ES2306677T3 - Procedimiento para la produccion de anticuerpos anticancerosos citotoxicos. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la producción de anticuerpos anticancerosos usando una muestra de tejido canceroso aislada de un individuo particular que comprende: preparar anticuerpos usando la muestra de tejido como un inmunógeno para producir hibridomas; sin ensayar antes la unión a células cancerosas, someter un sobrenadante de dichos hibridomas a un ensayo que mide la citotoxicidad de los anticuerpos preparados respecto a células normales y a células cancerosas; y seleccionar así un subconjunto de anticuerpos que expresan una mejora del grado de citotoxicidad dirigidos hacia células cancerosas y son relativamente benignos respecto de células normales.

Description

Procedimiento para la producción de anticuerpos anticancerosos citotóxicos.

Ámbito de la invención

Esta invención se refiere a la producción de anticuerpos anticancerosos personalizados para el paciente individual que pueden usarse para fines terapéuticos y diagnósticos. La invención se refiere además al procedimiento por el que se preparan los anticuerpos y a sus procedimientos de uso.

Antecedentes de la invención

Cada individuo que se enfrenta al cáncer es único y tiene un cáncer que es tan diferente del resto de los cánceres como la identidad de esa persona. A pesar de esto, la terapia actual trata a todos los pacientes con el mismo tipo de cáncer, en la misma fase, del mismo modo. Al menos el 30% de estos pacientes fracasarán en la terapia de primera línea, conduciendo así a más sesiones de tratamiento y al aumento de la probabilidad de fallo del tratamiento, metástasis y, por último, a la muerte. Una solución mejor para el tratamiento sería la personalización de la terapia para el individuo particular. La única terapia actual que se presta a la personalización es la cirugía. La quimioterapia y el tratamiento con radiación no pueden adaptarse al paciente, y la cirugía es por sí misma inadecuada en la mayoría de los casos para producir curaciones.

Con la llegada de los anticuerpos monoclonales, la posibilidad de desarrollar procedimientos para terapia personalizada se hizo más realista ya que cada anticuerpo puede dirigirse a un único epítopo. Además, es posible producir una combinación de anticuerpos que se dirigen a la constelación de epítopos que define de manera única el tumor de un individuo particular.

Habiendo reconocido que una diferencia significativa entre células cancerosas y normales es que las células cancerosas contienen antígenos que son específicos para células transformadas, la comunidad científica ha mantenido durante mucho tiempo que pueden diseñarse anticuerpos monoclonales para elegir específicamente como diana células transformadas mediante la unión específica a estos antígenos del cáncer, dando lugar así a la creencia de que los anticuerpos monoclonales pueden servir de "balas mágicas" para eliminar células cancerosas.

Sin embargo, en este momento, el paciente con cáncer tiene normalmente pocas opciones de tratamiento. La solución reglamentaria para la terapia del cáncer ha producido mejoras en las tasas de supervivencia y morbilidad globales. Sin embargo, para el individuo particular, estas estadísticas mejoradas no guardan necesariamente relación con una mejora en su situación personal.

Por tanto, si se mostrara una metodología que permitiera al médico tratar cada tumor independientemente de otros pacientes en el mismo cohorte, esto permitiría la solución única de adaptar la terapia a justamente esa persona. Dicha evolución de la terapia aumentaría idealmente la tasa de curaciones y produciría mejores resultados, satisfaciéndose así una necesidad que se sentía desde hace tiempo.

Históricamente, el uso de anticuerpos policlonales se ha usado con éxito limitado en el tratamiento de cánceres humanos. Los linfomas y leucemias se han tratado con plasma humano, pero había poca remisión o respuestas prolongadas. Además, había una falta de reproducibilidad y no había beneficio adicional en comparación con la quimioterapia. Los tumores sólidos tales como cánceres de mama, melanomas y carcinomas de células renales también se han tratado con sangre humana, suero de chimpancé, plasma humano y suero de caballo con resultados correspondientemente impredecibles e ineficaces.

Hay muchos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales para tumores sólidos. En los años 80 hubo al menos cuatro ensayos clínicos paró cáncer de mama humano que sólo produjeron un paciente que respondió al tratamiento de los al menos 47 pacientes que usaron anticuerpos contra antígenos específicos o basados en la selectividad de tejidos. No fue hasta 1998 que hubo un ensayo clínico satisfactorio usando un anticuerpo humanizado anti-her 2 en combinación con cisplatino. En este ensayo, 37 pacientes tuvieron acceso a respuestas, de los cuales aproximadamente un cuarto tuvieron una tasa de respuesta parcial y la otra mitad tuvo menor progresión de la enfermedad o progresión estable de la enfermedad.

