ES2308570T3 - Metodo para generar transcritos. - Google Patents
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Abstract
Método para generar transcritos a partir * de al menos una secuencia de ARN a amplificar que comprende una región "cebador" y una región de interés y * de un cebador de amplificación que comprende una región promotora y una región capaz de hibridar con dicha región "cebador" de la secuencia de ARN a amplificar, realizándose dicho método a temperatura constante y comprendiendo las siguientes etapas: a) se hibrida dicho cebador con el ARN a amplificar, b) se elonga el cebador mediante una actividad enzimática de transcriptasa inversa para generar una secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del ARN a amplificar, c) se corta el ARN a amplificar, hibridado con dicho ADNc, mediante una enzima que tiene una actividad ribonucleasa H, para obtener fragmentos de ARN a amplificar hibridados con dicho ADNc, d) se elongan los extremos de dichos fragmentos de ARN a amplificar con una enzima transcriptasa inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener híbridos ARN-ADN/ADN e) se obtienen transcritos de ARN a partir de los híbridos ARN-ADN/ADN formados durante la etapa d) con una enzima que tiene una actividad ARN polimerasa.
Description
Método para generar transcritos.
La presente invención se refiere a un método
para la amplificación de secuencias diana de ácido nucleico.
A menudo es necesario, en las tecnologías
relativas a los ácidos nucleicos y al material genético, determinar
si un gen, una parte de un gen o una secuencia de nucleótidos está
presente en un organismo vivo, un extracto celular de este
organismo o cualquier otra muestra biológica. El interés de la
búsqueda de secuencias de nucleótidos específicas es enorme,
particularmente para la detección de organismos patógenos, la
determinación de la presencia de alelos, la detección de la
presencia de lesiones en un genoma hospedador y la detección de la
presencia de un ARNm particular o de la modificación de un
hospedador celular. De este modo pueden diagnosticarse muchas
enfermedades genéticas mediante el análisis, e incluso la
cuantificación, de la expresión de algunos genes. La cuantificación
de la expresión de estos genes también es fundamental.
En la bibliografía se describen diferentes tipos
de métodos de detección de ácidos nucleicos. Estos métodos, y
particularmente los que requieren la detección de polinucleótidos,
se basan en las propiedades de apareamiento de las cadenas
complementarias de ácidos nucleicos en los dúplex
ADN-ADN, ADN-ARN y
ARN-ARN mediante el establecimiento de puentes de
hidrógeno entre las bases adenina y timina (A-T) y
las bases guanina y citosina (G-C) del ADN de doble
cadena o también entre las bases adenina y uracilo
(A-U) en los dúplex ADN-ARN o
ARN-ARN. El apareamiento de cadenas de ácidos
nucleicos se denomina comúnmente "hibridación de ácidos
nucleicos" o simplemente "hibridación".
De manera general, después de identificar la
secuencia específica de un organismo o de una enfermedad que debe
analizarse, es conveniente extraer los ácidos nucleicos de una
muestra y determinar si esta secuencia (también llamada
"secuencia de interés") está presente. Se han desarrollado
muchos métodos de detección con este fin.
El método más directo para detectar la presencia
de una secuencia de interés en una muestra de ácidos nucleicos es
obtener una "sonda" cuya secuencia sea lo suficientemente
complementaria a una parte del ácido nucleico diana para hibridar
con éste. La sonda sintetizada de este modo puede ponerse en
presencia de una muestra que contenga ácidos nucleicos y, si la
secuencia de interés está presente, la sonda hibridará y formará un
producto de reacción. En ausencia de secuencia de interés y evitando
cualquier fenómeno de hibridación no específica, no se formará
ningún producto de reacción. Si la sonda sintetizada se acopla a un
marcador detectable, el producto de reacción puede detectarse
midiendo la cantidad de marcador presente. La transferencia de
Southern (Southern E.M, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) o Northern o
la técnica Dot Blot o la hibridación sándwich (DUNN A.R. y HASSEL
J.k, Cell, 12, 23 (1977)) constituyen ejemplos de métodos
utilizables.
