ES2306903T3

ES2306903T3 - Biosensores, y metodo y kits para la utilizacion de los mismos.

Info

Publication number: ES2306903T3
Application number: ES03776713T
Authority: ES
Inventors: Francois Bellemare; Nathalie Boucher; Lucie Lorrain
Original assignee: Labbell Inc
Current assignee: Labbell Inc
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-20
Publication date: 2008-11-16
Anticipated expiration: 2023-11-20
Also published as: ATE394672T1; CA2412206A1; DE60320831D1; AU2003286039A1; US20060147342A1; WO2004046717A1; EP1563296A1; US20100279420A1; US8303907B2; EP1563296B1

Abstract

Una formulación estabilizada de membranas tilacoides, que comprende membranas tilacoides en una solución tamponada y liposomas, en la que la formulación tiene una relación de clorofila (mg/ml)/liposomas (mg/ml) de al menos 10:1.

Description

Biosensores, y método y kits para la utilización de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a biosensores, y a un método y a kits para la utilización de los mismos. Más específicamente, la presente invención está relacionada con biosensores basados en fotosíntesis, y a un método y a kits para la utilización de los mismos.

Antecedentes de la invención

Muchos ensayos para detectar moléculas tóxicas en efluentes, son ineficaces cuando estas moléculas están presentes a una concentración muy baja. Los ensayos que son eficaces para este propósito, tales como los realizados con células y organismos vivos tales como algas, adelfas, truchas, hepatocitos, o lombrices, necesitan tiempo (hasta 72 horas). Estos métodos investigan la presencia de moléculas tóxicas en el agua midiendo la supervivencia de estos organismos y de las células en contacto con el agua que se está probando.

Recientemente se han ideado ensayos que utilizan la respuesta de órganos fotosintéticos a las moléculas tóxicas, los cuales además de reducir el tiempo de respuesta del ensayo a 10 minutos, son ventajosamente sensibles a las moléculas que afectan al transporte fotosintético de electrones y son simples de usar. Los tilacoides son los órganos responsables de la fotosíntesis en el fitoplancton, las algas y las plantas superiores. En estos ensayos, la respuesta fisiológica de los tilacoides a sobrecargas tales como las moléculas tóxicas, se averigua mediante la medición indirecta de la fotosíntesis, en base a una relación funcional entre la eficacia fotosintética y una señal de fluorescencia simulada. La emisión de fluorescencia por parte de estos órganos se debe a su capacidad de usar la luz para la fotosíntesis. Ciertos métodos determinan las actividades fotosintéticas de del Fotosistema II aislado (PS II). Por ejemplo, la patente EP núm. 1.134.585 publicada el 19 de Septiembre de 2001 a nombre de Giardi et al., describe el uso del PS II aislado de las membranas tilacoides para monitorizar herbicidas. Otros métodos determinan actividades fotosintéticas de las plantas en su conjunto. Por ejemplo, la patente US núm. 6.121.053 concedida el 19 de Septiembre de 2000 a nombre de Kolber et al., describe un fluorómetro pulsado que permite la medición de la eficacia de la fotosíntesis en plantas, fitoplancton y algas. En el documento Laberge (1999) y (2000), se describen tilacoides químicamente inmovilizados en una matriz de BSA-glutaraldehído o encapsulados en poli(vinilalcohol) portador de grupos sustituyentes de estrilpiridinio, respectivamente.

No se ha demostrado que ninguno de estos sistemas sea estable a temperatura ambiente.

Otros métodos han utilizado las propias membranas tilacoides, las cuales también se degradan desventajosamente de forma rápida a temperatura ambiente. Estas muestras de membranas tilacoides deben ser mantenidas a 4ºC, y aún entonces sobreviven solamente unas pocas horas (tabla 2). La necesidad de mantener las membranas tilacoides aisladas a baja temperatura hasta inmediatamente antes del ensayo, hace que su uso en ensayos in situ resulte difícil.

El artículo de Enz et al., 1993 (Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, vol. 1143, páginas 67-76), describe vesículas gigantes formadas a partir de la infusión de tilacoides con liposomas de azolectina, y el uso de las vesículas gigantes de tilacoide, de un tamaño comprendido entre 20 y 50 \mum, y a veces tan grandes como 100 \mum, para caracterizar mejor los flujos iónicos a través de la membrana tilacoide.

El artículo de Millner et al., 1983 (Biochimica et Biophysica Acta, vol. 722, páginas 331-40) describe el enriquecimiento de lípido para estudiar las relaciones espaciales entre los diversos complejos integrales de la membrana tilacoide de cloroplasto con el fin de adquirir conocimientos acerca de los procesos de transferencia electrónica de la fotosíntesis.

El artículo de Loranger et al., 1994 (Biotecnología y Bioingeniería, vol. 44, páginas 178-83), se refiere a un método para estabilizar membranas tilacoides en bioensayos para contaminantes fototóxicos, consistiendo el mismo en su inmovilización sobre una matriz de BSA-glutaraldehído en la que se inserta una suspensión de tilacoide.

Un objeto de la presente invención consiste por lo tanto en proporcionar biosensores basados en fotosíntesis y bioensayos para detectar las moléculas tóxicas en los fluidos, y en métodos y kits para la utilización de los mismos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona ensayos que utilizan la respuesta de órganos fotosintéticos a moléculas tóxicas que tienen desventajosamente una baja respuesta, que pueden ser tan cortos como 10 minutos para la detección herbicidas, 15 minutos para una rápida monitorización o cribado de toxicidad (optimizado para la detección catiónica), o de 15 a 180 minutos, dependiendo de la muestra probada, para la detección de toxicidad de los efluentes (sensibilidad IC_{50}).

