ES2306711T3 - Metodo y composicion destinada a la prevencion y al tratamiento de la anemia. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un análogo de eritropoyetina hiperglicosilado y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde el análogo hiperglicosilado comprende al menos un sitio de glicosilación adicional que tiene una cadena carbohidratada anclada, y donde el análogo hiperglicosilado tiene una actividad biológica in vivo incrementada.

Description

Método y composición destinada a la prevención y al tratamiento de la anemia.

Campo de la invención

La invención se refiere al incremento del hematocrito en un mamífero utilizando una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde el análogo hiperglicosilado comprende al menos un sitio de glicosilación adicional que tiene una cadena carbohidratada anclada a éste, y donde el análogo hiperglicosilado tiene una actividad biológica in vivo incrementada. También se proporciona dicha proteína de fusión.

Antecedentes de la invención

La eritropoyetina (Epo) es una hormona glicoprotéica necesaria para la maduración de células progenitoras eritroides a eritrocitos. Es producida en el riñón y es esencial en la regulación de los niveles de glóbulos rojos en la circulación. Las condiciones marcadas por bajos niveles de oxígeno tisular señalan un aumento de la producción de Epo, lo que a su vez estimula la eritropoyesis. Una pérdida de la función renal como la que se observa en la insuficiencia renal crónica (CRF), por ejemplo, da como resultado típicamente un descenso de la producción de Epo y una reducción concomitante de los glóbulos rojos.

Miyake et al. (J. Biol. Chem. 252, 5558 (1977)) purificaron Epo de orina humana a partir de pacientes con anemia aplásica. Sin embargo, la cantidad de proteína Epo purificada obtenida de esta fuente fue insuficiente para aplicaciones terapéuticas. La identificación y clonación del gen que codifica la Epo humana y la expresión de la proteína recombinante fueron descritas en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.703.008 de Lin. Un método para la purificación de eritropoyetina humana recombinante a partir de medio celular se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.667.016 de Lai et. al. La producción de Epo biológicamente activa a partir de células anfitrionas de mamífero ha hecho asequibles, por primera vez, cantidades de Epo adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Además, el conocimiento de la secuencia génica y el aumento de disponibilidad de proteína purificada han conducido a una mejor comprensión del modo de acción de esta proteína.

Tanto la Epo derivada de orina humana (Miyake et al. supra) como la Epo humana recombinante expresada en células de mamífero contienen tres cadenas oligosacáridas unidas a N y una unida a O que comprenden juntas aproximadamente un 40% del peso molecular total de la glicoproteína. La glicosilación unida a N se produce en los restos asparragina localizados en las posiciones 24, 38 y 83 mientras la glicosilación unida a O se produce en un resto serina localizado en la posición 126 (Lai et al. J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy et al. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988)). Se ha demostrado que las cadenas oligosacáridas están modificadas con restos ácido siálico terminales con cadenas unidas a N que tienen típicamente hasta cuatro ácidos siálicos por cadena y cadenas unidas a O que tienen hasta dos ácidos siálicos. Por lo tanto un polipéptido Epo puede acomodar hasta un total de 14 ácidos siálicos.

Diversos estudios han demostrado que las alteraciones de las cadenas carbohidratadas de Epo pueden afectar a la actividad biológica. En un estudio, no obstante, la eliminación de las cadenas oligosacáridas unidas a N o unidas a O individualmente o juntas mediante mutagénesis de los restos asparragina o serina que son sitios de glicosilación reduce drásticamente la actividad in vitro de la Epo alterada que es producida en células de mamíferos (Dube et. al. J. Biol. Chem. 263, 17516 (1988)). Sin embargo, DeLorme et al. (Biochemistry 31, 9871-9876 (1992)) informaron de que la eliminación de los sitios de glicosilación unidos a N en la Epo reducía la actividad biológica in vivo pero no in vitro.

La relación entre el contenido de ácido siálico de la Epo y la actividad biológica in vivo se describió determinando la actividad in vivo de las isoformas de Epo aisladas. Se encontró que un incremento por etapas en el contenido de ácido siálico por molécula de Epo producían un incremento por etapas correspondiente en la actividad biológica in vivo medida mediante la capacidad de las concentraciones equimolares de las isoformas de Epo aisladas para elevar el hematocrito de ratones normales (Egrie et al. Glycoconjugate J. 10, 263 (1993)). Aquellas isoformas de Epo que tenían un contenido de ácido siálico superior también mostraban una vida media en suero más larga pero una disminucion de la afinidad por el receptor de Epo, sugiriendo que la vida media en suero es un determinante importante de la actividad biológica in vivo.

La introducción de nuevos sitios de glicosilación en el polipéptido Epo puede dar como resultado la producción de molécula con cadenas carbohidratadas adicionales. Véanse las Publicaciones PCT Núms. WO91/05867 y WO 9505465. Se describen los análogos de glicosilación de Epo que tienen al menos una cadena carbohidratada unida a N adicional y/o que tienen al menos una cadena carbohidratada unida a O adicional. Se determinó que un análogo de glicosilación que tiene una cadena unida a N adicional tenía una vida media en la circulación más larga en comparación con la Epo humana recombinante (rHuEpo) (-isoformas 9-14) y con una isoforma purificada de rHuEpo que tenía 14 ácidos siálicos por molécula.

La administración de eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) es eficaz al aumentar los niveles de glóbulos rojos en paciente anémicos con enfermedad renal en fase terminal (Eschbach et al. New Eng. J. Med. 316, 73-38 (1987)). Estudios posteriores han demostrado que el tratamiento con rHuEpo puede corregir la anemia asociada con una variedad de condiciones distintas. (Fischl et al. New Eng. J. Med. 322, 1488-1493 (1990); Laupacis, Lancet 341, 1228-1232 (1993). Se han concedido aprobaciones reguladoras para el uso de rHuEpo en el tratamiento de la anemia asociada con CRF, la anemia relacionada con la terapia con AZT (zidovudina) en paciente infectados con VIH, la anemia en pacientes con malignidades no mieloides que reciben quimioterapia, y la anemia en pacientes que son sometidos a cirugía para reducir la necesidad de transfusiones de sangre alogénicas. La terapia actual para todas las indicaciones aprobadas (excepto la indicación en cirugía) implica una dosis inicial entre 50 y 150 Unidades/kg tres veces a la semana (TIW) administrada mediante inyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) hasta alcanzar el intervalo de hematocrito diana sugerido. Para la indicación en cirugía, la rHuEpo se administra cada 10 días antes de la intervención, el día de la intervención, y cuatro días después de esta (EPOGEN® Package Insert, 12/23/96). En general, las dosis iniciales recomendadas actualmente para rHuEpo elevan el hematocrito al intervalo diana en aproximadamente seis a ocho semanas. Una vez que se ha alcanzado el intervalo del hematocrito diana, se establece un programa de dosificación de mantenimiento que variará dependiendo del paciente, pero es típicamente tres veces por semana para los pacientes anémicos con CRF. La administración de rHuEpo descrita antes representa un régimen eficaz y bien tolerado para el tratamiento de la anemia.

En la publicación WO0024893 se describen métodos para incrementar y mantener el hematocrito en un mamífero que comprenden administrar un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina.

Sería deseable tener un agente terapéutico con mayor potencia que rHuEpo. Una ventaja de semejante molécula sería que ésta podría ser administrada menos frecuentemente y/o a una dosis inferior. Los tratamientos actuales para pacientes que padecen anemia requieren una administración de EPOGEN® tres veces por semana y para los pacientes de cirugía una administración una vez al día. Sería más conveniente un programa de dosificación menos frecuente tanto para médicos como para pacientes, especialmente aquellos pacientes que no realizan visitas programadas regularmente a la consulta del doctor o a las clínicas, o aquellos que se autoinyectan su Epo. Otra ventaja de una molécula más potente es que se introduce menos fármaco en los pacientes para un incremento del hematocrito comparable.

Por lo tanto es un objeto de la invención identificar moléculas más potentes para el tratamiento de la anemia que permita un programa de dosificación menos frecuente. Un objeto adicional de la invención es proporcionar moléculas que incrementen y mantengan el hematocrito a niveles que sean al menos comparables con el de Epo cuando se administren a una dosis inferior. Asimismo es un objeto de la invención que estas moléculas seleccionadas por su dosificación menos frecuente sean al menos tan bien toleradas como rHuEpo y potencialmente mejor toleradas en algunos pacientes.

En EP 1 088 888 A1 se describe el uso de un constructo que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia señal, una región Fc de inmunoglobulina que carece al menos del dominio CH1, un conector peptídico que comprende un sitio de escisión enzimática, y una proteína diana (tal como Epo) para la producción eficaz de la proteína diana sin modificación alguna de los aminoácidos N-terminales.

Compendio de la invención

Se ha descubierto que un análogo de Epo hiperglicosilado denominado N47 (Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} Epo) tiene una vida media en suero más larga que la eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) y una actividad in vivo mayor cuando se administra a la misma dosis y frecuencia que rHuEpo. Adicionalmente, se ha demostrado que el análogo eleva el hematocrito en ratones con una administración una vez por semana que es comparable al aumento de hematocrito para la rHuEpo administrada tres veces por semana. Las farmacocinéticas de análogo de Epo N47 administrado a ratones y a seres humanos fueron similares.

La invención proporciona una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina (Epo) y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde el análogo hiperglicosilado comprende al menos un sitio de glicosilación adicional que tiene una cadena carbohidratada anclada a éste, y donde el análogo hiperglicosilado tiene un aumento de actividad biológica in vivo.

En una realización, la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una región Fc. En una realización preferida, la región Fc es de IgG humana o deriva de una IgG humana. En una realización preferida, la IgG es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o una combinación de las mismas.

En otra realización, el análogo hiperglicosilado de Epo comprende al menos un sitio de glicosilación adicional en cualquiera de las posiciones 30, 51, 52, 53, 55, 57, 69, 86, 88, 89, 114, 136 y 138 de la secuencia de Epo humana, en el que se añade una cadena carbohidratada unida a N en el sitio.

En otra realización, la proteína de fusión es una Epo Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} fusionada a una región Fc. En una realización preferida, la proteína de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos madura mostrada en la Figura 11 (SEQ ID NO: 26) que carece de la secuencia señal.

La invención proporciona adicionalmente el uso de una proteína de fusión como se ha descrito antes para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la anemia. En una realización preferida, el medicamento se utiliza para elevar y mantener el hematocrito en un mamífero.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión como se ha descrito antes.

La invención proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión como se ha descrito antes, y una célula anfitriona eucariótica transferida con dicha secuencia de ADN, donde la célula anfitriona expresa la proteína de fusión. La invención proporciona adicionalmente un método de producción de una proteína de fusión que comprende cultivar dicha célula anfitriona, expresar la proteína de fusión, y recuperar la proteína de
fusión.

La invención se puede emplear con cualquier condición que de como resultado un descenso de los niveles de glóbulos rojos, tales como anemia asociada con una disminución o pérdida de la función renal, (insuficiencia renal crónica) terapia mielosupresora, cáncer, infección viral, enfermedad crónica y pérdida excesiva de sangre durante procedimientos quirúrgicos. El tratamiento con una dosificación de una vez por semana, o menos frecuentemente, es para la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica.

Asimismo se describen nuevos análogos hiperglicosilados de Epo. Los análogos comprenden al menos una cadena carbohidratada adicional en comparación con rHuEpo donde se añade al menos una cadena carbohidratada unida a N en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114. Los nuevos análogos hiperglicosilados pueden tener dos, tres o cuatro cadenas carbohidratadas adicionales, o pueden tener más de cuatro cadenas adicionales.

Descripción de las figuras

La Figura 1 (SEQ ID NO: 1) muestra la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana.

La Figura 2 muestra un análisis de transferencia Western de rHuEpo y análogos de Epo hiperglicosilados a partir de la expresión en células CHO en medio sin suero. La construcción de los análogos N53 y N61 se describe en el Ejemplo 1. Se indica el número de cadenas carbohidratadas unidas a N de cada análogo.