La principal dificultad de este enfoque es, sin
embargo, que no es directamente aplicable a los casos en los que el
número de copias de la secuencia de interés presente en una muestra
es pequeño. En estas condiciones, es difícil distinguir una señal
significativa superior al ruido de fondo de la reacción (es decir
distinguir la fijación específica de una sonda a su secuencia de
interés de la fijación no específica entre la sonda y una secuencia
diferente de la secuencia de interés). Una de las soluciones a este
problema consiste en aumentar la señal de detección mediante una
reacción suplementaria. Como consecuencia, se han descrito diversos
métodos para aumentar la potencia de detección de estas técnicas de
hibridación. Estos métodos llamados de "amplificación" pueden
clasificarse en tres categorías: amplificación de diana, de sonda o
de señal. Los artículos de Lewis (1992, Genetic Engineering News
12: 1-9) por un lado y de Abramson y Myers (1993,
Curer. Opus. Biotechnol. 4: 4147), por otro, constituyen buenas
revisiones generales de estos métodos.
La amplificación de diana consiste en
multiplicar de manera específica un fragmento de ácido nucleico
presente en una muestra. Esta técnica permite aumentar
considerablemente el número de copias de una secuencia nucleica
diana a detectar.
Las técnicas de amplificación de diana descritas
en la bibliografía se basan principalmente en la repetición de
ciclos de síntesis de ADN in vitro mediante elongación de
cebadores nucleotídicos hibridados en la secuencia diana a
amplificar con una ADN polimerasa ("Reacción en cadena de la
polimerasa", llamada PCR: véase las patentes US 4 683 195, US 4
683 202 y US 4 800 159; EP 201 184; el método llamado "Repair
Chain Reaction" o RCR; véase solicitud de patente WO 90/01069;
el método llamado de amplificación por desplazamiento de cadena o
"Strand Displacement Amplification" (SDA); véase la patente EP
O 497 272; el método de amplificación por desplazamiento de cadena
utilizando una exonucleasa o "exonuclease-mediated
strand displacement amplification": véase la patente EP 500 224)
o en la repetición de ciclos de síntesis de ARN in vitro,
mediante reacción de transcripción con ayuda de una ARN
polimerasa.
Se han descrito varios de estos métodos de
amplificación de diana basados en la amplificación de transcritos.
El método llamado TAS, descrito en la solicitud de patente WO
88/10315, consiste en la repetición de un ciclo de tres etapas. La
primera etapa permite sintetizar un ADNc a partir de ARN en
presencia de una transcriptasa inversa y de un cebador
desoxinucleotídico que contiene una secuencia específica de promotor
de ARN polimerasa fágica. Seguida de la desnaturalización térmica
del heterodúplex ARN/ADNc, la hebra monocatenaria de ADNc es
replicada por la transcriptasa inversa en presencia de un cebador
oligonucleotídico anti-sentido. El homodúplex de
ADN obtenido de este modo durante esta segunda etapa contiene un
promotor de doble cadena sobre el que puede fijarse una ARN
polimerasa fágica dependiente de ADN. La tercera etapa es una
transcripción, que conduce a la obtención de 30 a 1000 moléculas de
ARN por matriz que, a su vez, podrán servir de matriz para la
síntesis de ADNc y continuar así el ciclo de amplificación (DAVIS
et al., 1990. J. Infect. Dis. 162:
13-20).
Existen diferentes métodos derivados de la TAS,
como la replicación de secuencia auto mantenida, llamada
"Self-Sustained Sequence Replication" (o 3SR),
descrita en la solicitud de patente WO 90/06995 y la patente EP O
373 960, el método llamado "Nucleic Acid
Sequence-Based Amplification" (o NASBA) descrito
en la solicitud de patente WO 91/02818 y la patente europea EP 329
822 y el método de replicación de secuencia con ayuda de un solo
cebador llamado "Single Primer Sequence Replication" (o SPSR)
descrito en la patente US 5 194 370.