Los métodos y kits biosensores de la presente invención permiten determinar el nivel/la presencia de ciertas moléculas tóxicas en fluidos incluyendo los efluentes. Estos biosensores son sensibles a moléculas que afectan al transporte electrónico fotosintético. Las moléculas que pueden competir con los sitios activos de las enzimas fotosintéticas y aquellas que tienen propiedades oxido-reductoras, pueden ser por lo tanto detectadas con los métodos y los bioensayos de la presente invención.

Más específicamente, de acuerdo con la presente invención, se proporcionan biosensores que comprenden membranas tilacoides estabilizadas que duran por lo menos alrededor de 7 días a temperatura ambiente, en realizaciones específicas en torno a 11 días, y en realizaciones más específicas en torno a 12 días.

También se proporciona un método para detectar moléculas tóxicas que comprende el uso de estos biosensores en combinación con un fluorómetro que permite ventajosamente el uso de un microprocesador debido a que la medición se realiza con una luz no modulada en vez de con luz pulsada. La luz pulsada permite la medición de parámetros fotoquímicos y no fotoquímicos, en el conjunto de las plantas o de las algas. En membranas tilacoides aisladas, debido a que ciertos parámetros, no fotoquímicos, no pueden ser obtenidos, puede que no sea necesaria la luz pulsada. Además, los fluorómetros de luz pulsada son aparatos relativamente complejos, costosos y voluminosos. Los fluorómetros que utilizan luz no modulada, no tienen estos inconvenientes y son sin embargo susceptibles de medir adecuadamente la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides.

También se proporciona una formulación de membrana tilacoide estabilizada que comprende membranas tilacoides en una solución tamponada y liposomas, donde la formulación tiene una relación de clorofila/liposomas que está al menos en torno a 10:1. En una realización específica, la solución tamponada tiene un pH comprendido entre alrededor de 6,2 y alrededor de 7,8. En otra realización específica, la formulación tiene una relación de clorofila/liposomas que está comprendida entre alrededor de 10:1 y 100:1. En otra realización específica, la formulación puede comprender además polivinilpirrolidina (PVP) en una concentración inferior a alrededor de un 4% en v/v. Los liposomas presentes en la formulación pueden estar constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de alrededor de 10:1.

También se proporciona un kit para detectar una molécula tóxica en un fluido, que comprende una formulación estabilizada de membranas tilacoides que comprende membranas tilacoides en solución tamponada y liposomas, en la que la relación de clorofila/liposomas es de al menos alrededor de 10:1; y un fluorómetro portátil que utiliza una luz no modulada. En una realización específica, la solución tamponada tiene un pH comprendido entre alrededor de 6,2 y alrededor de 7,8. En otra realización específica, la formulación tiene una relación de clorofila/liposomas que está comprendida entre alrededor de 10:1 y 100:1. En otra realización específica, la formulación puede comprender además polivinilpirrolidina (PVP) en una concentración inferior a alrededor de un 4% en v/v. Los liposomas presentes en la formulación pueden estar constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de aproximadamente 10:1.

También se proporciona un uso de una formulación tilacoide estabilizada de acuerdo con la presente invención para detectar o cuantificar la presencia de una molécula tóxica en una muestra de fluido. En una realización específica, la molécula tóxica se elige en el grupo constituido por herbicidas, y cationes metálicos.

También se proporciona un método para detectar o cuantificar la presencia de moléculas tóxicas en una muestra de fluido, que comprende obtener una formulación estabilizada de membranas tilacoides de acuerdo con la presente invención; y evaluar la eficacia fotosintética de la formulación de membranas tilacoides en presencia de dicha muestra, con lo que dichas moléculas son detectadas cuando dicha eficacia fotosintética es mensurablemente diferente en presencia, frente a ausencia, de dicha muestra. En una realización específica, la eficacia fotosintética se evalúa con un fluorómetro que utiliza luz no modulada después de que la formulación de membranas tilacoides ha sido incubada con la muestra durante un tiempo suficiente para permitir que las moléculas tóxicas de la muestra perturben la eficacia fotosintética de la formulación de membranas tilacoides. En otra realización específica, las moléculas comprenden un herbicida y la evaluación de la eficacia fotosintética se efectúa después de que la formulación de membranas tilacoides haya sido incubada durante 10 minutos. En otra realización específica, las moléculas comprenden un catión metálico, y la evaluación de la eficacia fotosintética se realiza después de 15 a 180 minutos.

Se proporciona adicionalmente un método de estabilización de membranas tilacoides para su uso en bioensayos, que comprende mezclar membranas tilacoides en una solución estabilizadora con liposomas, para producir una formulación de membranas tilacoides, en la que la relación final de clorofila/liposomas de la formulación es de al menos alrededor de 10:1. En una realización específica, la solución tamponada tiene un pH comprendido entre alrededor de 6,2 y alrededor de 7,8. En otra realización específica, la formulación tiene una relación de clorofila/liposomas comprendida entre alrededor de 10:1 y 100:1. En otra realización específica, la formulación puede comprender además polivinilpirrolidina (PVP) en una concentración inferior a aproximadamente un 4% en v/v. Los liposomas de la formulación pueden estar constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de alrededor de 10:1.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona por lo tanto también un kit para detectar una molécula tóxica, que comprende tilacoides estabilizados con liposomas y PVP. En una realización específica, el kit comprende además un fluorómetro portátil que utiliza una luz no modulada.

La terminología "tóxico", "molécula tóxica" y "toxicidad" se refiere en la presente a la propiedad de una sustancia que la permite perturbar (inhibir o incrementar), parcial o totalmente, la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides.

La terminología "eficacia fotosintética" se refiere en la presente a la correlación entre la fluorescencia de clorofila y las reacciones fotoquímicas (por ejemplo, evolución del oxígeno).

