ES2305813T3 - Compuestos tiomorfolino-esteroidales, el uso de los mismos para la reparacion de medicamentos reguladores de la meiosis, y metodo para prepracion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I (Ver fórmula) en donde en el resto I'' del compuesto I (Ver fórmula) cada enlace entre C 5 y C 6 , entre C 6 y C 7 , entre C 7 y C 8 , entre C 8 y C 9 , entre C 8 y C 14 y entre C 14 y C 15 , independientemente, es un enlace simple o un enlace doble, siendo al menos uno de estos enlaces un enlace doble, con la salvedad de que no existe enlace doble alguno en el esqueleto del esteroide exclusivamente entre C 5 y C 6 , y en donde R4 y R4'' , independientemente, se seleccionan del grupo que comprende hidrógeno y metilo.

Description

Compuestos tiomorfolino-esteroidales, el uso de los mismos para la preparación de medicamentos reguladores de la meiosis, y método para preparación de los mismos.

La invención se refiere a compuestos tiomorfolino-esteroidales farmacéuticamente activos, composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, el uso de estos compuestos para la preparación de una composición farmacéutica adecuada para regular la reproducción, especialmente la meiosis, de un contraceptivo o como fármaco profertilidad, un método para regular la reproducción, v.g. la meiosis, un método para mejorar la posibilidad de la capacidad de un oocito para desarrollarse en un mamífero utilizando estos compuestos, y un método para la preparación de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol.

La meiosis es el suceso exclusivo y final de las células germinales, en el cual está basada la reproducción sexual. La meiosis comprende dos divisiones meióticas. Durante la primera división, tiene lugar el intercambio entre los genes maternos y paternos, antes que los pares de cromosomas se separen en las células hijas. Éstas contienen solamente la mitad del número (1n) de cromosomas y DNA 2c. La segunda división meiótica procede sin una síntesis de DNA. Esta división da por tanto como resultado la formación de las células germinales haploides con DNA 1c
solamente.

Los sucesos meióticos son similares en las células germinales masculinas y femeninas, pero el programa de tiempos y los procesos de diferenciación, que conducen a óvulos y a espermatozoides, difieren profundamente. Todas las células germinales femeninas entran en la profase de la primera división meiótica al principio de su vida, a menudo antes del nacimiento, pero todas ellas se detienen como oocitos más tarde en la profase (estado dictiado) hasta la ovulación después de la pubertad. Así, desde el principio de la vida la hembra tiene un stock de oocitos, de los que se hace uso hasta que se agota el stock. La meiosis en las hembras no se completa hasta después de la fertilización, y da como resultado exclusivamente un óvulo y dos cuerpos polares abortivos por cada célula germinal. En contraste, sólo algunas de las células germinales masculinas entran en meiosis desde la pubertad y dejan una población de células germinales a todo lo largo de la vida. Una vez iniciada, la meiosis en la célula masculina procede sin retardo significativo y produce cuatro espermatozoides.

Se sabe poco acerca de los mecanismos que controlan la iniciación de la meiosis en el macho y en la hembra. Estudios recientes indican que las purinas foliculares hipoxantina y adenosina podrían ser responsables de la detección meiótica en el oocito [S.M. Downs et al., Dev. Biol., 82, 454-458 (1985); J.J. Epplg et al., Dev. Biol., 119, 313-321 (1986); S.M. Downs, Mol. Reprod. Dev., 35, 82-94 (1993)]. La presencia de una sustancia difusible reguladora de la meiosis fue descrita primeramente por Byskov et al., en un sistema de cultivo de gónadas fetales de ratón [A.G. Byskov et al., Dev. Biol., 52, 193-200 (1976)]. Una sustancia activadora de la meiosis (MAS) es secretada por el ovario de ratón fetal, en el cual está teniendo lugar la meiosis, y una sustancia preventiva de la meiosis (MPS) es liberada por el testículo diferenciado morfológicamente con células germinales en reposo, no meióticas. Se sugirió que las concentraciones relativas de MAS y MPS regulan el comienzo, la detención y la reanudación de la meiosis en las células germinales masculinas y femeninas [A.G. Byskov et al., en: The Physiology of Reproduction (compiladores E. Knobil y J.D. Neill), Raven Press, Nueva York (1994)]. Evidentemente, si puede regularse la meiosis, puede controlarse la reproducción. En un artículo reciente [A.G. Byskov et al., Nature, 374, 559-562 (1995)] se describe el aislamiento de ciertos esteroles. Dichos esteroles se aislaron de testículos de toro y de fluido folicular y activan la meiosis del oocito [T-MAS (esterol activador de la meiosis de los testículos) y FF-MAS (esterol activador de la meiosis del fluido folicular): 4,4-dimetil-5\alpha-colesta-8,14,24-trien-3\beta-ol].

Se demostró también que concentraciones micromolares de FF-MAS sintético son capaces de inducir la reanudación de la meiosis de una manera dependiente de la dosis en oocitos de rata que han sido detenidos por el inhibidor de fosfodiesterasa IBMX (3-isobutil-1-metil-xantina) [C. Hegele-Hartung et al., Biol. Reprod., 64, 418-424 (2001)]. Se demostró que este efecto puede observarse cuando se cultivan CEO (oocitos incluidos en cúmulus) y DO (oocitos desnudados) in vitro en presencia de FF-MAS.

Sustancias adicionales que regulan la meiosis se describen en los documentos siguientes.

En WO 98/52965 A1 se describen derivados de 20-aralquil-5\alpha-pregnano activadores de la meiosis.

En WO 00/68245 A1 se describen compuestos esteroidales que son capaces de inhibir la meiosis, por lo que estos compuestos son útiles como contraceptivos en hembras y machos. Estos compuestos son fundamentalmente derivados insaturados de colestano caracterizados por un átomo de hidrógeno en posición 3\beta unidos al átomo de carbono C^{14} del esqueleto de colestano.

En WO 96/00235 A1 se describen esteroles inductores de la meiosis, que se conocen como compuestos intermedios en la biosíntesis del colesterol, así como ciertos esteroles sintéticos estructuralmente afines. Se ha encontrado que estas sustancias regulan la meiosis. Análogamente al colesterol, estos esteroles están provistos de una cadena lateral en C^{17} en el esqueleto del esterol y adicionalmente de al menos un enlace doble \Delta^{7}, \Delta^{8} o \Delta^{8(14)}.

En WO 96/27658 A1 se describe un método de estimulación de la meiosis de una célula germinal, que comprende administrar a la célula in vivo, ex vivo o in vitro una cantidad eficaz de un compuesto, que causa acumulación de una sustancia endógena activadora de la meiosis a un nivel al cual se induce la meiosis. Se describe que tales compuestos que causan acumulación de la sustancia activadora de la meiosis son anfotericina B, aminoguanidina, 3\beta,5\alpha,6\beta-trihidroxicolestano, melatonina, 6-cloromelato-nina y 5-metoxitriptamina, así como otros derivados y agonistas de los mismos. Se informa también que sustancias activadoras de la meiosis son, inter alia, 5\alpha-colestan-3\beta-ol, D-homo-colesta-8,14-dien-3\beta-ol y 22,25-diazacolesterol, 25-aza-24,25-dihidrolanosterol, 24,25-iminolanosterol, 23- y 24-azacolesterol, y derivados de 25-azacolestanol.

