ES2307807T3

ES2307807T3 - Produccion de fragmentos f(ab')2 en celulas de mamiferos.

Info

Publication number: ES2307807T3
Application number: ES02789019T
Authority: ES
Inventors: Abraham Bout; David Halford Ashton Jones
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2001-12-17
Filing date: 2002-12-17
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2022-12-17
Also published as: CA2470579C; AU2002353662B2; US7537916B2; US20050048038A1; NZ533332A; SI1456238T1; EP1456238B1; CA2470579A1; AU2002353662A1; EP1456238A2; WO2003051927A2; US20080166767A1; DE60226896D1; DK1456238T3; WO2003051927A3; ATE397019T1

Abstract

Una célula PER.C6 tal como la depositada en la ECACC con el número 96022940 para la expresión recombinante de un fragmento F(ab'')2, comprendiendo además dicha célula ácido nucleico recombinante que codifica un fragmento F(ab'')2, funcionalmente unido a una o más secuencias promotoras y/o potenciadoras.

Description

Producción de fragmentos F(ab')2 en células de mamíferos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la producción de proteínas recombinantes, más particularmente a la producción de fragmentos de anticuerpos inmunológicamente activos en células eucariotas. La invención se refiere más particularmente a la producción de fragmentos F(ab')2 en células eucariotas.

Antecedentes de la invención

Los resultados de ensayos clínicos recientes han generado mucho entusiasmo y optimismo por los posibles beneficios de anticuerpos completamente humanos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades. Este éxito se debe en parte a la tecnología de selección de anticuerpos frente a dianas novedosas de bibliotecas de presentación en fago, y también se debe a plataformas de producción mejoradas.

Una molécula de IgG comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas consisten en (comenzando desde el extremo N-terminal): una región variable, una región constante, una región bisagra y dos regiones constantes adicionales (figura 1). La región bisagra contiene residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro con una segunda cadena pesada para mediar la dimerización de la proteína. El número de residuos de cisteína varía dependiendo de la subclase de IgG: IgG1 tiene 2 cisteínas que forman enlaces disulfuro en la bisagra. Las cadenas ligeras consisten en una región variable y una región constante; residuos C-terminales con respecto a la región constante forman enlaces disulfuro con residuos inmediatamente antes de las regiones bisagra de las cadenas pesadas. Por tanto, las cuatro cadenas se mantienen unidas mediante múltiples enlaces disulfuro así como otras interacciones no covalentes entre las cadenas íntimamente apareadas.

La estructura de un anticuerpo puede definirse como dominios diferenciados: la región Fc que media las funciones efectoras y la región F(ab') que se une al antígeno (George y Urch, 2000). Los dos dominios constantes C-terminales de las cadenas pesadas constituyen la región Fc. Un fragmento F(ab') comprende la cadena ligera y la región variable y la primera constante de la cadena pesada; un fragmento F(ab')2 comprende dos fragmentos F(ab') dimerizados a través de la región bisagra de la cadena pesada (figura 1).

Hay anticuerpos en investigación como terapias para un amplio intervalo de problemas clínicos incluyendo trasplante de órganos, cardiopatía, enfermedades infecciosas, cáncer, enfermedad reumatológica y autoinmunitaria, trastornos neurológicos, enfermedades respiratorias, así como trastornos de órganos tales como la sangre, la piel y el tubo digestivo.

Uno de los principales centros de interés para el descubrimiento y desarrollo de anticuerpos está en el campo de la terapia y la obtención de imágenes del cáncer (Carter, 2001). Pueden usarse anticuerpos como moléculas desnudas, o pueden marcarse y así usarse como una panacea para administrar una carga al tumor (Borrebaeck y Carlsson, 2001; Park y Smolen, 2001). Actualmente hay varios anticuerpos desnudos en las clínicas. Aunque está claro que pueden reducir la carga tumoral en pacientes, el mecanismo mediante el cual se produce esto no está claro. De manera clásica podrían funcionar reuniendo células efectoras (mediante receptores de Fc) o como complemento a la célula diana. Más recientemente, está resultando evidente que también pueden funcionar uniéndose a proteínas de la superficie celular y después activando rutas de señalización inapropiadas o rutas de señalización apoptóticas, lo que conduce a la muerte celular (Tutt et al., 1998).

Actualmente se usan anticuerpos en la clínica tanto como moléculas de IgG intactas como fragmentos F(ab') y F(ab')2. Cuando se selecciona un formato de anticuerpo, hay varios asuntos importantes. Deben tener una alta especificidad y avidez por el antígeno, ser lo suficientemente pequeños para penetrar en el tejido tumoral y permanecer en la circulación durante el tiempo suficiente para localizarse en los tumores. Además (particularmente si están marcados con un radiomarcador u otro resto tóxico) deben eliminarse del organismo a una velocidad que evite la toxicidad no específica o un ruido de fondo elevado. Los fragmentos F(ab')2 muestran varios beneficios con respecto a la IgG intacta relacionados con los puntos anteriores, que hacen que sean atractivos para la obtención de imágenes y la terapia. En primer lugar, estas moléculas tienen una semivida más corta que la IgG intacta ya que se eliminan más rápidamente de la circulación por los riñones como resultado de su menor peso molecular, reduciendo así la posible toxicidad (Behr et al., 1995). Otra ventaja del tamaño reducido es que pueden penetrar en el tejido tumoral y la vasculatura asociada más fácilmente (Yokota et al, 1992). De esta manera, se seleccionan como diana más células de la masa
tumoral.

También hay ventajas debidas a la ausencia de la región Fc de la molécula. El fragmento F(ab')2 no induce la activación de respuestas inmunitarias, ya que la región Fc (que se une al complemento y receptores de Fc) está ausente. Esto es de particular importancia en estudios de obtención de imágenes, en los que sólo se requiere una instantánea del tamaño y la dispersión del tumor. Los fragmentos F(ab')2 tampoco tienen el problema de la unión no específica a dianas mediante el resto Fc, y por tanto se reduce el ruido de fondo y el marcaje no específico. Las ventajas enumeradas anteriormente también pueden aplicarse en parte a fragmentos F(ab'). Sin embargo, las moléculas F(ab')2 son bivalentes (como lo son las IgG intactas) y así deben unirse a moléculas diana con mayor avidez. Los fragmentos F(ab') son monovalentes, y como resultado generalmente muestran menor avidez. Por estos motivos, los fragmentos F(ab')2 son sumamente deseables como agentes clínicos.

