ES2306128T3 - Procedimiento para purificar oocistos usando digestion enzimatica de desechos fecales. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de purificar oocistos a partir de una composición de material fecal, que comprende poner en contacto la composición con polisacaridasa bajo condiciones suficientes para reducir la cantidad de material fecal en la composición.
Description
Procedimiento de purificar oocistos usando
digestión enzimática de desechos fecales.
La presente invención proporciona procedimientos
y composiciones para la purificación de oocistos de protozoos; en
particular la presente invención proporciona procedimientos y
composiciones para la purificación de oocistos de Eimeria
que se pueden usar para producir vacunas.
La coccidiosis de las aves de corral es una
enfermedad causada por protozoos parásitos del género
Eimeria. Los oocistos de especies de Eimeria son
ubicuos en el ambiente y persisten durante muchos meses en los
desperdicios de las aves de corral. La ingestión de oocistos conduce
a la infección de las diversas regiones del tracto intestinal en
una forma específica de especie. El organismo prolifera en el
intestino durante un periodo de tiempo de varios días, dando como
resultado la excreción de la siguiente generación de oocistos en
las heces. Múltiples ciclos de infección conducen a inmunidad, y
cuando la infección se presenta a una gallinería pronto y en
dosificación uniforme entre la gallinería, la inmunidad desarrollada
durante varios ciclos de exposición puede ser bastante robusta.
En contraste, cuando las aves no se presentan
con la infección en una manera uniforme, pueden surgir las
situaciones en las que aves no inmunizadas son sujeto de infección
repentina, masiva, conduciendo a pobre realización en términos de
conversión en comida y ganancia de peso, y un alto riesgo de
infecciones secundarias. Actualmente, el procedimiento más común
usado para el control de coccidiosis en la industria de la pollería
no es la vacunación, sino más bien la administración de fármacos
anticoccidiales en la comida. La baja velocidad de vacunación se
atribuye a menudo a incertidumbre en la uniformidad en dosificación
por medio de la comida o el agua en la instalación para que
desaparezca o mediante vacunación en cabina por pulverización en el
criadero, que son las vías y tiempos de administración
tradicionales. Hay interés creciente en mejorar la uniformidad del suministro durante la administración en el criadero.
tradicionales. Hay interés creciente en mejorar la uniformidad del suministro durante la administración en el criadero.
Recientemente, se han encontrado técnicas de
vacunación en huevo aplicables a administración de una vacuna de la
coccidiosis basada en oocistos vivos (véase, por ejemplo, Patente de
los Estados Unidos Nº.: 6.500.438; Patente de los Estados Unidos
Nº.: 6.495.146; y Patente de los Estados Unidos Nº.: 6.627.205;
todas de Pfizer, Inc.). La vía de administración en huevo
proporciona un procedimiento conveniente de administrar usa dosis
uniforme de vacuna a cada embrión mientras está aún en el huevo. La
administración de vacunas aviares en huevo se practica actualmente
para aproximadamente el 85% de los 9 millardos de aves para cocinar
producidas en los Estados Unidos cada año y en un porcentaje
creciente de los 21 millardos de aves para cocinar producidas fuera
de los Estados Unidos cada año (véase, por ejemplo, la Patente de
los Estados Unidos 4.458.630; del gobierno de los Estados Unidos).
Por lo tanto, el mercado potencial para una vacuna de la coccidiosis
viva, administrada en huevo es considerablemente mayor que el
mercado actual para vacunas de la coccidiosis administradas tras la
salida del cascarón.
Los oocistos para usar en una vacuna de la
coccidiosis viva se derivan de heces, que están inicialmente muy
cargadas con microorganismos contaminantes. Típicamente, las
agencias reguladoras requieren que las vacunas administradas en
huevo estén mostrando estar esencialmente libres de microorganismos
contaminantes. Para asegurar que los niveles de biocarga están
totalmente minimizados en el producto final, es beneficioso usar
composiciones y metodologías que controlen de forma efectiva el
nivel de microorganismos contaminantes en cada fase del proceso de
producción de oocistos. La reducción en sólidos ajenos puede
incrementar la eficiencia de las metodologías de reducción de
biocarga.
De acuerdo con ello, hay una necesidad en la
técnica de procedimientos mejorados de purificación de oocistos de
protozoos, especialmente para usar en elaboración de vacunas.
La presente invención se refiere a
procedimientos incrementados y composiciones para purificar oocistos
de protozoos (por ejemplo, oocistos de Eimeria), por
ejemplo, para usar en la elaboración de vacunas. Con respecto en
particular a vacunas de aves de corral, la invención es adecuada
para producir vacunas para uso tras la salida del cascarón o para
uso en huevo. Asimismo, la vacuna se puede usar en las industrias
del pollo para cocinar, la gallina ponedora, las aves criadoras, el
pavo, y las aves criadas por afición y/o domésticas.
La presente invención se basa, en parte, en el
descubrimiento de que la materia fecal que contiene oocistos puede
digerirse enzimáticamente mediante polisacaridasa sin impactar
indebidamente la viabilidad y/o recuperación de los oocistos. Así,
la invención proporciona procedimientos mejorados para reducir el
material fecal en una composición que comprende oocistos digiriendo
el material fecal con polisacaridasa. La invención también
proporciona procedimientos de purificar oocistos a partir de una
composición que comprende material fecal mediante un proceso que
comprende digerir material fecal en la composición con
polisacaridasa. La polisacaridasa actúa para escindir los desechos
de plantas sólidos, insolubles en subcomponentes solubles, que se
pueden retirar. Por ejemplo, los productos solubles de la digestión
de enzimas se pueden retirar separando y concentrando los oocistos
por medio de técnicas tales como centrifugación o filtración de
flujo tangencial.
Los procedimientos y composiciones de la
invención son ventajosos para procesos de producción de oocistos
comerciales (por ejemplo, para vacunas) reduciendo la carga fecal y
facilitando el uso de una escala de proceso más pequeña. La
minimización de desechos fecales ajenos en la composición es
beneficiosa para el control de microorganismos contaminantes y, si
se desea, para la producción de un producto final estéril.
Adicionalmente, la digestión enzimática puede reducir
sustancialmente la cantidad de sólidos en la composición, dando como
resultado de este modo una escala de operación proporcionalmente
reducida para todos los procesos a partir de entonces. La reducción
en la escala del proceso puede hacer al proceso más eficiente y
económico.
La digestión enzimática se puede incorporar
dentro de un esquema de purificación mayor y se puede usar en
conjunción con, o como sustituto para, técnicas actuales para
purificar oocistos (por ejemplo, criba, flotación, centrifugación,
etc.). Si los procedimientos de flotación se reemplazan mediante
digestión enzimática, las ventajas incluyen (1) eliminar o reducir
sales, que son corrosivas para el equipamiento, a partir del proceso
de purificación; y/o (2) robustez mejorada del proceso. Si la
digestión enzimática se usa antes de una etapa de flotación, los
beneficios pueden incluir una reducción en el volumen de la solución
de flotación, que es generalmente directamente proporcional al
volumen inicial de la materia fecal.
De acuerdo con ello, como un primer aspecto, la
invención proporciona un procedimiento de purificar oocistos (por
ejemplo, oocistos viables) a partir de una composición que comprende
material fecal, comprendiendo el procedimiento poner en contacto la
composición con polisacaridasa bajo condiciones suficientes para
reducir la cantidad de material fecal en la composición. En
realizaciones particulares la polisacaridasa comprende, consiste
esencialmente en, o consiste en celulasa. En otras realizaciones, la
polisacaridasa comprende, consiste esencialmente en, o consiste en
celulasa y pectinasa. En realizaciones aún más representativas, la
polisacaridasa comprende, consiste esencialmente en, o consiste en
celulasa, pectinasa y amilasa.
Como un aspecto adicional, la invención
proporciona procedimientos de purificar oocistos de Eimeria
(por ejemplo, oocistos de Eimeria viables) a partir de una
composición que comprende material fecal, el procedimiento que
comprende poner en contacto la composición con polisacaridasa que
comprende celulasa bajo condiciones suficientes para reducir la
cantidad de material fecal en la composición.
La invención también proporciona procedimientos
para purificar oocistos de Eimeria (por ejemplo, oocistos de
Eimeria viables) para usar en la producción de una vacuna,
comprendiendo el procedimiento poner en contacto la composición con
polisacaridasa que comprende celulasa bajo condiciones suficientes
para reducir la cantidad de material fecal en la composición.
Según aún otro aspecto, la invención proporciona
una composición que comprende polisacaridasa para usar en purificar
oocistos de protozoos (por ejemplo, para elaborar vacunas) usando
los procedimientos de la invención.
Estos y otros aspectos de la invención se
exponen en más detalle en la descripción de la invención más
adelante.
La figura 1 muestra un curso temporal de
digestión de desechos fecales usando celulasa al 20% (v/v) y
pectinasa al 4% (v/v).
La presente invención se describirá ahora con
referencia a las realizaciones preferidas de la invención. Esta
invención puede, sin embargo, realizarse en formas diferentes y no
debería interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas
en el presente documento. Más bien, estas realizaciones se
proporcionan a fin de que esta descripción sea minuciosa y
completa, y exprese totalmente el alcance de la invención para
aquellos expertos en la técnica.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado según se entiende comúnmente por alguien
de habilidad ordinaria en la técnica a la que pertenece la
invención. La terminología usada en la descripción de la invención
en el presente documento es para el propósito de describir
realizaciones particulares sólo y no se desea para ser limitante de
la invención.