Los ensayos clínicos que investigan cáncer colorrectal implican anticuerpos contra dianas tanto de glicoproteínas como de glicolípidos. Los anticuerpos tales como 17-1A, que tienen alguna especificidad para adenocarcinomas, se habían sometido a ensayos clínicos de fase 2 en más de 60 pacientes, teniendo sólo un paciente una respuesta parcial. En otros ensayos, el uso de 17-1A sólo produjo una respuesta completa y dos respuestas menores entre los 52 pacientes en protocolos usando ciclofosfamida adicional. Otros ensayos en los que participó 17-1A dieron resultados similares. El uso de un anticuerpo monoclonal murino humanizado autorizado inicialmente para la obtención de imágenes tampoco produjo regresión tumoral. Hasta la fecha no ha habido un anticuerpo que haya sido eficaz para cáncer colorrectal. Asimismo, igualmente ha habido escasos resultados para cáncer de pulmón, cánceres cerebrales, cánceres de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de estómago. Ha habido algún éxito limitado en el uso de anticuerpo monoclonal anti-GD3 para melanoma. Por tanto, puede verse que, a pesar de los estudios satisfactorios en animales pequeños, que son un requisito esencial para ensayos clínicos en humanos, los anticuerpos que se han probado han sido en general ineficaces.

Patentes anteriores

La patente de EE.UU. n° 5.750.102 describe un procedimiento en el que las células de un tumor del paciente se transfectan con genes de MHC que pueden clonarse de células o tejido del paciente. A continuación, estas células transfectadas se usan para vacunar al paciente.

La patente de EE.UU. n° 4.861.581 describe un procedimiento que comprende las etapas de obtener anticuerpos monoclonales que son específicos para un componente celular interno de células neoplásicas y normales del mamífero, pero no para componentes externos, marcar el anticuerpo monoclonal, poner en contacto el anticuerpo marcado con tejido de un mamífero que ha recibido terapia para destruir células neoplásicas y determinar la eficacia de la terapia midiendo la unión del anticuerpo marcado al componente celular interno de las células neoplásicas degenerativas. En la preparación de los anticuerpos dirigidos hacia antígenos intracelulares humanos, el titular de la patente reconoce que las células malignas representan una fuente conveniente de tales antígenos.

La patente de EE.UU. n° 5.171.665 proporciona un anticuerpo novedoso y procedimiento para su producción. Específicamente, la patente enseña la formación de un anticuerpo monoclonal que tiene la propiedad de unirse fuertemente a un antígeno de proteína asociado con tumores humanos, por ejemplo, aquellos del colon y pulmón, mientras que se une a células normales en mucho menor grado.

La patente de EE.UU. n° 5.484.596 proporciona un procedimiento de terapia del cáncer que comprende extirpar quirúrgicamente tejido tumoral de un paciente humano con cáncer, tratar el tejido tumoral para obtener células tumorales, irradiar las células tumorales para que sean viables, pero no tumorígenas, y usar estas células para preparar una vacuna para el paciente que puede inhibir la reaparición del tumor primario, mientras que inhibe simultáneamente la metástasis. La patente enseña el desarrollo de anticuerpos monoclonales que son reactivos con antígenos de superficie de células tumorales. Como se expone en la col. 4, líneas 45 y sig., los titulares de la patente utilizan células tumorales autóctonas en el desarrollo de anticuerpos monoclonales que expresan inmunoterapia específica activa en neoplasia humana.

La patente de EE.UU. n° 5.693.763 enseña un antígeno de glicoproteína característico de carcinomas humanos y que no depende del tejido epitelial de origen.

La patente de EE.UU. n° 5.783.186 se refiere a anticuerpos anti-Her2 que inducen apóptosis en las células que expresan Her2, líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos, procedimientos para tratar cáncer usando los anticuerpos y composiciones farmacéuticas que incluyen dichos anticuerpos.

La patente de EE.UU. n° 5.849.876 describe nuevas líneas celulares de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales para antígenos de mucina purificados de fuentes de tejido tumoral y no tumoral.

La patente de EE.UU. n° 5.869.268 se refiere a un procedimiento para producir un linfocito humano que produce un anticuerpo específico para un antígeno deseado, un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal, además de anticuerpos monoclonales producidos mediante el procedimiento. La patente se refiere particularmente a la producción de un anticuerpo monoclonal humano anti-HD útil para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres.

La patente de EE.UU. n° 5.869.045 se refiere a anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, conjugados de anticuerpos e inmunotoxinas de una única cadena reactivos con células de carcinoma humano. El mecanismo por el que estos anticuerpos funcionan es doble, porque las moléculas son reactivas con antígenos de la membrana celular presentes en la superficie de carcinomas humanos, y además porque los anticuerpos tienen la capacidad de internalizarse dentro de las células de carcinoma, después de la unión, haciéndolas especialmente útiles para formar conjugados anticuerpo-fármaco y anticuerpo-toxina. En su forma sin modificar, los anticuerpos también manifiestan propiedades citotóxicas a concentraciones específicas.

La patente de EE.UU. n° 5.780.033 describe el uso de autoanticuerpos para terapia tumoral y profilaxis. Sin embargo, este anticuerpo es un autoanticuerpo antinuclear procedente de un mamífero anciano. En este caso se dice que el autoanticuerpo es un tipo de anticuerpo natural encontrado en el sistema inmunitario. Debido a que el autoanticuerpo procede de "un mamífero anciano", no hay necesidad de que el autoanticuerpo proceda en realidad del paciente que va a tratarse. Además, la patente describe un autoanticuerpo antinuclear natural y monoclonal procedente de un mamífero anciano, y una línea celular de hibridoma que produce un autoanticuerpo antinuclear monoclonal.

