ES2305945T3 - Metodo y dispositivo para la deteccion de analitos. - Google Patents

Abstract

Método para la detección de analitos en un líquido (5), en el cual el líquido (5) es sometido a un tratamiento de mezcla sobre una superficie base(3) de un soporte(1) configurado como un recipiente tipo cubeta con una base esencialmente plana que presenta unos reactantes inmovilizados, de manera que el líquido(5) en el tratamiento de mezcla es impulsado por un chorro de gas(9) por medio de una tobera o inyector(7) dirigida hacia la superficie soporte (3), que se caracteriza porque entre la tobera(7) y el soporte(1) se produce un movimiento relativo de forma que el chorro de gas cubra la superficie soporte(3), y la tobera(7) se oriente para que el chorro de gas incida verticalmente en el líquido.

Description

Método y dispositivo para la detección de analitos.

La presente invención se refiere a un método para la detección de analitos en un líquido conforme al concepto principal de la reivindicación 1, y a un dispositivo según el concepto principal de la reivindicación 7.

La invención trata en particular de las posibilidades para mejorar el tratamiento de un líquido y en este contexto de las posibilidades de mejorar el paso de los analitos en el líquido hacia los reactantes, que se encuentran inmovilizados en una zona o área del soporte cubierta por el líquido, en especial un biochip.

En las aplicaciones con biochips, en particular en las aplicaciones en inmunoanálisis, en las cuales se tienen que detectar las reacciones de enlace entre reactantes, que están inmovilizados en una superficie soporte, y los analitos, que existen en un líquido que moja la superficie soporte, aparecía el siguiente problema. Debido al enlace de los analitos a los reactantes inmovilizados cae la concentración en analitos en el líquido de una capa límite en la superficie del soporte, de manera que el líquido de prueba se empobrece en analitos en una capa límite. Debido a la normalmente baja velocidad de difusión del analito, que habitualmente es únicamente de pocos \mum o menos, las nuevas moléculas de analito no son enviadas de forma suficientemente rápida desde el volumen de líquido de muestra, de forma que en los ensayos inmunológicos o similares se requieren unos tiempos de incubación prolongados para lograr un efecto suficiente para su medición. Existen distintos equipos en la tecnología actual para solucionar este problema.

De la US 2003/0022176 A1 se conoce un método genérico para la detección de analitos en un líquido, donde el líquido es sometido a un tratamiento de mezcla en una superficie de un soporte configurado como un recipiente tipo cubeta que presenta reactantes inmovilizados y el líquido es impulsado con un chorro de gas mediante una tobera dirigida hacia la superficie del soporte. La tobera está inclinada con respecto a la superficie base del soporte, de manera que el chorro de gas de mezcla ataca el líquido bajo un ángulo correspondiente para producir una muestra de remolino deseada en el líquido. De este modo se puede prever que el chorro de gas que cae inclinado con respecto al soporte se desplace para intensificar la formación del remolino.

Este tipo de método para la detección de analitos en un líquido con dicha etapa de tratamiento se conoce también de las patentes americanas US 5.650.327 A, US 3.854.703 A y EP 0 643 989 A1, donde la mezcla se realiza por el impulso del material de mezcla con un chorro de gas que cae inclinado, para lograr un tipo de remolino macroscópico en el sentido del efecto agitador.

En la patente americana 3.854.703 se explica además una variante, en la cual sobre una cinta soporte se colocan unas gotitas por medio de unas toberas que se encuentran dirigidas en vertical hacia abajo. Cada una de las toberas o inyectores chafan las gotitas de líquido y las empujan fuera del centro de la cinta soporte. En el impulso siguiente por el par de inyectores las gotas vuelve en dirección al centro de la cinta soporte. Puesto que varias toberas o inyectores individuales y pares de inyectores actúan sobre cada gota de la serie, se produce el aplanado y la formación de nuevo de la gota, para lograr finalmente la mezcla correspondiente del material líquido.

