ES2307529T3 - Uso de extracto de ginkgo para el tratamiento del cancer que se caracteriza por la sobre-expresion de la proteina receptora de benzodiacepina de tipo periferico. - Google Patents

Abstract

Uso de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado en la fabricación de un medicamento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que dicho paciente se caracteriza por tener células cancerígenas que sobre-expresan la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico.

Description

Uso de extracto de Ginkgo para el tratamiento del cáncer que se caracteriza por la sobre-expresión de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico.

La presente invención se refiere al uso del extracto de hojas de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado (GKB), un componente del extracto de hojas de Ginkgo biloba, en la fabricación de un medicamento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que el cáncer se caracteriza por una sobre-expresión de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso del extracto de hojas de Ginkgo biloba o GKB aislado en la fabricación de un medicamento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que el cáncer se caracteriza por una sobre-expresión de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico en el que dicho cáncer es cáncer de mama humano. Incluso más particularmente, la presente invención se refiere al uso del extracto de hojas de Ginkgo biloba o GKB aislado en la fabricación de un medicamento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que el cáncer se caracteriza por una sobre-expresión de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico, en el que en dicho cáncer, las células son del fenotipo agresivo e invasivo y expresan niveles elevados de PBR en comparación con células cancerígenas no
agresivas.

En la descripción también se incluye el uso de extracto de hojas de Ginkgo biloba para reducir la expresión de treinta y cinco (35) productos génicos como se detalla en profundidad a continuación en el presente documento. En la descripción también se incluye un procedimiento para reducir la expresión del receptor de benzodiacepina de tipo periférico (PBR) en células de un paciente que lo necesite. En la descripción también se incluye el uso del extracto de hojas de Ginkgo biloba o GKB aislado en un procedimiento para reducir la proliferación de células cancerígenas en un paciente que lo necesite.

Se prefiere que una formulación particular del extracto de hojas de Ginkgo biloba conocida como EGB 761® (un producto de IPSEN, Paris, Francia) sea un constituyente de una composición o se use en un procedimiento de la presente invención.

El Ginkgo biloba es uno de los árboles más antiguos y los extractos de sus hojas se han usado en medicina tradicional durante varios cientos de años. Hay numerosos estudios que describen los efectos beneficiosos de los extractos de Ginkgo biloba en pacientes con trastornos de vigilia, memoria, y funciones cognitivas asociadas con la edad y la senilidad, y en aquellos con todo tipo de demencias, cambios de humor, y la capacidad de hacer frente a los factores de estrés diarios. En la mayoría de estos estudios se ha usado un extracto estandarizado de hojas de Ginkgo biloba denominado EGB 761®. También se sabe que este extracto tiene efectos cardioprotectores (DeFeudis F. V. Ginkgo biloba extract (EGB 761®): from chemistry to clinic. Ullstein Medical, Wisbaden, Alemania. 400 pp. 1998; Tosaki, A., Droy-Lefaix, M. T., Pali, T., y Das, D. K., Free Rad. Biol. Med., 14: 361-370,1993). Estos efectos se han atribuido, al menos en parte, a las propiedades secuestrantes de radicales libres del EGB 761®, probablemente debidas a la presencia de constituyentes flavonoides o terpenoides en el extracto. Recientes estudios in vivo e in vitro demuestran que los constituyentes terpenos del EGB 761®, los ginkgólidos y la bilobalida, tienen propiedades antioxidantes (Pietri, S., Maurelli, E., Drieu, K., y Culcasi, M., J. Mol. Cell. Cardiol., 29: 733- 742,1997; Yao, Z., Boujrad, N., Drieu, K., y Papadopoulos, V., Adv. Ginkgo Biloba Res. 7: 129-138, 1998). Otros estudios del EGB 761® han informado del valor medicinal del producto en el tratamiento de una variedad de trastornos clínicos incluyendo insuficiencias cerebrovasculares y vasculares periféricas asociadas con la edad y la senilidad. Véase, por ejemplo, Ginkgo biloba Extract (EGB 761®) Pharmacological Activities and Clinical Applications, DeFeudis, F.V., Eds, Elsevier, 1991; y Ullstein Medical 1998, Ginkgo biloba extract (EGB 761®), Eds. Wiesbaden, DeFeudis, F.V. El extracto contiene un 24% de glicósidos de ginkgo-flavona, un 6% de lactonas terpénicas (ginkgólidos y bilobalida), un 7% aproximadamente de proantocianidinas y diversos otros constituyentes. Véase, Boralle, N., y col., en: Ginkgolides, Chemistry, Biology, Pharmacology and Clinical perspectives, Ed: Braquet, P., J.R. Prous Science Publishers,
1988.

La progresión tumoral es un proceso multi-etapa en el que células normales adquieren gradualmente más fenotipos malignos, incluyendo la capacidad de invadir tejidos y formar metástasis, la causa primaria de mortalidad en el cáncer de mama. Durante este proceso, la expresión "aberrante" de una serie de productos génicos puede ser la causa o el resultado de la tumorogénesis. Considerando que la primera etapa de la progresión tumoral es la proliferación celular, se puede proponer que la tumorogénesis y la malignidad están relacionadas con el potencial proliferativo de las células tumorales.

Estudios en una serie de tumores tales como cerebro de rata conteniendo tumores glioma (Richfield, E.K. y col. (1988) Neurology 38:1255-1262), adenocarcinoma colónico y carcinoma de ovario (Katz, Y. y col. (1988) Eur. J. Pharmacol. 148:483-484 y Katz, Y. y col. (1990) Clinical Sci. 78:155-158) han mostrado una abundancia de receptores de benzodiacepina de tipo periférico (PBR) comparado con el tejido normal. Además, se encontró un incremento de 12 veces en la densidad del PBR en relación al parénquima normal, en glioma o astrocitoma de cerebro humano (Cornu, P. y col. (1992) Acta Neurochir. 199:146-152). Los autores sugieren que las densidades del PBR pueden reflejar la actividad proliferativa del receptor en estos tejidos. Recientemente, se ha demostrado adicionalmente la implicación del PBR en la proliferación celular (Neary, J.T. y col. (1995) Brain Research 675:27-30; Miettinen, H. y col. (1995) Cancer Research 55:2691-2695), y se ha encontrado que su expresión en tumores astrocíticos humanos está asociada a malignidad tumoral e índice proliferativo (Miettinen, H. y col. supra; Alho, H. (1994) Cell Growth Different. 5:1005-1014). Estudios adicionales han demostrado que los receptores PBR son abundantes en glioblastomas humanos (Broaddus, W.C., y col., Brain Research, Vol. 518:199-208, 1990; y Pappata, S., y col., J. Nuclear Med., 32:1608-1610, 1991).

El PBR es una proteína de 18 kDa descubierta como una clase de sitios de unión para benzodiacepinas diferentes del receptor del neurotrasmisor GABA (Papadopoulos, V. (1993) Endocr. Rev. 14:222-240). Los PBR son extremadamente abundantes en células esteroidogénicas y se encuentran principalmente en las membranas mitocondriales externas (Anholt, R. y col. (1986) J. Biol. Chem. 261:576-583). Se piensa que el PBR es parte de un complejo multimérico compuesto por la proteína de unión a isoquinolina de 18 kDa y por la proteína del canal aniónico dependiente de voltaje formadora de poro de 34 kDa, preferentemente localizada sobre los sitios de contacto de la membrana mitocondrial externa/interna (McEnery, M. W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3170-3174; Gamier, M. y col. (1994) Mol. Pharmacol. 45:201-211; Papadopoulos, V. y col. (1994) Mol. Cel. Endocr. 104:R5-R9). Los ligandos farmacológicos del PBR, tras la unión al receptor, estimulan la síntesis de esteroides en células esteroidogénicas in vitro (Papadopoulos, V. y col. (1990) J. Biol. Chem. 265:3772-3779; Ritta, M.N. y col. (1989) Neuroendocrinology 49:262-266; Bamea, E.R. y col. (1989) Mol. Cell Endocr. 64:155-159; Amsterdam, A. y Suh, B. S. (1991) Endocrinology 128:503-510; Yanagibashi, K. y col. (1989) J. Biochem. (Tokio) 106:1026-1029). Asimismo, estudios in vivo demuestran que los ligandos del PBR de alta afinidad incrementan los niveles plasmáticos de esteroides en ratas hipofisectomizadas (Papadopoulos V. y col. (1997) Steroids 62:21-28). Estudios in vitro adicionales sobre mitocondrias aisladas proporcionan evidencias de que los ligandos del PBR, ligandos farmacológicos, o el ligando endógeno del PBR, el polipéptido inhibidor de la unión de diazepam (BDI) (Papadopoulos, V. y col. (1997) Steroids 62:21-28), estimulan la formación de pregnenolona incrementando la velocidad de transferencia de colesterol desde la membrana mitocondrial externa a la interna (Krueger, K. E. y Papadopoulos, V. (1990) J. Biol. Chem 265:15015-15022; Yanagibashi, K. y col. (1988) Endocrinology 123: 2075-2082; Besman, M. J. y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:4897-4901; Papadopoulos, V. y col. (1991) Endocrinology 129:1481-
1488).

Basándose en la secuencia de aminoácidos del PBR de 18 kDa, se desarrolló un modelo tridimensional (Papadopoulos, V. (1996) en: The Leydig Cell. Payne, A.H. y col. (eds) Cache River Press, IL, pp. 596-628). Se demostró que este modelo se acomoda a la molécula de colesterol y funciona como un canal, apoyando el papel del PBR en el transporte del colesterol. Recientemente demostramos el papel del PBR en la esteroidogénesis generando células PBR negativas por recombinación homóloga (Papadopoulos, V. y col. (1997) J. Biol. Chem. 272:32129-32135) que no pudieron producir esteroides. No obstante, la adición del análogo hidrosoluble del colesterol, 22R-hidroxicolesterol, recuperó la producción de esteroides en estas células, lo que indica que el mecanismo de transporte del colesterol estaba afectado. Experimentos sobre el transporte del colesterol adicionales en bacterias que expresan la proteína PBR de 18 kDa proporcionaron evidencias definitivas de la función como transportador/canal de colesterol (Li y Papadopoulos, V. y col. (1998) Endocrinology). El documento EP 0359951 enseña que agentes quimioterapeúticos en combinación con glicósidos de flavina del Ginkgo presentan un mayor efecto inhibitorio sobre el desarrollo del cáncer que la aplicación combinada de diferentes agentes citostáticos.

El documento DE 4208868 enseña que se puede conseguir la amplificación del efecto inhibitorio del crecimiento tumoral de agentes quimioterapeúticos citostáticos mediante múltiples administraciones previas de ginkgóli-
dos.

Los autores teorizan que el receptor de benzodiacepina de tipo periférico es parte de los cambios en las funciones celulares y moleculares que influyen en el aumento del comportamiento agresivo del cáncer, y decidimos examinar esta hipótesis en el cáncer de mama humano. El cáncer de mama es el neoplasma más habitual y la principal causa de las muertes relacionadas con el cáncer en mujeres en la mayoría de países desarrollados (Lippman, M. E. (1993) Science 259:631-632), que afecta a cerca de 184.000 mujeres, con más de 46.000 muertes al año sólo en los EE.UU. (American Cancer Society, 1996). Las células de la mama humana son diferentes de las células cerebrales y gonadales y no pueden producir esteroides, pero al igual que muchas otras células en el cuerpo, son capaces de metabolizar los esteroides.

El aumento en la expresión del PBR se correlaciona con un mayor comportamiento agresivo de las células tumorales. Los tumores invasivos invaden y crecen localmente pero no metastatizan. No obstante, los tumores agresivos tienen la capacidad de invadir y metastatizar a través de los vasos sanguíneos hacia diferentes lugares del cuerpo humano. La metástasis tumoral en órganos vitales (tales como pulmones) es la causa de muerte más habitual.