La terminología usada en la descripción de la
invención en el presente documento es para el propósito de describir
realizaciones particulares sólo y no se desea para ser limitante de
la invención. Como se usa en la descripción de la invención y las
reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un",
"uno" y "el/la" se desean para incluir las formas del
plural también, a menos que el contexto indique claramente lo
contrario.
La presente invención es adecuada para purificar
oocistos tanto para usos médicos como para usos veterinarios. Los
términos "animal" y "sujetos animales" incluyen pero no se
limitan a sujetos mamíferos y/o avianos.
Los sujetos mamíferos adecuados incluyen pero no
se limitan a sujetos humanos y sujetos primates no humanos tales
como simios, sujetos porcinos, sujetos bovinos (por ejemplo, el
ganado vacuno), sujetos caprinos, sujetos equinos, sujetos felinos,
sujetos ovinos, sujetos caninos, sujetos murinos (por ejemplo,
ratones, ratas) y sujetos lagomorfos.
Los términos "aviano" y "sujetos
avianos" (por ejemplo, "ave" y "aves sujeto"), como se
usan en el presente documento, se desean para incluir machos y
hembras de cualesquiera especies de aves, pero se desean
principalmente para comprender aves de corral que se crían
comercialmente por los huevos, la carne o como mascotas. De acuerdo
con ello, los términos "aviano" y "sujeto aviano" se
desean particularmente para comprender pero no se limitan a pollos,
pavos, patos, gansos, codorniz, faisán, periquitos, loros, cacatúa,
carolina, avestruz, emú y similares. En realizaciones particulares,
el sujeto aviano es un sujeto pollo o pavo. En otras realizaciones,
el sujeto aviano es un sujeto pollo o un sujeto pavo. Como se usa
en la presente reivindicación, un "aviano" o "sujeto
aviano" se puede referir a un embrión aviano en huevo o a un
aviano tras la salida del cascarón.
La presente invención se refiere generalmente a
los procedimientos y composiciones para la purificación de oocistos
de protozoos. Tales procedimientos y composiciones hallan uso, por
ejemplo, en procedimientos de elaboración de vacunas.
Adicionalmente, los procedimientos se pueden usar para purificar
oocistos que se han modificado genéticamente, por ejemplo, para la
producción de proteínas recombinantes. Muchos protozoos forman una
fase vital denominada como "oocisto". La invención se puede
practicar para purificar oocistos a partir de cualquier especie de
protozoos, incluyendo pero no limitados a Eimeria,
Cryptosporidium, Toxoplasma, Plasmodia e
Isospora. En realizaciones de la invención, los
procedimientos y composiciones de la invención se usan para
purificar oocistos de Eimeria.
Los términos "protozoos", "oocistos",
"esporocistos", "esporozoitos" y "merozoitos" tienen
su significado aceptado en la técnica. A menos que se indique lo
contrario, estos términos se desean para hacer referencia a
protozoos, oocistos, esporocistos, esporozoitos y merozoitos vivos
(es decir, viables), incluyendo formas atenuadas, aunque aquellos
expertos en la técnica apreciarán que las vacunas se pueden formular
usando protozoos, oocistos, esporocistos, esporozoitos y merozoitos
muertos. Se entiende por aquellos expertos en la técnica que las
vacunas muertas se preparan usualmente purificando primero el
organismo vivo. También están comprendidos protozoos, oocistos,
esporocistos, esporozoitos y merozoitos modificados genéticamente.
Los oocistos pueden estar esporulados o no esporulados.
El término "Eimeria" indica una o
más especies del género Eimeria. El término
"Eimeria" incluye pero no se limita a cepas o especies
de Eimeria que infectan especies de aves (por ejemplo pollo,
pavo) o mamíferos (por ejemplo ganado vacuno, oveja o conejo).
Tales especies de Eimeria incluyen aquellas que se
encuentran en pollos, incluyendo E. tenella, E.
acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis,
E. praecox, E. mivati y E. brunetii; y también
aquellas que se encuentran en pavos, incluyendo E.
meleagrimitis, E. adenoedies, E. gallopavonis,
E. dispersa, E. innocua, y E. subrotunda, y
aquellas que infectan ganado vacuno tales como E. bovis y
E. zuernii, especies de Eimeria que infectan oveja
tales como E. ahsata, E. bakuensis, E.
crandallis, E. faurei, E. granulosa, E.
intrincata, E. marsica, E. ovinoidalis, E.
pallida, E. parva, E. weybridgensis; y especies
de Eimeria que infectan conejos incluyendo E.
intestinalis, E. vejdovskyi, E. piriformis, E.
coecicola, E. irresidua, E. flavescens, E.
exigua, E. magna, E. perforans, E. media,
y E. stiedai. Además, el término "Eimeria"
incluye todas las cepas de las especies precedentes de
Eimeria, incluyendo pero no limitadas a cepas de tipo
salvaje, cepas precoces o cepas seleccionadas de otra manera, cepas
atenuadas, y oocistos que se han atenuado, por ejemplo mediante
irradiación, tratamiento químico y similares. Adicionalmente, el
término "Eimeria" comprende Eimeria vivos y
muertos, aunque se desean los Eimeria vivos a menos que se
indique lo contrario.
La viabilidad se puede valorar, por ejemplo,
determinando la infectividad de los oocistos en un huésped. En
realizaciones particulares, los oocistos "viables" purificados
de acuerdo con los procedimientos de la invención tienen al menos
aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% de la infectividad
de oocistos que no se han sometido a tratamiento enzimático de
acuerdo con la presente invención.
Las composiciones que comprenden oocistos de
Eimeria hallaron uso en procedimientos de inmunizar aves
contra coccidiosis. Se conocen procedimientos de vacunar aves contra
coccidiosis en la técnica, e incluyen procedimientos de vacunación
en huevo (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº.: 6.500.438;
Patente de los Estados Unidos Nº.: 6.495.146, y Patente de los
Estados Unidos Nº.: 6.627.205; Pfizer, Inc.) y tras la salida del
cascarón (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº.: 3.147.186
de Auburn Research Foundation; Patente de los Estados Unidos Nº.:
5.055.292 y Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.438.097, ambas de
la National Research Development Corporation).
Los expertos en la técnica apreciarán que los
oocistos se pueden procesar adicionalmente para liberar otras fases
vitales (por ejemplo, esporozoitos o esporocistos) para usar en la
composición final de vacunas, o para producir extractos o proteínas
para propósitos de vacunación.
El término "protozoos" incluye cepas de
tipo salvaje, cepas precoces o cepas seleccionadas de otra manera,
cepas atenuadas, y oocistos que se han atenuado, por ejemplo
mediante irradiación, tratamiento químico y similares.
Adicionalmente, el término "protozoos" incluye además
cualesquiera cepas o especies de protozoos recién descubiertas.
Finalmente, el término "protozoos" abarca tanto protozoos vivos
como muertos, aunque se desean los Eimeria vivos a menos que
se indique lo contrario.
Los términos "producir", "produciendo"
o "producción" de oocistos, y similares se refieren
generalmente al proceso de recoger oocistos de un animal y
purificar los oocistos a partir del material fecal.
A menos que se indique lo contrario, los
términos "purifica(n)", "purificación",
"purificando" y "purificado" como se usan en el presente
documento con respecto a preparaciones de oocistos se refieren a la
separación de, o retirada de, desechos fecales y otro material no
deseado de preparaciones que contienen los oocistos. Estos términos
se desean para indicar que se potencia el grado de aislamiento o
separación de los oocistos a partir de otro material presente en
las heces, no que absolutamente todo (o incluso la mayoría) de
material ajeno se elimine de las preparaciones de oocistos.
Asimismo, las preparaciones de oocistos pueden contener algún grado
de contaminación microbiana, así como la preparación final es
adecuada para su uso deseado (por ejemplo como una vacuna tras la
salida del cascarón). En realizaciones particulares, las vacunas
deseadas para administración en huevo a aves están esencialmente
libres de contaminación detectable mediante microorganismos no
deseados (es decir, distintos de los oocistos de protozoos de
interés), en particular, microorganismos contaminantes que son
patógenos (es decir, causan enfermedad o mortalidad significativa)
al embrión.
Dependiendo del contexto, un proceso de
"purificación" puede referirse al proceso entero de purificar
oocistos a partir de heces para producir una preparación adecuada
para propósitos de vacunación. Alternativamente, un procedimiento
de "purificación" puede referirse a cualquier subgrupo de
etapas, o incluso a una etapa individual, dentro del esquema de
purificación entero.
La presente invención proporciona procedimientos
y composiciones para purificar oocistos (por ejemplo, oocistos de
Eimeria). Los procedimientos de digestión de la invención se
pueden combinar con una o más de las etapas de purificación como
parte de un esquema de purificación. Por ejemplo, los procedimientos
de la invención se pueden usar en conjunción con otros
procedimientos conocidos en la técnica.
Los procedimientos de producir oocistos, tales
como oocistos de Eimeria, se conocen en la técnica (véanse,
por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº.: 3.147.186 de Auburn
Research Foundation; Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.555.548
de Internationale Octroii Maatschappij "Octropa" B.V.; Patente
de los Estados Unidos Nº.: 4.863.731 de Unilever Patents Holdings;
Solicitudes de Patente Internacionales WO 00/50072 de Pfizer, Inc.;
WO 03/020917 de Embrex, Inc.; y WO 02/37961 de Novus International,
Inc.; Hammond y col., (1994) Amer. Vet. Res. 5:70; Hill y col.,
(1961) J. Parasit. 47:357; Jackson, (1964) Parasitology 54:87; Lotze
y col., (1961) J. Parasit. 47:588; Schmatz y col., (1984) J.