En la patente US 6 485 918 se ha descrito un método de mezcla para una micromatriz-biochip con una tapa deformable, que se aplica a la superficie de la micromatriz. La forma de la tapa produce un movimiento circulatorio en el líquido entre la tapa y la superficie de la micromatriz. Si bien este método conocido es adecuado para biochips planos con reactantes inmovilizados en la base, tiene el inconveniente de que la tapa durante el proceso de mezcla tiene que estar siempre en contacto con el líquido de prueba. Las etapas adicionales del proceso, como la etapa de lavado, de adición de reactivo, etc... requieren posiblemente una abertura de la tapa con el correspondiente riesgo de pérdida del líquido de prueba y de contaminación.

En la WO 001/10011 se habla de un método y un dispositivo para la mezcla próxima a la superficie límite de muestras en sistemas de biosensores, es decir biochips. Para aumentar la sensibilidad en este método conocido, el líquido en un biochip se excita con ondas mecánicas (ondas de ultrasonidos, rayos o superficiales), de forma que se produzca una mezcla mejor del líquido de prueba en la capa límite chip/líquido, y así mejora la difusión de los analitos.

De la patente EP 0 281 958 A2 se conoce un dispositivo para termostatizar y mezclar el contenido de los recipientes de una placa de microvaloración para pruebas inmunológicas. Este dispositivo conocido incluye una campana, que define un espacio hueco, en el que desemboca un tubo de gas. Una pared limítrofe de la campana dirigida hacia la placa de valoración está equipada con orificios de salida del gas que se disponen excéntricamente respecto a los ejes de los recipientes de la placa de microvaloración y se dirigen bajo un ángulo hacia las superficies de los líquidos en cada uno de los recipientes. El insuflado de aire caliente a través de los orificios de salida de gas sirve para el atemperado y la creación de un movimiento de mezcla de rotación del líquido en cada uno de los recipientes.

Por ejemplo, las patentes US 6 063 564, US 4 479 720 y US 5 009 998 estudian como mejorar la mezcla del líquido de prueba en los tubos de ensayo como en los recipientes de líquido.

Los métodos de agitación o mezcla conocidos en la tecnología actual como puede ser la agitación, el uso de ultrasonidos, vibraciones etc. han demostrado ser eficaces y preferidos en biochips con un soporte plano o bien superficies soporte planas con una matriz de reactantes.

La invención tiene el cometido de proponer un método del tipo mencionado al principio, el cual en la realización de pruebas a base de reacciones de enlace entre analitos en un líquido de prueba y reactantes en un soporte reticulado por el líquido de prueba y por tanto en aplicaciones típicas de biochips, facilita o permite un incremento de la sensibilidad en la medición o bien reducción del tiempo de incubación necesario para lograr un efecto de medida satisfactorio. Además se debe lograr a ser posible una homogeneidad de las reacciones de enlace entre analitos y reactantes independientemente del lugar, en todo el chip. Se entiende por ello que los reactantes que se encuentran en el centro o en un borde del soporte o de la micromatriz, se deberán poder unir a los analitos muy rápida y muy eficazmente.

Para resolver este cometido se ha propuesto un método con las características de la reivindicación 1.

Este método especialmente adecuado cuando se utilizan biochips tipo cubeta con una base esencialmente plana como superficie soporte, produce una mezcla local eficaz del líquido de prueba que contiene analitos en la zona impulsada en ese momento por el chorro de gas. La tobera o el inyector se dirige desde arriba hacia el líquido de prueba de manera que el chorro de gas penetra localmente en su zona de impacto del líquido de prueba. Esto tiene el efecto de que el nivel de líquido de prueba en la zona de impacto del chorro de gas se reduce a un valor muy bajo, de solo unos \mum, y de que en una zona que contiene esta sección de nivel de líquido reducida, el líquido de prueba es homogeneizado eficazmente por el remolino formado. Puesto que el punto de impacto del chorro de gas cubre la zona del soporte explorada, se desplaza la zona de mezcla intensiva del líquido de prueba en la base del chip sobre la superficie soporte, de manera que a la capa límite inicialmente empobrecida en analitos por las reacciones de enlace anteriores, llegan nuevos analitos rápidamente. Por tanto aumenta la posibilidad de que existan más reacciones de enlace entre los analitos y los reactantes inmovilizados, de manera que se puede lograr el aumento de la sensibilidad o bien una reducción del tiempo de incubación y una mejora de la homogeneidad, en particular de la homogeneidad independientemente del lugar del enlace de analitos si se compara con un método con-
vencional.