En WO 97/00884 A1 y WO 98/28323 A1 se describen sustancias que pueden utilizarse para estimular la meiosis in vitro, in vivo o ex vivo. Los compuestos descritos son en este caso agonistas de sustancias activadores de la meiosis existentes naturalmente y pueden utilizarse por tanto en el tratamiento de la infertilidad que es debida a estimulación insuficiente de la meiosis en hembras y machos. En este documento se describen también algunos compuestos que pueden ser antagonistas de sustancias activadoras de la meiosis existentes naturalmente, de tal modo que estos compuestos pueden ser adecuados para uso como contraceptivos. Los compuestos descritos comprenden, inter alia, 5\alpha-colest-8-eno-3\beta-oles y 5\alpha-colest-8,14-dien-3\beta-oles que, inter alia, pueden estar provistos de un grupo amino en la cadena lateral unida a C^{17} del esqueleto de colesterol, estando unido el grupo amino al esqueleto del esterol por un espaciador C_{4}. Alquilo C_{1}-C_{4} o cicloalquilo C_{3}-C_{6} están unidos al grupo amino.

Adicionalmente, en WO 99/58549 A1 se describen derivados de esterol que son eficaces en la regulación de la meiosis. Se describe que estos compuestos tienen capacidad para reducir la infertilidad en hembras y machos, particularmente en humanos. Los derivados de esterol que son eficaces como sustancias reguladoras son, inter alia, (20R)-20-metil-23-dimetilamino-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol, (20R)-20-metil-23-dimetilamino-5\alpha-pregna-5,7-dien-3\beta-ol, 4,4-dimetil-24-fenilamino-5\alpha-cola-8,14-dien-3\beta-ol, 4,4-dimetil-24-(N,N-dimetilamino)-24-ciano-5\alpha-colesta-8,14-dien-
3\beta-ol y adicionalmente una diversidad de amidas de ácidos 24-oicos de esteroles que tienen uno o más enlaces dobles en el esqueleto de esterol.

En WO 02/079220 A2 se describen compuestos esteroidales que tienen capacidad reguladora de la meiosis, siendo estos compuestos fundamentalmente esteroles que tienen un resto aminometilo o aminoetilo unido a C^{20}. El grupo amino puede ser v.g., un anillo heterocíclico nitrogenado, más específicamente un anillo de piperidina. Un ejemplo de tales compuestos es (20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-4\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol. En general, estos compuestos exhiben un efecto estimulador de la meiosis en oocitos, especialmente en CEOs (= oocitos incluidos en cúmulus). En un ejemplo específico, se describe un compuesto de tiomorfolino.

Derivados de esteroles insaturados que tienen un grupo amino en la cadena lateral en C^{17} han sido descritos también por: J.J. Sheets y L.E. Vickery en: "Active Site-directed Inhibitors of Cytochrome P-450scc" en J. Biol. Chem., Vol. 258 (19), 1983, páginas 11446-11452, con relación al efecto de estos esteroles sobre el citocromo P-450 de escisión de la cadena lateral del colesterol adrenocortical de bovino (P-450 scc). En este documento se describen, inter alia, 22-amino-23,24-bis-nor-col-5-en-3\beta-ol y 23-amino-24-norcol-5-en-3\beta-ol.

Otros derivados insaturados que tienen un grupo amino en la cadena lateral en C^{17} han sido consignados por: A.T. Mangla y W.D. Nes en: "Sterol C-methyl Transferase from Prototheca wickerhamii, Mechanism, - Sterol Specificity and Inhibition", en Bioorg. and Med. Chem. (2000), 8(5), 925-936. En este documento se describe, inter alia, 23-aza-zimosterol.

Se ha descubierto que, cuando se utilizan componentes reguladores de la meiosis descritos previamente, la reanudación de la meiosis ocurre en los oocitos desnudos in vitro. Sin embargo, muchos de estos compuestos eran sólo marginalmente efectivos cuando se estimulaba la meiosis en oocitos rodeados por células granulosas (CEOs). Las tasas adicionales de fertilización in vitro y de retransferencia de las implantaciones de así como del número de fetos vivos al final del embarazo no son suficientemente altos.

Un objeto de la presente invención es encontrar sustancias que son útiles para regular la reproducción, en particular la meiosis, en hembras y machos, especialmente en mamíferos y más específicamente en humanos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una nueva composición farmacéutica que comprende las nuevas sustancias.

Es otro objeto preferido de la presente invención proporcionar un uso de las nuevas sustancias para la preparación de una composición farmacéutica que es adecuada para regular la reproducción, especialmente la meiosis.

Es un objeto adicional de la presente invención mejorar la maduración de los oocitos humanos.

Es otro objeto adicional de la presente invención mejorar la sincronía de la maduración de los oocitos nucleares, citoplásmicos y/o membranosos.

Es otro objeto adicional de la presente invención mejorar la fertilidad de los oocitos.

Es otro objeto adicional de la presente invención mejorar la tasa de implantación de los oocitos por maduración y fertilización humana in vitro.

Es otro objeto adicional de la presente invención disminuir la incidencia de pre-embriones humanos con anormalidades cromosómicas (aneuploidía).

Es otro objeto adicional de la presente invención mejorar la tasa de escisión de los pre-embriones humanos.

Es otro objeto adicional de la presente invención mejorar la calidad de los pre-embriones humanos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para la preparación de las nuevas sustancias.

De acuerdo con la presente invención, los compuestos esteroidales de tiomorfolina de fórmula general I pueden emplearse ventajosamente en la regulación de la reproducción, v.g. la meiosis, en los mamíferos, v.g. en hembras y machos, y en particular en humanos:

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1

en donde en el resto I' del compuesto I

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2

\quad

cada enlace entre C^{5} y C^{6}, entre C^{6} y C^{7}, entre C^{7} y C^{8}, entre C^{8} y C^{9}, entre C^{8} y C^{14} y entre C^{14} y C^{15}, independientemente, es un enlace simple o un enlace doble, siendo al menos uno de estos enlaces un enlace doble, y en donde cada átomo de carbono C^{5}, C^{6}, C^{7}, C^{8}, C^{9}, C^{14} y C^{15} está unido a cada átomo C vecino como máximo por un solo enlace doble, con la salvedad de que no existe enlace doble alguno en el esqueleto del esteroide exclusivamente entre C^{5} y C^{6} (significando esta última condición que los compuestos que tienen exclusivamente un enlace doble \Delta^{5} no están abarcados por la presente invención), y

\quad

en donde

\quad

R^{4} y R^{4'}, independientemente, se seleccionan del grupo que comprende hidrógeno y metilo.

El resto con fórmula general I' en el compuesto esteroidal de acuerdo con la presente invención comprende preferiblemente un solo enlace doble entre C^{8} y C^{14} o dos enlaces dobles conjugados, preferiblemente o bien dos enlaces dobles entre C^{8} y C^{9} y entre C^{14} y C^{15} o dos enlaces dobles entre C^{5} y C^{6} y entre C^{7} y C^{8}.

R^{4} y R^{4'} son preferiblemente radicales iguales, es decir, son ambos hidrógeno o ambos metilo.

Los átomos de hidrógeno restantes pueden estar unidos a los carbonos C^{1}, C^{2}, C^{5}, C^{6}, C^{7}, opcionalmente C^{8}, C^{9}, C^{11}, C^{12}, C^{14}, C^{15}, C^{16} y C^{17}, dependiendo de si los átomos C respectivos forman parte de un enlace doble o no. En C^{10}, C^{13} y C^{18} están unidos grupos metilo al esqueleto del esteroidal y la cadena lateral, respectivamente.

