ES2308376T3 - Proceso de proteccion contra el arrastre en los sistemas de amplificacion del dna dirigido al analisis de la metilacion realizado por un pretratamiento modificado de los acidos nucleicos. - Google Patents

Proceso de proteccion contra el arrastre en los sistemas de amplificacion del dna dirigido al analisis de la metilacion realizado por un pretratamiento modificado de los acidos nucleicos. Download PDF

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Abstract

Un método para proporcionar un ácido nucleico descontaminado adecuado para análisis de metilación del DNA, caracterizado por a) incubar un ácido nucleico con una solución que contiene reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan y/o se desaminan, pero en donde no tiene lugar reacción de desulfonación alguna, y b) añadir a esta mezcla una enzima, que degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado y no degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilo sulfonado, e incubar la mezcla, con lo cual los ácidos nucleicos que contienen uracilos no sulfonados se degradan.

Description

Proceso de protección contra el arrastre en los sistemas de amplificación del DNA dirigido al análisis de la metilación realizado por un pretratamiento modificado de los ácidos nucleicos.
En las últimas décadas, los estudios en biología molecular han CONCENTRADO SU ATENCIÓN fundamentalmente en los genes, la transcripción de dichos genes en RNA, y la traducción del RNA en proteínas. Se ha registrado un análisis más limitado de los mecanismos reguladores asociados con el control génico. La regulación génica, por ejemplo, en qué etapa del desarrollo del individuo se activa o inhibe un gen, y la naturaleza específica de tejido de esta regulación, está menos comprendida. Sin embargo, la misma puede correlacionarse con un alto grado de probabilidad con la extensión y naturaleza de la metilación del gen o genoma. Tipos específicos de células pueden correlacionarse con patrones de metilación específicos, y esto ha sido demostrado en varios casos (Adorjan et al. (2002) Tumour Class Prediction and Discovery by Microarray-Based DNA Methylation Analysis. Nucleic Acids Res. 30(5) e21).
En los eucariotas de orden superior, el DNA está metilado casi exclusivamente en las citosinas localizadas 5' respecto a guanina en el dinucleótido CpG. Esta modificación tiene efectos reguladores importantes en la expresión génica, en especial cuando implica áreas ricas en CpG, conocidas como islas CpG, localizadas en las regiones promotoras de muchos genes. Si bien prácticamente la totalidad de las islas asociadas a genes están protegidas contra la metilación en los cromosomas autosómicos, se ha asociado una metilación extensa de las islas CpG con la desactivación transcripcional de genes seleccionados grabados y genes en el cromosoma X inactivo de las hembras.
La modificación de la citosina en forma de metilación contiene información importante. Es evidente que la identificación de 5-metil-citosina en una secuencia de DNA en la posición a la citosina no metilada es de la máxima importancia para analizar su papel ulteriormente. No obstante, dado que la 5-metilcitosina se comporta exactamente como una citosina en lo que concierne a su preferencia de hibridación (una propiedad a considerar en el análisis de la secuencia) su posición no puede identificarse por una reacción de secuenciación normal.
Adicionalmente, en cualquier amplificación, tal como una amplificación PCR, esta importante información epigenética, citosina metilada o citosina no metilada, se perderá completamente.
Se conocen varios métodos que resuelven este problema. Usualmente se trata el DNA genómico con un producto químico o una enzima que conduce a una conversión de las bases citosina, que permite consiguientemente diferenciar las bases después de ello. Los métodos más comunes son a) el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación capaces de diferenciar entre DNA metilado y no metilado, y b) el tratamiento con bisulfito. El uso de dichas enzimas es limitado debido a la selectividad de la enzima de restricción para una secuencia de reconocimiento específica.
Por esta razón, el "tratamiento con bisulfito", que permite la reacción específica de bisulfito con citosina, que, en la hidrólisis alcalina subsiguiente, se convierte en uracilo, mientras que la 5-metilcitosina queda inalterada en estas condiciones (Shapiro et al. (1970) Nature 227:1047 es en la actualidad el método utilizado más frecuentemente para analizar DNA respecto a 5-metilcitosona. El uracilo corresponde a la timina en su comportamiento de apareamiento de bases, es decir que se hibrida a la adenina; mientras que la 5-metilcitosina no cambia sus propiedades químicas en este tratamiento y por consiguiente tiene todavía el comportamiento de apareamiento de bases de una citosina, que se hibrida con guanina. Por consiguiente, el DNA original se convierte de tal manera que la 5-metilcitosina, que originalmente no podría distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, puede detectarse ahora como la única citosina remanente utilizando técnicas de biología molecular "normales", por ejemplo, amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas están basadas en el apareamiento de bases, que puede aprovecharse ahora plenamente. La comparación de las secuencias del DNA con y sin tratamiento con bisulfito, permite una identificación fácil de dichas citosinas que no se han metilado.
Una revisión de los métodos conocidos adicionalmente de detección de 5-metilcitosina puede encontrarse en el artículo revisado siguiente: Fraga FM, Esteller M, Biotechniques 2002, Sep. 33 (3):632, 634, 636-49.
Dado que el uso de enzimas específicas de metilación está restringido a ciertas secuencias (que comprenden sitios de restricción), la mayoría de los métodos están basados en un tratamiento con bisulfito que se conduce antes de un paso de detección o amplificación (para revisión: DE 100 29 915, A1, p.2, líneas 35-46 o la solicitud US traducida correspondiente 10/311.661, véase también WO 2004/067545). Debe entenderse que el término "tratamiento con bisulfito" comprende el tratamiento con un bisulfito, un disulfito o una solución de hidrogenosulfito. Como es conocido por los expertos en la técnica y de acuerdo con la invención, el término "bisulfito" se utiliza intercambiablemente con "hidrogenosulfito".
Se conocen varios protocolos en la técnica. Sin embargo, la totalidad de los protocolos descritos, comprenden los pasos siguientes: el DNA genómico se aísla, se desnaturaliza, se convierte durante varias horas con una solución concentrada de bisulfito y finalmente se desulfona y se desala (v.g.: Frommer et al.: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5- methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Mar 1;89(5):1827-31).
En los últimos años, se han desarrollado varias mejoras técnicas de los métodos de bisulfito.
El método de la perla de agarosa incorpora el DNA a investigar en una matriz de agarosa, con lo cual se impide la difusión y renaturalización del DNA (el bisulfito reacciona únicamente con el DNA monocatenario) y todos los pasos de precipitación y purificación se reemplazan por diálisis rápida (Olek A. et al. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis, Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064-5066).
En la solicitud de patente WO 01/98528 (20040152080) se describe una conversión con bisulfito en la cual la muestra de DNA se incuba con una solución de bisulfito de un intervalo de concentración comprendido entre 0,1 mol/l y 6 mol/l en presencia de un reactivo de desnaturalización y/o disolvente y al menos un agente de barrido. En dicha solicitud de patente, se describen varios reactivos desnaturalizantes y agentes de barrido adecuados. El paso final es la incubación de la solución en condiciones alcalinas, con lo cual se desulfona el ácido nucleico desaminado.
En la solicitud de patente WO 03/038121 (US 20040115663) se describe un método en el cual el DNA a analizar se fija a una superficie sólida durante el tratamiento con bisulfito. Por consiguiente, se facilitan los pasos de purificación y lavado.
En la solicitud de patente WO 04/067545 se describe un método en el cual la muestra de DNA se desnaturaliza por calentamiento y se incuba con una solución de bisulfito de un intervalo de concentración entre 3 mol/l y 6,25 mol/l. De este modo el valor de pH está comprendido entre 5,0 y 6,0 y el núcleo se desamina. Finalmente tiene lugar una incubación de la solución en condiciones alcalinas, con lo cual se desulfona el ácido nucleico desaminado.
La comprensión en la técnica de que "una conversión con bisulfito" comprende usualmente el paso de desulfonación puede obtenerse por ejemplo de dicha solicitud: "De acuerdo con la invención, el término una ``reacción con bisulfito'', ''tratamiento con bisulfito'' o ''método del bisulfito'' debe entenderse como una reacción para la conversión de una base citosina, preferiblemente bases citosina, en un ácido nucleico en una base uracilo, preferiblemente bases uracilo, en presencia de iones bisulfito, por lo cual preferiblemente una base 5-metil-citosina, preferiblemente bases 5-metil-citosina, no se convierte(n) significativamente. Esta reacción para la detección de citosinas metiladas ha sido descrita en detalle por Frommer et al., supra y Grigg y Clark (Grigg, G. y Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-436). La reacción del bisulfito contiene un paso de desaminación y un paso de desulfonación, que pueden conducirse por separado o simultáneamente (véase Figura 1; Grigg y Clark, supra). La afirmación de que las bases 5-metil-citosina no se convierten significativamente tendrá únicamente en cuenta el hecho de que no puede excluirse que un pequeño porcentaje de bases 5-metil-citosina se convierte en uracilo, aunque se pretende convertir única y exclusivamente las bases citosina (no metiladas) (Frommer et al.; supra). Los especialistas expertos en la técnica conocen el modo de realizar la reacción del bisulfito, v.g. por referencia a Frommer et al., supra o Grigg y Clark, supra, que describen los parámetros principales de la reacción del bisulfito".
Adicionalmente, en dicha solicitud se describe cuál es el estado general de la técnica con respecto a los diferentes protocolos: "por Grunau et al., supra, es conocido por los expertos en este campo que son posibles variaciones en el método del bisulfito. En resumen, en el paso de desaminación se emplea un tampón que contiene iones bisulfito, opcionalmente agentes caotrópicos y opcionalmente otros reactivos como un alcohol o estabilizadores como hidroquinona y el pH está comprendido en el campo ácido. La concentración de bisulfito está comprendida entre bisulfito 0,1 y 6 M, preferiblemente entre 1 M y 5,5 M, y la concentración del agente caotrópico está comprendida entre 1 y 8 M, empleándose preferentemente sales de guanidinio, el pH se encuentra en el campo ácido, preferiblemente entre 4,5 y 6,5, la temperatura está comprendida entre 0ºC y 90ºC, preferiblemente entre la temperatura ambiente (25ºC) y 90ºC, y el tiempo de reacción está comprendido entre 30 min y 24 horas o 48 horas o aún más, pero preferiblemente entre 1 hora y 24 horas. El paso de desulfonación se realiza por adición de una solución alcalina o tampón como v.g. una solución que contiene únicamente un hidróxido, v.g. hidróxido de sodio, o una solución que contiene etanol, cloruro de sodio e hidróxido de sodio (v.g. EtOH 38%, NaCl 100 mM, NaOH 200 mM) e incubación a la temperatura ambiente o a temperaturas elevadas durante varios min, con preferencia entre 5 min y 60 min".
Por consiguiente, está claro que la desulfonación es una característica inherente de todos estos métodos; en cualquier caso, tiene lugar una desulfonación antes de utilizar los ácidos nucleicos como moldes para reacciones de amplificación, a fin de proporcionar un molde ideal para la polimerasa utilizada en las reacciones siguientes.
En la solicitud de patente WO 05/038051 se describen mejoras para la conversión de citosina no metilada en uracilo por tratamiento con un reactivo bisulfito. De acuerdo con este método, la reacción se lleva a cabo en presencia de 10-35% en volumen, preferentemente en presencia de 20-30% en volumen de dioxano, uno de sus derivados o un éter cíclico alifático similar. La reacción del bisulfito puede llevarse a cabo también en presencia de un compuesto de n-alquilen-glicol, particularmente en presencia de sus dialquil-éteres, y especialmente en presencia de dietilenglicol-dimetiléter (DME). Estos compuestos pueden estar presentes en una concentración de 1-35% en volumen, preferentemente de 5-25% en volumen. De acuerdo con esta invención, la conversión con bisulfito se conduce a una temperatura en el intervalo de 0-80ºC y dicha temperatura se eleva de 2 a 5 veces hasta un intervalo de 85-100ºC brevemente durante el curso de la conversión (punta térmica). Se prefiere adicionalmente que la temperatura aumente hasta 85-100ºC, en particular hasta 90-98ºC durante la elevación de temperatura de breve duración.
Subsiguientemente a un tratamiento con bisulfito, fragmentos usualmente cortos y específicos de un gen conocido se amplifican y, o bien se secuencian completamente (Olek A, Walder J. (1997). La ontogenia de pre-implantación de la huella de metilación H19. Nat Genet. 3:275-6) o se detectan posiciones de citosinas individuales por una reacción de extensión con iniciadores Gonzalgo ML y Jones PA. (1997). La cuantificación rápida de diferencias de metilación en sitios específicos utilizando extensión con iniciadores nucleotídicos simples sensibles a la metilación (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 25:2529-31, WO 95/00669) o por digestión enzimática (Xiong Z, Laird PW. (1997) COBRA: un ensayo de metilación del DNA sensible y cuantitativo, Nucleic Acids Res. 25:2535-4).
Otra técnica para detectar la hipermetilación es la denominada PCR específica de metilación (MSP) (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD y Baylin SB. (1996), PCR específica de metilación: un nuevo ensayo PCR para el estado de metilación de las islas CpG. Proc Natl Acad Sci USA, 93:9821-6). La técnica está basada en el uso de iniciadores que diferencian entre una secuencia metilada y una no metilada si se aplican después del tratamiento con bisulfito de dicha secuencia de DNA. El iniciador contiene o bien una guanina en la posición correspondiente a la citosina, en cuyo caso la misma se fijará únicamente después del tratamiento con bisulfito si la posición estaba metilada; o bien, el iniciador contiene una adenina en la posición correspondiente a la citosina y por tanto se fija únicamente a dicha secuencia de DNA después del tratamiento con bisulfito si la citosina no estaba aún metilada y ha sido alterado por tanto por el tratamiento con bisulfito de tal modo que se hibrida a adenina. Con el uso de estos iniciadores, pueden producirse amplicones que dependen específicamente del estado de metilación de una cierta citosina e indicarán como tales su estado de metilación.
Otra técnica es la detección de la metilación por una sonda marcada, tal como la utilizada en la denominada PCR Taqman, conocida también como MethyLight (US 6331393). Con esta técnica se hizo posible la determinación del estado de metilación de una o varias posiciones directamente durante la PCR, sin tener que analizar los productos PCR en un paso adicional.
Adicionalmente, se ha descrito también la detección por hibridación (Olek et al., WO 99/28498).