Aunque estas ventajas de los fragmentos F(ab')2 están claras, no ha resultado ser tan fácil preparar fragmentos F(ab')2. Hay varios métodos actualmente disponibles. El método clásico es preparar la IgG intacta, después digerirla con una proteasa tal como pepsina para eliminar la región Fc del anticuerpo. Esto tiene el problema de que pueden cortarse otras regiones de la molécula por la proteasa (incluyendo la región de unión a antígeno, dando como resultado la pérdida de capacidad de unión de la región de unión a antígeno), y la digestión puede no ser completa. Después se requiere purificación adicional para eliminar el fragmento F(ab')2 del anticuerpo no digerido, el dominio Fc y la proteasa.

Un método alternativo es preparar fragmentos F(ab') en bacterias y después dimerizar las moléculas para generar moléculas de F(ab')2 (Willuda et al., 2001; Zapata et al., 1995, Humphreys et al., 1998; patente estadounidense 5.648.237). La dimerización puede usar péptidos de autoasociación específicos (que pueden resultar ser antigénicos in vivo), conjugación mediante reticuladores químicos o reducción/oxidación in vitro de fragmentos F(ab')-bisagra. Estos métodos requieren etapas de purificación adicionales y pueden producir moléculas no habituales (tales como dos fragmentos F(ab') unidos "cabeza a cola" de manera que las regiones de unión a antígeno están en extremos opuestos de la nueva molécula).

Otro método para la producción de fragmentos F(ab')2 es generarlos directamente en células de mamíferos. Aunque esto puede parecer sencillo, se ha observado que a menudo se producen fragmentos F(ab') con preferencia a fragmentos F(ab')2. Un informe en el que se usaron células CHO para la producción de F(ab')2 de IgG4 indicó que los fragmentos F(ab')2 representaban sólo el 10% de la proteína producida, representando los fragmentos F(ab') el 90% (King et al., 1992; King et al., 1994). El motivo para esto no está claro. Otra línea celular importante en la producción de anticuerpos monoclonales es SP2/0; un intento de producir fragmentos F(ab')2 de IgG1 en esta línea celular produjo esencialmente sólo productos monovalentes. La adición de una bisagra de IgG3, que comprende 11 puentes de azufre en lugar de los dos puentes de azufre presentes en una bisagra de IgG1, dio como resultado la producción de producto divalente al 98% (Leung et al., 1999). Sin embargo, el aumento del número de puentes de azufre reduce generalmente los niveles de producción de los fragmentos de anticuerpo, y por tanto es preferible tener menos puentes de azufre para la producción a gran escala. Se observó una situación similar tras la expresión de fragmentos F(ab')2 en células COS (De Sutter et al., 1992). Por tanto, a pesar de estos esfuerzos, todavía existe una necesidad de métodos de producción mejorados de fragmentos F(ab')2.

PER.C6^{TM} es una línea celular humana y un ejemplo de una célula huésped eucariota primaria inmortalizada. Puede crecer en cultivo en suspensión en medio libre de suero, que tras la transfección con un vector de expresión apropiado y la selección de líneas celulares estables, puede producir proteína recombinante en abundancia, tal como se da a conocer en el documento WO 00/63403. En la solicitud '403 se dio a conocer que las células PER.C6^{TM} pueden expresar IgG humana intacta, pero no se proporcionaron datos específicos para los fragmentos F(ab')2.

En vista de lo anterior, todavía existe una necesidad de una plataforma de expresión recombinante que pueda producir tales fragmentos con un rendimiento suficiente sin algunas de las desventajas observadas con las plataformas de la técnica anterior.

Sumario de la invención

En el presente documento, se demuestra que las células PER.C6^{TM} pueden producir y secretar de manera más eficaz fragmentos F(ab')2 sin la necesidad de tomar medidas especiales dadas a conocer en la técnica anterior. El fragmento F(ab')2 así producido y secretado puede unirse a un antígeno tan eficazmente como la IgG intacta, mientras que el F(ab') monovalente se une de manera considerablemente menos eficaz. Más en particular, se descubrió que la línea celular PER.C6^{TM} y derivados de la misma, parecen ser menos adecuados para la producción de fragmentos bivalentes de moléculas de Ig y en los que los restos monovalentes que constituyen el fragmento bivalente de la molécula de Ig están unidos mediante uno o más enlaces disulfuro.

Por tanto, según la invención, se proporciona una célula huésped PER.C6 que comprende ácido nucleico que codifica para un fragmento de anticuerpo multimérico bivalente inmunológicamente activo, y/o un precursor del mismo, funcionalmente unido a secuencias que pueden dirigir la expresión de dichos fragmentos en dicha célula huésped cuando se cultiva dicha célula en condiciones que permiten dicha expresión. Según un aspecto preferido de la invención, el fragmento de anticuerpo multimérico bivalente inmunológicamente activo comprende un fragmento F(ab')2. La célula huésped proporcionada puede obtenerse a partir de una células una célula PER.C6^{TM}.

La invención también proporciona una célula PER.C6^{TM} que comprende ácido nucleico que codifica para un fragmento F(ab')2. En una realización preferida de la invención, la secuencia que dirige la expresión comprende una región de un promotor de CMV, más preferiblemente la región del promotor de CMV comprende el promotor/potenciador del gen de expresión precoz de CMV desde el nucleótido -735 hasta el +95.

La invención también proporciona una célula huésped PER.C6 que expresa y que secreta fragmentos de anticuerpo monovalentes y bivalentes, inmunológicamente activos, y/o precursores de los mismos, caracterizados porque la razón de fragmento de anticuerpo activo bivalente con respecto a fragmento de anticuerpo activo monovalente secretados por dicha célula huésped es de al menos 1:3, en la que las dos regiones de unión a antígeno de dicho fragmento de anticuerpo activo bivalente no están unidas mediante enlaces peptídicos.

La invención también proporciona un método de preparación de una célula huésped que puede producir un fragmento de anticuerpo multimérico bivalente inmunológicamente activo, comprendiendo el método: introducir en una célula PER.C6 una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para dicho fragmento de anticuerpo o un precursor del mismo operativamente unido a una secuencia que puede dirigir la expresión de dicha secuencia que codifica para dichos fragmentos de anticuerpo en dicha célula.

La invención también proporciona un método de producción de un fragmento de anticuerpo bivalente inmunológicamente activo, que comprende cultivar una célula huésped según la invención. En un aspecto, dicho método comprende además aislar y/o purificar dicho fragmento de anticuerpo bivalente inmunológicamente activo.

En un aspecto preferido, la región de dicho fragmento de anticuerpo bivalente inmunológicamente activo que está unida mediante puentes de azufre no se deriva de una IgG3. En el método según la invención, dicho fragmento de anticuerpo bivalente inmunológicamente activo preferiblemente comprende un fragmento F(ab')2.