En cuanto al chorro de gas se trata preferiblemente de un chorro de aire, en particular de un chorro de aire humedecido. El humedecimiento del aire sirve para evitar que el biochip se seque.

En caso del chorro de gas se puede tratar alternativamente de un chorro de gas inerte.

Entre la tobera y el soporte se produce un movimiento relativo para cubrir la superficie con el chorro de gas. Este movimiento puede ser simple, y ser realizado periódicamente. Este se puede llevar a cabo, por ejemplo, de forma que el inyector se desplace de forma predeterminada en el soporte fijo o bien sea el soporte que se deslice por el inyector fijo. No se excluye también la posibilidad de que tanto el inyector como el soporte se muevan, para impulsar el líquido de prueba.

Como recipiente para el líquido de prueba se emplea un recipiente tipo cubeta con un fondo esencialmente plano como superficie soporte para los reactantes inmovilizados. En particular se emplea como soporte un biochip con una matriz de secciones individuales en las cuales se encuentran los reactantes.

Alternativamente se puede prever el empleo de un recipiente tipo cubeta como recipiente de prueba, que contiene unos elementos soporte especiales, micropartículas de la fase sólida, como reactantes inmovilizados.

Como chorro de aire se emplea preferiblemente una corriente de aire continua, esencialmente constante para el impulso del líquido. Sin embargo no se debe excluir que en versiones alternativas se emplea una corriente de aire modulada pulsátil.

Una ventaja especial de la invención reside en que el tratamiento de mezcla propuesto del líquido permite una buena homogeneidad de las reacciones de enlace entre analitos y reactantes inmovilizados independientemente del lugar en toda la superficie soporte.

El objeto de la invención es además un dispositivo con las propiedades de la reivindicación 7 para realizar el método conforme a la invención.

El dispositivo incluye un soporte fijador para el alojamiento de al menos un soporte configurado como un recipiente tipo cubeta para el líquido, en particular un biochip, que presente una superficie base con los reactivos inmovilizados en ella o bien una superficie de base como soporte de unos elementos soporte especiales con unos reactivos que se encuentran en ella, y un dispositivo de entrada de gas con al menos un inyector para expulsar un chorro de gas en la dirección de la superficie de base de un soporte que se encuentra en el soporte fijador. El dispositivo se caracteriza por un elemento de accionamiento que está equipado para realizar un movimiento relativo entre el inyector y el soporte fijador de manera que un chorro de gas expulsado por el inyector cubra la superficie de base, de forma que el chorro de gas esté orientado para que incida verticalmente sobre el líquido.

De acuerdo con la configuración de la invención el soporte fijador se puede desplazar de forma que el dispositivo de accionamiento se ajuste para desplazar el soporte con respecto al inyector.

En una configuración alternativa de la invención, el inyector se monta de forma que se pueda mover y el dispositivo de accionamiento se ajusta para desplazar el inyector con respecto al soporte fijador.

El ajuste de la entrada de gas se realiza conforme a otra versión de la invención con el fin de producir un chorro de aire expulsado por el inyector.

El ajuste de la entrada de gas incluye preferiblemente un dispositivo para humedecer el aire.

En particular para realizar pruebas en masa se ha propuesto que el soporte de fijación se configure para alojar una multitud de soportes o recipientes para muestras y que a cada soporte o recipiente le corresponda como mínimo un inyector.

Variando la disposición de los inyectores o toberas, su geometría, el desplazamiento relativo de los mismos y la intensidad de la corriente de aire, el sistema conforme a la invención se adaptará bien a los biochips que se colocan libremente con un recipiente plano para el analito y una base plana. Es posible de ese modo un tratamiento en paralelo de una multitud de biochips ya que un recipiente compresor puede abastecer al mismo tiempo a muchos inyectores.