Protozool. 31: 181; Whitlock, (1959) Aust. Vet. J. 35:310). La
Publicación de Patente Internacional WO 00/26341 describe una
población microbiana mixta que puede degradar material fecal
animal.
Como se usa en el presente documento, si una
etapa o proceso se "lleva a cabo antes" o "se lleva a cabo
después" o lenguaje equivalente referido a otra etapa o proceso,
se quiere decir que la primera etapa o proceso tiene lugar antes o
después, respectivamente, que la segunda etapa en el esquema de
purificación y no excluyen la posibilidad de etapas
intermedias.
Los términos "contaminación microbiana",
"contaminación mediante microorganismos", y términos similares
se desean para indicar la presencia de microorganismos viables
detectables e indeseados incluyendo pero no limitados a bacterias,
mohos, hongos, levadura y virus (es decir, microorganismos distintos
que los oocistos de protozoos de interés). En realizaciones
particulares, la preparación de oocistos está esencialmente libre de
contaminación microbiana detectable, significando que no se detecta
ningún nivel significativo de contaminación microbiana e la
preparación, o que la preparación de oocistos está libre de
cualquier contaminación microbiana detectable. Se conocen en la
técnica procedimientos de detectar microorganismos y dependen de la
clase de microorganismos que se estén detectando.
Mediante "desinfectando" o
"desinfección" o "desinfectado" (y términos similares), se
quiere decir que hay una reducción en la contaminación microbiana
(es decir, microorganismos contaminantes viables, como se definen
anteriormente) en la preparación de oocistos. No es necesario que la
preparación de oocistos contenga absolutamente nada de
contaminación microbiana con tal de que la preparación final sea
adecuada para su uso deseado (por ejemplo, como una vacuna). En el
caso de composiciones deseadas para administración en huevo a aves,
la preparación estará generalmente esencialmente libre de
contaminación microbiana detectable (es decir, no se detectan
niveles significativos de microorganismos contaminantres) o libre
de cualquier contaminación microbiana detectable, es decir, estará
asénica.
La abreviatura "v/v" se refiere a
"volumen/volumen". La abreviatura "p/v" se refiere a
"peso/volumen".
Los aspectos individuales de la presente
invención se describen en más detalle más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los presentes inventores han hecho el
descubrimiento de que la digestión enzimática con polisacaridasa se
puede usar para reducir los desechos fecales sin reducir
indebidamente viabilidad y/o recuperación de oocistos de protozoos.
La polisacaridasa actúa para degradar material de plantas insoluble
a una forma soluble (por ejemplo, en solución acuosa) que puede
eliminarse fácilmente de los oocistos. Así, la invención proporciona
procedimientos de purificar oocistos a partir de una composición
que comprende material fecal, donde los procedimientos comprenden
poner en contacto la composición con polisacaridasa bajo condiciones
suficientes para reducir la cantidad de material fecal (por
ejemplo, solubilizar y así volver fácilmente eliminable algo o todo
del material fecal sólido) en la composición. En realizaciones
particulares, los oocistos son oocistos viables.
Los procedimientos de la invención pueden
practicarse con cualquier composición que comprenda material fecal
y oocistos. Para ilustrar, los oocistos se pueden recoger de heces,
núcleos cecales, revestimientos intestinales u otros tejidos, y
similares de animales infectados. Para propósitos comerciales, los
oocistos se recogen típicamente de las heces de animales
infectados.
La polisacaridasa de acuerdo con la presente
invención puede comprender una o más enzimas de degradación de
polisacáridos. Cuando dos o más enzimas que degradan polisacáridos
se usan en los procedimientos de la invención, las enzimas se
pueden usar concurrentemente o esencialmente en cualquier orden. Las
polisacaridasas se conocen en la técnica e incluyen pero no se
limitan a celulasa, pectinasa, amilasa, xilanasa, arabinasa,
\alpha-galactosidasa, hemicelulasa,
\beta-glucanasa,
\beta-glucosidasa y amiloglucosidasa.
En una realización representativa de la
invención, la polisacaridasa comprende, consiste esencialmente en,
o consiste en celulasa. Mediante "consiste esencialmente en" se
quiere decir que la polisacaridasa contiene sólo niveles
insignificantes de una polisacaridasa distinta de celulasa.
En otras realizaciones representativas, la
composición se pone en contacto con una celulasa y una pectinasa.
En otras realizaciones ejemplares, la composición se somete a
digestión mediante una celulasa, una pectinasa y una amilasa. En
una realización tal, la composición se digiere primero con la
celulasa y la pectinasa, y después se somete a digestión con la
amilasa (por ejemplo, después de que la degradación enzimática con
la celulasa y la pectinasa está completa o sustancialmente
completa, por ejemplo, al menos el 70%, el 80% o el 90%
completa).
Las condiciones de reacción específicas para la
digestión enzimática se pueden seleccionar y optimizar para lograr
cualquier/cualesquiera punto(s) final(es)
deseado(s) tales como grado de pureza, recuperación de
oocistos, viabilidad de oocistos, escala de proceso, eficiencia
temporal, eficiencia de coste, compatibilidad con otras etapas en
el proceso, compatibilidad con el equipamiento, y similares.
La cantidad de enzima añadida a la composición
se selecciona para lograr el nivel deseado de purificación sin
afectar adversamente la recuperación y/o viabilidad de los oocistos.
Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el periodo de tiempo
requerido para la completación de la digestión enzimática es
dependiente de la temperatura y de la concentración enzimática así
como de la enzima particular usada. Así, con concentraciones
enzimáticas más bajas, se usan típicamente un tiempo de reacción
más largo y/o una temperatura de reacción más alta para obtener el
mismo grado de digestión.
En realizaciones particulares, cada enzima está
presente a una concentración de al menos aproximadamente 0,25 x
10^{3} unidades/litro, aproximadamente 0,5 x 10^{3}
unidades/litro, aproximadamente 1 x 10^{3} unidades/litro,
aproximadamente 2 x 10^{3} unidades/litro, aproximadamente 5 x
10^{3} unidades/litro, aproximadamente 1 x 10^{4}
unidades/litro, aproximadamente 2 x 10^{4} unidades/litro,
aproximadamente 4 x 10^{4} unidades/litro, aproximadamente 5 x
10^{4} unidades/litro, aproximadamente 1 x 10^{5}
unidades/litro, aproximadamente 2 x 10^{5} unidades/litro o
aproximadamente 3 x 10^{5} unidades/litro y menos de
aproximadamente 2 x 10^{4} unidades/litro, aproximadamente 3 x
10^{4} unidades/litro, aproximadamente 5 x 10^{4}
unidades/litro, aproximadamente 8 x 10^{4} unidades/litro,
aproximadamente 10 x 10^{4} unidades/litro, aproximadamente 12 x
10^{4} unidades/litro, aproximadamente 15 x 10^{4}
unidades/litro, aproximadamente 20 x 10^{4} unidades/litro,
aproximadamente 25 x 10^{4} unidades/litro, aproximadamente 30 x
10^{4} unidades/litro, aproximadamente 40 x 10^{4}
unidades/litro, aproximadamente 50 x 10^{4} unidades/litro,
aproximadamente 10 x 10^{5} unidades/litro, aproximadamente 15 x
10^{5} unidades/litro, aproximadamente 20 x 10^{5}
unidades/litro, aproximadamente 35 x 10^{5} unidades/litro,
aproximadamente 50 x 10^{5} unidades/litro, aproximadamente 10 x
10^{6} unidades/litro, aproximadamente 20 x 10^{6}
unidades/litro, aproximadamente 25 x 10^{6} unidades/litro, o
aproximadamente 30 x 10^{6} o más, con cualquier combinación de
límites superiores e inferiores.
Con respecto a celulasa, en realizaciones
ilustrativas, la celulasa está presente en una cantidad de
aproximadamente 0,5 x 10^{4} a 35 x 10^{5} unidades por litro,
aproximadamente 1 x 10^{4} a 15 x 10^{5} unidades/litro,
aproximadamente 2 x 10^{4} a 50 x 10^{4} unidades/litro,
aproximadamente 3 x 10^{4} a 30 x 10^{4} unidades/litro,
aproximadamente 4 x 10^{4} a 25 x 10^{4} unidades/litro, o
aproximadamente 8 x 10^{4} a 20 x 10^{4} unidades/litro o
más.
Para pectinasa, en realizaciones
representativas, la pectinasa está presente en una cantidad de
aproximadamente 5 x 10^{4} a 20 x 10^{6} unidades/litro,
aproximadamente 1 x 10^{5} a 10 x 10^{6} unidades/litro,
aproximadamente 2 x 10^{5} a 5 x 10^{6} unidades/litro, o
aproximadamente 3 x 10^{5} a 2,5 x 10^{6} unidades/litro o
más.
Para amilasa, en realizaciones representativas,
la amilasa está presente en una cantidad de aproximadamente 0,25 x
10^{3} a 15 x 10^{4} unidades/litro, aproximadamente 0,5 x
10^{3} a 8 x 10^{4} unidades/litro, aproximadamente 1 x
10^{3} a 5 x 10^{4} unidades/litro, o aproximadamente 2 x
10^{3} a 3 x 10^{4} unidades/litro o más.