La invención también proporciona un método para obtener fragmentos F(ab')2, comprendiendo dicho método: a) introducir en una célula PER.C6 una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho fragmento, o un precursor del mismo, operativamente unido a secuencias que pueden dirigir la expresión de dicha secuencia que codifica para dicho fragmento en dicha célula; b) cultivar dicha célula; mediante lo cual dicho fragmento se secreta a partir de dicha célula, en el que la razón de secreción de fragmentos F(ab')2 con respecto a F(ab') es de al menos 1:3; c) aislar y/o purificar dicho fragmento F(ab')2; caracterizado porque dicho método carece esencialmente de una etapa con proteasa.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona una célula huésped PER.C6, que comprende además ácido nucleico recombinante que codifica para un fragmento de anticuerpo multimérico bivalente inmunológicamente activo, y/o un precursor del mismo, funcionalmente unido a una o más secuencias que pueden dirigir la expresión de dicho fragmento en dicha célula huésped. También se proporcionan métodos de producción de un fragmento de anticuerpo bivalente inmunológicamente activo, que comprenden cultivar una célula huésped según la invención.

Célula huésped

Se conocen en la técnica células huésped para la producción de proteínas recombinantes. La célula huésped de la invención comprende secuencias de adenovirus E1, preferiblemente comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica para al menos una proteína E1 de un adenovirus o un homólogo, fragmento y/o derivado de la misma. Éstos pueden ser funcionales en la inmortalización de una célula primaria cuando se expresa en dicha célula. Dicha proteína E1 puede comprender la proteína E1A, que funciona en la transformación e inmortalización de la célula huésped. Además, puede expresarse la proteína E1B de adenovirus, lo que puede reprimir la apoptosis de la célula huésped. La célula huésped de la invención comprende al menos parte de la región E1 de un adenovirus, que comprende las secuencias E1A y E1B en formato expresable. La línea celular para su uso como célula huésped según la presente invención, PER.C6^{TM}, se obtuvo tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 5.994.128; tal como se describe en esa patente, se han depositado células PER.C6^{TM} en la ECACC con el número 96022940. Brevemente, se inmortalizaron retinoblastos embrionarios humanos mediante la introducción de la región E1 que comprende E1A y E1B de adenovirus, en los que el gen E1A está dirigido por el promotor PGK humano.

Inmunológicamente activo

Inmunológicamente activo según la invención significa que puede unirse selectivamente a un antígeno, definiéndose la unión selectiva como la unión con una afinidad (Kd) de al menos 5 * 10E4 litros/mol, más preferiblemente 5 * 10E5, más preferiblemente superior a 5 * 10E6, todavía más preferiblemente 5 * 10E7, o más. Normalmente, los anticuerpos monoclonales pueden tener afinidades que ascienden hasta 10E10 litros por mol, o incluso mayor.

Fragmento de anticuerpo multimérico bivalente

Las IgG normalmente tienen dos regiones Fab idénticas, es decir, dos regiones que se unen a antígeno, y por tanto, se dice que son bivalentes. Un fragmento de anticuerpo según la invención pretende definir una molécula, que retiene la función de unión pero que carece de la región que media las funciones efectoras. Por consiguiente, los fragmentos de anticuerpo según la invención carecen de al menos el dominio constante C-terminal de la cadena pesada, más preferiblemente los fragmentos de anticuerpo según la invención carecen de ambos dominios constantes C-terminales de la cadena pesada (C2 y C3). Un fragmento de anticuerpo bivalente según la invención es un fragmento, que comprende dos regiones de unión. Cada región de unión comprende una cadena ligera y un fragmento de cadena pesada, región de unión que puede existir como un dímero (es decir, el fragmento de cadena pesada y la cadena ligera se unen para formar un dímero) o como un monómero (por ejemplo, en un formato de cadena sencilla (scFv)). Los fragmentos de anticuerpo bivalentes según la invención son diméricos en el sentido de que las dos regiones de unión que constituyen el fragmento de anticuerpo bivalente se unen la una a la otra, aunque no mediante enlaces peptídicos. Las regiones de unión pueden dimerizarse de diferentes maneras, por ejemplo a través de uno o más puentes de S (puentes de azufre) dependientes de cisteína, tal como en las regiones bisagra unidas directamente a la región C1 de las dos cadenas pesadas. Los al menos dos sitios de unión a antígeno independientes pueden unirse ambos al mismo antígeno o unirse cada uno a diferentes antígenos. Los fragmentos de anticuerpo monovalentes como se entienden en la presente invención sólo tienen un sitio de unión a antígeno. Un ejemplo no limitativo de un fragmento de anticuerpo monovalente es un fragmento F(ab'). Las dos regiones de unión pueden ser o no idénticas, y pueden ser o no monoespecíficas, lo que significa que ambas regiones de unión reconocen el mismo epítopo con la misma afinidad, mientras que lo primero significa que puede reconocer el mismo epítopo con diferente afinidad o diferentes epítopos.

Un fragmento de anticuerpo dimérico bivalente preferido según la invención es un fragmento F(ab')2, que consiste en dos fragmentos F(ab') idénticos unidos el uno al otro a través de las regiones de bisagra de las cadenas pesadas mediante uno o normalmente dos puentes de azufre (figura 1).

Un fragmento de anticuerpo conjugado

Los fragmentos de anticuerpo producidos pueden marcarse o conjugarse con cualquier resto (radiomarcador o marcador fluorescente, toxina, proteína u otros agentes) de la misma manera que pueden marcarse los anticuerpos intactos. El marcaje también puede adoptar la forma de una generación de una proteína de fusión en la línea celular. Por tanto, los fragmentos de anticuerpo también pueden conjugarse con otros polipéptidos, en los que los conjugados o inmunoconjugados pretenden estar incluidos en esta invención. También es posible generar fragmentos biespecíficos, con sitios de unión a antígeno situados o bien N-terminales o C-terminales con respecto a la región bisagra.

Pueden usarse radiomarcadores tanto en la obtención de imágenes como en la terapia. Éstos pueden ser emisores de partículas alfa tales como bismuto-212 o astato-211; éstos tienen una energía muy elevada pero sólo un pequeño rango, de modo que los efectos circundantes son mínimos. Los emisores de partículas beta tienen un uso más común; éstos incluyen yodo-131, itrio-90 y renio-186, entre otros. Éstos tienen una menor energía de partícula pero un mayor rango, produciendo así potencialmente una muerte celular circundante en una masa tumoral. Además, pueden marcarse los anticuerpos con restos citotóxicos que destruyen la célula tumoral tras la internalización. Actualmente hay en el mercado un anticuerpo unido a una toxina bacteriana, calicheamicina (Mylotarg; Carter, 2001). Otro restos tóxicos incluyen maitansinoides (TAPs; ImmunoGen), así como inmunoliposomas cargados con agentes quimioterápicos, entre otros. La carga también puede ser cualquier número de proteínas, péptidos, fármacos o profármacos. También puede consistir en un resto al que puede unirse un agente terapéutico introducido posteriormente.