La invención se aclara con ayuda de los dibujos siguientes:

Figura 1 en una representación esquemática muy simplificada se muestra un esquema básico para explicar el procedimiento con un biochip en forma de cubeta y un inyector de gas que se desplaza sobre el mismo, y

Figura 2 una representación esquemática muy simplificada de un dispositivo conforme a la invención.

La figura 1 muestra un biochip 1 en forma de cubeta con una base de cubeta esencialmente plana 3, en la que preferiblemente se han inmovilizado reactantes o moléculas de iniciador en una disposición matricial. La superficie base 3 está cubierta de un líquido de prueba 5, que contiene analitos, que pueden formar enlaces con los reactantes en la base 3 del biochip 1, que son detectables mediante, por ejemplo, fluorescencia.

Puesto que tras la adición del fluido de prueba 5 al biochip 1 en una capa límite próxima a la base 3 se forma en seguida una zona de empobrecimiento de analitos libres en el líquido debido a los procesos de enlace, normalmente se retrasa la formación de otros enlaces. Para evitar este efecto de retraso se desplaza conforme a la figura 1 una tobera de gas 7 sobre la superficie del líquido de prueba 5, de manera que el punto de impacto del chorro de gas 9 cubra la superficie soporte 3 manteniéndose una capa intermedia de líquido 5. En la zona del punto de impacto correspondiente del chorro de gas 9 se produce un desplazamiento del líquido 5, como el que se explica en 11 en la figura 1. En este trozo de la zona 11 existe solamente una película de líquido de prueba 13 muy delgada. Debido al choque del líquido con el chorro de gas 9, éste se mezcla bien en esta zona de manera que la "zona pobre en analito" se quiebra localmente y se dispone de analitos nuevos para los enlaces con los reactantes. Puesto que se puede acceder a la zona 11 sobre toda la sección interesada de la base 3, es posible distribuir de un modo uniforme la elevada oferta de analitos sobre esta sección 3 de la superficie. Por lo tanto con el método conforme a la invención se puede incrementar la eficacia en enlaces por unidad de tiempo, lo que va acompañado de un descenso del tiempo de incubación requerido para lograr un efecto de medición satisfactorio en las aplicaciones en inmunoanálisis.

La figura 2 muestra un montaje esquemático representado de forma más simple de un dispositivo conforme a la invención con una bomba de aire 15 configurada como bomba de membrana para producir una corriente de aire. Un sensor de la cantidad de aire conectado al lateral posterior de la bomba 15 sirve para vigilar la corriente de aire y por tanto como indicador del valor real que regula la corriente de aire. En las mediciones de prueba se ha demostrado que la intensidad de aire preferida es de 7 ml/s.

Para la reducción de la evaporación del líquido de prueba en el biochip 1 se humedece el aire dirigido a la tobera o inyector 7 por medio de un dispositivo que humedece aire 26. Para ello se emplea en el caso del ejemplo 2 una caldera de presión 10 llenada parcialmente con agua. El aire requerido por la bomba 15 es insuflado por la tubería 21 hacia el depósito de agua. El aire que se forma bajo presión en el recipiente 25 por encima del recipiente de agua 23 con un contenido en humedad elevado pasa luego a la tobera 7 a través de la tubería 27. Luego el aire humedecido es insuflado por el inyector o tobera 7 en un chorro sobre el biochip 1, para lograr el efecto que se explica en la figura 1.

El biochip 1 se encuentra en la figura 2 sobre un soporte de fijación 30, en el cual puede ser tratado en un carro que se desplaza por medio de un motor. El soporte de fijación 30 se desplazará de manera que la tobera o el inyector 7 fija, con el chorro de aire dirigido hacia la base del biochip, pueda explorar la superficie del biochip 1 cubierta de reactantes inmovilizados. De este modo se puede prever que el soporte de fijación 30 pueda realizar el movimiento horizontal de un lado para otro que se aclara mediante la doble flecha 33, así como el movimiento vertical.

También se puede demostrar que según se necesite se pueden utilizar toberas o inyectores 7 con fisuras de salida de gas diferentes. Así que no se debe excluir que una tobera presente una rendija de salida de forma alargada, que por ejemplo, recubra casi totalmente la anchura completa de un biochip 1. El proceso de avance al desplazarse el biochip con respecto a la tobera 7 se puede reducir a un simple movimiento de adelante y atrás. En el ejemplo de las figuras 1 y 2 el chorro de gas aparece casi vertical al líquido.