La duración de la digestión de enzimas se
selecciona para lograr la reducción deseada en desechos fecales sin
afectar adversamente la recuperación y/o la viabilidad de los
oocistos. Como se describe anteriormente, la velocidad de la
reacción enzimática generalmente depende de la temperatura de
reacción, la concentración enzimática y la polisacaridasa
particular usada. En realizaciones particulares, la reacción de
digestión se lleva a cabo durante al menos 30 minutos, 45 minutos,
1 hora, 2 horas o 3 horas y durante tanto tiempo como
aproximadamente 3, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 30 ó 36 horas, o
más, con cualquier combinación de límites superiores o inferiores.
Los intervalos de tiempo ilustrativos para llevar a cabo la
digestión enzimática, son de aproximadamente 30 minutos a 24 horas,
de aproximadamente 1 a 20 horas, de aproximadamente 1 a 15 horas,
de aproximadamente 2 a 10 horas, de aproximadamente 2 a 8 horas, y
de aproximadamente 2 a 5 horas. En algunos casos, la digestión
enzimática se lleva a cabo durante un periodo de tiempo más largo
que es necesario para completar la reacción de digestión. Por
ejemplo, puede ser conveniente llevar a cabo la digestión durante
toda una noche, incluso aunque la reacción se complete en un periodo
de tiempo más corto.
El proceso de la digestión enzimática se lleva a
cabo típicamente a temperatura(s) que logra(n) la
velocidad de reacción deseada (es decir, tiempo de proceso) pero no
afecta(n) adversamente la recuperación y/o viabilidad de los
oocistos. En general, la temperatura es usualmente menor que
aproximadamente 31ºC o 32ºC. En realizaciones de la invención, la
temperatura es al menos aproximadamente 12, 15, 18, 20, 21, 22 ó
24ºC y es menos de aproximadamente 26, 27, 38, 29 ó 20ºC, con
cualquier combinación de límites superiores e inferiores. Las
temperaturas ilustrativas para la digestión enzimática están en el
intervalo de aproximadamente 15ºC a 30ºC, aproximadamente 18ºC a
29ºC, y aproximadamente 21ºC a 27ºC.
De forma similar, el pH de la reacción se puede
seleccionar rutinariamente para lograr el nivel deseado de la
actividad enzimática y purificación de los oocistos. En
realizaciones ejemplares, se lleva a cabo la digestión con celulasa
y/o pectinasa a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 1 a pH
7,5, aproximadamente pH 2 a pH 6,5, aproximadamente pH 3 a pH 6, o
aproximadamente pH 4 a pH 5,5 ó 6. En el caso de amilasa, la
reacción se lleva a cabo generalmente a de aproximadamente pH 4 a
pH 7,5, dependiendo en parte de la fuente de la amilasa (por
ejemplo, de bacterias u hongos). En realizaciones particulares, la
reacción se lleva a cabo en un intervalo de aproximadamente pH 4,5
a pH 7, aproximadamente pH 6 a pH 8 o aproximadamente pH 6,5 a pH
7,5.
Si se usa más de una enzima para la digestión,
el pH de la solución se puede ajustar para cada reacción enzimática.
En procedimientos ejemplares, la composición se digiere primero con
celulasa y/o pectinasa a un pH en el intervalo de aproximadamente
pH 3 a pH 6 o aproximadamente pH 4 a pH 5,5 ó 6. El pH de la
solución se ajusta después a aproximadamente pH 4 a pH 7,5 o
aproximadamente pH 6,5 a pH 7,5, por ejemplo, mediante adición de
base o mediante intercambio con una solución en el intervalo de pH
deseado (por ejemplo, sedimentando mediante centrifugación y
resuspensión en la nueva solución) para la digestión con
amilasa.
Por llevar a cabo la reacción dentro de un
"intervalo" de temperatura o pH se quiere decir que la reacción
se puede llevar a cabo a una o más de una temperaturas o pH dentro
del intervalo de temperatura o del intervalo de pH indicado,
respectivamente.
Después de que se ha logrado el nivel deseado de
digestión enzimática, la(s) enzima(s) se
puede(n) eliminar opcionalmente (por ejemplo, separando los
oocistos del material líquido mediante técnicas estándar tales como
centrifugación o filtración de flujo tangencial) o puede(n)
inactivarse (por ejemplo, cambiando temperatura y/o pH y/o mediante
inactivación química). Así, en realizaciones particulares, el
procedimiento comprende adicionalmente retirar la enzima del
contacto con los oocistos, y opcionalmente recoger los oocistos (por
ejemplo, mediante centrifugación, flotación o filtración de flujo
tangencial) para la siguiente etapa en el esquema de purificación,
para desinfección, o para un uso final tal como elaboración
vacunal).
Se expone un procedimiento de digestión
enzimática ejemplar de acuerdo con la presente invención más
adelante. De acuerdo con esta realización, la composición comprende
oocistos de Eimeria. La composición se digirió con celulasa,
y opcionalmente pectinasa, durante aproximadamente 2 a 18 horas, a
una temperatura en el intervalo de aproximadamente 21ºC a 27ºC, y
un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH
6. La concentración de celulasa está en el intervalo de
aproximadamente 1 x 10^{5} a 10 x 10^{6} unidades/litro.
Los procedimientos de digestión enzimática de la
invención se pueden usar solos o se pueden incorporar dentro de un
esquema de purificación de oocistos más grande. Se conocen en la
técnica procedimientos de producir oocistos e incluyen
procedimientos de producir oocistos de Eimeria como se
describen mediante Patente de los Estados Unidos Nº.: 3.147.186 de
Auburn Research Foundation; Patente de los Estados Unidos Nº.:
4.544.448 de Internationale Octroii Maatschappij "Octropa"
B.V.; Patente de los Estados Unidos Nº.: 4.863.731 de Unilever
Patents Holdings; Solicitudes de Patente Internacionales WO 00/50072
de Pfizer, Inc.; WO 03/020917 de Embrex, Inc.; y WO 02/37961 de
Novus International, Inc.; Hammond y col., (1994) Amer. Vet. Res.
5:70; Hill y col., (1961) J. Parasit. 47:357; Jackson, (1964)
Parasitology 54:87; Lotze y col., (1961) J. Parasit. 47:588; Schmatz
y col., (1984) J. Protozool. 31: 181; Whitlock, (1959) Aust. Vet.
J. 35:310.
En general, estos procedimientos implican
infectar un animal con el protozoo de interés, recoger heces que
contienen oocistos del animal infectado, purificar los oocistos a
partir del material fecal a través de una serie de procedimientos
de separación tales como tamización, centrifugación, filtración y/o
flotación por densidad, esporulación de los oocistos, etapas de
separación adicional opcionales, y, si se desea, desinfectar los
oocistos esporulados para inactivar los microorganismos
contaminantes. Las diferentes preparaciones de oocistos (por
ejemplo, de diferentes especies o cepas) se pueden combinar después
para formar un producto final, por ejemplo, una vacuna contra
especies de protozoos múltiples (por ejemplo, Eimeria).
La digestión enzimática se puede llevar a cabo
en cualquier punto dentro del proceso de purificación de oocistos.
La digestión enzimática se puede llevar a cabo durante o tras la
completación de la recogida de las heces, antes de procedimientos
de purificación tempranos, tales como tamización. En otras
realizaciones representativas, el proceso de la digestión
enzimática se lleva a cabo después de las etapas de purificación
anteriores, tales como tamización o centrifugación. En general,
puede ser ventajoso usar el proceso de digestión enzimática antes
de las etapas de purificación posteriores tales como flotación para
reducir la escala del proceso. En otras realizaciones, la digestión
enzimática se lleva a cabo antes de, o en lugar de, etapas de
purificación posteriores, tales como flotación. Adicionalmente, la
esporulación de los oocistos puede ocurrir antes de,
concurrentemente con, o después de la digestión enzimática. En
algunas realizaciones, los oocistos se concentran antes o después
de esporulación bien sedimentando por medio de centrifugación o bien
mediante eliminación de líquido mediante técnicas tales como
filtración de flujo tangencial. El proceso de digestión enzimática
se puede incorporar bien antes o bien después una etapa de
concentración tal. En una realización ilustrativa de la invención,
los oocistos en la composición fecal están sometidos a etapas de
purificación anteriores (por ejemplo, centrifugación y/o
tamización) y después esporulación. De acuerdo con esta realización,
se lleva a cabo la digestión enzimática en un punto después de la
etapa de esporulación y antes de (o en vez de) las etapas de
purificación posteriores, tales como flotación por densidad.
En realizaciones particulares, el procedimiento
de purificación comprende adicionalmente una etapa de flotación por
densidad, por ejemplo flotación en una solución de sal (por ejemplo,
sulfato de magnesio) o de glicerol (por ejemplo,
glicerol-arginina). Las soluciones de sal y de
flotación por densidad no iónica y los procedimientos de flotación
por densidad usando soluciones de sal y no iónicas se describen en
Publicaciones de Patentes Internacionales WO 00/50072 (Pfizer,
Inc.) y WO 03/020917 (Embrex, Inc.). En realizaciones
representativas, el proceso de flotación por densidad se lleva a
cabo pero después el proceso de digestión enzimática.
Se conocen en la técnica procedimientos de
llevar a cabo flotación por densidad de oocistos. En realizaciones
particulares, la flotación por densidad comprende: suspender una
preparación que contiene oocistos en una composición que comprende
un líquido de alta densidad para formar una suspensión bajo
condiciones suficientes para dar como resultado flotación de los
oocistos, y recuperar los oocistos a partir de la suspensión.
