A}, donde \alpha = 90º,\beta = 90º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se produjo por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4; aproximadamente 10 mg/ml de MurI de E. coli; y aproximadamente 0,6 mM del activador, UDP-MurNAc-Ala; preparar una segunda disolución de aproximadamente 100 mM de acetato de sodio pH 4,5; aproximadamente 5-10% de MME 2000; aproximadamente 30% de glicerol; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Un complejo cristalizado de la presente invención se caracteriza por que pertenece al grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 70,04 \ring{A}, b = 74,13 \ring{A} y c = 70,10 \ring{A}, donde \alpha = 90º,\beta = 107,15º y \gamma = 90º, en el que el complejo cristalizado se produjo por el proceso de preparar una primera disolución de aproximadamente 5 mM de ácido D,L-glutámico; aproximadamente 1 mM de TCEP; aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4; aproximadamente 10 mg/ml de MurI de E. coli; y aproximadamente 0,6 mM del activador, UDP-MurNAc-Ala; preparar una segunda disolución de aproximadamente 100 mM de acetato de sodio pH 4,5; aproximadamente 5-10% de MME 2000; aproximadamente 30% de glicerol; combinar la primera disolución y la segunda disolución, produciendo de esta manera una combinación; y formar gotas a partir de la combinación en un método de cristalización en condiciones en las que se produjeron cristales de MurI.

Los cristales se obtuvieron por difusión de vapor utilizando el método de la gota colgante. ("Protein Crystallization" Terese M. Bergfors (Editor), International University Line, páginas 7-15, 1999). La proteína se almacenó en alicuotas de 50 microlitros a -80 grados a una concentración de 10 mg/ml en un tampón que contiene 200 mM de acetato de amonio pH 7,4, 5 mM de ácido D,L-glutámico y 1 mM de TCEP. Antes de la cristalización, se añadió el activador, UDP-MurNAc-Ala, a la disolución a una concentración final de 0,6 mM. La disolución madre contenía típicamente 100 mM de acetato de sodio pH 4,5, 25% de polietilen glicol mono-metil-éter (MME) 2000 y 30% de glicerol. Las gotas se formaron mezclando 2 microlitros de disolución de proteína con 2 microlitros de la disolución madre. Durante la noche aparecieron cristales con forma plana y alcanzaron un tamaño típico de 0,4 x 0,3 x 0,2 (mm^{3}) en una semana. Se produjo MurI sustituida con Se-Met y se cristalizó en condiciones similares que las de la proteína salvaje. La sustitución de Se-Met se verificó por espectroscopía de Masa. Los cristales seleccionados se congelaron rápidamente en una corriente de nitrógeno frío y se ensayaron en un detector propio. El cristal pertenece al grupo espacial ortorrómbico C222_{1} con las dimensiones de celda a = 83,05 \ring{A}, b =112,82 \ring{A} y c = 74,12 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Los cristales pueden enfriarse rápidamente hasta 95 K directamente de la gota sin la formación de hielo.

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B. Recogida de Datos

Los cristales difractaron con una resolución de aproximadamente 2,3 \ring{A} utilizando una fuente de rayos X propia (MarResearch 345 mm sistema detector image-plate con rayos X generados en ánodo giratorio Rigaku RU300HB operado a 50 kV y 100 m \ring{A}). Se recogió un conjunto completo de datos a ID 14.4 ESRF a una resolución de 1,9 \ring{A}. Los datos de MAD (MAD = métodos de fase por Difracción Anómala de Múltiples Longitudes de Onda) (Se-Met) se recogieron en BM14, ESRF. Se recogieron tres conjuntos de datos a tres longitudes de onda diferentes (0,9786 \ring{A}, 0,9789 \ring{A} y 0,9184 \ring{A}).

Los datos se procesaron, se escalaron y se combinaron utilizando MOSFLM, SCALA y TRUNCATE (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta Cryst. D50: 760-763) y se escalaron juntos utilizando SCALEIT (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta Cryst. D50: 760-763). Las estadísticas de los datos de MAD recogidos se muestran en la Tabla 8.

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TABLA 8 Datos de MAD Recogidos en ESRF.BM14; Resolución 2,2 \ring{A} (detector CCD/DENZO)

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C. Determinación de Fase por MAD

El cristal tiene un monómero por unidad asimétrica y los 5 sitios seleno-metionina pudieron encontrarse fácilmente por el programa SOLVE (Terwilliger, T.C. y J. Berendzen, "Automated MAD and MIR structure solution", Acta Cryst. D55: 849-861 (1999)). Las estadísticas siguientes se obtuvieron a partir del mismo programa como se muestra en la Tabla 9.

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TABLA 9 Figura de Mérito (FOM) y estimaciones de los errores del cierre (LOC) como función de la resolución de la solución encontrada con SOLVE

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El mapa de densidad electrónica resultante sólo pudo mejorarse ligeramente por modificación de densidad como se implementa en el programa DM (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta. Cryst. D50, 760-763 (1991)).

La cadena polipeptídica se trazó fácilmente utilizando el mapa mejorado y según los 5 sitios Seleno-metionina. Más del 90% de la secuencia de aminoácidos se trazó con una confianza relativamente alta. La co-localización de los dos restos de cisteína propuestos para el sitio activo (Cys82 y Cys204, distancia C\alpha-C\alpha 7,6 \ring{A}) validó el trazado de la cadena. Análisis adicionales de este sitio activo potencial, confirmaron que, de hecho, un alto número de restos conservados estaban localizados en el mismo sitio. Además, la densidad electrónica correspondiente al sustrato unido, L-glutamato, se encontró entre las dos cisteínas conservadas.

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D. Refinamiento de la Estructura del Cristal

Se llevó a a cabo un primer ciclo de refinamiento utilizando el programa CNS (Crystallography & NMR System, Acta. Cryst. D54: 905-921 (1998)). Después de terminar la construcción del modelo para átomos de proteína, se consiguió un valor R de 0,24 y un valor R-libre de 0,27. En este punto del refinamiento se introdujo un conjunto de datos nativo de alta resolución a 1,9 \ring{A}. El refinamiento adicional proporcionó una construcción de modelo final que consiste en una cadena polipeptídica de 265 restos de aminoácidos (restos 20-285), un L-glutamato, una UDP-MurNAc-Ala y 221 moléculas de agua ordenadas. El valor final fue R = 0,2185 y R-libre = 0,2440.

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Ejemplo 3 Clonación y Caracterización de MurI de E. faecalis y S. aureus, y E. faecium

Los genomas de E. faecalis y S. aureus, y E. faecium contienen marcos de lectura abiertos (ORF) con homología con el gen MurI de Staphylococcus haemolyticus (dga) (Número de registro NCBI U12405) y con el gen MurI de E. coli que codifica la actividad MurI en ese organismo.