La Figura 3 compara la actividad de rHuEpo, análogos de Epo N4, N18, y N50 (que contiene cuatro cadenas carbohidratadas unidas a N), N47 (que contiene cinco cadenas carbohidratadas unidas a N), y N53 (que contiene seis cadenas carbohidratadas unidas a N) en el bioanálisis de ratón policitémico ex-hipóxico. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 3. Cada punto representa la respuesta media de cinco animales. Los análogos N4, N18 y N47 han sido descritos previamente en la publicación WO 9505465.

La Figura 4 compara la vida media en suero de rHuEpo y el análogo de Epo N47 administrados a ratas normales mediante inyección intravenosa (IV). Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 4. Los resultados son la media (\pmDT) para cada grupo.

La Figura 5 compara la vida media en suero de rHuEpo y el análogo de Epo N47 administrados a perros Beagle mediante inyección intravenosa (IV). Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 4. Los resultados son la media (\pmDT) para cada grupo.

La Figura 6 muestra el incremento del hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables de rHuEpo o análogo de Epo N47 administrados mediante inyección intraperitoneal (IP) tres veces por semana (TIW) durante seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Los resultados muestran la media del grupo (\pmDT) del cambio de hematocrito para cada grupo de dosificación.

La Figura 7 compara la potencia relativa en ratones de rHuEpo y el análogo de Epo N47 inyectados mediante las rutas de administración intraperitoneal (IP) o intravenosa (IV) a una frecuencia de una vez a la semana (QW) o de tres veces por semana (TIW). Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Cada punto representa la media (\pmDT) de los datos de experimentos separados como sigue: N47, IP, TIW (n=5); N47, IV, TIW (n=1); N47, IP, QW (n=2); N47, IV, QW (n=3); rHuEpo, IP, TIW (n=5); rHuEpo, IV, QW (n=2). Cada experimento utilizó 7 - 13 ratones por dosis.

La Figura 8 muestra el incremento en el hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables de rHuEpo o análogo de Epo N47 administrados mediante inyección intravenosa (IV) una vez a la semana (QW) durante aproximadamente seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Los resultados mostrados son la media del grupo (\pmDT) del cambio de hematocrito para cada grupo de dosificación.

La Figura 9 muestra el incremento en el hematocrito en ratones en respuesta a dosis variables de análogo de Epo N47 administrado mediante inyección intravenosa (IV) una vez a la semana (QW) o una vez cada dos semanas (EOW) durante aproximadamente seis semanas. Los procedimientos experimentales se describen en el Ejemplo 5. Los resultados muestran la media del grupo (\pmDT) del cambio de hematocrito para cada grupo de dosificación.

La Figura 10 (SEQ ID NO: 25) muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la IgG\gamma1 humana.

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La Figura 11 (SEQ ID NO: 26) muestra la secuencia de ADNc y de aminoácidos del polipéptido de fusión Epo N47-Fc que incluye la secuencia señal de Epo. El resto Fc amino terminal está fusionado con el resto arg-166 de la Epo.

Descripción detallada de la invención

En un método de elevación y mantenimiento del hematocrito, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina en una composición farmacéutica. El análogo se puede administrar menos frecuentemente que una cantidad molar equivalente de rHuEpo para obtener un hematocrito diana comparable.

En un método de elevación y mantenimiento del hematocrito, se puede administrar un análogo hiperglicosilado en cantidades molares inferiores que la rHuEpo para obtener un hematocrito diana comparable. La composición se puede administrar mediante las rutas intravenosa, subcutánea o intraperitoneal.

Sorprendentemente, se ha descubierto que el análogo N47, un análogo de Epo hiperglicosilado descrito en la publicación WO 9505465, podría lograr un incremento en el hematocrito administrado una vez a la semana que era comparable con el observado para la rHuEpo administrada tres veces por semana. El análogo N47 tiene los siguientes cambios de aminoácidos: ala por asn en 30; his por thr en 32; pro por val en 87; trp por asn en 88; y pro por thr en 90 lo que daría como resultado la adición de dos cadenas carbohidratadas unidas a N en los restos asparragina 30 y 88. El análogo fue expresado en células de ovario de hámster Chino (CHO) (como se describe en el Ejemplo 1) y purificado como se describe en el Ejemplo 2 para dar las isoformas de 17 a 22 ácidos siálicos. El análogo N47 mostró una vida media en suero mayor en ratas y perros beagle que rHuEpo cuando se inyectó intravenosamente (Figuras 4 y 5). Cuando se inyectó intraperitonealmente tres veces por semana, N47 indujo incrementos en el hematocrito de ratones normales comparables a rHuEpo a concentraciones inferiores (Figura 6). Se demostró que la potencia de N47 era aproximadamente 3 a 4 veces superior que la de rHuEpo cuando se administraba tres veces por semana (Figuras 6 y 7). Cuando se administró una vez por semana, a dosis similares, rHuEpo mostró una pequeña estimulación del hematocrito en ratones normales mientras N47 proporcionó un incremento marcado (Figura 8). La potencia de N47 fue aproximadamente 14 veces superior que la de rHuEpo para la dosificación una vez por semana (Figura 7). Significativamente, la respuesta del hematocrito para el análogo N47 administrado una vez por semana es comparable con la de rHuEpo administrada tres veces por semana. Incluso cuando se administró una vez cada dos semanas, N47 produjo todavía incrementos significativos en el hematocrito de ratones normales (Figura 9). Tomados juntos, los datos indicaron que los análogos de Epo hiperglicosilados, y del análogo N47 en particular, se pueden utilizar ventajosamente para elevar el hematocrito utilizando una dosificación menos frecuente que para el tratamiento actual con rHuEpo.

También se ha observado que los resultados descritos obtenidos antes en ratones se pueden extrapolar a seres humanos. Los parámetros farmacocinéticos para la administración de rHuEpo y del análogo N47 a 11 pacientes en Diálisis Peritoneal Ambulatoria Continua (CAPD) demuestran que el análogo N47 tiene una vida media en suero tres veces más larga que la de rHuEpo (Ejemplo 6 y Tabla 5). Estos resultados sugieren que los análogos hiperglicosilados de Epo permiten una dosificación menos frecuente que la de rHuEpo en seres humanos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "análogo de Epo hiperglicosilado" hace referencia a una Epo que comprende al menos un sitio de glicosilación adicional con una cadena carbohidratada adicional añadida al sitio. Los sitios de glicosilación pueden ser para cadenas carbohidratadas unidas a N o unidas a O. Se introducen nuevos sitios de glicosilación unidos a N mediante alteraciones en la secuencia de ADN para codificar el sitio consenso para la adición de carbohidratos unidos a N (los aminoácidos Asn-X-Ser/Thr) de la cadena polipeptídica, mientras se introducen nuevos sitios unidos a O mediante alteraciones en la secuencia de ADN para codificar un resto serina o treonina. Los análogos se construyen mediante técnicas de mutagénesis para la introducción de adiciones, deleciones o sustituciones de restos aminoácido que incrementan o alteran los sitios en el polipéptido Epo que están disponibles para la glicosilación. El ADN que codifica un análogo de Epo hiperglicosilado es transfectado a una célula anfitriona eucariótica y la glicoproteína expresada es analizada en cuanto a la presencia de una cadena carbohidratada
adicional.

Los análogos hiperglicosilados de Epo han demostrado una actividad in vitro que era comparable o incluso menor que la determinada para rHuEpo, sugiriendo que la unión al receptor de Epo no es intensificada, y puede en muchos casos disminuir, mediante la adición de cadenas carbohidratadas. Sin embargo, la hiperglicosilación puede incrementar típicamente la vida media en suero y potencialmente conducir a un incremento de la actividad biológica in vivo. Un análogo de Epo que tenía una cadena carbohidratada unida a N adicional en la posición 88 mostró un descenso de la afinidad por el receptor en comparación con rHuEpo (isoformas 9-14) o con una isoforma purificada de rHuEpo que tenía 14 ácidos siálicos por molécula, demostró aún una vida media circulante más larga y una actividad in vivo mejorada en comparación con una mezcla de isoformas de Epo 9-14 o una isoforma de Epo 14 aislada.

Los análogos de Epo hiperglicosilados que se pueden administrar tendrán al menos una cadena carbohidratada unida a N o unida a O adicional. En una realización, los análogos tendrán dos cadenas carbohidratadas unidas a N adicionales. En otras realizaciones, los análogos tendrán tres, cuatro o más cadenas carbohidratadas unidas a N adicionales. Como ejemplos, los análogos tendrán al menos una cadena unida a N adicional en uno o más de los restos aminoácido 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 y 138 de la secuencia de Epo humana. En una realización, el análogo tiene cadenas carbohidratadas unidas a N adicionales en los restos 30 y 88 de la Epo humana. La numeración de los restos aminoácido de la Epo humana es la mostrada en la Figura 1 y en el SEQ ID NO: 1. La Figura 1 muestra el polipéptido Epo maduro pronosticado de 166 aminoácidos mientras la Epo recombinante producida tiene 165 aminoácidos tras la eliminación del resto arginina C terminal. Se entiende que rHuEpo y los análogos de Epo hiperglicosilados pueden tener 165 o 166 aminoácidos.

Los análogos tendrán al menos cuatro cadenas carbohidratadas unidas a N. De las cuatro cadenas, tres pueden estar en los sitios en las posiciones 24, 38, y 83. No obstante, se contempla que algunos análogos puedan tener alteraciones de uno o más sitios de glicosilación de origen natural de manera que uno o más de los sitios son suprimidos y sustituidos por un sitio nuevo.

Por ejemplo, cualquiera de los sitios de las posiciones 24, 38 y 83 puede ser suprimido y sustituido por un sitio de la posición 88. Opcionalmente, los análogos pueden tener un sitio unido a O en la posición 126.

Los análogos hiperglicosilados de Epo pueden tener al menos una cadena carbohidratada adicional. Se ha encontrado que una cadena carbohidratada unida a N adicional es añadida en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 que han sido modificadas para que sean un sitio de glicosilación. Las realizaciones específicas incluyen los análogos N49 a N61 descritos en la Tabla 1. Los nuevos análogos tendrán al menos un nuevo sitio de glicosilación unido a N en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114 y pueden comprender además cadenas carbohidratadas unidas a N o unidas a O adicionales en otros sitios. Los análogos pueden tener una, dos, tres o cuatro cadenas carbohidratadas adicionales, o más de cuatro cadenas adicionales. En una realización preferida, los análogos tendrán tres cadenas carbohidratadas unidas a N adicionales (seis cadenas unidas a N en total). En otra realización preferida, los análogos tendrán cuatro cadenas unidas a N adicionales (siete cadenas unidas a N en total). Los análogos que tienen tres o cuatro, o más de cuatro, cadenas carbohidratadas unidas a N adicionales, pueden tener, pero no están limitadas a una cadena adicional en cualquiera de las posiciones 52, 53, 55, 86 y 114.

Sorprendentemente, se ha encontrado que un análogo hiperglicosilado con tres cadenas unidas a N adicionales en las posiciones 30, 53 y 88 (seis cadenas unidas a N en total) tiene una mayor actividad in vivo que el análogo N47 con dos cadenas adicionales (cinco en total). Los resultados se muestran en la Figura 3. Está claro que la actividad in vivo de los análogos es directamente dependiente del número de cadenas carbohidratadas unidas a N. Estos resultados se pueden extrapolar al entorno terapéutico donde los análogos que tiene más cadenas carbohidratadas unidas a N que N47 pueden ser dosificados incluso menos frecuentemente.

Además, se describen los análogos de Epo hiperglicosilados con tres cadenas unidas a N adicionales en las posiciones 30, 55 y 88; 30, 55 y 114; y 30, 88 y 114. También se describen los análogos de Epo con cuatro cadenas unidas a N adicionales o tres cadenas unidas a N adicionales en la posición 125.

Los análogos pueden ser preparados mediante una variedad de técnicas de mutagénesis asequibles para los expertos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis por PCR y la mutagénesis de casetes (Zoller et al. Meth. Enz. 100, 468-500 (1983); Higuchi, en PCR Protocols págs. 177-183 (Academic Press, 1990); Wells et al. Gene 34, 315-323 (1985)). En el Ejemplo 1 se describe el uso de las técnicas de mutagénesis por PCR para construir nuevos análogos hiperglicosilados de Epo.