Generalmente, el material que contiene los oocistos se mezcla con
la solución de flotación, y la solución se deja separar, con los
restantes oocistos en la fracción sobrenadante y los desechos
fecales formando un sedimento. La centrifugación se puede usar para
facilitar o mejorar la separación.
El medio de flotación se puede retirar de los
oocistos mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la
técnica, incluyendo etapas de centrifugación/lavado, diálisis y
filtración (por ejemplo, filtración de flujo tangencial).
Si se desea, los oocistos purificados se pueden
desinfectar para producir una solución estéril. Una etapa de
desinfección es una etapa opcional que se emplea típicamente en
procedimientos de producir oocistos para vacunas avianas en huevo y
se usa algunas veces para vacunas avianas postnatales también. Como
se conoce en la técnica, los oocistos para usar en preparaciones de
vacunas se desinfectan convencionalmente usando soluciones de
hipoclorito sódico. Otros procedimientos de desinfectar oocistos se
describen en el documento WO 031D20917 (Embrex, Inc.).
En realizaciones de la invención, la digestión
enzimática (y, opcionalmente, otras etapas de purificación) se
llevan a cabo en una solución antimicrobiana. La acción de la
polisacaridasa en liberar carbohidratos simples puede promover
potencialmente el crecimiento rápido de microorganismos
contaminantes. Se describen ejemplos de soluciones antimicrobianas
adecuadas en la Solicitud de Patente Internacional WO 03/020917
(Embrex, Inc.).
En realizaciones particulares, la composición
que comprende el material fecal y los oocistos se pone en contacto
con otras enzimas tales como lipasa y/o proteasa además de
polisacaridasa (por ejemplo, concurrentemente o secuencialmente en
cualquier orden).
Los inventores han encontrado adicionalmente que
la eficiencia de digestión enzimática de desechos fecales puede
estar influida por la dieta dada de comer a los animales a partir de
los que se recoge el material fecal. En realizaciones particulares,
los animales son alimentados con una dieta que tiene un tamaño de
partícula promedio grande durante y/o previamente al periodo de
recogida de oocistos. Las dietas de partículas grandes ejemplares
contienen granos completos tales como cebada, maíz (por ejemplo,
maíz molido grueso), trigo, avena, mijo y/o sorgo. Por ejemplo,
suministrar una dieta que contiene cebada a aves parece producir una
composición que se digiere más eficientemente. La cebada puede
estar en cualquier forma que es adecuada para usar en una dieta de
aves de corral, tal como cebada al
vapor-descascarillada. Así, los procedimientos de la
invención se pueden llevar a cabo con material fecal que contiene
oocistos recogidos a partir de un(as) ave(s)
alimentadas con una dieta que contiene cebada, por ejemplo una
dieta de cebada-soja. Las dietas ilustrativas
contienen al menos aproximadamente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%,
50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más cebada (p/p). Otras dietas
ejemplares contienen aproximadamente 15% a 70% (p/p),
aproximadamente 20% a 60% (p/p), aproximadamente 25% a 45% (p/p), o
aproximadamente 25% a 40% (p/p) de cebada. Una dieta representativa
contiene aproximadamente 35% (p/p) de cebada al
vapor-descascarillada; aproximadamente 35% (p/p) de
harina de soja alta en proteínas, aproximadamente 10% (p/p) de
avena aplastada, aproximadamente 6% (p/p) de fibra de arroz y otras
grasas, minerales, vitaminas y suplementos para mantener la salud
de las aves.
Se describen dietas animales que tienen un
tamaño de partícula promedio grande en el documento WO 03/020917
(Embrex, Inc.).
Se conocen en la técnica procedimientos de
suministrar enzimas a aves para mejorar digestibilidad de alimento
que contiene polisacáridos (véase, por ejemplo, documento de los
EE.UU. RE38.047; hemicelulosa), para mejorar velocidad de
crecimiento (véase, por ejemplo, documento de los EE.UU. 6.333.062;
alfa-galactosidasa), para tratar malabsorción
(véase, por ejemplo documento de los EE.UU. WO 91/04673; celulasa o
xilanasa) y/o para tratar síndrome de cloaca pastosa. Así, se puede
dar a comer la polisacaridasa a los animales (por ejemplo, aves) de
los que se recoge el material fecal y se recolectan los oocistos.
Están comercialmente disponibles preparaciones multienzimáticas,
por ejemplo, Natugrain®, Selfeed®, y Hemicell®.
Los procedimientos de digestión enzimática de la
invención se pueden llevar a cabo para lograr las reducciones
deseadas en material fecal, por ejemplo, en al menos aproximadamente
el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% (v/v), (p/p) o (p/v) o más
alto.
Adicionalmente, en realizaciones particulares,
la recuperación de oocistos (opcionalmente, oocistos viables) del
proceso de digestión enzimática es al menos aproximadamente el 60%,
70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% (v/v), (p/p) o (p/v) o más alto. Se
conocen en la técnica procedimientos de determinar la viabilidad de
los oocistos, por ejemplo valorando infectividad de los oocistos
(véase, por ejemplo, ejemplo 7).
Las composiciones inmunógenas producidas usando
los procedimientos de la presente invención se puede administrar a
un sujeto animal para vacunar contra una enfermedad causada por
protozoos. Una composición inmunógena (por ejemplo una vacuna) que
contiene oocistos producidos usando los procedimientos de la
presente invención se puede administrar para facilitar una
respuesta inmune. Típicamente, la composición inmunógena comprende
una cantidad inmunógena de oocistos como se describe en el presente
documento en combinación con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Una "cantidad inmunógena" es una cantidad de los
oocistos que es suficiente para iniciar o provocar una respuesta
inmune en el sujeto al que se administra la composición inmunógena.
Como se entiende por aquellos expertos en la técnica, la
composición inmunógena se puede formular con organismos vivos,
atenuados y/o muertos. Esta aproximación también es aplicable a
otras fases de la vida de los parásitos, tales como esporozoitos o
esporocistos.
Mediante "farmacéuticamente aceptable" se
quiere decir un material que no es indeseable biológicamente o de
otro modo, es decir, el material se puede administrar a un sujeto
sin causar efectos biológicos indeseables. Así, una composición
farmacéutica tal se puede usar, por ejemplo, para preparar
composiciones para inmunización. Los vehículos farmacéuticamente
aceptables pueden contener otros compuestos que incluyen pero no se
limitan a estabilizadores, sales, tampones, coadyuvantes y/o
conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, antifúngicos y
antivirales) como se conocen en la técnica. El vehículo
farmacéuticamente aceptable no necesita ser estéril, aunque
generalmente lo será para administración en huevo a embriones
avianos.
Cualquier vía de administración de la
composición inmunógena conocida en la técnica se puede emplear
durante tanto tiempo como se facilite una respuesta inmune activa
(preferiblemente, una respuesta inmune protectora) contra los
protozoos. Cuando el sujeto es un ave, la composición inmunógena se
puede administrar en huevo o tras la salida del cascarón. Las vías
ejemplares de administración son administración oral tras romper el
cascarón o inyección en huevo (por ejemplo, dentro del amnios). En
realizaciones particulares de la invención, se emplea la
administración en huevo usando equipamiento de inyección
automatizada.
Los términos "vacunación" o
"inmunización" se entienden bien en la técnica. Por ejemplo,
los términos vacunación o inmunización se pueden entender para ser
un proceso que da como resultado y/o incrementa una reacción inmune
de un sujeto a antígeno, y por lo tanto su capacidad para resistir o
superar infección. Se conocen en la técnica procedimientos en huevo
de vacunar aves contra Eimeria (por ejemplo, Patente de los
Estados Unidos Nº.: 6.500.438; Patente de los Estados Unidos Nº.:
6.495.146; y Patente de los Estados Unidos Nº.: 6.627.205; Pfizer,
Inc.).
Los términos "inmunidad protectora" o
"respuesta inmune protectora", como se usan en el presente
documento, se desean para querer decir que el animal huésped monta
usa respuesta inmune activa a la vacuna, tal que tras exposición o
reto subsiguiente, el animal es capaz de combatir la infección. Así,
una respuesta inmune protectora disminuirá la incidencia de
morbilidad y mortalidad de exposición subsiguiente al patógeno entre
animales tratados. Aquellos expertos en la técnica entenderán que
en un entorno de cría de animales de granja comercial, la
producción de una respuesta inmune protectora se puede valorar
evaluando los efectos de vacunación en la gallinería o rebaño como
un todo, por ejemplo, puede haber aún signos de enfermedad o de
morbilidad y mortalidad en una minoría de animales vacunados.
Mediante "respuesta inmune activa", se
quiere decir cualquier nivel de protección de exposición
subsiguiente a los protozoos o antígenos de protozoos que es de
algún beneficio en una población de sujetos, en la forma de
mortalidad disminuida, lesiones disminuidas, tasas de conversión de
comida mayores, o la reducción de cualquier otro efecto en
detrimento de la enfermedad, y similares, sin importar si la
protección es parcial o completa. Una "respuesta inmune
activa" o "inmunidad activa" se caracteriza por
"participación de tejidos huésped y células huésped después de un
encuentro con el inmunógeno. Ello implica diferenciación y
proliferación de células inmunocompetentes en tejidos
linforreticulares, que conducen a síntesis de anticuerpo o
reactividad mediada por células en desarrollo, o ambas". Herbert
B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular
Interactions in Antibody Formation, en IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES
117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Alternativamente establecida,
se monta una respuesta inmune activa por el huésped después de
exposición a inmunógenos mediante infección, o como en el presente
caso, mediante vacunación. Se puede contrastar la inmunidad activa
con la inmunidad pasiva, que se adquiere a través de la
"transferencia de sustancias preformadas (anticuerpos, factor de
transferencia, injerto tímico, interleuquina-2) a
partir de un huésped inmunizado activamente a un huésped no
inmune". Id.