También existe la posibilidad de generar anticuerpos biespecíficos: un dominio de unión a antígeno puede unir una célula tumoral, el otro una proteína de la superficie celular de una célula efectora, induciendo así la destrucción de la célula diana. La homodimerización de fragmentos también puede producir proteínas con características antitumorales potenciadas.

Precursor de fragmento de anticuerpo

Las proteínas pueden estar codificadas por proteínas precursoras que requieren modificaciones peritraduccionales y/o postraduccionales antes de que se alcance la forma de la proteína madura. Se incluyen en la invención ácido nucleico que codifica para formas precursoras de los fragmentos de anticuerpo, así como las propias proteínas precursoras codificadas, incluyendo pero sin limitarse a preproteínas que contienen señales de secreción y similares. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para los fragmentos de interés pueden comprender o no intrones. De manera similar, puede ser un ADNc o ácido nucleico similar a ADNc, o un fragmento genómico, o combinaciones de los mismos.

Secuencias que pueden dirigir la expresión

Para obtener la expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican para fragmentos de anticuerpo o precursores de los mismos, se sabe bien por los expertos en la técnica que las secuencias que pueden dirigir tal expresión tienen que estar funcionalmente (también denominado operativamente) unidas a las secuencias de ácido nucleico que codifican para los fragmentos de anticuerpo o precursores de los mismos. Funcionalmente unidas pretende describir que las secuencias de ácido nucleico que codifican para los fragmentos de anticuerpo o precursores de los mismos están unidas a las secuencias que pueden dirigir la expresión de tal manera que estas secuencias pueden dirigir la expresión de los anticuerpos o precursores de los mismos. Funcionalmente unidas incluye pero no se limita a una unión directa. Un ejemplo no limitativo de unión funcional se encuentra, por ejemplo, en los casetes de expresión. Las secuencias que dirigen la expresión pueden incluir promotores, potenciadores y similares, y combinaciones de los mismos. Obviamente, éstos deben poder funcionar en la célula huésped, dirigiendo así la expresión de las secuencias de ácido nucleico que están funcionalmente unidas a ellos. Los promotores pueden ser constitutivos o estar regulados, y pueden obtenerse de diversas fuentes, incluyendo virus, fuentes procariotas o eucariotas o diseñarse artificialmente. Estas secuencias de ácido nucleico pueden obtenerse mediante técnicas convencionales que se conocen bien en la técnica. La expresión de ácido nucleicos de interés puede ser a partir del promotor natural o derivado del mismo o a partir de un promotor completamente heterólogo. Algunos promotores bien conocidos y usados mucho comprenden promotores derivados de virus, tales como adenovirus, tales como el promotor E1A de adenovirus, promotores derivados de citomegalovirus (CMV), tal como el promotor de expresión precoz (IE, immediate early) de CMV, o derivados de células eucariotas, tales como promotores de metalotioneína (MT), promotor del factor de elongación 1\alpha (EF-1\alpha) promotor. Por tanto, cualquier promotor o potenciador/promotor que pueda dirigir la expresión de la secuencia de interés en la célula huésped es adecuado en la invención. En una realización preferida, la secuencia que puede dirigir la expresión comprende una región de un promotor de CMV, más preferiblemente la región que comprende los nucleótidos -735 a +95 del promotor/potenciador del gen de expresión precoz de CMV (CMVlong en la figura 2). Esta región comprende un potenciador muy fuerte (Boshart et al, 1985). Se ha descubierto que este CMVlong funciona particularmente bien, dando como resultado una expresión varias veces mayor en comparación con el uso del promotor regular, más corto de CMV tal como está presente, por ejemplo, en los plásmidos pcDNA3.1 (Invitrogen).

Se realiza el cultivo de una célula para permitir que se metabolice, y/o crezca y/o se divida. Esto puede lograrse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluye pero no se limita a proporcionar nutrientes para la célula. Los métodos comprenden el crecimiento con adhesión a superficies, crecimiento en suspensión, o combinaciones de los mismos. Pueden optimizarse varias condiciones de cultivo mediante métodos bien conocidos en la técnica para optimizar los rendimientos de producción de proteínas. Puede realizarse el cultivo, por ejemplo, en placas, frascos rotativos o en biorreactores, usando sistemas discontinuos, de alimentación discontinua o continuos, métodos con fibra hueca u otros, pretendiéndose que todos estén incluidos en la invención. Con el fin de lograr la producción a gran escala (continua) de proteínas recombinantes a través del cultivo celular, se prefiere en la técnica tener células que pueden crecer en suspensión, y se prefiere tener células que pueden cultivarse en ausencia de suero derivado de animales o seres humanos o componentes de suero derivado de animales o seres humanos. Por tanto, el aislamiento es más sencillo y se potencia la seguridad debido a la ausencia de proteínas animales o humanas adicionales derivadas del medio de cultivo, mientras que el sistema es también muy fiable ya que los medios sintéticos son los mejores en cuanto a reproducibilidad.

En una realización preferida de la invención, un fragmento de anticuerpo multimérico bivalente inmunológicamente activo es un fragmento F(ab')2. Por tanto, se ha encontrado hasta ahora que la expresión de tales fragmentos en células eucariotas es problemático, ya que la mayoría de los fragmentos F(ab') se produjeron en los sistemas descritos. Se proporciona en el presente documento una célula huésped eucariota primaria inmortalizada que puede expresar tales fragmentos F(ab')2 de manera funcional en cantidades significativas.

Las células huésped que pueden obtenerse a partir de las células mencionadas se derivan de las células mencionadas, por ejemplo, introduciendo secuencias de ácido nucleico en las células mencionadas. Esto puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica para introducir un ácido nucleico en células, tal como, por ejemplo, transfección, lipofección, electroporación, infección viral, y similares. El método usado para introducir secuencias de ácido nucleico en células no es crítico para la presente invención. Dicho ácido nucleico puede estar presente en las células de manera extracromosómica o estar integrado de manera estable en el genoma de dichas células. Dichas células pueden dirigir la expresión de manera transitoria, pero preferiblemente dichas células pueden dirigir la expresión de manera estable. Alternativamente, la expresión puede estar regulada.

PER.C6^{TM} es una línea celular humana que puede expresar proteínas de manera sumamente reproducible, ampliable a escala, tal como se da a conocer en el documento WO 00/63403. Esta invención da a conocer que las células PER.C6^{TM} pueden producir fragmentos de anticuerpo multiméricos bivalentes inmunológicamente activos cuando está presente ácido nucleico que codifica para tales fragmentos funcionalmente unidos a secuencias que pueden dirigir la expresión de dichos fragmentos en las células. Por tanto, según la invención, la célula huésped puede obtenerse a partir de una célula PER.C6^{TM}.