Para evaluar si estos ORF codifican una proteína con actividad MurI, se aisló el gen mediante clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se sobreexpresó en E. coli y se purificaron las proteínas hasta una homogeneidad aparente. Se desarrolló un ensayo sencillo para detectar la actividad MurI que resulta en la isomerización de ácido D-glutámico en ácido L-glutámico para facilitar la purificación y para utilizarse en el futuro como un cribado de fármacos de alto rendimiento.

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Clonación del gen murI de E. faecalis y S. aureus que codifica MurI

Se aisló una secuencia de ADN de 822 pares de bases que codifica el gen murI de E. faecalis mediante clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AAATAGTCATATGAAAATAGGCGTTTTTG-3' (SEQ ID NO: 67)) que codifica un sitio de restricción NdeI y el extremo 5' del gen murI y un cebador (5'-AGAATTCTATTACAATTTGAGCCATTCT-3' (SEQ ID NO: 68)) que codifica un sitio de restricción EcoRI y el extremo 3' del gen murI para amplificar el gen MurI de E. faecalis utilizando ADN genómico preparado a partir de la cepa de tipo ATCC 29212 de E. faecalis como ADN molde para las reacciones de amplificación por PCR. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., editores, 1994).

Se aisló una secuencia de ADN de 801 pares de bases que codifica el gen murI de S. aureus mediante clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AAATAGTCATATGAAAATAGGCGTTTTTG-3' (SEQ ID NO: 67)) que codifica un sitio de restricción NdeI y el extremo 5' del gen murI y un cebador (5'-AGAATTCTATTACAATTTGAGCCATTCT-3' (SEQ ID NO: 68)) que codifica un sitio de restricción EcoRI y el extremo 3' del gen murI para amplificar el gen MurI de S. aureus utilizando ADN genómico preparado a partir de la cepa de tipo ATCC 25923 de S. aureus como ADN molde para las reacciones de amplificación por PCR. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., editores, 1994).

Se aisló una secuencia de ADN de 913 pares de bases que codifica el gen murI de E. faecium mediante clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó un cebador oligonucleotídico sintético (5'-AAATAGTCATATGAAAATAGGCGTTTTTG-3' (SEQ ID NO: 67)) que codifica un sitio de restricción NdeI y el extremo 5' del gen murI y un cebador (5'-AGAATTCTATTACAATTTGAGCCATTCT-3' (SEQ ID NO: 68)) que codifica un sitio de restricción EcoRI y el extremo 3' del gen murI para amplificar el gen MurI de E. faecium utilizando ADN genómico preparado a partir de la cepa de tipo ATCC 19434 de E. faecium como ADN molde para las reacciones de amplificación por PCR. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., F. Ausubel et al., editores, 1994).

Para amplificar una secuencia de ADN que contiene el gen murI, se introdujo ADN genómico (25 nanogramos) en cada uno de los dos viales de reacción que contienen 1,0 micromol de cada cebador oligonucleotídico sintético, 2,0 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y 1,25 unidades de polimerasas de ADN estables en calor (Amplitaq, Roche Molecular Systems. Inc., Branchburg, NJ, EEUU) en un volumen final de 50 microlitros. Se utilizaron las condiciones de ciclo térmico siguientes para obtener productos de ADN amplificados para el gen MurI utilizando un termociclador Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 2400:

Condiciones para la amplificación de murI de E. faecalis y S. aureus:

Desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos;

30 ciclos a 94ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 90 segundos;

Las reacciones se terminaron a 72ºC durante 7 minutos.

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Condiciones para la amplificación de murI de E. faecium:

Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos;

25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos;

Las reacciones se terminaron a 72ºC durante 7 minutos.

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Después de terminar las reacciones del ciclo térmico, el ADN amplificado se lavó y se purificó utilizando el kit de purificación Qiaquick Spin PCR (Qiagen, Gaithersburg, MD EEUU). La muestra de ADN amplificada se sometió a digestión con las endonucleasas de restricción NdeI y EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA EEUU) (Current Protocols in Molecular Biology, Ibid). Las muestras de ADN de cada una de las dos mezclas de reacción se juntaron y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,0% SeaPlaque (FMC BioProducts, Rockland, ME, EEUU). El ADN se visualizó exponiéndolo a bromuro de etidio e irradiación UV cercana. El ADN amplificado que codifica el gen MurI de H. pylori se aisló a partir de los cortes del gel de agarosa y se purificó utilizando el protocolo del Bio 101 GeneClean Kit (Bio 101 Vista, CA EEUU).

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Clonación de las secuencias de ADN de murI de E. faecalis, S. aureus, y E. faecium en el vector de expresión procariota pET-23

El vector pET-23b puede propagarse en cualquier cepa K-12 de E. coli, por ejemplo, HMS174, HB101, JM109, DH5\alpha, etc., para el propósito de clonar o de preparar plásmidos. Los anfitriones para la expresión incluyen cepas de E. coli que contienen una copia cromosómica del gen para la 17 ARNpolimerasa. Estos anfitriones son lisógenos del bacteriófago DE3, un derivado lambda que posee el gen lacI, el promotor lacUV5 y el gen para la T7 ARNpolimerasa. La T7 ARN polimerasa se induce mediante la adición de isopropil-B-D-tiogalactosidasa (IPTG) y la T7 ARN polimerasa transcribe cualquier plásmido diana tal como pFT-28b, que posee su gen de interés. Las cepas utilizadas en nuestro laboratorio incluyen: BL21 (DE3) (Studier, F,W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., y Dubendorff, LW. Meth. Enzymol. 185: 60-89, 1990). El vector pET-23b (Novagen, Inc., Madison, WI, EEUU) se preparó para la clonación mediante digestión con NdeI y EcoRI (Current Protocols in Molecular Biology, ibid). Después de la digestión, el fragmento de ADN amplificado y purificado mediante gel de agarosa que posee el gen murI se clonó (Current Protocols in Molecular Biology, ibid) en el vector de expresión pET-23b previamente digerido. Los productos de la ligación se utilizaron para transformar la cepa BL21(DE3) de E. coli.

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Transformación de bacterias competentes con plásmidos recombinantes

Se transformaron bacterias competentes, cepa BL21 o cepa BL21(DE3) de E. coli, con el plásmido de expresión recombinante pET23-murI que posee la secuencia clonada de E. faecalis o S. aureus según métodos estándar (Current Protocols in Molecular, ibid). Brevemente, se mezcló 1 microlitro de la reacción de ligación con 50 microlitros de células electrocompetentes y se sometió a un pulso de alto voltaje, después del cual, las muestras se incubaron en 0,45 mililitros de medio SOC (0,5% de extracto de levadura, 2,0% de triptona, 10 mM de NaCl, 2,5 m de KCl, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de MgSO_{4} y 20 mM de glucosa) a 37ºC con agitación durante 1 hora. Las muestras se distribuyeron en placas de agar LB que contienen 100 microgramos/ml de ampicilina para que crezcan toda la noche. Las colonias transformadas de BL21 se seleccionaron y se analizaron para evaluar los insertos clonados como se describe a continuación.

