ES2305816T3 - Transfeccion de celulas sanguineas con mrna para inmunoestimulacion y terapia genetica. - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica que contiene células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo el mRNA como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas.

Description

Transfección de células sanguíneas con mRNA para inmunoestimulación y terapia genética.

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene células sanguíneas o células hematopoyéticas, por ejemplo glóbulos rojos (eritrocitos), granulocitos, células mononucleares (PBMC) y/o plaquetas, junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible, estando transfectadas las células con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno. Además, de acuerdo con la invención se da a conocer un procedimiento para la preparación de la composición farmacéutica arriba mencionada y la utilización de células transfectadas de este modo para la producción de medicamentos o composiciones farmacéuticas para la inmunoestimulación contra los antígenos codificados por el mRNA. Los objetos de la invención sirven sobre todo para la terapia y/o la profilaxis del cáncer o de enfermedades infecciosas, y también se pueden utilizar en la terapia genética.

La terapia genética y la vacunación genética son procedimientos de la medicina molecular, cuyo empleo en la terapia y en la prevención de enfermedades va a tener importantes consecuencias para la práctica médica. Ambos métodos se basan en la introducción de ácidos nucleicos en células o tejidos del paciente, y también en el posterior procesamiento de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir, la expresión de los polipéptidos deseados. En principio, los procedimientos ventajosos se basan en la incorporación directa o indirecta (a través de células adecuadas para la transfección) de (m)RNA codificador de la proteína correspondiente.

Actualmente, en la utilización de mRNA para la vacunación, en particular para la vacunación contra antígenos tumorales, el mRNA codificador del antígeno correspondiente normalmente se transfecta in vitro en células presentadoras de antígeno (profesionales) (en inglés: "antigen presenting cell" APC), en particular células dendríticas (DC) (Boczkowski et al. (1996) J. Exp. Med. 184 (2): 465-472; WO 97/41210). Las DC se obtienen de la sangre del paciente diferenciando monocitos correspondientes en DC mediante la utilización de un cóctel de citoquinas especial. Sin embargo, este procedimiento es largo. Sobre todo, entre la extracción de la sangre y la transfección normalmente transcurren aproximadamente 7 días (es decir, aproximadamente 1 semana de cultivo in vitro para la diferenciación de las DC), por lo que generalmente se requieren 9 días (2 días de maduración de las DC después de la transfección) hasta que las células son inyectadas de vuelta en el paciente. Para este largo intervalo de tiempo es decisiva la duración del cultivo in vitro para la diferenciación de las DC entre la extracción de la sangre y la transfección. Además, durante la producción de DC se han de mantener condiciones GMP (en inglés: "good manufacturing practice"). Por ello, este procedimiento resulta extremadamente costoso, debiendo tenerse también en cuenta que durante la producción de las DC el paciente quizá deba ser alojado por separado.

Por consiguiente, la presente invención tiene por objetivo poner a disposición un nuevo sistema para la inmunoestimulación de pacientes contra antígenos específicos, sobre todo de antígenos de tumores y gérmenes infecciosos, que supere los problemas de los procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica, en particular que evite una producción costosa y cara de APC in vitro.

Este objetivo se resuelve mediante las formas de realización de la presente invención caracterizadas en las reivindicaciones.

De acuerdo con la invención se pone a disposición una composición farmacéutica.

La composición farmacéutica contiene células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible, incluyendo el mRNA como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas.

La presente invención se basa en el sorprendente conocimiento de que para la vacunación de pacientes contra determinados antígenos, que son codificados por el mRNA según la invención, no es necesario diferenciar células sanguíneas, por ejemplo PBMC, obtenidas por ejemplo de la sangre de un individuo, en particular del paciente a tratar, mediante técnicas de cultivo celular costosas, duraderas y caras en una población de células con alta proporción de células presentadoras de antígeno profesionales (en inglés: "antigen presenting cell" APC), en particular células dendríticas (DC), sino que, para lograr una inmunoestimulación con éxito, basta con transfectar células sanguíneas directamente con el mRNA que codifica uno o más antígenos con el fin de obtener una composición farmacéutica que provoca por ejemplo en el propio paciente del que se han obtenido las células sanguíneas, en particular las poblaciones parciales de éstas anteriormente mencionadas, una inmunoestimulación adecuada dirigida preferentemente contra uno o más antígenos de un tumor o contra uno o más antígenos de un germen o agente
patógeno.

Las células sanguíneas, en particular las poblaciones parciales de éstas anteriormente mencionadas, de la composición farmacéutica según la invención se caracterizan principalmente porque contienen una proporción pequeña de APC profesionales diferenciadas, como DC. Preferentemente, cuando están contenidas en la composición farmacéutica de la presente invención, las células transfectadas incluyen menos de un 5%, preferentemente no más de un 2%, de DC.

Por consiguiente, de acuerdo con la invención, por "células sanguíneas" se entiende preferentemente una mezcla o una población enriquecida o esencialmente pura de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares (PBMC) y plaquetas, que procede de sangre total, suero sanguíneo u otra fuente, por ejemplo del bazo o de ganglios linfáticos, y que sólo presenta una pequeña proporción de APC profesionales. Preferentemente, a diferencia del estado actual de la técnica, las células sanguíneas de la presente invención consisten en células sanguíneas frescas, es decir, entre la obtención de las células sanguíneas (en particular la extracción de la sangre) y la transfección sólo transcurre un breve tiempo, por ejemplo menos de 12 horas, preferiblemente menos de 6 horas, de forma más preferente menos de 2 horas y de forma especialmente preferente menos de 1 hora.

Como ya se ha mencionado anteriormente, para la composición farmacéutica según la invención se utilizan preferentemente células sanguíneas procedentes del propio paciente tratado con la composición farmacéutica de la presente invención. Por ello, la composición farmacéutica según la invención contiene preferentemente células sanguíneas autólogas.

De acuerdo con otra forma de realización preferente de la presente invención, el mRNA utilizado para la transfección de las células según la invención incluye un área que codifica como mínimo un antígeno de un tumor o de un agente patógeno o un germen patógeno.

De acuerdo con la invención, el concepto "antígeno de un tumor" significa que el antígeno correspondiente es expresado en células asociadas con un tumor. Por ello los antígenos de tumores según la invención son principalmente los antígenos producidos en las propias células degeneradas. Preferentemente se trata de antígenos localizados en la superficie de las células. No obstante, también son antígenos de tumores aquellos antígenos que son expresados en células que no están degeneradas (o que originalmente no estaban degeneradas), pero que están asociadas con el tumor en cuestión. A este grupo pertenecen, por ejemplo, antígenos relacionados con vasos que alimentan tumores o con su (nueva) formación, en particular los antígenos asociados con la neovascularización o angiogénesis, por ejemplo factores de crecimiento como VEGF, bFGF, etc. Estos antígenos relacionados con un tumor también incluyen antígenos de células del tejido que rodea el tumor. En este contexto se pueden mencionar los antígenos correspondientes de células de tejido conjuntivo, por ejemplo antígenos de la matriz extracelular. Para la inmunoestimulación según la invención, las moléculas de mRNA también pueden representar una biblioteca de cDNA de un tejido tumoral. También se puede tratar de una parte de una biblioteca correspondiente, preferentemente de la parte de la biblioteca de cDNA que codifica los antígenos específicos del tumor.

A continuación se explican detalladamente procedimientos de preparación correspondientes en relación con el procedimiento según la invención para la preparación de la composición farmacéutica.