Estos métodos tienen en común la asociación de
tres actividades enzimáticas: ADN polimerasa dependiente de ARN y
de ADN (transcriptasa inversa), ribonucleasa H (ARNasa H, enzima de
Escherichia coli y/o actividad enzimática asociada a la
transcriptasa inversa) y ARN polimerasa dependiente de ADN (ARN
polimerasa del bacteriófago T7). Estos métodos se basan en el mismo
principio y se realizan a una temperatura fija (de 37 a 45ºC), de
acuerdo con un proceso continuo de reacciones de transcripción
inversa y de transcripción para replicar una diana de ARN por medio
de ADNc. Como en el caso de la TAS, se introduce un sitio de
fijación de una ARN polimerasa (fago T7) en el ADNc mediante el
cebador utilizado para la etapa de transcripción inversa. Sin
embargo, la desnaturalización del heterodúplex ARN/ADNc se realiza
de forma isotérmica mediante hidrólisis específica del ARN de este
heterodúplex mediante actividad ARNasa H. A continuación el ADNc
libre se replica a partir de un segundo cebador oligonucleotídico
mediante la transcriptasa inversa. El homodúplex ADN/ADN se
transcribe a ARN mediante la ARN polimerasa T7 y este ARN puede
servir de nuevo como matriz para el siguiente ciclo.
Otro método, llamado "Ligation Activated
Transcription" (o LAT) descrito en la patente US 5 194 370,
utiliza las mismas actividades enzimáticas que los métodos 3SR,
SPSR y NASBA y funciona en el mismo ciclo. Sin embargo, este método
difiere en el modo de instalación de una secuencia promotora que en
este caso se introduce en el extremo del ADNc mediante ligamiento
de una estructura varilla-bucle que contiene el
promotor, en presencia de una ADN ligasa.
También existen otros dos métodos de
amplificación de diana basados en la amplificación de transcritos
descritos en la solicitud de patente EP 369 775. Uno difiere de LAT
únicamente por el hecho de que el promotor está constituido por dos
oligonucleótidos distintos.
El otro utiliza dos actividades enzimáticas, una
ligasa y una ARN polimerasa que reconocen un promotor de ADN de
doble cadena, capaz de elongarse en la matriz de ARN. El promotor,
llamado promotor móvil, está constituido por dos oligonucleótidos.
Uno lleva una secuencia promotora sentido y una secuencia sonda que
permite la hibridación con el extremo 3' de una diana de ARN, el
otro lleva solamente una secuencia promotora
anti-sentido. Por hibridación, el extremo 5' del
oligonucleótido promotor anti-sentido se yuxtapone
al extremo 3' de la diana y después se liga con este mismo extremo.
La transcripción con la ARN polimerasa apropiada da como resultado
la síntesis de múltiples transcritos. Estos transcritos se hibridan
y se ligan a un segundo promotor móvil. La transcripción de la
matriz de ARN da como resultado la síntesis de transcritos
complementarios. El proceso puede repetirse, lo que conduce a una
amplificación exponencial de la secuencia diana inicial.
También puede mencionarse el método descrito en
la solicitud de patente WO 99/4385 que es un método de amplificación
específica de ácidos nucleicos. Este método de amplificación
también se basa en la transcripción pero solo necesita un único
cebador. Éste, bloqueado en posición 3', permite la adición de una
secuencia promotora T7 en posición 3' de un ARN sentido. Esta
secuencia permite entonces la transcripción de ARNc
anti-sentido. Este método no es específico ya que
el cebador utilizado hibrida con la cola poliA de los ARNm.
De manera general, los métodos de amplificación
tales como PCR o NASBA necesitan dos cebadores para la obtención de
un amplicón. De ello resulta entonces que los propios productos de
la reacción de amplificación se convierten en matrices para la
amplificación, lo que hace a la amplificación de tipo exponencial.
Aunque los métodos permiten obtener muy buenos rendimientos de
amplificación, siguen estando mal adaptados para la amplificación
simultánea de varias dianas (hablamos de la amplificación en
múltiplex), etapa sin embargo indispensable cuando se quiere
analizar un perfil de expresión de varios genes. Además, el método
descrito en la solicitud WO 99/4385 se basa en la amplificación del
conjunto de los ARNm, lo que puede contribuir a producir ruido de
fondo durante un análisis en chip de ADN. Además, este método se
limita a la región 3' de los genes. Por lo tanto, este método está
mal adaptado para el estudio de una mutación o de una región diana
situadas en medio del gen o en su región 5'.