Más preferiblemente, de acuerdo con la presente invención, el compuesto esteroidal se selecciona del grupo que comprende:

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol;

3

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(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8(14)-en-3\beta-ol:

4

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(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol:

5

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(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-pregna-5,7-dien-3\beta-ol:

6

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-5\alpha-pregna-8(14)-en-3\beta-ol:

7

El compuesto de tiomorfolino más preferido de acuerdo con la presente invención es (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol que tiene la fórmula química IA. Así pues, la eficiencia óptima con respecto a la inducción de la maduración de un sistema de cultivo folicular se alcanza con derivados de tiomorfolino si el esqueleto del esteroide comprende un sistema de enlaces dobles \Delta^{8,14} y si R^{4} y R^{4'} son metilo (compuesto IA).

Los nuevos compuestos esteroidales poseen varios centros quirales, por lo que estos compuestos existen en varias formas isómeras. La totalidad de estas formas isómeras están dentro del alcance de la presente invención a no ser que se indique otra cosa en esta memoria.

Sorprendentemente, se ha encontrado que los compuestos de acuerdo con la presente invención tienen un efecto potente de estimulación de la meiosis en los oocitos, especialmente en CEOs, aunque estos compuestos son estructuralmente muy diferentes al esterol FF-MAS. A este respecto, los compuestos de esta invención son superiores a esta sustancia reguladora de la meiosis descrita anteriormente [v.g.: A.G. Byskov et al., Nature, 374, 559-562 (1995)]. Compuestos preferidos de fórmula general I son aquéllos que inducen la rotura de la vesícula germinal al menos 40%, preferentemente al menos 60% y de modo especial al menos 80% cuando se ensayan en un ensayo de oocitos como se describe más adelante en esta memoria.

Los compuestos de acuerdo con la presente invención son superiores a los compuestos descritos con anterioridad en un segundo aspecto: en tanto que FF-MAS no es capaz de inducir la maduración de un sistema de cultivo folicular, los compuestos de la presente invención son capaces de activar la meiosis en esta situación.

Comparados con los compuestos descritos en WO 02/079220 A2, los compuestos tiomorfolino-esteroidales de la presente invención exhiben una actividad estimuladora de la maduración aún más fuerte, especialmente en la fertilización in vitro, y una tasa de retransferencia con éxito mayor en las trompas de una hembra después de fertilización in vitro. Adicionalmente, los nuevos compuestos exhiben propiedades superiores con respecto al número de fetos vivos al final del embarazo si se ha efectuado la retransferencia de los oocitos estimulados. Además, la solubilidad en agua de los compuestos de acuerdo con la presente invención es mejor que la solubilidad de los compuestos de la técnica anterior. Se ha encontrado también que el crecimiento de blastocistos está más estimulado, como ha podido observarse en ratones.

Las ventajas que anteceden de los nuevos compuestos son también ciertas para los compuestos de tiomorfolino de acuerdo con la presente invención cuando se comparan los mismos con los compuestos más eficientes descritos en el documento WO 02/079200 A2, especialmente con (20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto no. 2 en este documento).

Por esta razón, los nuevos compuestos esteroidales pueden emplearse v.g. para uso in vivo así como para uso no-in vivo, que comprende especialmente el uso in vitro. Los compuestos esteroidales son especialmente adecuados para fertilización in vitro y para fertilización in vivo de mamíferos, especialmente de humanos.

Las extraordinarias propiedades de los nuevos compuestos pueden atribuirse a la combinación de características estructurales de los compuestos, es decir fundamentalmente a la posición de los dobles enlaces en el esqueleto del esteroide y el grupo tiomorfolino en la cadena lateral unida al átomo de carbono C^{17} en el esqueleto del esteroide por la vía de un espaciador metileno en el grupo C^{20}-R^{20}.

Compuestos farmacéuticamente aceptables preferibles de la presente invención son las sales de compuestos esteroidales de fórmula general I. Ejemplos de estas sales se enumeran en Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 y siguientes (1977), que se incorpora por la presente por referencia. Ejemplos de dichas sales incluyen sales de ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido fumárico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido metanosulfónico y análogos. Ácidos inorgánicos adecuados que forman sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido succínico, ácido fosfórico y análogos.

Un objeto adicional de la presente invención son composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden al menos un compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, seleccionado del grupo de excipientes que son bien conocidos en la técnica. El excipiente puede ser v.g. al menos un vehículo, diluyente, mejorador de la absorción, conservante, tampón, agente para ajuste de la presión osmótica y la reología del medicamento si la composición farmacéutica es líquida, al menos un agente tensioactivo, disolvente, agente desintegrador de tabletas, micro-cápsulas, carga, aditivo de deslizamiento, colorante, saborizante y otros ingredientes. Estas sustancias se utilizan convencionalmente en la técnica. Los compuestos esteroidales de tiomorfolino de acuerdo con la presente invención están comprendidos preferiblemente en las composiciones farmacéuticas en una cantidad eficaz.

Ejemplos de vehículos sólidos son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, dextrina, lactosa, azúcar, talco, gelatina, pectina, almidón, gel de sílice, tragacanto, metilcelulosa, carboximetil-celulosa sódica, ceras de bajo punto de fusión y manteca de cacao.

Las composiciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles, que pueden administrarse v.g. oralmente, por administración nasal o como ungüento. Tales composiciones líquidas pueden ser también adecuadas para inyección o para uso en conexión con aplicación ex vivo o in vivo. Para administración oral, el líquido puede contener un agente tensioactivo aceitoso y/o lipófilo, y/o un disolvente farmacéuticamente aceptables, que son miscibles con el agua. En este contexto se hace referencia a WO 97/21440 A1.

Las composiciones líquidas pueden contener también otros ingredientes que se utilizan convencionalmente en la técnica, algunos de los cuales se mencionan en la lista anterior. Adicionalmente, una composición para administración transdérmica de un compuesto de la presente invención puede proporcionarse en la forma de un parche. Una composición para administración nasal puede proporcionarse en la forma de una pulverización nasal en forma líquida o en polvo.

Con objeto de mejorar la biodisponibilidad del compuesto esteroidal de tiomorfolino, estos compuestos pueden formularse también como clatratos de ciclodextrina. Para este propósito, los compuestos se mezclan con \alpha-, \beta- o \gamma-ciclodextrina o derivados de la misma.

Pomadas, ungüentos, lociones y otros líquidos para administración externa deben encontrarse en una condición tal que los compuestos esteroidales de tiomorfolino de la presente invención puedan suministrarse al individuo que se encuentra en necesidad de regulación de la meiosis en cantidad suficiente. Para este propósito, el medicamento contiene los excipientes anteriores para regulación de la reología del medicamento y otros aditivos, sustancias adicionales para mejorar la capacidad de permeación de la piel y sustancias dermoprotectoras, tales como acondicionadores y reguladores de la humedad.

El medicamento puede contener también otros principios activos para mejorar o regular la eficacia de los compuestos esteroidales de tiomorfolino o para producir otros efectos deseados del medicamento.

Para administración parenteral, los compuestos esteroidales pueden disolverse o suspenderse en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Los aceites son utilizados en muchos casos en combinación con disolventes, agentes tensioactivos, agentes de suspensión o emulsión, v.g. aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de ricino y análogos. Para la preparación de un medicamento inyectable puede emplearse cualquier vehículo líquido. Estos líquidos contienen también a menudo agentes para la regulación de la viscosidad de los mismos, así como agentes para regular la isotonicidad del líquido.