El tratamiento con bisulfito (o agentes químicos o enzimas similares) con el efecto de alterar el comportamiento de apareamiento de bases de un tipo de citosina específicamente, sea el tipo metilado o el no metilado, introduciendo con ello propiedades de hibridación diferentes, hace el DNA tratado más aplicable a los métodos convencionales de biología molecular, especialmente los métodos de amplificación basados en polimerasa, tales como la PCR.
La reparación de la excisión de las bases tiene lugar in vivo para reparar el deterioro de las bases de DNA que implica alteraciones de importancia relativamente pequeña en la estructura de la hélice del DNA, tales como bases desaminadas, oxidadas, alquiladas o ausentes. Numerosas glicosilasas de DNA se conocen en la técnica, y funcionan in vivo durante la reparación de la excisión de bases para eliminar bases deterioradas o modificadas por escisión del enlace glicosídico que une dichas bases a la cadena principal azúcar-fosfato del DNA (Memi-soglu, Samson, Mutation Res. (2000), 451:39-51). Todas las glicosilasas del DNA escinden los enlaces glicosídicos pero difieren en su especificidad de base sustrato y en sus mecanismos de reacción.
Una aplicación ampliamente reconocida de tales glicosilasas es la descontaminación en las aplicaciones PCR. En cualquiera de tales amplificaciones PCR, se generan 2 elevado a 30 (2^{30}) o más copias de un molde simple. Esta enorme cantidad de DNA producida sirve de ayuda en el análisis subsiguiente, como en la secuenciación del DNA de acuerdo con el método de Sanger, pero puede convertirse también en un problema cuando esta cantidad de DNA se manipula en un laboratorio analítico. Incluso volúmenes de reacción muy pequeños, cuando inadvertidamente no se guardan en un vial cerrado, pueden conducir a contaminación de todo el ambiente de trabajo con un número enorme de copias de DNA. Estas copias de DNA pueden ser moldes para un experimento de amplificación realizado subsiguientemente, y el DNA analizado posteriormente puede no ser el DNA de la muestra real, sino DNA contaminante de un experimento previo. Esto puede conducir también a controles positivo-negativos que no deberían contener DNA alguno y por consiguiente no debería observarse amplificación alguna.
En la práctica, este problema puede ser tan persistente que laboratorios enteros pueden desplazarse a una nueva localización, debido a que la contaminación del ambiente de trabajo hace imposible llevar a cabo ya experimentos basados en PCR significativos. En un laboratorio clínico, sin embargo, la preocupación es también que el DNA contaminante puede causar resultados falsos cuando se realizan diagnósticos moleculares. Esto significaría que se analiza el DNA contaminante actual que procede de un paciente previo, en lugar de la muestra real a investigar.
Por esta razón, se han implementado medidas para evitar la contaminación. Esto implica, por ejemplo, una amplificación y detección por PCR en un solo tubo en un experimento PCR de tiempo real. En este caso, no se requiere que se abra un tubo PCR. Después del uso, el tubo se mantendrá cerrado y se desechará y por consiguiente el riesgo de contaminación que conduce a resultados falsos se reduce notablemente.
Adicionalmente, existen medios moleculares que reducen el riesgo de contaminación. En una reacción en cadena de polimerasa, la enzima uracil-DNA-glicosilasa (UNG) reduce el potencial de reacciones positivas falsas debidas al arrastre de amplicones (véase v.g. US 5035996 o Thornton CG, Hartley JL, Rashtchian A (1992). La utilización de uracil-DNA-glicosilasa para controlar la contaminación por arrastre en PCR: caracterización de la actividad residual de UDG después de la ciclación térmica. Biotechniques, 13(2):180-4). El principio de este método de protección contra la contaminación es que en cualquier amplificación se proporciona y se incorpora dUTP en lugar de dTTP y el amplicón resultante puede distinguirse de su molde y de cualquier muestra futura de DNA por la presencia de uracilo en lugar de timina. Antes de cualquier amplificación subsiguiente, se utiliza uracil-DNA-glicosilasa (UNG) para escindir estas bases de cualquier DNA contaminante, y por consiguiente sólo el molde legítimo permanece intacto y puede amplificarse. Este método se considera como el método estándar de elección en la técnica y es ampliamente utilizado en los diagnósticos basados en DNA. Lo que sigue es una cita de una publicación que resume el uso de UNG (Longo MC, Berninger MS, Hartley JL (1990). Uso de uracil-DNA-glicosilasa para controlar la contaminación por arrastre en reacciones en cadena de polimerasa. Gene, 1990, 1 de septiembre; 93 (1):125-8.):
\quad
"Las reacciones en cadena de polimerasa (PCRs) sintetizan abundantes productos de amplificación. La contaminación de nuevas PCRs con cantidades traza de estos productos, denominada contaminación por arrastre, produce resultados positivos falsos. La contaminación por arrastre de alguna PCR previa puede ser un problema significativo, debido tanto a la abundancia de productos PCR, como a la estructura ideal del material contaminante para re-amplificación. Los autores informan que la contaminación por arrastre puede controlarse por los dos pasos siguientes: (i) incorporación de dUTP en todos los productos PCR (por empleo de dUTP en sustitución de dTTP, o por incorporación de uracilo durante la síntesis de los iniciadores oligodesoxirribonucleotídicos; y (ii) tratamiento de todas las reacciones iniciales subsiguientes totalmente preensambladas con uracil-DNA-glicosilasa (UNG), seguido por desactivación térmica de UNG. La UNG escinde la base uracilo de la cadena principal de fosfodiéster del DNA que contiene uracilo, pero no tiene efecto alguno sobre el DNA natural (es decir, el que contiene timina). Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean la replicación por las DNA-polimerasas, y son muy lábiles frente a la hidrólisis ácido-base. Dado que la UNG no reacciona con dUTP, y está desactivada también por desnaturalización térmica antes de la PCR real, la contaminación por arrastre de las PCRs puede controlarse eficazmente si los contaminantes contienen uracilos en lugar de timinas".
Otro método para protección contra el arrastre en la PCR ha sido descrito por Walder et al (Walder RY, Hayes JR, Walder JA. Uso de iniciadores PCR que contienen un residuo ribosa 3-terminal para prevenir la contaminación cruzada de secuencias amplificadas. Nucleic Acids Res 1993 Sep. 11; 21(18): 4339-43).
Se ha descrito aquí que la protección contra el arrastre puede conseguirse - aunque no muy reproduciblemente - por utilización de iniciadores constituidos por un extremo 3' que se caracteriza como una ribocitidina. Después de la extensión con iniciadores, el producto de amplificación se escinde específicamente en el sitio de este ribonucleótido por una enzima conocida como RNasa A. De este modo, los amplificados potencialmente contaminantes se acortan en sus extremos y no pueden servir como moldes para dichos iniciadores en el procedimiento de amplificación siguiente. Sin embargo, la desventaja inherente a este método es la inestabilidad de las moléculas iniciadoras, que contienen un ribonucleótido en el extremo 3'.
Dado que la existencia de uracilos es una característica inherente del DNA convertido con bisulfito y la propiedad necesaria básica para la detección de diferencias de metilación, el método de elección para protección contra el arrastre basado en la actividad de la enzima uracil-DNA-glicosilasa como se ha descrito arriba no puede aplicarse. Sin embargo, varios ensayos potentes para diagnosis están basados en PCR realizada sobre DNA convertido con bisulfito como molde. Por esta razón, para la ejecución rutinaria de tales ensayos en un laboratorio, es necesario desarrollar nuevos métodos para prevención contra el arrastre. Existe gran necesidad en la técnica de proporcionar soluciones al problema de la consecución de una protección fiable contra el arrastre cuando se analiza la metilación de las posiciones citosina en DNA procedente de muestras de pacientes.
La dificultad de resolver el problema para descontaminación de los moldes convertidos con bisulfito está considerada como una dificultad general, que no puede resolverse por adaptación del método estándar UNG, dado que cualquier DNA convertido con bisulfito contendrá asimismo uracilo. Se ha argumentado por esta razón comúnmente que, en cualquier paso con uracil-DNA-glicosilasa, el DNA molde se destruiría junto con cualquier DNA contaminante.
Sorprendentemente, los autores de la invención pudieron resolver este problema principal por la invención del método reivindicado. La idea central del método de acuerdo con la invención es sulfonar y/o desaminar únicamente las citosinas no metiladas sin una desulfonación subsiguiente. Después que las citosinas no metiladas se convierten en uracilos sulfonados en C6, la mezcla de reacción se trata con UNG, que degrada todo el DNA que contiene uracilo y por tanto cualquier DNA contaminante, pero no tiene efecto alguno sobre el DNA que contiene uracilo sulfonado. Si es posible, puede llevarse a cabo una desactivación de la UNG seguida por una desulfonación de los uracidos
sulfonados.
El descubrimiento, consignado por primera vez en esta solicitud, de que la sulfonación del uracilo en la posición C6 protege el uracilo contra la degradación por UNG permite encontrar una nueva y sorprendentemente fácil solución a dicho problema. Una realización de esta invención comprende por consiguiente un método que proporciona a la vez una diferenciación suficiente y fiable entre las citosinas metiladas y no metiladas, así como la aplicabilidad del patrón oro de protección contra el arrastre (basado en el uso de UNG) para ensayos comunes basados en PCR.
Breve descripción de la invención
Se describe un método para la amplificación específica de DNA molde en presencia de productos PCR potencialmente contaminantes procedentes de experimentos de amplificación previos. Este DNA molde se deriva usualmente del aislamiento del DNA gnómico a analizar antes que pueda aplicarse el método. Asimismo, el ácido nucleico molde utilizado en este método está usualmente ya desnaturalizado y presente por tanto en modo monocatenario. En el primer paso del método de acuerdo con la invención, el DNA se pone en contacto con una solución de bisulfito, que reacciona con las citosinas no metiladas pero no con las citosinas metiladas, por sulfonación de las mismas. Esto da como resultado una modificación de dichos ácidos nucleicos, que se conoce como sulfonación. Esta sulfonación de la citosina no metilada en solución acuosa da como resultado la desaminación de la citosina con lo cual se genera uracilo sulfonado. Se ha reconocido ahora por primera vez que dicha denominada sulfonación, que ocurre únicamente en las bases citosina no metiladas a) protege el ácido nucleico molde evitando que se convierta en una diana para la enzima UNG y permite por tanto la discriminación del ácido nucleico molde y ácidos nucleicos potencialmente contaminantes. Cualquier DNA contaminante, que contiene uracilos no protegidos no sulfonados o desulfonados mientras la UNG es activa, se degrada subsiguientemente por vía enzimática y únicamente queda el ácido nucleico molde de la muestra para ser amplificado en el paso siguiente.
Después que el tratamiento con UNG se ha realizado y la actividad de UNG ha terminado, las bases uracilo sulfonadas (que reemplazan las citosinas no metiladas) se convierten en uracilo por desulfonación. El método es útil para descontaminación de muestras de ácido nucleico, o más bien para evitar la amplificación de los "productos de arrastre" en particular en el contexto del análisis de la metilación del DNA.
Hasta ahora, no se ha consignado ningún método para descontaminar muestras de DNA que pudieran ser compatibles con DNA tratado con bisulfito empleado como molde para un procedimiento de amplificación como la PCR.
Por el método que se proporciona de acuerdo con la invención, podría conseguirse hacer el método más comúnmente utilizado basado en la enzima glicosilasa UNG, como se ha descrito arriba, aplicable al análisis de metilación del DNA:
La presente invención resuelve el problema por descripción de un método para proporcionar un ácido nucleico molde descontaminado para reacciones de amplificación basadas en polimerasa adecuadas para análisis de metilación de DNA, que comprende los pasos siguientes:
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incubar los ácidos nucleicos con una solución del reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan, o se sulfonan y se desaminan, y
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mezclar el ácido nucleico molde sulfonado o sulfonado y desaminado con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación, y
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añadir a esta mezcla UNG e incubar la mezcla, con lo cual los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado se degradan, y
\quad
terminar la actividad de UNG y desulfonar el ácido nucleico molde, convirtiendo con ello las citosinas no metiladas desaminadas y sulfonadas, es decir los uracilos sulfonados en uracilos.
Subsiguientemente, se realiza un ensayo basado en polimerasa o basado en amplificación, que tiene lugar preferiblemente en presencia de dUTPs en lugar de dTTPs.
Preferiblemente, durante la actividad de polimerasa se inicia durante el paso de sulfonación (sic).
Descripción detallada de la invención
El método se llevará a cabo típicamente realizando al menos los pasos siguientes en el orden dado:
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Primeramente, incubar un ácido nucleico molde con una solución que contiene el reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan, o se sulfonan y se desaminan, y
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en segundo lugar, mezclar el ácido nucleico molde sulfonado, o sulfonado y desaminado, con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación, y en tercer lugar, añadir a esta mezcla unidades de UNG e incubar dicha mezcla, con lo cual cualesquiera ácidos nucleicos que contienen uracilos no sulfonados se degradan, en tanto que los uracilos sulfonados permanecen esencialmente intactos, y en cuarto lugar, terminar la actividad de UNG y desulfonar el ácido nucleico molde.
La sulfonación tiene lugar en C6 de la citosina base (véase la Figura 1). La desaminación de las citosinas sulfonadas tiene lugar espontáneamente en solución acuosa. De este modo, la citosina sulfonada se convierte en un uracilo sulfonado.
El método de acuerdo con la invención se basa en dos descubrimientos esenciales. En primer lugar, se ha encontrado que los ácidos nucleicos sulfonados son estables hasta al menos 6 días a 4ºC, v.g. cuando se guardan en un frigorífico común de laboratorio. Este descubrimiento fue esencial para el método de acuerdo con la invención, dado que una desulfonación incontrolada espontánea de los ácidos nucleicos podría hacer el método no fiable e inestable. Por otra parte, se sabe que el patrón de sulfonación de los ácidos nucleicos, que se asemeja básicamente al patrón de metilación de los ácidos nucleicos, se mantendrá estable cuando se mantiene durante varios días a una temperatura más baja permite el uso de esta característica en la realización de ensayos sensibles para detectar exactamente cuáles son los ácidos nucleicos que estaban metilados en una muestra dada y en qué proporción.
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En segundo lugar, pudo ser demostrado por los autores que la UNG (uracil-DNA-glicosilasa), no degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilos sulfonados, o dicho de otro modo que los uracilos sulfonados no son sustrato para la actividad de UNG, y por tanto están protegidos contra la degradación con UNG.