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Identificación de plásmidos de expresión recombinantes pET que poseen secuencias murI

Se analizaron clones individuales de BL2I transformados con pET-23-murI recombinante mediante amplificación por PCR de los insertos clonados utilizando los mismos cebadores directos e inversos específicos para cada secuencia que se utilizaron en las reacciones originales de clonación por amplificación por PCR. La amplificación exitosa verificó la integración de las secuencias de murI en el vector de expresión (Current Protocols in Molecular Biology, ibid).

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Aislamiento y Preparación de ADN plasmídico de los transformantes BL21

Las colonias que poseen vectores pET-23-murI se seleccionaron y se incubaron en 5 ml de medio LB más 100 microgramos/ml de ampicilina toda la noche. Al día siguiente, el ADN plasmídico se aisló y se purificó utilizando el protocolo de purificación de plásmidos de Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EEUU).

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Clonación y expresión del operón groE de E. coli

Se ha demostrado que la co-expresión del gen murI de E. coli con los genes del operón groE de E. coli reduce la formación de cuerpos de inclusión insolubles que contienen MurI recombinante (Ashiuchi, M., Yoshimura, 1., Kitamura, T., Kawata, Y., Nagai, J., Gorlatov, S., Esaki, N. y Soda, K. 1995, J. Biochem. 117: 495-498). El operón groE codifica dos proteínas, GroES (97 aminoácidos) y GroEL (548 aminoácidos), que son chaperonas moleculares. Las chaperonas moleculares cooperan para facilitar el plegamiento de nuevas cadenas polipeptídicas (F. Ulrich Hartl, 1996, Nature Londres 381:571-580).

La secuencia de ADN de 2.210 pb que codifica el operón groE de E. coli (Número de registro NCBI X07850) se aisló por clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizó un cebador oligonucleotídico sintético (5'-GCGAATTCGATCAGAATTTTTTTTCT (SEQ ID NO: 69)) que codifica un sitio de restricción EcoRI y el extremo 5' del operón groE que contiene la región promotora endógena del operón groE y un cebador (5'-ATAAGTACTTGTGAATCTTATACTAG-3' (SEQ ID NO: 70)) que codifica un sitio de restricción ScaI y el extremo 3' del gen groEL contenido en el operón groE para amplificar el operón groE de E. coli utilizando ADN genómico preparado a partir de la cepa MG1655 de E. coli como el ADN molde para las reacciones de amplificación por PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Ibid). Para amplificar, se introdujo una secuencia de ADN que contiene el ADN genómico del operón groE de E. coli (12,5 nanogramos) en cada uno de los dos viales de reacción que contienen 0,5 micromoles de cada cebador oligonucleotídico sintético, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y 2,6 unidades de polimerasas de ADN estables en calor (Expanded High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) en un volumen final de 50 microlitros. Se utilizaron las condiciones de ciclo térmico siguientes para obtener productos de ADN amplificados para el operon groE de E. coli utilizando un termociclador Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR System 9600: cultivo a una concentración final de 1,0 mM. Las células se cultivaron toda la noche para inducir la expresión génica de las construcciones de ADN recombinantes de H. pylori.

Después de la inducción de la expresión génica con IPTG, las bacterias se sedimentaron por centrifugación en una centrífuga Sorvall RC-3B a 3.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos se resuspendieron en 50 mililitros de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M de NaCl y 0,1 mM de EDTA frío (tampón STE). Las células se centrifugaron a 2.000 x g durante 20 min a 4ºC. Los sedimentos se pesaron (peso húmedo medio 6 gramos/litro) y se procesaron para purificar la proteína recombinante como se describe a continuación.

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Procedimiento de purificación para proteínas MurI recombinantes

El sedimento celular de cultivos de 2L se suspendió en 50 ml de tampón de lisis (50 mM de Tris pH 8, 150 mM de NaCl, 1 mM de DL glutamato, 0,1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo) y se lisó con la prensa de French (10.000-15.000 psi). Los lisados se centrifugaron a 4ºC (10.000 x g, 30 min) y el sobrenadante se cargó en una columna de agarosa de 5 mL HiTrap quelante (Amersham, Piscutaway, MH, EEUU) cargada con NiSO_{4}. La columna se lavó con 50 mL de tampón de columna 19.100 mM de Tris pH 9, 300 mM de NaCl, 2 mM de DL glutamato). La proteína unida se eluyó utilizando un gradiente por etapas de concentración de imadazol en tampón de columna y la proteína MurI pura (>95%) eluyó a 100-300 mM de imadazol. Las fracciones que contienen MurI se llevaron a 1 mM de ditio-DL-treitol (DTT), se concentraron y se dializaron (4x, 2-4L cada una) con tampón de diálisis (10 mM de Tris pH 8, 0,1 mM de ácido etilen glicol-bis-(2-aminoetiléter-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), 1 mM de DL glutamato, 150 mM de NaCl, 1 mM de tricarboxietil fosfina (TCEP)). El tampón final de diálisis contenía glicerol (10-50% p/v) para el almacenamiento a -80ºC.

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Amplificación de fragmentos internos del gen murI de 9 especies Enterococcales

Con el fin de obtener la secuencia de nucleótidos de los genes murI de otras especies Enterococcales, fue necesario amplificar y secuenciar de novo el ADN ya que las secuencias genómicas no se han elucidado para estas especies. El método utilizado fue diseñar cebadores oligonucleotídicos sintéticos basados en la secuencia de murI de E. faecalis y utilizar la posibilidad de homología de nucleótidos entre especies del mismo género para amplificar murI a partir de especies de Enterococcus relacionadas taxonómicamente.

Se generaron fragmentos de 360 pares de bases de la secuencia codificadora de murI de 9 especies del género Enterococcus por clonación por amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utilizaron dos cebadores oligonucleotídicos sintéticos derivados del gen murI de E. faecalis (5'-AAAATGCTAGTAATCGCATGTAATACCGC-3' (SEQ ID NO: 71) y (5'-TGGGTACAACCTAAAATCAACGTATC-3' (SEQ ID NO: 72) para amplificar el fragmento del gen murI de E. saccharolyticus (ATCC 43076), E. mundtii (ATCC 43186), E. casseliflavus (ATCC 25788), E. favescens (ATCC 49996), E. cecorum (ATCC 43198), E. raffinosus (ATCC 49427), E. malodoratus (ATCC 43197), E. solitarus (ATCC 49428), y E. hirae (ATCC 48043) utilizando ADN genómico como molde para las reacciones de amplificación con PCR. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., R. Ausubel et al., eds., 1994). Para amplificar una secuencia de ADN que contiene el gen murI, se introdujo ADN genómico (50 nanogramos) en un vial de reacción que contiene 1,0 micromol de cada cebador oligonucleotídico sintético, 2,0 mM de MgCl_{2}, 25 microlitros de High Fidelity Platinum PCR Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008, EEUU) hasta un volumen final de 50 microlitros. Se utilizaron las condiciones de ciclo térmico siguientes para obtener productos de ADN amplificados para el gen murI utilizando un termociclador Perkin Elmer Cetus/GeneAmp PCR
System 2400:

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Condiciones para la amplificación de fragmentos de murI Enterococcales:

Desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos;

30 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos.