La terminología "muestra" se refiere en la presente a cualquier fluido que contenga moléculas tóxicas. Sin limitarse a ello, incluye aguas superficiales, aguas freáticas, aguas pluviales, aguas subterráneas, agua potable, efluentes agrícolas, efluentes industriales (pulpa y papel, aguas residuales municipales, filtraciones de vertedero de aguas residuales, productos textiles, petroquímicos, químicos, mineros), agua extraída de los alimentos, lodos, sedimentos, escorias,
etc.

Fluorescencia

Se utiliza un número de parámetros para medir la fluorescencia emitida por las membranas tilacoides. F_{0} corresponde a la fluorescencia mínima de los fotosistemas activados. Esta fluorescencia se produce mediante una débil iluminación de los fotosistemas. F_{1} corresponde a una iluminación ligeramente más alta que F_{0}. F_{2} (cerca del nivel de máxima fluorescencia) corresponde a la fluorescencia producida por iluminación intensa/actínica.

Otros objetos, ventajas y características de la presente invención resultarán más evidentes con a lectura de la descripción no limitativa que sigue de realizaciones preferidas de la misma, dadas a título de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos que se acompañan.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos adjuntos:

La figura 1 ilustra esquemáticamente la disposición de LEDs en un fluorómetro de acuerdo con una realización específica de la presente invención;

la figura 2 ilustra esquemáticamente el modo de medición de un fluorómetro de acuerdo con una realización específica de la presente invención;

la figura 3 ilustra gráficamente la variación de los parámetros F_{1}(A) y F_{2}(B) como función de la concentración de clorofila en las membranas tilacoides estabilizadas;

la figura 4 ilustra gráficamente la variación de inhibición de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides estabilizadas mediante 1,08 \mug/ml de atrazina de acuerdo con realizaciones específicas de la presente invención, como función de la concentración de clorofila calculada con los datos F_{1}(A) y F_{2}(B) presentados en la figura 3;

la figura 5 ilustra gráficamente la variación de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides estabilizadas de acuerdo con realizaciones de la presente invención, como función del tiempo tras la liberación de las membranas en una solución;

la figura 6 ilustra gráficamente la variación de inhibición de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides estabilizadas como función de diversas concentraciones de atrazina, y en diferentes momentos tras su liberación en la solución;

la figura 7 ilustra gráficamente la variación de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides como función del pH;

la figura 8 ilustra gráficamente el efecto de diversas concentraciones de atrazina sobre los parámetros de fluorescencia F_{1} y F_{2}, y la eficacia fotosintética calculada con las condiciones óptimas presentadas en las figuras 3-7, sobre membranas tilacoides estabilizadas que fueron obtenidas tras la optimización de la instalación de LEDs y las condiciones definidas de intensidad de luz y tiempo de duración;

la figura 9 ilustra gráficamente el porcentaje de inhibición mediante atrazina sobre membranas tilacoides estabilizadas, determinado con una realización específica de un fluorómetro de la presente invención, y calculado con los datos presentados en la figura 8;

la figura 10 ilustra gráficamente la variación de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides en función de la temperatura;

la figura 11 ilustra gráficamente el porcentaje de inhibición mediante efluente de pulpa y de papel, no tratado (A) y tratado (B), sobre membranas tilacoides, determinado tras diferentes tiempos de incubación con una realización específica de un fluorómetro según la presente invención;

la figura 12 ilustra típicamente el porcentaje de inhibición mediante efluente de agua residual municipal no tratado (espontáneo P-D-L) (A) y tratado (B) sobre membranas tilacoides, determinado tras diferentes tiempos de incubación con una realización específica de un fluorómetro de la presente invención; y

la figura 13 ilustra gráficamente el porcentaje de inhibición mediante efluente de filtrado no tratado (A) y tratado (tratamiento con UV) (B) sobre las membranas tilacoides, determinado después de diferentes tiempos de incubación con una realización específica de un fluorómetro según la presente invención.

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Descripción de realizaciones específicas

Ejemplo 1

Fluorómetro

En una realización específica, un fluorómetro ilumina de forma continuada, débilmente, el material biológico fotosintético con un diodo emisor de luz (LED) que emite luz a una longitud de onda de 475 o a 660 nm. Los mejores resultados se obtuvieron con una longitud de onda de 475 nm. Con el fin de obtener una sensibilidad más alta para medir la respuesta fotosintética a las moléculas tóxicas, la intensidad de la luz de baja excitación fue ajustada con vistas a obtener un nivel de fluorescencia F_{1} ligeramente más alto que F_{0}.

La fluorescencia medida a los 2 segundos después de encender un LED, es F_{1}. A continuación se encendieron tres LEDs adicionales con el fin de inducir una iluminación F_{2} actínica. La dispersión de LEDs ha sido ilustrada en la figura 1. Los haces de luz están orientados de manera que forman conjuntamente un punto de convergencia precisamente en el nivel en que se lee el fotodiodo. Tras un tiempo específico, elegido de acuerdo con la naturaleza de las membranas tilacoides utilizadas (por ejemplo, la fuente de tilacoides, etc.) (tabla 1), del ruido de fondo y del nivel de sensibilidad pretendido, se midió la fluorescencia F_{2}. Para determinar F_{1} y F_{2}, el fluorómetro mide longitudes de onda superiores a 650 nm cuando la iluminación se realiza a 475 nm, y superiores a 700 nm cuando la iluminación se realiza a
660 nm.

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TABLA 1 Influencia del retardo de tiempo sobre los niveles de fluorescencia (F_{1} y F_{2}) y la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides estabilizadas

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La figura 2 ilustra cómo se han recopilado las mediciones de fluorescencia y cómo puede ser ajustado el fluorómetro de acuerdo con una realización específica de la presente invención. La terminología "ganancia" se utiliza para referirse a la variación de integración de señal según ha sido elegida desde 0,32 hasta 80 ms. La terminología "Retardo" se utiliza en esta figura para referirse al retardo de 0,1 a 1000 ms requerido por los LEDs con vistas a producir iluminación actínica tras su activación. El retardo específico se ajusta a la vista de los diversos parámetros relacionados con respecto al retardo con anterioridad a la lectura. La terminología "alta intensidad" se utiliza para referirse a la corriente aplicada a los LEDs para producir una variación en la intensidad de luz comprendida entre 2 y 20 mV (lectura de F_{2}). La terminología "baja intensidad" se utiliza para referirse a la corriente aplicada al LED para producir una variación en la intensidad de luz comprendida entre 0 y 1,6 mV (lectura de F_{1}).