La correlación entre niveles elevados de expresión del PBR y el potencial metastático en el cáncer de mama humano se demuestra en la solicitud de EE.UU. Nº 09/047.652 pendiente de tramitación presentada el 25 de marzo de 1998, de la que el co-inventor Vassilios Papadopoulos lo es también en la presente solicitud. No obstante, debido a la implicación del PBR en la proliferación celular, y la expresión del PBR en todas las células, es probable que esta relación existiese para otros tumores sólidos y cánceres tales como el cáncer de próstata, cáncer de colon, tumores cerebrales, y tumores en tejidos que producen esteroides tales como tumores gonadales, por nombrar unos
pocos.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención se refiere al uso de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado en la fabricación de un medicamento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que dicho cáncer se caracteriza por una sobre-expresión de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico. En la descripción también se incluye un procedimiento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que el cáncer está provocado por la desregulación de la expresión de proteínas que tienen un papel en la regulación de células tumorales, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para combatir la proliferación de células cancerígenas en un paciente que necesite combatirla, en el que la proliferación está provocada por la desregulación de la expresión de proteínas que tienen un papel en la regulación de células tumorales, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para combatir la proliferación de células cancerígenas en un paciente que necesite combatirla, en el que la proliferación está provocada por la sobre-expresión de proteínas que tienen un papel en la regulación de células tumorales, que comprende la administración de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado a un paciente.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para combatir la proliferación de células cancerígenas que tienen un fenotipo agresivo en un paciente que necesite combatirla, en el que la proliferación está provocada por la sobre-expresión de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para combatir la proliferación de células cancerígenas, en el que la proliferación está provocada por la sobre-expresión de oncogenes, reduciendo la expresión de dichos oncogenes en un paciente que necesite combatirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado. Un procedimiento preferido de los procedimientos inmediatamente precedentes es aquel en el que dichos oncogenes son uno o más de APC, PE-1, RhoA y c-Jun.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para reducir la expresión del receptor de benzodiacepina de tipo periférico en células cancerígenas en un paciente que necesite reducirla, en el que dichas células cancerígenas expresan un nivel anormal de receptor de benzodiacepina de tipo periférico en relación a células cancerígenas normales, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado. Un procedimiento preferido de los procedimientos inmediatamente precedentes es aquel en el que las células cancerígenas son células cancerígenas de mama humanas; glioblastomas humanos; tumores cerebrales humanos; astrocitomas humanos; carcinoma colónico humano; adenocarcinoma colónico humano; carcinomas de ovario humano; y carcinoma hepatocelular humano.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para reducir la expresión del ARNm del receptor de benzodiacepina de tipo periférico en células cancerígenas en un paciente que necesite reducirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento para incrementar la expresión del protooncogén c-Myc en un paciente que necesite incrementarla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de los reguladores del ciclo celular protimosina-\alpha, CDK2, p55CDC, mieloblastina y el antígeno nuclear de células en proliferación p120 (PCNA) en un paciente que necesite reducirlo, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de los moduladores de la transducción de señales intracelulares NET1 y ERK2, en un paciente que necesite reducirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de las proteínas relacionadas con la apoptosis receptor de adenosina A2A, ligando FIt3, Grb2, Clusterina, RXR-\beta, Glutation S-transferasa P, N-Myc, TRADD, SGP-2 y NIP-1, en un paciente que necesite reducirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de los factores de transcripción Id-2, ATF-4, ETR-101 y ETR-103, en un paciente que necesite reducirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

\newpage

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de los factores de crecimiento factor estimulante de colonias de macrófagos 1, factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina, proteína similar al factor de crecimiento de hepatocitos e inhibina \alpha, en un paciente que necesite reducirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de las moléculas de adhesión celular antígeno de linfocitos B CD19, L1CAM, \beta-catenina, subunidades de la integrina \alpha3, \alpha4, \alpha6, \beta5, y \alphaM, en un paciente que necesite reducirla, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye un procedimiento de reducción de la expresión de los genes APC, PE-1, RhoA, c-Jun, protimosina-\alpha, CDK2, p55CDC, mieloblastina, antígeno nuclear de células en proliferación p120 (PCNA), NET1, ERK2, receptor de adenosina A2A, ligando FIt3, Grb2, Clusterina, RXR-\beta, Glutation S-transferasa P, N-Myc, TRADD, SGP-2, NIP-1, Id-2, ATF-4, ETR-101, ETR-103, factor estimulante de colonias de macrófagos 1, factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina, proteína similar al factor de crecimiento de hepatocitos, inhibina \alpha, antígeno de linfocitos B CD19, L1CAM, \beta-catenina, y subunidades de la integrina \alpha3, \alpha4, \alpha6, \beta5, y \alphaM, en un paciente que necesite reducirlo, que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado.

En la presente descripción también se incluye una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado para combatir el cáncer y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

De todos los procedimientos y composiciones anteriores de la presente invención y la presente descripción, una forma de realización preferida de cada uno es aquel en el que el extracto de Ginkgo biloba es EGB 761®.

Además, de todos los procedimientos y composiciones anteriores de la presente invención y la presente descripción, se prefiere aquel en el que se usa ginkgólido B.

Breve descripción de los dibujos

El documento de esta patente contiene al menos un dibujo a color (Figura 11). Las copias de esta patente con dibujos a color serán proporcionadas por la Oficina de patentes y marcas bajo pedido y tras el pago de las tarifas necesarias.

Fig. 1. Efecto de diversas concentraciones de EGB 761® sobre la capacidad de unión del ligando del PBR EN MDA-231. Se cultivaron células MDA-231 como se describe en la sección de Materiales y procedimientos. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de la forma inyectable del EGB 761®. Las células se recogieron en los períodos de tiempo indicados y se determinaron las características de unión del ligando del PBR por análisis de Scatchard. Los puntos de los datos representan la media \pm DE de tres experimentos independientes llevados a cabo por triplicado.

Fig. 2. Efecto de diversas concentraciones de GKB sobre la capacidad de unión del ligando del PBR EN MDA-231. Se cultivaron células MDA-231 como se describe en Materiales y procedimientos. Las células se trataron con las concentraciones indicadas de GKB durante 48 horas. Las células se recogieron en los períodos de tiempo indicados y se determinaron las características de unión del ligando del PBR por análisis de Scatchard. Los puntos de los datos representan la media \pm DE de dos experimentos independientes llevados a cabo por triplicado.

Fig. 3. Efecto del EGB 761® y el GKB sobre los niveles del ARNm del PBR en células MDA-231. Las células se trataron durante 48 horas con o sin 20 (EGb-20) o 200 (EGb-200) \mug/ml de EGB 761® o 2 (GKB-2) o 20 (GKB-20) \mug/ml de GKB. Al final de la incubación se aisló el ARN total y se cargó sobre un gel de formaldehído al 1% a una concentración de 10 \mug/carril. Las transferencias Northern se incubaron con una sonda hPBR marcada con ^{32}P y se expusieron a la película XOMAT de Kodak. Arriba, el autoradiograma de la transferencia. El PBR migra a 0,9 Kb. Abajo, intensidad relativa del ARNm del PBR/ARN ribosómico 28S visualizado por tinción con bromuro de etidio. El autoradiograma y la cuantificación del ARNm del PBR representan uno de dos experimentos
independientes.

Fig. 4. Efecto del EGB 761® sobre la proliferación de células MDA-231. Células MDA-231 crecidas en placas de 96 pocillos se lavaron con PBS y se cultivaron en medio suplementado con FBS al 10% en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de EGB 761®. 4 horas antes del final de la incubación, se añadió bromodesoxiuridina (BrdU) a cada pocillo. Se midió la incorporación de BrdU a 450 nm (referencia = 700 nm). Los puntos de los datos representan la media \pm DE de cuatro experimentos independientes llevados a cabo por cuadruplicado. El análisis de una vía ANOVA indica que la proliferación de las células MDA-231 estaba significativamente alterada por el tratamiento con EGB 761® en los puntos temporales 48, 72 y 96 h (P<0,0001).

Fig. 5. Derecha, centro, izquierda. Recuperación de la proliferación de las células MDA-231 tras la retirada de EGB 761®. Células MDA-231 crecidas en placas de 96 pocillos se lavaron con PBS y se cultivaron en medio suplementado con FBS al 10% en presencia o ausencia de 2 (izquierda), 20 (medio) o 200 (derecha) \mug/ml de EGB 761® durante 48 h. Al final del tratamiento las células se lavaron y se incubaron en medio exento de EGB 761® durante 48 h. 4 horas antes del final de la incubación, se añadió bromodesoxiuridina (BrdU) a cada pocillo. Se midió la incorporación de BrdU a 450 nm (referencia = 700 nm). Los puntos de los datos representan la media \pm DE de dos experimentos independientes llevados a cabo por cuadruplicado.

Fig. 6. Efecto del GKB sobre la proliferación de células MDA-231. Células MDA-231 crecidas en placas de 96 pocillos se lavaron con PBS y se cultivaron en medio suplementado con FBS al 10% en presencia o ausencia de 2 \mug/ml o 20 \mug/ml de GKB durante 48 h. 4 horas antes del final de la incubación, se añadió bromodesoxiuridina (BrdU) a cada pocillo. Se midió la incorporación de BrdU a 450 nm (referencia = 700 nm). Los puntos de los datos representan la media \pm DE de dos experimentos independientes llevados a cabo por cuadruplicado. El análisis de una vía ANOVA indica que la proliferación de las células MDA-231 estaba significativamente alterada por el tratamiento con GKB (P<0,0001).

Fig. 7. Efecto del EGB 761® y el GKB sobre la proliferación de células MCF-7. Se crecieron células MCF-7 en placas de 96 pocillos como se describe en la Figura 4 para las células MDA-231. Las células MCF-7 se trataron durante 48 horas con o sin 20 (EGb-20) o 200 (EGb-200) \mug/ml de EGB 761®, o 2 (GKB-2) o 20 (GKB-20) \mug/ml de GKB. 4 horas antes del final de la incubación, se añadió bromodesoxiuridina (BrdU) a cada pocillo. Se midió la incorporación de BrdU a 450 nm (referencia = 700 nm). Los puntos de los datos representan la media \pm DE de dos experimentos independientes llevados a cabo por cuadruplicado. El análisis de una vía ANOVA indica que la proliferación de las células MCF-7 estaba alterada en un menor grado que la proliferación de las células MDA-231 por el tratamiento con EGB 761® o GKB (P<0,0001).

Fig. 8. Efecto del EGB 761® sobre la producción de radicales libres de células MDA-231. Células MDA-231 se trataron durante 48 horas con 2 (EGb-2), 20 (EGb-20) o 200 (EGb-200) \mug/ml de EGB 761®. A continuación las células se lavaron y se midieron los niveles de estrés oxidativo celular usando la sonda de fluorescencia DCF como se describe en Materiales y procedimientos. Los resultados mostrados son las medias \pm DE (n = 4). El análisis estadístico indica que el efecto del EGB 761® no fue significativo.

Fig. 9. La respuesta transcripcional al EGB 761® sugiere un efecto sobre los genes involucrados en la proliferación celular. Los resultados mostrados representan un análisis cuantitativo del biochip de expresión de ADNc humano Atlas que contiene 588 fragmentos de ADNc amplificados por PCR (Clontech Inc.). Se obtuvo el ARNm de las células MDA-231 tratadas con el control o el EGB 761® (20 \mug/ml), durante 48 h. Para normalizar la abundancia de ARNm, los valores densitométricos obtenidos del análisis de la imagen se normalizaron usando los genes de control endógeno proporcionados en el biochip. Sólo se consideraron cambios significativos consistentes por encima del 30%.

Fig. 10. Crecimiento de xenoinjertos de MDA-231 en ratones desnudos después de cualquiera de los tratamientos con EGB 761® o GKB. Los animales se trataron oralmente con 50 mg/kg de EGB 761® o ip con 1 mg/kg de GKB una vez al día durante un mes partiendo de un volumen de 100-150 mm^{3} de tumores de MDA-231. Al final del tratamiento los animales se mantuvieron durante 30 días más y a continuación los animales se sacrificaron el día 60. Los datos mostrados son la media \pm MES (n = 10). El análisis estadístico indica que los efectos del EGB 761® y el GKB fueron significativos comparados con sus respectivos controles (p<0,05).

Figs. 11. A, B, C, D, E, F, G, H. Expresión del PBR en xenoinjertos de MDA-231 en animales de control y tratados con EGB 761® o GKB. Secciones embebidas en formalina de xenoinjertos de MDA-231 se tiñeron inmunológicamente con un antisuero anti-PBR a una dilución 1:500 como se describe en la sección de Materiales y procedimientos. Se obtuvieron tumores MDA-231 de animales tratados con el vehículo (A-D), 50 mg/kg de EGB 761® per os (E, G), o 1 mg/kg de GKB ip (F, H). A muestra las células encontradas en medio de un tumor obtenido de animales tratados con vehículo en el que se puede ver fácilmente la localización nuclear de la proteína PBR (véanse las puntas de flecha). B muestra la inmunotinción vista en células ubicadas en el borde del tumor obtenido de animales tratados con vehículo. E muestra la inmunotinción del PBR en células encontradas en medio del tumor obtenido de animales tratados con EGB 761®. F muestra la inmunotinción del PBR en células encontradas en medio del tumor obtenido de animales tratados con GKB. G muestra la inmunotinción del PBR en células encontradas en el borde del tumor obtenido de animales tratados con EGB 761®. H muestra la inmunotinción del PBR en células encontradas en medio del tumor obtenido de animales tratados con GKB. Las puntas de flecha indican los núcleos. El aumento es de x75 para A, B, C, E, F, G, y H y de x150 para C.