El compuesto esteroidal de tiomorfolino puede administrarse adicionalmente como un depósito inyectable o como un implante, el cual puede, v.g., administrarse por vía subcutánea, con lo que se hace posible la liberación retardada de los compuestos esteroidales de tiomorfolino. Para este propósito pueden emplearse diversas técnicas, v.g., la administración por medio de un depósito que incluye una membrana que contiene el compuesto activo, o la administración por la vía de un depósito que se disuelve lentamente. Los implantes pueden, v.g., contener polímeros biológicamente degradables o siliconas sintéticas como material inerte.

La dosis del compuesto esteroidal de tiomorfolino a utilizar será determinada por un médico y dependerá entre otras cosas del compuesto esteroidal particular empleado, de la ruta de administración y del propósito de la utilización. En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan poniendo en asociación íntima el compuesto activo con los ingredientes adyuvantes líquidos o sólidos y conformando luego en caso necesario el producto en la formulación deseada.

Usualmente no se administrarán más de 3000 mg por día, preferentemente no más de 350 mg, y en algunos casos preferidos no más de 30 mg de los compuestos esteroidales a los mamíferos, v.g., a los humanos.

La presente invención se refiere también al uso de los compuestos esteroidales de tiomorfolino de fórmula general I para la preparación de una composición que es útil para regular la reproducción, v.g. la meiosis. Esta composición es aplicable preferiblemente como medicamento.

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La presente invención se refiere adicionalmente al uso de los nuevos compuestos esteroidales de tiomorfolino de fórmula general I para la preparación de un contraceptivo o de un fármaco profertilidad.

La presente invención se refiere adicionalmente al uso del compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I para uso no in vivo.

La regulación de la reproducción, v.g. de la meiosis, se utiliza en esta memoria para indicar que los compuestos de acuerdo con la presente invención son especialmente adecuados para estimular la reproducción, v.g., la meiosis, en los mamíferos, especialmente en los humanos, de los oocitos, de tal modo que estos compuestos que son análogos agonistas de una sustancia activadora de la meiosis existente naturalmente (FF-MAS), pueden utilizarse en el tratamiento de la infertilidad que es debida a estimulación insuficiente de la meiosis en hembras y machos.

La ruta de administración de las composiciones que contienen un compuesto de la presente invención puede ser cualquier ruta, que transporte eficazmente el compuesto esteroidal activo a su lugar de acción.

Así pues, cuando los compuestos esteroidales deben administrarse a un mamífero, los mismos se preparan convenientemente en la forma de una composición farmacéutica, que comprende al menos un compuesto esteroidal de tiomorfolino de acuerdo con la presente invención en conexión con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Para uso oral, tales composiciones se encuentran preferiblemente en forma de tabletas o cápsulas.

Los compuestos esteroidales de tiomorfolino pueden sintetizarse análogamente a la preparación de compuestos conocidos. Así pues, la síntesis de los compuestos esteroidales de fórmula I puede seguir los caminos de síntesis bien establecidos descritos en la extensa bibliografía de esteroles y esteroides. La bibliografía siguiente puede utilizarse como fuente principal para la síntesis: L.F. Fieser & M. Fieser: Steroids, Reinhold Publishing Corporation, N.Y., 1959; Rood's Chemistry of Carbon Compounds (compilador: S. Coffrey): Elsevier Publishing Company, 1971; y especialmente el Dictionary of Steroids (compiladores: R.A. Hill, D.N. Kirk, H.L.J. Makin y G.M. Murphy), Chapman & Hall, incorporándose esta bibliografía por la presente por referencia. El último texto citado contiene una larga lista de citas de los documentos originales que abarcan el periodo hasta 1990.

La presente invención se refiere también específicamente a un método para la preparación de (20S)-20-[(tiomorfo-
lin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA), comprendiendo el métodos los pasos metódicos siguientes:

a)

iniciación a partir de (20S)-20-hidroximetil-pregna-4-en-3-ona;

b)

introducción de dos grupos alquilo en C^{4} por alquilación;

c)

reducción del grupo ceto a un grupo hidroxi;

d)

protección del grupo hidroxi resultante con un grupo acilo, preferiblemente con un grupo benzoílo;

e)

introducción de un enlace doble \Delta^{7} por bromación/deshidrobromación;

f)

isomerización del dieno \Delta^{5,7} al dieno \Delta^{8,14} por calentamiento en presencia de ácido;

g)

oxidación del grupo 20-hidroxi a un grupo aldehído;

h)

aminación en condiciones reductoras del grupo aldehído con tiomorfolina y eliminación del grupo benzoílo por reacción de reducción.

El esquema de síntesis correspondiente de este primer método de síntesis se muestra en Fig. 1 (esquema 1). De acuerdo con esto, en primer lugar el grupo hidroxi de la cadena lateral de (20S)-20-hidroximetil-pregna-4-en-3-ona 1 se protege como un sililéter, v.g. como un triisopropilsilil (TIPS)-éter dando como resultado el compuesto 2 (paso a del método). Con objeto de producir el compuesto 3, se introducen dos grupos metilo por alquilación con yoduro de metilo en presencia de una base tal como terc-butóxido de potasio en C^{4} del esqueleto del esteroide (paso b del método). En el paso siguiente, el grupo 3-ceto se reduce con un agente reductor común como hidruro de litio y aluminio o borohidruro de sodio (paso c del método). El alcohol 4 resultante se protege luego, v.g., como un benzoato (compuesto 5; paso d del método). Se introduce después un segundo enlace doble por una secuencia de bromación-deshidrobromación (paso d del método). El sistema diénico \Delta^{5,7} resultante en el compuesto 6 se isomeriza luego al sistema diénico \Delta^{8,14} por calentamiento en presencia de ácido clorhídrico para obtener el compuesto 7 (paso f del método). En este paso catalizado por ácido, únicamente está desprotegido el grupo hidroxi de la cadena lateral, obteniéndose el compuesto 7. Como resultado, una oxidación selectiva del grupo hidroxi en la cadena lateral con peryodinano Dess-Martin da como resultado el aldehído 8 (paso g del método), que sirve como compuesto intermedio para introducir un resto tiomorfolina en la cadena lateral por aminación reductora. Para este propósito pueden utilizarse diferentes agentes reductores tales como borohidruro de sodio o tris-(acetoxi)-borohidruro. Después de la aminación reductora se efectúa la desprotección del grupo 3-benzoato en condiciones reductoras con LiAlH_{4} en un procedimiento de un solo reactor (paso h del método). Como resultado, se obtiene el compuesto esteroidal I de acuerdo con la presente invención.

En lugar de formar el benzoato en el paso d) del método, puede introducirse otro grupo protector acilo tal como v.g. el grupo acetilo. Si se forma el acetato inmediatamente en lugar del benzoato, la desprotección de hidroxi en el paso f) del método tiene lugar no sólo en la cadena lateral, sino también en C^{3}. En este caso, la oxidación selectiva para dar el aldehído respectivo debe realizarse cuidadosamente a fin de prevenir la oxidación del grupo hidroxi en C^{3}. Si se forma en su lugar el benzoato en el paso d) del método, la oxidación puede tener lugar únicamente en el grupo hidroxi de la cadena lateral. Debido al hecho de que después del paso d) del método el producto obtenido cristaliza, si se utiliza un grupo protector benzoato, es posible una purificación más fácil del compuesto intermedio 8. Esto permite adicionalmente llevar a cabo menos pasos de purificación. Por esta razón, se prefiere la formación del benzoato.