Las reacciones se terminaron a 72ºC durante 30 minutos.

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Después de terminar las reacciones del ciclo térmico, el ADN amplificado se lavó y se purificó utilizando el kit de purificación Qiaquick Spin PCR (Qiagen, Gaithersburg, MD 20876, EEUU). Los fragmentos purificados se secuenciaron utilizando el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Biosystems, Foster City, CA, 94404, EEUU) y las reacciones se llevaron a cabo en un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA 94404, EEUU).

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Ejemplo 4 Cristalización y Caracterización de MurI de E. Faecalis

La clonación y purificación de MurI de E. faecalis se ha descrito previamente en la Solicitud Provisional EEUU 60/435.272.

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A. Cristalización de MurI de E. faecalis

Los cristales se obtuvieron por difusión de vapor utilizando el método de la gota colgante. ("Protein Crystallization" Terese M. Bergfors (Editor), International University Line, páginas 7-15, 1999).

La proteína se almacenó en alicuotas de 50 microlitros a -80 grados a una concentración de 10 mg/ml en un tampón que contiene 0,2 M de acetato de amonio pH 7,4; 5 mM de ácido D,L-glutámico y 1 mM de hidrocloruro de Tri(2-carboxietil)fosfina (TCEP).

La disolución madre contenía típicamente 200 mM de cloruro de magnesio, 100 mM de Tris pH 7,5 y 20-25% de PEG 4000.

Las gotas se formaron mezclando 2 microlitros de disolución de proteína con 2 microlitros de la disolución madre. Durante la noche aparecieron cristales con forma de placa y alcanzaron un tamaño típico de 0,2 x 0,2 x 0,2 mm en una semana. Se produjo MurI sustituida con Se-Met y se cristalizó en condiciones similares que las de la proteína salvaje (wt). La sustitución de Se-Met se verificó por espectroscopía de Masa. Los cristales seleccionados se incubaron durante 5 segundos en una disolución que contiene 100 mM de Tris pH 7,5, 200 mM de sulfato de amonio, 25% de PEG 4000 y 25% de glicerol y se congelaron rápidamente en una corriente de nitrógeno frío y se ensayaron en un detector propio.

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B. Recogida de Datos

Los cristales difractaron a una resolución de aproximadamente 2,2 \ring{A} utilizando una fuente de rayos X propia (MarResearch 345 mm sistema detector image-plate con rayos X generados en ánodo giratorio Rigaku RU300HB operado a 50 kV y 100 m \ring{A}). Los datos de MAD (MAD = método de fase por Difracción Anómala de Múltiples Longitudes de Onda) (Se-Met) se recogieron en BM14 en ESRF en un cristal crecido a partir de material modificado con Se-Met. Se recogieron tres conjuntos de datos a tres longitudes de onda diferentes (0,9786 \ring{A}, 0,8789 \ring{A} y 0,9184 \ring{A}). Los datos se procesaron, se escalaron y se combinaron utilizando los programas MOSFLM, SCALA, TRUNCATE y SCALEIT (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta. Cryst. D50, 760-763, Yao Jia-xing, (1981). Acta. Cryst. A37, 642-644). Las estadísticas de la colección de datos de MAD se muestran en la Tabla 10.

El cristal pertenece al grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 60,29 \ring{A}, b = 82,08 \ring{A} y c =115,57 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º. Este grupo espacial está englobado por las coordenadas estructurales de la Figura 13.

TABLA 10 Datos de MAD Recogidos en ESRF.BM14; Resolución 2,2 \ring{A} (detector CCD/MOSFLM)

18

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C. Determinación de Fase por MAD

Los sitios de selenio se encontraron con el programa SOLVE (Terwilliger, T.C. y J. Berendzen. ``Automated MAD and MIR structure solution:. Acta Cryst. D55: 849-861 (1999)). El programa encontró una solución basada en nueve sitios que proporcionaron las estadísticas de fase descritas en la Tabla 11. El mapa resultante se interpretó fácilmente y el polipéptido pudo trazarse fácilmente.

TABLA 11 Estadísticas de fase utilizando MLPHARE

19

Más del 90% de la secuencia de aminoácidos se trazó con una confianza relativamente alta a partir del primer mapa utilizando el programa O (T.A. Jones, J.Y. Zou, S.W. Cowan & M. Kjeldgaard, ``Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models:, Acta Cryst. A47: 110-119 (1991)). La co-localización de los dos restos de cisteína propuestos en el sitio activo (Cys76 y Cys185, distancia C\alpha-C\alpha 7,5 \ring{A}) así como los 9 sitios Seleno-Metionina fácilmente identificados validaron el trazado de la cadena.

Los dos monómeros se produjeron independientemente de manera que pudieran observarse fácilmente las diferencias en la posición relativa de los dos dominios principales así como los elementos estructurales secundarios.

El monómero es una estructura de dos dominios en la que cada dominio tiene un plegamiento de tipo alfabeta. Los restos del sitio de unión residen en la interfaz entre los dos dominios.

E. faecalis tiene dos sitios de unión, cada uno en lados opuestos de la cara del dímero. El hecho de que éste sea un dímero biológicamente relevante se confirmó por la conservación de los restos localizados en la interfaz del dímero en la familia de bacterias Gram positivas. Es interesante el hecho de que se encontrara que un sitio de unión se une a D-glutamato, mientras que el otro sitio de unión se une a L-glutamato. Parece que la unión de L-glutamato induce diferencias conformacionales significativas en el sitio activo que aparentemente se propagan a lo largo de la estructura. La proteína tiene aminoácidos que se utilizan para plegar la cadena polipeptídica de nuevo en la estructura para formar prácticamente una cadena adicional en una de las láminas beta.

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D. Refinamiento de la Estructura del Cristal

El modelo inicial se refinó con un protocolo de recocido simulado utilizando dinámicas de ángulo de torsión como se implementa en el programa CNS (Crystallography & NMR System, Acta. Cryst. D54: 905-921 (1998)). Después del primer ciclo de refinamiento, el modelo tenía un valor R de 28,6% y un valor R-libre de 36,8%. La construcción y refinamiento adicionales del modelo rindieron un modelo que comprende 4.243 átomos correspondientes a 2 x 268 aminoácidos, un D-glutamato, un L-glutamato y 184 moléculas de agua ordenadas. Las estadísticas de refinamiento finales para CNS son las siguientes: R final = 0,2045 y R-libre = 0,2567.