También se han inmortalizado células 293 humanas transformadas (de origen de riñón embrionario, células también conocidas como células HEK293) mediante la región E1 de adenovirus (Graham et al., 1977), pero las células PER.C6^{TM} se comportan mejor en la manipulación que dichas células 293. Las células PER.C6^{TM} se han caracterizado y documentado extensamente, aunque se comportan significativamente mejor en la ampliación a escala, crecimiento en suspensión e independencia del factor de crecimiento. Especialmente el hecho de que las células PER.C6^{TM} pueden ponerse en suspensión de manera sumamente reproducible, las hace muy adecuadas para la producción a gran escala.

Otra ventaja de la presencia del ácido nucleico de la región E1 de adenovirus en comparación con células que carecen de esta secuencia en la invención es que se sabe que E1A de adenovirus como activador transcripcional potencia la transcripción de ciertos promotores, incluyendo el potenciador/promotor IE de CMV (Gorman et al., 1989; Olive et al., 1990). Por tanto, cuando la proteína recombinante que va a expresarse está bajo el control del potenciador/promotor de CMV, como en una de las realizaciones preferidas de la invención, aumentan los niveles de expresión de la proteína recombinante en las células que comprenden E1A.

Los fragmentos de anticuerpo multiméricos bivalentes inmunológicamente activos pueden unirse a cualquier diana antigénica seleccionada. Se conocen bien en la técnica métodos para identificar tales dianas y descubrir anticuerpos o fragmentos de anticuerpo frente a tales dianas. Preferiblemente, los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo son de origen humano, pero obviamente los fragmentos de anticuerpo o anticuerpos puede ser también de otros orígenes. Como ejemplo, la presente invención da a conocer la producción de fragmentos F(ab')2 que se unen selectivamente a vitronectina activada.

Puede producirse un fragmento de anticuerpo bivalente inmunológicamente activo, puesto como ejemplo con un fragmento F(ab')2, de varias maneras, pero tal como se trató, existe todavía una necesidad de métodos de producción mejorados de fragmentos F(ab')2. Sería particularmente útil que se encontraran células huésped eucariotas y métodos para la producción de tal fragmento que se caracterizaran por razones mejoradas de fragmentos F(ab')2 con respecto a fragmentos F(ab') producidos, o razones generalmente mejoradas de fragmentos de anticuerpo inmunológicamente activos bivalentes frente a los monovalentes. Por tanto, la presente invención proporciona por primera vez una célula huésped que expresa y que secreta un fragmento de anticuerpo monovalente y bivalente inmunológicamente activo, y/o un precursor del mismo, caracterizado porque la razón de fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo bivalente con respecto a fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo monovalente secretados por dicha célula huésped es de al menos 3:1, en la que las dos regiones de unión a antígeno de dicho fragmento de anticuerpo activo bivalente no están unidas mediante enlaces peptídicos. El experto entenderá que son preferibles razones mayores. Se da a conocer un ejemplo en el que esta razón es incluso superior a 3:1 en la presente invención.

Según la invención, se mostró que es posible producir de manera recombinante fragmentos de anticuerpo multiméricos bivalentes y fragmentos de anticuerpo monovalentes en una razón de al menos 1:3. Se ha descrito que el uso de una región bisagra que se deriva de IgG3 en fragmentos F(ab')2 da como resultado mejores razones de fragmentos F(ab')2 con respecto a F(ab') en comparación con una región bisagra derivada de IgG1 (Leung et al., 1999). Esto se debe probablemente al alto número de puentes de azufre (11 posibles puentes de azufre) que unen las dos regiones de unión a anticuerpo en una bisagra de IgG3. Sin embargo, el aumento del número de puentes de azufre generalmente disminuye los niveles de producción de los fragmentos de anticuerpo, y por tanto, es preferible tener menos puentes de azufre para la producción a gran escala. Esta invención proporciona una célula huésped y métodos que pueden expresar fragmentos de anticuerpo monovalentes y bivalentes inmunológicamente activos, de los que las dos regiones de unión a antígeno están unidas mediante sólo unos cuantos puentes de azufre, en una razón mucho mejor que la conseguida con las células huésped y los métodos descritos hasta ahora. Por tanto, en otra realización de la invención, las dos regiones de unión a antígeno de dichos fragmentos de anticuerpo monovalentes y bivalentes inmunológicamente activos están unidas mediante de uno a diez ten puentes de azufre, más preferiblemente mediante uno o dos puentes de azufre. Según un aspecto preferido, dichos fragmentos bivalentes inmunológicamente activos son fragmentos F(ab')2.

Puede realizarse el cultivo de las células de la invención según una variedad de formas, generalmente conocidas y descritas en la técnica. Puede realizarse una optimización de las condiciones de cultivo para mejorar los rendimientos de los fragmentos de anticuerpo producidos y para mejorar la razón de fragmentos de anticuerpo multiméricos inmunológicamente activos con respecto a los monovalentes secretados. Tal optimización puede incluir, pero no se limita a, los medios de crecimiento y aditivos, temperatura de cultivo, tiempo de crecimiento y fases de producción, tipo y volumen del biorreactor o placa de cultivo, y similares. Preferiblemente, se usan medios de crecimiento que carecen de suero derivado de animales o seres humanos o componentes de suero derivado de animales o seres humanos, tales como por ejemplo, medio ExCell 525 (JRH). Los medios de cultivo definidos son sumamente controlables e imponen menos cuestiones de seguridad y alta reproducibilidad. También son sumamente beneficiosos para etapas de procesamiento aguas abajo, cuando van a aislarse las proteínas o fragmentos de proteína deseados.

En una realización preferida de la invención, dichos fragmentos de anticuerpo inmunológicamente activos se aíslan y/o purifican. Puede usarse cualquier etapa que mejore la razón del producto deseado con respecto a cualquier subproducto para lograr esto, y pretende estar incluido en la invención. Se conocen muchos métodos en la técnica para aislar y/o purificar, y algunos ejemplos no limitativos son filtración, centrifugación, cromatografía, incluyendo por ejemplo cromatografía de afinidad, interacción hidrófoba, fraccionamiento por tamaños, intercambio aniónico, intercambio catiónico, y similares. En el ejemplo, se realiza el fraccionamiento por tamaños para separar los fragmentos F(ab')2 de los F(ab').

Los fragmentos de anticuerpo bivalentes inmunológicamente activos, puestos como ejemplo con los fragmentos F(ab')2, pueden producirse mediante digestión con proteasa (por ejemplo, pepsina) de anticuerpos completos, pero tal como se trató este método tiene varias desventajas. En el presente documento, se proporciona un método que puede producir grandes cantidades de fragmentos de anticuerpo bivalentes funcionales sin el uso de etapas con proteasa.