En lo que concierne a la síntesis de los compuestos esteroidales sin grupos metilo en C^{4} y/o con otro patrón de enlaces dobles en el esqueleto del esteroide, se hace referencia a WO 02/079220 A2, incorporándose por referencia la descripción respectiva de dicho documento.

Se dan ejemplos para describir más detalladamente la presente invención.

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Ejemplo 1 (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dime-til-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA) a) (20S)-20-[((Triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-4-en-3-ona (Paso a del método)

A una solución de 30 g de (20S)-20-[(hidroximetil]-pregna-4-en-3-ona y 13,5 g de imidazol en 300 ml de diclorometano, se añadieron gota a gota 26 ml de cloruro de triisopropilsililo, a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 20 horas a la misma temperatura y se vertió luego en agua. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. Se reunieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar 45,4 g de (20S)-20-[((triisopropilsilil)oxi)-metil]-pregna-4-en-3-ona bruta como un aceite pardo, que se utilizó sin purificación ulterior.

MS (CI+): 487 (M+H)

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b) (20S)-4,4-Dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5-en-3-ona (Paso b del método)

Una solución de 45,4 g de (20S)-20-[((triisopropil-silil)oxi)metil]-pregna-4-en-3-ona en 320 ml de tetrahidrofurano se añadió a una solución de 42,3 g de terc-butilato de potasio en 950 ml de terc-butanol a una temperatura de 50ºC. La mezcla se agitó durante 10 minutos a la misma temperatura. Se añadieron luego 50 ml de yoduro de metilo y se continuó agitando durante 1 hora. La mezcla de reacción se vertió en agua y se extrajo con acetato de etilo. Se reunieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna para dar 27,3 g de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)-metil]-pregna-5-en-3-ona como un sólido amarillo pálido.

MS (CI+): 515 (M+H)

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c) (20S)-4,4-Dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol (Paso c del método)

A una solución de 27,3 g de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5-en-3-ona en 500 ml de tetrahidrofurano, se añadieron cuidadosamente 1,24 g de hidruro de litio y aluminio en pequeñas porciones a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora y se enfrió luego a 0ºC. Se añadieron sucesivamente 2,5 ml de agua, 2,5 ml de una solución 1 N de hidróxido de sodio y 7,5 ml de agua. La mezcla se filtró sobre celita. El filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna para dar 18,2 g de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropil-silil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol como un sólido amarillo pálido.

MS (CI+): 517 (M+H)

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d) Acetato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropil-silil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol (Paso d del método)

A una solución de 18,2 g de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol en 175 ml de piridina se añadieron a la temperatura ambiente 6,24 ml de anhídrido acético. La mezcla de reacción se agitó durante 20 horas y se vertió luego en una mezcla hielo/ácido clorhídrico. Se extrajo ésta con acetato de etilo. Se reunieron las capas orgánicas, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar 16,2 g de acetato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)-oxi)metil]-pregna-5-en-3-ona como un sólido blanco, que se utilizó sin purificación ulterior.

MS (CI+): 559 (M+H)

e) Acetato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)-oxi)metil]-pregna-5,7-dien-3\beta-ol (Paso e del método)

A una solución de 16,2 g de acetato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol en una mezcla de 100 ml de benceno y 100 ml de hexano, se añadieron 4,93 g de 1,3-dibromo-5,5-dimetil-hidantoína en porciones a 70ºC. Después de 30 minutos, la mezcla se enfrió a 0ºC y se filtró. El filtrado se evaporó a vacío.

Se añadieron al residuo resultante 160 ml de tolueno y 7,8 ml de 2,4,6-trimetilpiridina. La mezcla se calentó a reflujo durante 2,5 horas . Después de enfriar, la mezcla de reacción se lavó con ácido clorhídrico 1 N, solución saturada de bicarbonato de sodio y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en columna para dar 12,5 g de acetato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5,7-dien-3\beta-ol, como un sólido blanco.

MS (CI+): 557 (M+H)

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f) (20S)-4,4,20-Trimetil-pregna-8,14-dien-3\beta,21-diol (Paso f del método)

Una mezcla de 16,1 g de acetato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5,7-dien-3\beta-ol, 210 ml de etanol, 28 ml de benceno y 28 ml de ácido clorhídrico concentrado se calentó a reflujo durante 6 horas . Después de enfriar, la mezcla se vertió en solución saturada de bicarbonato de sodio, se extrajo con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se recristalizó en diclorometano y metanol para dar 4,48 g de (20S)-21-hidroxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-3\beta-ol.

MS (EI+): 358 (M)

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g) (20S)-3\beta-Hidroxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-al (Paso g del método)

A una solución de 1 g de (20S)-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-3\beta,21-diol en 10 ml de diclorometano se añadieron 5,4 ml de una solución 0,5 M de peryodinano Dess-Martin a la temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 1 hora, se vertió en solución saturada de bicarbonato de sodio, se extrajo con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna para dar 230 mg de (20S)-3\beta-hidroxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-al como un sólido blanco.

MS (EI+): 356 (M)

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h) (20S)-20-[(Tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (Paso h del método)

Se añadieron 38 mg de tris(acetoxi)borohidruro a una solución de 42 mg de (20S)-3p-hidroxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-al y 20 \mul de tiomorfolina en 3 ml de tetrahidrofurano a la temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 2 horas, se vertió en solución saturada de bicarbonato de sodio, se extrajo con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna para dar 15 mg de (20S)-20-[(tiomorfolina-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol como un sólido blanco.

MS (EI+): 443 (M)

Los espectros NMR estaban de acuerdo con su estructura.

La estructura se confirmó también por análisis estructural de rayos X.

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Ejemplo 2 Reacción de acuerdo con el esquema de reacción 1, Fig. 1

Las reacciones del Ejemplo 1 se repitieron produciendo el benzoato análogo de los compuestos intermedios 5, 6, 7 y 8. Para este propósito, las condiciones de reacción en los varios pasos del método se modificaron como sigue:

Paso a) del método:

TIPSCl, imidazol, CH_{2}Cl_{2}, temperatura ambiente, tiempo de reacción 4 horas

Paso b) del método:

terc-butilato de potasio, yoduro de metilo, terc-butanol, temperatura ambiente, tiempo de reacción 30 minutos

Paso c) del método:

LiAlH_{4}, tetrahidrofurano, temperatura ambiente, tiempo de reacción 30 minutos

Paso d) del método:

cloruro de benzoílo, piridina, 0ºC, tiempo de reacción 1 hora; cristalización; 52% en 4 pasos

Paso e) del método:

1,3-dibromo-5,5-dimetil-imidazolidi-na-2,4-diona, benceno, hexano, 60ºC, tiempo de reacción 30 minutos; a continuación 2,4,6-trimetilpiridina, tolueno, reflujo, tiempo de reacción 2 horas

Paso f) del método:

HCl, etanol, reflujo, tiempo de reacción 4 horas, cromatografía; 70% en dos pasos

Paso g) del método:

Peryodinano Dess-Martin, CH_{2}Cl_{2}, temperatura ambiente

Paso h) del método:

Tiomorfolina, NaBH(OAc)_{3}, tetrahidrofurano, temperatura ambiente, tiempo de reacción 6 horas; seguido por reacción con LiAlH_{4}, temperatura ambiente; tiempo de reacción 18 horas, cromatografía y cristalización en etanol (2x), rendimiento: 19% en dos pasos y purificación (pureza > 93%).

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El rendimiento global en esta secuencia de reacciones se calculó como 6,9% en los 8 pasos.