De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica que contiene células sanguíneas (PBMC, glóbulos rojos, granulocitos y plaquetas) transfectadas con uno o más mRNA se utiliza para la terapia o vacunación, en particular para el tratamiento o la prevención (profilaxis) de enfermedades cancerosas. La vacunación se basa en la introducción de un antígeno (o varios antígenos) de un tumor, en el presente caso de la información genética para el antígeno en forma del mRNA que codifica el antígeno o los antígenos, en las células sanguíneas. El mRNA contenido en la composición farmacéutica se traduce en el antígeno (tumoral) en las células, es decir, se expresa el polipéptido o péptido antigénico codificado por el mRNA modificado, con lo que, después de la introducción de la composición farmacéutica que contiene las células transfectadas, se estimula una respuesta inmune dirigida contra este polipéptido o péptido antigénico. Por consiguiente, en el presente caso de utilización como vacuna genética para el tratamiento del cáncer, la respuesta inmune se logra mediante la introducción de la información genética de antígenos de un tumor, principalmente proteínas, que son expresados exclusivamente en células cancerosas, a través de la administración de una composición farmacéutica según la invención que contiene células sanguíneas, por ejemplo glóbulos rojos, granulocitos, PBMC y/o plaquetas, transfectadas con un mRNA que codifica un antígeno de cáncer de este tipo. De este modo se presentan células inmunes al antígeno o los antígenos de cáncer en el organismo, con lo que se provoca una respuesta inmune que es eficaz contra las células cancerosas.

Por ello, en la vacunación contra un germen patógeno, como un virus, una bacteria o un germen protozoológico, preferentemente se utiliza un antígeno de superficie de un germen de este tipo para la vacunación con ayuda de la composición farmacéutica según la invención que contiene células sanguíneas transfectadas con el mRNA que codifica el antígeno de superficie. Por ello, la composición farmacéutica según la invención también se utiliza principalmente contra enfermedades infecciosas (por ejemplo enfermedades infecciosas virales, como el SIDA (VIH), hepatitis A, B o C, herpes, herpes zoster (varicelas), rubeola (virus de la rubeola), fiebre amarilla, dengue, etc. (Flavivirus), gripe (Influenzavirus), enfermedades infecciosas hemorrágicas (virus de Marburg o virus Ebola), enfermedades infecciosas bacterianas, como la enfermedad de los legionarios (Legionella), úlcera de estómago (Helicobacter), cólera (Vibrio), infecciones por E. coli, infecciones por estafilococos, infecciones por Salmonella o infecciones por estreptococos (tétanos), enfermedades infecciosas protozoológicas (malaria, enfermedad del sueño, leishmaniasis, toxoplasmosis, es decir, infecciones por Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma, y también infecciones clamidiales, por ejemplo por Chlamydia pneumoniae o Chlamydia trachomatis). Preferentemente, en el caso de las enfermedades infecciosas el mRNA también codifica los antígenos de superficie correspondientes con el potencial antigénico más fuerte. En los genes mencionados de gérmenes patógenos u organismos, en particular en caso de genes virales, se trata típicamente de una forma segregada de un antígeno de superficie.

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En el caso de la inmunoestimulación contra un germen patógeno, las moléculas de mRNA transfectadas también pueden incluir una biblioteca de cDNA o una parte de la misma de determinados tipos de células. De acuerdo con la invención, en este caso se utilizan preferentemente bibliotecas (parciales) de cDNA de células infectadas por el agente patógeno. Por ejemplo, en caso de una infección por VIH se puede utilizar una población de mRNA de células T, preferentemente autólogas, infectadas por VIH para lograr una inmunoestimulación contra los productos de los genes huésped regulados hacia arriba por el agente patógeno, en el ejemplo mencionado el
VIH.

Además, de acuerdo con la invención preferentemente se utilizan mRNA codificadores de polipéptidos, consistiendo los polipéptidos en poliepítopes, por ejemplo de los antígenos anteriormente mencionados, en particular antígenos de superficie de gérmenes patógenos u organismos o células tumorales, preferentemente formas proteínicas segregadas.

En su utilización como vacuna, la composición farmacéutica según la invención entra en consideración principalmente para el tratamiento de enfermedades cancerosas (codificando el mRNA preferentemente un antígeno de superficie específico de tumor (TSSA)), por ejemplo para el tratamiento de melanoma maligno, carcinoma de colon, linfomas, sarcomas, carcinoma pulmonar de células pequeñas, blastomas, etc. Los ejemplos específicos de antígenos tumorales son entre otros: 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, \beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LOLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, TEUAML1, TPIIm, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.

De acuerdo con otra forma de realización preferente, el antígeno o los antígenos de un tumor o de un agente patógeno son un poliepítope del antígeno o de los antígenos de un tumor o de un agente patógeno. Un "poliepítope" de un antígeno o de varios antígenos es una secuencia de aminoácidos en la que están representadas varias o muchas regiones del antígeno o de los antígenos, que interactúan con la parte de un anticuerpo a la que se une el antígeno o con un recepto de células T. El poliepítope puede estar completo y no modificado. No obstante, de acuerdo con la presente invención también puede estar modificado, sobre todo para optimizar la interacción de anticuerpo/antígeno o receptor de células T/antígeno. Una modificación con respecto al poliepítope natural puede incluir por ejemplo una deleción, adición y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido. En consecuencia, en el mRNA de la presente invención que codifica el poliepítope modificado se eliminan, añaden y/o sustituyen uno o más nucleótidos con respecto al mRNA que codifica el poliepítope natural.

Además, la composición farmacéutica según la invención se puede utilizar en el marco de la terapia genética, en cuyo caso el RNA codifica por ejemplo una proteína, por ejemplo una enzima, que falta o no está operativa en las células sanguíneas o hematopoyéticas de un paciente.

Para aumentar la estabilidad y la eficacia de transfección del (m)RNA, preferentemente cada uno de los (m)RNA a introducir en las células sanguíneas de la presente invención presenta una o varias modificaciones, en particular modificaciones químicas, que mejoran la transferencia del (m)RNA o de los (m)RNA en las células a transfectar y/o aumentan la expresión del antígeno o los antígenos codificados.

Por ejemplo, en las secuencias hay elementos de secuencia desestabilizadores (DSE) de mRNA eucariotas, a los que se unen proteínas señal que regulan la descomposición enzimática del mRNA in vivo. Por consiguiente, para lograr una estabilización adicional del mRNA, en caso dado en el área que codifica el antígeno o los antígenos de un tumor o de un agente patógeno se llevan a cabo una o más modificaciones con respecto al área correspondiente del mRNA natural, de modo que ya no contenga ningún elemento de secuencia desestabilizador. Evidentemente, de acuerdo con la invención también es preferible eliminar los DSE del mRNA dado el caso presentes en las áreas no traducidas (3'- y/o 5'-UTR).

Estas secuencias desestabilizadoras son por ejemplo secuencias ricas en AU ("AU-RES"), que están presentes en secciones de 3'-UTR de numerosos mRNA inestables (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 a 1674). Por ello, las moléculas de mRNA utilizadas en la presente invención preferiblemente están modificadas con respecto al mRNA natural de tal modo que no presentan ninguna secuencia desestabilizadora de este tipo. Esto también es aplicable a los motivos de secuencia que son reconocidos por posibles endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG, que está incluida en el segmento 3'-UTR del gen que codifica el receptor de transferrina (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980).

Preferentemente, en el mRNA modificado utilizado para la transfección de las células sanguíneas también se eliminan estos motivos de secuencia.

Los especialistas conocen diferentes procedimientos que son adecuados para la sustitución de codones en el mRNA modificado según la invención. En caso de áreas codificadoras más cortas (que codifican péptidos con efecto biológico o antígenos), el mRNA total se puede sintetizar por ejemplo químicamente utilizando técnicas estándar.

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Sin embargo, preferentemente se introducen sustituciones de bases utilizando una matriz de DNA para producir el mRNA modificado con ayuda de técnicas de la mutagénesis selectiva usual (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª edición, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Por consiguiente, en este procedimiento, para producir el mRNA se transcribe in vitro una molécula de DNA correspondiente. Esta matriz de DNA posee un promotor adecuado para la transcripción in vitro, por ejemplo un promotor T7 o SP6, al que siguen la secuencia de nucleótidos deseada para el mRNA a producir y una señal de terminación para la transcripción in vitro. De acuerdo con la invención, la molécula de DNA que constituye la matriz de la construcción de RNA a producir se prepara normalmente mediante reproducción por fermentación y aislamiento subsiguiente como parte de un plásmido replicable en bacterias. Como plásmidos adecuados para la presente invención se pueden mencionar por ejemplo los plásmidos pT7TS (número de acceso GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), la serie pGEM®, por ejemplo pGEM®-1 (número de acceso GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (número de acceso GenBank X65327) (véase también Mezei y Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin y Griffin (eds.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001).