La presente invención se propone resolver el
conjunto de inconvenientes del estado de la técnica presentando un
método de amplificación específico, lineal, que permite amplificar
simultáneamente regiones diana de diferentes genes, pudiendo
situarse dichas regiones diana en posición 3', 5' o en medio del
gen.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ello, la invención se refiere a un método
para generar transcritos a partir
\bullet de una secuencia de ARN a amplificar
que comprende una región "cebador" y una región de interés
y
\bullet de un cebador de amplificación que
comprende una región promotora y una región capaz de hibridar con
dicha región "cebador" de la secuencia de ARN a amplificar,
\vskip1.000000\baselineskip
realizándose dicho método a temperatura
constante y comprendiendo las siguientes etapas:
- a)
- se hibrida dicho cebador con el ARN a amplificar,
- b)
- se elonga el cebador mediante una actividad enzimática de transcriptasa inversa para generar una secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del ARN a amplificar,
- c)
- se corta el ARN a amplificar, hibrida con dicho ADNc, mediante una enzima que tiene una actividad ribonucleasa H, para obtener fragmentos de ARN a amplificar, hibridados con dicho ADNc,
- d)
- se elongan los extremos de dichos fragmentos de ARN a amplificar con una enzima transcriptasa inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener híbridos ARN-ADN/ADN
- e)
- se obtienen transcritos de ARN a partir de los híbridos ARN-ADN/ADN formados durante la etapa d) con una enzima que tiene una actividad ARN polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención, se entiende por
transcrito un producto de transcripción, es decir un ARN
neosintetizado durante la transcripción de la matriz bajo la
dependencia del promotor que ha iniciado la transcripción.
Se entiende por secuencia, una secuencia
de nucleótidos que contiene las bases naturales (A, C, G, T si es
una secuencia de naturaleza desoxirribonucleotídica, A, C, G, U si
es una secuencia de naturaleza ribonucleotídica) natural y/o una o
más bases modificadas, tales como inosina,
metil-5-desoxicitidina,
desoxiuridina,
dimetilamino-5-desoxiuridina,
diamino-2,6-purina,
bromo-5-desoxiuridina o cualesquiera
bases modificadas que permitan una reacción de hibridación. La
secuencia de polinucleótidos también puede estar modificada a nivel
de los enlaces internucleotídicos (que pueden implicar por ejemplo
enlaces fosforotioato, H-fosfonato, alquil
fosfonato) o a nivel del esqueleto como es el caso por ejemplo para
los alfa-oligonucleótidos (patente francesa Nº 2 607
507) o PNA (EGHOLM et al., 1992, J. Am. Chem. Soc.
1141895-1987). En una secuencia polinucleotídica
modificada, pueden estar presentes varias modificaciones tales como
las indicadas anteriormente en combinación. Esta secuencia puede ser
de naturaleza ADN, ARN o de naturaleza quimérica ADN/ARN y posee
generalmente una "longitud" de al menos 5
desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos, pudiendo contener
opcionalmente al menos un nucleótido modificado. Una secuencia puede
contener diferentes regiones, cada una asociada a diferentes
funciones.
Para realizar el método de acuerdo con la
invención, se parte de una secuencia de ARN a amplificar, que podría
calificarse de primer modelo de ARN a amplificar. En la
presente invención, el ARN a amplificar puede ser una secuencia
cualquiera de ácido ribonucleico. Preferiblemente, el ARN a
amplificar es un ARN mensajero.
El ARN a amplificar comprende particularmente
una región de interés, es decir un polinucleótido que puede
hibridar con una sonda de hibridación, específica de dicha región de
interés. De este modo, esta sonda permite, tal como se describe a
continuación, la detección de la presencia o la ausencia de la
región de interés.
Este ARN a amplificar comprende también una
región "cebador", es decir un polinucleótido sobre el
que puede hibridar específicamente un cebador de amplificación tal
como se define a continuación. Preferiblemente, la región
"cebador" se sitúa en la región 3' de la región de interés de
la secuencia de ARN a amplificar.
Por secuencia o región capaz de hibridar con
otra secuencia/región, se entiende una secuencia o una región
que puede hibridar con otra secuencia/región en condiciones de
hibridación, que pueden determinarse en cada caso de forma
conocida. También se habla de secuencias/regiones complementarias.