Los ejemplos, que siguen, se exponen para
ilustrar la presente invención, y no son para interpretarse como
limitantes de la misma.
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Se llevó a cabo un experimento inicial probando
la factibilidad de usar enzimas digestivas para purificar oocistos
de Eimeria. Se produjeron oocistos de E. maxima en
aves para cocinar. Se recogieron heces que contenían oocistos 5 a 8
días tras la inoculación dentro de una solución antimicrobiana que
consta de ácido cítrico al 10%, peróxido de hidrógeno del 0,75 al
3%, y ácido propiónico al 0,25%. Se tamizaron los materiales
eliminando desechos grandes y se esporularon en ácido cítrico al
10%, peróxido de hidrógeno del 0,75 al 3%, y ácido propiónico al
0,25% con agitación y aireación durante al menos 48 horas. Se tomó
una muestra de material tras la esporulación y se sometió a
diversos tratamientos enzimáticos (véase Tabla 1). Se obtuvieron
las enzimas (celulasa y amilasa) de dos fuentes comerciales
(Novozymes y Genencor) para usar en este experimento. Se añadieron
enzimas al 20% (v/v) a cada preparación. El pH de la muestra se
ajustó a aproximadamente pH 4,5 para tratamiento con celulasa o
tratamiento con celulasa + amilasa y a pH 7,0 para tratamiento con
amilasa sola. Se enumeraron los oocistos mediante el procedimiento
de McMasters (Hodgson, J.N., (1970) Coccidiosis: oocysts counting
technique for coccidiostat evaluation. Exper. Parasitol. 28:
99-102). Los valores de desechos se determinaron
centrifugando una submuestra representativa a 1800 x g durante 10
minutos, midiendo el volumen de sólidos sedimentados y calculando
el volumen de sólidos sedimentables por volumen de muestra. Los
sólidos totales se determinaron después multiplicando el valor para
sólidos sedimentables por ml de muestra por el volumen de muestra
total. Los resultados se presentan en la Tabla 1 más adelante.
En éste y en los ejemplos siguientes, la
actividad específica de las preparaciones enzimáticas recibidas del
fabricante fue como sigue: celulasa (8,4 x 10^{5} unidades/litro);
pectinasa (2,6 x 10^{7} unidades/litro); y amilasa (3 x 10^{5}
unidades/litro). Los materiales se diluyeron en una base v/v como se
indica para cada experimento.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras control parecen normales. El mejor
resultado se observó con la celulasa de Novozymes en el día 1 de
incubación. Se obtuvo recuperación esencialmente cuantitativa de los
oocistos, y los oocistos tenían una apariencia normal.
Aproximadamente el 73% de los desechos se habían hecho solubles
después de 1 día de incubación. La reducción de desechos no cambió
mucho con incubación adicional. En base a estos resultados, se
llevaron a cabo estudios adicionales enfocados en el tratamiento de
celulasa y/o de amilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron aves para cocinar con oocistos de
E. maxima, y las heces conteniendo oocistos se recogieron 5
a 8 días tras la infección. Las heces se recogieron en ácido cítrico
al 10%, peróxido de hidrógeno del 0,75 al 3%, y ácido propiónico al
0,25%. La suspensión se tamizó eliminando partículas grandes, y los
oocistos se esporularon durante al menos 48 horas en ácido cítrico
al 10%, peróxido de hidrógeno del 0,75 al 3%, y ácido propiónico al
0,25% con agitación y aireación. Tras la esporulación, la suspensión
se centrifugó sedimentando los oocistos y los desechos fecales, y
se desechó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en solución
de flotación de sulfato de magnesio ajustada a una densidad de 1,2
g/ml y centrifugada a 1800 x g durante aproximadamente 10 minutos.
Los oocistos, contenidos en el sobrenadante, se diluyeron con agua y
se procesaron adicionalmente u en otros experimentos. El material
sedimentado restante, que representó el material fecal no digerido
de las aves de producción, se resuspendió en ácido cítrico al 10% y
ácido propiónico al 0,25%. Estos sólidos representan los desechos
de plantas residuales insolubles objetivo de las heces que son para
solubilizarse por medio de digestión enzimática. Los sólidos se
usaron en una serie de experimentos evaluando diversas condiciones
de digestión enzimáticas. La reducción de desechos se evaluó como se
describe en el ejemplo 1.
Se prepararon nueve sedimentos de 15 ml
replicados centrifugando partes de los sólidos descritos
anteriormente. Los sedimentos se lavaron una vez con PBS. La
suspensión se centrifugó después y los sedimentos se resuspendieron
en la solución de tratamiento apropiada.
Todos los replicados se incubaron a temperatura
ambiente durante toda una noche con agitación suave. Las
suspensiones se centrifugaron después a 3000 r.p.m durante 10
minutos, y se midió el volumen de los sólidos sedimentados.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con celulasa proporcionó una
reducción en los desechos del 67%. El tratamiento con celulasa +
xilanasa no parece ofrecer ninguna ventaja sobre el tratamiento con
celulasa sola.
Se llevó a cabo un experimento adicional usando
los 3 tubos de replicado del tratamiento 2 con celulasa del
experimento I. Se añadieron directamente pectinasa,
amiloglucosidasa, o beta-glucosidasa al tratamiento
con celulasa y se incubaron durante toda una noche con agitación
suave.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento con celulasa + pectinasa produjo
un sobrenadante clarificado por encima del sedimento de desechos
más pesados. Ni el tratamiento con aminoglucosidasa ni el
tratamiento con beta-glucosidasa ofrecieron
cualquier ventaja visible sobre tratamiento con celulasa sola.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pollos para cocinar se inocularon con
oocistos de cualquiera de E. acervulina, E. maxima, o
E. tenella. Las heces que contenían oocistos se recogieron
durante el periodo de producción de oocistos pico para cada
especie. Las heces se recogieron en una solución antimicrobiana
constituida por ácido cítrico al 10%, peróxido de hidrógeno a
aproximadamente 0,75 al 3%, y ácido propiónico al 0,25%. Las
muestras se tamizaron retirando partículas de desecho grandes y se
centrifugaron sedimentando los desechos.
Tres muestras replicadas, constituidas cada una
por 5 ml de sólidos sedimentados resuspendidos en PBS a pH 5,0
sirvieron como controles para cada tratamiento. Se prepararon tres
muestras replicadas por tratamiento enzimático. Las muestras se
resuspendieron en cada solución de celulasa al 20% o celulasa al 20%
con pectinasa al 4% en PBS a pH 5,0 y se incubaron a temperatura
ambiente con agitación suave durante al menos 4 horas. Los oocistos
se enumeraron en muestras de control y de tratamiento usando el
procedimiento de McMasters, y los sólidos se determinaron mediante
los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. La reducción en
desechos y la recuperación de oocistos se calcularon en relación a
muestras control.
Se prepararon nueve sedimentos replicados de
\sim 5 ml de cada muestra. Los sedimentos se lavaron una vez
usando PBS. Los sedimentos lavados se resuspendieron en la solución
enzimática apropiada para tratamientos 1-3 como se
indica en la tabla 5 a continuación.
Tras la preparación de tratamientos
1-3, la enumeración de los oocistos y la medida de
desechos se llevaron a cabo por controles de tampón de tratamiento
1. Los tratamientos 2 y 3 se incubaron durante toda una noche con
agitación suave. Tras la incubación, los oocistos se enumeraron y
las determinaciones de desechos se llevaron a cabo para
tratamientos 2 y 3.
Los tratamientos 2-amilasa y
3-amilasa se prepararon después usando materiales
residuales de tratamientos 2 y 3 como se indica en la tabla 6.
Los tubos que contienen el material residual de
tratamientos 2 y 3 se centrifugaron y los sedimentos se lavaron una
vez con PBS. Los sedimentos lavados se resuspendieron en solución de
amilasa. Tras la incubación durante toda una noche a temperatura
ambiente con agitación suave, los oocistos se enumeraron (Hodgson,
J.N., (1970) Coccidiosis: oocysts counting technique for
coccidiostat evaluation. Exper. Parasitol. 28:
99-102) y las determinaciones de desechos se
llevaron a cabo por tratamientos nº^{s}. 2 y 3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El tratamiento con celulasa + pectinasa produjo
una reducción de desechos mayor que el tratamiento con celulasa
sola. El tratamiento con amilasa produjo mejor reducción de desechos
cuando la muestra se trató primero con celulasa + pectinasa.
Aproximadamente el 79% de los desechos se retiraron usando
tratamiento con celulasa + pectinasa seguido por tratamiento con
amilasa. La recuperación de oocistos general varió entre el 57 y el
68% por estos tratamientos. El tratamiento enzimático proporcionó
recuperación de oocistos aceptable, comparable a o mejor que la
recuperación de oocistos del 50 al 90% típicamente lograda por medio
de técnicas de flotación estándar.