Pudo demostrarse también que los ensayos "PCR en tiempo real" que utilizan ácidos nucleicos sulfonados como molde se comportaban satisfactoriamente en presencia de actividad de UNG, lo que indica que los ácidos nucleicos sulfonados tales como se derivan del primer paso del tratamiento con bisulfito pueden servir como moldes en ensayos basados en PCR.
Por último, era necesario encontrar respuesta a la cuestión de si la reacción de desulfonación, que debe tener lugar antes que el ácido nucleico pueda ser amplificado por una amplificación mediada por polimerasa, puede realizarse dentro de la reacción PCR.
El método desarrollado, de acuerdo con la invención, fue testado satisfactoriamente para GSTP1 y connexina, véanse los ejemplos.
En el primer paso, la sulfonación de las citosinas mediada por bisulfito puede iniciarse de acuerdo con los primeros pasos de protocolos comunes de conversión con bisulfito como se ha indicado arriba, en particular como se indica en WO 05/038051. La reacción puede tener lugar tanto en solución como en DNA fijado a una fase sólida. Preferiblemente, se utiliza disulfito de sodio (= bisulfito de sodio/metabisulfito de sodio), dado que el mismo es más soluble en agua que el sulfito de sodio. La sal disulfito se desproporciona en solución acuosa para dar los aniones hidrogenosulfito necesarios para la sulfonación de la citosina. Cuando se discute con mayor detalle la concentración de bisulfito, este término hace referencia a la concentración de aniones hidrogenosulfito y sulfito en la solución de reacción. Para el método de acuerdo con la invención, son posibles intervalos de concentración de 0,1 a 6 mol/l. Se prefiere particularmente una gama de concentración de 1 a 6 mol/l, y de modo muy particularmente preferido, 2-4 mol/l. sin embargo, cuando se utiliza dioxano como agente desnaturalizante, la concentración máxima de trabajo de bisulfito es más pequeña. Puede utilizarse también dioxano en concentraciones diferentes. Preferiblemente, la concentración de dioxano asciende a 10 hasta 35%, siendo particularmente preferido 20 a 30%, y muy particularmente preferido 22 a 28%, especialmente 25%.
En las realizaciones particularmente preferidas con una concentración de dioxano de 22-28%, la concentración preferida final de bisulfito asciende a 3,3 hasta 3,6 mol/l, y en la realización más particularmente preferida con una concentración de dioxano de 25%, la misma asciende a 3,5 mol/l (véanse los ejemplos).
En otra realización preferida, se utiliza DME como agente desnaturalizante en concentraciones diferentes. Se utiliza DME en concentraciones comprendidas en el intervalo de 1-35%, preferiblemente en el intervalo de 5-25%, y muy preferiblemente 10%.
En una realización particularmente preferida, la conversión con bisulfito se lleva a cabo en presencia de agentes de barrido. Los agentes de barrido preferidos son derivados de cromano, v.g., ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (conocido también como: Trolox-C^{TM}). Agentes de barrido adicionales se enumeran en la solicitud de patente WO 01/99528 (= DE 10029915 = solicitud US 10/311661).
La conversión con bisulfito puede conducirse en un amplio intervalo de temperatura de 0 a 95ºC. No obstante, en una realización preferida la temperatura de reacción está comprendida entre 30 y 70ºC. Se prefiere particularmente un intervalo entre 45 y 60ºC; y es muy particularmente preferido un intervalo entre 50 y 55ºC.
El tiempo óptimo de reacción del tratamiento con bisulfito depende de la temperatura de reacción. El tiempo de reacción asciende normalmente a entre 1 y 18 horas (véase: Grunau et al. 2001, Nucleic Acids Research; 29(13):E65-5.). El tiempo de reacción preferido es 4-6 horas para una temperatura de reacción de 50ºC.
En una realización particularmente preferida del método de acuerdo con la invención, la conversión con bisulfito se conduce a temperaturas de reacción moderadas, en donde la temperatura de reacción se incrementa luego claramente durante un tiempo breve al menos una sola vez durante el curso de la conversión. Los aumentos de temperatura de corta duración se conocen como "puntas térmicas" más adelante. La temperatura de reacción "estándar" fuera de las puntas térmicas se designa como la temperatura de reacción básica. La temperatura de reacción básica asciende a un valor comprendido entre 0 y 80ºC, preferiblemente entre 30 y 70ºC, muy preferiblemente entre 45º y 55ºC, como se ha descrito arriba. La temperatura de reacción durante una punta térmica se incrementa hasta más de 85ºC al menos para una punta térmica. El número óptimo de puntas térmicas es función de la temperatura básica de reacción. Cuanto mayor es el número óptimo de puntas térmicas, tanto menor es la temperatura de reacción básica. Es necesaria al menos una punta térmica en cada caso. Y, por otra parte, en principio, es admisible cualquier número de puntas térmicas.
En una realización particular, el número preferido de puntas térmicas está comprendido entre 1 y 10 puntas térmicas, dependiendo de la temperatura básica de reacción. Son particularmente preferidas 2 a 5 puntas térmicas. Durante las puntas térmicas, la temperatura de reacción aumenta preferiblemente hasta 85 a 100ºC, de modo particularmente preferible hasta 90-98ºC, y de modo muy preferible hasta 94ºC-96ºC. La duración en el tiempo de los aumentos de temperatura depende también del volumen del lote de reacción.
La duración en el tiempo de las puntas térmicas depende también del volumen del lote de reacción. Debe asegurarse que la temperatura se incrementa uniformemente en la solución de reacción total. Para un lote de reacción de 20 \mul cuando se utiliza un termociclador, se prefiere una duración entre 15 segundos y 1,5 minutos, especialmente una duración entre 20 y 50 segundos. En una realización particular preferida, la duración es 30 segundos. Cuando se opera con un volumen de 100 \mul, el intervalo preferido está comprendida entre 30 segundos y 5 minutos, especialmente entre 1 y 3 minutos. Se prefieren particularmente 1,5 minutos. Para un volumen de 600 pl, se prefiere una duración de 1 a 6 minutos, especialmente entre 2 y 4 minutos. Se prefiere particularmente una duración de 3 minutos. Una persona experta en la técnica podrá determinar fácilmente duraciones adecuadas de las puntas térmicas en relación con una diversidad de volúmenes de reacción.
El uso arriba descrito de puntas térmicas conduce a tasas de conversión notablemente mejoradas en la reacción de conversión con bisulfito, aun cuando no se utilicen los disolventes desnaturalizantes arriba descritos. De acuerdo con la invención, un método para conversión de DNA con bisulfito se caracteriza por tanto por el hecho de que la temperatura básica de reacción asciende a 0ºC hasta 80ºC y porque la temperatura de reacción se incrementa durante un tiempo breve hasta más de 85ºC al menos una vez en el curso de la conversión.
En el segundo paso, antes de cualquier paso de desulfonación, se añaden a dicha premezcla unidades de una actividad enzimática, que degrada específicamente los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado. En una realización preferida, esta enzima degradante es una DNA-glicosilasa o una endonucleasa, en particular UNG (uracil-DNA-glicosilasa). El ácido nucleico contaminante se caracteriza porque contiene bases uracilo no sulfonadas. La enzima degradante añadida se caracteriza por escindir la base uracilo no sulfonada de la cadena de fosfodiéster de los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado, pero no tiene efecto alguno sobre el ácido nucleico que contiene uracilo sulfonado o sobre el ácido nucleico que contiene timina, que no contiene uracilo. Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean la replicación por las DNA-polimerasas, y son muy lábiles frente a la hidrólisis ácido/base.
En otra realización preferida, el primer paso se lleva a cabo como se ha descrito arriba. Después de ello, en un paso intermedio, el ácido nucleico sulfonado y/o desaminado se mezcla con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación. La mezcla de la reacción de amplificación se prepara de acuerdo con protocolos estándar. Una mezcla de amplificación de este tipo, preferiblemente una mezcla PCR, puede contener al menos un juego de dos iniciadores y una polimerasa. Esta polimerasa es preferiblemente una enzima termoestable, siendo aún más preferido el uso de una polimerasa activada térmicamente para PCR de iniciación en caliente, y de modo muy particularmente preferido se utiliza una polimerasa Taq activada térmicamente.
El segundo paso siguiente se lleva a cabo también como se ha descrito arriba. Se añaden a dicha premezcla unidades de una actividad enzimática, que degrada específicamente el ácido nucleico que contiene uracilo sulfonado. El ácido nucleico sulfonado muestra y un juego de al menos dos oligonucleótidos iniciadores se incuban con una composición de enzimas, que incluye una enzima con actividad degradante del ácido nucleico que contiene uracilo sulfonado y tampones para escindir o degradar cualquier ácido nucleico contaminante. El ácido nucleico contaminante se caracteriza porque contiene bases uracilo. La actividad de enzima degradante añadida se caracteriza por escindir la base uracilo de la cadena principal de fosfodiéster del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado, pero no tiene efecto alguno sobre el ácido nucleico que contiene uracilo sulfonado o sobre el ácido nucleico que contiene timina, que no contiene uracilo. Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean la replicación por las DNA-polimerasas, y son muy lábiles frente a la hidrólisis ácido/base. En principio, la actividad enzimática es cualquier actividad enzimática, que causa sitios específicamente apirimidínicos o una o más mellas adyacentes a una base uracilo no sulfonada. En cualquier caso esto dará como resultado un bloqueo de la replicación por la DNA-polimerasa.
Los oligonucleótidos iniciadores se seleccionarán de tal modo que los mismos amplifiquen un fragmento de interés. Se prefiere particularmente que estos iniciadores estén diseñados para amplificar un fragmento de ácido nucleico de una muestra de ácido nucleico molde por medio de una reacción de polimerasa, en particular una reacción en cadena de polimerasa, como es conocido en la técnica. Los oligonucleótidos iniciadores están diseñados por tanto para reasociarse a los ácidos nucleicos molde para formar una doble cadena, siguiendo las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick, y la longitud de estos iniciadores oligonucleotídicos se seleccionará de tal manera que los mismos se reasocien aproximadamente a la misma temperatura.
En dicho segundo paso, se añaden una enzima y los tampones de igualación para conseguir la escisión de cualesquiera amplificados contaminantes presentes que se hubieran generado en cualquiera de los experimentos precedentes. Estos amplificados tendrán la propiedad de que comprenden bases uracilo en lugar de bases timina, si se han generado en una reacción de polimerasa que proporcione dUTPs en lugar de dTTPs. Por dicha razón, en este paso el ácido nucleico muestra no podría ser reconocido y degradado por la enzima, sino únicamente los ácidos nucleicos que se generaron en las amplificaciones precedentes, el DNA contaminante que debe separarse antes de la tanda de amplificación siguiente.
Se prefiere particularmente que la enzima empleada en este segundo paso sea uracil-DNA-glicosilasa (UNG). Se prefiere, adicionalmente, que dicha enzima degradante del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado sea termolábil, en particular la DNA-glicosilasa o la endonucleasa son termolábiles, respectivamente, y de modo muy particularmente preferido la UNG es termolábil.
En el tercer paso, después de la degradación enzimática, la composición de enzimas y tampón está desactivada subsiguientemente, en el sentido de que no es capaz de escindir sustancialmente ningún producto del paso de amplificación subsiguiente. La actividad de enzima degradante del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado se termina, terminando en particular la actividad de DNA-glicosilasa o la actividad de endonucleasa, y terminando de modo muy particularmente preferido la actividad de UNG.
Después que la composición de enzimas degradantes del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado y tampón se ha desactivado, en el sentido de que no es capaz de degradar sustancialmente ningún producto del paso de amplificación subsiguiente, se realiza el cuarto paso, es decir la desulfonación de los ácidos nucleicos molde. Antes de la amplificación por una polimerasa, debe realizarse un cuarto paso, que consiste en la desulfonación del ácido nucleico molde sulfonado. La desulfonación puede tener lugar en condiciones alcalinas (como se describe en la técnica). Sin embargo, la desulfonación puede estar catalizada también por un aumento de temperatura en condiciones de pH como las que son comunes para la reacción PCR.
Es una realización preferida de la invención que los pasos 3 y 4 se conducen simultáneamente por un aumento breve de la temperatura de incubación de dicha premezcla, que da como resultado la desactivación de la enzima degradante del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado por una parte, y la desulfonación térmica del ácido nucleico molde por otra parte. Este aumento en la temperatura de incubación puede ser adecuado también para transferir DNA bicatenario en forma monocatenaria que permite una amplificación.
El ácido nucleico muestra puede amplificarse ahora en el paso siguiente utilizando el juego de oligonucleótidos iniciadores y una polimerasa, mientras que cualquier DNA contaminante escindido no se amplifica esencialmente. El ácido nucleico muestra puede amplificarse, utilizando un juego de nucleótidos iniciadores y una polimerasa, mientras que el ácido nucleico contaminante escindido o degradado no puede amplificarse. Los productos amplificados pueden analizarse luego y el estado de metilación del DNA genómico puede deducirse de la presencia de un producto amplificado y/o por el análisis de la secuencia dentro del producto amplificado.
Esta amplificación puede llevarse a cabo, en una realización particularmente preferida de la invención, por medio de una reacción en cadena de polimerasa, pero también por otros medios de amplificación de DNA conocidos en la técnica, como TMA (amplificación mediada por transcripción), amplificaciones isotérmicas, amplificación en circulo rodante, reacción en cadena de ligasa, y otros.
Los fragmentos de DNA generados se analizarán luego, en lo que respecta a su presencia, cantidad o propiedades de su secuencia o una combinación de dichos aspectos.
Por consiguiente, una realización de la invención es un método para proporcionar un ácido nucleico molde descontaminado para reacciones de amplificación basadas en polimerasas adecuadas para análisis de la metilación del DNA, que se caracteriza por, en primer lugar, incubar un ácido nucleico molde con una solución que contiene reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan y/o se desaminan, y en segundo lugar, mezclar el ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación, y en tercer lugar, añadir a esta mezcla una enzima con actividad de uracil-DNA-glicosilasa e incubar la mezcla, con lo cual los ácidos nucleicos que contienen uracilos no sulfonados se degradan, y en cuarto lugar, terminar la actividad de UNG, y en quinto lugar, desulfonar el ácido nucleico molde. En una realización preferida de esta invención, el método se caracteriza adicionalmente por un paso 4 y 5 que tienen lugar simultáneamente, por incubación breve de la mezcla a una temperatura incrementada, donde la actividad de UNG se termina, con lo cual tiene lugar la desulfonación del ácido nucleico molde, y con lo cual el DNA se transfiere de una forma bicatenaria a una forma monocatenaria adecuada para la amplificación.