Descripción detallada

El término "terpenoide ginkgo" incluye todos los terpenos de origen natural que proceden del árbol gimnosperma Ginkgo biloba así como los terpenoides ginkgo producidos sintéticamente y los derivados farmacéuticamente activos y sus sales y sus mezclas. Ejemplos de terpenoides ginkgo incluyen ginkgólidos. Ejemplos de terpenoides ginkgo se describen en Ginkgolides, Chemistry, Biology, Pharmacology, and Clinical Perspectives, J.R. Provs. Science Publishers, editado por P. Braguet (1988); F.V. DeFeudis, Ginkgo Biloba Extract (EGB 761®); Pharmacological Activities and Clinical Applications, Elsevier, capítulo II (1991).

El término "ginkgólido" como se usa en el presente documento incluye los diversos ginkgólidos descritos en los libros citados anteriormente así como sus derivados no tóxicos farmacéuticamente activos. Ejemplos de derivados de ginkgólido incluyen tetrahidroderivados, derivados de acetilo, y alquilésteres tales como los derivados de monoacetato y derivados de triacetato descritos en Okabe, y col., J. Chem. Soc. (c), pp. 2201-2206 (1967). El ginkgólido B tiene la siguiente estructura y como se usa en el presente documento, se refiere al ginkgólido B aislado:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

El término "extracto de Ginkgo biloba" como se usa en el presente documento incluye una colección de moléculas naturales, incluyendo terpenoides, derivadas de las hojas del árbol Ginkgo biloba. Preferentemente, el extracto es la formulación específica del extracto de Ginkgo biloba conocido como EGB 761®.

El término "combatir" como se usa en el presente documento significa prevenir, inhibir y/o reducir cualquier cosa sobre la que actúe la palabra "combatir", por ejemplo, combatir la proliferación celular del cáncer significa que se previene o se inhibe a las células cancerígenas de proliferar adicionalmente y/o se reduce el grado o la velocidad de proliferación.

El nivel de expresión del PBR, para los propósitos de diagnosis o prognosis de un cáncer o tumor, se puede detectar a diversos niveles. Usando la metodología habitual muy conocida en la técnica, se pueden diseñar ensayos para la detección y cuantificación del ARN del PBR, e incluyen ensayos de hibridación Northern, ensayos de hibridación in situ, y ensayos de PCR, entre otros. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fitsch y Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982) o DNA Cloning, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985), o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. y col. (Eds), Wiley & Sons, Inc. para la descripción general de procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos. Las sondas de polinucleótidos para la detección de ARN del PBR se pueden diseñar a partir de la secuencia disponible en el número de acceso L21950 para la secuencia del PBR humano (Riond, J. y col. (1991) Eur. J. Biochem. 195:305-311; Chang, Y. J. y col. (1992) DNA and Cell Biol. 11:471-480). También se conoce la secuencia del PBR de otras fuentes tales como ganado bovino (Parola, A. L. y col. (1991) J. Biol. Chem 266:14082-14087) y ratón (Garnier, M. y col. (1994) Mol Phar. 45:201-211).

La secuencia completa del PBR, normal o mutante, se puede usar en una sonda para detectar la expresión de ARN. Alternativamente, se puede usar una porción o porciones de la secuencia. Los procedimientos para el diseño de sondas son conocidos en la técnica. Las secuencias de polinucleótidos preferentemente son homólogas o complementarias a una región del gen del PBR, preferentemente, la secuencia de la región de la cual procede el polinucleótido es homóloga o complementaria a una secuencia que es única para el gen del PBR. Se puede determinar si una secuencia es única o no para el gen del PBR mediante técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia se puede comparar a secuencias en bancos de datos, por ejemplo, GenBank. Las regiones de las cuales pueden proceder secuencias de ADN típicas incluyen, pero no están limitadas a, por ejemplo, regiones que codifican epítopos específicos, así como regiones no transcritas y/o no traducidas.

Los ligandos del PBR o los anticuerpos anti-PBR, o fragmentos de ligando y anticuerpos capaces de detectar el PBR, se pueden marcar usando cualquiera de una variedad de marcadores y procedimientos de marcado para uso en la diagnosis y prognosis de una enfermedad, tal como cáncer de mama, particularmente para ensayos tales como Tomografía de emisión de positrones (TEP) y obtención de imágenes por resonancia magnética (Leong, D. y col. (1996) Alcohol Clin. Exp. Res. 20: 601-605). Ejemplos de tipos de marcadores que se pueden usar en la invención incluyen, pero no están limitados a, marcadores enzimáticos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos no radiactivos y marcadores quimioluminiscentes.

Ejemplos de marcadores enzimáticos adecuados incluyen la malato deshidrogenasa, estafilococo nucleasa, \delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, \alpha-glicerolfosfato deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparraginasa, glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa, acetilcolina esterasa, etc.

Ejemplos de marcadores radioisotópicos adecuados incluyen ^{3}H, ^{111}In, ^{125}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{57}To, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{75}Se, ^{152}Eu, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{21}Ci, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{47}Sc, ^{109}Pd, ^{11}C, ^{19}F, ^{123}I, etc.

Ejemplos de marcadores isotópicos no radiactivos adecuados incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Tr, ^{46}Fe, etc.

Ejemplos de marcadores fluorescentes adecuados incluyen el marcador de ^{152}Eu, un marcador de fluoresceína, un marcador de isotiocianato, un marcador de rodamina, un marcador de ficoeritrina, un marcador de ficocianina, un marcador de aloficocianina, un marcador de fluorescamina, etc.

Ejemplos de marcadores quimioluminiscentes incluyen un marcador luminal, un marcador isoluminal, un marcador éster de acridinio aromático, un marcador imidazol, un marcador sal de acridinio, un marcador éster de oxalato, un marcador luciferina, un marcador luciferasa, etc.

En el presente documento los autores examinaron el efecto de los extractos de Ginkgo biloba, más específicamente el EGB 761® y el GKB sobre la expresión del PBR y la proliferación celular, particularmente en células de cáncer de mama humano. Los autores usaron la línea celular muy agresiva MDA-231, que expresa niveles de unión del ligando del PBR y de ARNm más de 60 veces superior en relación a la línea celular no agresiva MCF-7. El EGB 761® y el GKB reducen la expresión del PBR y la proliferación celular en células MDA-231 de forma dependiente con el tiempo y la dosis mientras que el EGB 761® y el GKB no afectan a la proliferación celular de MCF-7 en el mismo grado. Este efecto era reversible y no era debido a las propiedades antioxidantes de los compuestos probados.

La determinación de niveles elevados de PBR se realiza en relación a la muestra sin tumor detectable. Ésta puede proceder del mismo paciente o de un paciente diferente. Por ejemplo, se puede recoger una primera muestra inmediatamente después de la extracción quirúrgica de un tumor sólido. Se pueden tomar muestras posteriores para controlar la recurrencia del crecimiento tumoral y/o la proliferación celular del tumor. Adicionalmente, otros escenarios pueden incluir células de fenotipo agresivo variable de manera que se pueda acceder al aumento o reducción en un fenotipo agresivo.

La diferente localización subcelular del PBR en el citoplasma de células epiteliales de conductos mamarios normales y la ausencia de tinción en el núcleo y el área perinuclear de las células tumorales agresivas proporciona un procedimiento simple para el diagnóstico del fenotipo agresivo de una célula tumoral. La inmunotinción usando un ligando del PBR marcado o un anticuerpo para PBR marcado o un fragmento de ligando o anticuerpo capaz de unirse al PBR y la determinación de la localización subcelular del PBR en las muestras celulares proporciona otro ensayo diagnóstico más de la presente invención. Además, también se puede usar antisuero que reconoce el PBR junto con un anticuerpo secundario reactivo al anticuerpo primario. Los ensayos de inmunotinción son muy conocidos en la técnica, y se describen adicionalmente en los Ejemplos a continuación con respecto a las células y biopsias de cáncer de mama.

Se determina un incremento en el nivel del PBR cuando el nivel del PBR en una célula tumoral es 2-3 veces el nivel del PBR en la célula normal, hasta 10-100 veces aproximadamente la cantidad de PBR en una célula
normal.

Cultivo celular y tratamientos. Se obtuvieron líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7 y MDA-231) del Lombardi Cancer Center, Georgetown University Medical Center. Las líneas celulares se cultivaron en placas de cultivo de poliestireno (Coming) y se crecieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con el 10% de suero fetal bovino (FBS). Se usó la forma inyectable (IPS200) del extracto de Ginkgo biloba estandarizado EGB 761®. Esta forma inyectable está desprovista de protocianidinas, que se sabe que interaccionan con proteínas in vitro (Defeuder, 1998 Ullstein Medical). La forma inyectable del EGB 761® y el GKB (BN 52021) aislado del EGB 761® fue proporcionada por el Henri Beaufour-IPSEN (Paris, Francia).

Ensayos de unión del radioligando. Se rasparon células de placas de cultivo de 150 mm en 5 ml de tampón fosfato salino (PBS), se dispersaron por trituración, y se centrifugaron a 500 g durante 15 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS y se sometieron a ensayo para la concentración de proteínas. Se llevaron a cabo estudios de unión de [^{3}H]PK 11195 sobre 50 \mug de proteína procedente de suspensiones celulares como se ha descrito previamente (Papadopoulos, V. y col., 1990, J. Biol. Chem. 265: 3772-3779; Hardwick, M. y col., 1999, Cancer Research, 59: 631-632). [N-metil-^{3}H]PK 11195 (1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metil-propil)-3-isoquinolinecarboxamida; sp. Act. Se obtuvieron 83,50 (Ci/mmol), de Du Pont-New England Nuclear (Wilmington, DE) y se obtuvo PK 11195 de Research Biochemicals Incorporated (Natick, MA). Las representaciones de Scatchard se analizaron mediante el programa LIGAND (Munson, PJ, y Robbard, D. 1980, Anal. Biochem., 107: 220-239) (BIOSOFT, Ferguson,
MO).

Medición de la proteína. Los niveles de proteínas se midieron mediante el método de Bradford (Bradford, MM, 1976, Anal. Biochem., 72: 248-254) usando el kit Protein Assay de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con seroalbúmina bovina como patrón.

Análisis de ARN (Northern). Se examinó la expresión del ARNm del PBR en células MDA-231 tratadas con los diversos compuestos mediante el análisis de transferencia Northern Blot como se ha descrito previamente (Hardwick, M., y col., 1999, Cancer Research, 59: 831-842). Resumiendo, se aisló el ARN celular total usando el reactivo RNAzol B (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX) y cloroformo. 20 \mug del ARN total de cada línea celular se corrieron sobre geles de agarosa al 1% y se transfirieron durante toda la noche a membranas de nailon (S&S Nytran, Schleicher & Schuell, Keene, NH) (21). Un fragmento de ADNc del PBR humano (hPBR) de 0,2 kb (procedente del vector plásmido pCMV5-PBR que contiene el hPBR de longitud completa amablemente cedido por el Dr. Jerome Strauss, University of Pennsylvania, PA) se radiomarcó con [\alpha-^{32}P]dCTP usando un sistema de marcaje de ADN con cebadores aleatorios (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las condiciones de hibridación fueron como se ha descrito previamente (Hardwick, M., y col., 1999, Cancer Research, 59: 831-842). Se realizó la autorradiografía exponiendo las transferencias a una película X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY) a -70ºC durante 4-48 h. La cuantificación del ARNm del PBR se llevó a cabo usando el software SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafael,
CA).

Biochips de ácidos nucleicos. Nosotros los autores usaron el biochip de expresión de ADNc humano Atlas I de Clontech (Palo Alto, CA). Este biochip contiene 588 fragmentos de ADNc amplificados por PCR de 200-500 pb de longitud inmovilizados sobre una membrana de nailon cargada positivamente. Células MDA-231 se trataron con y sin 20 \mug/ml de EGB 761® durante 48 horas. Se aisló ARN poli A+ del control y de las células tratadas con EGB 761®. Se generaron sondas de ADNc marcadas con ^{32}P a partir de cada ARN poli A+ y se hibridaron al biochip Atlas según las recomendaciones del fabricante. La autorradiografía se realizó exponiendo las transferencias a una película X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY) a -70ºC durante 4-96 h. La cuantificación de la hibridación observada se llevó a cabo usando el software SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Se usaron múltiples exposiciones para detectar genes expresados a bajos niveles. Se usaron los tres controles internos, ubiquitina, G3PDH y \beta-actina para comparar los niveles de expresión relativos de los productos génicos detectados en el control y en las células tratadas con EGB 761®. Se corrigieron las variaciones experimentales usando las relaciones de expresión génica frente a los controles internos. El efecto del tratamiento con EGB 761® sobre cada producto génico se expresa como % de células control (sin tratar). Los resultados presentados en el presente documento muestran genes afectados consistentemente, a un nivel por encima del 30% del control, por el tratamiento con el EGB 761®.