Una secuencia de ADN de Epo que ha experimentado mutagénesis se inserta en un vector de expresión utilizando técnicas normalizadas con el vector que es adecuado para el mantenimiento en una célula anfitriona de mamífero. El vector contendrá típicamente los siguientes elementos: promotor y otros elementos reguladores "aguas arriba", origen de replicación, sitio de unión al ribosoma, sitio de terminación de la transcripción, sitio del poliligador, y marcador seleccionable que son compatibles con el uso en una célula anfitriona de mamífero. Los vectores pueden contener asimismo elementos que también permiten la propagación y el mantenimiento en células anfitrionas procarióticas.

Las células o las líneas celulares adecuadas incluyen cualquiera de fuentes de mamífero, incluyendo fuentes humanas. Los Ejemplos incluyen COS-7 (Núm. de acceso ATCC CRL 1651), 293 humanas, de riñón de cría de hámster (BHK, Núm. de acceso CCL 10), células de ovario de hámster Chino (incluyendo células deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR), Urlab et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220 (1980)). Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, HeLa, L-929 y 3T3 de ratón. En una realización preferida, se utilizan las células CHO deficientes en DHFR.

Los vectores que comprenden las secuencias que codifican los análogos de hiperglicosilación de Epo son introducidos en células anfitrionas mediante técnicas de transformación o transfección normalizadas. El cultivo, la amplificación y el escrutinio de las células anfitrionas transformadas o transfectadas se completan utilizando los métodos públicamente disponibles (Gething et al. Nature 293, 620-625 (1981); Kaufman et al. Mol Cell. Biol. 5, 1750-1759 (1985); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.419.446). Las células anfitrionas que albergan secuencias de ADN que codifican análogos hiperglicosilados de Epo se cultivan en condiciones que permiten la expresión de los análogos. Los análogos se recuperan del medio celular y se purifican utilizando los procedimientos descritos esencialmente en la publicación WO 9505465 y los del Ejemplo 2. Los procedimientos de purificación permiten el aislamiento de las isoformas de Epo que contienen más ácido siálico resultantes de la adición de cadenas carbohidratadas
adicionales.

Los análogos hiperglicosilados de Epo pueden incluir, además de nuevos sitios de glicosilación, adiciones, deleciones o sustituciones de restos aminoácido que no crean nuevos sitios de glicosilación y no alteran sustancialmente la actividad biológica del análogo hiperglicosilado. Aquellos sitios individuales o regiones de Epo que pueden ser alterados sin afectar a la actividad biológica pueden ser determinados mediante examen de la estructura del complejo Epo-receptor de Epo como describen Syed et. al. en Nature 395, 511 (1998). El examen de la estructura del complejo Epo-receptor de Epo revela aquellos restos que interaccionan con, o están en íntima proximidad con, el sitio de unión al receptor de Epo y que deben ser evitados cuando se realizan cambios en la secuencia de aminoácidos de Epo. Alternativamente, se pueden determinar empíricamente aquellas regiones que tolerarían sustituciones de aminoácidos mediante mutagénesis de barrido con alanina (Cunningham et al. Science 244, 1081-1085 (1989). En este método, los restos aminoácido seleccionados son sustituidos individualmente por un aminoácido neutro (p. ej., alanina) con el fin de determinar los efectos sobre la actividad biológica.

Es reconocido generalmente que es menos probable que los cambios de aminoácidos conservativos perturben la estructura y/o la función de un polipéptido. Por consiguiente, se pueden producir uno o más cambios de aminoácidos conservativos en un análogo hiperglicosilado de Epo. Los cambios de aminoácidos conservativos implican generalmente la sustitución de un aminoácido por otro que es similar en estructura y/o función (p. ej., aminoácidos con cadenas laterales de tamaño, carga y forma similares). La naturaleza de estos cambios es bien conocida por los expertos en la técnica y se resumen en la siguiente Tabla 1. Tales sustituciones conservativas se muestran en el encabezamiento "Sustituciones preferidas". Asimismo se contemplan cambios sustanciales ("Sustituciones ilustrativas") que también pueden ser introducidos. Un artesano experto apreciará que inicialmente los sitios deben ser modificados mediante sustitución de una manera relativamente conservativa. Si tales sustituciones dan como resultado una conservación de la actividad biológica, se pueden introducir en ese caso cambios más sustanciales (Sustituciones Ilustrativas) y/o se pueden realizar otras adiciones/deleciones y escrutar los productos resultantes.

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TABLA 1 Sustituciones de Aminoácidos

1

TABLA 1 (continuación)

2

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Las deleciones o adiciones de aminoácidos se pueden producir en un análogo de Epo hiperglicosilado que no afecta sustancialmente a la actividad biológica. Tales adiciones y deleciones pueden ser en el extremo N o el extremo C del polipéptido, o pueden ser dentro de él. En general, es menos probable que las pequeñas deleciones o adiciones afecten a la estructura y/o la función de Epo o del análogo hiperglicosilado. En otra realización, las deleciones o adiciones pueden ser de 5-10 restos, alternativamente de 2-5 restos aminoácido, o de 1-2 restos.

La invención proporciona proteínas de fusión que comprenden análogos hiperglicosilados de Epo y composiciones de los mismos. En un aspecto, la invención proporciona proteínas de fusión de análogos hiperglicosilados de Epo y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. Las fusiones se pueden realizar en el extremo amino de un análogo hiperglicosilado de Epo, esto es, el extremo carboxi de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina se fusiona con el extremo amino de un análogo hiperglicosilado de Epo. Alternativamente, puede ser deseable fusionar el extremo carboxi de un análogo hiperglicosilado de Epo con el extremo amino de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. En un aspecto de la invención, la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una región Fc. Los análogos hiperglicosilados de Epo, cuando son parte de un polipéptido de fusión, pueden tener 165 o 166 aminoácidos de longitud, o pueden tener más o menos restos si se añaden o se suprimen aminoácidos. En una realización, el análogo N47 está fusionado en su extremo C al extremo N de una región Fc derivada de IgG\gamma1 humana. (Véase el Ejemplo 2). En el presente ejemplo, el análogo N47 incluye el resto arginina en la posición 166. Sin embargo, se contempla que el análogo N47 así como otros análogos hiperglicosilados de restos 1-165 (carentes de resto arginina C terminal) también puedan comprender los polipéptidos de fusión de la
invención.

El término "Fc" hace referencia a una molécula o secuencia que comprende la secuencia de una porción que no se une al antígeno de un anticuerpo, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original de un Fc es preferiblemente de origen humano o puede ser de cualquier isotipo, p. ej., IgG, IgA, IgM, IgE o IgD. Un método de preparación de una molécula Fc aislada implica la digestión de un anticuerpo con papaína para separar las porciones que se unen al antígeno y las que no se unen al antígeno del anticuerpo. Otro método de preparación de una molécula Fc aislada es la producción mediante expresión de ADN recombinante seguida de la purificación de las moléculas Fc expresadas de ese modo. Un Fc completa consiste en las siguientes regiones de la cadena pesada de Ig: CH1, CH2 y CH3 donde las regiones CH1 y CH2 están conectadas típicamente por medio de una región bisagra flexible. En otra realización, una Fc tiene la secuencia de aminoácidos de IgG1 tal como se muestra en la Figura 10. Se considera que los términos "proteína Fc", "secuencia Fc", "molécula Fc", "región Fc" y "porción Fc" tienen el mismo significado que "Fc".

El término "fragmento Fc" cuando se utiliza asociado con molécula Fc, o con polipéptidos de fusión de la misma, hace referencia a un péptido o polipéptido que comprende menos que la secuencia de aminoácidos completa de una molécula Fc. Semejante fragmento puede surgir, por ejemplo, de un truncamiento en el extremo amino, un truncamiento en el extremo carboxi, y/o una deleción interna de uno o varios restos de la secuencia de aminoácidos. Los fragmentos Fc pueden resultar del empalme alternativo de ARN o de la actividad proteasa in vivo.

El término "variante Fc" cuando se utiliza asociado con una molécula de Fc, o con polipéptidos de fusión de la misma, hace referencia a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que contiene una o más sustituciones, deleciones, y/o adiciones de la secuencia de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de Fc nativa. Las variantes pueden ser de origen natural o construidas artificialmente. Las variantes de la invención se pueden preparar a partir de las correspondientes moléculas de ácido nucleico que codifican dichas variantes, que tienen una secuencia de ADN que varía por consiguiente a partir de las secuencias de ADN para la molécula de Fc nativa.

El término "derivado" cuando se utiliza asociado con una molécula de Fc, o con polipéptidos de fusión de la misma, hace referencia a variantes de Fc o fragmentos de la misma, que han sido modificados químicamente, como por ejemplo, mediante anclaje covalente de uno o más polímeros, incluyendo, pero no limitados a, polímeros solubles en agua, carbohidratos unidos a N o unidos a O, azúcares, fosfatos, y/o otras moléculas semejantes. Los derivados se modifican de manera que difiere de la Fc nativa, ya sea en el tipo o la localización de las moléculas ancladas al polipéptido. Los derivados incluyen adicionalmente la deleción de uno o más grupos químicos anclados naturalmente a una molécula de Fc.

El término "fusión" hace referencia a la unión de segmentos de péptidos o proteínas diferentes mediante métodos genéticos o químicos donde los extremos unidos de los segmentos de péptidos o proteínas pueden ser directamente adyacentes entre sí o pueden estar separados por radicales conectores o espaciadores tales como restos aminoácido u otros grupos conectores.

Una Fc, o una variante, fragmento o derivado de la misma, puede ser de una clase de Ig. En una realización, la Fc es de la clase IgG, tal como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. En otra realización, la Fc es de IgG1. La Fc también puede comprender restos aminoácido representados por una combinación de dos o más clases de IgG, tales como restos de IgG1 e IgG2, o de IgG1, IgG2 e IgG3, etcétera. En una realización, la región Fc de una proteína de fusión del análogo hiperglicosilado de Epo tiene la secuencia mostrada en la Figura 10 (SEQ ID NO: 25) (véase Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)) partiendo del resto 6 (esto es, los restos 1-5 son suprimidos).

Además de las variaciones de origen natural en las regiones Fc, las variantes, fragmentos y derivados de Fc pueden contener cambios no naturales en la Fc que son construidos, por ejemplo, introduciendo sustituciones, adiciones, inserciones o deleciones de restos o secuencias en una Fc nativa o de origen natural, o modificando la porción Fc mediante modificación química y similares. En general, las variantes, fragmentos y derivados de Fc se preparan de manera que se conserva en gran parte la vida media circulante incrementada de las fusiones de Fc con análogos de glicosilación de Epo.

También son proporcionadas por la invención variantes de Fc con sustituciones de aminoácidos conservativas. Los ejemplos de las sustituciones de aminoácidos conservativas se han expuesto antes, y también son ejemplificadas por la sustitución de restos aminoácido de origen no natural que se incorporan típicamente mediante síntesis peptídica química en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estas incluyen peptidomiméticos, y otras formas revertidas o invertidas de radicales aminoácido. Se espera que las modificaciones conservativas de la secuencia de aminoácidos de una región Fc (y las correspondientes modificaciones de los nucleótidos codificantes) produzcan moléculas de Fc (y proteínas de fusión que comprendan análogos hiperglicosilados de Epo y regiones Fc) que tengan características funcionales y químicas similares a las de las moléculas de Fc no modificadas y las proteínas de fusión que comprendan las regiones Fc no modificadas.

Además de las sustituciones mostradas en la Tabla I, cualquier resto nativo de una molécula de Fc (o en una región Fc de una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo) también puede ser sustituido por alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis de barrido con alanina" (Cunningham et al. Science 244, 1081-1085 (1989)).

Las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de una molécula de Fc (y de una región Fc de una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo) se pueden completar seleccionando las sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto molecular en la zona de la sustitución, por ejemplo, en forma de una conformación en lamina o helicoidal, (b) la carga o el carácter hidrófobo de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se pueden dividir en grupos basándose en las propiedades comunes de las cadenas laterales:

1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;

3) ácidos: Asp, Glu;

4) alcalinos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales restos sustituidos pueden ser introducidos en regiones de una molécula de Fc que son homólogas a una molécula de Fc no humana, o en regiones no homólogas de la molécula.