Resumen de la invención

Esta solicitud enseña un procedimiento para producir anticuerpos anticancerosos específicos para el paciente usando un paradigma novedoso de cribado. Estos anticuerpos pueden prepararse específicamente para un tumor y, por tanto, posibilitan la personalización de la terapia del cáncer. Dentro del contexto de esta solicitud, los anticuerpos anticancerosos que tienen propiedades destructoras de células (citotóxicas) o inhibidoras del crecimiento celular (citostáticas) se denominarán en lo sucesivo citotóxicos. Estos anticuerpos pueden usarse en beneficio de la determinación del estado y diagnóstico de un cáncer, y pueden usarse para tratar metástasis tumorales.

Las perspectivas de tratamiento anticanceroso individualizado provocarán un cambio en el modo en que se trata un paciente. Un escenario clínico probable es que se obtenga una muestra de tumor en el momento de la presentación y se guarde en un banco. A partir de esta muestra, el tumor puede clasificarse según un panel de anticuerpos anticancerosos preexistentes. Se determinará convencionalmente la fase del paciente, pero los anticuerpos disponibles pueden ser útiles en una determinación posterior de la fase del paciente. El paciente puede tratarse inmediatamente con los anticuerpos existentes y puede producirse un panel de anticuerpos específicos para el tumor bien usando los procedimientos explicados resumidamente en este documento o mediante el uso de bibliotecas de expresión en fagos conjuntamente con los procedimientos de cribado descritos en este documento. Todos los anticuerpos generados se añadirán a la biblioteca de anticuerpos anticancerosos, ya que existe la posibilidad de que otros tumores puedan compartir algunos de los mismos epítopos que el que va a tratarse.

Además de anticuerpos anticancerosos, el paciente puede optar por recibir las terapias actualmente recomendadas como parte de una pauta posológica multimodal de tratamiento. El hecho de que los anticuerpos aislados mediante la presente metodología sean relativamente no tóxicos para células no cancerosas permite que se usen combinaciones de anticuerpos a altas dosis, bien solos o conjuntamente con terapia convencional. El alto índice terapéutico también permitirá volver a tratar en un corto periodo de tiempo, lo que debería disminuir la probabilidad de aparición de células resistentes al tratamiento.

Si el paciente no responde al tratamiento inicial de la terapia o desarrolla metástasis, puede repetirse el procedimiento de generación de anticuerpos específicos para el tumor para repetir el tratamiento. Además, los anticuerpos anticancerosos pueden conjugarse con glóbulos rojos obtenidos de ese paciente y volver a infundirlos para el tratamiento de la metástasis. Ha habido pocos tratamientos eficaces para cáncer metastático y las metástasis normalmente auguran un escaso éxito, dando como resultado la muerte. Sin embargo, los cánceres metastáticos están normalmente bien vascularizados y la administración de anticuerpos anticancerosos mediante glóbulos rojos puede tener el efecto de concentrar los anticuerpos en el sitio del tumor. Incluso antes de la metástasis, la mayoría de las células cancerosas dependen del aporte de sangre del huésped para su supervivencia, y los glóbulos rojos conjugados con anticuerpos anticancerosos también pueden ser eficaces contra tumores in situ. Alternativamente, los anticuerpos pueden conjugarse con otras células hematógenas, por ejemplo linfocitos, macrófagos, monocitos, células asesinas naturales, etc.

Hay cinco clases de anticuerpos y cada una está asociada con una función que se confiere por su cadena pesada. Generalmente se piensa que la destrucción de células cancerosas mediante anticuerpos desnudos está mediada por la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o la citotoxicidad dependiente del complemento. Por ejemplo, los anticuerpos murinos contra IgM e IgG2a pueden activar el complemento humano uniendo el componente C-1 del sistema del complemento, activando así la ruta clásica de la activación de complementos que puede llevar a la lisis tumoral. Para anticuerpos humanos, los anticuerpos activadores del complemento más eficaces son generalmente IgM e IgG1. Los anticuerpos murinos del isotipo IgG2a e IgG3 son eficaces en el reclutamiento de células citotóxicas que tienen receptores Fc que llevarán a la destrucción de células por monocitos, macrófagos, granulocitos y ciertos linfocitos. Los anticuerpos humanos tanto del isotipo IgG1 como del IgG3 participan en la ADCC.

Otro mecanismo posible de destrucción del cáncer mediado por anticuerpos puede ser mediante el uso de anticuerpos que actúan para catalizar la hidrólisis de diversos enlaces químicos en la membrana celular y sus glicoproteínas o glicolípidos asociados, los denominados anticuerpos catalíticos.

Hay dos mecanismos adicionales de destrucción de células cancerosas mediados por anticuerpos que están más ampliamente aceptados. El primero es el uso de anticuerpos como una vacuna para inducir que el cuerpo produzca una respuesta inmunitaria contra el antígeno del cáncer putativo que reside en la célula tumoral. El segundo es el uso de anticuerpos para elegir como diana receptores del crecimiento y afectar a su función o para regular por disminución ese receptor de manera que se pierda eficazmente su función.