Es otro aspecto de la presente invención proporcionar fragmentos F(ab')2 que pueden obtenerse mediante la expresión de dichos fragmentos en una célula derivada de una célula PER.C6^{TM}. Tales fragmentos F(ab')2 pueden obtenerse de manera eficaz en cantidades elevadas.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una preparación en bruto de un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, que puede obtenerse mediante los métodos según la invención. Una preparación en bruto puede incluir el medio de cultivo usado para cultivar las células, y cualquier preparación que comprenda los fragmentos de anticuerpo inmunológicamente activos en algún momento en el proceso de purificación del material deseado. En una realización preferida, dichos fragmentos de anticuerpo inmunológicamente activos comprenden fragmentos
F(ab')2 y F(ab'). En otro aspecto preferido de la invención, se proporcionan fragmentos F(ab')2 que pueden obtenerse separando los fragmentos F(ab')2 de los fragmentos F(ab') en la preparación en bruto. Puede realizarse la separación según cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de afinidad, intercambio aniónico y/o catiónico, centrifugación, filtración. Estará claro para el experto que los métodos de separación basados en la masa o el tamaño de los fragmentos son particularmente útiles para este fin.

También están incluidas como un aspecto de la invención composiciones farmacéuticas que comprenden un fragmento de anticuerpo inmunológicamente activo, preferiblemente un fragmento F(ab')2, según la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir o no vehículos para la administración del material deseado a seres humanos o animales. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, sales, azúcares, proteínas, lípidos. La administración de las composiciones farmacéuticas puede realizarse de una variedad de formas, que no son críticas para la presente invención. Un ejemplo no limitativo para el uso de composiciones farmacéuticas según la presente invención comprende la administración de un fragmento F(ab')2 con una especificidad deseada en forma de una composición farmacéutica a un ser humano para fines de obtención de imágenes, por ejemplo para localizar un tumor al que se une selectivamente dicho fragmento F(ab')2. También es posible la administración de fragmento F(ab')2 que puede producirse según la invención para fines terapéuticos.

Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos. Se clonó ADN que codificaba para un anticuerpo completo así como los fragmentos de anticuerpo que constituían un fragmento F(ab')2 dirigidos frente a vitronectina activada y se expresó en células PER.C6^{TM}, se mostró expresión y tras purificación, se mostró la actividad de unión a vitronectina de las proteínas resultantes.

Ejemplo 1 Construcción de vectores de expresión

Se generó un plásmido de expresión que codifica para las cadenas tanto ligeras como pesadas de un anticuerpo IgG1 que reconoce vitronectina activada (tal como se da a conocer en el documento EP 1130099). Se aisló en primer lugar el ADN que codificaba para la región de unión a antígeno de este anticuerpo a partir de una biblioteca de presentación en fago de scFv y se añadieron una secuencia líder y regiones constantes antes de la clonación en el vector de expresión pcDNA3002(Neo) (figura 2). El vector de expresión pcDNA3002(Neo) se deposita el 13 de diciembre de 2001 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el número 01121318. El plásmido resultante es pVN18LcvHcv (figura 3), que se deposita el 13 de diciembre de 2001 en la ECACC con el número 01121320. Además, se construyó un plásmido que contiene una cadena ligera intacta y una cadena pesada que está truncada inmediatamente después del último codón traducido de la región bisagra. Éste estaba seguido por una secuencia que codificaba para una cola de 6 histidinas y luego un codón de terminación. Este plásmido, pVN18LcvHcvHis, puede expresar un fragmento F(ab')2 (figura 3), y se deposita el 13 de diciembre de 2001 en la ECACC con el número 01121319. También se ha generado un plásmido adicional para la producción de F(ab')2 que no contiene la secuencia que codifica para una cola de His. Se realizaron los procedimientos esencialmente tal como se describen en Sambrook y Russell, 2001.

Generación de pVN18LcvHcv y pVN18LcvHcvHis

Se aislaron las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo anti-vitronectina a partir de una biblioteca de presentación en fago. Éstas se clonaron por separado en vectores mientras que también se añadieron secuencias líder (señal) en los extremos N-terminales, y regiones constantes en los extremos C-terminales de las dos cadenas, dando como resultado los plásmidos VL VN18 y VH VN18 que comprenden la cadena ligera y pesada, respectivamente. La cadena ligera de la IgG anti-vitronectina es un tipo kappa de cadena. Ésta estará presente en ambos plásmidos de expresión y así se insertó en primer lugar en pcDNA3002(Neo). Se usó el plásmido VL VN18 como molde para PCR de la cadena ligera kappa y para incluir sitios de restricción convenientes (para los procedimientos de clonación molecular generales, véase por ejemplo Sambrook y Russel, 2001).

: Oligo E001: CCTGGCGC\scur{GCC}\underline{ACC}\sneg{ATG}\underline{G}CATGCCCTGGCTTCCTGTGG

Esto es homólogo al inicio de la secuencia traducida. El codón de iniciación está en negrita; la secuencia Kozak está subrayada; el sitio AscI usado para la clonación está en cursiva.

: Oligo E002: CCGGGTTAA CTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC

Esto es homólogo a la hebra no codificante al final de la secuencia traducida. El codón de terminación está en negrita; el sitio HpaI usado para la clonación está en cursiva.

Usando estos oligonucleótidos, se amplificó la cadena ligera usando Pwo polimerasa como fragmento de 1,3 kb, se digirió con AscI y HpaI y se ligó en pcDNA3002(Neo) digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante es pVN18Lcv (no mostrado).

Entonces se insertaron dos formas de la cadena pesada en este plásmido para generar o bien la molécula de IgG1 intacta o bien el fragmento F(ab')2. Se usó el plásmido VH VN18 como molde para la amplificación por PCR.

Para la producción de la IgG1 intacta, se usaron los siguientes oligonucleótidos:

: E003: GGAGGATCC\underline{GCCACC}\sneg{ATG}\underline{G}CATGCCCTGGCTTCCTGTGG

Esto es homólogo al inicio de la secuencia traducida. El codón de iniciación está en negrita; la secuencia Kozak está subrayada; el sitio BamHI usado para la clonación está en cursiva.

: E004: GGATGGCTAGC TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG

Esto es homólogo a la hebra no codificante al final de la secuencia traducida. El codón de terminación está en negrita; el sitio NheI usado para la clonación está en cursiva.

Usando estos oligonucleótidos, se amplificó la cadena pesada usando Pwo polimerasa como fragmento de 2,2 kb, se digirió con BamHI y NheI y se ligó en pVN18Lcv digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante es pVN18LcvHcv.