Los restos cisteína de las moléculas de Fc pueden ser suprimidos o remplazados por otros aminoácidos para evitar la formación de entrecruzamientos de disulfuro. En particular, un resto cisteína en la posición 5 de la Figura 10 (SEQ. ID. NO. 25) puede ser sustituido por uno o más aminoácidos, tales como alanina o serina. Alternativamente, el resto cisteína de la posición 5 podría ser suprimido.

Se puede preparar un fragmento de Fc mediante deleción de uno o más aminoácidos en cualquiera de las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5 como se muestra en la Figura 10 (SEQ ID NO. 25). En una realización, los restos aminoácido de las posiciones 1-5 inclusive son suprimidos. También se pueden realizar sustituciones en estas posiciones y se encuentran dentro del alcance de esta invención.

También se pueden elaborar variantes de Fc que muestran una unión reducida a los receptores de Fc que desencadenan funciones efectoras tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y activación del complemento (véase por ejemplo Molec. Immunol. 29, 633-639, (1992)). Tales variantes pueden incluir la leucina en la posición 20 suprimida o sustituida por un resto glutamina, el glutamato de la posición 103 suprimida o sustituida por un resto alanina, y las lisinas de las posiciones 105 y 107 suprimidas o sustituidas por restos alanina (siguiendo la numeración mostrada en la Figura 1). Se contemplan una o más de tales sustituciones.

En una realización, las variantes de Fc mostrarán una unión más fuerte al receptor FcRn ("receptor salvaje") y una vida media circulante más larga en comparación con la Fc nativa tal como se muestra en la Figura 1. Los ejemplos de tales variantes incluyen sustituciones de aminoácidos en uno o más de los restos 33, 35-42, 59, 72, 75, 77, 95-98, 101, 172-174, 215 y 220-223, donde la sustitución o las sustituciones confieren una unión más fuerte de una variante de Fc al receptor FcRn. En otra realización, las variantes de Fc tienen uno o más sitios de glicosilación eliminados. Los sitios de glicosilación unidos a N pueden ser eliminados mediante deleción o sustitución de restos asparragina que tienen ancladas cadenas carbohidratadas.

Otras variantes de Fc incluyen uno o más restos tirosina remplazados, por ejemplo, por restos fenilalanina. Además, también se contemplan otras inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos variantes y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos incluyen las variantes de Fc descritas en las publicaciones WO96/32478 y WO97/34630. Además, las alteraciones pueden estar en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos.

La proteína Fc también puede estar unida a los análogos de glicosilación de Epo por medio de radicales "conectores" que comprenden grupos químicos o aminoácidos de longitudes variables. Tales conectores químicos son bien conocidos en la técnica. Las secuencias de aminoácidos pueden incluir, pero no están limitadas a:

(a) ala-ala-ala;

(b) ala-ala-ala-ala; (SEQ ID NO: 6)

(c) ala-ala-ala-ala-ala; (SEQ ID NO: 7)

(d) gly-gly;

(e) gly-gly-gly;

(f) gly-gly-gly-gly-gly; (SEQ ID NO: 8)

(g) gly-gly-gly-gly-gly-gly-gly; (SEQ ID NO: 9)

(h) gly-pro-gly;

(i) gly-gly-pro-gly-gly; (SEQ ID NO: 10) y

(j) cualquier combinación de las subpartes (a) a (i).

Si bien se prefieren las moléculas de Fc como componentes de las proteínas de fusión con análogos de glicosilación de Epo, también se contempla que se puedan utilizar otras secuencias de aminoácidos que se unen a un receptor FcRn y confieren una vida media incrementada in vivo. Los ejemplos de tales moléculas alternativas se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.739.277, presentada el 14 de Abril, 1998 por Presta et al.

El término "cantidad molar" hace referencia a una cantidad de un análogo hiperglicosilado de rHuEpo que está basado en el peso molecular del correspondiente polipéptido de eritropoyetina sin glicosilación. Las cantidades equivalentes de rHuEpo y análogo hacen referencia a cantidades que son iguales cuando se tienen en consideración variaciones del procedimiento utilizado para determinar tales cantidades. Es necesario determinar cantidades equivalentes de esta manera puesto que el peso molecular de rHuEpo y análogos variará dependiendo del número de cadenas carbohidratadas. Para rHuEpo, el peso molecular del polipéptido de eritropoyetina se calcula basándose en los restos aminoácido 1-165 como se muestra en la Figura 1 y en el SEQ ID NO: 1. Para los análogos hiperglicosilados, los pesos moleculares se ajustan dependiendo de los cambios de aminoácidos en los restos 1-165 de la Figura 1 y del SEQ ID NO: 1.

La frecuencia de dosificación para un análogo hiperglicosilado variará dependiendo de la afección que se esté tratando y del hematocrito diana, pero en general será menos de tres veces por semana. La frecuencia de dosificación será de aproximadamente dos veces por semana, aproximadamente una vez por semana. La frecuencia de dosificación también puede ser menos de aproximadamente una vez por semana, por ejemplo aproximadamente una vez cada dos semanas (aproximadamente una vez cada 14 días), una vez al mes o una vez cada dos meses. Se entiende que las frecuencias de dosificación utilizadas realmente pueden variar algo de las frecuencias descritas en la presente memoria debido a variaciones en las respuestas de los diferentes individuos a los análogos de Epo; se pretende que el término "aproximadamente" refleje tales variaciones.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" hace referencia a una cantidad de un análogo hiperglicosilado (o una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina) que produce un incremento en el hematocrito hasta un hematocrito diana, o hasta un intervalo de hematocrito diana que proporciona un beneficio al paciente o, alternativamente, mantiene a un paciente en un hematocrito diana, o en un intervalo de hematocrito diana. La cantidad variará dependiendo de un individuo a otro y dependerá de numerosos factores, incluyendo el estado físico general del paciente, la gravedad y la causa subyacente de la anemia y por último el hematocrito diana para el paciente individual. El hematocrito diana es típicamente al menos aproximadamente 30%, o en un intervalo de 30%-38%, preferiblemente por encima del 38% y más preferiblemente 40%-45%. Las pautas generales referentes a los intervalos de hematocrito diana para rHuEpo también se encuentran en el prospecto del envase de EPOGEN® fechado el 23/12/96 y son de 30%-36%, o alternativamente de 32%-38% como se establece allí. Se entiende que tales dianas variarán de un individuo a otro de manera que la discreción del médico puede ser apropiada al determinar un hematocrito diana real para cualquier paciente dado. Sin embargo, la determinación de un hematocrito diana se encuentra al nivel del experto en la técnica.

Un experto en la técnica puede obtener fácilmente una cantidad terapéuticamente eficaz de las presentes composiciones. En el Ejemplo 6 se muestra un protocolo clínico que tiene el objetivo de determinar una cantidad terapéuticamente eficaz del análogo N47 en dosificaciones de una vez por semana y tres veces por semana. Un intervalo de dosificación para la administración una vez por semana es de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 4,5 \mug de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Un intervalo de dosificación para la administración tres veces por semana es de 0,025 a 1,5 \mug de péptido de eritropoyetina por kg por dosis. Este intervalo de dosificación se puede emplear con otros análogos hiperglicosilados de Epo, siendo rutinario cualquier ajuste del intervalo de dosificación para un experto en la técnica.

Una ventaja significativa es la capacidad para correlacionar el grado de hiperglicosilación con la cantidad de dosis o con un intervalo de dosificación que permita "ajustar" un análogo de Epo a una dosis o programa de dosificación dados. Basándose en las actividades crecientes in vivo de los análogos de Epo que tienen una, dos o tres cadenas carbohidratadas adicionales como se muestra en la Figura 3, el médico que pone el tratamiento puede seleccionar un análogo que sea apropiado y conveniente para la afección anémica que está siendo tratada. Por ejemplo, en pacientes que tienen anemia aguda y necesitan una dosis eficaz grande, o en pacientes que requieren un tratamiento de más larga duración, se puede preferir la administración de un análogo hiperglicosilado con tres o cuatro o incluso más cadenas carbohidratadas adicionales. Para otros pacientes que padecen una anemia menos grave o requieren tratamiento durante un tiempo relativamente corto, se puede preferir un análogo con una o dos cadenas carbohidratadas adicionales. Los análogos proporcionan al médico una flexibilidad considerable en la prevención y el tratamiento de la anemia que puede resultar de una amplia variedad de condiciones subyacentes.

Asimismo se describe la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de hierro con el fin de mantener un aumento de eritropoyesis durante la terapia. La cantidad que se va a administrar puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica basándose en la terapia con rHuEpo.

La presente invención se puede utilizar para estimular la producción de glóbulos rojos y evitar y tratar la anemia. Entre las condiciones tratables por medio de la presente invención se incluyen la anemia asociada con un descenso o pérdida de la función del riñón (insuficiencia renal crónica), la anemia asociada con la terapia mielosupresora, tal como la quimioterapéutica o los fármacos antivirales (como AZT), la anemia asociada con el progreso de los cánceres no mieloides, la anemia asociada con las infecciones virales (tal como el VIH), y la anemia de las enfermedades crónicas. Asimismo son tratables las condiciones que pueden conducir a anemia en un individuo sano por otra parte, tal como una pérdida de sangre prevista durante la cirugía. En general, cualquier condición tratable con rHuEpo también puede ser tratada con los análogos hiperglicosilados de Epo.

Asimismo se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un análogo hiperglicosilado de Epo, junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o coadyuvante farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión que comprende un análogo hiperglicosilado de Epo y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o coadyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición será adecuada para un programa de dosificación de menos de tres veces por semana. La composición puede estar en forma líquida o liofilizada y comprende un diluyente (tampones Tris, citrato, acetato o fosfato) que tiene diversos valores de pH y fuerzas iónicas, un solubilizante tal como Tween o Polysorbate, portadores tales como seralbúmina humana o gelatina, conservantes tales como timerosal, parabenos, cloruro de benzalconio o alcohol bencílico, antioxidantes tales como ácido ascórbico o metabisulfito de sodio, y otros componentes tales como lisina o glicina. La selección de una composición concreta dependerá de numerosos factores, incluyendo la afección que se esté tratando, la ruta de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Un examen más extenso de los componentes adecuados para las composiciones farmacéuticas se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^{a} ed. A.R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980). En una realización preferida, los análogos de glicosilación de Epo se formulan en forma líquida en una solución isotónica tamponada con cloruro de sodio/citrato de sodio que contiene albúmina humana, y que contiene opcionalmente alcohol bencílico como conservante. Las composiciones contienen preferiblemente análogos que tienen una, dos, tres, cuatro, o más cadenas carbohidratadas adicionales.

Las composiciones de la invención se administran preferiblemente mediante inyección, subcutánea o intravenosa. La ruta de administración elegida eventualmente dependerá de numerosos factores y puede ser averiguada por un experto en la técnica.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención, pero no se deben considerar limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Construcción de Análogos de Epo Hiperglicosilados Construcción de ADNc que codifican los Análogos de Epo Hiperglicosilados

Se elaboraron los análogos de Epo mediante mutagénesis in vitro utilizando varios métodos diferentes. Los análogos N49 y N50 se construyeron como se describe en la publicación WO 9505465. Los análogos también se construyeron mediante variaciones de los métodos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) solapantes. El procedimiento básico incluyó dos etapas sucesivas. En la primera etapa, se realizaron dos reacciones (PCR1 y PCR2) sobre ADN molde de Epo o análogo de Epo utilizando un total de cuatro oligonucleótidos: un cebador 5' (directo), un cebador mutagénico inverso, un cebador mutagénico directo (normalmente complementario al cebador mutagénico inverso) y un cebador 3' (inverso). Los cebadores mutagénicos contenían los cambios de nucleótidos deseados así como 6-14 nucleótidos emparejados exactamente a cada lado de estos cambios. La PCR 1 utilizó el cebador 5' (directo) y el cebador mutagénico inverso. La PCR2 utilizó el cebador 3' (inverso) y el cebador mutagénico directo. Los fragmentos de ADN amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los pedazos pequeños de agarosa que contenían fragmentos de ADN del tamaño correcto se separaron por corte del gel. Los fragmentos de ADN de PCR1 y PCR2 se combinaron juntos y se realizó una tercera reacción PCR utilizando solamente los cebadores 5' directo y 3' inverso. De este modo, se amplificó un segmento de ADN completo que contenía las mutaciones deseadas. En varias bases, se combinaron dos o tres mutaciones introduciendo una nueva sustitución en el ADN que ya contenía un cambio, utilizando el mismo procedimiento de PCR. Para construir estos análogos de sitios de glicosilación múltiple, se utilizaron análogos de sitio sencillo, doble o triple (producidos como se ha descrito antes) como molde para la PCR, y se introdujo un sitio de glicosilación adicional mediante mutagénesis dirigida al sitio con los cebadores apropiados.