De este modo, utilizando oligonucleótidos de DNA sintéticos cortos que presentan transiciones de cadena simple cortas en los puntos de intersección formados, o empleando genes producidos mediante síntesis química, la secuencia de nucleótidos deseada se puede clonar en un plásmido adecuado mediante métodos de biología molecular conocidos por los especialistas (Maniatis et al., véase más arriba). Después, la molécula de DNA se recorta del plásmido, en el que puede estar presente en copia simple o múltiple, mediante digestión con endonucleasas de restricción.

El mRNA modificado que puede ser utilizado para la transfección de las células sanguíneas puede presentar además una caperuza-5' (un nucleótido guanosina modificado). Como ejemplos de caperuzas se pueden mencionar: m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

De acuerdo con otra forma de realización preferente de la presente invención, el mRNA modificado contiene una cola de poli(A^{+}) de como mínimo aproximadamente 25 nucleótidos, en particular como mínimo aproximadamente 30 nucleótidos, preferentemente como mínimo aproximadamente 50 nucleótidos, de forma más preferente como mínimo aproximadamente 70 nucleótidos, de forma especialmente preferente como mínimo aproximadamente 100 nucleótidos. No obstante, la cola de poli(A^{+}) también puede incluir 200 o más nucleótidos.

Para una traducción eficiente del mRNA también se requiere una unión eficaz de los ribosomas al sitio de unión de ribosomas (secuencia de Kozak: GCCGCCAC-CAUGG, el AUG constituye el codón de iniciación). A este respecto se ha comprobado que un contenido elevado de A/U alrededor de dicho sitio posibilita una unión más eficiente de los ribosomas al mRNA.

También es posible insertar en el mRNA uno o más, así llamados, IRES (en inglés: "internal ribosomal entry side"). Un IRES puede actuar como único sitio de unión de ribosomas, pero también puede servir para la producción de un mRNA que codifica varios (por ejemplo dos) péptidos o polipéptidos que han de ser traducidos independientemente entre sí a las PBMC por los ribosomas (mRNA "multicistrónico" o "policistrónico", por ejemplo bicistrónico)). Las secuencias de IRES utilizables según la invención son por ejemplo las procedentes de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV) o virus de la parálisis cricket (CrPV).

De acuerdo con otra forma de realización preferente de la presente invención, el mRNA presenta en las áreas no traducidas en 5' y/o 3' secuencias estabilizadoras que pueden aumentar la vida media del mRNA en el citosol.

Estas secuencias estabilizadoras pueden presentar una secuencia homóloga en un 100% a las secuencias naturales presentes en virus, bacterias y eucariotas, pero también pueden ser de índole parcial o totalmente sintética. Como ejemplos de secuencias estabilizadoras utilizables en la presente invención se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de \alpha- y \beta-globina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de una secuencia estabilizadora presenta la fórmula general (C/U)CCAN_{x}CCC(U/A)Py_{x}UC(C/U)CC, que está incluida en el 3'UTR del mRNA muy estable que codifica \alpha-globina, \alpha-(I)-colágeno, 15-lipoxigenasa o tirosina-hidroxilasa (véase Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente, estas secuencias estabilizadoras se pueden utilizar de forma individual o en combinación entre sí o con otras secuencias estabilizadoras conocidas por los especialistas.

Para una mayor estabilización del mRNA también es preferible que éste presente como mínimo un análogo de nucleótidos naturales. Esto se debe a que las enzimas que descomponen RNA presentes en las células sanguíneas reconocen preferentemente nucleótidos naturales como substrato. Por consiguiente, mediante la inserción de análogos de nucleótidos se puede dificultar la descomposición del RNA. La inserción de estos análogos, en particular en el área codificadora del mRNA, puede tener un efecto positivo o negativo en la eficiencia de traducción.

En una enumeración en modo alguna definitiva, como ejemplos de análogos de nucleótidos utilizables según la invención se pueden mencionar fosforamidatos, fosforotioatos, peptidonucleótidos, metil-fosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metil-citosina e inosina. La preparación de estos análogos es conocida por los especialistas y se da a conocer por ejemplo en las patentes US 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 y 5,700,642. De acuerdo con la invención, estos análogos pueden estar presentes en áreas no traducidas y en áreas traducidas del mRNA modificado.

Además, la eficacia de la transferencia del mRNA (preferentemente modificado) en las células se puede mejorar si el mRNA está asociado o unido con un agente catiónico o policatiónico, en particular un péptido o proteína correspondiente, antes de la transfección de las células sanguíneas previamente obtenidas. Por ello, antes de la transfección de las PBMC, el mRNA preferentemente está complejado o condensado con un agente de este tipo. En este contexto, la utilización de protamina como proteína policatiónica de unión de ácido nucleico es especialmente eficaz. También es posible utilizar otros péptidos catiónicos o proteínas, como poli-L-lisina, poli-L-arginina o histonas. Este procedimiento para estabilizar el mRNA modificado está descrito en el documento EP-A-1083232, cuyo contenido publicado a este respecto está incluido en toda su extensión en la presente invención. Además, el mRNA para la transfección en las células puede estar asociado o mezclado con otras sustancias para lograr una transferencia eficaz. Como ejemplo se puede mencionar la inclusión en micropartículas o nanopartículas, principalmente las basadas en PLGA (poli(D,L-lactida-co-glicolida)), y lípidos.

De acuerdo con la invención, además del péptido o polipéptido antigénico o eficaz para la terapia genética, el mRNA también puede contener como mínimo otra sección funcional que codifique por ejemplo una citoquina promotora de la respuesta inmune (monoquina, linfoquina, interleuquina o quimioquina, como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-\alpha, IFN-\gamma, GM-CFS, LT-\alpha) o factores de crecimiento, como hGH. Alternativa o adicionalmente, el mRNA previsto para la transfección de las células sanguíneas o células hematopoyéticas, en particular glóbulos rojos, PBMC, granulocitos y/o plaquetas, también puede codificar como mínimo una molécula coestimuladora (por ejemplo CD40, CD80, CD86 o ligando 4-1 BB) y/o como mínimo un factor de transcripción (por ejemplo NF-kappaB o ICSBP (en inglés: "interferon consensus binding protein")), que facilita una expresión especialmente eficaz de moléculas inmunoestimuladoras en las células transfectadas, y/o como mínimo un receptor homing (por ejemplo CCR7), que conduce las células transfectadas por ejemplo a los ganglios linfáticos, y/o como mínimo una molécula suicida (por ejemplo timidina quinasa del virus Herpes Simplex (HSV-tk, citocromo P450 4B1 (cyp4B1) y/o folil-poliglutamato sinteasa (FPGS)), que es expresada en las células transfectadas y que transforma un profármaco normalmente no activo en su forma activa (por ejemplo análogos de nucleósido como ganciclovir o aciclovir a través de HSV-tk y/o 4-ipomeanol o 2-amino-antraceno a través de cyp4B1), o que refuerza el efecto de un agente quimioterapéutico ya eficaz (por ejemplo agentes alquilantes como metotrexato a través de FPGS), induciendo de este modo una muerte celular necrótica y/o apoptósica, lo que conduce a la liberación del contenido celular que incluye el antígeno codificado por el mRNA.

Otro objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir la composición farmacéutica anteriormente definida, que incluye los siguientes pasos:

(a)

obtención de células sanguíneas, y

(b)

transfección in vitro de las células sanguíneas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno.