Por consiguiente, un objetivo de la invención es enseñar un procedimiento para producir anticuerpos anticancerosos a partir de células derivadas de un individuo particular que son citotóxicas con respecto a las células cancerosas, aunque simultáneamente son relativamente no tóxicas para células no cancerosas.

Descripción detallada de la invención

Uno de los beneficios potenciales de los anticuerpos monoclonales con respecto al tratamiento del cáncer es su capacidad para reconocer específicamente antígenos individuales. Se pensó que, en algunos casos, las células cancerosas poseían antígenos que eran específicos para ese tipo de célula transformada. Ahora se cree más frecuentemente que las células cancerosas tienen pocos antígenos únicos, sino que más bien tienden a sobreexpresar un antígeno normal o a expresar antígenos fetales. Sin embargo, el uso de anticuerpos monoclonales proporcionó un procedimiento para administrar dosis reproducibles de anticuerpos al paciente con la esperanza de mejores tasas de respuesta que con los anticuerpos policlonales.

Tradicionalmente, los anticuerpos monoclonales se han preparado según principios fundamentales establecidos por Kohler y Milstein. Los ratones se inmunizan con antígenos, con o sin adyuvantes. Los esplenocitos se recogen del bazo para fusionarse con componentes de hibridoma inmortalizado. Éstos se siembran en placas de microvaloración, en las que pueden segregar anticuerpos en el sobrenadante que se usa para el cultivo celular. Para seleccionar de entre los hibridomas que se han sembrado en placa aquellos que producen los anticuerpos de interés, los sobrenadantes de hibridoma se prueban normalmente para la unión de anticuerpos a antígenos en un ensayo ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas). La idea es que los pocillos que contienen el hibridoma de interés contendrán anticuerpos que se unirán más ávidamente al antígeno de prueba, normalmente el antígeno inmunizante. A continuación, estos pocillos se subclonan en un modo de dilución limitante para producir hibridomas monoclonales. La selección de los clones de interés se repite usando un ensayo ELISA para probar la unión del anticuerpo. Por tanto, el principio que se ha transmitido es que, en la producción de anticuerpos monoclonales, los hibridomas que producen los anticuerpos que se unen más ávidamente son aquellos que se seleccionan de entre todos los hibridomas que se produjeron inicialmente. Es decir, el anticuerpo preferido es aquel con la mayor afinidad por el antígeno de interés.

Se han realizado muchas modificaciones de este procedimiento tales como usar células completas para la inmunización. En este procedimiento, en lugar de usar antígenos purificados, se usan células enteras para la inmunización. Otra modificación es el uso de ELISA celular para el cribado. En este procedimiento, en lugar de usar en el ELISA antígenos purificados como diana, se usan células fijadas. Además de pruebas de ELISA, en el procedimiento de cribado también se han usado ensayos de citotoxicidad mediada por el complemento. Sin embargo, los ensayos de unión del anticuerpo se usaron conjuntamente con pruebas de citotoxicidad. Por tanto, a pesar de muchas modificaciones, el procedimiento para producir anticuerpos monoclonales se basa en la unión del anticuerpo al antígeno de prueba como criterio de valoración.

La mayoría de los anticuerpos dirigidos contra células cancerosas se han producido usando los procedimientos tradicionales explicados resumidamente anteriormente. Estos anticuerpos se han usado tanto terapéutica como diagnósticamente. En general, para estas dos aplicaciones, el anticuerpo se ha usado como agente director que administra una carga útil al sitio del cáncer. Estos conjugados de anticuerpos pueden ser radiactivos, tóxicos, o servir de intermedios para administrar más fármaco al cuerpo, tal como una enzima o biotina. Además, hasta recientemente se consideró generalmente que los anticuerpos desnudos tenían poco efecto in vivo. Tanto HERCEPTIN como RITUXIMAB son anticuerpos monoclonales murinos humanizados que han sido recientemente autorizados por la FDA para uso humano. Sin embargo, estos dos anticuerpos se prepararon inicialmente ensayando la unión de anticuerpos y su citotoxicidad directa no fue el objetivo primario durante la producción de hibridomas. Por tanto, cualquier tendencia de estos anticuerpos a producir la destrucción de células tumorales es por casualidad, no por diseño.

Aunque la producción de anticuerpos monoclonales se ha llevado a cabo usando la inmunización de células completas para diversas aplicaciones, el cribado de estos hibridomas se ha basado en antígenos diana putativos o identificados o en la selectividad de estos hibridomas para tejidos específicos. Es axiomático que los mejores anticuerpos son aquellos con las mayores constantes de unión. Este concepto se originó del principio bioquímico básico de que las enzimas con las mayores constantes de unión eran aquellas que eran las más eficaces para catalizar una reacción. Este concepto puede aplicarse a la unión de ligandos a receptores en la que la molécula de fármaco que se une al receptor con la mayor afinidad tiene normalmente la mayor probabilidad de iniciar o inhibir una señal. Sin embargo, esto no puede ser siempre el caso ya que es posible que en ciertas situaciones haya casos en los que la iniciación o inhibición de una señal pueda estar mediada por la unión a no receptores. La información transmitida por un cambio conformacional inducido por la unión de ligandos puede tener muchas consecuencias tales como una transducción de señales, endocitosis, entre otros. La capacidad para producir un cambio conformacional en una molécula de receptor puede no ser necesariamente debida a la ocupación de un sitio del ligando-receptor, pero puede producirse mediante la unión de otro dominio celular adicional o debido a la agrupación de receptores inducida por un ligando multivalente.