Los análogos de Epo N51, N52 y N53 se construyeron mediante el método 1 de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) solapante. Se introdujo un sitio de N-glicosilación adicional en cada caso. N56 añadió un sitio de glicosilación (N114 T116) a la secuencia de HuEpo nativa utilizando pDSR\alpha2 Epo como molde de la PCR, N51 añadió un sitio de glicosilación unido a O (Thr125) a Epo N47 utilizando un molde pDSR\alpha2 Epo N47 (Asn30, Thr32, Val87, Asn88, Thr90) y el análogo N59 añadió un sitio de glicosilación (Asn53) al análogo N47 utilizando un molde pDSR\alpha2 EpoN47.

Las reacciones en cadena de la polimerasa para el método 1 se realizaron utilizando un protocolo adaptado de Cheng et. al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5695 (1994)). El cebador 3' (inverso) contenía secuencias que introducían un codón de terminación seguido de un sitio de restricción XbaI: ATCTAGAAGTTGCTCTCTGGACAGTTCCT (SEQ ID NO: 2). El cebador de reacción 5' directo: GAAGCTTGCGCCACCATGGGGGTGCACGAATG (SEQ ID NO: 3) tenía un sitio de restricción Hind III seguido de una secuencia Kozak aguas arriba del codón iniciador de Epo (ATG). La mezcla de reacción para PCR típica contenía: 4 \mul de cada uno de los cebadores directo e inverso (5 pmoles/\mul), 1 \mul de molde (25 ng), 10 \mul de 5X tampón LP (Tricina 100 mM pH 8,7/glicerol al 25%/KOAc 425 mM), 10 \mul de solución de partida de dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP 1 mM cada uno), 0,8 \mul de polimerasa rtTh (Perkin Elmer; 2,5 U/\mul), y 2 \mul de polimerasa Vent (NEB; 0,01 U/\mul después 1:100 dilución de nueva aportación en tampón 1X LP). Se añadió H_{2}O para llevar el volumen final a 50 \mul. Todos los componentes se añadieron juntos en el orden mostrado y la reacción de PCR se inició cuando la temperatura durante el primer ciclo fue mayor de 60ºC añadiendo 1 \mul de MgOAc 50 mM. Las condiciones de reacción típicas fueron: 2 ciclos de 94ºC, 10 seg/50ºC, 1 min./68ºC, 5 min. seguido de 25 ciclos de 94ºC, 10 seg/55ºC, 1 min./68ºC, 5 min. Los fragmentos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN del tamaño correcto se purificó utilizando un kit Geneclean® y los procedimientos suministrados por el fabricante (Bio 101, Inc.). El ADN purificado se digirió con Hind III y Xba I, después se purificó de nuevo utilizando el kit Geneclean®. El fragmento se ligó después en el vector pDSR\alpha2 cortado con Hind III y Xba I. El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOAc 0,3 M pH 5,2 en presencia de ARNt portador y se transformó en E. coli. Los análogos de Epo se escrutaron mediante digestión de restricción de las minipreps de ADN. Los plásmidos de los clones positivos se prepararon después y el inserto se secuenció para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurarse de que no se habían introducido cambios de aminoácidos adicionales.

Se construyeron los análogos N54 a N61 utilizando el método de estrategia de PCR solapante 2. El cebador 3' (inverso) contenía secuencias que introducían un codón de parada seguido de un sitio de restricción XbaI: GATCCTC
TAGAGTTGCTCTCTGGACAG (SEQ ID NO: 4). El cebador de reacción 5' directo: CAACAAGCTTGCGCCGC
CATGGGGG (SEQ ID NO: 5) tenía un sitio de restricción HindIII seguido de una secuencia Kozak aguas arriba del codón iniciador de Epo (ATG). Se realizó una estrategia de PCR de alta fidelidad utilizando ADN Polimerasa UlTma de Perkin Elmer y los reactivos acompañantes; 10 \mul de 10X tampón para PCR, 3 \mul de dNTP 1 mM, 5 pmoles de cada cebador, y agua a un volumen final de 100 \mul. Se añadieron 0,5 unidades de polimerasa UlTma después de que la mezcla de PCR alcanzara los 94ºC. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo después durante 5 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 90 segundos. Se realizaron 25 ciclos con posterioridad a 94ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 90 segundos. Las bandas de producto de los tamaños correctos se separaron cortando del gel de agarosa después de la electroforesis.

Los productos resultantes de la PCR para cada análogo se limpiaron utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen. El ADN purificado se digirió en 100 \mul de producto digerido con las enzimas de restricción HindIII y XbaI (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 1 hora. Los productos digeridos se purificaron de nuevo en gel y el fragmento digerido se ligó después en el vector pDSR\alpha2 digerido con HindIII y XbaI.

El ADN ligado se precipitó con 2 volúmenes de etanol en NaOH 0,3 M pH 5,2 en presencia de ARNt portador y se transformó en E. coli. Los análogos de Epo hiperglicosilados se escrutaron inicialmente mediante PCR de las colonias para identificar los clones que contenían el inserto de ADN del tamaño y tipo correctos. Con este procedimiento, se colocaron las células que contenían los plásmidos en tubos de PCR en presencia de cebadores directo e inverso para Epo. La mezcla se sometió después a PCR utilizando las condiciones de reacción descritas antes. Los plásmidos de los clones positivos se prepararon después y el inserto del análogo de Epo se secuenció para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurarse de que no se habían introducido cambios de aminoácidos adicionales.

TABLA 1

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3

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Análisis de la adición de carbohidratos

Los constructos para los análogos de Epo hiperglicosilados que se habían insertado en el vector de expresión pDSR\alpha2 fueron transfectados a células COS. Los sobrenadantes de las células COS transfectadas se analizaron mediante transferencia western para determinar si el análogo de Epo expresado y secretado contenía carbohidrato adicional. Las muestras se cargaron directamente en los pocillos de geles de SDS-PAGE después se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando el anticuerpo monoclonal, 9G8A (Elliott et al. (1996) Blood 87:p2714). Se compararon las movilidades de las muestras de análogo con las de las muestras que contenían rHuEpo. La Figura 1 muestra el descenso de movilidad de los análogos N53 y N61 en comparación con los análogos N4 (cuatro cadenas carbohidratadas) y N47 (cinco cadenas carbohidratadas). La movilidad coincide con la presencia de seis cadenas carbohidratadas para el análogo N53 y siete cadenas carbohidratadas para el análogo N61. Los datos para todos los análogos hiperglicosilados se muestran en la Tabla 2.

Bioanálisis in vitro

Se analizaron los medios acondicionados por células COS o CHO que expresaban rHuEpo o sus análogos en cuanto a la estimulación de la absorción de timidina-H3 por las células UT7-Epo (Komatsu et al., Blood 82,456). Las células UT7-Epo son sensibles a Epo y expresan receptores de Epo humanos en su superficie celular. Las células UT7-Epo se hicieron crecer en medio de Crecimiento (1X Medio de Dulbecco Modificado por Iscove con L-glutamina, tampón HEPES 25 mM, y 3.024 mg/L de bicarbonato de sodio, pero sin alfa-tioglicerol ni beta-mercaptoetanol (GIBCO)/Suero Bovino fetal al 10% v/v/solución de L-glutamina-Penicilina-Estreptomicina al 1% v/v (Irvine Scientific)/1 Unidad/mL de rHuEpo) hasta aproximadamente 3x10^{5} células/mL. Las células se recogieron mediante centrifugación (aprox. 500xG) se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se resuspendieron a 5x10^{4} células/mL en medio de Análisis (1x Medio RPMI 1640 sin L-glutamina (Gibco)/L-glutamina al 1%/suero bovino fetal al 4%). Las muestras de ensayo o la Epo normalizada (rHuEpo), 100 \muL diluidas en medio de análisis al menos 5 veces, se añadieron a los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Después se añadieron 50 \mul de células suspendidas (5.000 células/pocillo) y las placas se incubaron en una incubadora humidificada a 37ºC y con 5% de CO_{2}. Después de 72 horas, se añadieron 50 \muL de metil-timidina-H^{3} (1 mCi/mL; 20 Ci/mMol) diluida 1:100 en medio de análisis. Las células se incubaron durante 4 horas más a 37ºC con 5% de CO_{2}. Las células marcadas se cosecharon sobre esteras de filtro de fibra de vidrio, se lavaron con agua desionizada seguido de 2-propanol, se secaron y se sometieron a recuento. La actividad se determinó comparando la respuesta determinada para cada análogo con la del patrón de rHuEpo. Después se determinó la actividad biológica específica dividiendo la actividad in vitro por la concentración de cada análogo determinada mediante inmunoanálisis (Elliott et al (1996) Blood 87: p2714). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

5

Los análogos de Epo N62-N69 se elaboraron mediante métodos de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) solapante. El procedimiento básico incluía dos etapas sucesivas. En la primera etapa, se realizaron dos reacciones (PCR1 y PCR2) sobre ADN molde de Epo o análogo de Epo utilizando un total de cuatro oligonucleótidos: un cebador 5' (directo), un cebador mutagénico inverso, un cebador mutagénico directo complementario al cebador mutagénico inverso y un cebador 3' (inverso). Los cebadores mutagénicos contenían los cambios de nucleótidos deseados así como 6-14 nucleótidos emparejados exactamente a cada lado de estos cambios. La PCR1 utilizó el cebador 5' (directo) y el cebador mutagénico inverso. La PCR2 utilizó el cebador 3' (inverso) y el cebador mutagénico directo. Los fragmentos de ADN amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y los fragmentos de ADN del tamaño correcto se separaron por corte y se hicieron eluir del gel. Los fragmentos de ADN de la PCR1 y la PCR2 se combinaron juntos y se realizó una tercera reacción de PCR utilizando solamente los cebadores directo 5' e inverso 3'. Para algunos análogos, se requerían tres reacciones de PCR para generar la secuencia deseada. Estas se llevaron a cabo como antes, utilizando un segundo par de cebadores mutagénicos para generar el tercer producto. De nuevo, los fragmentos de ADN amplificados se purificaron en gel y se combinaron en una reacción final que contenía solamente los cebadores directo 5' e inverso 3'. En cada caso, se amplificó un segmento de ADN completo que contenía las mutaciones deseadas.

N62 añadió dos sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57) a la secuencia nativa HuEpo utilizando pDSR\alpha2 Epo N4 (N30 T32) como molde de la PCR. N63 añadió tres sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57 V87 N88 T90) a la secuencia nativa HuEpo utilizando pDSR\alpha2 Epo N4 (N30 T32) y pDSR\alpha2 Epo N47 (N30 T32 N55 T57) como moldes de la PCR. N64 añadió tres sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57 N114 T116) a la secuencia nativa HuEpo utilizando pDSR\alpha2 Epo N4 (N30 T32) y pDSR\alpha2 Epo N60 como moldes de la PCR. N65 añadió tres sitios de glicosilación (N30 T32 V87 N88 T90 N114 T116) a la secuencia nativa HuEpo utilizando pDSR\alpha2 Epo N4 (N30 T32) y pDSR\alpha2 Epo N60 como moldes de la PCR. N66 añadió cuatro sitios de glicosilación (N30 T32 N55 T57 V87 N88 T90 N114 T116) a la secuencia nativa HuEpo utilizando pDSR\alpha2 Epo N4 (N30 T32) y pDSR\alpha2 Epo N60 como moldes de la PCR. N67 añadió un sitio de glicosilación unido a O (P124 T125 T 126) a N64 Epo. N68 añadió un sitio de glicosilación unido a O (P124 T125 T 126) a N65 Epo. N69 añadió un sitio de glicosilación unido a O (P124 T125 T 126) a N66 Epo.