La eficacia fotosintética se determina con la siguiente fórmula: (F_{2}-F_{1})/F_{2}. Con preferencia, la eficacia fotosintética de los tilacoides estabilizados es de 0,8 \pm 0,1. Cualquier molécula que influya en los fotosistemas, modifica ya sea F_{1} o ya sea F_{2}, cuya modificación perturba necesariamente (incrementa o reduce) la eficacia fotosintética. La curva de inhibición de una molécula particular se determina calculando la actividad de los fotosistemas en ausencia de la molécula y en presencia de la molécula, y comparando ambas eficacias tal y como sigue, según se describe en Conrad 1993:

Sin inhibidor (wi):

: Eficacia_{(wi)} = (F_{2(wi)} - F_{1(wi)})/F_{2(wi)}

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Con inhibidor:

: Eficacia fotosintética relativa_{(muestra)} = (F_{2(muestra)} - F_{1(muestra)})/F_{2}(wi)

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Porcentaje de eficacia:

: Eficacia(%) = (eficacia_{(muestra)} x 100)/eficacia_{(wi)}

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Porcentaje de inhibición:

: Inhibición(%) = 100 - eficacia(%)

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El experto en la materia comprenderá que se puede utilizar cualquier fluorómetro de acuerdo con la presente invención. Por ello, los fluorómetros de luz modulada están también dentro del alcance de la presente invención

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Ejemplo 2

Preparación de membranas tilacoides

Todas las etapas se realizan en la oscuridad o bajo luz verde y a temperatura fría (muestras sobre hielo o procedimiento en habitación fría). Las membranas tilacoides son aisladas a partir de 100 g de hojas de espinaca desnervadas. Las hojas de espinaca son trituradas a continuación en un mezclador con un tampón de homogeneización que comprende TES-NaOH 20 mM con un pH de 7,5, sorbitol 330 mM, y MgCl_{2} 5 mM. Se podrían utilizar otros tampones convencionales incluyendo TES, Hepes, Tris, fosfato, tricina y MOPs. El homogenato se filtra sobre una gasa, y el filtrado se centrifuga durante 2 minutos a 2500X g a 4ºC sobre un Eppendorf® 5810-R, rotor # A-4-44.

El aglomerado es re-suspendido a continuación en una solución hipotónica consistente en 1 en 20 del tampón de homogeneización. Esta etapa se utiliza para la disolución de las membranas de cloroplasto. La solución resultante se tritura a continuación en un mezclador Wheaton® y se centrifuga durante 3 minutos a 3500X. El aglomerado resultante contiene las membranas purificadas. Éstas son re-suspendidas a continuación en un tampón consistente en TES-NaOH 20 nM con un pH de 7,5, sorbitol 330 mM, MgCl_{2} 5 mM, y NH_{4}Cl 1 mM, para obtener una concentración final de clorofila/membranas tilacoides comprendida entre 2 y 3 mg/ml. La concentración de clorofila se evalúa de acuerdo con el método descrito en Porra (1989) que aquí se describe. La solución, o bien se almacena después a -80ºC para su uso posterior, o bien puede ser estabilizada para su almacenamiento a temperatura ambiente, para su uso entre corto y medio plazo.

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Ejemplo 3

Preparación de formulación estabilizada de membranas tilacoides, lista para su uso

Una preparación de 2 a 3 mg/ml de membranas tilacoides, fue mezclada con un tampón de fosfato con un pH de 6,5 que contenía: fosfato 0,02 M, sacarosa 300 mM, NH_{4}Cl 10 mM, MgCl_{2} 20 mM, EDTA 10 mM, polivinilpirrolidina (PVP) (125 \mul de solución al 20% por 1 ml) y liposomas constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de 10:1, para obtener una solución de 0,0125 mg de liposoma/ml de clorofila/solución tamponada de membranas tilacoides. En esta formulación de membrana tilacoide estabilizada, la concentración final de PVP es de un 2% en v/v, la concentración final de liposomas es de 0,0125 mg/ml en v/v, y la de clorofila es de 0,125 mg/ml en v/v.

El PVP incrementó la estabilidad de las preparaciones de tilacoide en comparación con la misma preparación sin PVP, pero se obtuvo no obstante una estabilidad útil incluso sin PVP. La cantidad de PVP puede ser cambiada sin que afecte a la estabilidad de las membranas tilacoides entre aproximadamente 0 y aproximadamente un 4% de PVP en v/v (datos no mostrados). Otros tampones convencionales en la gama de pH de entre alrededor de 6,2 y alrededor de 7,8 -se genera una variación de alrededor de un 10% dentro de esta gama de pH (datos no mostrados)- pueden ser utilizados también sin que afecte a la utilidad de la preparación tilacoide de la presente inven-
ción.

La cantidad de liposomas utilizada fue determinada mediante la relación de clorofila/liposoma. Esta relación puede variar y con preferencia es al menos igual a 10:1, y se obtuvieron mejores resultados con relación a la estabilidad y a la sensibilidad con una relación de 100:1. Cualquier relación mayor de 100:1 se espera que funcione. Se estima que los liposomas ayudan a la formación de la vesícula de membranas tilacoides incrementando con ello su estabilidad e incrementando la consistencia de las lecturas. La cantidad utilizada puede ser variada mientras que la relación final de clorofila/liposomas sea al menos de alrededor de 10:1.