Ensayos de proliferación de células con BrdU. Células MDA-231 se pusieron en placas de 96 pocillos (Coming, Coming, NJ) a una concentración de aproximadamente 10.000 células/pocillo (24 horas de incubación) o aproximadamente 5000 células/pocillo (48 horas de incubación) en DMEM suplementado con FBS al 0,1%. A continuación las células se incubaron con FBS al 10% de con diferentes concentraciones de EGB 761® o GKB durante los períodos de tiempo indicados. Se analizaron las diferencias en la proliferación celular midiendo la cantidad de incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) determinada mediante el ELISA de BrdU (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). La incorporación de BrdU se midió a 450 nm (referencia a 690 nm).

Análisis del estrés oxidativo. Los niveles de estrés oxidativo celular se midieron usando la sonda fluorescente diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (2,7-DCF; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) como se describe en Goodman, Y. y Mattson, M.P., Exp. Neurol., 128: 1-12, 1994. Resumiendo, se cultivaron células en placas de 96 pocillos y se trataron durante 48 horas con las concentraciones indicadas de EGB 761®. Al final del tratamiento las células se lavaron y se incubaron en presencia de 2,7-DCF 50 \muM en PBS. A continuación se cuantificó la fluorescencia usando el fluorómetro de detección cuantitativa Victor^{2} (EGG-Wallac, Inc., Gaithersburg, MD).

Evaluación biológica in vivo . Se usó el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama humano (insensible a estrógenos) de MDA-231 para la selección in vivo del EGB 761® y el GKB. Basándose en los datos in vitro y los datos in vivo (23) publicados previamente las dosis usadas fueron de 50 mg/kg para el EGB 761® y de 1 mg/kg para el GKB. Ratones desnudos atímicos hembra (NCl/Charles River, Frederick, MD) fueron inyectados subcutáneamente con 8 x 10^{6} células tumorales MDA-231 y se dejaron formar los tumores hasta un volumen de 100 a 150 mm^{3}. En ese momento, grupos de 10 animales por compuesto fueron inyectados tanto oralmente para el EGB 761® como intraperitonealmente para el GKB una vez al día durante un mes. Dos veces a la semana se registró el tamaño de los tumores y los pesos corporales de todos los animales durante los 30 días de tratamiento, así como durante los 30 días posteriores al final del tratamiento. En ese momento los animales se sacrificaron y los tumores se extrajeron y se procesaron por inmunohistoquímica. El cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales.

Inmunocitoquímica de tumores MDA-231. Tumores MDA-231 extraídos de los ratones tratados con o sin el EGB 761® o el GKB se fijaron en el 10% de formalina tamponada. Los tumores se seccionaron y a continuación se pusieron en portas de vidrio y se procesaron como se ha descrito previamente (19). Para la inmunohistoquímica con anticuerpos primarios anti-PBR, las secciones tisulares se trataron con una mezcla de H_{2}O_{2} al 30%/metanol (relación 1:9) durante 5 min a temperatura ambiente para neutralizar la actividad peroxidasa endógena y a continuación se lavó bien con PBS. Se añadió el anticuerpo primario en suero de ternero con PBS al 10% a secciones a una concentración de 1:500 a temperatura ambiente durante 1 h. Las reacciones con el anticuerpo secundario se realizaron usando anticuerpo secundario de cabra anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano diluido a 1:500 en PBS suplementado con el 10% de suero de ternero. Después de lavar los portas 3 veces en PBS durante 2 minutos cada uno, se añadió H_{2}O_{2} fresco diluido 1:1000 con 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y los portas se incubaron durante 1 h a 37ºC. A continuación los portas se enjuagaron en H_{2}O destilada antes de montarlos con Crystal/Mount.

Análisis estadístico. Se llevó a cabo la comparación de múltiples medios con el análisis de la varianza de una vía de InStat (ANOVA) (GraphPad Inc., San Diego, CA). Todas las estadísticas F y los valores de P para los ANOVA de una vía se proporcionan en el texto. La comparación de los tratamientos farmacológicos individuales a los tratamientos control se realizó con pruebas t desparejadas. Todos los valores de p para las pruebas t se proporcionan en el
texto.

Resultados

El EGB 761® y el GKB reducen la capacidad de unión del ligando del PBR de las células de cáncer de mama humano MDA-231. La Figura 1 muestra que concentraciones crecientes de la forma inyectable del EGB 761® inhiben de forma dependiente con el tiempo la capacidad de unión del ligando del PBR (Bmax), determinada usando isotermas de saturación con el ligando radiomarcado PK 11195 seguido del análisis de Scatchard de los datos. Se obtuvieron resultados similares usando el GKB aislado (Figura 2). De forma interesante, el EGB 761® y el GKB redujeron los niveles del PBR un 66% de los valores control. No se pudieron observar efectos significativos sobre la afinidad del receptor (K_{d}) (5,8 \pm 1,4 pmol/mg de proteína, n = 12).

El EGB 761® y el GKB reducen la expresión del ARNm del PBR en células de cáncer de mama humano MDA-231. Se llevó a cabo el análisis de transferencia de ARN (Northern) para determinar si las diferencias observadas en la unión del ligando del PBR entre el control y las células tratadas con EGB 761® o GKB reflejan un efecto sobre la expresión del ARNm del PBR. Como se muestra en la Figura 3, ambos EGB 761® y GKB redujeron los niveles de ARNm del PBR. Este resultado se ajusta con los resultados presentados anteriormente sobre la expresión de la unión del ligando del PBR.

El EGB 761® y el GKB inhiben la proliferación de células MDA-231. Usando el ELISA de proliferación celular con bromodeoxiuridina (BrdU) (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN), los autores examinaron el efecto de concentraciones crecientes de EGB 761® sobre la proliferación de células MDA-231. La Figura 4 muestra que el EGB 761® inhibe la proliferación de células MDA-231 de forma dependiente de la concentración y el tiempo. Este efecto del EGB 761® fue reversible, incluso para la concentración de EGB 761® más alta usada (Figura 5). La incubación de células MDA-231 durante 48 horas con EGB 761®, seguido del lavado y la incubación durante otras 48 horas con medio exento de EGB 761®, dio como resultado la recuperación de la actividad proliferativa de las MDA-231. El incremento de las concentraciones de GKB también inhibe la proliferación celular de MDA-231 después de 48 horas de tratamiento (Figura 6).

El EGB 761® y el GKB no tienen el mismo nivel de inhibición frente a la proliferación de células MCF-7 que tienen frente a la proliferación de células MDA-231. Comparadas con las células MDA-231, las células MCF-7 no agresivas contienen niveles de PBR extremadamente bajos (<60 veces), determinados tanto por estudios de unión del ligando y análisis del ARNm, los autores examinaron si el EGB 761® y el GKB afectan a la velocidad de proliferación de células MCF-7 en el mismo grado que afectan a la velocidad de proliferación de células MDA-231. La Figura 7 muestra claramente que ni el EGB 761® ni el GKB afectan a la proliferación de células MCF-7 en el mismo grado que afectan a la proliferación de células MDA-231.

El EGB 761® no afecta a los niveles de radicales libres de MDA-231. Recientes estudios in vivo e in vitro han demostrado que los constituyentes terpeno del EGB 761®, incluyendo el GKB, tienen propiedades antioxidantes. Para determinar si el efecto antiproliferativo del EGB 761® era debido a sus propiedades antioxidantes, determinamos los niveles de radicales libres en células MDA-231 tratadas con y sin concentraciones crecientes de EGB 761® (Figura 8). Aunque se puede observar un descenso del 20% en los niveles de radicales libres, este efecto no fue estadísticamente significativo ni dependiente de la dosis, que indica que el efecto observado no era debido a un descenso de los radicales libres en las células inducido por el EGB 761®.

El EGB 761® regula el programa transcripcional de MDA-231 relacionado con la proliferación celular. Los resultados presentados anteriormente indican que el EGB 761® y el GKB inhiben la expresión del PBR y la proliferación celular en células de cáncer de mama MDA-231 muy agresivas y ricas en PBR. Las células MCF-7 no agresivas, que contienen niveles de PBR extremadamente bajos, no respondieron al tratamiento con EGB 761® en el mismo grado que las células de cáncer de mama MDA-231. Para determinar si el efecto del EGB 761® (20 \mug/ml durante 48 horas) sobre células MDA-231 era específico para el PBR o si otros genes involucrados en la proliferación celular estaban afectados por el tratamiento, los autores usaron un biochip de ADNc que representa 588 genes humanos distintos. Como se indica en Materiales y procedimientos, las variaciones experimentales se corrigieron usando las relaciones de expresión génica frente a los controles internos. El efecto del tratamiento con EGB 761® sobre cada producto génico se expresa en forma de % de las células control (sin tratar). En la Figura 9 y en la Tabla I sólo se presentan cambios consistentes por encima del 30% de los valores control.

Evaluación biológica del efecto del EGB 761® y el GKB in vivo . Para valorar el efecto del EGB 761® y el GKB sobre la proliferación de células tumorales y la expresión del PBR en un escenario in vivo los autores usaron el modelo de implante de xenoinjerto de almohadilla adiposa mamaria (véase, Medina, D., J. Mamm. Gland. Biol. Neopl. 1:5-19, 1996). La Figura 10 muestra que el tratamiento de 30 días con 50 mg/kg de EGB 761® o con 1 mg/kg de GKB dio como resultado un descenso en un 35% (p = 0,037) y un 32% (p = 0,043) en el tamaño del tumor, medido un mes después del final del tratamiento, respectivamente. Estos tratamientos no afectaron al peso corporal del animal (datos no mostrados). Considerando estos datos in vitro sobre el efecto del EGB 761® y el GKB sobre la expresión del PBR en células MDA-231, los autores examinaron si el EGB 761® y el GKB también reducen la expresión del PBR en xenoinjertos de MDA-231. La Figura 11 (A-D) muestra la tinción con peroxidasa de rábano (HRP) del antisuero de PBR usado para detectar la proteína de peso molecular 18.000 en xenoinjertos de MDA-231 en animales tratados con vehículo. Se omitió la contratinción con hematoxilina para distinguir la localización nuclear del PBR (19) en los tumores. La Figura 11A muestra el medio de un tumor en el que se puede observar fácilmente la localización nuclear de la proteína PBR de 18.000 (véanse las puntas de flecha). La Figura 11B muestra la inmunotinción observada en el borde del tumor obtenido de animales tratados con vehículo. En la Figura 11C se muestra un mayor aumento de la inmunotinción observada en el borde del tumor obtenido de animales tratados con vehículo, y en la Figura 11D se muestra un control tratado con antisuero no específico. El tratamiento con EGB 761® (Fig. 11E) o GKB (Fig. 11 F) redujo la expresión del PBR nuclear presente en células encontradas en el medio del tumor. De forma interesante, el tratamiento con EGB 761® (Fig. 11G) o GKB (Fig. 11 H) también eliminó la expresión del PBR nuclear presente en las células en el borde de los tumores. No obstante, en el último caso se pudo observar la inmunotinción citosólica (Figuras 11G y H). Estos datos se reprodujeron en secciones tomadas de xenoinjertos crecidos en tres animales
distintos.

Es interesante indicar que incluso en presencia de concentraciones elevadas de EGB 761® o GKB, los niveles de PBR y las velocidades de proliferación celular no se pudieron reducir por debajo del 30% de los valores normales. Esto sugiere que hay un mínimo de PBR necesario para mantener la integridad de la membrana y la función celular. También se debe indicar que incluso a las concentraciones más elevadas usadas, ni el EGB 761® ni el GKB fueron tóxicos para las células, debido a que la proliferación celular se recuperó tras la eliminación de los compuestos. Estos datos sugieren que estos compuestos son citostáticos y no citotóxicos. Ensayos de citotoxicidad adicionales indicaron que bajo las mismas condiciones ni el EGB 761® ni el GKB indujeron ninguna muerte celular
significativa.

La ausencia de alguna reducción significativa en la cantidad de especies de oxígeno reactivas producidas en las células MDA-231 por el EGB 761® o el GKB sugiere que sus propiedades antioxidantes no eran responsables de la reducción en la expresión del PBR y la proliferación celular en las células MDA-231. Estos resultados indican que estos compuestos pueden regular la transcripción del gen PBR directa o indirectamente.