La producción de anticuerpos para producir la destrucción de células no necesita basarse en el cribado de los hibridomas para los anticuerpos de mejor unión. Más bien, aunque no es recomendado por aquellos que producen anticuerpos monoclonales, el cribado de los sobrenadantes de hibridoma para la destrucción de células o alternativamente para el cese del crecimiento de las células cancerosas puede seleccionarse como un criterio de valoración deseable para la producción de anticuerpos citotóxicos o citostáticos. Se entiende bien que los anticuerpos in vivo logran su función a través de las porciones Fc y que la utilidad del anticuerpo terapéutico está determinada por la funcionalidad de la región constante o restos unidos. En este caso, la porción FAb del anticuerpo, la porción que se combina con el antígeno, conferirá al anticuerpo su especificidad y la porción Fc su funcionalidad. El sitio del anticuerpo que se combina con el antígeno puede considerarse como que es el producto de una biblioteca combinatoria natural. El resultado de la reorganización de la región variable del anticuerpo puede considerarse una biblioteca combinatoria molecular en la que la salida es un péptido. Por tanto, el muestreo de esta biblioteca combinatoria puede basarse en cualquier parámetro. Al igual que el muestreo de una biblioteca de compuestos naturales para antibióticos, es posible muestrear una biblioteca de anticuerpos para compuestos citotóxicos o citostáticos.

Los diversos criterios de valoración en un cribado deben diferenciarse entre sí. Por ejemplo, la diferencia entre la unión del anticuerpo a la célula es distinta de la destrucción de la célula. La destrucción de células (citotoxicidad) es distinta de los mecanismos de muerte celular tales como oncosis o apóptosis. Puede haber muchos procedimientos por los que se consiga la muerte celular y algunos de estos pueden conducir a oncosis o a apóptosis. Se especula que hay otros mecanismos de muerte celular distintos de la oncosis o apóptosis, pero independientemente de cómo muere la célula, hay algunas características comunes de muerte celular. Una de éstas es la ausencia de metabolismo y otra es la desnaturalización de enzimas. En cualquier caso, las tinciones vitales fracasarán al teñir estas células. Estos criterios de valoración de muerte celular se han entendido desde hace tiempo y son anteriores al entendimiento actual de los mecanismos de muerte celular. Además, existe la distinción entre efectos citotóxicos, en los que las células se destruyen, y efectos citostáticos, en los que se inhibe la proliferación de células.

En una realización preferida de la presente invención, el ensayo se realiza centrándose en la actividad citotóxica hacia células cancerosas como criterio de valoración. En una realización preferida se utiliza un kit de ensayo de células vivas/muertas, por ejemplo el kit de ensayo de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD® (L-3224) de Molecular Probes. El kit de Molecular Probes proporciona un ensayo de viabilidad celular de fluorescencia de dos colores que se basa en la determinación simultánea de células vivas y muertas con dos sondas que miden dos parámetros reconocidos de viabilidad celular-actividad de la esterasa intracelular e integridad de la membrana plasmática. Los principios del ensayo son generales y pueden aplicarse a la mayoría de los tipos de células eucariotas, incluyendo células adherentes y ciertos tejidos, pero no a bacterias o levadura. Este procedimiento basado en la fluorescencia para evaluar la viabilidad celular se prefiere en lugar de tales ensayos como exclusión con azul de tripano, liberación de Cr y procedimientos similares para determinar la viabilidad y citotoxicidad celulares.

En la realización del ensayo, las células vivas se distinguen por la presencia de actividad ubicua de la esterasa intracelular, determinada por la conversión enzimática de la calceína AM penetrante a células prácticamente no fluorescente respecto a la calceína intensamente fluorescente. El colorante polianiónico calceína se retiene bien dentro de las células vivas, produciendo una fluorescencia verde uniforme intensa en células vivas (ex/em \sim495 nm/\sim515 nm). EthD-1 entra en células con membranas dañadas y experimenta una mejora de la fluorescencia de 40 veces con la unión a ácidos nucleicos, produciéndose así uña fluorescencia roja brillante en células muertas (ex/em \sim495 nm/\sim635 nm). EthD-1 es excluido por las membranas plasmáticas intactas de células vivas. La determinación de la viabilidad celular depende de estas propiedades físicas y bioquímicas de las células. Los acontecimientos citotóxicos que no afectan estas propiedades celulares no pueden evaluarse con exactitud usando este procedimiento. Los niveles de fluorescencia de fondo son inherentemente bajos con esta técnica de ensayo porque los colorantes son prácticamente no fluorescentes antes de interaccionar con las células.