Se pueden emplear también toberas o inyectores con varias rendijas de salida o capilares. Así en los ensayos del dispositivo se ha empleado un inyector a base de dos capilares de acero paralelos, cuya distancia entre ellos es de 1,4 mm y presentan respectivamente un diámetro interior de 0,5 mm. La longitud del capilar es de 10 mm. La distancia entre el orificio del inyector y la superficie de líquido de prueba era en los ensayos de unos 2 mm. La altura de llenado del líquido de prueba en un biochip era de aproximadamente 1 mm. La zona sensible al analito del biochip presentaba una superficie de unos 2,5 x 6 mm^{2}. Un impulso progresivo del motor servía para el movimiento de adelante y atrás del biochip bajo el inyector con una frecuencia de unos 0,5 Hz.

Claims (12)

1. Método para la detección de analitos en un líquido (5), en el cual el líquido (5) es sometido a un tratamiento de mezcla sobre una superficie base(3) de un soporte(1) configurado como un recipiente tipo cubeta con una base esencialmente plana que presenta unos reactantes inmovilizados, de manera que el líquido(5) en el tratamiento de mezcla es impulsado por un chorro de gas(9) por medio de una tobera o inyector(7) dirigida hacia la superficie soporte(3), que se caracteriza porque entre la tobera(7) y el soporte(1) se produce un movimiento relativo de forma que el chorro de gas cubra la superficie soporte(3), y la tobera(7) se oriente para que el chorro de gas incida verticalmente en el líquido.

2. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque en el caso del chorro de gas (9) se trata de un chorro de aire, en particular de un chorro de aire humedecido.

3. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque en el caso del chorro de gas se trata de un chorro de gas inerte.

4. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque en el recipiente tipo cubeta las micropartículas de fase sólida son consideradas como soporte con los reactantes inmovilizados en ellas.

5. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque como soporte(1) se emplea un biochip con una matriz de zonas individuales, en las cuales se encuentran los reactantes.

6. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque una corriente de aire esencialmente uniforme se emplea para impulsar el líquido.

7. Dispositivo para la detección de analitos en un líquido (5) conforme al método según una de las reivindicaciones anteriores, que incluye

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un soporte fijo(30) para el alojamiento de un soporte (1) configurado como un recipiente tipo cubeta con una base esencialmente plana para el líquido(5) con los reactantes inmovilizados o bien una superficie base para sostener los elementos soporte especiales con los reactantes que se encuentren en ellos y

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un dispositivo para la entrada de gas(26) con al menos una tobera(7) o inyector para impulsar un chorro de gas en la dirección de la superficie de base(3) de un soporte(1) que se encuentra en el soporte fijo(30), que se caracteriza por un dispositivo de accionamiento que se acciona para producir un movimiento relativo entre la tobera(7) y el soporte fijo(30) de forma que un chorro de gas(9) que sale de la tobera(7) cubra la superficie de base(3), y el chorro de gas se oriente de manera que incida verticalmente sobre el líquido.

8. Dispositivo conforme a la reivindicación 7, que se caracteriza porque el soporte (30) es móvil y porque el dispositivo de accionamiento se acciona para desplazar el soporte fijo (30) con respecto a la tobera (7).

9. Dispositivo conforme a la reivindicación 7 ó 8, que se caracteriza porque la tobera (7) es móvil y porque el dispositivo de accionamiento se acciona para desplazar la tobera (7) con respecto al soporte fijo.

10. Dispositivo conforme a la reivindicación 7,8 ó 9, que se caracteriza porque el dispositivo de alimentación de gas se ha configurado para producir un chorro de aire que será expulsado por medio de una tobera o inyector (7).

11. Dispositivo conforme a la reivindicación 10, que se caracteriza porque el dispositivo alimentador de gas presenta un aparato (19) que humedece el aire.

12. Dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 7 hasta 11, que se caracteriza porque el soporte fijo se ha configurado para almacenar una multitud de soportes y cada soporte se le adjudica al menos un inyector.