La secuencia de reacción detallada y las condiciones de reacción se reseñan más adelante en esta memoria.

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a-d) Benzoato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropil-silil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol (compuesto 5, véase el esquema Fig. 1)

(Pasos a, b, c y d del método)

Este compuesto se sintetizó por analogía a la ruta del acetato descrita en el Ejemplo 1, pasos de método a, b, c, y d, y se describe también en Organic Letters, 5, 1837-1839 (2003). Se realizó solamente una cristalización como paso de purificación después de la benzoilación. El rendimiento global para los pasos a, b, c y d fue 52%.

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e) Benzoato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropil-silil)oxi)metil]-pregna-5,7-dien-3\beta-ol (compuesto 6, véase el esquema Fig. 1)

(Paso e del método)

A una solución de 30,0 g de benzoato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropilsilil)oxi)metil]-pregna-5-en-3\beta-ol en una mezcla de 160 ml de benceno y 160 ml de hexano, se añadieron 9,81 g de 1,3-dibromo-5,5-dimetil-hidantoína en porciones, a 70ºC. Después de 30 minutos, la mezcla se enfrió a 0ºC y se filtró. El filtrado se evaporó a vacío.

Se añadieron al residuo resultante 280 ml de tolueno y 12,7 ml de 2,4,6-trimetilpiridina. La mezcla se calentó a reflujo durante 2,5 horas . Después de enfriar, la mezcla de reacción se lavó con ácido clorhídrico 0,5 N, solución saturada de bicarbonato de sodio y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó a vacío para dar 31,8 g de benzoato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropil)oxi)metil]-pregna-5,7-dien-3\beta-ol bruto, que se utilizó sin purificación ulterior.

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f) (20S)-3\beta-Benzoiloxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-ol (compuesto 7, véase el esquema Fig. 1)

(Paso f del método)

Una mezcla de 31,8 g de benzoato de (20S)-4,4-dimetil-20-[((triisopropil)oxi)metil]-pregna-5,7-dien-3\beta-ol, 467 ml de etanol, 67 ml de benceno y 67 ml de ácido clorhídrico concentrado se calentó a reflujo durante 5 horas . Después de enfriar, se vertió la mezcla en solución saturada de bicarbonato de sodio, se extrajo con diclorometano y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna para dar 15,7 g de (20S)-3\beta-benzoiloxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-ol.

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g) (20S)-3\beta-Benzoiloxi-4,4,2-metil-pregna-8,14-dien-21-al (compuesto 8, véase el esquema Fig. 1) (Paso g del método)

A una solución de 17,6 g de (20S)-3\beta-benzoiloxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-ol en 470 ml de tetrahidrofurano y 4,1 ml de piridina, se añadieron 17,3 ml de peryodinano Dess-Martin a 0ºC. La mezcla se agitó durante 30 minutos, se calentó a temperatura ambiente, se vertió en tampón de citrato de pH 7, se extrajo con diclorometano y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida para dar 17,6 g de (20S)-3\beta-benzoiloxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-al bruto, que se utilizó sin purificación ulterior.

h) (20S)-20-[(Tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto I, véase el esquema Fig. 1) (Paso h del método)

Se añadieron 3,9 g de tris(acetoxi)borohidruro de sodio a una solución de 8,8 g de (20S)-3\beta-benzoiloxi-4,4,20-trimetil-pregna-8,14-dien-21-al bruto y 2,7 ml de tiomorfolina en 400 ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 2 horas, se añadieron luego 10,56 g de hidruro de litio y aluminio en porciones, se extinguió con NaOH y agua, se extrajo con acetato de etilo y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna y dos cristalizaciones consecutivas en etanol para dar 1,67 g de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol como un sólido blanco (1,43 g + 0,24 g, obteniéndose dos cosechas de cristalización).

Todos los compuestos se caracterizaron por ^{1}H-NMR y MS. La prueba final de la estructura de (20S)-20-[(tiomor-
folina-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA) se obtuvo por análisis estructural de rayos X.

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Caracterización química y físico-química y formulación (solubilidad)

Pudo demostrarse que la introducción de una cadena lateral nitrogenada mejora la solubilidad de los compuestos en agua (medida por turbidimetría).

Se encontró que la solubilidad de FF-MAS en agua era solamente < 0,1 mg/l. Se determinó la solubilidad de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA) en agua, encontrándose que era ~ 4 mg/l.

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Maduración y fertilización de los oocitos in vitro (sistemas de ensayo biológicos) a) Ensayo de Oocitos Incluidos en Cúmulus Descripción detallada del ensayo

La activación de los oocitos detenidos en MI puede evaluarse por la desaparición de la vesícula germinal (GV). La desaparición de la GV, denominada rotura de la vesícula germinal (GVB) va seguida por la extrusión del primer cuerpo polar (PB) (C. Grøndahl, J.L. Ottesen, M. Lessi, P. Faarup, A. Murray, FC Grønvald, C. Hegele-Hartung, I. Ahmfelt-Rønne, "Meiosis-activa-ting sterol promotes resumption of meiosis in mouse oocytes cultured in vitro in contrast to related oxysterols", Biol. Reprod., 58, 1297-1302 (1998); C. Hegele-Hartung, J. Kuhnke, M. Lessi, C. Grøndahl, J. Ottesen, H.M. Beier, S. Eisner, U. Eichenlaub-Ritter, "Nuclear and cytoplasmic maturation of mouse oocytes after treatment with synthetic meiosis-activating sterol in vitro", Biol. Reprod., 61, 1362-1372 (1999)).

Se obtuvieron Oocitos Encerrados en Cúmulus (CEOs) a partir de ratones hembra inmaduros (C57BU6J x DBA/2J F1) que pesaban 13-16 gramos, que se mantuvieron a temperatura (20-22ºC), luz (luces encendidas desde las 06:00 hasta las 18:00) y humedad relativa (50-70%) controladas. Los ratones recibieron una inyección intra-peritoneal de 0,2 ml de gonadotropinas que contenían 20 UI FSH. 48 horas después se sacrificaron los animales por dislocación cervical. Se disecaron los ovarios y se aislaron los oocitos en medio Hx (véase más adelante) bajo un esteromicroscopio por rotura manual de los folículos utilizando un par de agujas de calibre 27. Los oocitos incluidos en cúmulus que exhibían una vesícula germinal intacta se pusieron en medio esencial mínimo \alpha (\alpha-MEM sin ribonucleósidos suplementado con 8 mg/ml de Sero-Albúmina Humana (HSA), piruvato 0,23 mM, glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina). Para mantener los oocitos en la etapa de la vesícula germinal, este medio se suplementó con hipoxantina 3 mM, designada como medio Hx.

Se prepararon diluciones de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA) a partir de una solución stock que contenía 1 mg/ml disuelto en etanol. La adición de etanol (3,8 \mul/ml) a los controles no afectaba al nivel de control. Los CEOs (35-45 CEOs en 0,4 ml de medio Hx) se cultivaron en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2} en aire durante 24 horas a 37ºC. Se cultivó en todos los casos un solo pocillo de control (medio idéntico sin adición de compuesto de ensayo) simultáneamente con los pocillos de ensayo.

Hacia el final del periodo de cultivo, se contaron el número de CEOs con vesícula germinal (GV), rotura de la vesícula germinal (GVB) y cuerpos polares (PB), respectivamente. El % de GVB, definido como el porcentaje de CEOs que sufría GVB referido al número total de CEOs en dicho pocillo, se calculó como:

% GVB = (número de GVB + número de PB/número total de CEOs) x 100

El % de PB se definió con el porcentaje de CEOs que presentaban un solo cuerpo polar extrudido referido al número total de CEOs dicho pocillo.