Una secuencia o región estrictamente complementaria de otra es una
secuencia en la que cada una de las bases puede emparejarse con una
base de la otra secuencia, sin emparejamiento erróneo. Por
hibridación, se entiende el proceso durante el cual, en las
condiciones apropiadas, dos fragmentos nucleotídicos, que tienen
secuencias suficientemente complementarias pueden formar una doble
cadena con puentes de hidrógeno estables y específicos. Las
condiciones de hibridación vienen determinadas por la rigurosidad,
es decir el rigor de las condiciones operatorias. La hibridación es
tanto más específica cuanto a mayor rigurosidad se realiza. La
rigurosidad se define particularmente en función de la composición
de bases de un dúplex sonda/diana, así como por el grado de
emparejamiento erróneo entre dos ácidos nucleicos.
La rigurosidad también puede estar en función de
los parámetros de la reacción, tales como la concentración y el
tipo de especies iónicas presentes en la solución de hibridación, la
naturaleza y la concentración de agentes desnaturalizantes y/o la
temperatura de hibridación. La rigurosidad de las condiciones en las
que debe realizarse una reacción de hibridación dependerá
principalmente de las sondas de hibridación utilizadas. Todos estos
datos son bien conocidos y las condiciones apropiadas pueden ser
determinadas por el especialista en la técnica.
\newpage
En la presente invención, se entiende por
cebador de amplificación una secuencia que, cuando hibrida
con un ácido nucleico (de naturaleza ADN o ARN) a amplificar,
permite iniciar una reacción de elongación. El cebador utilizado en
la presente invención puede dividirse en 2 regiones, que son, en
sentido 5'-3':
\bullet una región promotora, que puede ser
reconocida por una ARN polimerasa para iniciar la transcripción, es
decir la síntesis de un ARN. Esta región promotora comprende un
promotor y un sitio de iniciación de la transcripción por una ARN
polimerasa. Esta región promotora comprende particularmente una de
las cadenas de un promotor de una ARN polimerasa. Como ejemplo,
pueden mencionarse los promotores naturales de las ARN polimerasas,
secuencias acortadas derivadas de los promotores naturales y que han
conservado su funcionalidad o también las estructuras en forma de
"bucles" capaces de iniciar la transcripción, tales como las
descritas en el documento MOLLEGAARD N.E. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3892-3895. Esta región
promotora puede comprender también una secuencia favorable a la
iniciación de la transcripción, cuya función es limitar la formación
de transcritos abortivos. La ARN polimerasa puede ser dependiente
de ADN, lo que permite la transcripción de un ARN a partir de una
secuencia de ADN.
\bullet una región capaz de hibridar con la
región "cebador" del ARN a amplificar, es decir complementaria
de dicha región "cebador" del ARN a amplificar. Esta región
puede ser de naturaleza ADN.
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De este modo, el extremo 5' del cebador puede
comprender nucleótidos que no hibridan con dicho ARN a amplificar
(secuencia anti-sentido de un promotor, secuencia
anti-sentido de un sitio de iniciación de la
transcripción...), mientras que el extremo 3' debe tener una
longitud y una composición de nucleótidos que permita la iniciación
de la elongación del cebador, en condiciones de temperatura y de
rigurosidad apropiadas. De acuerdo con una realización preferida de
la invención, el cebador es de naturaleza ADN. El cebador no está
bloqueado en posición 3', lo que permite establecer el híbrido
ADN-ARN.
El método de acuerdo con la invención es un
método isotérmico, es decir que no necesita cambio de temperatura
en el transcurso de las diferentes etapas. De acuerdo con una
realización preferida de la invención, el método se realiza a una
temperatura comprendida entre 37ºC y 50ºC, preferiblemente entre 40
y 45ºC y aún más preferiblemente a 41ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la etapa a), se hibrida dicho
cebador con el ARN a amplificar a nivel de dicha región que permite
la hibridación cebador/secuencia de ARN a amplificar. Esta
hibridación se realiza por complementariedad de una región
predeterminada del ARN a amplificar con una región predeterminada
del cebador, en condiciones de rigurosidad y de temperatura
apropiadas. De acuerdo con una realización preferida de la
invención, esta etapa está precedida de una etapa de
desnaturalización del ARN a amplificar, preferiblemente a 65ºC.