El hallazgo de que el EGB 761® y el GKB reducen la expresión del PBR y la proliferación celular en células MDA-231 muy agresivas que expresan PBR nuclear, pero que no afectan a células MCF-7 no agresivas, que tienen niveles de PCR extremadamente bajos y están desprovistas de PBR nuclear, hasta el mismo grado que hicieron para células MDA-231, proporciona un apoyo adicional a la hipótesis de que la presencia de PBR puede ser un factor determinante para el fenotipo agresivo de células tumorales de mama. Además, esta observación demuestra adicionalmente la especificidad del efecto del EGB 761® y el GKB sobre la regulación de la expresión del PBR. Este último hallazgo nos planteó dos cuestiones claves surgidas del estudio actual: ¿la expresión de otros genes está regulada por el EGB 761®? ¿Hay un programa transcripcional activado o inhibido por el EGB 761®, en el que el PBR está en el origen o es una parte de una serie de sucesos, responsable de alterar la velocidad de proliferación de las células MDA-231? Para abordar estas cuestiones, utilizamos el biochip de expresión de ADNc humano Atlas. Como se indica en la Tabla I, el tratamiento de células MDA-231 con el extracto EGB 761® indujo alteraciones en la expresión transcripcional de 36 de los 588 genes examinados. De forma poco sorprendente, la inmensa mayoría de los genes afectados están muy ligados a la proliferación celular, a la diferenciación, o a la apoptosis. Quizás el efecto más revelador que tiene el EGB 761® sobre la línea celular MDA-231 es la regulación reduciendo la expresión del antígeno nuclear de células en proliferación p120. El p120 se usa como indicador pronóstico en pacientes con cáncer de mama y adenocarcinomas prostáticos (Perlaky, L., y col., Cancer Res., 52: 428-436, 1992; Zhuang, S.H. y col., Endocrinology, 139: 1197-1207, 1998). Más importante aún, no obstante, es que el p120 es un marcador inmunocitoquímico de células proliferativas. La reducción de este marcador de proliferación en un 68% confirma así nuestros datos que demuestran que el EGB 761® inhibe la proliferación celular de MDA-231.

Usando un biochip de expresión de ADNc humano los autores examinaron el efecto del tratamiento con EGB 761® sobre la expresión de 588 genes en células MDA-231. Los autores encontraron que el tratamiento incrementó la expresión del protooncogen c-Myc y redujo la expresión de 35 productos génicos, incluyendo los oncogenes (AP-1, PE-1, RhoA, n-Myc), los reguladores del ciclo celular (CDK2, p55CDC, PCNA p120), los moduladores de la transducción de señales (NET1, ERK2), los productos relacionados con la apoptosis (SGP-2, NIP1), los receptores (A2A, RXR-\beta, Grb2), los factores de transcripción (ld-2, ATF-4, ETR-101, ETR-103), los factores de crecimiento (HB-EGF, de tipo HGF), y las moléculas de adhesión celular (CD19, L1CAM, integrinas \alpha3, \alpha4, \alpha6, \beta5. Mac-1, \beta-catenina) que están directamente involucrados en diversas vías que regulan la proliferación celular. Considerando que los compuestos probados sólo eran eficaces sobre las células MDA-231, que expresan niveles elevados de PBR, estos datos sugieren que la expresión de PBR nuclear puede ser un factor determinante para que una célula tumoral adquiera un fenotipo agresivo e invasivo.

TABLA I Efecto del EGB 761® sobre la expresión de genes en células MDA-231 examinados usando el biochip de expresión de ADNc humano Atlas como se describe en la sección de Materiales y procedimientos

2

3

4

5

6

7

8

Se encontró que dos miembros de la familia de factores de transcripción Myc, c-Myc y n-Myc, estaban muy alterados en este experimento. La expresión del protooncogen c-Myc se incrementó un 75% mientras que la expresión del n-Myc se redujo un 74%. Estos dos genes están sobre-expresados en varios tipos de cáncer (Kim, C.J., y col., Virchows Arch., 434: 301-305, 1999; Dang, C.V., Mol. Cel. Biol., 19: 1-11, 1999) y están muy correlacionados con la proliferación celular tumoral. Estudios previos han demostrado que la detención del crecimiento celular de neuroblastoma mediante el inhibidor tirosina quinasa genisteína está acompañada por la regulación reduciendo la expresión de n-Myc. Este dato se ajusta extremadamente bien con nuestros datos de la proliferación celular y del n-Myc. No obstante, la sobre-expresión de c-Myc, está asociada a una estimulación de la proliferación celular en condiciones de suero normal. La sobre-expresión de c-Myc induce la muerte celular en ausencia de suero u otros factores de supervivencia. Tomados juntos los datos implican que la desregulación de la expresión c-Myc también requiere la expresión alterada de otros genes.

En su experimento con el biochip, los autores descubrieron la expresión desregulada de diversos otros genes relacionados con c-Myc. Uno de esos genes, la protimosina \alpha (proT \alpha), es inducido por c-Myc. No obstante, la expresión de proT \alpha se reduce un 79% en lugar de incrementarse, como se podría predecir por la regulación aumentando su expresión de c-Myc. Además, la expresión de otros genes diana c-Myc tales como cdc25A, ciclina A, y ciclina E no se ve afectada por el tratamiento de células MDA-231 con EGB 761®, que sugiere un cortocircuito específico de tratamiento o específico de la línea celular en la transcripción génica regulada por c-Myc. Otros datos recopilados del experimento con el biochip apoyan adicionalmente esta hipótesis. La regulación transcripcional de c-Myc está bajo el control del APC y la \beta-catenina. No obstante, estos dos genes están regulados reduciendo su expresión por el EGB 761® en células MDA-231 (59 y 58%, respectivamente) mientras que el c-Myc está regulado aumentando su expresión. Aunque algunos de estos datos parecen ser contradictorios, muchos de los datos publicados sobre el papel del c-Myc en la proliferación, diferenciación, y muerte celular también parecen contradictorios.

Similar a la regulación alterada del c-Myc y de las proteínas relacionadas con Myc por el EGB 761®, el experimento con el biochip expuso la interrupción de varias moléculas señalizadoras. El tratamiento con el EGB 761® dio como resultado una reducción del 93% en la expresión de RhoA, un gen que codifica la proteína de unión a GTP involucrada en numerosos fenómenos celulares, y una reducción del 55% en la expresión de NET1, un factor de intercambio de guanina específico de RhoA. De manera interesante, se ha demostrado que RhoA regula la actividad ciclina E/Cdk2 en fibroblastos. La activación del complejo ciclina E/Cdk2 es crucial para la progresión del ciclo celular de fase G1 a fase S. La regulación de la actividad ciclina E/Cdk2 también se ha demostrado para c-Myc. Aunque la importancia de estos dos fenómenos no es inmediatamente obvia, se debe indicar que la expresión de Cdk2 se reduce un 83% por el EGB 761®.

Otras moléculas señalizadoras importantes también están reguladas reduciendo su expresión por el EGB 761®. La expresión de la molécula adaptadora Grb2 se reduce un 70%. La Grb2 desempeña un papel importante en la señalización celular uniendo físicamente transductores de señales tales como tirosina quinasas receptoras a la vía Ras/MAPK. Con respecto a la vía MAPK, la expresión del miembro ERK2 de la familia MAP/ERK está regulado reduciendo su expresión un 46% y la expresión del factor de transcripción c-Jun se reduce un 78%. De manera interesante, se ha informado de que el EGB 761® es un supresor del factor de transcripción AP-1 estimulado por ésteres de forbol. Estos datos implican que los efectos del EGB 761® sobre la proliferación celular MDA-231 están acompañados por una amplia reducción en los ARNm con relaciones funcionales entre sí.

Otro hallazgo interesante del experimento con el biochip es la expresión reducida de varias integrinas. Las integrinas son una gran familia de receptores de adhesión célula-célula y célula-matriz extracelular que están compuestas de dos subunidades de glicoproteína transmembrana, una subunidad \alpha y una subunidad \beta. Todas las integrinas representadas en la Tabla I están involucradas de alguna forma en la regulación de la proliferación celular. Por ejemplo, la integrina \alphaM es parte del receptor elastasa. El ONO-5046, un inhibidor elastasa, suprime la proliferación de células BALB/c3T3 transformadas por el virus del polioma y del virus del sarcoma de Kirsten y de las células de carcinoma pancreático Capan-1. Además, la integrina \alpha4 se ha implicado en la acumulación de metástasis distal en modelos celulares de melanoma, sarcoma, y linfoma. Es importante enfatizar que las integrinas funcionan como heterodímeros de una subunidad \alpha y una subunidad \beta. La expresión reducida de cualquiera de las subunidades \alpha o \beta es claramente importante en la regulación de la función del receptor integrina.

La expresión de algunos genes de factores de crecimiento claves, tales como el factor de crecimiento similar a hepatocitos y el factor de crecimiento similar al EGF, también se redujo mediante el EGB 761®. Es posible que la inhibición de la proliferación celular inducida por el EGB 761® se pueda deber a la expresión reducida de estos factores de crecimiento que pueden actuar como reguladores autocrinos del crecimiento celular.

El EGB 761® y el GKB están pensados para ser suministrados a un paciente receptor en una cantidad suficiente para combatir el cáncer en dicho paciente o en una cantidad suficiente para afectar la expresión (negativa o positivamente) de los productos génicos listados en la Tabla 1, anteriormente. Se dice que una cantidad es suficiente para combatir el cáncer si la dosificación, vía de administración, etc. del EGB 761® y el GKB son suficientes para influir esa
respuesta.

Se dice que una composición es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. Se dice que un agente se administra en una "cantidad terapéuticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología del paciente receptor.

El EGB 761® y el GKB se pueden formular según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que estos materiales, o sus derivados funcionales se combinan opcionalmente en mezcla con un vehículo portador farmacéutico aceptable. Los vehículos adecuados y su formulación, inclusiva de otras proteínas humanas, por ejemplo, seroalbúmina humana, se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (16ª ED., Osol, A. ed., Mack Easton PA. (1980)). Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para una administración eficaz, esas composiciones contendrán una cantidad eficaz de los compuestos descritos anteriormente junto con una cantidad adecuada de vehículo portador.

Se pueden emplear procedimientos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Se pueden conseguir preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para complejar o absorber los compuestos. La liberación controlada se puede ejercer seleccionando macromoléculas apropiadas (por ejemplo poliésteres, poliaminoácidos, polivinilo, pirrolidona, etilenvinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sulfato de protamina) y la concentración de las macromoléculas así como el procedimiento de incorporación para controlar la liberación. Otro posible procedimiento para controlar la duración de la acción mediante preparaciones de liberación controlada es incorporar los compuestos de la presente invención a partículas de un material polimérico tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de etilenvinilacetato. Alternativamente, en lugar de incorporar estos agentes a partículas poliméricas, es posible atrapar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, o en sistemas de administración de fármacos coloidales, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas o en macroemulsiones. Esas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

El EGB 761® y el GKB aislado se pueden administrar por vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, o implante), nasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica y se pueden formular con vehículos farmacéuticamente aceptables para proporcionar formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.

Las formas de dosificación sólidas para la administración por vía oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En esas formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable inerte tal como sacarosa, lactosa, o fécula. Esas formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica habitual, sustancias adicionales distintas de esos diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Los comprimidos y píldoras adicionalmente se pueden preparar con recubrimientos entéricos.

Las formas de dosificación líquidas para la administración por vía oral incluyen emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes, y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes usados habitualmente en la técnica, tal como agua. Aparte de esos diluyentes inertes, las composiciones también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y suspensores, y agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.

Las preparaciones según esta invención para la administración por vía parenteral incluyen disoluciones, suspensiones, o emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Esas formas de dosificación también pueden contener adyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes, y dispersantes. Se pueden esterilizar mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro que retenga las bacterias, incorporando agentes esterilizantes a las composiciones, irradiando las composiciones, o calentando las composiciones. También se pueden fabricar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso.

Las composiciones para la administración por vía rectal o vaginal preferentemente son supositorios que pueden contener, además de la sustancia activa, excipientes tales como manteca de coco y una cera supositoria.

Las composiciones para la administración por vía nasal o sublingual también se preparan con excipientes normales muy conocidos en la técnica.

La dosificación del EGB 761® y el GKB aislado en las composiciones de esta invención se puede variar; no obstante, es necesario que la cantidad del principio activo sea tal que se obtenga una forma de dosificación adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración, y de la duración del tratamiento. La dosis se puede administrar en forma de dosis individual o dividida en múltiples dosis. Una cantidad de dosis eficaz de cualquiera de EGB 761® o GKB aislado depende de la dolencia tratada, la vía de administración elegida y en último término lo decidirá el facultativo o veterinario que atiende.

Referencias

37. Amati, B., Alevizopoulos, K., y Vlach, J. Myc and the Cell Cycle. Frontiers in Bioscience, 3: 250-268, 1998.

38. Huang, W. y Erikson, R. L. Signal Transduction. p. 161. Chapman and Hall, 1996.

39. Hu, W., Bellone, C. J., y Baldassare, J. J. RhoA stimulates p27 (Kip) degradation through its regulation of cyclin E/CDK2 activity. J. Biol. Chem., 274: 3396-3401, 1999.