La obtención de células sanguíneas de un paciente animal o humano tiene lugar por ejemplo mediante procedimientos estándar. Se puede obtener sangre total fácilmente mediante punción de un vaso adecuado. El suero se obtiene de forma conocida mediante coagulación de los componentes sólidos de la sangre. Como ejemplo de una población parcial enriquecida de células sanguíneas se pueden mencionar las PBMC. Normalmente, éstas se aíslan mediante un procedimiento descrito por primera vez por Bøyum (Nature 204: 793-794, 1964; Scan. J. Lab. Clin. Invest. Suppl. 97, 1967). Para ello, generalmente se extrae sangre del individuo y se añade por ejemplo a una solución con una densidad de 1,077 g/ml (25ºC), que contiene normalmente Ficoll y diatrizoato de sodio, para la centrifugación en gradiente de densidad. Durante la centrifugación cuidadosa a temperatura ambiente, las PBMC se acumulan en la capa límite Ficoll/sangre, mientras que los glóbulos rojos y los demás glóbulos blancos se sedimentan. Después se extrae la capa límite con las PBMC y normalmente se lava con un tampón adecuado, por ejemplo PBS estéril. Preferentemente, las PBMC se someten a un breve tratamiento isotónico con una solución acuosa, por ejemplo de cloruro amónico. Finalmente, las PBMC se lavan de nuevo una o más veces con un tampón, como PBS (estéril). En caso dado, las células así obtenidas se pueden guardar bajo condiciones adecuadas, normalmente a -70ºC, hasta su utilización.

De acuerdo con la invención, las células sanguíneas consisten preferentemente en células sanguíneas frescas inmediatamente antes de la transfección, es decir, entre la obtención de las células sanguíneas (en particular la extracción de la sangre) en el paso (a) y la transfección según el paso (b) sólo transcurre un breve tiempo, por ejemplo menos de 12 horas, preferiblemente menos de 6 horas, de forma más preferente menos de 2 horas y de forma especialmente preferente menos de 1 hora.

La transfección de las células sanguíneas también se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos usuales, por ejemplo mediante electroporación o procedimientos químicos, en particular lipofección.

En lo que respecta a las formas de realización preferentes de las células sanguíneas, véanse las explicaciones anteriores referentes a la composición farmacéutica de la presente invención. Del mismo modo, en lo que respecta a las formas de realización preferentes del mRNA en el paso (b) del procedimiento según la invención, véanse las formas de realización correspondientes de la composición farmacéutica según la invención.

De acuerdo con otra forma de realización preferente, después del paso (b) las células transfectadas se someten a un paso (c) para la estimulación con agentes inmunoestimuladores, como LPS, TNF\alpha, ligandos de receptor de tipo peaje ("toll-like") como RNA de cadena doble, DNA estabilizado o CpG, etc.

Como ejemplo de células sanguíneas utilizables según la invención, tal como se ha explicado detalladamente más arriba las PBMC se pueden obtener mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque. En caso necesario se llevan a cabo uno o más pasos de lavado subsiguientes con solución salina tampón fosfato (PBS). La producción de mRNA para la transfección según la invención tiene lugar mediante un procedimiento conocido por los especialistas, principalmente mediante síntesis química o de forma especialmente preferente mediante procedimientos de biología molecular, ya mencionados más arriba.

Como ya se ha mencionado más arriba, durante la transfección in vitro según el paso (b) el mRNA está complejado o condensado con como mínimo un agente catiónico o policatiónico para aumentar la estabilidad del mRNA, lo que conduce a una mayor eficacia de transfección y sobre todo a un aumento de la tasa de expresión en las células transfectadas. Los agentes catiónicos o policatiónicos adecuados son por ejemplo protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina o histonas (a este respecto, véase el contenido de la publicación EP-A-1083232 arriba mencionada).

De acuerdo con una forma de realización preferente, el procedimiento arriba indicado para la producción de la composición farmacéutica anteriormente definida incluye los siguientes pasos:

(1)

producción de una biblioteca de cDNA o de una parte de la misma a partir de tejido tumoral o a partir de células de un paciente infectadas por un agente patógeno;

(2)

producción de una matriz para la transcripción in vitro de RNA mediante la biblioteca de cDNA o una parte de la misma; y

(3)

transcripción in vitro de la matriz.

El tejido tumoral del paciente se puede obtener por ejemplo mediante una simple biopsia. No obstante también se puede preparar mediante extirpación quirúrgica de tejido atacado por el tumor. Del mismo modo, a partir de biopsias de cualquier tejido infectado, por ejemplo de los ganglios linfáticos, se pueden obtener células infectadas por un agente patógeno (evidentemente, de acuerdo con la invención las células también pueden estar afectadas por varios gérmenes). Otras fuentes especialmente adecuadas de células infectadas pueden ser, por ejemplo, sangre, suero, linfa y líquido sinovial. Además, dado el caso también se pueden obtener células infectadas de otros fluidos corporales, como esputo, esperma, líquido vaginal, orina, heces, sudor, etc. Por otra parte, la producción de una biblioteca de cDNA o de una parte de la misma de acuerdo con el paso (1) de la forma de realización preferente del procedimiento de preparación de la presente invención se puede llevar a cabo después de congelar el tejido correspondiente o las células para su almacenamiento, preferentemente a temperaturas inferiores a -70ºC.

Para producir la biblioteca de cDNA o una parte de la misma, primero se lleva a cabo un aislamiento del RNA total de las células de tejido tumoral, por ejemplo de las células infectadas. Por ejemplo en Maniatis et al. (véase más arriba) se describen procedimientos para dicho aislamiento. Además, en el mercado se pueden obtener kits para ello, por ejemplo de la firma Roche AG (por ejemplo el producto "High Pure RNA Isolation Kit"). A partir del RNA total se aísla el poli(A^{+})-RNA correspondiente de acuerdo con un procedimiento conocido por los especialistas (por ejemplo Maniatis et al., véase más arriba). En el mercado también se pueden adquirir los kits correspondientes para ello, por ejemplo el "High Pure RNA Tissue Kit" de la firma Roche AG. A partir del poli(A^{+})-RNA así obtenido se produce después la biblioteca de cDNA (a este respecto véase también por ejemplo Maniatis et al., más arriba). Los especialistas también pueden adquirir en el mercado kits para este paso de la producción de la biblioteca de cDNA, por ejemplo el "SMART PCR cDNA Synthesis Kit" de la firma Clontech Inc.

De acuerdo con el paso (2) de la forma de realización preferente del procedimiento de preparación arriba descrita, a partir de la biblioteca de cDNA (o de una parte de ésta) se sintetiza una matriz para la transcripción in vitro. De acuerdo con la invención, esto se lleva a cabo en particular clonando los fragmentos de cDNA obtenidos en un vector de producción de RNA adecuado. La matriz de DNA adecuada y los plásmidos preferentes según la invención ya han sido indicados más arriba en relación con la producción del mRNA previsto para la transfección de las
células.

Para la transcripción in vitro de la matriz producida en el paso (2) arriba indicado, si ésta se encuentra en forma de (c)DNA plásmido circular primero se linealiza con una enzima de restricción correspondiente. Preferentemente, antes de la transcripción in vitro propiamente dicha, la construcción configurada de este modo se purifica de nuevo, por ejemplo mediante mezclas correspondientes de fenol/cloroformo y/o cloroformo/fenol/alcohol isoamílico. Esto sirve principalmente para asegurar que la matriz de DNA esté libre de proteínas. A continuación se lleva a cabo la síntesis enzimática del RNA a partir de la matriz purificada. Esta subetapa tiene lugar en una mezcla de reacción correspondiente, que contiene la matriz de DNA linealizada y libre de proteínas en un tampón adecuado, al que se añade preferentemente un inhibidor de ribonucleasa, utilizando una mezcla de los trifosfatos de ribonucleótido necesarios (rATP, rCTP, rUTP y rGTP) y una cantidad suficiente de una RNA-polimerasa, por ejemplo polimerasa T7. En este proceso, la mezcla de reacción se encuentra en agua libre de RNasa. Preferentemente, en la síntesis enzimática propiamente dicha del RNA también se añade un análogo CAP. Después de una incubación a 37ºC durante el tiempo correspondiente, por ejemplo 2 horas, la matriz de DNA se descompone mediante adición de DNasa libre de RNasa, para lo que preferentemente se vuelve a incubar a 37ºC.