Se vertieron 100 \mul de esta solución en un tubo de 5 ml o de 7 ml previamente refrigerado. Los tubos fueron congelados a continuación y después liofilizados con un sepeed-vac® de Savant (#SS-22). La liofilización se realizó durante 4 horas para separar el agua completamente de la cantidad de 100 \mul. Los tubos se cerraron a continuación y se mantuvieron a la temperatura deseada. La tabla 2 presenta la estabilidad de varias preparaciones tilacoides obtenidas como función de la temperatura de almacenamiento.

TABLA 2 Estabilidad de diversas formulaciones de membranas tilacoides

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La tabla 3 presenta la sensibilidad de detección de membranas tilacoides estabilizadas de acuerdo con el método que aquí se presenta, así como su concentración inhibitoria media (IC_{50}) sobre varios herbicidas. En alguna de las preparaciones de membranas tilacoides de la presente invención, se observó un umbral de detección de 1 ppb con atrazina.

TABLA 3 Sensibilidad de detección de las membranas tilacoides estabilizadas re-suspendidas en varios tampones y concentración inhibitoria media (IC_{50}) sobre varios herbicidas

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Ejemplo 4

Preparación de formulación estabilizada concentrada de membranas tilacoides

Se preparó un lote concentrado de 50 pruebas en un volumen total de 20 ml de solución constituida por membranas tilacoides a una concentración de clorofila/tilacoide de 0,625 mg/ml, Tes-NaOH 25 mM con un pH de 7,5, HEPES-NaOH 25 mM con un pH de 7,5, sorbitol 330 mM, MgCl_{2} 2mM, NH_{4}Cl 1 nM, 2% de PVP (p/v) y liposomas (fosfatidilcolina : fosfatidilglicerol 10:1). Se vertió 1 ml de esta solución en una botella de ámbar. Esta preparación puede estar adaptada obviamente para la preparación de un número mayor o menor de ensayos. En esta formulación de membranas tilacoides estabilizada concentrada, la concentración final de PVP es de un 2% v/v, la concentración final de liposomas es de 0,0625 mg/ml v/v, y la de clorofila es de 0,625 mg/ml v/v. La cantidad utilizada puede ser modificada mientras la relación final de clorofila/liposomas sea de al menos alrededor de 10:1.

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Ejemplo 5

Suspensión de membranas tilacoides estabilizadas

Los tubos de ensayo individuales (100 \mul de membranas tilacoides liofilizadas) fueron re-suspendidos en 2 ml de agua o de muestras ensayadas. El lote concentrado de tubos de ensayo fue re-suspendido en agua, en Tampón 1 (50 nM de tampón HEPES-NaOH con un pH de 7,5 que contenía 330 nM de sacarosa, 20 nM de MgCl_{2}, 10 nM de NH_{4}Cl, 4% de PEG 4000 (p/v)), o en Tampón 2 (0,1 M de tampón fosfato con pH 6,5 que contenía 330 mM de sacarosa, 10 mM de NH_{4}Cl, 20 mM de MgCl_{2}, 10 mM de EDTA, 4% de PEG 4000 (p/v)). También se puede usar una combinación de las soluciones 1 y 2 tamponadas. La adición de bicarbonato (10 \mug/ml) y de hidroxilamina (100 \mug/ml) a estos tampones, no proporcionó estadísticamente ninguna diferencia en los resultados. Estos diferentes tampones rs producen diferentes resultados en la sensibilidad de detección (véase la tabla 3 anterior). El volumen final obtenido depende de la cantidad de membranas liofilizadas utilizadas (2,5 ml para 25 pruebas, 5 ml para 50 pruebas).

Según puede apreciarse a partir de la tabla 4 que sigue, las membranas tilacoides detectan moléculas tóxicas tales como los cationes metálicos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Sensibilidad de detección de las membranas tilacoides estabilizadas y concentración inhibitoria media (IC_{50}) sobre varios cationes metálicos

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El anión combinado con el metal en las sales metálicas utilizadas, puede tener influencia sobre la sensibilidad de detección (cloruro, sulfato, nitrato, carbonato, soluciones en ácido nítrico, etc.).

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Ejemplo 6

Determinación de la actividad de las membranas tilacoides mediante el método de reducción DCIP

La medición de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides estabilizadas de acuerdo con los métodos de la presente invención, se valida con el método de reducción de diclorofenol (DCIP).

Tubo A de ensayo: a 750 \mul de un tampón de partida (fosfato de sodio 0,5 M con un pH de 6,2) o de un tampón de liofilización (fosfato de sodio 0,5 M con un pH de 6,2, que contiene EDTA 10 mM; MgCl_{2} 20 mM; NH_{4}Cl 10 mM; sacarosa 330 mM; 1% de PVP), se añaden 500 \mul de solución DCIP 3,6 mM, y 500 \mul de dispersión tilacoide (membranas tilacoides diluidas en 17,5 \mug/ml^{-1} de clorofila con tampón de partida o tampón de liofilización, enfriados con hielo).

Tubo B de ensayo: a 750 \mul del tampón de partida (tampón de fosfato de sodio 0,5 M con un pH de 6,2) o del tampón de liofilización (según se ha descrito anteriormente en el tubo A de ensayo), se añaden 500 \mul de solución de DCIP 3,6 mM y 500 \mul de agua destilada.

A continuación se lee la absorbencia a 655 nm de ambos tubos, se incuban durante 10 minutos bajo una lámpara de 100 W a temperatura ambiente, y se lee de nuevo la absorbencia a 655 nm. La actividad se calcula con la siguiente fórmula: (Lectura a 655 nm tras iluminación) - (lectura a 655 nm tras iluminación).

Los resultados de las tablas 5 y 6 que siguen están expresados en forma de reducción DPIP por mg de clorofila por hora. Se diluyen diferentes volúmenes de solución de DPIP en volúmenes apropiados de tampón y se lee la absorbencia a 655 nm.