Para cada análogo, se utilizaron los mismos cebadores externos. El cebador 3' (inverso) contenía secuencias que introducían un codón de parada seguido de un sitio de restricción Sal I:

AGGTGGACAGTCGACATTATCTGTCCCCTGTC

(SEQ ID NO: 11).

El cebador de la reacción directo 5':
AACAAGCTTCTAGACCACCATGGGGGTG	(SEQ ID NO: 12)

tenía un sitio de restricción Hind III seguido de una secuencia Kozak aguas arriba del codón iniciador de Epo (ATG). Los cebadores mutagénicos fueron los siguientes:

cebador directo mutagénico N30 T32
ACG ACG GGC TGT AAT GAA ACG TGC AGC TTG	(SEQ ID NO: 13)

cebador inverso mutagénico N30 T32
CAA GCT GCA CGT TTC ATT ACA GCC CGT CGT G	(SEQ ID NO: 14)

cebador directo mutagénico N55 T57
GCC TGG AAG AGG ATG AAT GTC ACGCAG CAG GCC GTA GAA	(SEQ ID NO: 15)

cebador inverso mutagénico N55 T57
TTC TAC GGC CTG CTG CGT GAC ATTCAT CCT CTT CCA GGC A	(SEQ ID NO: 16)

cebador directo mutagénico V87 N88 T90
TCT TCC CAG GTG AAT GAG ACC CTG CAG CTG	(SEQ ID NO: 17)

cebador inverso mutagénico V87 N88 T90
CAG CTG CAG GGT CTC ATT CAC CTG GGA AGA GTT G	(SEQ ID NO: 18)

cebador directo mutagénico P124 T125 T126
CCA GAT CCG ACC ACA GCT GCT CCA	(SEQ ID NO: 19)

cebador inverso mutagénico P124 T125 T126
TGG AGC AGC TGT GGT CGG ATC TGG A	(SEQ ID NO: 20)

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Los cambios N114 T116 se introdujeron utilizando un molde que contenía las mutaciones apropiadas, de manera que no se necesitaron cebadores mutagénicos para generar este sitio.

La mezcla de reacción para la PCR1 típica contenía: 2,5 \mul de cada uno de los cebadores directo e inverso mutagénico (10 pmoles/\mul), 1 \mul de molde (25 ng), 10 \mul de tampón 10X Taq Extend (Stratagene), 2 \mul de solución de partida de dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP 10 mM cada uno), 0,5 \mul de polimerasa Taq (BMB), y 0,5 \mul de Taq Extend (Stratagene). Se añadió H_{2}O para llevar el volumen final a 100 \mul. Las condiciones de reacción típicas fueron: 1 ciclo de 94ºC, 5 min./55ºC, 1 min./68ºC, 1 min. seguido de 25 ciclos de 94ºC, 1 min./55ºC, 1 min./68ºC, 1 min. La reacción de PCR2 típica fue idéntica a la descrita para PCR1, excepto que se utilizaron los cebadores inverso y directo mutagénico. Cuando se necesitó una tercera reacción inicial, la reacción contuvo los cebadores directo mutagénico e inverso. Los fragmentos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de ADN con el tamaño correcto se purificó utilizando un kit de Extracción en Gel y los procedimientos suministrados por el fabricante (Qiagen). Después se combinaron los fragmentos complementarios en una tercera reacción de PCR utilizando solamente los cebadores directo externo e inverso. Los fragmentos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron del gel como se ha descrito antes. El ADN purificado se digirió con Hind III y Sal I, después se purificó de nuevo en gel. El fragmento se ligó después en el vector pDSR\alpha19 cortado con Hind III y Sal I. El ADN ligado se transformó mediante electroporación en E. coli. Los análogos hiperglicosilados de Epo se escrutaron inicialmente mediante PCR de las colonias para identificar los clones que contenían el inserto de ADN con el tamaño correcto. El ADN plasmídico de los clones seleccionados se preparó después y el inserto se secuenció para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y para asegurarse de que no se habían introducido cambios de aminoácidos adicionales.

TABLA 3

6

7

Construcción de ADNc que codifica el Polipéptido de Fusión del Análogo de Epo Hiperglicosilado

El análogo de Epo N70 también se elaboró mediante PCR solapante. Se utilizaron el plásmido DSR\alpha2 que contenía la secuencia de ADNc que codifica el análogo N47 (N30 T32 V87 N88 T90) y el plásmido pAMG21 (Núm. de acceso ATCC 98113) que contiene el ADNc que codifica una región Fc como moldes para las reacciones en cadena de la polimerasa. La porción Fc de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana IgG1 desde el resto 104 del dominio bisagra (Asp-104) hasta el extremo carboxilo (Ellison et al., supra, véase también la Figura 10 partiendo del resto ácido aspártico de la posición 6), fue generada mediante amplificación por PCR de una genoteca de ADNc de bazo humano (Clontech). Los productos de la PCR solapante se generaron en dos reacciones utilizando los siguientes cebadores oligonucleotídicos

cebador de reacción directo 5' 2343-85 (específico de Epo):
AAC AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GGT G	(SEQ ID NO: 21)

cebador de reacción inverso 3' 2343-87 (homología tanto con Epo como con Fc):
AGG TGG ACA TGT GTG AGT TTT GTC TCT GTC CCC TCT CCT GCA GGC CTC C	(SEQ ID NO: 22)

cebador de reacción directo 5' 2343-86 (homología tanto con Epo como con Fc):
GAG GCC TGC AGG ACA GGG GAC AGA GAC AAA ACT CAC ACA TGT CCA CCT	(SEQ ID NO: 23)

cebador de reacción inverso 3' 2343-88 (específico de Fc):
TGG ACA GTC GAC ATT ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA GGC TCT TCT GC	(SEQ ID NO: 24)

La PCR1 contenía 2,5 \mul de cada uno de los cebadores directo (2343-85) e inverso (2343-87) (10 pmoles/\mul), mientras la PCR2 contenía 2,5 \mul de cada uno de los cebadores directo (2343-86) e inverso (2343-88) (10 pmoles/\mul). Las condiciones fueron las descritas antes. Los productos amplificados resultantes contenían una región de solapamiento (48 nucleótidos) que codificaban los últimos 8 aminoácidos de Epo y los 8 primeros aminoácidos de Fc. Los fragmentos complementarios fueron purificados en gel y combinados en una tercera reacción de PCR utilizando solamente los cebadores directo e inverso externos. El fragmento amplificado fue separado mediante electroforesis en gel de agarosa y purificado del gel como se ha descrito antes. El ADN purificado fue digerido con Hind III y Sal I, después fue purificado en gel de nuevo. El fragmento fue ligado después en el vector pDSR\alpha19 cortado con Hind III y Sal I. El ADN ligado se transformó mediante electroporación en E. coli. Los transformantes se escrutaron inicialmente mediante PCR de las colonias para identificar los clones que contenían el inserto de ADN del tamaño correcto. El ADN plasmídico de los clones seleccionados fue preparado después y el inserto fue secuenciado para confirmar la secuencia de la proteína de fusión y asegurarse de que no se habían introducido cambios de aminoácidos adicionales.

Análisis de la adición de carbohidrato

Los constructos para los análogos de Epo hiperglicosilados N62 a N69 y la proteína de fusión (análogo N70) fueron insertados en el vector de expresión pDSR\alpha19 y transfectados en células CHO. Los sobrenadantes de las células CHO transfectadas se analizan mediante transferencia western para determinar si los análogos de Epo expresados y secretados contenían carbohidrato adicional utilizando los procedimientos descritos antes para los análogos N49 a N62.

Bioanálisis in vitro

Los análisis in vitro para los análogos N62 a N70 expresados en células transfectadas CHO se realizan como se ha descrito antes para los análogos N49 a N61.

Ejemplo 2 Preparación de Eritropoyetina Humana Recombinante y Análogos de Eritropoyetina Hiperglicosilada

La eritropoyetina humana recombinante (rHuEpo) utilizada para los experimentos descritos en la presente memoria fue expresada por células de ovario de hámster Chino (CHO) transfectadas con un plásmido recombinante que portaba el gen de la eritropoyetina humana. El producto recombinante fue recuperado del medio acondicionado y purificado esencialmente como describen Lai et al. supra. La preparación de rHuEpo resultante tiene predominantemente las isoformas de 9 a 14 ácidos siálicos como se determina mediante isoelectroenfoque.

Los análogos de eritropoyetina hiperglicosilados recombinantes fueron expresados en células CHO transfectadas con un plásmido recombinante que portaba el gen análogo de Epo como se describe en las publicaciones WO91/05867 y WO 9505465.

Los análogos hiperglicosilados se purificaron de los sobrenadantes de cultivo como se describe más abajo.

Concentración y diafiltración de medios acondicionados

Se recogió el medio acondicionado (sin suero) de tres cosechas sucesivas (5-8 días cada una) de la línea de células CHO transfectadas, se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum, se concentró aproximadamente treinta veces, y se sometió a diafiltración en Tris 10 mM, CuSO_{4} 20 \muM, pH 7,0 utilizando un sistema de ultrafiltración de flujo tangencial (Millipore) con una membrana de corte de peso molecular 10.000. Los medios sometidos a diafiltración (DFM) se filtraron (0,45 \mum) una segunda vez y se almacenaron a -20ºC hasta que se utilizaron para la purificación.

Purificación

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de 2 a 8ºC.

Cromatografía de Intercambio Aniónico (C10)

El DFM aclarado se aplicó a una columna Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 6 cm x 18 cm) equilibrada en bis Tris-propano 10 mM (BTP), pH 7,0 y se lavó con dos veces el volumen de la columna de BTP 10 mM para hacer eluir todas las especies que no se unían. Los siguientes gradientes se hicieron correr dependiendo de si el análogo hiperglicosilado tenía cuatro, cinco o seis cadenas carbohidratadas unidas a N. Todos los tampones utilizados en esta fase contenían glicina 1 mM, CuSO_{4} 20 \muM, urea 6 M, 5 \mug/mL de leupeptina y 1 \mug/mL de pepstatina. Para los análogos con cuatro cadenas carbohidratadas unidas a N, el gradiente fue ácido acético 10 mM, NaCl 0,1 mM a ácido acético 500 mM, NaCl 5 mM sobre 49 veces el volumen de la columna manteniendo dos veces el volumen de la columna en condiciones de elevada concentración de sal. Para los análogos con cinco cadenas carbohidratadas unidas a N, el gradiente fue ácido acético 0,7 M, NaCl 7 mM a ácido acético 1,0 M, NaCl 12 mM sobre 30 veces el volumen de la columna manteniendo dos veces el volumen de la columna en condiciones de elevada concentración de sal. Para los análogos con seis cadenas carbohidratadas unidas a N, el gradiente fue ácido acético 1,0 M, NaCl 10 mM a ácido acético 1,5 M, NaCl 20 mM sobre 50 veces el volumen de la columna manteniendo dos veces el volumen de la columna en condiciones de elevada concentración de sal. Siguiendo el gradiente, la columna se lavó con dos veces el volumen de la columna de BTP 10 mM, pH 7,0 y la fracción con alto contenido de isoforma se hizo eluir con NaCl 0,6 M, BTP 100 mM, pH 7,0.

Cromatografía en Fase Reversa (C4)

La tira con elevada concentración de sal de la columna de Q-Sepharose (1Q) se aplicó a una columna en fase reversa Vydac C4 (partículas de 30 \mu, 4 cm x 18 cm) equilibrada en etanol del 20%, BTP 10 mM, pH 7,0 y se hizo eluir de la columna con un gradiente de treinta veces el volumen de la columna de etanol del 94% tamponado en BTP 10 mM, pH 7,0. El pico de producto reunido, que eluía en etanol de aproximadamente 60%, se diluyó con cuatro volúmenes de BTP 10 mM, pH 7,0 para minimizar la posibilidad de agregación en presencia de etanol.

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Cromatografía de Intercambio Aniónico (20)

El producto eluido diluido de la columna en fase reversa se aplicó a una segunda columna Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, 3 cm x 9 cm) equilibrada con BTP 10 mM, pH 7,0. La columna se lavó con tampón de equilibrado, y el análogo de Epo hiperglicosilado se hizo eluir con cloruro de sodio 0,6 M, citrato de sodio 20 mM, pH 6,0.