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Ejemplo 5 Cristalización y Caracterización de MurI de S. aureus

La clonación y purificación de MurI de S. aureus se ha descrito previamente en la Solicitud Provisional EEUU 60/435.272.

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A. Cristalización de MurI de S. aureus

Los cristales se obtuvieron por difusión de vapor utilizando el método de la gota colgante. ("Protein Crystallization" Terese M. Bergfors (Editor), International University Line, páginas 7-15, 1999).

La proteína se almacenó en alicuotas de 50 microlitros a -80 grados a una concentración de 10 mg/ml en un tampón que contiene 5 mM de ácido D,L-glutámico; aproximadamente 1 mM de TCEP; y aproximadamente 200 mM de acetato de amonio pH 7,4.

La disolución madre contenía típicamente 150 mM de sulfato de amonio y 25% de PEG 8000 y 15% de glicerol.

Las gotas se formaron mezclando 2 microlitros de disolución de proteína con 2 ó 4 microlitros de la disolución madre. En dos días aparecieron cristales con forma de caja y alcanzaron un tamaño típico de 0,3 x 0,2 x 0,2 (mm^{3}), en una semana. Los cristales seleccionados se congelaron rápidamente en una corriente de nitrógeno frío y se ensayaron en un detector propio.

El cristal pertenece al grupo espacial monoclínico C2 y tiene las dimensiones de celda a = 96,43 \ring{A}, b = 88,87 \ring{A} y c = 96,56 \ring{A}, \alpha = 90º, \beta= 109,00º y \gamma = 90º.

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B. Recogida de Datos de MurI de S. aureus

Los cristales difractaron a una resolución de aproximadamente 3,0 \ring{A} utilizando una fuente de rayos X propia (MarResearch 345 mm sistema detector image-plate con rayos X generados en ánodo giratorio Rigaku RU300HB operado a 50 kV y 100 m \ring{A}). La estructura de S. aureus se resolvió con reemplazamiento molecular utilizando el modelo de E. faecalis, de manera que sólo se recogió un conjunto de datos en la línea de luz 711 en MaxLab con una resolución de 2,15 \ring{A}. Los conjuntos de datos se procesaron, se escalaron y se combinaron utilizando los programas MOSFLM, SCALA, TRUNCATE y SCALEIT (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography". Acta. Cryst. D50, 760-763, Yao Jia-xing, (1981). Acta. Cryst. A37, 642-644). Los conjuntos de datos comprendían 169.158 medidas de 41.453 reflexiones únicas proporcionando una multiplicidad de 4,0, una completitud de 98,2% y un R-merge global de 9,9% (34,3% en la parte de mayor resolución).

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C. Determinación de Fase de MurI de S. aureus por reemplazamiento molecular

La estructura se resolvió por reemplazamiento molecular utilizando el programa MOLREP (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta Cryst. D50: 760-763, J. Navaza, Acta Cryst. A50: 157-163 (1994)) y un modelo reducido de un monómero de la estructura previamente resuelta de E. faecalis como modelo de búsqueda. A partir de los dos picos en la función de rotación, se determinó que la proteína MurI de S. aureus era un dímero asimétrico. La solución final a 4 \ring{A} tenía un valor R de 0,44 y una correlación de 0,49. El mapa mostró una densidad clara para las cadenas laterales que son diferentes entre las dos especies lo que confirma una solución correcta.

El modelo se corrigió fácilmente utilizando el programa ONO (T.A. Jones et al. Acta Cryst. A47: 110-119 (1991)) y pudo construirse un modelo correspondiente a los restos 3 a 268 a partir del primer mapa.

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D. Refinamiento de la Estructura de Cristal de S. aureus

El modelo inicial se refinó con un protocolo de recocido simulado utilizando dinámicas de ángulo de torsión como se implementa en el programa CNS (Crystallography & NMR System, Acta. Cryst. D54: 905-921 (1998)). Después de un ciclo de recocido simulado se consiguió un valor R de 0,27 y un valor R-libre de 0,30. El refinamiento y construcción del modelo adicionales proporcionaron un modelo final que consiste en dos cadenas polipeptídicas de 262 aminoácidos (restos 1-262), dos D-glutamatos y 133 moléculas de agua ordenadas. Los valores finales fueron R = 0,2020 y R-libre = 0,2290.

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Ejemplo 6 Cristalización y Caracterización de MurI de E. faecium

La clonación y purificación de MurI de E. faecium se ha descrito previamente en la Solicitud Provisional EEUU 60/435.272.

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A. Cristalización

Los cristales se obtuvieron por difusión de vapor utilizando el método de la gota colgante. (Protein Crystallization, Terese M. Bergfors (Ed.), Published 1999).

La proteína se almacenó a -80ºC a una concentración de 10 mg/ml en un tampón que contiene 200 mM de acetato de amonio pH 7,4, 5 mM de ácido D,L-glutámico y 1 mM de TCEP.

La disolución madre contenía típicamente 100 mM de dihidrógeno citrato de sodio pH 5,6 y (1) 0,6-0,7M de dihidrógeno fosfato de amonio, (2) 200 mM de citrato de trisodio dehidrato y 20% de polietilen glicol 3350, o (3) 200 mM de tartrato de disodio dehidrato y 20% de polietilen glicol 3350.

Se mezclaron dos microlitros de la disolución de proteína con 2 ó 4 microlitros de la disolución madre para hacer gotas. En un día aparecieron cristales bipiramidales y alcanzaron un tamaño típico de 0,3 x 0,3 x 0,2 mm^{3} en una semana.

Un cristal pertenece al grupo espacial monoclínico centrado P3_{1}2_{1} con dimensiones de celda (fosfato) a = b = 85,82 \ring{A} y c = 92,25 \ring{A}, \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 120º; (citrato) a = b = 85,42 \ring{A} y c = 92,91 \ring{A}, \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 120º; y (tartrato) a = b = 85,16 \ring{A} y c = 96,56 \ring{A}, \alpha = 90º, \beta =109º y \gamma = 90º. Los cristales pueden enfriarse rápidamente hasta 95 K directamente de la gota sin la formación de hielo.