Preferentemente, el RNA así preparado se precipita mediante acetato amónico/etanol y en caso dado se lava una o varias veces con etanol libre de RNasa. Finalmente, el RNA purificado se seca y, de acuerdo con una forma de realización preferente, se recoge en agua libre de RNasa.

Además, el RNA así producido se puede someter a varias extracciones con fenol/cloroformo o cloroformo/fenol/
alcohol isoamílico.

De acuerdo con otra forma de realización preferente de la presente invención sólo se produce una parte de una biblioteca de cDNA total y se transforma en moléculas de mRNA correspondientes. Por consiguiente, de acuerdo con la invención también se puede utilizar una, así llamada, biblioteca de sustracción como parte de la biblioteca de cDNA total para preparar las moléculas de mRNA según la invención. Una parte preferente de la biblioteca de cDNA del tejido tumoral codifica los antígenos específicos del tumor. En el caso de ciertos tumores ya se conocen los antígenos correspondientes. En el caso de las células infectadas por un agente patógeno (o varios agentes patógenos diferentes), la biblioteca parcial de cDNA codifica preferentemente los productos (polipéptidos) de los genes de la célula (huésped) regulados hacia arriba a causa de la infección. De acuerdo con otra forma de realización preferente, en primer lugar (por ejemplo antes del paso (1) del procedimiento anteriormente definido) se puede determinar la parte de la biblioteca de cDNA que codifica los antígenos específicos del tumor o la parte de la biblioteca de cDNA que codifica los productos de los genes regulados hacia arriba. Preferentemente, esto se lleva a cabo determinando las secuencias de los antígenos específicos del tumor o de los productos de los genes regulados hacia arriba debido a la infección con el agente patógeno mediante una alineación con una biblioteca correspondiente de cDNA de tejido sano o de células no infectadas.

La alineación según la invención incluye principalmente una comparación del patrón de expresión del tejido sano con el del tejido tumoral en cuestión o, en el caso de la inmunoestimulación contra un germen patógeno, una comparación del patrón de expresión de células sanas con el de células infectadas. Los patrones de expresión correspondientes se pueden determinar a nivel de ácido nucleico por ejemplo con ayuda de experimentos de hibridación adecuados. Para ello, por ejemplo, las bibliotecas de (m)RNA o cDNA correspondientes de los tejidos o de las células se pueden separar en cada caso en geles de agarosa o poliacril-amida adecuados, trasladar a membranas e hibridar con sondas de ácido nucleico correspondientes, preferentemente sondas de oligonucleótido, que representen los genes correspondientes (Northern-Blot o Southern-Blot). De este modo, una comparación de las hibridaciones correspondientes permite determinar los genes especialmente adecuados para la inmunoestimulación, es decir, genes expresados exclusivamente por tejido tumoral o expresados con más intensidad dentro de éste, o genes regulados hacia arriba en células infectadas.

De acuerdo con otra forma de realización preferente, los experimentos de hibridación mencionados se llevan a cabo con ayuda de un diagnóstico por microarrays (biochips) (uno o más microarrays). Un microarray de DNA correspondiente incluye una disposición definida, en poco espacio o en el menor espacio posible, de sondas de ácido nucleico, en particular sondas de oligonucleótido, representando cada sonda por ejemplo un gen cuya presencia o ausencia se ha de investigar en la biblioteca de (m)RNA o cDNA correspondiente. En una microdisposición correspondiente pueden estar representados cientos, miles o incluso decenas o centenas de miles de genes. Para analizar el patrón de expresión del tejido correspondiente o de las células correspondientes, el poli(A^{+})-RNA o preferentemente el cDNA correspondiente se marca con un marcador adecuado, para lo que se utilizan en particular marcadores fluorescentes, y se pone en contacto con el microarray bajo condiciones de hibridación adecuadas. Si una especie de cDNA se une a una molécula de sonda presente en el microarray, en particular una molécula de sonda de oligonucleótido, se observa una señal de fluorescencia correspondiente más o menos intensa que puede ser medida con un aparato de detección adecuado, por ejemplo un espectrómetro de fluorescencia correspondientemente diseñado. Cuanto mayor sea la representación de la especie de cDNA (o RNA) en la biblioteca, mayor será la señal, por ejemplo la señal de fluorescencia. El experimento de hibridación con microarray (o varios o muchos de ellos) se lleva (se llevan) a cabo por separado para el tejido tumoral y para el tejido sano, o para las células infectadas y las no infectadas. La diferencia entre las señales seleccionadas de los experimentos con microarray permite deducir qué genes son expresados de forma exclusiva o incrementada por el tejido tumoral, o qué genes están regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno. Por ejemplo en Schena (2003), Microarray Analysis, ISBN 0-471-41443-3, John Wiley & Sons, Inc., New York, se describen análisis con microarray de DNA de este tipo, quedando incluido en la presente invención el contenido correspondiente de dicha publicación en toda su extensión.

Sin embargo, la preparación de patrones de expresión específicos de infección o de tejido tumoral no está limitada en modo alguno al análisis a nivel de ácido nucleico. Evidentemente, los especialistas también conocen procedimientos del estado actual de la técnica que sirven para el análisis de expresión a nivel de proteínas. En este contexto se han de mencionar en particular las técnicas de la electroforesis en gel 2D y la espectrometría de masas, pudiendo combinarse ventajosamente estas técnicas también con biochips de proteína (es decir, microarrays a nivel de proteínas, en los que por ejemplo un extracto proteínico de tejido sano o de tejido tumoral, o de células infectadas o células no infectadas, se pone en contacto con anticuerpos y/o péptidos aplicados sobre el substrato del microarray). En lo que respecta a los procedimientos de espectrometría de masas se han de mencionar principalmente los procedimientos MALDI-TOF ("matrix assisted laser desorption/ionisation-time of flight"). Las técnicas mencionadas para el análisis químico proteínico para la obtención del patrón de expresión de tumores en comparación con tejido sano, o de células infectadas en comparación con células correspondientes no infectadas, se describen por ejemplo en Rehm (2000) Der Experimentator: Proteinbiochemie/Proteomics, Editorial Spektrum Akademischer, Heidelberg, 3ª edición, a cuyo contenido correspondiente se hace referencia explícita expressis verbis en la presente invención. Además, en cuanto a los microarrays de proteínas se remite de nuevo a las explicaciones al respecto dadas en Schena (2003), véase más arriba.

Además de las células transfectadas, la composición farmacéutica según la invención contiene uno o más excipientes farmacéuticamente compatibles y/o uno o más vehículos farmacéuticamente compatibles. Los excipientes o vehículos adecuados son preferentemente medios estériles o soluciones tampón adaptados a las células sanguíneas correspondientes.