Resultados

Fig. 2 muestra la activación de la meiosis de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA) en CEOs monitorizados por GVB y PB (n = 5; *p < 0,05). El nuevo compuesto IA aumentaba significativamente la activación de la meiosis a 1 \muM (p < 0,01; n = 10), a 3 \muM (p < 0,05; n = 7) y 10 \muM (p < 0,001; n = 6).

Se repitieron los mismos experimentos con los otros compuestos nuevos:

IB: (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8(14)-en-\beta-ol

IC: (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol

ID: (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-pregna-5,7-dien-3\beta-ol y

IE: (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-5\alpha-pregna-8(14)-en-3\beta-ol.

Los resultados de la activación de la meiosis en presencia de hipoxantina (Hx) en CEOs se dan en la Tabla 1. Para cada compuesto se realizaron dos experimentos, y los resultados se compararon con medio Hx como control y FF-MAS a una concentración de 10 \muM.

Adicionalmente, se determinó la dependencia respecto de la concentración de la activación de la meiosis en presencia de Hx en CEOs utilizando el compuesto IE, que era, además del compuesto IA, el compuesto más eficiente ensayado. La dependencia respecto de la concentración de la activación de la meiosis en comparación con la del medio Hx, de FF-MAS y de (20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (descrito en WO 02/079220 A2 como compuesto no. 2) se da en la Tabla 2.

b) Fertilización in vitro (IVF)

Para investigar el efecto de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA) sobre la tasa de IVF, se maduraron CEOs in vitro en presencia o ausencia de este nuevo compuesto con IVF subsiguiente. Como compuestos de control se utilizaron FF-MAS y (20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (descrito en WO 02/079220 A2 como el compuesto no. 2). Dado que los medios para maduración in vitro en un escenario clínico no contendrían hipoxantina, no se utilizó este nuevo compuesto en ningún medio, lo que dio como resultado aproximadamente 100% de activación de la meiosis de los oocitos debida a la maduración meiótica espontánea. Los cambios en la IVF subsiguiente son debidos por tanto probablemente a los efectos de los compuestos de ensayo sobre la maduración citoplásmica.

Se utilizaron como donantes de oocitos ratones hembra inmaduros (C57BU6J x DBA/2JF1) de 21-24 días de edad. Los animales recibieron una inyección i.p. de 10 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) para inducir el crecimiento folicular. Los animales se sacrificaron por dislocación cervical 48 horas después y se disecaron los ovarios. Como donantes de esperma se utilizaron ratones macho de 8 semanas de edad (C57BL6J x DBA/2JF1).

Se aislaron los oocitos de los ovarios por rotura manual de los folículos utilizando un par de agujas de calibre 27. Se seleccionaron oocitos esféricos desnudos (NkO) y CEOs que exhibían una GV intacta, y se pusieron en medio esencial mínimo \alpha (\alpha-MEM sin ribonucleósidos, Gibco BRL, Gaithersburg; Cat. No. 22561) suplementado con 8 mg/ml de seroalbúmina humana (HSA), piruvato 0,23 mM, glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina.

Los oocitos se lavaron tres veces en medio de cultivo sin superposición de aceite en multicápsulas de 4 pocillos que contenían 0,4 ml del medio de cultivo de oocitos respectivo. Los oocitos se cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% CO_{2} en aire en presencia de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto IA), FF-MAS y (20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol, siendo los últimos compuestos de comparación.

El medio de cultivo de oocitos se suplementó con Suero Bovino Fetal (FBS) al 6,4%. Se prepararon soluciones del nuevo compuesto IA y de los dos compuestos de comparación mencionados a partir de una solución stock que contenía 1 mg/ml de compuesto disuelto en etanol absoluto. El grupo de control se cultivó con una cantidad correspondiente de etanol.

Después de un tiempo de cultivo de 18-19 horas, los oocitos se procesaron ulteriormente para fertilización in vitro. Unicamente los oocitos que exhibían GVB o un PB se definieron como "oocitos madurados in vitro". Los oocitos se lavaron brevemente sin compuesto de ensayo alguno y se transfirieron subsiguientemente a las cápsulas de inseminación preparadas con anterioridad, que contenían aproximadamente 600.000 células de esperma capacitadas por cada 500 \mul de medio IVF (obtenido de los epidídimos de ratones macho). Las cápsulas se incubaron luego en condiciones definidas de gas (5% CO_{2} en aire) a 37ºC en un medio de IVF \alpha-MEM modificado suplementado con 8 mg/ml de HSA, piruvato 0,23 mM, 100 UI penicilina/ml y 100 \mug estreptomicina/ml como se ha descrito arriba para maduración de los oocitos.

El examen de los oocitos se realizó 22-24 horas después de la inseminación a fin de comprobar la fertilización y registrar el número de pronúcleos (PN) y embriones en la etapa de 2 células. La tasa de fertilización se determinó como el número de oocitos que habían alcanzado la etapa embrionaria PN o de 2 células, con relación al número total inseminado.

Resultados

Fig. 3 muestra mayores tasas de fertilización de los oocitos de ratón con el nuevo compuesto IA y los dos compuestos mencionados, (20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol (compuesto no. 2) o FF-MAS comparados con el control de vehículo (*p < 0,05; ***p < 0,001; n = 18). Fig. 3a da los valores en porcentaje de los oocitos totales utilizados en el experimento (aproximadamente 100 oocitos por grupo en cada grupo para cada experimento). Fig. 3b proporciona los datos como factor de estimulación normalizado para el grupo de vehículo.

Estudio de Retransferencia

Se realizó la fertilización in vitro como se ha descrito arriba para el experimento IVF.

Un día antes de la retransferencia, se aparearon ratones receptores hembra (madres de acogida) en el estado proestro del ciclo con machos vasectomizados a fin de desencadenar la pseudogestación. Un día después, se realizó una comprobación vaginal. Los animales con un tapón vaginal positivo exento de esperma (apareamiento con éxito) tomaron parte en el estudio. Este día se designó como día 0 de gestación (= día 0 después de la copulación estéril, día 0 p.c.). Se transfirieron 18 embriones de 2 células a la trompa derecha de las madres de acogida el día 0 después de la copulación estéril bajo anestesia. La trompa contralateral se dejó sin utilizar (comprobación para la pseudogestación). Las madres de acogida se sacrificaron el día 19 de la gestación. Se extirparon los fetos y se examinaron. Se extirparon inmediatamente los ovarios y los úteros para registrar el número de sitios de implantación, fetos viables y muertos, así como resorciones. Los úteros aparentemente no preñados se pusieron en una solución acuosa al 10% de sulfuro de amonio durante aproximadamente 10 minutos para teñir los sitios de implantación posibles en el endometrio. Los fetos viables se pesaron individualmente y se determinó su sexo por inspección de sus gónadas.

En una prueba de fertilidad se distribuyeron 269 ratones aleatoriamente en 6 grupos y se implantaron con 7-10 óvulos fertilizados in vitro. La fertilización in vitro tuvo lugar en presencia de vehículo (grupo 1) o de una sustancia (grupos 2 a 6). Los grupos se distribuyeron como se indica en la Tabla 3.

El efecto de aumento de la fertilidad de las sustancias en comparación con el control de vehículo fue objeto de interés principal. Además, se investigó también una mejora comparada con la sustancia FF-MAS.