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B. Recogida de Datos

Los cristales se evaluaron para difracción utilizando una fuente de rayos X propia (MarResearch 345 mm sistema detector image-plate con rayos X generados en ánodo giratorio Rigaku RU300HB operado a 50 kilovoltios y 100 miliamperios). Se recogieron conjuntos completos de datos en la línea de luz 711 en MaxLab a una resolución de 1,8 \ring{A} (fosfato y citrato) y 2,0 \ring{A} (tartrato). Los conjuntos de datos se procesaron, se escalaron y se combinaron utilizando MOSFLM, SCALA y TRUNCATE (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta Cryst. D50, 760-763). Los conjuntos dedatos incluyen:

Fosfato: 732.191 medidas de 36.792 reflexiones únicas proporcionando una multiplicidad de 19,9, una completitud de 99,4% y un R-merge global de 8,0%;

Citrato: 151.895 medidas de 34.849 reflexiones únicas proporcionando una multiplicidad de 4,4, una completitud de 95,3% y un R-merge global de 4,9%; y

Tartrato: 85.092 medidas de 25.682 reflexiones únicas proporcionando una multiplicidad de 3,3, una completitud de 94,4% y un R-merge global de 6,6%.

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C. Determinación de fase por Reemplazamiento Molecular (MR)

La estructura se resolvió por reemplazamiento molecular utilizando el conjunto de datos del fosfato y el programa MOLREP (The CCP4 Suite: "Programs for Protein Crystallography", Acta Cryst. D50, 760-763, J. Navaza, Acta Cryst. A50, 157-163 (1994) y un modelo reducido de un monómero de la estructura previamente resuelta de E. faecalis como modelo de búsqueda. A partir del único pico principal en la función de rotación resultó obvio que sólo había un monómero en la unidad asimétrica pero con un eje cristalográfico doble creando el mismo dímero como se observa en las estructuras resueltas de E. faecalis y S. aureus. La solución final a 4 \ring{A} tenía un valor R de 0,448 y una correlación de 0,504. El mapa mostró una densidad clara para las cadenas laterales que son diferentes entre E. faecium y E. faecalis lo que confirma una solución correcta.

El modelo incompleto se corrigió manualmente utilizando el programa ONO (T.A. Hones, J.Y. Zou, S.W. Cowan & M. Kjeldgaard, "Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models", Acta Cryst. A47, 110-119 (1991)) y se construyó un modelo correspondiente a los restos 2-273 a partir del primer mapa.

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D. Refinamiento de la Estructura del Cristal

Se llevó a a cabo un primer ciclo de refinamiento utilizando el programa CNS (Crystallography & NMR System. Acta Cryst. (1998) D54: 905-921). Después de un ciclo de recocido simulado se consiguió un valor R de 0,27 y un valor R-libre de 0,30. El refinamiento y construcción adicionales del modelo adicional proporcionaron un modelo final que consiste en una cadena polipeptídica de 271 restos de aminoácidos (restos 1-271 de SEQ ID NO: 48), dos iones fosfato y 250 moléculas de agua ordenadas. Los valores R finales fueron R = 0,1927 y R-libre = 0,2092.

Las estructuras de citrato y tartrato se resolvieron por reemplazamiento molecular utilizando MOLREP y el modelo de fosfato como modelo de búsqueda. Se refinaron hasta una resolución de 1,8 \ring{A} y 2,0 \ring{A} para citrato y tartrato, respectivamente. La estructura de citrato consiste en una cadena polipeptídica de 271 aminoácidos (restos 1-271 de SEQ ID NO: 48), una molécula de citrato y 282 moléculas de agua ordenadas. Los valores R finales fueron R = 0,1991 y R-libre 0,2073. La estructura de tartrato consiste en una cadena polipeptídica de 271 aminoácidos (restos 1-271 de SEQ ID NO: 48), una molécula de tartrato y 296 moléculas de agua ordenadas. Los valores R finales fueron R = 0,2036 y R-libre = 0,244.

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Ejemplo 7 Aislamiento e Identificación de Proteínas MurI Mutantes

Se prepararon diluciones seriadas de dos veces de inhibidores de MurI (AR-B051082, AR-B051076 y
AR-B052184), que variaban de 0,25 a 32 x MIC en medio de agar en triplicado. Después de transferir las células de H. pylori (>10^{8} cfu) a placas, las placas se incubaron a 37ºC en un incubador tri-gas (5% oxígeno, 85% nitrógeno, 10% dióxido de carbono) durante siete (7) días. Las colonias aisladas de placas con concentraciones de compuesto superiores a los niveles MIC se seleccionaron y se transfirieron a medio de agar sin inhibidor, antes de crecerlas en medio de agar que contiene inhibidor para confirmar la adquisición de un fenotipo de resistencia estable.

El ADN cromosómico se extrajo de colonias representativas y el gen murI se amplificó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores molde TGATGCAACAAATGGACGA (SEQ ID NO: 75) y TTACAATTTGAGCCATTC (SEQ ID NO: 76). Las mutaciones en el gen murI se identificaron utilizando secuenciación de ADN. Las muestras de los productos de PCR murI mutantes se transformaron en H. pylori de tipo salvaje y posteriormente se crecieron en medio de agar que contiene inhibidores de MurI a concentraciones superiores a MIC de la cepa salvaje.

El crecimiento confluente en estas placas respecto al control en medio que contiene inhibidor mostrando la presencia de MurI mutada confirmó que la resistencia estaba mediada por la expresión de proteínas MurI mutantes.

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Sobreexpresión y Caracterización de Proteínas Mutantes

Se alteró murI de J99 clonada para codificar la mutación A75T (G223A) o E151K (G451A) utilizando mutágenesis dirigida en el vector de expresión pET23a. Se mostró por transformación que los clones mutados confieren resistencia a AI1244 acrB^{-}. Para la sobreexpresión, las construcciones anteriores se co-transformaron con un plásmido que codifica GroEL en BL21(DE3) y se crecieron en LB con D/L glutamato. La inducción se realizó utilizando 0,5 mM de IPTG a temperatura ambiente una noche. Los niveles de expresión de las proteínas MurI mutadas fueron los mismos que los de MurI salvaje con una solubilidad de aproximadamente 50-80%. Las proteínas expresadas se purificaron utilizando el procedimiento descrito para la proteína MurI salvaje (>20 mg, >99% pura). Los análisis cinéticos de las proteínas MurI mutantes de resistencia fueron medidas en dirección directa (L-Glu \rightarrow D-Glu) e inversa (D-Glu \rightarrow L-Glu). En la dirección directa, no se observó inhibición del sustrato por L-Glu y los valores de velocidad de recambio fueron muy similares a los de la enzima salvaje (k_{cat} \sim90 min^{-1}), pero la K_{M} para L-Glu estaba elevada 10 veces proporcionando una disminución global en la eficacia catalítica (k_{cat}/K_{M}) de 10 veces respecto a la enzima nativa. En la dirección inversa (D-Glu \rightarrow L-Glu) la enzima mutante exhibe una inhibición de sustrato por D-glutamato, pero la constante de inhibición está desplazada > 120 veces respecto a la enzima salvaje (es decir, K_{I,D-Glu A75T} - 680 \muM, K_{I,D-Glu WT} - 5 \muM). Además, la K_{M} para D-Glu para la enzima mutante está elevada respecto a la enzima salvaje (es decir. K_{M,D-Glu A75T} - 280 \muM, K_{M,D-Glu WT} - 70 \muM).