Una realización adicional preferida del método de acuerdo con la invención consiste en que, en un paso subsiguiente 6, se amplifica el ácido nucleico molde.
Se prefiere adicionalmente que una vez terminada la actividad de degradación del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado y la desulfonación del ácido nucleico molde, se inicia una reacción de amplificación basada en polimerasa y/o se realiza un ensayo basado en amplificación.
Se prefiere adicionalmente que la reacción de amplificación basada en polimerasa se inicie por una incubación breve a temperatura incrementada (activación térmica).
En una realización preferida del método, la polimerasa es una polimerasa termoestable.
De acuerdo con la invención, se prefiere particularmente que la amplificación mediada por polimerasa o el ensayo basado en amplificación se realicen en presencia de dUTPs en lugar de dTTPs.
En una realización preferida de la invención, el método se lleva a cabo por adición de una cantidad de unidades de la enzima, que degrada específicamente los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado, en el segundo paso que se requiere para degradar esencialmente la totalidad de los ácidos nucleicos contaminantes potenciales.
Se prefiere especialmente que después de la activación de la enzima polimerasa, se realice una reacción de amplificación basada en polimerasa o un ensayo basado en amplificación.
Adicionalmente, se prefiere que después de la activación de la enzima polimerasa, se realice una reacción de amplificación basada en polimerasa o un ensayo basado en amplificación en presencia de dUTPs en lugar de dTTPs.
Adicionalmente, se prefiere que este ensayo sea un ensayo en tiempo real.
En una realización particularmente preferida, el DNA muestra se obtiene a partir de suero u otros fluidos corporales de un individuo. Adicionalmente, se prefiere de modo particular que las muestras de DNA se obtengan de líneas de células, tejido incrustado en parafina, por ejemplo tejido de los ojos, intestino, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mama o hígado, portaobjetos histológicos, fluidos corporales y todas las combinaciones posibles de los mismos. El término fluidos corporales debe entenderse que comprende fluidos tales como sangre entera, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, esputo, eyaculado, semen, lágrimas, sudor, saliva, fluido linfático, lavado bronquial, efusión pleural, fluido peritoneal, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular, aspirados finos con aguja, fluido aspirado de pezón, fluido espinal, fluido conjuntivo, fluido vaginal, jugo duodenal, jugo pancreático, bilis, heces y fluido cerebroespinal. Se prefiere especialmente que dichos fluidos corporales sean sangre entera, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, heces, eyaculado, lavado bronquial, fluido vaginal y fluido aspirado de pezón.
En una realización particularmente preferida de la invención, el tratamiento químico se conduce con un bisulfito (= disulfito, hidrogenosulfito). De nuevo, se prefiere que el tratamiento químico se conduzca después de incrustar el DNA en agarosa, o que el mismo se conduzca en presencia de un agente desnaturalizante y/o agente de barrido de radicales.
Los ensayos de detección de la metilación siguientes son todos ellos realizaciones preferidas de la invención cuando se realizan subsiguientemente a los pasos del método de acuerdo con la invención:
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Procedimientos del Ensayo de Metilación. Se conocen en la técnica diversos procedimientos del ensayo de metilación, y pueden utilizarse en asociación con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (v.g., islas CpG) dentro de una secuencia de DNA. Tales ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de DNA del DNA tratado con bisulfito, y varios ensayos de metilación basados en PCR, algunos de los cuales - conocidos como COBRA, MS-SNuPE, MSP, MSP anidada, HeavyMethyl y MethyLight se describen a continuación con mayor detalle.
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SECUENCIACIÓN DE BISULFITO. Los patrones de metilación del DNA y la distribución de 5-metilcitosina pueden analizarse por análisis de secuenciación de un fragmento previamente amplificado del DNA genómico tratado con bisulfito, como ha sido descrito por Frommer et al. (Frommer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). Dado que el DNA tratado con bisulfito se amplifica antes de la secuenciación, el procedimiento de amplificación de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
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COBRA. El análisis COBRA es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación del DNA en loci génicos específicos en pequeñas cantidades de DNA genómico (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). De modo resumido, se utiliza digestión con enzimas de restricción para revelar diferencias de secuencia dependientes de la metilación en productos PCR de DNA tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de la metilación se introducen primeramente en el DNA genómico por tratamiento estándar con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA '89:1827-1831, 1992) o como ha sido descrito por Olek et al., (Olek A, Oswald J, Walder J. (1996) en Nucleic Acids Res. 24:5064-6). La amplificación por PCR del DNA convertido con bisulfito se realiza luego utilizando iniciadores de metilación inespecíficos seguido por digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección utilizando sondas de hibridación específicas marcadas. Los niveles de metilación en la muestra de DNA original se representan por las cantidades relativas de producto PCR digerido y no digerido de una manera linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación de DNA. Además, esta técnica puede aplicarse fiablemente al DNA obtenido a partir de muestras de tejidos microdiseccionadas incrustadas en parafina. Reactivos típicos (v.g., como podrían encontrarse en un kit típico basado en COBRA) para el análisis COBRA pueden incluir, pero sin carácter limitante: iniciadores PCR para un gen específico (o secuencia de DNA alterada en metilación o isla CpG); enzima de restricción y tampón apropiado; oligo-hibridación de genes; oligo-hibridación de control; kit de marcación de quinasas para oligosonda; y nucleótidos radiactivos. Adicionalmente, reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de DNA; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de DNA (v.g., precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de DNA.
Adicionalmente, se utiliza también digestión con enzimas de restricción de productos PCR amplificados a partir de DNA convertido con bisulfito, en el método descrito por Sadri & Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996).
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
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Ms-SNuPE (Extensión con Iniciadores Mononucleotídicos Sensibles a la Metilación). La técnica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para evaluar diferencias de metilación en sitios CpG específicos basado en tratamiento de DNA con bisulfito, seguido por extensión con iniciadores mononucleotídicos (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997). Resumidamente, el DNA genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo en tanto que se deja inalterada la 5-metilcitosina. La amplificación de la secuencia diana deseada se realiza luego utilizando iniciadores PCR específicos para DNA convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como molde para análisis de metilación en el o los sitios CPG de interés. Pueden analizarse pequeñas cantidades de DNA (v.g., secciones de patología microdiseccionadas), y ello evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios CpG.
Reactivos típicos (v.g., como podrían encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPE) para análisis y Ms-SNuPE pueden incluir, pero sin carácter limitante: iniciadores PCR para un gen específico (o secuencia de DNA alterada por metilación o isla CpG); tampones PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción en gel; iniciadores de control positivos; iniciadores Ms-SNuPE para un gen específico; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos radiactivos. Adicionalmente, reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de DNA: tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de DNA (v.g. precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de DNA.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
MSP. La MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar los estados de metilación de prácticamente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; patente US No. 5786146). Resumidamente, el DNA se modifica por conversión con bisulfito de sodio de todas las citosinas no metiladas, pero no de las metiladas en uracilo, y se amplifica subsiguientemente con iniciadores específicos para DNA metilado frente al no
metilado.
Los pares de iniciadores MSP contienen al menos un iniciador, que se hibrida a un dinucleótido CpG tratado con bisulfito. Por esta razón, la secuencia de dichos iniciadores comprende al menos un dinucleótido CpG. Los iniciadores MSP específicos para DNA no metilado contienen una "T" en la posición 3' de la posición C en el CpG. Preferiblemente, por tanto, se requiere que la secuencia de bases de dichos iniciadores se requiere que comprenda una secuencia que tenga una longitud de al menos 9 nucleótidos que se hibride a la secuencia de ácido nucleico convertida con bisulfito, en la cual la secuencia de bases de dichos oligómeros comprende al menos un dinucleótido CpG. La MSP requiere únicamente pequeñas cantidades de DNA, es sensible a 0,1% de alelos metilados de un locus de isla CpG dado, y puede realizarse sobre DNA extraído de muestras incrustadas en parafina. Reactivos típicos (v.g., como podrían encontrarse en un kit típico basado en MSP) para análisis MSP pueden incluir, pero sin carácter limitante: iniciadores PCR metilados y no metilados para un gen específico (o secuencia de DNA o isla CpG alterada en metilación), tampones PCR y desoxinucleótidos optimizados, así como sondas específicas.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
MSP ANIDADA (Belinsky y Palmisano en la solicitud US 20040038245). Considerando el aparente conflicto del requerimiento de alta especificidad del iniciador MSP para diferenciar suficientemente entre las posiciones CG y TG, pero tolerando un desapareamiento a fin de crear un sitio de restricción único, se prefiere utilizar una versión modificada de MSP, conocida como MSP anidada, como se describe en WO 02/18649 y la solicitud de patente US 2004/0038245 por Belinsky y Palmisano. Este método para detectar la presencia de metilación de promotores específica de un gen, comprende los pasos de: expandir el número de copias de la región genética de interés utilizando una reacción en cadena de polimerasa para purificar una porción de dicha región donde reside la metilación del promotor, generando con ello un producto de amplificación; y utilizar una parte alícuota del producto de amplificación generado por la primera reacción en cadena de polimerasa en una segunda reacción en cadena de polimerasa específica de metilación para detectar la presencia de metilación. Dicho de otro modo, se realiza una PCR no específica de metilación antes de la PCR específica de metilación. El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
HEAVYMETHYL. (WO 02/072880; Cottrell SE et al. Nucleic Acids Res., 13 de enero de 2004; 32(1):e10). Una realización preferida adicional del método comprende el uso de oligonucleótidos bloqueadores. En el ensayo HeavyMethyl se hibridan oligonucleótidos de sondas bloqueantes al ácido nucleico tratado con bisulfito concurrentemente con los iniciadores PCR. La amplificación PCR del ácido nucleico se termina en la posición 5' de la sonda bloqueadora, de tal modo que se suprime la amplificación de un ácido nucleico donde está presente la secuencia complementaria a la sonda bloqueante. Las sondas pueden diseñarse para hibridación al ácido nucleico tratado con bisulfito de una manera específica del estado de metilación. Por ejemplo, para detección de ácidos nucleicos metilados dentro de una población de ácidos nucleicos no metilados, la supresión de la amplificación de los ácidos nucleicos que no están metilados en la posición en cuestión podría llevarse a cabo por el uso de sondas bloqueantes que comprenden un "CpA" o "TpA" en la posición en cuestión, en oposición a una "CpG" si se desea la supresión de la amplificación de los ácidos nucleicos metilados.
Para métodos PCR que utilizan oligonucleótidos bloqueadores, una disrupción eficiente de la amplificación mediada por polimerasa requiere que los oligonucleótidos bloqueadores no estén alargados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se consigue por el uso de bloqueadores que son 3'-desoxioligonucleótidos, u oligonucleótidos derivatizados en la posición 3' con un grupo hidroxilo distinto de "libre". Por ejemplo, los 3'-O-acetil-oligonucleótidos son representativos de una clase preferida de molécula bloqueadora.
Adicionalmente, debería excluirse la descomposición mediada por polimerasa de los oligonucleótidos bloqueadores. Preferiblemente, dicha exclusión comprende o bien el uso de una polimerasa que carece de actividad de 5'-3'-exonucleasa, o el uso de oligonucleótidos bloqueadores modificados que tienen, por ejemplo, puentes tioato en los términos 5' de los mismos, que hacen la molécula bloqueadora resistente a las nucleasas. Aplicaciones particulares pueden no requerir tales modificaciones 5' del bloqueador. Por ejemplo, si los sitios de fijación al bloqueador y el iniciador se solapan, excluyendo con ello la fijación del iniciador (v.g., con exceso de bloqueador), se excluirá sustancialmente la degradación del oligonucleótido bloqueador. Esto es debido a que la polimerasa no extenderá el iniciador hacia, y a través de (en la dirección 5'-3') del bloqueador - un proceso que normalmente da como resultado la degradación del oligonucleótido bloqueador hibridado.
Una realización bloqueador/PCR particularmente preferida, para los propósitos de la presente invención y como se implementa en esta memoria, comprende el uso de oligómeros de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) como oligonucleótidos bloqueadores. Tales oligómeros bloqueadores de PNA son idealmente adecuados, debido a que los mismos no se descomponen ni son extendidos por la polimerasa.
Preferiblemente, por tanto, se requiere que la secuencia de bases de dicho oligonucleótido bloqueante comprenda una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleótidos que se hibrida a la secuencia de ácido nucleico tratada químicamente, en donde la secuencia de bases de dichos oligonucleótidos comprende al menos un dinucleótido CpG, TpG o CpA.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
Preferiblemente, se realizan ensayos CPR en tiempo real especificados por el uso de tales iniciadores de acuerdo con la invención. Los ensayos PCR en tiempo real pueden realizarse con iniciadores específicos de metilación (MSP-tiempo real) como PCR específica de metilación ("MSP"; como se ha descrito arriba), o con iniciadores específicos de no metilación en presencia de bloqueadores específicos de metilación (HM en tiempo real) ("HEAVYMETHYL", como se ha descrito arriba). La PCR en tiempo real puede realizarse con cualesquiera sondas adecuadas marcadas detectablemente. Para detalle véase más adelante.
Los dos métodos citados (MSP o HM) pueden combinarse con el método de detección conocido como Methy-
Light^{TM} (una técnica PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999), que aumenta generalmente la especificidad de la señal generada en un ensayo de este tipo. Siempre que la sonda de tiempo real utilizada sea específica de metilación en sí misma, se hará referencia a la tecnología como MethyLight^{TM}, un método utilizado ampliamente.
Otro ensayo hace uso de la sonda específica de metilación, el denominado ensayo "QM" (metilación cuantitativa). Se realiza una amplificación PCR en tiempo real inespecífica de metilación, por consiguiente no sesgada, que va acompañada por el uso de dos sondas específicas de metilación (MethyLight^{TM}) una para el amplificado metilado y una segunda para el amplificado no metilado. De este modo, se generan dos señales que pueden utilizarse para a) determinar la relación de ácidos nucleicos metilados (CG) a ácidos nucleicos no metilados (TG), y al mismo tiempo b) puede determinarse la cantidad absoluta de ácidos nucleicos metilados, cuando se calibra el ensayo con una cantidad conocida de DNA de control.