40. Aepfelbacher, M., Essler, M., Luber, D. Q., y Weber, P. C. ADP-ribosylation of the GTP-binding protein RhoA blocks cytoplasmic division in human myelomonocytic cells. Biochem. J., 308: 853-858, 1995.

41. Jeanteur, P. The role of APC in colon cancer: Zeroing in on Myc. Bulletin du Cancer (Francia), 85: 925-928, 1998.

42. Munemitsu, S., Albert, I., Souza, B., Rubinfeld, B., y Polais, P. Regulation of intracellular beta-catenin levels by the adenomatous polyposis coli (APC) tumor-suppressor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92: 3046-3050, 1995.

43. Klemsz, M., Hromas, R., Raskind, W., Bruno, E., y Hoffman, R. PE-1, a novel ETS oncogene family member, localizes to chromosome 1q21-q23. Genomics, 20: 291-294, 1994.

44. Gomez-Marquez, J., Segade, F., Dosil, M., Pichel, J. G., Bustelo, X. R., y Freire, M. The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. J. Biol. Chem., 264: 8451-8454, 1989.

45. Bories, D., Raynal, M. C., Solomon, D. H., Darzynkiewicz, Z., y Cayre, Y. E. Down-regulation of a serine protease, myeloblastin, causes growth arrest and differentiation of promyelocytic leukemia cells. Cell, 59: 959-968, 1989.

46. Kao, C. T., Lin, M., O'Shea-Greenfield, A., Weinstein, J., y Sakamoto, K. M. Over-expression of p55Cdc inhibits granulocyte differentiation and accelerates apoptosis in myeloid cells. Oncogene, 13: 1221-1229, 1996.

47. Landberg, G. y Roos, G. The Cell Cycle in Breast Cancer. APMIS, 105: 575-589, 1997.

48. Perlaky, L., Valdez, B. C., Busch, R. K., Larson, R. G., Jhiang, S. M., Zhang, W. W., Brattain, M., y Busch, H. Increased growth of NIH/3T3 cells by transfection with human p120 complementary DNA and inhibition by a p120 antisense construct. Cancer Res., 52: 428-436, 1992.

49. Zhuang, S. H. y Burnstein, K. L. Antiproliferative Effect of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 in Human Prostate Cancer Cell Line LNCaP Involves Reduction of Cyclin-dependent Kinase 2 Activity and Persistent G1 Accumulation. Endocrinology, 139: 1197-1207, 1998.

50. Chan, A. M., Takai, S., Yamada, K., y Miki, T. Isolation of a novel oncogene, NET1, from neuroepithelioma cells by expression cDNA cloning. Oncogene, 12: 1259-1266, 1996.

51. Ahn, N. G. y Tolwinski, N. S. U0126: An Inhibitor of MKK/ERK Signal Transduction in Mammalian Cells. Promega Notes, 71: 4-13, 1999.

52. Coppee, F., Gerard, A. C., Denef, J. F., Ledent, C., Vassart, G., Dumont, J. E., y Parmentier, M. Early occurrence of metastatic differentiated thyroid carcinomas in transgenic mice expressing the A2a adenosine receptor gene and the human papillomavirus type 16 E7 oncogene. Oncogene, 13: 1471-1482, 1996.

53. Dehmel, U., Zaborski, M., Meierhoff, G., Rosnet, O., Birnbaum, D., Ludwig, W. D., Quentmeier, H., y Drexler, H. G. Effects of FLT3 ligand on human leukemia cells. 1. Proliferative response of myeloid leukemia cells. Leukemia, 10: 261-270, 1996.

54. Benito, M., Valverde, A. M., y Lorenzo, M. IGF-I: a mitogen also involved in differentiation processes in mammalian cells. Int. J Biochem. Cell Biol., 28: 499-510, 1996.

55. Chevalier, R. L. Effects of ureteral obstruction on renal growth. Semin. Nephrol., 15: 353-360, 1995.

56. Truong, L. D., Sheikh-Hamad, D., Chakraborty, S., y Suki, W. N. Cell Apoptosis and Proliferation in Obstructive Uropathy. Semin. Nephrol., 18: 641-651, 1998.

57. Choi-Miura, N. H. y Oda, T. Relationship between multifunctional protein "clusterin" and Alzheimer disease. Neurobiol. Aging, 17: 717-722, 1996.

58. Lotan, R. Retinoids and chemoprevention of aerodigestive tract cancers. Cancer Metastasis Rev., 16: 349-356, 1997.

59. Hagiwara, H., Inoue, A., Nakajo, S., Nakaya, K., Kojima, S., y Hirose, S. Inhibition of proliferation of chondrocytes by specific receptors in response to retinoids. Biochem. Biophys. Res. Commun., 222: 220-224,
1996.

60. Campos, L., Oriol, P., Sabido, O., y Guyotat, D. Simultaneous expression of P-glycoprotein and BCL-2 in acute myeloid leukemia blast cells. Leuk. Lymphoma., 27: 119-125, 1997.

61. Lacave, R., Coulet, F., Ricci, S., Touboul, E., Flahault, A., Rateau, J. G., Cesari, D., Lefranc, J. P., y Bernaudin, J. F. Comparative evaluation by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of MDR1, MRP and GSTp gene expression in breast carcinomas. Br. J. Cancer, 77: 694-702, 1998.

62. McCaughan, F. M., Brown, A. L., y Harrison, D. J. The effect of inhibition of glutathione S-transferase P on the growth of the Jurkat human T cell line. J. Pathol., 172: 357-362, 1994.

63. Kim, C. J., Chi, J. G., Choi, H. S., Shin, H. Y., Ahn, H. S., Yoo, Y. S., y Chang, K. Y. Proliferation not Apoptosis as a Prognostic Indicator in Retinoblastoma. Virchows Arch., 434: 301-305, 1999.

64. Newton, K., Harris, A. W., Bath, M. L., Smith, K. C., y Strasser, A. A dominant interfering mutant of FADD/MORT1 enhances deletion of autoreactive thymocytes and inhibits proliferation of mature T lymphocytes. EMBO J., 17: 706-718, 1998.

65. Gu, Z., Moerschell, R. P., Sherman, F., y Goldfarb, D. S. NIP1, a gene required for nuclear transport in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89: 10355-10359, 1992.

66. Phan, L., Zhang, X., Asano, K., Anderson, J., Vornlocher, H. P., Greenberg, J. R., Qin, J., y Hinnebusch, A. G. Identification of a translation initiation factor 3 (eIF3) core complex, conserved in yeast and mammals, that interacts with eiF5. Mol. Cell Biol., 18: 4935-4946, 1998.

67. Kleeff, J., Ishiwata, T., Friess, H., Buchler, M. W., Israel, M. A., y Korc, M. The helix-loop-helix protein Id2 is overexpressed in human pancreatic cancer. Cancer Res., 58: 3769-3772, 1998.

68. Mielnicki, L. M., Hughes, R. G., Chevray, P. M., y Pruitt, S. C. Mutated Atf4 suppresses c-Ha-ras oncogene transcript levels and cellular transformation in NIH3T3 fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., 228: 586-595, 1996.

69. Shimizu, N., Ohta, M., Fujiwara, C., Sagara, J., Mochizuki, N., Oda, T., y Utiyama, H. A gene coding for a zinc finger protein is induced during 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-stimulated HL-60 cell differentiation. J. Biochem. (Tokio.), 111: 272-277, 1992.

\newpage

\global\parskip0.940000\baselineskip

70. Shimizu, N., Ohta, M., Fujiwara, C., Sagara, J., Mochizuki, N., Oda, T., y Utiyama, H. Expression of a novel immediate early gene during 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced macrophagic differentiation of HL-60 cells. J. Biol. Chem., 266: 12157-12161, 1991.

71. Dolcetti, R., Zancai, P., Cariati, R., y Boiocchi, M. In vitro effects of retinoids on the proliferation and differentiation features of Epstein-Barr virus-immortalized B lymphocytes. Leuk. Lymphoma, 29: 269-281, 1998.

72. Tsuzuki, T., Izumoto, S., Ohnishi, T., Hiraga, S., Arita, N., y Hayakawa, T. Neural cell adhesion molecule L1 in gliomas: correlation with TGF-beta and p53. J. Clin. Pathol., 51: 13-17, 1998.

73. Young, C. S., Kitamura, M., Hardy, S., y Kitajewski, J. Wnt-1 induces growth, cytosolic beta-catenin, and Tcf/Lef transcriptional activation in Rat-1 fibroblasts. Mol. Cell Biol., 18: 2474-2485, 1998.

74. Cai, T. Q. y Wright, S. D. Human leukocyte elastase is an endogenous ligand for the integrin CR3 (CD11b/
CD18, Mac-1, alpha M beta 2) and modulates polymorphonuclear leukocyte adhesion. J. Exp. Med, 184: 1213-1223, 1996.

75. De Deyne, P. G., O'Neill, A., Resneck, W. G., Dmytrenko, G. M., Pumplin, D. W., y Bloch, R. J. The Vitronectin Receptor Associates with Clathrin-coated Membrane Domains Via the Cytoplasmic Domain of its beta5 Subunit. J. Cell Sci., 111: 2729- 2740, 1998.

76. Milner, R. y Ffrench-Constant, C. A developmental analysis of oligodendroglial integrins in primary cells: changes in alpha v-associated beta subunits during differentiation. Development, 120: 3497-3506, 1994.

77. Friedlander, M., Theesfeld, C. L., Sugita, M., Fruttiger, M., Thomas, M. A., Chang, S., y Cheresh, D. A. Involvement of integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 in ocular neovascular diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 93: 9764-9769, 1996.

78. Bittner, M., Gosslar, U., Luz, A., y Holzmann, B. Sequence Motifs in the Integrin alpha4 Cytoplasmic Tail Required for Regulation of In Vivo Expansion of Murine Lymphoma Cells. J. Immunol., 161: 5978-5986, 1998.

79. Holzmann, B., Gosslar, U., y Bitter, M. alpha 4 integrins and tumor metastasis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 231: 125-141, 1998.

80. Gonzales, M., Haan, K., Baker, S. E., Fitchmun, M., Todorov, I., Weitzman, S., y Jones, J. C. A Cell Signal Pathway Involving Laminin-5, alpha3beta1 Integrin, and Mitogen-activated Protein Kinase can Regulate Epithelial Cell Proliferation. Mol. Biol. Cell, 10: 259-270, 1999.

81. Falcioni, R., Antonini, A., Nistico, P., Di, S. S., Crescenzi, M., Natali, P. G., y Sacchi, A. Alpha 6 beta 4 and alpha 6 beta 1 integrins associate with ErbB-2 in human carcinoma cell lines. Exp. Cell Res., 236: 76-85, 1997.

82. Rousse, M. F. Regulation of cell cycle entry and G1 progression by CSF-1. Mol. Reprod. Dev., 46: 11-18, 1997.

83. Keshava, N., Gubba, S., y Tekmal, R. R. Overexpression of Macrophage Colony-stimulating Factor (CSF-1) and its Receptor, c-fms, in Normal Ovarian Granulosa Cells Leads to Cell Proliferation and Tumorigenesis. J. Soc. Gynecol. Investi., 6: 41-49, 1999.

84. Mishima, K., Higashiyama, S., Asai, A., Yamaoka, K., Nagashima, Y., Taniguchi, N., Kitanaka, C., Kirino, T., y Kuchino, Y. Heparin-binding Epidermal Growth Factor-like Growth Factor Stimulates Mitogenic Signaling and is Highly Expressed in Human Malignant Gliomas. Acta Neuropathologica, 96: 322-328, 1998.

85. Zhu, M. y Paddock, G. V. Expression of the Hepatocyte Growth Factor-like Protein Gene in Human Hepatocellular Carcinoma and Interleukin-6-induced Increased Expression in Hepatoma Cells. Biochim. Biophys. Acta, 1449: 63-72, 1999.

86. Wang, M. H., Dlugosz, A. A., Sun, Y., Suda, T., Skeel, A., y Leonard, E. J. Macrophage-stimulating protein induces proliferation and migration of murine keratinocytes. Exp. Cell Res., 226: 39-46, 1996.

87. Pelkey, T. J., Frierson, H. F., Mills, S. E., y Stoler, M. H. Detection of the alpha-subunit of inhibin in Trophoblastic Neoplasia. Hum. Pathol., 30: 26-31, 1999.

88. Arola, J., Liu, J., Heikkila, P., Voutilainen, R., y Kahri, A. Expression of inhibin alpha in the human adrenal gland and adrenocortical tumors. Endocrine Res., 24: 865-867, 1998.

89. Kallakury, B. S., Sheehan, C. E., Rhee, S. J., Fisher, H. G., Kaufman, R. P. J., Rifkin, M. D., y Ross, J. S. The prognostic significance of proliferation-associated nucleolar protein p120 expression in prostate adenocarcinoma: A comparison with cyclins A and B1, Ki-67, proliferating cell nuclear antigen, and p34 (cdc2). Cancer, 85: 1569-1576, 1999.