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TABLA 5 Concentración/volumen de DPIP utilizada con relación al volumen de tampón utilizado

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TABLA 6 Absorbencia de la solución antes y después de la iluminación

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Las concentraciones de DPIP según se determinan con el método de fluorescencia de la presente invención, se compararon con los valores DPIP reales para validar el método de la presente invención.

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Ejemplo 7

Medición de la concentración de clorofila en membranas tilacoides estabilizadas

Se midió la concentración de clorofila en la preparación estabilizada con un ensayo convencional de dosificación de absorbencia. Se añadieron 10 \mul de extracto de tilacoide a 5 ml de acetona al 80%. La mezcla fue centrifugada a continuación durante 5 minutos en una centrifugadora de mesa, y la absorbencia fue leía a 647 nm y a 664 nm en un fotómetro. La concentración total de clorofila fue calculada a continuación con la fórmula que sigue, según se describe en Porra (1989): [(17,76 x A647)] + (7,34 x A664) x 500/1000 = mg/ml.

La concentración de clorofila fue ajustada a continuación diluyendo la preparación con un tampón adecuado o con agua para alcanzar la concentración deseada. En una realización específica, esta concentración es de 5 \mug/ml.

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Ejemplo 8

Incubación de membranas tilacoides

Con anterioridad a su uso, los tubos que contenían las membranas tilacoides estabilizadas, fueron recuperados desde su almacenamiento. Si estaban almacenados en un el congelador o en el refrigerador, fueron aclimatados durante 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Dos mililitros de muestras de fluido y el volumen requerido de solución madre de MgCl_{2} para obtener 0-10 mM de MgCl_{2} (dependiendo de las muestras ensayadas), fueron añadidos a 100 \mul de la formulación de membranas tilacoides a una concentración de 5 \mug/ml. Los tubos fueron agitados a continuación, por inversión, durante 2 minutos. Los tubos se dejaron después en la oscuridad durante 1) otros 10 minutos para la detección de herbicidas; o 2) otros 180 minutos para determinación de la toxicidad del efluente con anterioridad a que se tomaran las mediciones de fluorescencia.

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Ejemplo 9

Comparación de la sensibilidad y la estabilidad a temperatura ambiente de biosensores basados en fotosíntesis de la técnica anterior, con membranas tilacoides estabilizadas de acuerdo con la presente invención

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TABLA 7 Comparación de la sensibilidad de detección de biosensores basados en fotosínteis de la técnica anterior con los de la presente invención

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TABLA 8 Comparación de la estabilidad a temperatura ambiente de los biosensores basados en fotosíntesis de la técnica anterior con las membranas tilacoides estabilizadas

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Ejemplo 10

Determinación del IC_{50} de las membranas tilacoides estabilizadas con atrazina

Los datos de inhibición obtenidos con el método de la presente invención, permiten determinar la concentración inicial de molécula tóxica en la muestra probada. Por ello, según se presenta en la tabla 9 que sigue, a partir de una inhibición calculada del 64,8%, es posible calcular una unidad de probabilidad (probit) del 5,377, lo que a su vez permite establecer que la muestra contenía una concentración inicial de 4 mg/l de atrazina (Finney, 1971).

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TABLA 9 Valores Log-Probit de progresión lineal entre un 5 y un 95% de efecto

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Pendiente (B) = 1,12; Dato número = 3; Intercepción = 5,53; grado de libertad = 1; Varianza (S2) = 0,003; error estándar = 0,056; error estándar de línea de regresión = 0,033; coeficiente de correlación ® = 0,9988; coeficiente de correlación para una confianza del 95% = 0,997; coeficiente de determinación (R^{2}) = 0,9976; fórmula de regresión: Y = 5,533 + 1,118 * X; fórmula de regresión: X = Y - 5,534/1,118; IC50 = 0,033 mg/l (0,031 - 0,036); Valor significativo de pendiente: T = 20,2 dl = 1 p = 0,031454.

Esta línea es significativamente diferente de 0. Su intervalo de confianza puede ser calculado como: 1,118 +/- T(1) * 0,055.

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Ejemplo 11

Efecto del tiempo de incubación sobre la emisión de fluorescencia mediante membranas tilacoides estabilizadas para detección de herbicidas

El tiempo de incubación antes de tomar la medición de fluorescencia, fue fijado en diez minutos. La emisión de fluorescencia hasta 60 minutos después de la liberación de tilacoides en la solución, es sustancialmente similar al encontrado a los diez minutos. Se estima que la medición después de menos de 10 minutos tras la liberación, puede afectar a la sensibilidad de las pruebas puesto que una concentración más baja de moléculas herbicidas (figura 5) tarda más tiempo en inhibir la señal de fluorescencia.

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Ejemplo 12

Efecto de las concentraciones de clorofila en la preparación de membranas tilacoides estabilizadas sobre la medición de fluorescencia

La variación de los parámetros F_{1}(A) y F_{2}(B) fue determinada como función de la concentración de clorofila (figura 3) sobre membranas estabilizadas con PVP y liposomas según se describe en la presente. Estas mediciones determinaron la concentración efectiva más baja de tilacoides de membrana (expresada como concentración de clorofila) necesaria para realizar el ensayo. Las concentraciones comprendidas entre 10 y 20 \mug/ml de clorofila/tilacoides, dieron casi los mismos resultados. Resulta deseable utilizar la concentración más baja posible de clorofila/tilacoides con vistas a limitar la turbiedad de la solución causada por la clorofila, ya que reduce la fluorescencia. La figura 4 ilustra que a concentraciones de clorofila más bajas, se obtienen mejores resultados.