En "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980), cuyo contenido completo forma parte de la exposición de la presente invención, se dan a conocer métodos para la formulación y producción adecuada de las composiciones farmacéuticas según la invención. Como excipientes para la administración parenteral, además de agua estéril, soluciones tampón estériles o medios estériles, también entran en consideración polialquilén-glicoles, naftaleno hidrogenado y principalmente polímeros de lactida biocompatibles, copolímeros de lactida/glicolida o copolímeros de polioxietileno/polioxipropileno. Las composiciones según la invención pueden contener sustancias de relleno o sustancias como lactosa, manitol, sustancias para el enlace covalente de polímeros, como por ejemplo polietilén-glicol, complejación con iones metálicos o inclusión de materiales en o sobre preparaciones especiales de compuestos poliméricos, como por ejemplo polilactato, ácido poliglicólico, hidrogel, o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, fragmentos de eritrocitos o esferoplastos. Las formas de realización correspondientes de las composiciones se eligen en función de comportamientos físicos, por ejemplo teniendo en cuenta la solubilidad, la estabilidad, la biodisponibilidad o la degradabilidad. La liberación controlada o constante de los componentes de principio activo según la invención en la composición incluye formulaciones basadas en depósitos lipófilos (por ejemplo ácidos grasos, ceras o aceites). En el marco de la presente invención también se dan a conocer revestimientos de sustancias o de composiciones según la invención que contienen estas sustancias, a saber: revestimientos con polímeros (por ejemplo poloxámeros o poloxaminas). Además, las sustancias o composiciones según la invención también pueden presentar revestimientos protectores, por ejemplo inhibidores de proteasa o amplificadores de permeabilidad. Los excipientes acuosos preferentes son por ejemplo agua para inyección (WFI) o agua tamponada con fosfato, citrato o acetato, etc., o medios celulares correspondientes, ajustándose el pH típicamente a un valor de 5,0 a 8,0, preferentemente de 6,0 a 7,0. Preferentemente, el o los excipientes, o el o los vehículos, contendrán adicionalmente componentes salinos, por ejemplo cloruro sódico, cloruro potásico u otros componentes, que hacen que la solución por ejemplo se vuelva isotónica.

Además de los componentes anteriormente mencionados, el o los excipientes, o el o los vehículos, también pueden contener componentes adicionales, como suero bovino fetal, factores de crecimiento, albúmina sérica humana (HSA), polisorbato 80, azúcares o aminoácidos.

El modo de administración y la dosificación de la composición farmacéutica según la invención dependen de la enfermedad a tratar y el estado de avance de la misma, y también del peso corporal, la edad y el sexo del paciente.

Por consiguiente, la concentración de las células transfectadas en este tipo de formulaciones puede variar dentro de amplios márgenes, por ejemplo de 5 x 10^{4} a 1 x 10^{8} células/ml. La composición farmacéutica según la invención se administra al paciente preferentemente por vía parenteral, por ejemplo intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular. Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede inyectar localmente, por ejemplo en un tumor.

En consecuencia, de acuerdo con la invención también se pone a disposición un procedimiento para la producción de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cancerosas o enfermedades infecciosas, por ejemplo de las enfermedades anteriormente mencionadas, o un procedimiento de vacunación para la prevención de dichas enfermedades, incluyendo estos procedimientos la administración de la composición farmacéutica según la invención a un paciente, en particular a un ser humano.

De acuerdo con una forma de realización preferente del procedimiento de tratamiento o vacunación, o en la utilización anteriormente definida de las células sanguíneas transfectadas según la invención, es decir, una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas, para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas o enfermedades infecciosas, al paciente se le administran una o más citoquinas y/o una o mas moléculas coestimuladoras además de la composición farmacéutica según la invención.

En lo que respecta a las especies administradas de forma adicional, véanse las realizaciones arriba descritas en relación con las moléculas codificadas adicionalmente junto con el o los antígenos del mRNA.

Por consiguiente, de acuerdo con la invención también se pone a disposición en general un procedimiento de tratamiento o vacunación que incluye la administración de las células sanguíneas transfectadas según la invención y como mínimo una citoquina, por ejemplo una o más de las citoquinas anteriormente mencionadas, en particular GM-CSF, a un paciente, en particular a un ser humano. El procedimiento sirve principalmente para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas correspondientes (por ejemplo las enfermedades cancerosas arriba indicadas) o enfermedades infecciosas. En consecuencia, la presente invención también está orientada en general a una composición farmacéutica que incluye células transfectadas (tal como se definen más arriba) y como mínimo una citoquina, por ejemplo una o más de las citoquinas arriba mencionadas, como GM-CSF, preferentemente junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente compatible. Por consiguiente, de acuerdo con la invención también se da a conocer la utilización de citoquinas, por ejemplo una o más de las citoquinas anteriormente mencionadas, en particular GM-CSF, en combinación con las células sanguíneas transfectadas tal como se definen más arriba, para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades cancerosas (por ejemplo las enfermedades cancerosas anteriormente indicadas) o enfermedades infecciosas (por ejemplo las enfermedades infecciosas anteriormente indicadas).

De acuerdo con otra forma de realización preferente de la presente invención, la citoquina, por ejemplo GM-CSF, se administra al mismo tiempo que la composición farmacéutica que contiene las células transfectadas, o preferentemente se administra antes o después de ésta (o se utiliza para producir un medicamento correspondiente para ser administrado simultáneamente con las células sanguíneas anteriormente indicadas o para ser administrado antes o después de éstas). De forma totalmente preferente, la administración de la citoquina, en particular GM-CSF, tiene lugar poco antes (por ejemplo aproximadamente 2 horas o menos, por ejemplo hasta aproximadamente 5 minutos), poco después (por ejemplo aproximadamente 5, 10, 15, 30, 45 ó 60 minutos) o mucho después (por ejemplo aproximadamente 2, 6, 12, 24, ó 36 horas) de la administración de la composición farmacéutica anteriormente definida, o en general después de las células transfectadas según la invención.

La administración de la citoquina, por ejemplo GM-CSF, puede tener lugar del mismo modo que las composiciones farmacéuticas según la invención o las células sanguíneas transfectadas según la invención, o de un modo diferente. Las vías de administración adecuadas y también las posibilidades de formulación adecuadas con respecto a la citoquina o las citoquinas se desprenden de las anteriores explicaciones con respecto a las composiciones farmacéuticas según la invención. En caso de un paciente humano es recomendable en particular una dosis de GM-CSF de 100 microgramos/m^{2}. De forma especialmente preferente, la citoquina, por ejemplo GM-CSF, se administra mediante una inyección subcutánea.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención o las células sanguíneas transfectadas según la invención, y en caso dado junto con ellas la o las citoquinas u otras moléculas coestimuladoras, se administran en forma de dosis periódicas. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de la composición farmacéutica según la invención a intervalos cortos, por ejemplo a diario, cada dos días, cada tres días, etc., o preferiblemente a intervalos más largos, por ejemplo semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas, mensualmente, etc. Los intervalos también pueden ser variables, para lo que se han de tener en cuenta principalmente los parámetros inmunológicos del paciente. Por ejemplo, la administración de una composición farmacéutica según la invención (y en caso dado junto con ella la administración de la citoquina o las citoquinas o de la o las moléculas coestimuladoras) puede seguir un esquema de tratamiento en el que al principio el intervalo es más corto, por ejemplo cada dos semanas, y después, en función del desarrollo del tratamiento o de los parámetros inmunológicos del paciente determinados correspondientemente, el intervalo se puede prolongar por ejemplo a una vez al mes.

De este modo, dependiendo del paciente, en particular de su estado y sus parámetros inmunológicos, se puede emplear un esquema terapéutico a medida del individuo correspondiente.

Por consiguiente, de acuerdo con la invención también se pone a disposición un procedimiento de tratamiento en el que en primer lugar se obtienen células sanguíneas (tal como se definen más arriba) de un paciente (animal o humano), después se someten a transfección in vitro según la invención con el mRNA arriba definido y finalmente se administran a un paciente correspondiente, preferentemente el mismo paciente del que se han tomado las células sanguíneas correspondientes en el primer paso, para lo que se aplican las realizaciones correspondientes con respecto a la formulación y administración de la composición farmacéutica según la invención.

En consecuencia, de acuerdo con la invención se utilizan células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno para producir un medicamento correspondiente para estimular una respuesta inmune contra el antígeno o los antígenos codificados por el mRNA.