La proteína purificada se cambió por NaPO_{4} 20 mM, pH 6,0, NaCl 140 mM por medio de un centricon (corte de peso molecular 10.000), seguido de pase a través de un filtro de 0,2 \mum y almacenamiento a 2-8ºC.

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Ejemplo 3 Bioactividad In Vivo de rHuEpo y Análogos de rHuEpo que Contienen cuatro, cinco y seis Cadenas carbohidratadas Unidas a N

La actividad in vivo de los análogos de Epo que contenían cuatro, cinco y seis cadenas carbohidratadas unidas a N se comparó con la de rHuEpo en el bioanálisis de ratón policitémico exhipóxico. Este análisis cuantifica la incorporación de Fe^{59} a glóbulos rojos recién sintetizados como medida del incremento de eritropoyesis en ratones en respuesta a una muestra de ensayo administrada exógenamente. El análisis, realizado como se describe más abajo, es una modificación del método de Cotes y Bangham (Nature 191, 1065 (1961)).

En este análisis, se preeacondicionan primero ratones BDF_{1} hembra mediante exposición a condiciones de poco oxígeno en una cámara hipobárica (0,4 - 0,5 atm) durante aproximadamente 18 horas al día durante 14 días. Para compensar las condiciones de poco oxígeno los ratones responden estimulando la eritropoyesis para incrementar el número de glóbulos rojos y de ese modo la capacidad para transportar oxígeno relativa. Una vez completada la exposición hipobárica final, se dejó que los ratones permanecieran a la presión ambiental durante aproximadamente 72 horas antes de la administración de muestras de ensayo mediante inyección intraperitoneal. A la presión ambiental los ratones son relativamente policitémicos y responden disminuyendo la producción de eritropoyetina endógena y la velocidad de eritropoyesis. Cinco días después de la administración de la muestra, se inyectaron 0,2 - 0,3 \muCi de Fe^{59}Cl_{3} en 0,2 mL en la vena de la cola. Cuarenta y ocho horas más tarde, los animales se sacrifican y se determina el aumento de eritropoyesis producido por las muestras de ensayo midiendo la cantidad de Fe^{59} incorporado en una muestra de 0,5 mL de sangre completa.

Un ejemplo de los resultados obtenidos cuando se sometían a ensayo rHuEpo y cinco análogos de Epo diferentes, que contenían cuatro, cinco o seis cadenas carbohidratadas unidas a N en este análisis se muestra en la Figura 3. Cada muestra fue analizada a seis o siete diluciones diferentes en un intervalo de concentración apropiado. Todas las muestras se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato que contenía seralbúmina bovina al 0,5%, y se administraron 0,4 mL de cada dilución a cinco ratones previamente acondicionados. Cuarenta y ocho horas después de la administración de Fe^{59}, se midió la cantidad incorporada en 0,5 mL de sangre mediante un conteo gamma. Los resultados para cada una de las muestras se trazan como el porcentaje de Fe^{59} incorporado versus log de la dosis administrada.

Como se muestra en la Figura 3, los cinco análogos de Epo hiperglicosilados sometidos a ensayo en este análisis fueron más potentes que rHuEpo. Además, la potencia de cada análogo fue directamente dependiente del número de cadenas carbohidratadas unidas a N, teniendo aquellos análogos con un número incrementado de cadenas carbohidratadas una mayor actividad. De este modo, el análogo N53, que contenía seis cadenas carbohidratadas unidas a N, fue el análogo más potente. El análogo N47, que contenía cinco cadenas carbohidratadas unidas a N, fue a su vez, más potente que aquellos análogos que contenían cuatro cadenas unidas a N. Las potencias de los tres análogos que contenían cuatro cadenas carbohidratadas unidas a N (N4, N18 y N50) fueron aproximadamente iguales entre sí y mayores que las de rHuEpo.

En este experimento, las dosis de rHuEpo y análogos que contenían cuatro, cinco o seis cadenas carbohidratadas unidas a N requeridas para producir una incorporación de Fe^{59} del 40% fueron 10.700 ng, 640 ng, 140 ng y 38 ng, respectivamente. Basándose en la cantidad de material requerido para producir este nivel de eritropoyesis, los análogos de Epo que contenían cuatro, cinco, o seis cadenas carbohidratadas unidas a N son 17 veces, 77 veces y 280 veces más potentes que rHuEpo.

Ejemplo 4 Farmacocinéticas IV de rHuEpo y análogo de Epo N47 en Ratas y Perros Beagle

Se realizaron dos estudios separados en ratas y perros para comparar los parámetros farmacocinéticos del análogo de Epo N47 y de rHuEpo.

En los estudios en rata, se inyectó 1 \muCi (~0,1 \mug de péptido/kg) de análogo N47 de Epo-I^{125}, o eritropoyetina humana recombinante-I^{125} (Amersham) intravenosamente en una cánula en la carótida implantada quirúrgicamente en ratas Sprague-Dawley macho normales que pesaban entre 314 y 363 g. En diversos momentos puntuales después de la administración, se recogieron 0,3 mL de sangre y se preparó el suero mediante centrifugación. Después se determinó el nivel de rHuEpo-I^{125} o análogo N47 Epo-I^{125} en 0,1 mL de cada de muestra de suero después de una incubación a 4ºC durante la noche con etanol del 90%. La proteína precipitada con etanol de cada muestra de suero se recogió mediante centrifugación y se sometió a recuento la radiactividad en un contador gamma. Las curvas farmacocinéticas de concentración resultante en suero vs tiempo se muestran en la Figura 4. Cada punto representa una media del grupo de cinco ratas en el grupo de análogo N47 y seis ratas en el grupo de rHuEpo. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron para cada rata utilizando el análisis de regresión no lineal PCNONLIN 4.0 (Statistical Consultants, 1992) y se promediaron los resultados para cada grupo. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

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TABLA 3

8

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En los estudios con perros, perros Beagle normales que pesaban entre 7,8 y 9,5 kg recibieron una inyección de bolo intravenoso de \sim29\muCi de rHuEpo-I^{125} o N47-I^{125} (\sim0,1 \mug péptido/kg) en la vena cefálica. En diversos momentos hasta 24 horas después de la administración, se recogieron aproximadamente de 1 a 2 mL de sangre y se preparó el suero. Se determinó la concentración de rHuEPo-I^{125} y N47-I^{125} en 0,1 mL de suero y se calcularon los parámetros farmacocinéticos como se ha descrito antes. Las curvas farmacocinéticas de concentración en suero vs tiempo para los estudios con perros se muestran en la Figura 5. Los momentos puntuales son las medias del grupo de dos animales de cada grupo. Los parámetros farmacocinéticos se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4

9

En los estudios tanto con ratas como con perros, rHuEpo y el análogo de Epo mostraron un aclaramiento en suero bifásico. El aclaramiento en ratas fue aproximadamente 3,7 veces más rápido para rHuEpo que para el análogo de Epo N47 y la vida media \beta fue aproximadamente 2,8 veces más larga para el análogo de Epo N47 que para rHuEpo. Los parámetros farmacocinéticos en los estudios con perros coincidieron generalmente con aquellos observados en ratas. En perros, el aclaramiento de rHuEpo fue 3,5 veces más rápido que para el análogo de Epo N47 y la vida media \beta fue 3,5 veces más larga para el análogo de Epo N47 que para rHuEpo.

Ejemplo 5 Respuesta del hematocrito a la dosis después de la administración de rHuEpo y análogo de Epo N47 Estudios de Respuesta del Hematocrito a la Dosis tres veces por semana (TIW)

Se compararon los efectos biológicos in vivo de rHuEpo y análogo de Epo N47 en ratones normales después de administrar un intervalo de dosis mediante inyección intraperitoneal o intravenosa tres veces por semana hasta durante seis semanas. Las determinaciones de hematocrito se realizaron dos veces por semana mediante sangrado retro-orbital.

Se inyectó intraperitonealmente tres veces por semana durante un total de seis semanas rHuEpo (en un intervalo de dosificación de 0,625 - 10 \mug de péptido/kg/dosis), análogo de Epo N47 (en un intervalo de dosificación de
0,156 - 1,25 \mug de péptido/kg/dosis) o vehículo de control a ratones CD1 normales que pesaban 30 g (10-13 ratones por grupo). El vehículo de control y el diluyente para las diversas preparaciones de dosificación de rHuEpo y de análogo de Epo N47 fue solución salina tamponada con fosfato (PBS), que contenía seralbúmina de ratón al 0,025%. Se determinaron los hematocritos de todos los ratones en la línea base y dos veces por semana después de eso mediante sangrados retro-orbitales. Al concluir el experimento, se recogió suero de todos los animales y se analizó en cuanto a los anticuerpos para el producto inyectado por medio de un análisis de radioinmunoprecipitación en solución. Los datos del hematocrito de los animales evaluados como negativos para los anticuerpos neutralizantes se utilizaron para el análisis posterior.

Como se muestra en la Figura 6 tanto rHuEpo como el análogo de Epo N47 producen un incremento del hematocrito dependiente de la dosis en el estudio de seis semanas, aunque el análogo N47 promueve un incremento mayor del hematocrito en comparación con rHuEpo a una concentración dada. En este experimento el análogo de Epo N47 es aproximadamente 3 a 4 veces más potente cuando se dosifica tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal.

Los estudios de respuesta a la dosis de rHuEpo y análogo N47 se llevaron a cabo mediante inyección intravenosa tres veces por semana utilizando procedimientos similares a los de la inyección intraperitoneal. Los resultados obtenidos fueron similares a los de la administración intraperitoneal y, en particular, los estudios confirmaron adicionalmente que el análogo de Epo N47 tenía una potencia mayor que rHuEpo cuando se administraba tres veces por semana.

Para comprender mejor y cuantificar la actividad biológica de rHuEpo y análogo de Epo N47 en la elevación del hematocrito en ratones normales, también se analizaron los resultados de los experimentos mediante gráficas de la potencia relativa. Para cada experimento, se determinó la actividad de rHuEpo o análogo N47 a cada dosis sumando el incremento en el hematocrito a lo largo de los 38 primeros días del estudio mediante sumación trapezoidal para obtener el área bajo la curva (AUC). Después esto se trazó frente al log de la dosis en \mug de péptido/kg/semana. La diferencia de la potencia entre los compuestos administrados por las mismas o diferentes rutas de administración o frecuencias de dosificación se puede determinar midiendo la distancia entre las líneas log de respuesta a la dosis relevantes. La Figura 7 resume los datos de la potencia relativa para todos los experimentos realizados comparando la actividad de rHuEpo y el análogo de Epo N47 administrados mediante dos rutas diferentes (intraperitoneal e intravenosa) y con dos programas de dosificación diferentes.

Como se muestra en la Figura 7 cuando se administraba tres veces por semana, el análogo de Epo N47 tenía la misma potencia cuando se inyectaba por ruta intravenosa o intraperitoneal y era 3,6 veces más potente que rHuEpo inyectado intraperitonealmente tres veces por semana.

Estudios de Respuesta del Hematocrito a la Dosis una vez por semana (OW)

Se acometieron las comparaciones de rHuEpo y el análogo de Epo N47 a un incremento de hematocrito en ratones normales con una administración una vez por semana mediante las rutas de administración intraperitoneal o intravenosa durante seis semanas.

Se inyectaron intravenosamente una vez a la semana durante un total de seis semanas concentraciones variables de rHuEpo o análogo de Epo N47 preparadas en PBS que contenía 0,025% de seralbúmina de ratón, o vehículo de control (PBS con 0,025% de seralbúmina de ratón) en ratones CD1 normales que pesaban aproximadamente 30 g (8-10 ratones por grupo). La dosis de análogo variaba de 6,25-25 \mug de péptido/kg/dosis y la dosis de rHuEpo variaba de 25-200 \mug/kg/dosis. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron en la línea base y dos veces por semana después de eso mediante sangrados retro-orbitales. Al concluir el experimento, se recogió suero de todos los animales y se analizó en cuanto a los anticuerpos para el producto inyectado mediante radioinmunoprecipitación en solución. Los datos de los animales que se evaluaron como negativos para los anticuerpos neutralizantes se utilizaron para el análisis posterior.