Para la generación del fragmento F(ab')2 con cola de His, se usaron los siguientes oligonucleótidos para someter a PCR el fragmento de cadena pesada a partir de VH VN18:

: E005: GATGGCTAGC TCA\underline{ATGGTGATGGTGATGATG}TGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTT

Esto es homólogo a la hebra no codificante al final de la secuencia traducida. El codón de terminación está en negrita; el sitio NheI usado para la clonación está en cursiva y la secuencia codificante para los seis residuos de histidina que forman la cola de His está subrayada. Por tanto, la secuencia de aminoácidos en el extremo terminal de la cadena pesada es:

: GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProHisHisHisHisHisHis-terminación

Usando estos oligonucleótidos, se amplificó el fragmento de cadena pesada a partir del plásmido VH VN18 como fragmento de 1,3 kb usando Pwo polimerasa, se digirió con BamHI y NheI y se ligó en pVN18Lcv digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante es pVN18LcvHcvHis.

Las secuencias de las regiones que codifican para el anticuerpo se muestran en las figuras 8 - 10.

Ejemplo 2 Transfección de líneas celulares PER.C6^{TM} y producción de fragmentos F(ab')2

Se transfectaron células o bien con pVN18LcvHcv o bien con pVN18LcvHcvHis mediante un método basado en lipofectamina. En resumen, se sembraron células PER.C6^{TM} a 3,5 x 10^{6} células por placa de cultivo tisular de 96 mm. Para cada placa, se mezclaron 2 \mug de ADN de plásmido con 10 \mul de lipofectamina (Gibco); esto se añadió a las células en medio DMEM libre de suero (volumen total de 7 ml) y se incubaron durante 5 horas. Esto se sustituyó entonces por medio completo. Al día siguiente (y durante las 3 que siguieron) se hicieron crecer las células en DMEM en presencia de Geneticin (G418) 0,5 mg/ml para seleccionar los clones que se transfectaron de manera estable con el plásmido. Se seleccionaron los clones que secretaban altos niveles de anticuerpo monoclonal en el sobrenadante del cultivo celular mediante un ensayo de ELISA. En resumen, se recubrieron los pocillos de una placa de 96 pocillos con anticuerpo producido frente a la cadena ligera kappa de Ig. Tras el bloqueo con una disolución láctea, se añadieron muestras a los pocillos con diluciones variables y se incubaron durante 1 hora. Tras el lavado, se aplicó el anticuerpo de detección (anti-IgG marcado con biotina) durante 30 minutos. Tras una etapa de lavado adicional, éste se detectó mediante la adición de peroxidasa de rábano-estreptavidina, seguido por un lavado final y la adición del sustrato diclorhidrato de O-fenilendiamina. Se determinó la concentración de anticuerpo comparando la densidad óptica a 492 nm con la de un patrón de anticuerpo conocido.

Se seleccionaron los clones de producción superior de cada transfección (IgG o F(ab')2) para su análisis adicional. Éstos fueron:

IgG intacta:: clones 125 y 243

F(ab')2:: clones 118 y 195

Se realiza la producción de anticuerpos en medio libre de suero. Por tanto, se lavaron las células adherentes en matraces de cultivo tisular con PBS, luego se añadió medio ExCell 525 (JRH) y se incubaron las células durante 4 días más para permitir que se acumulara el anticuerpo secretado en el medio de cultivo celular. Se sometió a electroforesis una muestra del medio en SDS-PAGE reductora (figura 4). Las cadenas ligeras y pesadas que comprenden el anticuerpo secretado, intacto son las especies proteicas predominantes. La cadena pesada truncada del fragmento F(ab')2 está presente a una concentración menor que cualquiera de la cadena ligera o la cadena pesada intacta de IgG. Entonces se purificó el material: la IgG intacta sobre una columna de proteína A y los fragmentos F(ab')2 sobre una columna de proteína L (la proteína L se une a las cadenas ligeras kappa). Se dializó el material purificado en PBS y luego se analizó mediante filtración en gel en una columna HiLoad 16/60 Superdex 200. Los resultados de la filtración en gel para el clon 243 (IgG intacta) y 118 (F(ab')2) se muestran en la figura 5. Los resultados son idénticos a los observados para el clon 125 (IgG) y el clon 195 (F(ab')2) para los que no se muestran datos. La IgG intacta discurre como un único pico con un tiempo de elución de 67,18 (tal como se espera para una proteína de 150 kDa). El fragmento F(ab')2 discurre como dos picos principales; los tiempos de elución sugieren que el primero es F(ab')2 y el segundo es F(ab'). Esto se confirmó mediante electroforesis sobre SDS-PAGE no reductora (figura 5). Las posteriores purificaciones indicaron que la razón de F(ab')2:F(ab') con frecuencia es mejor. Esto se muestra en la figura 6, de nuevo para el clon 118, en el que los porcentajes de F(ab')2 y F(ab') son del 76% y el 22%, respectivamente. También se obtuvieron resultados simulares con las construcciones que carecían de una cola de His. Se determinó la eficacia de unión a antígeno para la IgG intacta, F(ab')2 y F(ab'). Se produjo el anticuerpo descrito anteriormente frente a vitronectina activada, así, se purificó vitronectina de esta forma (Yatohgo et al., 1988) y se unió a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Tras un análisis de ELISA, el material de IgG y F(ab')2 de dos clones diferentes se unió de manera igualmente eficaz mientras que el material de F(ab') se unió a la vitronectina de manera aproximadamente 100 veces menos eficaz (figura 7). Esto indica que el F(ab')2 producido mediante este método no se une, de hecho, al antígeno con igual avidez que la IgG divalente intacta.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. IgG intacta (izquierda) y fragmento F(ab')2 de IgG (derecha). Las regiones variables son claras, las regiones constantes son oscuras. Los enlaces disulfuro están marcados en negro.

Figura 2. Vectores de expresión.

Figura 3. Vectores para la expresión de IgG intacta o fragmento F(ab')2 de IgG.

Figura 4. SDS-PAGE reductora del sobrenadante del cultivo celular de clones que producen IgG intacta y fragmento F(ab')2. A: clon 243 IgG, B: clon 125 IgG, C: clon 195 F(ab')2, D: clon 118 F(ab')2

Figura 5. Análisis por filtración en gel y SDS-PAGE no reductora de muestras purificadas de material de IgG y
F(ab')2. Se indican los tiempos de elución sobre los picos.

Figura 6. Ejemplo adicional de filtración en gel del material de F(ab')2. Se indican los volúmenes de elución sobre los picos; F(ab')2 (72,89 min.) representa el 76% del material; F(ab') (85,01 min.) representa el 22% de material.