De acuerdo con la invención se comprobó sorprendentemente que para la vacunación contra determinados antígenos no es necesario diferenciar las células sanguíneas adecuadas en células presentadoras de antígeno (APC), en particular células dendríticas (DC), mediante costosas técnicas de cultivo celular antes de la transfección con un mRNA codificador del antígeno correspondiente, con el fin de provocar una respuesta inmune correspondiente en el paciente. Las APC se caracterizan principalmente porque, mediante la expresión de moléculas coestimuladoras y la secreción de citoquinas, pueden interactuar con linfocitos y provocar a través de éstos una respuesta inmune específica del antígeno. Las APC también pueden ser macrófagos o linfocitos B además de DC. Las células sanguíneas utilizadas según la invención incluyen células B, monocitos, linfocitos T, granulocitos y una pequeña cantidad de DC, que se pueden dividir entre DC plasmacitoideas (pDC) y DC mieloideas (mDC). Sin establecer ningún compromiso con una teoría determinada con respecto al modo de acción de las células sanguíneas así transfectadas, de acuerdo con los conocimientos actuales según la invención se supone que las células transfectadas administradas al paciente por ejemplo mediante inyección expresan la proteína codificada por el mRNA y estimulan una inmunidad específica del antígeno bien directamente (a través de las APC presentes en las células sanguíneas como las PBMC), bien indirectamente (a través de las células transfectadas que no son APC, pero que mueren y son absorbidas por fagocitosis por las APC presentes en el organismo; o a través de proteínas segregadas por las células transfectadas, que son absorbidas por fagocitosis por las APC presentes en el organismo). Por consiguiente, al contrario que en el estado actual de la técnica, en la presente invención no se requiere ninguna etapa de procedimiento costoso, por ejemplo pasos de cultivo celular y similares, para obtener poblaciones de APC enriquecidas o para producir de otro modo por ejemplo APC artificiales. Además, tampoco es necesario utilizar grandes cantidades de citoquinas. De acuerdo con la invención, entre la obtención de las células sanguíneas, por ejemplo la extracción de sangre, y la administración de la composición farmacéutica utilizada por ejemplo como vacuna contra tumores o contra infecciones sólo transcurre típicamente una hora o pocas horas, por ejemplo 2 horas. Al contrario que en los procedimientos conocidos hasta ahora, según la invención se utilizan células sanguíneas, en general una mezcla de glóbulos rojos, células mononucleares, granulocitos y plaquetas, o poblaciones enriquecidas o esencialmente puras de estas células sanguíneas, y no APC generadas in vitro, lo que conduce a las ventajas anteriormente mencionadas.

Las figuras muestran:

La figura 1 muestra una representación gráfica de los resultados de experimentos FACS con respecto a la expresión de EGFP en células T colaboradoras específicas de CD4 o en células B específicas de CD19. Un mRNA codificador de EGFP (gráficos izquierdos) o un mRNA codificador de la proteína de matriz de influenza (control; gráficos derechos) se transfectó in vitro mediante electroporación en PBMC humanas frescas. Después se examinó la expresión de EGFP mediante FACS sobre la base de la fluorescencia del EGFP. La detección de células positivas de CD4 o CD19 se llevó a cabo mediante anticuerpos fluorescentes anti-CD4 (gráficos superiores) o anti-CD19 (gráficos inferiores). Los resultados muestran que algunas de las células positivas de CD4 contenidas en las PBMC habían absorbido el mRNA y expresaban EGFP.

La figura 2 también muestra representaciones gráficas de los resultados de experimentos FACS, que demuestran que las PBMC transfectadas con mRNA pueden activar células T contra antígenos codificados por el mRNA. Los experimentos se llevaron a cabo con 2 procedimientos de electroporación diferentes, por un lado con el aparato Nucleofector de la firma AMAXA y por otro con el sistema de electroporación estándar EASY JECT PLUS de la firma Equibio. Unas PBMC humanas frescas se sometieron a transfección con mRNA EGFP o con un mRNA que codifica la proteína de matriz de influenza. Como controles positivos se utilizaron PBMC cargadas con el péptido GILGFVFPL de la proteína de matriz de influenza. Después de la transfección, o después de la carga en el caso de los controles positivos, las células se cocultivaron durante una semana con PBMC autólogas frescas. A continuación, las células se marcaron con ayuda de anticuerpos monoclonales específicos de CD8 marcados con PercP (para la detección de células T citotóxicas) y mediante marcado PE de tetrámeros MHC fluorescentes (que reconocen exclusivamente las células T citotóxicas específicas del epítope de la proteína de matriz de influenza, que es presentado por HLA-A*0201). En los dos procedimientos de electroporación se comprueba que, cuando las PBMC utilizadas para la estimulación se sometían a transfección con mRNA EGFP, sólo un 0,1% o un 0,7% de las células T citotóxicas positivas de CD8 eran específicas del epítope dominante de la proteína de matriz de influenza. En cambio, en el caso de la transfección de PBMC con el mRNA que codifica la proteína de matriz de influenza, después de una semana se observa una frecuencia de un 1,6% o un 2,5% de células T citotóxicas positivas de CD8 que son específicas del epítope dominante de la proteína de matriz de influenza. Por consiguiente, de acuerdo con la invención se puede constatar que la electroporación de PBMC con mRNA que codifica la proteína de matriz de influenza induce la proliferación de células T citotóxicas que son específicas del epítope dominante de la proteína de matriz de influenza, pero que esto no se logra a través de la transfección con mRNA EGFP. Además, este resultado es independiente del tipo de electroporación.

La presente invención se explica más detalladamente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Aislamiento de PBMC

Se aislaron células mononucleares de la sangre periférica de donantes positivos de HLA-A0201 sanos. Las células mononucleares se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque. Las PBMC se lavaron tres veces con PBS.

Ejemplo 2 Transfección con PBMC mediante electroporación

Las PBMC obtenidas se sometieron a reacción con el dispositivo Nucleofector y el Human B-Cell Nucleofector Kit (ambos de AMAXA GmbH, Colonia, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En cada transfección se transfectaron 4 x 10^{6} células con 5 microgramos de RNA.

Para la fenotipización inmunológica de PBMC transfectadas con el mRNA EGFP se utilizaron los anticuerpos monoclonales CD4-PerCP y CD19-PE (en ambos casos, anticuerpos monoclonales de BD Pharmingen).

Después de la transfección, 1,5 x 10^{6} células se incubaron para su maduración en placas de cultivo con 24 pocillos (Greiner) en 1,5 ml de X-Vivo 15 Medium (Bio Whittaker, Bélgica), que contenía 100 mg/ml de LPS (Sigma, Deisenhofen, Alemania) y 2,5 mg/ml de TNF-\alpha (R&D Systems). Como control positivo se utilizaron PBMC maduras no transfectadas, que se cargaron durante 1 hora con 1 mg/ml del péptido restringido de HLA-A*0201 (GILGFVFTL) de la proteína de matriz de influenza. Después de 24 horas de incubación, las PBMC maduras se lavaron con medio. A continuación, las células se utilizaron para la estimulación de PBMC singeneicas descongeladas (10^{7} células por pocillo). Cuatro días después se añadió medio fresco y 10 u/ml de IL-2 recombinante y 5 mg/ml de IL-7 recombinante (ambos de R&D Systems). Después de 6 días de cultivo, las células se marcaron con un tetrámero de HLA-A*0201 humano marcado con PE, que es específico de la proteína de matriz de influenza. Para la detección de células específicas de CD8 se utilizó un anticuerpo anti-CD4 marcado con FITC y dirigido contra un anticuerpo CD-8 marcado con PercP.

Ejemplo 3 Expresión de EGFP en PBMC humanas transfectadas in vitro

Un mRNA codificador de EGFP se transfectó mediante electroporación (o mediante lipofección, datos no mostrados) en PBMC humanas frescas. Un día después de la transfección se examinó mediante análisis FACS la expresión de EGFP en células con anticuerpos monoclonales fluorescentes (anti-CD4 en el caso de las células T colaboradoras o anti-CD19 en el caso de las células B). Como muestra la figura 1, algunas células positivas de CD4 han absorbido el mRNA y expresado EGFP. En algunos casos también se ha podido comprobar una expresión de EGFP en células B y también en otras células que no son células B ni T, por ejemplo monocitos (no mostrado).