Además de los diversos criterios de valoración para el cribado, hay otras dos características muy importantes del procedimiento de cribado. La biblioteca de productos génicos de anticuerpos no es una biblioteca aleatoria, pero es el producto de un procedimiento de sesgado. En los ejemplos siguientes, el sesgado se produce inmunizando ratones con células fijadas. Esto aumenta la proporción de anticuerpos que tienen el potencial de unirse al antígeno diana. Aunque la inmunización se entiende como una forma para producir anticuerpos de mayor afinidad (maduración de la afinidad), no es en este caso. Más bien puede considerarse como una forma para desplazar el conjunto de sitios que se combinan con el antígeno hacia las dianas. Esto también es distinto del concepto de cambio de isotipo, en el que la funcionalidad, como se impone por la porción constante de la cadena pesada, cambia del isotipo de IgM inicial a otro isotipo tal como IgG.

El tercer rasgo clave que es crucial en el procedimiento de cribado es el uso de cribado de múltiples dianas. La especificidad está relacionada hasta un cierto grado con la afinidad. Un ejemplo de esto es la situación en la que un antígeno tiene una distribución de tejido muy limitada y la afinidad del anticuerpo es un determinante clave de la especificidad del anticuerpo - cuanto mayor sea la afinidad, más tejido específico para el anticuerpo, y asimismo un anticuerpo con baja afinidad puede unirse a tejidos distintos de aquel de interés. Por tanto, para dirigir la cuestión de la especificidad, los anticuerpos se criban simultáneamente contra una variedad de células. En los ejemplos siguientes, los sobrenadantes de hibridoma (que representan las fases más tempranas del desarrollo de anticuerpos monoclonales) se prueban contra varias líneas celulares para establecer la especificidad, además de la actividad.

Los anticuerpos se diseñan para el tratamiento terapéutico del cáncer en pacientes. Idealmente, los anticuerpos pueden ser anticuerpos desnudos. También pueden estar conjugados con toxinas. Pueden usarse para elegir como diana otras moléculas para el cáncer, por ejemplo enzimas conjugadas con biotina. Para la conjugación también pueden usarse compuestos radiactivos.

Se prevé que estos anticuerpos puedan usarse para el diagnóstico, pronóstico y control del cáncer. Por ejemplo, pueden haberse extraído muestras de sangre de los pacientes para liberarse de antígenos tumorales que pueden detectarse mediante estos anticuerpos en diferentes formatos tales como ensayos ELISA, formatos de paneles de pruebas rápidas, etc. Los anticuerpos pueden usarse para teñir biopsias de tumores con los fines de diagnóstico. Además, puede usarse un panel de anticuerpos terapéuticos para probar muestras de pacientes para determinar si hay algún anticuerpo adecuado para uso terapéutico.

Ejemplo uno

Con el fin de producir anticuerpos monoclonales específicos para una muestra de tumor, el procedimiento de selección de los pocillos de hibridoma apropiados se complica por la probabilidad de seleccionar pocillos que producirán señales positivas falsas. Es decir, existe la probabilidad de producir anticuerpos que pueden reaccionar contra células normales, además de células cancerosas. Para obviar esta posibilidad, una estrategia es ocultar los anticuerpos anti-antígenos normales del procedimiento de selección. Esto puede llevarse a cabo eliminando los anticuerpos anti-normales en la primera fase de cribado, revelándose así la presencia de los anticuerpos deseados. Un clonado posterior por dilución limitante puede definir los clones que no producirán la destrucción de células de control, pero producirán la destrucción de células cancerosas diana.

Las piezas de biopsia de tumores de mama, melanoma y pulmón se obtuvieron y se guardaron a -70°C hasta que se usaron. Se prepararon suspensiones individuales de células y se fijaron con -30°C, etanol al 70%, se lavaron con PBS y se reconstituyeron hasta un volumen apropiado para inyección. Se inmunizaron ratones Balb/c con 2,5x10^{5}-1x10^{6} células y se reforzaron cada tercera semana hasta que se realizó un refuerzo final previo a la fusión tres días antes de la esplenectomía. Los hibridomas se prepararon mediante fusión de los esplenocitos aislados con los constituyentes del mieloma Sp2/0 y NS1. Los sobrenadantes de las fusiones se probaron para subclonar los hibridomas. Las células (incluyendo células del melanoma A2058, fibroblastos de CCD-12CoN, células de mama MCF-12A, entre otras) se obtuvieron de ATCC y se cultivaron según las instrucciones adjuntas. La línea celular HEY fue un obsequio de la Dr. Inka Brockhausen. Las células no cancerosas, por ejemplo fibroblastos de CCD-12CoN y células de mama MCF-12A, se sembraron en placa en placas de microvaloración de 96 pocillos (NUNC) 1 a 2 semanas antes del cribado. Las células cancerosas, por ejemplo HEY, A2058, BT 483 y HS294t, se sembraron en placa dos o tres días antes del cribado.

Las células normales sembradas en placa se fijaron antes de uso. Las placas se lavaron con 100 microlitros de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se secaron por aspiración. A cada pocillo se añadieron 75 microlitros de glutaraldehído al 0,01 por ciento diluido en PBS durante cinco minutos y luego se aspiraron. Las placas se lavaron tres veces con 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Los pocillos se vaciaron y a cada pocillo se añadió durante una hora a temperatura ambiente 100 microlitros de albúmina de suero humano al uno por ciento en PBS. A continuación, las placas se guardaron a cuatro grados Celsius.