Figura 7. Unión a antígeno de IgG intacta (clones 243 y 125), F(ab')2 y F(ab') (clones 118 y 195). F(ab') se une a vitronectina de manera aproximadamente 100 veces menos eficaz de lo que lo hace IgG y F(ab')2.

Figura 8. Secuencia de ADN completa que codifica para la cadena ligera de la IgG1 anti-vitronectina (esta secuencia es idéntica tanto en pVN18LcvHcv como en pVN18LcvHcvHis).

Figura 9. Secuencia de ADN completa que codifica para la cadena pesada completa de la IgG1 anti-vitronectina.

Figura 10. Secuencia de ADN completa que codifica para el fragmento de la cadena pesada truncada (F(ab')2) de la IgG1 anti-vitronectina, con la secuencia de la cola de His subrayada.

Bibliografía

Behr T, Becker W, Hannappel E, Goldenberg DM, Wolf F. (1995). Targeting of liver metastases of colorectal cancer with IgG, F(ab')2, and Fab' anti-carcinoembryonic antigen antibodies labeled with 99mTc: the role of metabolism and kinetics. Cancer Res 55(Supl. 23), 5777s-5785s.

Borrebaeck, C.A.K. y Carlsson, R. (2001). Human therapeutic antibodies. Curr. Op. Pharmacol. 1, 404-408.

Boshart, W, Weber, F, Jahn G, Dorsch-Hasler K, Fleckenstein B, Schaffner W (1985). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell 41, 521-530.

Carter, P. (2001). Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. Nature Reviews: Cancer 1, 118-129.

De Sutter K, Feys V, Van de Voorde A, Fiers W. (1992). Production of functionally active murine and murine::human chimeric F(ab')2 fragments in COS-1 cells. Gene 113, 223-30

George, A.J.T. y Urch, C.E. (2000). Diagnostic and therapeutic antibodies. Pub. Humana Press.

Gorman CM, Gies D, McCray G, Huang M. (1989). The human cytomegalovirus major immediate early promoter can be transactivated by adenovirus early proteins. Virology 171, 377-385.

Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-72.

Humphreys, D.P., Vetterlein, O.M., Chapman, A,P., King, D.J., Antoniw, P., Suitters, A.J., Reeks, D.G., Parton, T.A.H., King, L.M., Smith, B.J., Lang, V. y Stephens, P.E. (1998). F(ab')2 molecules made from Escherichia coli produced Fab' with hinge sequences conferring increase serum survival in an animal model. J. Imm. Methods 217, 1-10.

King DJ, Adair JR, Angal S, Low DC, Proudfoot KA, Lloyd JC, Bodmer MW, Yarranton GT. (1992). Expression, purification and characterization of a mouse-human chimeric antibody and chimeric Fab' fragment. Biochem J. 281, 317-23.

King DJ, Turner A, Farnsworth AP, Adair JR, Owens RJ, Pedley RB, Baldock D, Proudfoot KA, Lawson AD, Beeley NR, et al. (1994). Improved tumor targeting with chemically cross-linked recombinant antibody fragments. Cancer Res. 154, 6176-85.

Leung, S., Qu, Z., Hansen, H., Shih, L., Wang, J., Losman, M., Goldenberg, D., Sharkey, R. (1999). The effects of domain deletion, glycosylation, and long IgG3 hinge on the biodistribution and serum stability properties of a humanized IgG1 immunoglobulin, hLL2, and its fragments. Clinical Cancer Research vol. 5, 3106s - 3117s.

Olive DM, Al-Mulla W, Simsek M, Zarban S, al-Nakib W. (1990). The human cytomegalovirus immediate early enhancer-promoter is responsive to activation by the adenovirus-5 13S E1A gene. Arch. Virol. 112, 67-80.

Park, J.W. y Smolen, J. (2001). Monoclonal antibody therapy. Adv. Prot. Chem. 56, 369-421.

Sambrook, J. y Russell, D.W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Pub. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Tutt, A.L., French, R.R., Illidge, T.M., Honeychurch, J., McBride, H.M., Penfold, C.A., Fearon, D.T., Parkhouse, R.M.E., Klaus, G.G.B. y Glennie, M.J. (1998). Monoclonal antibody therapy of B cell lymphoma: signalling activity on tumour cells appears more important than recruitment of effectors. J. Immunol. 161, 3176-3185.

Willuda J, Kubetzko S, Waibel R, Schubiger PA, Zangemeister-Wittke U, Pluckthun A., (2001). Tumor targeting of mono-, di-, and tetravalent anti-p185(HER-2) miniantibodies multimerized by self-associating peptides. J Biol Chem. 276, 14385-92.

Yokota T, Milenic DE, Whitlow M, Schlom J. 1992. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res. 52, 3402-3408.

Zapata G, Ridgway JB, Mordenti J, Osaka G, Wong WL, Bennett GL, Carter P. (1995). Engineering linear
F(ab')2 fragments for efficient production in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity. Protein Eng. 8, 1057-62.

Claims

1. Una célula PER.C6 tal como la depositada en la ECACC con el número 96022940 para la expresión recombinante de un fragmento F(ab')2, comprendiendo además dicha célula ácido nucleico recombinante que codifica un fragmento F(ab')2, funcionalmente unido a una o más secuencias promotoras y/o potenciadoras.

2. Célula según la reivindicación 1, en la que la una o más secuencias promotoras y/o potenciadoras comprenden una región de un promotor de CMV.

3. Célula según la reivindicación 2, en la que la región de un promotor de CMV comprende el potenciador/promotor del gen de expresión precoz de CMV desde el nucleótido -735 hasta el +95.

4. Un método para producir un fragmento F(ab')2, comprendiendo el método:

a) proporcionar una célula PER.C6 tal como la depositada en la ECACC con el número 96022940, comprendiendo además dicha célula ácido nucleico recombinante que codifica un fragmento F(ab')2, y/o un precursor del mismo, funcionalmente unido a una o más secuencias promotoras y/o potenciadoras;

b) cultivar dicha célula;

mediante lo cual dicho fragmento F(ab')2 se secreta a partir de dicha célula.

5. Método según la reivindicación 4, que comprende además:

c) aislar y/o purificar dicho fragmento F(ab')2.

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, en el que las dos regiones de unión a antígeno de dicho fragmento F(ab')2 están unidas mediante al menos uno y no más de diez puentes de azufre.

7. Método según la reivindicación 6, en el que las dos regiones de unión a antígeno de dicho fragmento F(ab')2 están unidas mediante uno o dos puentes de azufre.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que la región de dicho fragmento F(ab')2 que está unida mediante dichos puentes de azufre no se deriva de una IgG3.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, que comprende además formular el fragmento F(ab')2 en una composición farmacéutica.