\global\parskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es sólo para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europeo. Aunque se ha tenido mucho cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO renuncia a toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet EP 0359951 A [0008]

\bullet US 04765298 A [0012]

\bullet DE 4208868 [0009]

Bibliografía no de patentes citada en la descripción

\bulletDEFEUDIS F. V. Ginkgo biloba extract (EGB 761®): from chemistry to clinic. Ullstein Medical, 1998, 400 [0004]

\bulletTOSAKI, A.; DROY-LEFAIX, M. T.; PALI, T.; DAS, D. K. Free Rad. Biol. Med., 1993, vol. 14, 361-370 [0004]

\bulletPIETRI, S.; MAURELLI, E.; DRIEU, K.; CULCASI, M. J. Mol. Cell. Cardiol., 1997, vol. 29, 733-742 [0004]

\bulletYAO, Z.; BOUJRAD, N.; DRIEU, K.; PAPADOPOULOS, V. Adv. Ginkgo Biloba Res., 1998, vol. 7, 129-138 [0004]

\bullet Ginkgo biloba Extract (EGB 761®) Pharmacological Activities and Clinical Applications. Elsevier, 1991 [0004]

\bulletBORALLE, N. y col. Ginkgolides, Chemistry, Biology, Pharmacology and Clinical perspectives. J.R. Prous Science Publishers, 1988 [0004]

\bulletRICHFIELD, E. K. y col. Neurology, 1988, vol. 38, 1255-1262 [0006]

\bulletKATZ, Y. y col. Eur. J. Pharmacol., 1988, vol. 148, 483-484 [0006]

\bulletKATZ, Y. y col. Clinical Sci., 1990, vol. 78, 155-158 [0006]

\bulletCORNU, P. y col. Acta Neurochir., 1992, vol. 199, 146-152 [0006]

\bulletNEARY, J. T. y col. Brain Research, 1995, vol. 675, 27-30 [0006]

\bulletMIETTINEN, H. y col. Cancer Research, 1995, vol. 55, 2691-2695 [0006]

\bulletALHO, H. Cell Growth Different, 1994, vol. 5, 1005-1014 [0006]

\bulletBROADDUS, W. C. y col. Brain Research, 1990, vol. 518, 199-208 [0006]

\bulletPAPPATA, S. y col. J. Nuclear Med., 1991, vol. 32, 1608-1610 [0006]

\bulletPAPADOPOULOS, V. Endocr. Rev., 1993, vol. 14, 222-240 [0007]

\bulletANHOLT, R. y col. J. Biol. Chem., 1986, vol. 261, 576-583 [0007]

\bulletMCENERY, M. W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 89, 3170-3174 [0007]

\bulletMANIATIS; FITSCH; SAMBROOK. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1982 [0036]

\bulletDNA Cloning. 1985, vol. I y II [0036]

\bulletCurrent Protocols in Molecular Biology. Wiley & Sons, Inc, [0036]

\bulletRIOND, J. y col. Eur. J. Biochem., 1991, vol. 195, 305-311 [0036]

\bulletCHANG, Y. J. y col. DNA and Cell Biol., 1992, vol. 11, 471-480 [0036]

\bulletPAROLA, A. L. y col. J. Biol. Chem, 1991, vol. 266, 14082-14087 [0036]

\bulletGARNIER, M. y col. Mol Phar., 1994, vol. 45, 201-211 [0036]

\global\parskip0.950000\baselineskip

\bulletLEONG, D. y col. Alcohol Clin. Exp. Res., 1996, vol. 20, 601-605 [0038]

\bulletHARDWICK, M. y col. Cancer Research, 1999, vol. 59, 631-632 [0047]

\bulletMUNSON, PJ; ROBBARD, D. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220-239 [0047]

\bulletBRADFORD, MM. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, 248-254 [0047]

\bulletHARDWICK, M. y col. Cancer Research, 1999, vol. 59, 831-842 [0047] [0047]

\bulletGOODMAN, Y.; MATTSON, M. P. Exp. Neurol., 1994, vol. 128, 1-12 [0047]

\bulletMEDINA, D. J. Mamm. Gland. Biol. Neopl., 1996, vol. 1, 5-19 [0054]

\bulletPERLAKY, L. y col. Cancer Res., 1992, vol. 52, 428-436 [0057]

\bulletZHUANG, S. H. y col. Endocrinology, 1998, vol. 139, 1197-1207 [0057]

\bulletKIM, C. J. y col. Virchows Arch., 1999, vol. 434, 301-305 [0059]

\bulletDANG, C. V. Mol. Cel. Biol., 1999, vol. 19, 1-11 [0059]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. Mack Easton PA, 1980 [0067]

\bulletAMATI, B.; ALEVIZOPOULOS, K.; VLACH, J. Myc and the Cell Cycle. Frontiers in Bioscience, 1998, vol. 3, 250-268 [0076]

\bulletHUANG, W.; ERIKSON, R. L. Signal Transduction. Chapman and Hall, 1996, 161 [0076]

\bulletHU, W.; BELLONE, C. J.; BALDASSARE, J. J. RhoA stimulates p27(Kip) degradation through its regulation of cyclin E/CDK2 activity. J. Biol. Chem., 1999, vol. 274, 3396-3401 [0076]

\bulletAEPFELBACHER, M.; ESSLER, M.; LUBER, D. Q.; WEBER, P. C. ADP-ribosylation of the GTP-binding protein RhoA blocks cytoplasmic division in human myelomonocytic cells. Biochem. J., 1995, vol. 308, 853-858 [0076]

\bulletJEANTEUR, P. The role of APC in colon cancer: Zeroing in on Myc. Bulletin du Cancer (Francia, 1998, vol. 85, 925-928 [0076]

\bulletDEHMEL, U.; ZABORSKI, M.; MEIERHOFF, G.; ROSNET, O.; BIRNBAUM, D.; LUDWIG, W. D.; QUENTMEIER, H.; DREXLER, H. G. Effects of FLT3 ligand on human leukemia cells. I. Proliferative response of myeloid leukemia cells. Leukemia, 1996, vol. 10, 261-270 [0076]

\bulletBENITO, M.; VALVERDE, A. M.; LORENZO, M. IGF-I: a mitogen also involved in differentiation processes in mammalian cells. Int. J Biochem. Cell Biol., 1996, vol. 28, 499-510 [0076]

\bulletCHEVALIER, R. L. Effects of ureteral obstruction on renal growth. Semin. Nephrol., 1995, vol. 15, 353-360 [0076]

\bulletTRUONG, L. D.; SHEIKH-HAMAD, D.; CHAKRABORTY, S.; SUKI, W. N. Cell Apoptosis and Proliferation in Obstructive Uropathy. Semin. Nephrol., 1998, vol. 18, 641-651 [0076]

\bulletCHOI-MIURA, N. H.; ODA, T. Relationship between multifunctional protein "clusterin" and Alzheimer disease. Neurobiol. Aging, 1996, vol. 17, 717-722 [0076]

\bulletLOTAN, R. Retinoids and chemoprevention of aerodigestive tract cancers. Cancer Metastasis Rev., 1997, vol. 16, 349-356 [0076]

\bulletHAGIWARA, H.; INOUE, A.; NAKAJO, S.; NAKAYA, K.; KOJIMA, S.; HIROSE, S. Inhibition of proliferation of chondrocytes by specific receptors in response to retinoids. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol. 222, 220-224 [0076]

\bulletCAMPOS, L.; ORIOL, P.; SABIDO, O.; GUYOTAT, D. Simultaneous expression of P-glycoprotein and BCL-2 in acute myeloid leukemia blast cells. Leuk. Lymphoma., 1997, vol. 27, 119-125 [0076]

\bulletLACAVE, R.; COULET, F.; RICCI, S.; TOUBOUL, E.; FLAHAULT, A.; RATEAU, J. G.; CESARI, D.; LEFRANC, J. P.; BEMAUDIN, J. F. Comparative evaluation by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of MDR1, MRP and GSTp gene expression in breast carcinomas. Br. J. Cancer, 1998, vol. 77, 694-702 [0076]

\global\parskip1.000000\baselineskip

\bulletMCCAUGHAN, F. M.; BROWN, A. L.; HARRISON, D. J. The effect of inhibition of glutathione S-transferase P on the growth of the Jurkat human T cell line. J. Pathol., 1994, vol. 172, 357-362 [0076]

\bulletKIM, C. J.; CHI, J. G.; CHOI, H. S.; SHIN, H. Y.; AHN, H. S.; YOO, Y. S.; CHANG, K. Y. Proliferation not Apoptosis as a Prognostic Indicator in Retinoblastoma. Virchows Arch., 1999, vol. 434, 301-305 [0076]

\bulletNEWTON, K.; HARRIS, A. W.; BATH, M. L.; SMITH, K. C.; STRASSER, A. A dominant interfering mutant of FADD/MORT1 enhances deletion of autoreactive thymocytes and inhibits proliferation of mature T lymphocytes. EMBO J., 1998, vol. 17, 706-718 [0076]

\bulletGU, Z.; MOERSCHELL, R. P.; SHERMAN, F.; GOLDFARB, D. S. NIP1, a gene required for nuclear transport in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, vol. 89, 10355-10359 [0076]

\bulletMILNER, R.; FFRENCH-CONSTANT, C. A developmental analysis of oligodendroglial integrins in primary cells: changes in alpha v-associated beta subunits during differentiation. Development, 1994, vol. 120, 3497-3506 [0076]

\bulletFRIEDLANDER, M.; THEESFELD, C. L.; SUGITA, M.; FRUTTIGER, M.; THOMAS, M. A.; CHANG, S.; CHERESH, D. A. Involvement of integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 in ocular neovascular diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996, vol. 93, 9764-9769 [0076]

\bulletBITTNER, M.; GOSSLAR, U.; LUZ, A.; HOLZMANN, B. Sequence Motifs in the Integrin alpha4 Cytoplasmic Tail Required for Regulation of In Vivo Expansion of Murine Lymphoma Cells. J. Immunol., 1998, vol. 161, 5978-5986 [0076]

\bulletHOLZMANN, B.; GOSSLAR, U.; BITTNER, M. Alpha 4 integrins and tumor metastasis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1998, vol. 231, 125-141 [0076]

\bulletGONZALES, M.; HAAN, K.; BAKER, S. E.; FITCHMUN, M.; TODOROV, I.; WEITZMAN, S.; JONES, J. C. A Cell Signal Pathway Involving Laminin-5, alpha3beta1 Integrin, and Mitogen-activated Protein Kinase can Regulate Epithelial Cell Proliferation. Mol. Biol. Cell, 1999, vol. 10, 259-270 [0076]

\bulletFALCIONI, R.; ANTONINI, A.; NISTICO, P.; DI, S. S.; CRESCENZI, M.; NATALI, P. G.; SACCHI, A. Alpha 6 beta 4 and alpha 6 beta 1 integrins associate with ErbB-2 in human carcinoma cell lines. Exp. Cell Res., 1997, vol. 236, 76-85 [0076]

\bulletROUSSEL, M. F. Regulation of cell cycle entry and G1 progression by CSF-1. Mol. Reprod. Dev., 1997, vol. 46, 11-18 [0076]

\bulletKESHAVA, N.; GUBBA, S.; TEKMAL, R. R. Overexpression of Macrophage Colony-stimulating Factor (CSF-1) and its Receptor, c-fms, in Normal Ovarian Granulosa Cells Leads to Cell Proliferation and Tumorigenesis. J. Soc. Gynecol. Investig., 1999, vol. 6, 41-49 [0076]

\bulletGAMIER, M. y col. Mol. Pharmacol., 1994, vol. 45, 201-211 [0007]

\bulletPAPADOPOULOS, V. y col. Mol. Cel. Endocr., 1994, vol. 104, R5-R9 [0007]

\bulletPAPADOPOULOS, V. y col. J. Biol. Chem., 1990, vol. 265, 3772-3779 [0007] [0047]

\bulletRITTA, M. N. y col. Neuroendocrinology, 1989, vol. 49, 262-266 [0007]

\bulletBAMEA, E. R. y col. Mol. Cell Endocr., 1989, vol. 64, 155-159 [0007]

\bulletAMSTERDAM, A.; SUH, B. S. Endocrinology, 1991, vol. 128, 503-510 [0007]

\bulletYANAGIBASHI, K. y col. J. Biochem. (Tokio), 1989, vol. 106, 1026-1029 [0007]

\bulletPAPADOPOULOS V. y col. Steroids, 1997, vol. 62, 21-28 [0007]

\bulletPAPADOPOULOS, V. y col. Steroids, 1997, vol. 62, 21-28 [0007]

\bulletKRUEGER, K. E.; PAPADOPOULOS, V. J. Biol. Chem, 1990, vol. 265, 15015-15022 [0007]