Antes de transferir el sobrenadante de las placas de hibridoma, las células normales fijadas se lavaron tres veces con 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Después de la aspiración, los microlitros de los sobrenadantes primarios del cultivo de hibridoma se transfirieron a las placas de células fijadas y se incubaron durante dos horas a 37 grados Celsius en un incubador con 8 por ciento de CO_{2}. Los sobrenadantes de hibridoma derivados del melanoma se incubaron con células CCD-12 CoN y aquellos derivados del cáncer de mama se incubaron con células MCF-12a. Después de la incubación, el sobrenadante absorbido se dividió en dos porciones de 75 microlitros y se transfirieron a placas de células cancerosas diana. Antes de la transferencia, las placas de células cancerosas se lavaron tres veces con 100 microlitros de PBS. El sobrenadante de las células CCD-12 CoN se transfirió a las células A2058 y HS294t, mientras que el sobrenadante de las células MCF-12A se transfirió a las células HEY y BT 483. Las células cancerosas se incubaron con los sobrenadantes de hibridoma durante 18 horas a 37 grados Celsius en un incubador con 8 por ciento de CO_{2}.

El ensayo de citotoxicidad con Live/Dead se obtuvo de Molecular Probes (Eu, OR). Los ensayos se realizaron según las instrucciones del fabricante con los cambios explicados resumidamente más adelante. Las placas con las células se lavaron una vez con 100 microlitros de PBS a 37°C. Se transfirieron de 75 a 100 microlitros de sobrenadante de las placas de microvaloración de hibridoma a las placas de células y se incubaron en un incubador con 8% de CO_{2} durante 18-24 horas. A continuación, los pocillos que sirvieron como control de todas las células muertas se aspiraron hasta vaciarlos y se añadieron 50 microlitros de etanol al 70%. A continuación, la placa se vació invirtiéndola y se secó con material absorbente. Se dispensó PBS a temperatura ambiente a cada pocillo de un frasco lavador multicanal, se golpeó tres veces, se vació mediante inversión y luego se secó con material absorbente. A cada pocillo se añadieron 50 microlitros del colorante Live/Dead fluorescente diluido en PBS y se incubaron a 37°C en un incubador con 5% de CO_{2} durante una hora. Las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de placas Perkin-Elmer HTS7000 y los datos se analizaron en Microsoft Excel.

Se realizaron cuatro sesiones de cribado para producir cultivos individuales de hibridoma clonado. Durante dos sesiones de cribado, los sobrenadantes de hibridoma se probaron sólo contra las células cancerosas. En la última sesión de cribado, el sobrenadante se probó contra varias células no cancerosas, además de las células diana indicadas en la tabla 1. Los anticuerpos se clasificaron en isotipos usando un kit comercial de clasificación de isotipos.

Se produjeron varios anticuerpos monoclonales según el procedimiento de la presente invención. Estos anticuerpos, cuyas características se resumen en la tabla 1, se identifican como 3BD-3, 3BD-6, 3BD-8, 3BD-9, 3BD-15, 3BD-25, 3BD-26 y 3BD-27. Estos anticuerpos se consideran monoclonales después de cuatro sesiones de clonado por dilución limitante. Los anticuerpos anti-melanoma no produjeron destrucción significativa de células cancerosas. El panel de anticuerpos anti-cáncer de mama destruyó el 32-87% de las células diana y < 1-3% de las células de control. El isotipo predominante fue IgG1, aún cuando se esperaba que la mayoría de los anticuerpos anti-tumorales se dirigirían contra antígenos de carbohidratos, y por tanto, serían del tipo IgM. Existe un alto índice terapéutico ya que la mayoría de los anticuerpos perdonan a las células de control de la muerte celular.

TABLA 1 Anticuerpos anti-cáncer de mama

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Ejemplo 2

En este ejemplo, anticuerpos anticancerosos personalizados se producen obteniendo primero muestras del tumor del paciente. Normalmente, ésta es de una pieza de biopsia de un tumor sólido o una muestra de sangre de tumores hematógenos. Las muestras se preparan en suspensiones celulares individuales y se fijan para inyección en ratones. Después de completarse el programa de inmunización, los hibridomas se producen a partir de los esplenocitos. Los hibridomas se criban contra una variedad de líneas celulares cancerosas y células normales en ensayos de citotoxicidad habituales. Aquellos hibridomas que son reactivos contra líneas celulares cancerosas, pero no son reactivas contra células normales no transformadas, se seleccionan para posterior propagación. Los clones que se consideraron positivos fueros aquellos que destruyeron selectivamente las células cancerosas, pero no destruyeron las células no transformadas. Los anticuerpos se caracterizan por un gran número de parámetros bioquímicos y luego se humanizan para uso terapéutico. Las células tumorales de melanoma se aislaron y las líneas celulares se cultivaron como se describe en el ejemplo 1. Se inmunizaron ratones Balb/c según el siguiente programa: 200.000 células s.c. e i.p. en el día 0, luego se inyectaron i.p. 200.000 células en el día 21, luego se inyectaron 1.000.000 de células en el día 49, luego se inyectaron i.p. 1.250.000 células en adyuvante completo de Freund en el día 107, y luego se inyectaron 200.000 células i.p. en el día 120 y luego los ratones se sacrificaron en el día 123. Los bazos se recogieron y los esplenocitos se dividieron en dos alícuotas para fusionarse con constituyentes del mieloma Sp2/0 (1LN) o NS-1 (2LN) usando los procedimientos explicados resumidamente en el ejemplo 1.