Como se muestra en la Figura 8, mientras, tanto rHuEpo como el análogo N47 pueden incrementar el hematocrito en ratones normales cuando se administra en dosis una vez a la semana, la dosis de rHuEpo requerida para producir una respuesta era significativamente mayor que la del análogo N47. Por ejemplo, en este experimento 25 \mug de péptido/kg/semana de N47 aumentaba el hematocrito de los ratones en 41,2 puntos en seis semanas, mientras la misma dosis de rHuEpo producía solamente un aumento del hematocrito de 12,5 puntos.

Los estudios de respuesta a la dosis de rHuEpo y análogo N47 se realizaron mediante inyección intraperitoneal una vez a la semana utilizando procedimientos similares a los descritos antes. Los resultados obtenidos coincidieron con los resultados para la administración intravenosa y confirmaron adicionalmente la mayor potencia de análogo N47 en comparación con rHuEpo cuando se administró una vez por semana.

Para cuantificar la diferencia de actividad entre rHuEpo y el análogo N47 cuando se administraron semanalmente, se generaron los gráficos de potencia relativa a partir de todos los experimentos relevantes descritos antes. Como se muestra en la Figura 7, cuando se administró una vez por semana, el análogo N47 tenía la misma potencia cuando se inyectó por ruta intravenosa e intraperitoneal. El análogo N47 es aproximadamente 14 veces más potente que rHuEpo cuando se administraron cada uno semanalmente.

Además, los gráficos log de respuesta a la dosis de la Figura 6 también ilustran lo siguiente: (1) Una dosis dada de análogo N47 administrada una vez a la semana (QW) es aproximadamente tan eficaz como la misma dosis semanal total de rHuEpo administrada en forma de tres dosis divididas (TIW); (2) Una dosis dada de rHuEpo administrada una vez a la semana (QW) es solamente aproximadamente un 2% tan eficaz como la misma dosis semanal total de análogo N47 suministrado en forma de tres dosis divididas (TIW); (3) El análogo N47 es aproximadamente 4 veces más potente en ratones cuando se administra TIW en comparación con QW.

Estudios de Respuesta del Hematocrito a la Dosis en Semanas Alternas (EOW)

También se acometieron experimentos para evaluar la capacidad del análogo N47 para incrementar el hematocrito de los ratones cuando se inyectaba una vez cada dos semanas. Se inyectaron intravenosamente o bien semanalmente o bien una vez cada dos semanas durante un total de seis semanas concentraciones variables de análogo de Epo N47 preparadas en PBS que contenía 0,025% de seralbúmina de ratón a ratones CD-1 normales (10 ratones por grupo). El análogo N47 se administró a 200, 100 o 25 \mug/kg/dosis cada dos semanas o a 12,5 \mug/kg/dosis una vez a la semana. Los hematocritos de todos los ratones se determinaron en la línea base o dos veces por semana después de eso mediante sangrados retro-orbitales.

Como se muestra en la Figura 9, el análogo N47 puede incrementar el hematocrito de ratones normales de una manera dependiente de la dosis incluso cuando se administra bimensualmente. Como se esperaba cuando la dosis era menos frecuente, se requiere una cantidad mayor de análogo N47 para incrementar el hematocrito. Una dosis de 200 \mug/kg de análogo N47 administrada cada dos semanas aumentó el hematocrito a aproximadamente el mismo nivel en seis semanas que lo hacían 12,5 \mug/kg cuando se administraron en dosis semanales.

Ejemplo 6 Farmacocinética IV del análogo de Epo N47 y de rHuEpo en pacientes con Diálisis Peritoneal Ambulatoria Continua (CAPD)

A la vista del incremento marcado de la vida media en suero del análogo de Epo N47 en comparación con rHuEpo en rata y perro beagle, era interesante determinar si también se podría observar un incremento en seres humanos.

Se acometió un estudio de diseño cruzado al azar, doble ciego de once pacientes con CAPD estables (7 hombres, 4 mujeres, de 27-75 años de edad). Un grupo de pacientes recibió 100 U/kg de rHuEpo (equivalente a 0,5 \mug de péptido/kg) mientras un segundo grupo de pacientes recibió 0,5 \mug de péptido/kg de análogo de Epo N47, ambos administrados en forma de una única inyección de bolo intravenoso. Se recogieron muestras de sangre venosa (3 mL) por medio de un catéter para acceso intravenoso rápido y se tomaron antes de la dosificación y a los 5, 10, 15, 30 minutos y 1, 2, 5, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 60, 72 y 96 horas después del bolo intravenoso. Después de un período de lavado de 28 días, el primer grupo de pacientes recibió una única dosis intravenosa de análogo de Epo N47 mientras el segundo grupo recibió una única dosis intravenosa de rHuEpo. Las muestras de sangre se tomaron como en el primer ciclo de tratamiento. Los niveles de rHuEpo y análogo de Epo N47 se determinaron en suero mediante ELISA después de restar los niveles de Epo endógena en la línea base. Los parámetros farmacocinéticos (media \pm DT) estimados tras el ajuste para los efectos del diseño cruzado se muestran en la Tabla 5. Se calculó el AUC de la concentración en suero utilizando la sumación trapezoidal lineal. t1/2_{z} se define como: log(2)/K_{z}, donde K_{z} se calcula como la pendiente de la porción terminal de la curva del tiempo In (concentración en suero). El aclaramiento (Cl) se define como: dosis/AUC. El volumen de distribución (V_{d}) se define como: Cl/K.

TABLA 5

10

La vida media en suero para el análogo Epo N47 (25,3 hr) era tres veces más larga que para rHuEpo (8,5 hr) y el aclaramiento era 2,5 veces más rápido para rHuEpo que para el análogo N47.

Ejemplo 7 Descubrimiento de la Dosis en Fase II y Estudio de Programación de la Dosis del Análogo Epo N47

Se inician estudios de dosificación a escala sucesiva, al azar, de centros múltiples para investigar la dosis óptima y el programa de dosificación para el análogo N47 cuando se administra mediante inyección subcutánea o intravenosa en pacientes con CRF que reciben diálisis.

El programa de dosificación es el siguiente:

Dosificación una vez por semana: 0,075, 0,225, 0,45, 0,75, 1,5 y 4,5 \mug de péptido/kg/dosis.

Dosificación tres veces por semana: 0,025, 0,075, 0,15, 0,25, 0,5 y 1,5 \mug de péptido/kg/dosis.

Los estudios se llevan a cabo en dos partes: la primera parte es un estudio de dosificación a escala diseñado para evaluar la dosis del análogo N47 suministrada una o tres veces por semana que aumenta la hemoglobina a una velocidad óptima a lo largo de cuatro semanas (mayor o igual a 1 g/dL pero menor de 3 g/dL). La segunda parte de cada estudio se diseña para determinar las dosis requeridas (cuando se administra una o tres veces por semana mediante las rutas de administración intravenosa o subcutánea) para mantener el hematocrito en la diana terapéutica.

Los resultados preliminares indican que la dosificación una vez a la semana con el análogo N47 se puede utilizar tanto para incrementar como para mantener el hematocrito de pacientes CRF anémicos. Los resultados iniciales sugieren que las dosis preferidas para iniciar la terapia con un programa de dosificación tres veces a la semana son 0,15 y 0,25 \mug/péptido/kg/dosis, y con un programa de dosificación de una vez por semana son 0,45 y 0,75 \mug/péptido/kg/dosis para ambas rutas de administración.

Si bien se ha descrito la invención en lo que se considera que son sus realizaciones preferidas, no se debe limitar a las realizaciones descritas, si no al contrario, se pretende abarcar las diversas modificaciones y equivalentes incluidos en el alcance de las reivindicaciones adjuntas, cuyo alcance debe estar de acuerdo con la interpretación más amplia con el fin de abarcar todas esas modificaciones y equivalentes.

<110> Egrie, Joan

\hskip1cm Elliott, Steven

\hskip1cm Browne, Jeffrey

\hskip1cm Karen, Sitney

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<120> Métodos y Composiciones para la Prevención y el Tratamiento de la Anemia

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<130> A-460A

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<140> 09/559,001

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<141> 2000-04-21

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<150> 09/178,292

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<151> 1998-10-23

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<160> 26

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 193

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 1

11

12

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<210> 2

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400> 3

\hskip1cm14

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<210> 4

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400> 4

\hskip1cm15

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<210> 5

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 6

\hskip1cm17

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<210> 7

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 8

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<210> 9

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> artificial

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<220>

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<223> Sintética

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<400> 10

\hskip1cm21

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<210> 11

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 11

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\hskip1cm22

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<210> 12

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 12

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\hskip1cm23

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<210> 13

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 13

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\hskip1cm24

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<210> 14

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 14

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\hskip1cm25

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<210> 15

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 15

\hskip1cm26

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<210> 16

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 16

\hskip1cm27

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<210> 17

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 17

\hskip1cm28

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<210> 18

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 18

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<210> 19

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 20

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\hskip1cm31

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<210> 21

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 21

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\hskip1cm32

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<210> 22

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 22

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\hskip1cm33

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<210> 23

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 23

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\hskip1cm34

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<210> 24

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<211> 47

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<212> ADN

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<213> artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido sintético

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<400> 24

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\hskip1cm35

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<210> 25

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<211> 232

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 25

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36

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<210> 26

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<211> 2572

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<212> PRT

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<213> Humana

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<400> 26

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37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> AMGEN INC.

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Métodos y Composiciones para la Prevención y el Tratamiento de la Anemia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> A-460A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US 01/12836

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-04-19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/559,001

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido_señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido_mad

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atctagaagt tgctctctgg acagttcct

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagcttgcg ccaccatggg ggtgcacgaa tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctctag agttgctctc tggacag

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacaagctt gcgccgccat ggggg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtggacag tcgacattat ctgtcccctg tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagcttc tagaccacca tgggggtg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgacgggct gtaatgaaac gtgcagcttg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagctgcac gtttcattac agcccgtcgt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctggaaga ggatgaatgt cacgcagcag gccgtagaa

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctacggcc tgctgcgtga cattcatcct cttccaggca

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttcccagg tgaatgagac cctgcagctg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagctgcagg gtctcattca cctgggaaga gttg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagatccga ccacagctgc tcca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggagcagct gtggtcggat ctgga

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagcttc tagaccacca tgggggtg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtggacat gtgtgagttt tgtctctgtc ccctctcctg caggcctcc

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggcctgca ggacagggga cagagacaaa actcacacat gtccacct

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggacagtcg acattattta cccggagaca gggagaggct cttctgc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

49

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(1276)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

56

57

58

Claims (13)

1. Una proteína de fusión que comprende un análogo de eritropoyetina hiperglicosilado y una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, donde el análogo hiperglicosilado comprende al menos un sitio de glicosilación adicional que tiene una cadena carbohidratada anclada, y donde el análogo hiperglicosilado tiene una actividad biológica in vivo incrementada.

2. La proteína de fusión de la Reivindicación 1, donde la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una región Fc.

3. La proteína de fusión de la Reivindicación 2, donde la región Fc es de IgG humana o derivada de IgG humana.

4. La proteína de fusión de la Reivindicación 3, donde la IgG es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, o una combinación de las mismas.

5. La proteína de fusión de la Reivindicación 1, que comprende al menos un sitio de glicosilación adicional en cualquiera de las posiciones 30, 51, 52, 53, 55, 57, 69, 86, 88, 89, 114, 136 y 138 de la secuencia de la eritropoyetina humana, en la que se añade una cadena carbohidratada unida a N en el sitio.

6. La proteína de fusión de la Reivindicación 1, que es Epo Asn^{30}Thr^{32}Val^{87}Asn^{88}Thr^{90} fusionada con una región Fc.

7. La proteína de fusión de la Reivindicación 6 que consiste en la secuencia de aminoácidos madura mostrada en la Figura 11 (SEQ ID NO: 26) que carece de la secuencia señal.

8. El uso de una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la anemia.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 para elevar y mantener el hematocrito en un mamífero.

10. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

12. Una célula anfitriona eucariótica transfectada con la secuencia de ADN de la reivindicación 11, donde la célula anfitriona expresa la proteína de fusión.

13. Un método de producción de una proteína de fusión que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 12, expresar la proteína de fusión, y recuperar la proteína de fusión.