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Ejemplo 13

Efecto del pH sobre la medición de fluorescencia sobre membranas tilacoides estabilizadas

Se midió la variación de la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides como función del pH, sobre tilacoides estabilizados con PVP y liposomas según se ha descrito en la presente. Los resultados presentados en la figura 7 indican que los pHs básicos (definidos en la presente como más altos que 7,8), inhiben la eficacia fotosintética como lo hacen las sustancias tóxicas. Por lo tanto, en realizaciones específicas del método de la presente invención, el pH de la solución acuosa se ajusta en 7,5 con anterioridad a la liberación de las membranas tilacoides para la medición de fluorescencia.

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Ejemplo 14

Sensibilidad de las mediciones de F_{1} y F_{2} en comparación con la eficacia de la fotosíntesis para medir la inhibición

La capacidad de las mediciones F_{1} y F_{2} para proporcionar información precisa sobre la presencia de un agente tóxico, fue comparada con la proporcionada por la fórmula (F_{2} - F_{1})/F_{2} (wi) (eficacia de la fotosíntesis). Las mediciones se realizaron sobre membranas tilacoides estabilizadas con PVP y liposomas, según se ha descrito en la presente. Tal y como se ha ilustrado en la figura 9, la fórmula (F2 - F_{1})/F_{2} de eficacia de fotosíntesis, es más sensible que F_{1} y F_{2} para evaluar el efecto de los inhibidores.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 15

Influencia de los parámetros físico-químicos de los fluidos ensayados sobre la eficacia de fotosíntesis de las membranas tilacoides estabilizadas

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TABLA 10 Influencia de algunos parámetros físico-químicos sobre la eficacia de fotosíntesis de las membranas tilacoides estabilizadas

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Éstos son los parámetros físico-químicos que se comprueban normalmente para caracterizar las muestras de agua tras su recepción. Estos parámetros pueden conducir a resultados falsos sobre la evaluación de la toxicidad.

Con el fin de evitar estos eventuales efectos, se sugiere leer los valores de fluorescencia (F_{1} y F_{2}) en el instante cero, y utilizarlos como valor de partida (o valor cero) en el cálculo del porcentaje de inhibición.

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Ejemplo 16

Efecto de la temperatura sobe las membranas tilacoides

Se midió la variación de la eficacia fotosintética y de los niveles de fluorescencia (F_{1} y F_{2}) sobre tilacoides estabilizados con PVP y liposomas según se ha descrito en la presente. Los resultados presentados en la figura 10, indican que la prueba puede ser llevada a cabo a una temperatura comprendida en la gama de 4 a 35ºC si las lecturas de las muestras de control y de las probadas se llevan a cabo a la misma temperatura.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 17

Determinación de atrazina espiciforme en agua y zumo

Los herbicidas pueden ser también detectados en los zumos (tras el ajuste del pH) o en el agua extraída de los zumos (filtración gravimétrica) como se demuestra en la tabla 11. El porcentaje de inhibición observado con concentraciones bajas de atrazina en los jugos, es similar al observado en el agua.

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TABLA 11 Determinación de atrazina espiciforme en el agua y el zumo

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Ejemplo 18

Determinación de la toxicidad en efluentes industriales

Las figuras 11 a 13 ilustran la eficacia de la prueba para la determinación de la toxicidad en efluentes industriales con diferentes tiempos de incubación. La sensibilidad de detección de toxicidad se incrementa con el aumento del tiempo de incubación en efluentes no tratados (no tratados = efluentes sin depurar, tratados = tratamientos biológicos, químicos o de otro tipo). Se detectan pequeñas concentraciones de moléculas tóxicas en la pulpa y en el papel y en los efluentes de filtrado incluso después de un tiempo de incubación de 2 horas. La prueba puede ser utilizada para determinar la eficacia de los tratamientos de aguas residuales tales como los tratamientos biológicos, aeróbicos o químicos. Las figuras 11 a 13 muestran la eficacia de varios de esos tratamientos (biológicos: industria del papel y de la pulpa (figura 11), tratamiento aeróbico en las aguas residuales municipales (figura 12), tratamiento biológico y químico en el lugar de un vertedero sanitario (figura 13).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 19

Determinación de toxicidad en efluentes medioambientales

Según puede apreciarse a partir de la tabla 12, algunas moléculas tóxicas medioambientales que pueden encontrarse en muestras de fluido, pueden estimular o inhibir la eficacia fotosintética.

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TABLA 12 Muestra una corta lista de moléculas detectadas por la presente invención y sus efectos (inhibición o estimulación) sobre membranas tilacoides

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Aunque la presente invención ha sido descrita en lo que antecede en forma de realizaciones preferidas de la misma, puede ser modificada sin salir del espíritu y la naturaleza del objeto de la invención según se define en las reivindicaciones anexas.

En particular, aunque los ejemplos que se presentan en la descripción muestran el uso de preparaciones de membranas tilacoides estabilizadas para la detección de moléculas tóxicas tales como los herbicidas, los iones metálicos, el H_{2}O_{2}, NaCl, CaCO_{3}, los nitratos, fosfatos, ácido oleico, ácido esteárico, nitrógeno amoniacal y ácido húmico, un experto en la materia comprenderá que cualquier molécula tóxica susceptible de perturbar la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides puede ser detectada de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Referencias

1. Conrad, R; C. Büchel; C. Wilhelm; W. Arslane; C. Berkaloff y J. C. Duval (1963). "Cambios en la producción de fluorescencia de la clorofila in vivo como herramienta para la monitorización selectiva de herbicidas", J. Appl. Phycol. 5; 505-516;

2. Porra R.J., Thompson W.A., Kriedemann P.E., (1989), "Biochimia Biophysica Acta 975": 384-394;

3. Ministerio de Medioambiente de Québec (2001). Criterios de calidad del agua de superficie en Québec. Dirección de ecosistemas acuáticos, Ministerio de Medioambiente, Québec;

4. Laberge, Chartrand, Rouillon, Carpentier (1999). "Prueba de examen de fitotoxicidad in vitro utilizando tilacoides de espinaca inmovilizadas", Env. Tox. Chem. 18 (12): 2851-2858;