MethyLight^{TM}. El ensayo MethyLight^{TM} es un ensayo de metilación cuantitativo de alta capacidad que utiliza tecnología PCR en tiempo real basada en fluorescencia (tasman.^{TM}) que no requiere manipulación adicional alguna después del paso PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). Resumidamente, el proceso MethyLight^{TM} comienza con una muestra mezclada de DNA genómico que se convierte, en una relación con bisulfito de sodio, en una agrupación mixta de diferencias de secuencias dependientes de la metilación de acuerdo con procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los residuos citosina no metilados en uracilo). Se realiza luego la PCR basada en fluorescencia, sea en una reacción PCR "no sesgada" (con iniciadores que no solapan los sitios de metilación CPG conocidos), o en una reacción "sesgada" (con iniciadores PCR que solapan los dinucleótidos CPG conocidos). La discriminación de secuencias puede ocurrir sea al nivel del procedo de amplificación o al nivel del proceso de detección por fluorescencia, o a ambos niveles.
El ensayo MethyLight^{TM} puede utilizarse como test cuantitativo para patrones de metilación en la muestra de DNA genómico, en donde ocurre discriminación de secuencias al nivel de hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción PCR proporciona la amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa un sitio de metilación particular supuesto. Un control no sesgado para la cantidad de DNA de entrada se proporciona por una reacción en la cual ni los iniciadores, ni la sonda recubren ningún dinucleótido CPG. Alternativamente, un test cualitativo para metilación genómica se obtiene por sondeo de la agrupación PCR sesgada con oligonucleótidos de control que no "ocultan" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de la técnica "MSP"), o con oligonucleótidos que ocultan sitios de metilación potenciales.
El proceso MethyLight^{TM} puede utilizarse con una sonda "TaqMano®" en el proceso de amplificación. Por ejemplo, se trata DNA genómico bicatenario con bisulfito de sodio y se somete a una o dos series de reacciones PCR utilizando sondas TaqMan®; v.g., con iniciadores sesgados y sonda TaqMano, o iniciadores no sesgados y sonda TaqMan®. La sonda TaqMano® está marcada dualmente con moléculas fluorescentes "informadora" y "apagadora", y está diseñada de modo que sea específica para una reacción con contenido relativamente alto de GC de tal modo que la misma funde a una temperatura de aproximadamente 10ºC más alta en el ciclo PCR que los iniciadores directo o inverso. Esto hace posible que la sonda TaqMan® se mantenga totalmente hibridada durante el paso PCR de reasociación/extensión. Dado que la polimerasa Taq sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, la misma alcanzará eventualmente la sonda TaqMan® reasociada. La actividad de endonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq desplazará luego la sonda TaqMan® por digestión de la misma para liberar la molécula informadora fluorescente para detección cuantitativa de su señal ahora no apagada utilizando una red de detección fluorescente en tiempo real.
Las variaciones de la metodología de detección TaqMan® que son adecuadas también para uso con la invención descrita incluyen el uso de tecnología de sonda dual (LightCycler^{TM}) o iniciadores fluorescentes de amplificación (tecnología Sunrise^{TM}). Ambas técnicas citadas pueden adoptarse de una manera adecuada para uso con DNA tratado con bisulfito, y adicionalmente para análisis de metilación en dinucleótidos CpG.
Los reactivos típicos (v.g., como podrían encontrarse en un kit típico basado en MethyLight^{TM}) para el análisis MethyLight^{TM} pueden incluir, pero sin carácter limitante: iniciadores PCR para secuencias específicas de bisulfito, es decir regiones genéticas convertidas con bisulfito (o DNA convertido con bisulfito o islas CpG convertidas con bisulfito); sondas (v.g. TaqMan® o el LightCycler^{TM}) específicas para dichas secuencias convertidas con bisulfito y amplificadas; tampones PCR y desoxinucleótidos optimizados; y una polimerasa, tal como polimerasa Taq.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación pueden llevar un marcador detectable directa o indirectamente. Se prefieren marcadores en la forma de marcadores de fluorescencia, radionucleidos, o fragmentos separables de moléculas que tienen una masa típica, que puede ser detectada en un espectrómetro de masas. Donde dichos marcadores son marcadores másicos, se prefiere que los amplificados marcados tengan una carga neta positiva o negativa simple, permitiendo una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección puede llevarse a cabo y visualizarse por medio de, v.g., espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) o utilizando espectrometría de masas por pulverización electrónica (ESI).
La Espectrometría de Masas por Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficiente para el análisis de biomoléculas (Karas & Hillenkamp, Anal. Chem., 60:2299-301, 1988). Se incrusta un analito en una matriz fotoabsorbente. La matriz se evapora por un pulso de láser corto, transportando así la molécula del analito a la fase vapor de una manera no fragmentada. El analito se ioniza por colisiones con moléculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones a un tubo de vuelo exento de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a velocidades diferentes. Los iones más pequeños alcanzan el detector más pronto que los de mayor tamaño. La espectrometría MALDI-TOF es muy adecuada para el análisis de péptidos y proteínas. El análisis de los ácidos nucleicos es algo más difícil (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995). La sensibilidad con respecto al análisis de ácidos nucleicos es aproximadamente 100 veces menor que en el caso de los péptidos, y decrece desproporcionadamente con el tamaño creciente de los fragmentos. Además, en el caso de los ácidos nucleicos que tengan una cadena principal con múltiples cargas negativas, el proceso de ionización por la vía de la matriz es considerablemente menos eficiente. En la espectrometría MALDI-TOF, la selección de la matriz juega un papel eminentemente importante. Para la desorción de péptidos, se han encontrado varias matrices muy eficientes que producen una cristalización muy fina. Existen ahora varias matrices sensibles al DNA; sin embargo, la diferencia de sensibilidad entre péptidos y ácidos nucleicos no se ha reducido. Esta diferencia de sensibilidad puede reducirse, sin embargo, por modificación química del DNA de tal manera que el mismo se haga más similar a un péptido. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de fosforotioato, en los cuales los fosfatos usuales de la cadena principal están sustituidos con tiofosfatos, pueden convertirse en un DNA de carga neutra utilizando química de alquilación simple (Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23:1367-73, 1995). El acoplamiento de una etiqueta de carga a este DNA modificado da como resultado un aumento en la sensibilidad MALDI-TOF hasta el mismo nivel que el encontrado para los péptidos.
Los amplificados pueden detectarse y/o analizarse adicionalmente por medio de oligonucleótidos que constituyen la totalidad o parte de una "red" o "chip de DNA" (es decir, una disposición de oligonucleótidos diferentes y/o PNA-oligómeros fijada a una fase sólida). Una red de este tipo de secuencias de oligonucleótidos y/o PDA-oligómeros diferentes puede caracterizarse, por ejemplo, en el sentido de que la misma está dispuesta en la fase sólida en la forma de un retículo rectangular o hexagonal. La superficie de la fase sólida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata, u oro. Puede utilizarse también nitrocelulosa así como plásticos tales como nailon, que pueden existir en la forma de pelets o también como matrices de resina. Una revisión de la técnica anterior en la fabricación de redes de oligómeros puede obtenerse de una edición especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, volumen 21, enero de 1999, y de la bibliografía citada en dicho lugar). Las sondas marcadas fluorescentemente se utilizan a menudo para el escaneo de redes de DNA inmovilizadas. La simple fijación de tintes Cy3 y Cy5 al 5'OH de la sonda específica es particularmente adecuada para marcadores de fluorescencia. La detección de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede realizarse, por ejemplo, por microscopía confocal. Los tintes Cy3 y Cy5, además de muchos otros, están disponibles comercialmente.
El procedimiento de conversión y amplificación con bisulfito de acuerdo con la invención puede utilizarse en combinación con este método de detección.
Una realización particularmente preferida de la invención es un método para proporcionar un ácido nucleico descontaminado para hibridación en una Red de DNA, preferiblemente una Red de Oligonucleótidos, adecuada para un análisis de metilación de DNA.
Por supuesto, una realización particular preferida de la invención es también un método mejorado para la conversión de DNA con bisulfito. De este modo, las citosinas no metiladas se convierten en uracilo en tanto que las citosinas metiladas permanecen inalteradas. De acuerdo con esta realización, se incuba un ácido nucleico con una solución que contiene el reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan y/o se desaminan, pero no se desulfonan todavía, como se ha descrito arriba. Después de ello, el ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado se mezcla con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación. Después de ello, el ácido nucleico molde se desulfona por incubación breve de la mezcla a una temperatura incrementada. A continuación, el ácido nucleico molde desulfonado se amplifica. En una variante particularmente preferida, la reacción de amplificación basada en polimerasa se inicia por una incubación breve a temperatura elevada (activación térmica). Simultáneamente, esta breve incubación a temperatura elevada sirve para desulfonar el ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado. Adicionalmente, se prefiere de modo particular que la polimerasa sea una polimerasa termoestable.
Esta realización particular tiene la ventaja, en comparación con métodos conocidos de tratamiento con bisulfito, de que el paso de purificación después del tratamiento con bisulfito se hace innecesario. Ésta es una simplificación que da como resultado reducción de costes y de esfuerzo de manipulación, minimiza la pérdida de DNA tratado con bisulfito y ahorra asimismo tiempo. Por consiguiente, el uso de esta realización se prefiere si las muestras de DNA se tratan con bisulfito y se amplifican subsiguientemente. Esto es especialmente preferido si se analizan grandes cantidades de muestras. El uso de esta realización se prefiere adicionalmente con relación a los métodos de detección sensibles para análisis de metilación de DNA tales como COBRA, MS-SNuPE, MSP, MSP anidada, HeavyMethyl y MethyLight.
Adicionalmente, la invención se refiere a un kit de test para la realización del método de acuerdo con la invención con un componente que contiene bisulfito, por ejemplo un reactivo o solución que contiene bisulfito, y un componente que contiene una actividad enzimática. Esta actividad enzimática degrada específicamente el DNA que contiene uracilo no sulfonado. En particular, esta actividad enzimática es una actividad de una DNA-glicosilasa y/o una endonucleasa, siendo preferentemente esta actividad enzimática la de una uracil-DNA-glicosilasa, y siendo más preferentemente esta actividad enzimática la de uracil-N-DNA-glicosilasa (UNG). La actividad de la enzima degradante añadida se caracteriza por su capacidad para producir sitios específicamente apirimidínicos y/o una o más mellas adyacentes a una base uracilo no sulfonada. En cualquier caso, esto dará como resultado un bloqueo de la replicación por DNA-polimerasa. En un kit de test particular, la actividad enzimática se caracteriza por escindir la base uracilo de la cadena principal de fosfodiéster de los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado, pero no tiene efecto alguno sobre el ácido nucleico que contiene uracilo sulfonado o sobre el ácido nucleico que contiene timina, que no contiene uracilo. Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean la replicación por las DNA-polimerasas, y son muy lábiles frente a la hidrólisis ácido/base.
Un kit de test adicional comprende uno o más de los componentes adicionales. Éstos pueden ser:
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uno(a) o más reactivos y/o solución desnaturalizante(s), por ejemplo: dioxano o dietilenglicol-dimetiléter (DME) o cualquier sustancia, que sea adecuada como se describe en WO 05/038051,
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uno o más agentes de barrido, por ejemplo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico u otros agentes de barrido como se describe en WO 01/98528 o WO 05/038051,
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uno o más iniciadores, que son adecuados para la amplificación de uno o más amplificados de DNA, entre otros el iniciador o iniciadores pueden modificarse, por ejemplo con un apagador y/o un marcador para detección como es bien conocido por una persona experta en la técnica, como el tinte FAM o el apagador de agujero negro BHQ o dabcyl,
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una o más sondas, que puede(n) ser cualquier sonda, que pueda utilizarse para registrar específicamente la amplificación de uno o más amplificados, por ejemplo en un ensayo de tiempo real, entre otras la sonda o sondas pueden modificarse, por ejemplo con un apagador y/o un marcador para detección como es bien conocido por una persona experta en la técnica como el tinte FAM o el apagador de agujero negro BHQ o dabcyl,
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uno o más bloqueadores, que son ácidos nucleicos y pueden utilizarse para bloquear la fijación de un iniciador específico o la replicación por la DNA-polimerasa, entre otros el bloqueador o bloqueadores pueden modificarse, por ejemplo con un apagador y/o un marcador para la detección como es bien conocido por una persona experta en la técnica como el tinte FAM o el apagador de agujero negro BHQ o dabcyl,
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uno o más tampones de reacción, que son adecuados para un tratamiento con bisulfito y/o una reacción PCR,
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nucleótidos, que pueden ser dATP, dCTP, dUTP y dGTP, o cualquier derivado de estos nucleótidos,
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MgCl_{2} como sustancia pura o en solución y/o cualquier otra sal de magnesio, que puede utilizarse para llevar a cabo una replicación de DNA polimerasa,
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DNA-polimerasa, por ejemplo polimerasa Taq o cualquier otra polimerasa con o sin actividad de lectura de pruebas, - tinte o apagador, que puede utilizarse para la detección de los amplificados como se conoce en la técnica, por ejemplo un tinte de intercalación como el Verde SYBR o un tinte para unión a un enlazador o sonda o bloqueador como el tinte FAM o el apagador de agujero negro BHQ o dabcyl, y/o
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cualquier reactivo, solución, dispositivo y/o instrucción que sea útil para realización de un ensayo de acuerdo con la invención.
Los métodos y kits de test aquí descritos se utilizan preferiblemente para la diagnosis y/o prognosis de sucesos adversos para pacientes o individuos, en donde diagnosis significa el diagnóstico de un suceso adverso, una predisposición para un suceso adverso y/o una progresión de un suceso adverso. Estos sucesos adversos pertenecen a al menos una de las categorías siguientes: interacciones indeseables con fármacos; enfermedades cancerosas; disfunciones, deterioro o enfermedad del CNS; síntomas de agresión o alteraciones del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de deterioro cerebral; alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedad, disfunción o deterioro cardiovascular; disfunción, deterioro o enfermedad del tracto gastrointestinal; disfunción, deterioro o enfermedad del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; disfunción, deterioro o enfermedad del cuerpo como una anormalidad en el proceso del desarrollo; disfunción, deterioro o enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; disfunción, deterioro o enfermedad endocrina y metabólica; dolores de cabeza o disfunción sexual.