El cribado se llevó a cabo 11 días después de la fusión contra células del melanoma A2058 y fibroblastos de CCD-12CoN. Cada par de placas se lavó con 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente y luego se aspiró hasta casi sequedad. Luego se añadieron 50 microlitros de sobrenadante de hibridoma a los mismos pocillos en cada una de las dos placas. El sobrenadante de Sp2/0 gastado se añadió a los pocillos de control al mismo volumen y las placas se incubaron durante aproximadamente 18 horas a 37 grados Celsius en un incubador a 8% de CO_{2}, 98% de humedad relativa. A continuación, se sacó cada par de placas y los medios se sustituyeron en los pocillos de control positivos por 50 microlitros de etanol al 70% durante 4 segundos. A continuación, las placas se invirtieron y se lavaron una vez con PBS a temperatura ambiente y se secaron. Luego se añadieron 50 ul del colorante Live/Dead fluorescente diluido en PBS (kit Live/Dead de Molecular Probes) durante una hora y se incubaron a 37 grados Celsius. A continuación, las placas se leyeron en un lector de fluorescencia de placas de Perkin-Elmer y los datos se analizaron usando Microsoft Excel. Los pocillos que se consideraron positivos se subclonaron y el mismo procedimiento de cribado se repitió 13 días después y luego 33 días después. Los resultados del último cribado se explican resumidamente en la tabla 2 de a continuación. Se produjeron varios anticuerpos monoclonales según el procedimiento de la presente invención. Estos anticuerpos, cuyas características se resumen en la tabla 2, se identifican como 1LN-1, 1LN-12, 1LN-14, 2LN-21, 2LN-28, 2LN-29, 2LN-31, 2LN-33, 2LN-34 y 2LN-35.

TABLA 2 Anticuerpos anti-melanoma

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La tabla ilustra que los clones de tanto las fusiones de Sp2/0 como de NS-1 pudieron producir anticuerpos que tenían una tasa de destrucción superior al 50% para células cancerosas y, al mismo tiempo, algunos de los clones pudieron producir una destrucción inferior al uno por ciento de fibroblastos normales de control.

Los anticuerpos anticancerosos de la invención son útiles para tratar un paciente con una enfermedad cancerosa cuando se administran en mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable, por ejemplo solución salina normal, una emulsión de lípidos, albúmina, solución salina tamponada con fosfato o similares, y se administran en una cantidad eficaz para lograr el tratamiento de dicha enfermedad cancerosa, por ejemplo con un intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 1 g/ml.

El procedimiento para tratar un paciente que padece una enfermedad cancerosa puede incluir además el uso de anticuerpos anticancerosos conjugados y esto incluiría conjugar anticuerpos anticancerosos específicos para el paciente con un miembro seleccionado del grupo que está constituido por toxinas, enzimas, compuestos radiactivos y células hematógenas; y administrar estos anticuerpos conjugados al paciente; en el que dichos anticuerpos anticancerosos se administran en mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable, por ejemplo solución salina normal, una emulsión de lípidos, albúmina, solución salina tamponada con fosfato o similares, y se administran en una cantidad eficaz para lograr el tratamiento de dicha enfermedad cancerosa, por ejemplo con un intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a aproximadamente 1 g/l. En una realización particular, los anticuerpos anticancerosos útiles en cualquiera de los procedimientos anteriormente explicados resumidamente pueden ser un anticuerpo humanizado.

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante sólo es para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto mucho cuidado en recabar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP niega cualquier responsabilidad en este aspecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5750102 A [0010]

\bullet US 5783186 A [0015]

\bullet US 4861581 A [0011]

\bullet US 5849876 A [0016]

\bullet US 5171665 A [0012]

\bullet US 5869268 A [0017]

\bullet US 5484596 A [0013]

\bullet US 5869045 A [0018]

\bullet US 5693763 A [0014]

\bullet US 5780033 A [0019]

Claims (3)

1. Un procedimiento para la producción de anticuerpos anticancerosos usando una muestra de tejido canceroso aislada de un individuo particular que comprende:

preparar anticuerpos usando la muestra de tejido como un inmunógeno para producir hibridomas;

sin ensayar antes la unión a células cancerosas, someter un sobrenadante de dichos hibridomas a un ensayo que mide la citotoxicidad de los anticuerpos preparados respecto a células normales y a células cancerosas; y

seleccionar así un subconjunto de anticuerpos que expresan una mejora del grado de citotoxicidad dirigidos hacia células cancerosas y son relativamente benignos respecto de células normales.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de eliminar anticuerpos anti-antígenos normales de dichos anticuerpos preparados antes de realizar dicho ensayo de citotoxicidad mediante absorción previa del sobrenadante de hibridoma con células normales.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que incluye además la etapa de humanizar dicho subconjunto de anticuerpos que expresan una mejora del grado de citotoxicidad dirigidos hacia células cancerosas y son relativamente benignos respecto de células normales.