Las variables de interés primario son el número de puntos de implantación y el número de fetos viables.

Métodos

Debe considerarse que los datos para puntos de implantación así como para fetos viables tienen carácter binario, es decir que pueden expresarse en tasas o en número de éxitos y fallos con respecto al número de óvulos transferidos. Por tanto, métodos como los reseñados por D. Collett: "Modelling Binary Data", 2ª edición, Chapman & Hall/CRC, Boca Raton, constituyen enfoques apropiados para el análisis de los datos.

Dado que las probabilidades para un éxito en un grupo en comparación con las probabilidades para un éxito en otro grupo se prestan por sí mismas a la interpretación de estos datos, el análisis está enfocado en la computación de las relaciones de probabilidad. La relación de probabilidades de un grupo comparado con el otro se define como:

relación de probabilidades (grupo 1, grupo 2) = rp_{1,2} = probabilidades (grupo 1)/probabilidades (grupo 2)

donde las probabilidades de un grupo pueden estimarse por el número de éxitos dividido por el número de fracasos en dicho grupo.

Para llegar a afirmaciones acerca de la significación de cualesquiera hallazgos, los intervalos de confianza de 95% para las relaciones de probabilidad se computan como:

[exp (log(rp_{1,2})/1,96\cdotee(log(rp_{1,2}))); exp (log(rp_{1,2}) + 1,96\cdotee(log(rp_{1,2})))]

donde ee(log(rp_{1,2})) es el error estándar del logaritmo de la relación de probabilidades (véase D. Collett (2003) para la fórmula correspondiente).

Puede afirmarse que las probabilidades de un grupo son significativamente mayores que las probabilidades del otro grupo, si el límite inferior de confianza es mayor que 1.

Comparaciones con el Control de Vehículo

Como base para la computación de las relaciones de probabilidad, se computan el número de éxitos (es decir, el número de puntos de implantación o número de fetos viables) y fallos (es decir, el número de óvulos transferidos menos el número de puntos de implantación o número de fetos viables) para todos los grupos. La Tabla 4 muestra estos números y las probabilidades resultantes para los 6 grupos.

Las relaciones de probabilidad de los 5 grupos en comparación con el control de vehículo y sus intervalos de confianza se muestran en la Tabla 5.

Para el número de puntos de implantación, el compuesto IA muestra una mejora significativa de probabilidades en ambas dosis. Este nuevo compuesto en 1 \muM aumenta las probabilidades de una implantación con éxito en un 51%, mientras que 10 \muM conducen a una probabilidad 55% mejor de una implantación con éxito. Ni FF-MAS ni el compuesto no. 2 ((20S)-20-[(piperidin-1-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol) exhiben una mejora significativa de las probabilidades.

Las probabilidades de éxito en términos de efectos viables se incrementan en un 70% en el caso del compuesto IA en las dosis inferiores. Ninguno de los otros grupos exhibe diferencias significativas respecto al control de vehículo.

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Comparaciones con FF-MAS

Las relaciones de probabilidad de los grupos 3 a 6 en comparación con FF-MAS (grupo 2) y sus intervalos de confianza se muestran en la Tabla 6.

Dado que todos los intervalos de confianza incluyen el valor 1, no puede deducirse diferencia significativa alguna entre los cuatro grupos de sustancias y FF-MAS.

Fig. 4 muestra la tasa de implantación por embrión de 2 células transferido, alcanzando números mayores para el tratamiento con FF-MAS (10 \muM) y los nuevos compuestos IA a 1 \muM y 10 \muM. Los números de crías vivas se dan en Fig. 5. Se registraron de nuevo los números de crías vivas después de tratamiento con FF-MAS y el nuevo compuesto IA (1 \muM y 10 \muM). Las tasas de preñez para cada grupo se muestran en Fig. 6.

El nuevo compuesto IA exhibe sensiblemente un efecto beneficioso tanto en la tasa de 2 células como en la de blastocistos ya a una concentración de 0,1 \muM, que tiende a ser mayor aún para una concentración de 1 \muM.

Debe entenderse que los ejemplos y realizaciones descritos en esta memoria tienen únicamente finalidad ilustrativa, y que podrán ser ideadas diversas modificaciones y cambios a la vista de los mismos así como combinaciones de las características descritas en esta solicitud por las personas expertas en la técnica, las cuales deben considerarse incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en esta memoria se incorporan por la presente por referencia.

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TABLA 1 Activación de la meiosis en presencia de Hx en CEOs

8

TABLA 2 Activación de la meiosis en presencia de Hx en CEOs

9

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TABLA 3

10

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TABLA 4 Éxitos, Fracasos y Probabilidades por Grupo

12

TABLA 5 Relaciones de Probabilidad y Límites de Confianza para Comparación con Control de Vehículo

13

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TABLA 6 Relaciones de Probabilidad y Límites de Confianza para Comparación con FF-MAS

15

Claims (10)

1. Un compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I

16

en donde en el resto I' del compuesto I

17

\quad

cada enlace entre C^{5} y C^{6}, entre C^{6} y C^{7}, entre C^{7} y C^{8}, entre C^{8} y C^{9}, entre C^{8} y C^{14} y entre C^{14} y C^{15}, independientemente, es un enlace simple o un enlace doble, siendo al menos uno de estos enlaces un enlace doble, con la salvedad de que no existe enlace doble alguno en el esqueleto del esteroide exclusivamente entre C^{5} y C^{6}, y

\quad

en donde

\quad

R^{4} y R^{4'}, independientemente, se seleccionan del grupo que comprende hidrógeno y metilo.

2. El compuesto esteroidal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en el resto con fórmula general I' está presente un enlace doble entre C^{8} y C^{14} o están presentes dos enlaces dobles entre C^{8} y C^{9} y entre C^{14} y C^{15} o están presentes dos enlaces dobles entre C^{5} y C^{6} y entre C^{7} y C^{8}.

3. El compuesto esteroidal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, que se selecciona del grupo que comprende:

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol;

18

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8(14)-en-3\beta-ol:

19

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol:

20

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-pregna-5,7-dien-3\beta-ol:

21

(20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-5\alpha-pregna-8(14)-en-3\beta-ol:

22

4. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el compuesto esteroidal de fórmula general I está comprendido en una cantidad eficaz.

6. Un uso del compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de una composición farmacéutica que es útil para regular la reproducción, especialmente la meiosis.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, para uso no-in vivo.

8. Un uso del compuesto esteroidal de tiomorfolino de fórmula general I de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para la preparación de un contraceptivo o de un fármaco profertilidad.

9. Un método para la preparación de (20S)-20-[(tiomorfolin-4-il)metil]-4,4-dimetil-5\alpha-pregna-8,14-dien-3\beta-ol, que comprende

a)

partir de (20S)-20-hidroximetil-pregna-4-en-3-ona;

b)

introducir dos grupos alquilo en C^{4} por alquilación;

c)

reducir el grupo ceto a un grupo hidroxi;

d)

proteger el grupo hidroxi resultante con un grupo acilo;

e)

introducir un enlace doble \Delta^{7} por bromación/deshidrobromación;

f)

isomerizar el dieno \Delta^{5,7} al dieno \Delta^{8,14} por calentamiento en presencia de ácido;

g)

oxidar el grupo 17-hidroxi a un grupo aldehído;

h)

someter a aminación en condiciones reductoras el grupo aldehído con tiomorfolina y eliminar el grupo benzoílo por reacción de reducción.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el grupo acilo es un grupo benzoato.