El tratamiento con celulasa + pectinasa produjo
una reducción de desechos mucho mayor, aproximadamente dos veces
aquella del tratamiento de la celulasa sola. El tratamiento con
amilasa produjo mejor reducción de desechos cuando la muestra se
trató primero con celulasa + pectinasa. Se retiró aproximadamente el
73% de los desechos usando tratamiento de celulasa + pectinasa
seguido por tratamiento de amilasa. La recuperación de oocistos
general fue esencialmente cuantitativa en este grupo de
experimentos.
Celulasa + pectinasa produjeron una reducción de
desechos mayor que el tratamiento con celulasa sola. El tratamiento
con amilasa produjo mucha mejor reducción de desechos (\sim4X
mayor) cuando la muestra se trató primero con celulasa + pectinasa.
Se retiró aproximadamente el 81% de los desechos usando tratamiento
con celulasa + pectinasa seguido por tratamiento de amilasa. La
recuperación de oocistos general fue aproximadamente del 70% en este
grupo de experimentos.
Celulasa + pectinasa produjeron una reducción de
desechos mayor que el tratamiento con celulasa sola. El tratamiento
con amilasa produjo mucha mejor reducción de desechos (\sim5X
mayor) cuando la muestra se trató primero con celulasa + pectinasa.
Se retiró aproximadamente el 80% de los desechos usando tratamiento
con celulasa + pectinasa seguido por tratamiento de amilasa. La
recuperación de oocistos general fue aproximadamente del 75 al 95%
en este grupo de experimentos.
La digestión enzimática que usa una combinación
de celulasa y pectinasa a pH 5 redujo niveles de desechos después
de esporulación en aproximadamente el 60% para todas las cepas de
vacunas; la recuperación de oocistos promedió aproximadamente el
82%.
El tratamiento de celulasa + pectinasa seguido
por digestión con amilasa a pH 7 produjo un total de aproximadamente
el 80% de reducción de desechos después de esporulación; la
recuperación de oocistos después de tratamiento con amilasa
promedió 94,4% para la etapa. La recuperación de oocistos general
usando la secuencia de tratamientos enzimáticos promedió 76%.
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Los pollos para cocinar se inocularon con
oocistos de cualquiera de E. acervulina, E. maxima, o
E. tenella. Las heces que contenían oocistos se recogieron
durante el periodo de producción de oocistos pico para cada
especie. Las heces se recogieron en una solución antimicrobiana
constituida por ácido cítrico al 10%, peróxido de hidrógeno a
aproximadamente 0,75 al 3%, y ácido propiónico al 0,25%. Las
muestras se tamizaron retirando partículas de desecho grandes y se
centrifugaron sedimentando los desechos.
Tres muestras replicadas, constituidas cada una
por 5 ml de sólidos sedimentados resuspendidos en PBS a pH 5,0
sirvieron como controles para cada tratamiento. Se prepararon tres
muestras replicadas por tratamiento enzimático. Las muestras se
resuspendieron bien en solución de celulasa al 20% o bien en
celulasa al 20% con pectinasa al 4% en PBS de pH 5,0 y se incubaron
a temperatura ambiente con agitación suave durante al menos 4
horas. Los oocistos se enumeraron usando técnicas microscópicas
estándar en muestras de control y de tratamiento, y los sólidos se
determinaron mediante centrifugación de muestras y medida del
volumen de sedimento. Se calculó la reducción de desechos y la
recuperación de oocistos, en relación a las muestras control. Los
resultados se muestran en la tabla 10 a continuación:
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Los resultados indican que la celulasa en
combinación con pectinasa produjo una reducción de desechos mayor
que el tratamiento con celulasa sola. Cada tratamiento proporcionó
recuperación de oocistos aceptable, comparable con o mejor que la
recuperación de oocistos del 50 al 90% lograda típicamente por medio
de técnicas de flotación estándar.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pollos para cocinar se inocularon con
oocistos de E. maxima. Las heces que contenían oocistos se
recogieron 5 a 8 días tras la inoculación. Las heces se recogieron
en una solución antimicrobiana constituida por ácido cítrico al
10%, peróxido de hidrógeno a aproximadamente 0,75 al 3%, y ácido
propiónico al 0,25%. Las muestras se tamizaron retirando partículas
de desecho grandes y se centrifugaron sedimentando los desechos.
Se prepararon veinte muestras replicadas de 5 ml
de los sólidos sedimentados. El pH de las muestras se ajustó a
aproximadamente pH 5,0. Las muestras se centrifugaron sedimentando
los sólidos. Se resuspendieron dos muestras de control en PBS
ajustadas a pH 5,0. Las dos muestras se centrifugaron sedimentando
los sólidos y se midió el volumen de los sedimentos. Las restantes
18 muestras se resuspendieron en celulasa al 20% más pectinasa al
4% en PBS ajustado a pH 5,0. Las muestras se incubaron a temperatura
ambiente con agitación suave. A aproximadamente intervalos de media
hora, un replicado se centrifugó y el volumen del sedimento se
midió: la reducción de desechos en porcentaje se calculó en
relación al volumen de sedimento promedio de las dos muestras
control. Los resultados se muestran en la figura 1.
Los resultados indican que digestión enzimática
de desechos usando una combinación de celulasa y pectinasa estuvo
aproximadamente completa al 90% en aproximadamente 1 hora y
aproximadamente completa al 99% en 3 a 5 horas. En general, la
celulasa y la pectinasa solubilizaron aproximadamente el 57% de los
desechos en la muestra.
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El uso de enzimas en alimentación de pollos se
conoce por contribuir a la digestibilidad general de los alimentos.
Se evaluó la posibilidad de que las enzimas en la alimentación
redujeran también niveles de sólidos fecales en la recogida de los
oocistos. Una dieta de maíz/soja se probó con o sin la presencia de
enzimas suplementarias en la formulación. Se incluyó una
combinación de tres preparaciones de enzimas comerciales en la dieta
que contenía enzimas (Natugrain®, Selfeed®, y Hemicell®). Las aves
para cocinar se situaron a 9 por corral usando 5 corrales
replicados para cada uno de los dos tratamientos de dieta. Las aves
se inocularon con oocistos de E. maxima. Las heces que
contenían oocistos se recogieron 5 a 8 días tras inoculación. Las
heces se recogieron dentro de una solución antimicrobiana
constituida por ácido cítrico al 10%, peróxido de hidrógeno a
aproximadamente 0,75 al 3%, y ácido propiónico al 0,25%. Cada
muestra replicada se ajustó a volumen total de 8 l, se agitó bien,
y se submuestreó. Se tomaron dos submuestras de -50 ml de cada
muestra y se almacenaron a 4ºC. Las muestras se analizaron para
contenido en desechos y concentración de oocistos. Dos muestras de
8 l replicadas se almacenaron y tamizaron para eliminar partículas
de desecho grandes y se centrifugaron para sedimentar los desechos.
Las variables valoradas en el estudio incluyeron niveles de desecho
iniciales y producción de oocistos inicial por ave.
La tabla 11 muestra el material de sedimento
promedio por ave en heces recogidas 5 a 8 días tras la inoculación
y el promedio de oocistos por ave. Para aquellos corrales donde la
mortalidad tiene lugar el número promedio de aves se calculó en
base a cada día de mortalidad. Los tratamientos se compararon usando
pruebas t de muestras independientes y no se encontraron
diferencias de tratamiento bien para sedimento por ave o bien para
producción de oocistos por ave, aunque el sedimento por ave fue
numéricamente inferior con enzimas añadidas a la dieta.
No se han encontrado diferencias significativas
en volumen de sedimento por ave o producción de oocistos por ave
entre las dietas experimentales con enzimas frente a las dietas
experimentales sin enzimas.
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Se tamizaron las muestras de material fecal
derivadas de la dieta de maíz/soja con o sin enzimas y los
resultados se compararon. Para cada tratamiento, se almacenaron dos
muestras replicadas que representan un total de 18 pájaros y se
tamizaron secuencialmente a través de pantallas de malla de 18, 60,
y 230. Se registraron los volúmenes y se tomaron las submuestras
representativas a cada fase de tamización. Se analizaron las
muestras para contenido en desechos y para concentración de
oocistos. Se calcularon la recuperación de oocistos y la reducción
de desechos a través del proceso de tamización.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados indican que la recuperación de
los oocistos y los niveles de sedimento finales fueron similares
para ambas dietas. Durante el proceso de tamización, se destaca
cuantitativamente que la muestra derivada de la dieta de maíz/soja
+ enzimas fue menos viscosa y se vertió a través de los tamices más
fácilmente que las muestras de tratamiento no enzimático.
En general, el uso de enzimas en la alimentación
no reduce significativamente el volumen de sólidos bien tras
recolección o bien tras tamización. Sin embargo, se observó una
disminución de problemas de cloaca pastosa cuando las aves están
consumiendo la dieta que contiene enzimas, que es probablemente
atribuible al efecto disminuidor de la viscosidad de las enzimas.
Mientras las enzimas en el alimento no son exitosas en reducir la
cantidad de sólidos de partida, la inclusión de enzimas en la dieta
durante la producción de oocistos puede proporcionar beneficios
complementarios tales como salud de las aves general mejorada y
características de tamización mejoradas.
Los materiales producidos usando la dieta de
maíz/soja con o sin enzimas así como una dieta de cebada/soja con
enzimas se probaron adicionalmente usando procesamiento posterior
bien con o bien sin enzimas seguidas por flotación usando dos
diferentes soluciones de flotación.