Ejemplo 4 PBMC transfectadas con mRNA activan células T

Unas PBMC de donantes sanos positivos de HLA-A*0201 se sometieron a transfección con mRNA codificador de la proteína de matriz de influenza. Las transfecciones se llevaron a cabo utilizando el dispositivo Nucleofector de AMAXA o un sistema de electroporación estándar (EASYJECT PLUS) de la firma Equibio. Las PBMC transfectadas se cocultivaron in vitro durante una semana junto con PBMC frescas autólogas y, en caso dado, a lo largo de la noche se llevó a cabo una maduración por incubación con LPS y TNF-\alpha. Sin embargo, con PBMC transfectadas no estimuladas se obtuvieron los mismos resultados. Después, las células se marcaron utilizando anticuerpos monoclonales (anti-CD8 para células T citotóxicas positivas de CD8) y tetrámeros de MHC fluorescentes, reconociendo estos últimos exclusivamente las células T citotóxicas que son específicas del epítope de la proteína de matriz de influenza presentado por HLA-A*0201. Como muestran los resultados de la figura 2, únicamente la electroporación de mRNA que codifica la proteína de matriz de influenza induce una proliferación de células T citotóxicas que son específicas del epítope dominante derivado de la proteína de matriz de influenza, mientras que la transfección de mRNA EGFP no provoca ninguna proliferación correspondiente de células T citotóxicas positivas de CD8. Además, este resultado es independiente del sistema de electroporación utilizado y tampoco depende de si las PBMC transfectadas han sido tratadas o no a lo largo de la noche con LPS y TNF-\alpha antes del cocultivo.

Además, mediante experimentos in vivo con ratones se puede demostrar que unos esplenocitos frescos transfectados por electroporación como células sanguíneas en el sentido de la presente invención pueden provocar una respuesta inmune. Esto es aplicable sobre todo al mRNA bicistrónico, que codifica el antígeno de interés y al mismo tiempo una citoquina, un receptor coestimulador, una molécula homing y/o una molécula suicida (que provoca una necrosis o apoptosis).

Claims (37)

1. \global\parskip0.950000\baselineskip

   1. Composición farmacéutica que contiene células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo el mRNA como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas.
2. 2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que las células sanguíneas no incluyen más de un 2% de células dendríticas (DC).
3. 3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, que contiene células sanguíneas autólogas.
4. 4. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el mRNA incluye un área que codifica como mínimo un antígeno de un tumor o de un agente patógeno.
5. 5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que el antígeno o los antígenos son un poliepítope de antígenos de un tumor o de un agente patógeno.
6. 6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que el poliepítope está modificado por deleción, adición y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido.
7. 7. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 6, en la que las células sanguíneas están transfectadas con varias moléculas de mRNA que representan una biblioteca de cDNA o una parte de la misma de un tejido tumoral o de una células infectada por un agente patógeno.
8. 8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que la parte de la biblioteca de cDNA codifica los antígenos específicos del tumor o los productos de los genes regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno.
9. 9. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 8, en la que el antígeno o los antígenos tumorales se seleccionan entre 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, \beta-catenina/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R1701, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR\alpha, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 y WT1.
10. 10. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 8, en la que el agente patógeno se selecciona entre el grupo consistente en virus, bacterias y protozoos.
11. 11. Composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que el antígeno viral, bacteriano o protozoológico procede de una proteína segregada.
12. 12. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el área que codifica el antígeno o los antígenos y/o el área no traducida en 5' y/o 3' están modificadas con respecto al mRNA natural de tal modo que no presentan ningún elemento de secuencia desestabilizador.
13. 13. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el mRNA incluye un área de secuencia que sirve para aumentar la tasa de traducción.
14. 14. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el mRNA codifica adicionalmente como mínimo una citoquina y/o como mínimo una molécula coestimuladora y/o como mínimo un factor de transcripción y/o como mínimo un receptor homing y/o como mínimo un gen suicida.
15. 15. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el mRNA presenta una caperuza-5' y/o una cola de poli(A^{+}) de como mínimo aproximadamente 25 nucleótidos y/o como mínimo un IRES y/o como mínimo una secuencia estabilizadora 5' y/o como mínimo una secuencia estabilizadora 3'.
16. 16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, en la que la secuencia estabilizadora 5' y/o la secuencia estabilizadora 3' se seleccionan entre el grupo consistente en secuencias no traducidas (UTR) del gen de \alpha-globina o \beta-globina y una secuencia estabilizadora de la fórmula general (C/U)CCAN_{x}CCC(U/A)Py_{x}UC(C/U)CC.
17. 17. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 16, en la que el mRNA presenta como mínimo un análogo de nucleótidos naturales.
18. 18. Composición farmacéutica según la reivindicación 17, en la que el análogo se selecciona entre el grupo consistente en fosforotioatos, fosforamidatos, peptidonucleótidos, metil-fosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metil-citosina e inosina.

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19. 19. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 18 para la terapia y/o la profilaxis contra el cáncer o enfermedades infecciosas.
20. 20. Procedimiento para la producción de una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 19, que incluye los siguientes pasos:

    (a)

    obtención de células sanguíneas, consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas; y

    (b)

    transfección in vitro de las células sanguíneas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno.

21. 21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que las células sanguíneas no incluyen más de un 2% de DC directamente antes de la transfección según el paso (b).
22. 22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó 21, en el que entre la obtención de las células sanguíneas en el paso (a) y la transfección en el paso (b) transcurren menos de 12 horas, preferentemente menos de 6 horas y en particular menos de 2 horas.
23. 23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 22, en el que las células sanguíneas son autólogas.
24. 24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el mRNA es tal como se define en una de las reivindicaciones 4 a 18.
25. 25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 24, en el que, durante la transfección según paso (b), el mRNA está presente en forma complejada o condensada con como mínimo un agente catiónico o policatiónico.
26. 26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el agente catiónico o policationico se selecciona entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina e histonas.
27. 27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 26, en el que el mRNA se produce mediante un procedimiento que incluye los siguientes pasos:

    (1)

    producción de una biblioteca de cDNA o de una parte de la misma a partir de tejido tumoral o a partir de células de un paciente infectadas por un agente patógeno;

    (2)

    producción de una matriz para la transcripción in vitro de RNA mediante la biblioteca de cDNA o una parte de la misma; y

    (3)

    transcripción in vitro de la matriz.

28. 28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la parte de la biblioteca de cDNA del tejido tumoral codifica los antígenos específicos de tumor o los productos de los genes regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno.
29. 29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que antes del paso (1) se determinan las secuencias de los antígenos específicos de tumor o las secuencias de los productos de los genes regulados hacia arriba a causa de la infección por el agente patógeno.
30. 30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que la determinación de las secuencias de los antígenos específicos del tumor o las secuencias de los productos de los genes regulados hacia arriba debido a la infección con el agente patógeno incluye una alineación con una biblioteca correspondiente de cDNA de tejido sano o de células no infectadas.
31. 31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la determinación de las secuencias de los antígenos específicos del tumor o las secuencias de los productos de los genes regulados hacia arriba debido a la infección con el agente patógeno incluye un diagnóstico mediante un microarray.
32. 32. Composición farmacéutica que se puede obtener mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 20 a 31.
33. 33. Utilización de células sanguíneas transfectadas con como mínimo un mRNA que incluye como mínimo un área que codifica como mínimo un antígeno y consistiendo las células sanguíneas en una mezcla de glóbulos rojos, granulocitos, células mononucleares y plaquetas con no más de un 5% de células dendríticas, dado el caso junto con un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable, para producir un medicamento para estimular una respuesta inmune contra el antígeno o los antígenos codificados por el mRNA.

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34. 34. Utilización según la reivindicación 33, en la que las células sanguíneas no incluyen más de un 2% de células dendríticas (DC).
35. 35. Utilización según la reivindicación 33 ó 34, en la que las células sanguíneas son autólogas.
36. 36. Utilización según una de las reivindicaciones 33 a 35, en la que el mRNA es tal como se define en una de las reivindicaciones 4 a 18.
37. 37. Utilización según una de las reivindicaciones 33 a 36, en la que la inmunoestimulación sirve para la terapia y/o la profilaxis contra el cáncer o enfermedades infecciosas.