Los métodos y kits de test sirven también de una manera particularmente preferida para diferenciar tipos de células, tejidos o para investigación de la diferenciación celular. Los mismos sirven de una manera particularmente preferida para análisis de la respuesta de un paciente a un tratamiento con fármaco.
De otra manera preferida, los métodos y kits de test de la invención pueden utilizarse también para caracterizar el estado de metilación del DNA en el que las posiciones están metiladas o no metiladas en comparación con condiciones normales si existe un estado de enfermedad simple definido. De una manera particularmente preferida, aquéllos pueden servir para identificar una diana específica de indicación, en donde un ácido nucleico molde se trata con bisulfito y actividad enzimática de UNG, y en donde una diana específica de indicación se define como diferencias en el estado de metilación del DNA de un DNA derivado de un tejido enfermo en comparación con un DNA derivado de un tejido sano. Estas muestras de tejidos pueden proceder de pacientes enfermos o sanos o de tejido enfermo o sano adyacente del mismo paciente.
De una manera particularmente preferida, la diana de indicación específica es una proteína, un péptido o una enzima, y en particular un modulador conocido per se de la proteína, péptido o enzima codificada está asignada con la indicación específica del tejido enfermo. De una manera particularmente preferida, este modulador sirve para preparar una composición farmacéutica con una indicación específica, en particular una indicación específica de cáncer.
De una manera particular preferida, la enzima UNG sirve como enzima para generación de ácidos nucleicos exentos de contaminación para análisis de metilación.
Breve descripción de los dibujos Figura 1
La Figura 1 describe la conversión completa de citosina no metilada en uracilo, denominada conversión con bisulfito.
El primer paso de esta reacción tiene lugar cuando se ponen en contacto bases citosina no metiladas con hidrogenosulfito a un pH aproximado de 5. La sulfonación tiene lugar en la posición 6 de la molécula cíclica (posición C6).
El segundo paso es la desaminación que tiene lugar más bien espontáneamente en solución acuosa y de este modo convierte citosina-sulfonato en uracil-sulfonato.
El tercer paso es el paso de desulfonación, que tiene lugar en condiciones alcalinas, dando como resultado uracilo.
Figura 2
La Figura 2 es un gráfico de amplificación en tiempo real de DNA metilado del gen GSTP1 a partir de DNA desulfonado convertido con bisulfito, de acuerdo con el estado de la técnica. El eje Y muestra la señal de fluorescencia medida en el canal F2 normalizado contra el canal F1 en cada ciclo (eje X). Se añadieron a la reacción 10 ng, 1 ng o respectivamente 0,1 ng de DNA metilado tratado con bisulfito. No se determinó señal alguna utilizando la mezcla de reacción que contenía uracil-DNA-glicosilasa (marcada con círculos vacíos) lo que indicaba una degradación completa del DNA convertido con bisulfito. La amplificación ocurre únicamente en ausencia de uracil-DNA-glicosilasa (marcada con rectángulos). El control sin molde se marca como línea continua.
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Figura 3
La Figura 3 es un gráfico de amplificación en tiempo real de DNA metilado del gen GSTP1 a partir de DNA convertido con bisulfito de acuerdo con el nuevo método reivindicado sin desulfonación. El eje Y muestra la señal de fluorescencia medida en el canal F2 normalizado contra el canal F1 en cada ciclo (eje X). Se añadieron a la reacción 10 ng, 1 ng o respectivamente 0,1 ng de DNA metilado tratado con bisulfito. Las señales generadas a partir de la reacción sin uracil-DNA-glicosilasa se marcan con círculos. No se determinó diferencia significativa alguna en amplificación a partir de la reacción que contenía uracil-DNA-glicosilasas (marcada con triángulos) lo que indica que DNA que contiene 6-sulfon-uracilo no es un molde para UNG. El control sin molde se marca como línea
continua.
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Figura 4
La Figura 4 demuestra la degradación eficiente del DNA que contiene uracilo. El gráfico muestra la reamplificación de productos PCR que contienen uracilo. El eje Y muestra la señal de fluorescencia medida en el canal F2 normalizado contra el canal F1 en cada ciclo (eje X). Se añadieron a la reacción 10^{5} copias. Las señales determinadas a partir de la reacción sin uracil-DNA-glicosilasa se marcan con diamantes, mostrando una reamplificación alta eficiente. La reacción que contiene uracil-DNA-glicosilasas da como resultado puntos de cruce espectacularmente incrementados (marcados con asteriscos) lo que indica una fuerte degradación de los productos PCR que contienen uracilo por UNG. El control sin molde se marca como línea continua.
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Figura 5
La Figura 5 muestra un gráfico de correlación de los resultados obtenidos en el Ejemplo 3 por el flujo de trabajo estándar y el método de acuerdo con la invención (prevención del arrastre). Cada símbolo representa una sola muestra: los cuadrados tejidos tumorales, y los triángulos tejidos normales adyacentes. El porcentaje de metilación determinado de acuerdo con el flujo de trabajo estándar (eje x) o con el método de acuerdo con la invención (eje y) se indica para cada muestra.
El método de acuerdo con la invención ha conducido solamente en 2 de 24 muestras a un porcentaje de metilación diferente que el flujo de trabajo estándar. Esto significa que aunque las muestras tratadas de acuerdo con el método de la invención estaban contaminadas con amplicones TPEF que contenían uracilo, únicamente el DNA de las muestras servía como molde para la amplificación del amplicón TPEF en casi todos los casos. En el caso de dichas 2 muestras, los resultados que diferían ocurrieron probablemente debido al bajo porcentaje de metilación del DNA (menor que 0,2%).
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Ejemplos Ejemplo 1 Amplificación de DNA metilado del gen GSTP1 (conocido también como gen GST-pi) en donde servía como molde DNA humano que contenía uracilos sulfonados
El uso de uracil-DNA-glicosilasa es un método bien conocido en la técnica para evitar resultados positivos falsos en métodos de amplificación basados en polimerasa, causados por contaminación cruzada por productos amplificados previamente (Pang J., Mol Cell Probes. 1992 Jun; 6(3):251-6). Sin embargo, este método no es aplicable para métodos de amplificación basados en polimerasa que tienen el propósito de detectar bases uracilo en el molde dado. Éste es el caso en el análisis de la metilación del DNA, en donde una vía para detectar la diferencia entre citosinas metiladas y no metiladas consiste en reflejar estas diferencias en la diferencia entre citosina y uracilo, lo que se facilita por el uso generalizado de métodos comunes de conversión con bisulfito. Éstos tienen el efecto de convertir las citosinas no metiladas en uracilos mientras que las citosinas metiladas permanecen como citosinas. Por tanto, en las reacciones de amplificación subsiguientes para detectar patrones de metilación, el molde contiene uracilos.
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En el ejemplo siguiente se demostró que el método de acuerdo con la invención permite la técnica basada en uracil-DNA-glicosilasa (UNG) para prevención del arrastre de DNA convertido con bisulfito, sin pérdida de la información crítica, qué bases estaban no metiladas y cuáles estaban metiladas. Para conseguir esto se realizaron los pasos siguientes:
\quad
Dos muestras de ácido nucleico, que contenían 1,5 \mug de DNA Universal Metilado GpGenome^{TM} (Chemicon International) diluidas en 100 \mul de agua se mezclaron con 354 \mul de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 \mul de dioxano que contenía un agente de barrido de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99ºC y se incubó subsiguientemente con el programa de temperatura siguiente durante un total de 5 h: 30 min a 50ºC; una primera punta térmica (99,9ºC) durante 3 min; 1,5 h a 50ºC; una segunda punta térmica (99,9ºC) durante 3 min; 3 h a 50ºC. Una de las mezclas de reacción servía como control, mientras que la otra se trató de acuerdo con la invención. Las mezclas de reacción tanto de la reacción de control como de la reacción de test se purificaron subsiguientemente por ultrafiltración por medio de una columna Millipore Microcon. La purificación se condujo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este propósito, la mezcla de reacción se mezcló con 200 \mul de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y se lavó subsiguientemente con agua. El DNA se mantiene en la membrana en este tratamiento. Para la muestra de control se realizó una desulfonación alcalina de acuerdo con los métodos, que constituyen técnica anterior (véanse por ejemplo los documentos US 20040152080, 20040115663, WO 2004/067545). Para este propósito, se añadieron 100 \mul de una solución de NaOH 0,2 mol/l y se incubaron durante 10 min. Para la otra muestra, se reemplazó este paso de desulfonación por adición de 100 \mul de agua. Se condujo luego una centrifugación (10 min), seguida por un paso final de lavado con agua. Después de esto, se eluyó el DNA. Para este propósito, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 50 \mul de tampón 1 x TE caliente (50ºC) ajustado a pH 7. La membrana se dio la vuelta de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Subsiguientemente, se condujo una centrifugación repetida, con la cual el DNA se separó de la membrana.
Subsiguientemente el DNA se guardó a 4ºC durante 12 h y se utilizó luego como molde en una reacción PCR.
Deteniendo la reacción química después de la sulfonación, todas las citosinas no metiladas se convierten en uracilos sulfonados en C6 (5,6-dihidro-6-sulfonil-uracilo) y las citosinas metiladas se mantienen inalteradas. Sin embargo, después de una desulfonación completa, como se describe en la técnica, todas las citosinas no metiladas se convierten en uracilo y las citosinas metiladas quedan inalteradas.
Como control para la actividad de UNG se añadieron 10^{5} copias de un producto PCR que contenía uracilo a la premezcla de reacción, generada por uso de los mismos iniciadores pero en presencia de dUTP en lugar de dTTP. La reamplificación tuvo lugar cuando estaba ausente UNG, con la eficiencia esperada de un punto de cruce de 22,6. Sin embargo, cuando estaba presente UNG en la mezcla de PCR los puntos de cruce alcanzaban solamente un valor de 35,8 (Figura 4). Esta diferencia demuestra sutilmente la degradación eficiente de los productos PCR por UNG resultante de la escisión de los uracilos del DNA. En este ejemplo se demostró que el DNA desulfonado tratado convencionalmente con bisulfito es degradado también por UNG (Figura 2). Sin embargo, el DNA no desulfonado tratado con bisulfito no se comporta como sustrato para UNG y sirve - incluso después de preincubación con UNG - como molde de trabajo en una reacción de amplificación (Figura 3).
En el ejemplo, la desulfonación del DNA molde requerida para la amplificación satisfactoria tuvo lugar durante la fase de desnaturalización inicial de la reacción PCR a 95ºC. La única condición previa para este paso es un pH alcalino, tal como el dado en el tampón PCR utilizado. Simultáneamente, termina la actividad de UNG y por tanto no es capaz de escindir o degradar ya producto PCR nuevamente generado.
En este ejemplo, se utilizaron como moldes 3 concentraciones diferentes (10 ng, 1 ng y 0,1 ng) de cada DNA desulfonado y sulfonado (que contenía 5,6-dihidro-uracilos sulfonados en posición 6) en dos reacciones PCR de iniciación en caliente diferentes.
En un caso, la mezcla de reacción contenía 0,2 unidades de UNG, y en el otro caso no se añadió cantidad alguna de UNG. Las reacciones PCR se realizaron en el Ciclador Ligero en un volumen de reacción de 20 \mul y contenían:
\quad
10 \mul de DNA molde (en concentraciones diferentes)
\quad
2 \mul de mezcla del Ciclador Ligero de iniciación en caliente para sondas de hibridación (Roche Diagnostics)
\quad
3,5 mM MgCl_{2} (Roche Diagnostics)
\quad
0,30 \muM iniciador directo (Seq ID-1, TIB-MolBiol)
\quad
0,30 mM iniciador inverso (Seq ID-2, TIB-MolBiol)
\quad
0,15 \muM sonda 1 (Seq ID-3, TIB-MolBiol)
\quad
0,15 \muM sonda 2 (Seq ID-4, TIB-MolBiol)
\quad
opcionalmente 0,2 unidades uracil-DNA-glicosilasa (Roche Diagnostics)
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El perfil temperatura-tiempo se programó como sigue:
\quad
Pre-incubación (UNG activa) 15 min a 25ºC
\quad
Activación de polimerasa: 20 min a 95ºC
\quad
50 ciclos de temperatura: 10 s a 95ºC
\quad
30 s a 56ºC
\quad
10 s a 72ºC
\quad
Finalmente, la mezcla de reacción se enfría a 35ºC.
Los iniciadores (Seq ID 1, Seq ID 2) usados amplifican un fragmento de 123 pb de longitud del gen GSTP1 (Seq ID 5, nt 1184 a nt 1304 en Acceso a GenBank X08058). Utilizando sondas de hibridación específicas de secuencia (Seq ID 3, Seq ID 4) la tasa de amplificación se detectó en una PCR en tiempo real. La interpretación de los datos se realizó por medio del Software LightCycler en el canal F2/F1.
El punto de cruce (Cp) se generó automáticamente empleando el método "Máximo de la Segunda Derivada" (Tabla 1).
Los resultados del experimento se resumen en la Tabla 1. La reamplificación de 10^{5} copias de amplicones que contienen uracilo da como resultado CT de 22,6 sin UNG y 35,8 con UNG. El retardo CT de 13 ciclos demuestra la degradación eficiente del molde que contiene uracilo por la glicosilasa. Asimismo el DNA desulfonado convertido con bisulfito era degradado por UNG y no podía medirse amplificación alguna en la reacción con UNG. En la reacción sin UNG, el DNA de 10, 1, y 0,1 ng se detectó a CT de 28,5/31,7/33,8. En contraste con esto, el DNA sulfonado, preparado de acuerdo con la invención, se amplificaba en ambos casos, sin y con uracil-DNA-glicosilasa prácticamente con la misma eficiencia, y se detectaron a CT de 29,3/32,2/34,1 y 29,9/32,7/34,8, respectivamente.
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TABLA 1 
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1
TABLA 2 Secuencias de oligonucleótidos
2
Fluo = marcador fluoresceína, red640 = marcador de fluorescencia LightCycler para el canal F2, PH = fosforilación en 3'OH. Las tes escritas en minúsculas indican citosinas convertidas por tratamiento con bisulfito, y respectivamente las aes minúsculas indican las bases complementarias de adenosina en la cadena inversa del complemento sintetizada.