Una muestra de 3 l de material tamizado se
sedimentó centrifugando a 3000 r.p.m. durante 10 minutos. El
sobrenadante se decantó y el volumen de sedimento se estimó. Se
usaron tres volúmenes de solución de flotación (bien sulfato de
magnesio o bien glicerol-arginina) resuspendiendo el
sedimento. La muestra se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 10
minutos haciendo flotar los oocistos. El sobrenadante completo
incluyendo los oocistos hechos flotar se decantó en otro recipiente
y se diluyó con 4 volúmenes de agua. La muestra se centrifugó a 3000
r.p.m. durante 10 minutos sedimentando los oocistos. El
sobrenadante se decantó y eliminó. El sedimento de los oocistos se
resuspendió en 200 ml de ácido cítrico al 5%.
Una muestra de 3 l de material tamizado se
sedimentó centrifugando a 300 r.p.m. durante 10 minutos. Se decantó
el sobrenadante y se estimó el volumen de sedimento. Se usaron dos
volúmenes de agua resuspendiendo el sedimento. Se añadió fosfato de
potasio dibásico ajustando el pH a 5,0. Se añadió celulasa al 20%, y
se añadió pectinasa al 4%. La muestra se incubó a temperatura
ambiente y se agitó durante aproximadamente 4 horas. La muestra se
centrifugó a 3000 r.p.m. durante 10 minutos. Se decantó el
sobrenadante y se estimó el volumen de sedimento. El sedimento se
resuspendió usando 3 volúmenes de solución de flotación (bien
sulfato de magnesio o bien glicerol-arginina). La
muestra se centrifugó a 300 r.p.m. durante 10 minutos haciendo
flotar a los oocistos. El sobrenadante completo incluyendo los
oocistos hechos flotar se transfirió dentro de otro recipiente y se
diluyó con 4 volúmenes de agua. La mezcla diluida se centrifugó a
3000 rpm durante 10 minutos sedimentando los oocistos. El
sobrenadante se eliminó y el sedimento de oocistos se resuspendió
en 200 ml de ácido cítrico al 5%.
El tratamiento en proceso con enzimas seguidas
por flotación usando glicerol-arginina produjo mejor
eliminación de desechos comparado con otros tratamientos.
Generalmente, la recuperación de oocistos se mejoró usando dieta
basada en cebada.
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Se puso a prueba el efecto de usar enzimas bien
en la alimentación o bien en el procesamiento en oocistos de E.
maxima. Los oocistos de E. maxima se produjeron en pollos
para cocinar bien con o bien sin enzimas en la alimentación. Los
oocistos producidos usando cada alimentación se purificaron después
con o sin enzimas en el procedimiento de purificación.
Para probar la viabilidad de los oocistos
purificados producidos como se describe anteriormente, se situaron
cinco aves para cocinar por corral con cinco corrales por
tratamiento en jaulas en batería. Las aves se alimentaron con
alimento de partida de aves para cocinar normal a lo largo del
estudio. Se administraron a las aves 1000 oocistos de E.
coli esporulados del tratamiento apropiado por medio de sonda
oral. Los oocistos eran de menos de dos meses de edad en el tiempo
de administración. Se sacaron los papeles y se añadieron 2 litros
de fluido de recogida (ácido cítrico al 10% y ácido propiónico al
0,25%) a cada bandeja en D5 tras la prueba. En D8 tras la prueba,
las aves se sometieron a eutanasia, y se recogieron las heces de
cada bandeja individualmente. Se ajustó cada muestra a volumen
total de 4 l con agua, se mezclaron brevemente a velocidad mediana
en un mezclador comercial, y se submuestrearon. Las concentraciones
de oocistos se determinaron usando el procedimiento de McMasters.
Los resultados fueron como se indica en la tabla siguiente.
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El uso de enzimas bien en la dieta o bien en el
procesamiento o bien en ambos no tiene ningún efecto en viabilidad
de los oocistos como se determina mediante producción de
oocistos.
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Los pollos se infectaron con Eimeria, y
las heces ricas en oocistos resultantes se recogieron en una
solución de ácido cítrico al 10%, peróxido de hidrógeno al 0,75%, y
ácido propiónico al 0,25% durante el periodo de producción pico
para cada especie. Las heces se tamizaron retirando las partículas
grandes, y los oocistos se esporularon. La suspensión se centrifugó
sedimentando los oocistos, y se desechó el sobrenadante libre de
oocistos. El material sedimentado que contenía los oocistos se
resuspendió en tampón fosfato a pH \sim5. Las enzimas de celulasa
y pectinasa se añadieron a aproximadamente 5 al 10% cada una en una
base de volumen, y la suspensión se agitó durante toda una noche a
temperatura ambiente. Los oocistos totales y los sólidos totales se
determinaron antes y después de tratamiento enzimático.
\newpage
Los resultados se muestran en la tabla 16 a
continuación:
La digestión enzimática redujo exitosamente el
volumen de sólidos en una media del 59%. La recuperación de
oocistos fue esencialmente cuantitativa en cada caso.
Reducir la cantidad de sólidos a procesarse
tiene efectos positivos en el proceso, incluyendo 1) reducir la
cantidad de reactivos necesitados para el procesamiento posterior,
2) reducir la escala de equipamiento necesaria para el
procesamiento posterior, y 3) mejorar la eficiencia de las etapas de
purificación subsiguientes.
Claims (26)
1. Un procedimiento de purificar oocistos a
partir de una composición de material fecal, que comprende poner en
contacto la composición con polisacaridasa bajo condiciones
suficientes para reducir la cantidad de material fecal en la
composición.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende adicionalmente retirar la
polisacaridasa del contacto con los oocistos.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende adicionalmente
recoger los oocistos tras poner en contacto con la
polisacaridasa.
4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la polisacaridasa comprende
una enzima seleccionada del grupo constituido por celulasa,
pectinasa, amilasa, xilanasa, arabinasa,
alfa-galactosidasa, hemicelulasa,
beta-glucanasa, beta-glucosidasa,
amiloglucosidasa, y cualquier combinación de las mismas.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la polisacaridasa comprende celulasa, o
celulasa y pectinasa.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que la celulasa está
presente en una cantidad en el intervalo de (i) 2 x 10^{4} a 50 x
10^{4} unidades/litro, o (ii) 4 x 10^{4} a 25 x 10^{4}
unidades/litro.
7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento
comprende:
- poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende celulasa y pectinasa, y después
- poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende amilasa.
8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que los oocistos son
oocistos esporulados.
9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que los oocistos son
oocistos de Eimeria.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que los oocistos de Eimeria se
seleccionan del grupo constituido por oocistos de E. maxima,
oocistos de E. mitis, oocistos de E. tenella,
oocistos de E. acervulina, oocistos de E. brunetii, oocistos
de E. necatrix, oocistos de E. praecox, oocistos de
E. mivati, oocistos de E. meleagrimitis, oocistos de
E. adenoedies, oocistos de E. gallopavonis, oocistos
de E. dispersa, oocistos de E. innocua, oocistos de
E. subrotunda, oocistos de E. zuernii, oocistos de
E. bovis, oocistos de E. ahsata, oocistos de E.
bakuensis, oocistos de E. crandallis, oocistos de E.
faurei, oocistos de E. granulosa, oocistos de E.
intrincata, oocistos de E. marsica, oocistos de E.
ovinoidalis, oocistos de E. pallida, oocistos de E.
parva, oocistos de E. weybridgensis, oocistos de E.
intestinalis, oocistos de E. vejdovskyi, oocistos de
E. piriformis, oocistos de E. coecicola, oocistos de
E. irresidua, oocistos de E. flavescens, oocistos de
E. exiguta, oocistos de E. magna, oocistos de E.
perforans, oocistos de E. media, oocistos de E.
stiedai, y cualquier combinación de los mismos.
11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición se
pone en contacto con polisacaridasa durante 30 minutos a 24
horas.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la composición se pone en contacto con
polisacaridasa durante dos horas a diez horas.
13. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición se
pone en contacto con polisacaridasa a una temperatura en el
intervalo de 15ºC a 30ºC.
14. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que la composición se pone en contacto con
polisacaridasa a una temperatura en el intervalo de 21ºC a 27ºC.
15. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición se
pone en contacto con polisacaridasa a un pH en el intervalo de pH 1
a pH 7,5.
16. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en el que la composición se pone en contacto con
polisacaridasa a un pH en el intervalo de pH 4 a pH 6.
17. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento
comprende dos etapas de digestión enzimática, que se llevan a cabo a
pH diferente.
18. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, comprendiendo el procedimiento:
- poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende celulasa y amilasa a un pH en el intervalo de pH 4 a pH 5,5, y después
- poner en contacto la composición con polisacaridasa que comprende amilasa a un pH en el intervalo de pH 4 a pH 7,5.
19. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en el que el procedimiento
comprende un procedimiento de densidad de flotación.
20. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que el un procedimiento de densidad de
flotación se lleva a cabo después de poner en contacto la
composición con polisacaridasa.
21. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que la solución de
densidad de flotación es una solución de sal.
22. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que la solución de sal es una solución de
sulfato de magnesio.
23. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19 o la reivindicación 20, en el que la solución de
densidad de flotación es una solución de glicerol.
24. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23, en el que la solución de glicerol es una solución
de glicerol-poliarginina.
25. El procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el que el material fecal se
ha recogido de un animal al que se ha alimentado con una dieta que
tiene un tamaño de partícula medio grande antes del periodo de
recogida.
26. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 25, en el que la dieta de partículas grandes
comprende cebada o cebada-soja.
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