\bulletYANAGIBASHI, K. y col. Endocrinology, 1988, vol. 123, 2075-2082 [0007]

\bulletBESMAN, M. J. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, vol. 86, 4897-4901 [0007]

\bulletPAPADOPOULOS, V. y col. Endocrinology, 1991, vol. 129, 1481-1488 [0007]

\bulletPAPADOPOULOS, V. y col. The Leydig Cell. Cache River Press, IL, 1996, 596-628 [0008]

\bulletPAPADOPOULOS, V. y col. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 32129-32135 [0008]

\bulletLI; PAPADOPOULOS, V. y col. Endocrinology, 1998 [0008]

\bulletLIPPMAN, M. E. Science, 1993, vol. 259, 631-632 [0010]

\bullet Ginkgolides, Chemistry, Biology, Pharmacology, and Clinical Perspectives. J.R. Provs. Science Publishers, 1988 [0032]

\bullet F. V. DEFEUDIS. Ginkgo Biloba Extract (EGB 761®); Pharmacological Activities and Clinical Applications. Elsevier, 1991 [0032]

\bulletOKABE y col. J. Chem. Soc. (c, 1967, 2201-2206 [0033]

\bulletMUNEMITSU, S.; ALBERT, I.; SOUZA, B.; RUBINFELD, B.; POLAKIS, P. Regulation of intracellular beta-catenin levels by the adenomatous polyposis coli (APC) tumor-suppressor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995, vol. 92, 3046-3050 [0076]

\bulletKLEMSZ, M.; HROMAS, R.; RASKIND, W.; BRUNO, E.; HOFFMAN, R. PE-1, a novel ETS oncogene family member, localizes to chromosome 1q21-q23. Genomics, 1994, vol. 20, 291-294 [0076]

\bulletGOMEZ-MARQUEZ, J.; SEGADE, F.; DOSIL, M.; PICHEL, J. G.; BUSTELO, X. R.; FREIRE, M. The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 8451-8454 [0076]

\bulletBORIES, D.; RAYNAL, M. C.; SOLOMON, D. H.; DARZYNKIEWICZ, Z.; CAYRE, Y. E. Down-regulation of a serine protease, myeloblastin, causes growth arrest and differentiation of promyelocytic leukemia cells. Cell, 1989, vol. 59, 959-968 [0076]

\bulletKAO, C. T.; LIN, M.; O'SHEA-GREENFIELD, A.; WEINSTEIN, J.; SAKAMOTO, K. M. Over-expression of p55Cdc inhibits granulocyte differentiation and accelerates apoptosis in myeloid cells. Oncogene, 1996, vol. 13, 1221-1229 [0076]

\bulletLANDBERG, G.; ROOS, G. The Cell Cycle in Breast Cancer. APMIS, 1997, vol. 105, 575-589 [0076]

\bulletPERLAKY, L.; VALDEZ, B. C.; BUSCH, R. K.; LARSON, R. G.; JHIANG, S. M.; ZHANG, W. W.; BRATTAIN, M.; BUSCH, H. Increased growth of NIH/3T3 cells by transfection with human p120 complementary DNA and inhibition by a p120 antisense construct. Cancer Res., 1992, vol. 52, 428-436 [0076]

\bulletZHUANG, S. H.; BURNSTEIN, K. L. Antiproliferative Effect of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 in Human Prostate Cancer Cell Line LNCaP Involves Reduction of Cyclin-dependent Kinase 2 Activity and Persistent G1 Accumulation. Endocrinology, 1998, vol. 139, 1197-1207 [0076]

\bulletCHAN, A. M.; TAKAI, S.; YAMADA, K.; MIKI, T. Isolation of a novel oncogene, NET1, from neuroepithelioma cells by expression cDNA cloning. Oncogene, 1996, vol. 12, 1259-1266 [0076]

\bulletAHN, N. G.; TOLWINSKI, N. S. U0126: An Inhibitor of MKK/ERK Signal Transduction in Mammalian Cells. Promega Notes, 1999, vol. 71, 4-13 [0076]

\bulletCOPPEE, F.; GERARD; A. C.; DENEF, J. F.; LEDENT, C.; VASSART, G.; DUMONT, J. E.; PARMENTIER, M. Early occurrence of metastatic differentiated thyroid carcinomas in transgenic mice expressing the A2a adenosine receptor gene and the human papillomavirus type 16 E7 oncogene. Oncogene, 1996, vol. 13, 1471-1482 [0076]

\bulletPHAN, L.; ZHANG, X.; ASANO, K.; ANDERSON, J.; VOMLOCHER, H. P.; GREENBERG, J. R.; QIN, J.; HINNEBUSCH, A. G. Identification of a translation initiation factor 3 (elF3) core complex, conserved in yeast and mammals, that interacts with elF5. Mol. Cell Biol., 1998, vol. 18, 4935-4946 [0076]

\bulletKLEEFF, J.; ISHIWATA, T.; FRIESS, H.; BUCHLER, M. W.; ISRAEL, M. A.; KORC. M. The helix-loop-helix protein Id2 is overexpressed in human pancreatic cancer. Cancer Res., 1998, vol. 58, 3769-3772 [0076]

\bulletMIELNICKI, L. M.; HUGHES, R. G.; CHEVRAY, P. M.; PRUITT, S. C. Mutated Atf4 suppresses c-Ha-ras oncogene transcript levels and cellular transformation in NIH3T3 fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol. 228, 586-595 [0076]

\newpage

\bulletSHIMIZU, N.; OHTA, M.; FUJIWARA, C.; SAGARA, J.; MOCHIZUKI, N.; ODA, T.; UTIYAMA, H. A gene coding for a zinc finger protein is induced during 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-stimulated HL-60 cell differentiation. J. Biochem. (Tokio., 1992, vol. 111, 272-277 [0076]

\bulletSHIMIZU, N.; OHTA, M.; FUJIWARA, C.; SAGARA, J.; MOCHIZUKI, N.; ODA, T.; UTIYAMA, H. Expression of a novel immediate early gene during 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced macrophagic differentiation of HL-60 cells. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 12157-12161 [0076]

\bulletDOLCETTI, R.; ZANCAI, P.; CARIATI, R.; BOIOCCHI, M. In vitro effects of retinoids on the proliferation and differentiation features of Epstein-Barr virus-immortalized B lymphocytes. Leuk. Lymphoma, 1998, vol. 29, 269-281 [0076]

\bulletTSUZUKI, T.; IZUMOTO, S.; OHNISHI, T.; HIRAGA, S.; ARITA, N.; HAYAKAWA, T. Neural cell adhesion molecule L1 in gliomas: correlation with TGF-beta and p53. J. Clin. Pathol., 1998, vol. 51, 13-17 [0076]

\bulletYOUNG, C. S.; KITAMURA, M.; HARDY, S.; KITAJEWSKI, J. Wnt-1 induces growth, cytosolic beta-catenin, and Tcf/Lef transcriptional activation in Rat-1 fibroblasts. Mol. Cell Biol., 1998, vol. 18, 2474-2485 [0076]

\bulletCAI, T. Q.; WRIGHT, S. D. Human leukocyte elastase is an endogenous ligand for the integrin CR3 (CD11b/
CD18, Mac-1, alpha M beta 2) and modulates polymorphonuclear leukocyte adhesion. J. Exp. Med, 1996, vol. 184, 1213-1223 [0076]

[0076] \bullet DE DEYNE, P. G.; O'NEILL, A.; RESNECK, W. G.; DMYTRENKO, G. M.; PUMPLIN, D. W.; BLOCH, R. J. The Vitronectin Receptor Associates with Clathrin-coated Membrane Domains Via the Cytoplasmic Domain of its beta5 Subunit. J. Cell Sci., 1998, vol. 111, 2729-2740 [0076]

\bulletMISHIMA, K.; HIGASHIYAMA, S.; ASAI, A.; YAMAOKA, K.; NAGASHIMA, Y.; TANIGUCHI, N.; KITANAKA, C.; KIRINO, T.; KUCHINO, Y. Heparin-binding Epidermal Growth Factor-like Growth Factor Stimulates Mitogenic Signaling and is Highly Expressed in Human Malignant Gliomas. Acta Neuropathologica, 1998, vol. 96, 322-328 [0076]

\bulletZHU, M.; PADDOCK, G. V. Expression of the Hepatocyte Growth Factor-like Protein Gene in Human Hepatocellular Carcinoma and Interleukin-6-induced Increased Expression in Hepatoma Cells. Biochim. Biophys. Acta, 1999, vol. 1449, 63-72 [0076]

\bulletWANG, M. H.; DLUGOSZ, A. A.; SUN, Y.; SUDA, T.; SKEEL, A.; LEONARD, E. J. Macrophage-stimulating protein induces proliferation and migration of murine keratinocytes. Exp. Cell Res., 1996, vol. 226, 39-46 [0076]

\bulletPELKEY, T. J.; FRIERSON, H. F.; MILLS, S. E.; STOLER, M. H. Detection of the alpha-subunit of Inhibin in Trophoblastic Neoplasia. Hum. Pathol., 1999, vol. 30, 26-31 [0076]

\bulletAROLA, J.; LIU, J.; HEIKKILA, P.; VOUTILAINEN, R.; KAHRI, A. Expression of inhibin alpha in the human adrenal gland and adrenocortical tumors. Endocrine Res., 1998, vol. 24, 865-867 [0076]

\bulletKALLAKURY, B. S.; SHEEHAN, C. E.; RHEE, S. J.; FISHER, H. G.; KAUFMAN, R. P. J.; RIFKIN, M. D.; ROSS, J. S. The prognostic significance of proliferation-associated nucleolar protein p120 expression in prostate adenocarcinoma: A comparison with cyclins A and B1, Ki-67, proliferating cell nuclear antigen, and p34(cdc2. Cancer, 1999, vol. 85, 1569-1576 [0076]

Claims (22)

1. \global\parskip0.880000\baselineskip

   1. Uso de una cantidad eficaz de extractos de Ginkgo biloba o ginkgólido B aislado en la fabricación de un medicamento para combatir el cáncer en un paciente que necesite combatirlo, en el que dicho paciente se caracteriza por tener células cancerígenas que sobre-expresan la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico.
2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento combate la proliferación de células cancerígenas en un paciente que necesite combatirlas.
3. 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dichas células cancerígenas tienen un fenotipo agresivo.
4. 4. Uso según la reivindicación 2, en el que la proliferación está causada por la sobre-expresión de oncogenes, y el medicamento actúa reduciendo la expresión de dichos oncogenes en un paciente que necesite combatirla.
5. 5. Uso según la reivindicación 4, en el que dichos oncogenes son uno o más de APC, PE-1, RhoA y c-Jun.
6. 6. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión del receptor de benzodiacepina de tipo periférico en dichas células cancerígenas.
7. 7. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión del ARNm del receptor de benzodiacepina de tipo periférico en células cancerígenas.
8. 8. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión de los reguladores del ciclo celular protimosina-\alpha, CDK2, p55CDC, mieloblastina y el antígeno nuclear de células en proliferación p120 (PCNA) en un paciente que necesite reducirla.
9. 9. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión de los moduladores de la transducción de señales intracelulares NET1 y ERK2, en un paciente que necesite reducirla.
10. 10. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión de los productos relacionados con la apoptosis receptor de adenosina A2A, ligando FIt3, Grb2, Clusterina, RXR-\beta, Glutation S-transferasa P, N-Myc, TRADD, SGP-2 y NIP-1, en un paciente que necesite reducirla.
11. 11. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión de los factores de transcripción Id-2, ATF-4, ETR-101 y ETR-103, en un paciente que necesite reducirla.
12. 12. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión de los factores de crecimiento factor estimulante de colonias de macrófagos 1, factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina, proteína similar al factor de crecimiento de hepatocitos e inhibina \alpha, en un paciente que necesite reducirla.
13. 13. Uso de la reivindicación 1, en el que dicho medicamento reduce la expresión de las moléculas de adhesión celular antígeno de linfocitos B CD19, L1CAM, \beta-catenina, subunidades de la integrina \alpha3, \alpha4, \alpha6, \beta5, y \alphaM, en un paciente que necesite reducirla.
14. 14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas células cancerígenas son células cancerígenas de mama humana.
15. 15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son glioblastomas.
16. 16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son células tumorales cerebrales humanas.
17. 17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son células de astrocitoma de ser humano.
18. 18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son células de carcinoma colónico de ser humano.
19. 19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son células de adenocarcinoma colónico de ser humano.
20. 20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son células de carcinoma de ovario de ser humano.
21. 21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas células cancerígenas son células de carcinoma hepatocelular de ser humano.
22. 22. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha sobre-expresión es un incremento de al menos 3 veces de la proteína receptora de benzodiacepina de tipo periférico comparada con células normales.