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Ejemplo 8 MAPS

MAPS se ha descrito con detalle anteriormente y se utilizó, por ejemplo, para encontrar unidades estructurales comunes entre MurI de Gram positivas de tres especies de bacterias. Las abreviaturas utilizadas en el ejemplo de MAPS: Sa = S. aureus, Ef = E. faecalis, y Ef2 = E. faecium.

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21

23

25

27

30

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<110> ASTRAZENECA AB et al.

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<120> ESTRUCTURA DE CRISTAL DE LA GLUTAMATO RACEMASA (MURI)

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<130> ASZD-PWO-007

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<140> EEUU03/38977

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<141> 2003-12-08

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<150> 60/435.272

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<151> 2002-12-20

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<150> 60/435.167

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<151> 2002-12-20

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<150> 60/435.087

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<151> 2002-12-20

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<150> 60/435.527

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<151> 2002-12-20

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<160> 76

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<170> Versión PatentIn 3.1

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<210> 1

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 1

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33

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<210> 2

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 2

34

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<210> 3

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 3

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35

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<210> 4

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 4

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36

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<210> 5

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 5

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37

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<210> 6

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 6

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38

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<210> 7

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<211> 749

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(747)

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<400> 7

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39

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<210> 8

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<211> 249

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 8

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40

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<210> 9

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 9

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41

42

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<210> 10

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 10

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43

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<210> 11

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<211> 749

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(747)

\newpage

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<400> 11

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45

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<210> 12

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<211> 249

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 12

47

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<210> 13

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 13

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49

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 14

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51

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 15

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52

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<210> 16

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 16

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53

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<210> 17

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 17

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54

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 18

55

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<210> 19

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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<400> 19

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56

57

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<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

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<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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\vskip1.000000\baselineskip

60

61

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<210> 22

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 22

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62

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<210> 23

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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63

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<210> 24

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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64

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<210> 25

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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65

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<210> 26

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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66

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<210> 27

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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67

68

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<210> 28

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<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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69

70

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<210> 29

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<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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71

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<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 30

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72

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 768

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<212> ADN

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<213> H. pylori

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(768)

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73

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

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<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 32

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74

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 765

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> H. pylori

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(765)

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<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> H. pylori

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<400> 34

77

78

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<210> 35

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<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

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<400> 35

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatagtcat atgaaaatag gcgtttttg

\hfill

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattctat tacaatttga gccattct

\hfill

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcga tcagaatttt ttttct

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataagtactt gtgaatctta tactag

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 858

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

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<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatagtcat atgaaaatag gcgtttttg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattctat tacaatttga gccattct

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 822

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. faecalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. faecalis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 801

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> S. aureus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> S. aureus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 822

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. faecium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. faecium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. saccharolyticus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. saccharolyticus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. mundtii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

90

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. mundtii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. casseliflavus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. casseliflavus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. flavescens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. flavescens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. cecorum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. cecorum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. raffinosus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. raffinosus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. malodoratusi

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. malodoratusi

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. solitarus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. solitarus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. hirae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. hirae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatagtcat atgaaaatag gcgtttttg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattctat tacaatttga gccattct

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaattcga tcagaatttt ttttct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataagtactt gtgaatctta tactag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaatgctag taatcgcatg taataccgc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggtacaac ctaaaatcaa cgtatc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 765

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aquifex pyrophilus secuencia de NA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aquifex pyrophilus secuencia de aminoácidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgatgcaaca aatggacga

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttacaatttg agccattc

\hfill

18

Claims (27)

1. Un cristal de MurI de Helicobacter pylori (H. pylori) formando un complejo con un inhibidor y/o un sustrato.

2. Un cristal según la reivindicación 1, en el que el inhibidor está unido a una interfaz molecular de MurI.

3. Un cristal según la reivindicación 2, en el que la interfaz molecular de MurI se selecciona del grupo que consiste en un sitio de unión al sustrato, un sitio de unión al activador, una interfaz intermolecular del dímero, una interfaz intradominio, un sitio de unión al inhibidor y una combinación de éstos.

4. Un cristal según la reivindicación 3, en el que el sitio de unión al sustrato de MurI de H. pylori comprende los restos de aminoácidos: Ser8, Cys70, Thr72, Thr116, Thr119, Glu150, Cys181, Thr182 e His183 de SEQ ID NO: 2

5. Un cristal según la reivindicación 3, en el que la interfaz intermolecular del dímero de MurI de H. pylori comprende los restos de aminoácidos: Ser34, Ala35, Arg36, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Asp43, Pro44, Thr46, Phe50, Lys117, Asn121, Ser143, Leu144, Pro147, Leu148, Glu150, Glu151, Ser152, Ile153, Gly157, Leu158, Thyr161, Cys162, Tyr165, Tyr166, Ser239, Gly240, Asp241 y Trp244 de SEQ ID NO: 2.

6. Un cristal según la reivindicación 3, en el que la interfaz intradominio comprende los restos de aminoácidos: Asp7, Ser8, Gly9, Va110, Gly11, Gly12, Phe13, Ser14, Val15, Ser18, Lys21, Ala22, Val37, Pro38, Tyr39, Gly40, Thr41, Lys42, Asp43, Pro44, Ile47, Ala69, Cys70, Asn71, Thr72, Ser74, Ala75, Leu76, Gly91, Val92, Gly211, Asp212, Ala213, Ile214, Val215, Glu216, Tyr217, Leu218, Gln219, Gln220, Lys221, Glu251, Trp252, Leu253, Lys254 y Leu255 de un primer dominio y los restos de aminoácidos Ile93, Glu94, Pro95, Ser96, Ile97, Leu98, Ala99, Ile100, Arg102, Gln103, Thr116, Lys117, Ala118, Thr119, Ser122, Asn123, Ala124, Tyr125, Ala128, Gln131, Gln132, Ser143, Val146, Pro147, Ile149, Glu150, Glu151, Ser152, Ile178, Leu179, Gly180, Cys181, Thr182, His183, Phe184, Pre185, Leu186, Ile208, His209, Ser210, Gly211 y Asp212 de un segundo dominio de SEQ ID NO: 2.

7. Un cristal según la reivindicación 3, en el que el sitio de unión al inhibidor comprende los restos de aminoácidos Va110, Gly11, Phe13, De149, Glu151, Ser152, Leu186, Trp244, Gln248 y Trp252 de SEQ ID NO: 2.