Durante la etapa b), se elonga el cebador
mediante una actividad enzimática de transcriptasa inversa (también
llamada reverse transcriptase) para generar una secuencia de ácido
desoxirribonucleico complementario (ADNc) del ARN a amplificar.
Esta etapa necesita la presencia de desoxirribonucleótidos, que son
utilizados por la enzima para la síntesis por complementariedad del
ADNc. Esta elongación se realiza en sentido 5'-3'
del cebador, en condiciones de rigurosidad y temperatura
apropiadas, comparables a las de la etapa a). Esta enzima
transcriptasa inversa es preferiblemente la transcriptasa inversa
AMV.
Durante la etapa c), se corta el ARN
hibridado en dicho ADNc con una enzima que tiene actividad ARNasa H,
para obtener fragmentos de ARN hibridados en dicho ADNc. La
actividad ARNasa H permite la hidrólisis de los híbridos
ARN-ADN, mientras que no hidroliza los híbridos
ARN-ARN o ADN. La actividad ARNasa H puede obtenerse
mediante una enzima diferente, tal como particularmente por la
enzima ARNasa H de E. coli o mediante la actividad ARNasa H
de una enzima transcriptasa inversa tal como transcriptasa inversa
AMV.
Durante la etapa d), se elongan los
extremos de dichos fragmentos de ARN con una enzima transcriptasa
inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener complejos
ARN-ADN/ADN. Esta enzima transcriptasa inversa es
preferiblemente la transcriptasa inversa AMV.
Durante la etapa e), se obtienen
transcritos de ARN a partir de los complejos
ARN-ADN/ADN formados durante la etapa d) mediante
una enzima que tiene actividad ARN polimerasa. La transcripción se
realiza mediante síntesis, en sentido 5'-3', de un
ARN anti-paralelo y complementario de la cadena de
nucleótidos transcrita.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima que tiene una actividad ARN polimerasa
que se utiliza es una enzima capaz de unirse al promotor del
cebador y de iniciar in vitro la síntesis de ARN a partir del
sitio de iniciación de la transcripción del cebador. De acuerdo con
una realización preferida de la invención, la enzima que tiene
actividad ARN polimerasa es una ARN polimerasa de bacteriófago,
preferiblemente ARN polimerasa del bacteriófago T7, pero pueden
utilizarse otras polimerasas tales como ARN polimerasa de los
bacteriófagos T3, SP6, gh-1... Por supuesto, la
secuencia promotora situada en el cebador debe adaptarse a la ARN
polimerasa utilizada durante la etapa e).
El método de amplificación de acuerdo con la
invención puede desarrollarse mediante la adición, en condiciones
apropiadas, de todos los compuestos necesarios para su realización,
es decir el ARN a amplificar, las enzimas, el cebador de
amplificación y los desoxirribonucleótidos. Este medio de reacción
está libre de agentes que pueden interferir con el proceso de
amplificación, tales como las sustancias que podrían inhibir la
actividad de las enzimas necesarias, que podrían interferir con la
hibridación del cebador con el ARN a amplificar o que podrían
degradar los productos amplificados.
De este modo, de acuerdo con una realización
preferida de la invención, se realizan las etapas a) a e) durante
un tiempo suficiente para obtener un número suficiente de
transcritos. Preferiblemente, se realizan las etapas a) a e)
durante un periodo comprendido entre 30 minutos y 3 h 30 min. y aún
más preferiblemente entre 1 h 30 min. y 2 h 30 min.
Los transcritos obtenidos de este modo pueden
detectarse a continuación mediante cualquiera de las técnicas
conocidas por el especialista en la técnica.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el método para generar transcritos de acuerdo con la
invención comprende además la siguiente etapa:
f) se utiliza una sonda de hibridación
específica de dicha región de interés para detectar los transcritos
de ARN generados.
Por detección, se entiende una detección
directa mediante un método físico, o un método de detección con
ayuda de un marcador. Existen muchos métodos de detección para la
detección de los ácidos nucleicos [Véase por ejemplo el documento
Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, Nº 45(4), p.
453-458 o Keller G.H. et al., DNA Probes, 2º
Ed., Stockton Press, 1993, secciones 5 y 6, págs.