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Ejemplo 2
En este experimento, se analizó la estabilidad de las bases nucleicas sulfonadas en presencia de actividad de UNG cuando se guardaron a 4ºC o 40ºC. De nuevo, dos muestras de ácido nucleico, que contenían 1,5 \mug de DNA Universal Metilado GpGenome^{TM} (Chemical International) diluido en 100 \mul de agua se mezclaron con 354 \mul de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 \mul de dioxano que contenía un agente de barrido de radicales (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99ºC y subsiguientemente se incubó con el programa de temperatura siguiente durante un total de 5 h: 30 min a 50ºC, una primera punta térmica (99,9ºC) durante 3 min; 1,5 h a 50ºC; una segunda punta térmica (99,9ºC) durante 3 min; 3 h a 50ºC. Una de las mezclas de reacción sirvió como control, mientras que la otra se trató de acuerdo con la invención. Las mezclas de reacción tanto del control como de la reacción de test se purificaron ulteriormente por ultrafiltración mediante una columna Millipore Microcon. La purificación se condujo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este propósito, la mezcla de reacción se mezcló con 200 \mul de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y se lavó subsiguientemente con agua. El DNA permanece en la membrana en este tratamiento. Para la muestra de control se realizó una desulfonación alcalina de acuerdo con los métodos, que constituyen el estado de la técnica (véanse por ejemplo los documentos US 20040152080, 20040115663 y WO 2004/067545) (designado como "desulfonado" en la Tabla 3). Para este propósito, se añadieron 100 \mul de una solución de NOH 0,2 mol/l y se incubó durante 10 min. Para la otra muestra, este paso de desulfonación se reemplazó por adición de 100 \mul de agua (designado "sulfonado" en la Tabla 3). Se condujo luego una centrifugación (10 min), seguida por un paso final de lavado con agua. Después de esto, se eluyó el DNA. Para este propósito, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 50 \mul de tampón 1 x TE (50ºC) ajustado a pH 7. La membrana se dio la vuelta de acuerdo con la instrucciones del fabricante. Subsiguientemente, se realizó una centrifugación repetida, con lo cual se separó el DNA de la membrana.
Subsiguientemente, el DNA se dividió en partes alícuotas y algunas de ellas se guardaron a 4ºC durante 12 h, y otras a 4ºC durante 144 h y se utilizaron luego como molde en una reacción PCR. Para demostrar la solidez del método de acuerdo con la invención, se decidió analizar si este efecto protector de la sulfonación se mantenía estable a lo largo del tiempo. La reacción PCR se realizó en las mismas condiciones.
Adicionalmente, se guardaron partes alícuotas a una temperatura incrementada de 40ºC durante 22 h y se utilizaron luego como molde en una reacción PCR.
Al detener la reacción química después de la sulfonación, las citosinas no metiladas se convirtieron en uracilos sulfonados en C6 (5,6-dihidro-6-sulfonil-uracilo) y las citosinas metiladas se mantenían inalteradas. No obstante, después de una desulfonación completa, como se describe en la técnica, todas las citosinas no metiladas se habrían convertido en uracilo en su lugar y las citosinas metiladas se habrían mantenido inalteradas.
Como control para la actividad de UNG, se añadieron 10^{5} copias de un producto PCR que contenía uracilo a la premezcla de reacción, generada por el uso de los mismos iniciadores pero en presencia de dUTP en lugar de dTTP. La reamplificación tuvo lugar cuando estaba ausente UNG, con la eficiencia esperada de un punto de cruce de 22,6. Sin embargo, cuando estaba presente UNG en la mezcla PCR, los puntos de cruce alcanzaban solamente un valor de 35,1 (Tabla 3). Esta diferencia demuestra sutilmente la degradación eficiente de los productos PCR por UNG resultante de la escisión de uracilos del DNA.
En este ejemplo pudo demostrarse que el DNA tratado con bisulfito que no está desulfonado de acuerdo con la invención es estable a 4ºC durante un periodo de tiempo más largo de al menos 144 horas. Adicionalmente, pudo demostrarse que incluso el almacenamiento a 40ºC durante un periodo de 22 horas no tiene un efecto importante sobre el efecto protector de UNG de la sulfonación en los uracilos C6.
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TABLA 3
3
Ejemplo 3 Comparación del método de acuerdo con la invención con el flujo de trabajo estándar por medio de la determinación de la tasa de metilación del gen TPEF (conocido también como TMEFF2) en tejido de cáncer de colon
Se extrajo 1 \mug de DNA genómico (200 \mul) de tumores y tejido normal adyacente de 12 pacientes con cáncer de colon, respectivamente. Las 24 muestras obtenidas de este modo se dividieron cada una en 2 x 100 \mul de DNA. Se trataron 100 \mul de cada muestra de acuerdo con procedimientos estándar (protocolo A de tratamiento con bisulfito, juego de muestras A) o con el método de acuerdo con la invención (protocolo B de bisulfito, juego de muestras B). Entretanto, se guardó el DNA a -20ºC.
Flujo de trabajo estándar Juego de muestras A
La medida del DNA se realizó de acuerdo con el ensayo de cuantificación C3 versión A y de acuerdo con el ensayo HeavyMethyl para la versión A del gen TPEF. Se generó un estándar A para calibración.
Generación del estándar A
5 tubos, cada uno con 2 \mug de DNA Universal Metilado se trataron con bisulfito de acuerdo con el protocolo A de tratamiento con bisulfito, y se agruparon después de ello. La concentración de DNA en solución se determinó por medio de UV a 260 nm después de la reacción con bisulfito.
Protocolo A de tratamiento con bisulfito (procedimientos estándar)
Se mezclaron 100 \mul de las muestras (juego de muestras A) que contenían 0,5 \mug de DNA diluido en 100 \mul de agua con 354 \mul de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 \mul de dioxano que contenía un agente de barrido (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99ºC y se incubó subsiguientemente con el programa de temperatura siguiente durante un total de 5 h: 30 min a 50ºC; una punta térmica de 99,9ºC durante 3 min; 1,5 h a 50ºC; una punta térmica de 99,9ºC durante 3 min; 3 h a 50ºC. El DNA de las mezclas de reacción se purificó subsiguientemente por ultrafiltración por medio de una columna Millipore Microcon. La purificación se condujo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este propósito, la mezcla de reacción se mezcló con 200 \mul de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y se lavó subsiguientemente con agua. El DNA permanece en la membrana en este tratamiento. Para la desulfonación completa, se añadieron 100 \mul de una solución de NaOH 0,2 mol/l y se incubó durante 10 min. Se condujo de nuevo una centrifugación durante 10 min, seguida por un paso final de lavado con agua. Después de esto, se eluyó el DNA. Para este propósito, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 \mul de tampón 1 x TE precalentado (50ºC) ajustado a pH 8,5. A continuación se dio la vuelta la membrana y se centrifugó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para recuperar el DNA de la membrana.
Ensayo de cuantificación C3 (EP 05075404)
El ensayo de cuantificación C3 es un ensayo de cuantificación específico para la cantidad total de DNA convertido con bisulfito como se describe en detalle en EP 05075404. El ensayo amplifica un fragmento de DNA que comprende posiciones múltiples de citosina (pero no CpG) en la forma genómica, que se convierten inicialmente en uracilo y se reemplazan durante la amplificación por timina en la variante convertida con bisulfito. De acuerdo con ello, el ensayo no cuantifica el DNA tratado con bisulfito no convertido o convertido parcialmente (es decir en el cual la secuencia diana comprende una o más posiciones de citosina que no se han convertido en timina). La cantidad de DNA en la muestra se deduce por comparación del CP medido (punto de cruce, que representa el ciclo de umbral) con una curva estándar que relaciona dichos valores CP con cantidades de DNA. La curva estándar se basa en medidas de cantidades conocidas de DNA convertido con bisulfito con el ensayo procedente.
Ensayo de cuantificación C3, versión A
Una mezcla de reacción de 20 \mul contenía:
\bullet
2 \mul del DNA molde
\bullet
2 \mul de mezcla LightCycler de iniciación rápida para sondas de hibridación (Roche Diagnostics)
\bullet
3,5 mmol/l MgCl_{2} (Roche Diagnostics)
\bullet
0,60 \mumol/l iniciador directo (Seq ID-6, TIB-MolBiol)
\bullet
0,60 pmol/l iniciador inverso (Seq ID-7, TIB-MolBiol)
\bullet
0,2 \mumol/l sonda 1 (Seq ID-8, TIB-MolBiol)
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo se realizó de acuerdo con el perfil temperatura-tiempo siguiente:
-
activación 10 min a 95ºC
-
50 ciclos: 10 s a 95ºC
30 s a 56ºC
10 s a 72ºC
Los iniciadores usados (Seq ID-6 y Seq ID-7) amplifican un fragmento de 123 pb del gen GSTP1 (Seq ID-9, nucleótido 2273 a nucleótido 2402 de GenBank, Número de Acceso X08058). La detección se realizó durante la fase de reasociación a 56ºC en el canal F1 a 530 nm. Los puntos de cruce (CP) se calcularon de acuerdo con el método "máximo de la segunda derivada" por medio del Software LightCycler.
\vskip1.000000\baselineskip
Detección de la tasa de metilación de acuerdo con el ensayo HeavyMethyl para la versión A del gen TPEF
Una mezcla de reacción de 20 \mul contenía:
\bullet
2 \mul de DNA molde
\bullet
2 \mul de mezcla LightCycler de iniciación rápida para sondas de hibridación (Roche Diagnostics)
\bullet
3,5 mmol/l MgCl_{2} (Roche Diagnostics)
\bullet
0,30 \mumol/l iniciador directo (Seq ID-10, TIB-MolBiol)
\bullet
0,30 \mumol/l iniciador inverso (Seq ID-11, TIB-MolBiol)
\bullet
4,0 \mumol/l bloqueador (Seq ID-12, TIB-MolBiol)
\bullet
0,15 \mumol/l sonda de hibridación (Seq ID-13, TIB-MolBiol)
\bullet
0,15 \mumol/l sonda de hibridación (Seq ID-14, TIB-MolBiol)
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo se realizó de acuerdo con el perfil temperatura-tiempo siguiente:
-
activación 10 min a 95ºC
-
50 ciclos: 10 s a 95ºC
30 s a 56ºC
10 s a 72ºC
Los iniciadores usados (Seq ID-10 y Seq ID-11) amplifican un fragmento de 113 pb del gen TPEF (Seq ID-15, nucleótido 1102 a nucleótido 1214 de GenBank, Número de Acceso AF242221). La detección se realizó durante la fase de reasociación a 56ºC en el canal F2/F1 a 640/530 nm. Los puntos de cruce (CP) se calcularon de acuerdo con el método del "máximo de la segunda derivada" por medio del Software LightCycler.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo de las cantidades de DNA a partir de CP
Tanto el ensayo de cuantificación C3 como el ensayo HeavyMethyl para el gen TPEF son ensayos PCR en tiempo real que utilizan un estándar externo para calcular la cantidad de DNA de las muestras medidas. El valor absoluto (ng) para una concentración desconocida se obtiene por una comparación de la amplificación de DNA en una muestra desconocida contra una curva estándar preparada con concentraciones conocidas de la misma diana. Las muestras estándar se amplifican en capilares separados, pero dentro de la misma operación del LightCycler. La curva estándar es la línea de regresión lineal a partir de los puntos de datos en una gráfica de puntos de cruce (ciclo umbral) frente al logaritmo de la concentración de la muestra estándar. La cantidad absoluta de DNA (ng) de la muestra desconocida coincide con los puntos de datos de la curva estándar para los cuales el CP de la muestra desconocida se ajusta a la curva estándar.
TABLA 4 Secuencia de Oligonucleótidos
5
Fluo = marcador fluoresceína, red640 = marcador de fluorescencia LightCycler para el canal F2, PH = fosforilación en 3'OH. FAM = marcador 5'-FAM, BHQ1 = apagador de agujero negro 1. Las tes escritas en minúsculas indican citosinas convertidas por tratamiento con bisulfito, y respectivamente las aes minúsculas indican las bases complementarias de adenosina en la cadena inversa del complemento sintetizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Método de acuerdo con la invención Juego de muestras B
La medida del DNA se realizó de acuerdo con el ensayo de cuantificación C3 versión B y de acuerdo con el ensayo HeavyMethyl para la versión B del gen TPEF con adición de 10.000 copias de un producto PCR de DNA metilado. Se generó para calibración un estándar B (DNA que contenía uracilo sulfonado en C6).
Generación del estándar B (DNA que contenía uracilo sulfonado en C6)
Se trataron con bisulfito 5 tubos, cada uno de los cuales contenía 2,0 \mug de DNA metilado universal, de acuerdo con el protocolo B de tratamiento con bisulfito. La concentración del DNA en solución se determinó por medio de UV a 260 nm después de la reacción con bisulfito.
Generación de productos PCR
10 ng de DNA metilado convertido con bisulfito generado de acuerdo con procedimientos estándar (protocolo de bisulfito A) se amplificaron por medio del ensayo HeavyMethyl para la versión A del gen TPEF. Los productos PCR se purificaron con el kit de purificación PCR QUIAquick y se analizaron subsiguientemente en un gel de agarosa al 2%. Después de esto, se realizó una dilución seriada con agua hasta una dilución final de 1:10^{10}. 2 \mul de esta dilución se reamplificaron y cuantificaron de acuerdo con el ensayo HeavyMethyl para la versión A del gen TPEF. El número de copias se determinó: 2 \mul de dicha dilución contienen 10.000 copias de producto PCR.
Protocolo B de tratamiento con bisulfito (protocolo para protección contra el arrastre)
100 \mul de las muestras (juego de muestras B) que contenían 0,5 \mug de DNA diluido en 100 \mul de agua se mezclaron con 354 \mul de solución de bisulfito (5,89 mol/l) y 146 \mul de dioxano que contenía un agente de barrido (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico, 98,6 mg en 2,5 ml de dioxano). La mezcla de reacción se desnaturalizó durante 3 min a 99ºC y se incubó subsiguientemente con el programa de temperatura siguiente durante un total de 5 h: 30 min a 50ºC; una punta térmica de 99,9ºC durante 3 min; 1,5 h a 50ºC; una punta térmica de 99,9ºC durante 3 min; 3 h a 50ºC. El DNA de las mezclas de reacción se purificó subsiguientemente por ultrafiltración mediante una columna Millipore Microcon. La purificación se condujo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este propósito, la mezcla de reacción se mezcló con 200 \mul de agua, se cargó en la membrana de ultrafiltración, se centrifugó durante 15 min y se lavó subsiguientemente con agua. El DNA permanece en la membrana en este tratamiento. En contraste con el protocolo A de tratamiento con bisulfito, el DNA no se incubó con NaOH, sino que se lavó adicionalmente con agua. Después de esto, se eluyó el DNA. Para este propósito, la membrana se mezcló durante 10 minutos con 75 \mul de agua precalentada (50ºC). A continuación se dio la vuelta la membrana y se centrifugó de acuerdo con las instrucciones del fabricante para recuperar el DNA de la membrana.