8. Un método asistido por ordenador para identificar un agente que es un inhibidor de MurI, que comprende:

(a)

proporcionar a una aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales relativas de un cristal de MurI de H. pylori como se muestra en cualquiera de las Figuras 5-7 o de una interfaz molecular de ésta;

(b)

suministrar a la aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales de un agente que se va a evaluar para determinar si se une a una interfaz molecular de MurI;

(c)

comparar los dos conjuntos de coordenadas y;

(d)

determinar si se espera que el agente se una a una interfaz molecular de MurI;

en el que si se espera que el agente se una a una interfaz molecular de MurI, se ha identificado un agente que es un inhibidor de la actividad MurI.

9. Un método asistido por ordenador para diseñar un inhibidor de la actividad MurI, que comprende:

(a)

suministrar a una aplicación informática de modelado un conjunto de coordenadas estructurales relativas de MurI de H. pylori como se muestra en cualquiera de las Figuras 5-7 o una interfaz molecular de ésta;

(b)

fabricar informáticamente un agente representado por un conjunto de coordenadas estructurales; y

(c)

determinar si se espera que el agente interfiera con MurI, o una interfaz molecular de ésta,

en el que si se espera que el agente interfiera con MurI o una interfaz molecular de ésta, se ha diseñado un inhibidor.

10. Un método para identificar una molécula que se une a MurI que comprende:

(a)

aplicar un algoritmo de modelado molecular tridimensional a las coordenadas atómicas de una interfaz molecular de MurI de H. pylori como se muestra en cualquiera de las Figuras 5-7; y

(b)

cribar electrónicamente las coordenadas espaciales almacenadas de un conjunto de compuestos candidatos frente a las coordenadas espaciales de la interfaz molecular de MurI para identificar compuestos que se unen a la interfaz molecular de MurI.

\newpage

11. Un método para diseñar un compuesto, tomando como base la estructura, que se ajusta a una superficie conservada de MurI que comprende:

(a)

producir una representación generada informáticamente de una superficie conservada de una forma cristalina de MurI, en la que la superficie conservada de una forma cristalina de MurI está representada por las coordenadas estructurales relativas de cualquiera de las Figuras 5-7;

(b)

producir una representación generada informáticamente de una biblioteca de compuestos para evaluar su capacidad de ajustarse a la superficie conservada; y

(c)

determinar si los compuestos de la etapa (b) se ajustan a la superficie conservada,

en el que la forma cristalina de MurI es adecuada para utilizarse en estudios de rayos X.

12. Un método para evaluar la unión in vitro de un inhibidor de MurI identificado en el método asistido por ordenador de cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 que comprende las etapas de:

(a)

cultivar un cultivo de ensayo que comprende un sustrato de MurI, el inhibidor y una bacteria que tiene MurI;

(b)

cultivar el cultivo de ensayo durante un periodo de tiempo tal que la bacteria que tiene MurI en el cultivo se expanda; y

(d)

comparar el crecimiento del cultivo de ensayo con el crecimiento de un cultivo control apropiado,

mediante el que si se inhibe el crecimiento de la bacteria que tiene MurI en el cultivo de ensayo, se ha identificado un agente que se une a MurI, en el que el agente que se une a MurI es un inhibidor.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el cultivo control se cultiva simultáneamente con el cultivo de ensayo.

14. El método de la reivindicación 12, en el que el cultivo control se cultiva antes que el cultivo de ensayo.

15. El método de la reivindicación 12, en el que el cultivo control se cultiva después que el cultivo de ensayo.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8-15 y que comprende además ensayar el agente que se une a MurI para determinar si inhibe MurI, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a)

preparar un cultivo de ensayo de un sustrato, un inhibidor de ensayo y una bacteria atípica;

(b)

preparar un cultivo control de un sustrato y una bacteria atípica;

(c)

cultivar los cultivos de bacterias atípicas durante un periodo de tiempo tal que la bacteria atípica en el cultivo control se expanda; y

(d)

comparar el crecimiento de la bacteria atípica control con el crecimiento del cultivo de ensayo de la bacteria atípica,

mediante el que si se inhibe el crecimiento de la bacteria atípica en el cultivo de ensayo, se ha identificado un agente que se une a MurI, en el que el agente que se une a MurI es un inhibidor.

17. Un cristal según la reivindicación 1 en el que el complejo comprende el grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,14 \ring{A}, b = 81,07 \ring{A} y c = 113,82 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º.

18. Un cristal según la reivindicación 1 en el que el complejo comprende el grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 59,20 \ring{A}, b = 82,40 \ring{A} y c = 106,50 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92.15º y \gamma = 90º.

19. Un cristal según la reivindicación 1 en el que el complejo comprende el grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,28 \ring{A}, b = 78,96 \ring{A} y c = 59,14 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92,64º y \gamma = 90º.

20. Un cristal según la reivindicación 1 en el que el complejo comprende el grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,02 \ring{A}, b = 80,66 \ring{A} y c = 59,18 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92,65º y \gamma = 90º.

21. Un cristal según la reivindicación 1 en el que el complejo comprende el grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 52,61 \ring{A}, b = 78,40 \ring{A} y c = 59,43 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 92,33º, \gamma = 90º.

22. Un cristal según la reivindicación 1 en el que el complejo comprende el grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 62,9 \ring{A}, b = 81,8 \ring{A} y c = 113,6 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º, \gamma = 90º.

23. Un cristal según la reivindicación 1 en el que la glutamato racemasa (MurI) de Helicobacter pylori formando un complejo con un inhibidor y sustrato comprende el grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 61,41 \ring{A}, b = 76,31 \ring{A} y c = 108,92 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º.

24. Un cristal según la reivindicación 1 en el que la glutamato racemasa (MurI) de Helicobacter pylori formando un complejo con un inhibidor y sustrato comprende el grupo espacial ortorrómbico P2_{1}2_{1}2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 60,7 \ring{A}, b = 77,5 \ring{A}, c = 56,6 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 90º y \gamma = 90º.

25. Un cristal según la reivindicación 1 en el que la glutamato racemasa (MurI) de Helicobacter pylori formando un complejo con un inhibidor y sustrato comprende el grupo espacial monoclínico P2_{1} y tiene las dimensiones de celda a = 57,1 \ring{A}, b = 78,0 \ring{A}, c = 58,55 \ring{A}, donde \alpha = 90º, \beta = 97,91º y \gamma = 90º.

26. Un cristal según la reivindicación 1 en el que la glutamato racemasa (MurI) de Helicobacter pylori formando un complejo con un sustrato está representado por las coordenadas estructurales de la Figura 5.

27. Un cristal según la reivindicación 1 en el que la glutamato racemasa (MurI) de Helicobacter pylori formando un complejo con un sustrato e inhibidor está representado por las coordenadas estructurales de la Figura 6.