5. Koblizek, Maly, Masojidek, Komenda, Kucera, Giardi, Matloo, Piloton (2002). "Un biosensor para la Detección de Herbicidas de Triazina y de Polilurea Diseñado con la utilización de Fotosistema II Acoplado a un Electrodo Impreso de Examen", Biotechnol. Bioeng. 78 (1): 110-116;

6. Jay, Ducruet, Duval, Pelletier (1997). "Un ensayo de fluorescencia de clorofila de alta sensibilidad para monitorizar la inhibición de herbicidas del fotosistema II en Selenastrum capricomutum de la clorofila": Comparación con el efecto sobre el cultivo celular. Arch. Hydrobiol. 140 (2): 273-286;

7. Laberge, Rouillon, Carpentier (2000). "Estudio comparativo de la sensibilidad de membranas tilacoides para la detección de herbicidas tras la inmovilización física o química", Enz. Microb. Technol. 26: 332-336;

8. Loranger, Carpentier (1994), "Un bioensayo rápido para mediciones de fototoxicidad utilizando membranas fotosintéticas inmovilizadas" Biotech. Bioeng. 44: 178-183;

9. Rouillon, Carpentier (2000), "Mediciones de actividad amperométrica de material fotosintético inmovilizado en poli(vinilalcohol)-SbQ. Aplicación para detectar contaminantes", Curr. Topics Electroch. 7: 125-133;

10. Finney, D. J. (1971), Análisis de Probabilidad, Cambridge University Press, 333 páginas.

Claims

1. Una formulación estabilizada de membranas tilacoides, que comprende membranas tilacoides en una solución tamponada y liposomas, en la que la formulación tiene una relación de clorofila (mg/ml)/liposomas (mg/ml) de al menos 10:1.

2. Una formulación según se define en la reivindicación 1, en la que la solución tamponada tiene un pH entre 6,2 y 7,8.

3. Una formulación según se define en la reivindicación 1 ó 2, en la que la formulación tiene una relación de clorofila (mg/ml)/liposomas (mg/ml) de entre 10:1 y 100:1.

4. Una formulación según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además polivinilpirrolidina (PVP) en una concentración inferior al 4% en v/v.

5. Una formulación según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los liposomas están constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilgliceron en una relación de 10:1.

6. Una formulación según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que los liposomas consisten en fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de 10:1.

7. Un kit para la detección de una molécula que perturba (inhibe o incrementa), parcial o totalmente, la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides en un fluido, que comprende una formulación estabilizada de membranas tilacoides, que comprende membranas tilacoides en una solución tamponada y liposomas, en la que la relación de clorofila (mg/ml)/liposomas (mg/ml) es de al menos 10:1; y un fluorómetro portátil que utiliza luz no modulada.

8. Un kit según se define en la reivindicación 7, en el que la solución tamponada tiene un pH entre 6,2 y 7,8.

9. Un kit según se define en la reivindicación 7 u 8, que comprende además polivinilpirrolidina (PVP) en una concentración inferior al 4% en v/v.

10. Un kit según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que los liposomas están constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de 10:1.

11. Uso de una formulación tilacoide estabilizada según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para detectar o cuantificar la presencia de una molécula que perturba (inhibe o aumenta), parcial o totalmente, la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides en una muestra de fluido.

12. Uso según se define en la reivindicación 11, en el que dicha molécula se elige en el grupo constituido por herbicidas, iones metálicos, H_{2}O_{2}, NaCl, CaCO_{3}, nitratos, fosfatos, ácido oleico, ácido esteárico, nitrógeno amoniacal y ácido húmico.

13. Un método para detectar o cuantificar la presencia de moléculas que perturban (inhiben o aumentan), parcial o totalmente, la eficacia fotosintética de las membranas tilacoides en una muestra de fluido, que comprende:

obtener una formulación estabilizada de membranas tilacoides según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y

evaluar la eficacia fotosintética de la formulación de membranas tilacoides en presencia de dicha muestra, en el que la eficacia fotosintética se evalúa con un fluorómetro que utiliza luz no modulada después de que la formulación de membranas tilacoides ha sido incubada con la muestra durante un tiempo suficiente para permitir que dichas moléculas presentes en la muestra perturben la eficacia fotosintética de la formulación de membranas tilacoides;

por lo que dichas moléculas son detectadas cuando dicha eficacia fotosintética es mensurablemente diferente en presencia, frente a ausencia, de dicha muestra.

14. Un método según se define en la reivindicación 13, en el que las moléculas comprenden un herbicida y en el que la evaluación de la eficacia fotosintética se realiza después de que la formulación de membranas tilacoides ha sido incubada durante 10 minutos.

15. Un método según se define en la reivindicación 13, en el que las moléculas comprenden un ion metálico y en el que la evaluación de la eficacia fotosintética se realiza después de entre 15 a 180 minutos.

16. Un método de estabilización de membranas tilacoides para su uso en bioensayos, que comprende mezclar membranas tilacoides en una solución tamponada, con liposomas, para producir una formulación de membranas tilacoides, en la que la relación final de clorofila (mg/ml)/liposomas (mg/ml) es de al menos 10:1.

17. Un método según se define en la reivindicación 16, en el que la solución tamponada tiene un pH entre 6,2 y 7,8.

18. Un método según se define en la reivindicación 16 ó 17, en el que la relación final de clorofila (mg/ml)/liposomas (mg/ml) es de entre 10:1 y 100:1.

19. Un método según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la formulación comprende además polivinilpirrolidina (PVP) en una concentración inferior a un 4% en v/v.

20. Un método según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que los liposomas están constituidos por fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de 10:1.

21. Un método según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que los liposomas consisten en fosfatidilcolina y fosfatidilglicerol en una relación de 10:1.