Ensayo de cuantificación C3, versión B
Una mezcla de reacción de 20 \mul contenía:
\bullet
2 \mul de DNA molde
\bullet
2 \mul de producto PCR (10.000 copias)
\bullet
2 \mul de mezcla LightCycler de iniciación rápida para sondas de hibridación (Roche Diagnostics)
\bullet
3,5 mmol/l MgCl_{2} (Roche Diagnostics)
\bullet
0,60 pmol/l iniciador directo (Seq ID-6, TIB-MolBiol)
\bullet
0,60 pmol/l iniciador inverso (Seq ID-7, TIB-MolBiol)
\bullet
0,2 pmol/l sonda 1 (Seq ID-8, TIB-MolBiol)
\bullet
0,2 unidades uracil-DNA-glicosilasa (Roche Diagnostics)
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo se realizó de acuerdo con el perfil temperatura-tiempo siguiente:
-
preincubación, 10 min a 37ºC
-
desulfonación/activación, 30 min a 95ºC
-
50 ciclos: 10 s a 95ºC
30 s a 56ºC
10 s a 72ºC
Los iniciadores usados (Seq ID-6 y Seq ID-7) amplifican un fragmento de 123 pb del gen GSTP1 (Seq ID-9, nucleótido 2273 a nucleótido 2402 de GenBank, Número de Acceso X08058). La detección se realizó durante la fase de reasociación a 56ºC en el canal F1 a 530 nm. Los puntos de cruce (CP) se calcularon de acuerdo con el método "máximo de la segunda derivada" por medio del Software LightCycler.
Detección de la tasa de metilación de acuerdo con el ensayo HeavyMethyl para la versión B del gen TPEF
Una mezcla de reacción de 20 \mul contenía:
\bullet
2 \mul de DNA molde
\bullet
2 \mul de producto PCR (10.000 copias)
\bullet
2 \mul de mezcla LightCycler de iniciación rápida para sondas de hibridación (Roche Diagnostics)
\bullet
3,5 mmol/l MgCl_{2} (Roche Diagnostics)
\bullet
0,30 \mumol/l iniciador directo (Seq ID-10, TIB-MolBiol)
\bullet
0,30 \mumol/l iniciador inverso (Seq ID-11, TIB-MolBiol)
\bullet
4,0 \mumol/l bloqueador (Seq ID-12, TIB-MolBiol)
\bullet
0,15 \mumol/l sonda de hibridación (Seq ID-13, TIB-MolBiol)
\bullet
0,15 \mumol/l sonda de hibridación (Seq ID-14, TIB-MolBiol)
\bullet
0,2 unidades uracil-DNA-glicosilasa (Roche Diagnostics)
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo se realizó de acuerdo con el perfil temperatura-tiempo siguiente:
-
preincubación, 10 min a 37ºC
-
desulfonación/activación, 30 min a 95ºC
-
50 ciclos: 10 s a 95ºC
30 s a 56ºC
10 s a 72ºC
Los iniciadores usados (Seq ID-10 y Seq ID-11) amplifican un fragmento de 113 pb del gen TPEF (Seq ID-15, nucleótido 1102 a nucleótido 1214 de GenBank, Número de Acceso AF242221). La detección se realizó durante la fase de reasociación a 56ºC en el canal F2/F1 a 640/530 nm. Los puntos de cruce (CP) se calcularon de acuerdo con el método "máximo de la segunda derivada" por medio del Software LightCycler.
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Cálculo de las cantidades de DNA a partir de CP
Tanto el ensayo de cuantificación C3 como el ensayo HeavyMethyl para el gen TPEF son ensayos PCR en tiempo real que utilizan un estándar externo para calcular la cantidad de DNA de las muestras medidas. El valor absoluto (ng) para una concentración desconocida se obtiene por una comparación de la amplificación de DNA en una muestra desconocida contra una curva estándar preparada con concentraciones conocidas de la misma diana. Las muestras estándar se amplifican en capilares separados, pero dentro de la misma operación del LightCycler. La curva estándar es la línea de regresión lineal a partir de los puntos de datos en una gráfica de puntos de cruce (ciclo umbral) frente al logaritmo de la concentración de la muestra estándar. La cantidad absoluta de DNA (ng) de la muestra desconocida coincide con los puntos de datos de la curva estándar para los cuales el CP de la muestra desconocida se ajusta a la curva estándar.
Cálculo de la tasa de metilación a partir de las cantidades de DNA: Los resultados del estudio se presentan como tasas de metilación de la región promotora del gen TPEF. De acuerdo con el método del valor PMR (Eads CA et al. Cancer Res 2001, Apr15; 61(8): 3410-8. PMID: 11309301) la tasa de metilación es igual al porcentaje de copias metiladas medido en una muestra como proporción del DNA total medido en la misma muestra. En la Tabla 5 y 6, se enumeran todos los CPs recibidos del ensayo C3 y el ensayo TPEF y las cantidades de DNA resultantes. En la columna de la derecha se muestra la tasa de metilación (PMR), que se calculó a partir de las cantidades de DNA enumeradas en las columnas anteriores.
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Resultados TABLA 5 Resultado del flujo de trabajo estándar
Las muestras de tejidos de cáncer de colon y tejido adyacente normal se trataron con bisulfito con el protocolo A de tratamiento con bisulfito seguido por cuantificación con el ensayo de cuantificación C3 versión A utilizando una curva de calibración obtenida por medio del estándar A. La tabla muestra los puntos de cruce y la cantidad de DNA calculada de dos réplicas. El ensayo HeavyMethyl para la versión A del gen TPEF detecta únicamente el DNA metilado de la región promotora del gen TPEF. La tabla muestra los valores CP medidos de dos réplicas y la cantidad de DNA calculada. Finalmente se calcularon los porcentajes de metilación (PMR) por la relación de DNA metilado y DNA total.
6 
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TABLA 6 Resultados generados por el método de acuerdo con la invención (prevención del arrastre)
Muestras de tejido de cáncer de colon y tejido adyacente normal se trataron con bisulfito según el protocolo B de tratamiento con bisulfito dando como resultado DNA que contenía uracilo sulfonado en C6. El DNA total se midió con el ensayo de cuantificación C3 versión B utilizando una curva de calibración obtenida por medio del estándar B. La tabla muestra los puntos de cruce y la cantidad de DNA calculada de dos réplicas. Antes de la medida del DNA metilado con el ensayo HeavyMethyl para la versión B del gen TPEF, las reacciones se contaminaron con 10.000 copias del amplicón de TPEF que contenía uracilo en lugar de timina. La tabla muestra el CP medido de dos réplicas y la cantidad de DNA calculada. Finalmente se calcularon los porcentajes de metilación (PMR) por la relación de DNA metilado y DNA total.
7
Los resultados obtenidos por el flujo de trabajo estándar y el método de acuerdo (sic) se comparan en un gráfico de correlación (Figura 5). Cada símbolo representa una sola muestra: los cuadrados tejidos tumorales, los triángulos tejidos normales adyacentes. El porcentaje de metilación determinado de acuerdo con el flujo estándar (eje x) o con el método de acuerdo con la invención (eje y) se indica para cada muestra.
El método de acuerdo con la invención ha conducido sólo en 2 de 24 muestras a un porcentaje de metilación distinto del flujo de trabajo estándar. Aunque las muestras tratadas de acuerdo con el método de la invención estaban contaminadas con amplicones TPEF que contenían uracilo, únicamente el DNA de las muestras sirvió como molde para la amplificación del amplicón TPEF en casi todos los casos. En el caso de dichas dos muestras, los resultados que diferían ocurrieron probablemente debido al bajo porcentaje de metilación del DNA (< 0,2%).

Claims (20)

1. Un método para proporcionar un ácido nucleico descontaminado adecuado para análisis de metilación del DNA, caracterizado por
a)
incubar un ácido nucleico con una solución que contiene reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan y/o se desaminan, pero en donde no tiene lugar reacción de desulfonación alguna, y
b)
añadir a esta mezcla una enzima, que degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado y no degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilo sulfonado, e incubar la mezcla, con lo cual los ácidos nucleicos que contienen uracilos no sulfonados se degradan.
2. Un método de la reivindicación 1 para proporcionar un ácido nucleico molde descontaminado para reacciones de amplificación basadas en polimerasa, caracterizado por
a)
mezclar el ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación, y
b)
después de degradación de los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado, terminar la actividad enzimática, que causaba la degradación del ácido nucleico que contiene uracilo no sulfonado y
c)
desulfonar el ácido nucleico molde.
3. El método de la reivindicación 2, en donde los pasos b) y c) tienen lugar simultáneamente por incubación breve de la mezcla a una temperatura incrementada, con lo cual la actividad enzimática, que degrada específicamente los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado, se termina y por lo cual tiene lugar la desulfonación del ácido nucleico molde.
4. El método de la reivindicación 2, en donde en un paso d) subsiguiente el ácido nucleico molde se amplifica.
5. El método de la reivindicación 2, en donde la enzima, que degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilo no sulfonado y no degrada los ácidos nucleicos que contienen uracilo sulfonado es una DNA-glicosilasa o endonucleasa, en particular uracil-DNA-glicosilasa.
6. El método de la reivindicación 2, en donde después de la terminación de la actividad enzimática, que causa una degradación de los ácidos nucleicos que contienen uracilo sulfonado, y desulfonación del ácido nucleico molde, se inicia una reacción de amplificación basada en polimerasa y/o se realiza un ensayo basado en amplificación.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la reacción de amplificación basada en polimerasa se inicia por una breve incubación a temperatura incrementada (activación térmica).
8. El método de la reivindicación 6, en donde la polimerasa es una polimerasa termoestable.
9. El método de la reivindicación 6, en donde la amplificación mediada por polimerasa o el ensayo basado en amplificación se realiza en presencia de dUTPs en lugar de dTTPs.
10. Un método para un tratamiento con bisulfito y amplificación subsiguiente de un ácido nucleico, caracterizado porque
a)
el ácido nucleico se incuba con una solución que contiene reactivo bisulfito, con lo cual las citosinas no metiladas en dicho ácido nucleico se sulfonan y/o se desaminan, pero en el cual no tiene lugar desulfonación alguna;
b)
el ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado se mezcla con los componentes requeridos para una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación;
c)
el ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado se desulfona, por una incubación breve de la mezcla a una temperatura incrementada.
11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico molde desulfonado se amplifica, preferiblemente con una reacción de amplificación mediada por polimerasa o un ensayo de detección basado en amplificación, en donde se utiliza preferiblemente una polimerasa termoestable.
12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la reacción de amplificación basada en polimerasa se inicia por una breve incubación a temperatura incrementada (activación térmica), por lo cual simultáneamente al comienzo de la amplificación puede tener lugar la desulfonación del ácido nucleico molde sulfonado y/o desaminado.
13. Kit de test que puede utilizarse para la realización del método de acuerdo con una o más de las reivindicaciones anteriores con los componentes siguientes: un reactivo que contiene bisulfito y una actividad enzimática, que degrada específicamente el DNA que contiene uracilo no sulfonado y no degrada el DNA que contiene uracilo sulfonado, siendo en particular esta actividad enzimática uracil-DNA-glicosilasa.
14. Kit de test de la reivindicación 13, que comprende uno o más de los componentes adicionales siguientes: reactivo y solución de desnaturalización; agente de barrido; iniciador, sonda, tampón de reacción, nucleótidos, solución de MgCl_{2}, polimerasa y/o tinte para la producción de amplificados; y/o reactivo, solución e instrucciones, que son útiles para conducir un ensayo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores.
15. Uso de un kit de test de la reivindicación 13 ó 14 para diagnosis y/o prognosis de sucesos adversos para pacientes o individuos, en donde estos sucesos adversos pertenecen a al menos una de las categorías siguientes: interacciones indeseables con fármacos; enfermedades cancerosas; disfunciones, deterioro o enfermedad del CNS; síntomas de agresión o alteraciones del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de deterioro cerebral; alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedad, cardiovascular del tracto gastrointestinal (sic); disfunción, deterioro o enfermedad del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; disfunción, deterioro o enfermedad del cuerpo como una anormalidad en el proceso del desarrollo; disfunción, deterioro o enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; disfunción, deterioro o enfermedad endocrina y metabólica; dolores de cabeza o disfunción sexual.
16. Uso de un kit de test de la reivindicación 13 ó 14 para diferenciar tipos de células o tejidos o para investigar la diferenciación celular.
17. Uso del método de las reivindicaciones 1 a 12 o de un kit de test de la reivindicación 13 ó 14 para análisis de metilación en el que el estado de metilación del DNA se caracteriza porque ciertas posiciones están metiladas o no metiladas comparadas con condiciones normales si existe una enfermedad simple definida.
18. Uso de la enzima uracil-DNA-glicosilasa para la generación de ácidos nucleicos exentos de contaminación para análisis de metilación.
19. Uso del método de las reivindicaciones 1 a 12 para análisis de metilación, en donde el análisis de metilación se realiza sobre muestras de pacientes o individuos para diagnosticar y/o pronosticar sucesos adversos para los mismos, en donde estos sucesos adversos pertenecen a al menos una de las categorías siguientes: interacciones indeseables con fármacos; enfermedades cancerosas; disfunciones, deterioro o enfermedad del CNS; síntomas de agresión o alteraciones del comportamiento; consecuencias clínicas, psicológicas y sociales de deterioro cerebral; alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedad, cardiovascular del tracto gastrointestinal (sic); disfunción, deterioro o enfermedad del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; disfunción, deterioro o enfermedad del cuerpo como una anormalidad en el proceso del desarrollo; disfunción, deterioro o enfermedad de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; disfunción, deterioro o enfermedad endocrina y metabólica; dolores de cabeza o disfunción sexual.
20. Uso del método de las reivindicaciones 1-12 para análisis de metilación, en donde el análisis de metilación se realiza para diferenciar tipos de células o tejidos o para investigar la diferenciación celular.
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