173-259]. Por marcador, se entiende un
trazador capaz de generar una señal. Una lista no limitante de
estos trazadores comprende las enzimas que producen una señal
detectable por ejemplo por colorimetría, fluorescencia o
luminiscencia, como la peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa
alcalina, betagalactosidasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa;
cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminiscentes o
colorantes; los grupos con densidad electrónica detectables mediante
microscopía electrónica o por sus propiedades eléctricas como la
conductividad, mediante métodos de amperimetría o de voltimetría o
mediante mediciones de impedancia; los grupos detectables mediante
los métodos ópticos como difracción, resonancia del plasmón
superficial, variación del ángulo de contacto o mediante métodos
físicos como espectroscopía de fuerza atómica, el efecto túnel,
etc; moléculas radiactivas como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I. De
este modo, el polinucleótido puede marcarse durante la etapa de
amplificación de acuerdo con la invención, por ejemplo utilizando
un nucleótido trifosfato marcado para la reacción de amplificación.
También pueden utilizarse sistemas indirectos, como por ejemplo
ligandos capaces de reaccionar con un anti-ligando.
Los pares ligando/anti-ligando los conoce bien el
especialista en la técnica, como es el caso por ejemplo de los
siguientes pares: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo,
antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectinas,
polinucleótido/complementario del polinucleótido, secuencia
sucesiva de histidina, llamada "tag", para un metal, por
ejemplo níquel. En este caso, es el ligando el que lleva el agente
de unión. El anti-ligando puede ser detectable
directamente por los marcadores descritos en el párrafo anterior o
ser él mismo detectable por un
ligando/anti-ligando.
El nucleótido marcado será un ribonucleótido. El
polinucleótido también puede marcarse después de la etapa de
amplificación, por ejemplo hibridando una sonda marcada de acuerdo
con la técnica de hibridación sándwich descrita en el documento
WO-A-91/19812. Dichas sondas también
pueden utilizarse en una técnica OLISA, tal como se describe en la
solicitud WO 03/098217.
Esta detección también puede realizarse mediante
la utilización de sondas de hibridación que reconocen dichas
regiones de interés de los ARN amplificados de acuerdo con la
invención. Por sonda de hibridación, se entiende un
fragmento de nucleótidos que comprende de 5 a 100 motivos de
nucleótidos, particularmente de 6 a 35 motivos de nucleótidos, que
posee una especificidad de hibridación en condiciones determinadas
para formar un complejo de hibridación con una región de interés.
Esta sonda de hibridación puede ser una sonda llamada de
captura. En este caso, el fragmento nucleotídico diana puede
marcarse previamente por medio de un marcador. La sonda llamada de
captura es inmovilizada o inmovilizable en un soporte sólido
mediante cualquier medio apropiado, es decir directa o
indirectamente, por ejemplo mediante covalencia o adsorción. A
continuación se realiza una reacción de hibridación entre dicha
sonda y el fragmento nucleotídico diana marcado.
La sonda de hibridación también puede ser una
sonda llamada de detección. En este caso, la sonda de
hibridación puede marcarse por medio de un marcador. A continuación
se realiza una reacción de hibridación entre dicha sonda de
detección y el fragmento nucleotídico diana. Un ensayo sándwich
también puede emplear una sonda de captura fijada en un soporte
sólido, en el que se hibrida el fragmento nucleotídico diana, en el
que se hibrida la sonda de detección.
Ya se utilice una sonda llamada de captura o una
sonda llamada de detección, la reacción de hibridación puede
realizarse sobre un soporte sólido que incluye todos los materiales
sobre los que puede inmovilizarse un ácido nucleico. Pueden
utilizarse materiales de síntesis o materiales naturales,
opcionalmente modificados químicamente, como soporte sólido,
particularmente polisacáridos tales como materiales a base de
celulosa, por ejemplo papel, derivados de celulosa tales como
acetato de celulosa y nitrocelulosa o dextrano, polímeros,
copolímeros, particularmente a base de monómeros de tipo estireno,
fibras naturales tales como algodón y fibras sintéticas tales como
nylon; materiales minerales tales como sílice, cuarzo, vidrios,
cerámicas; látex; partículas magnéticas; derivados metálicos,
geles, etc. El soporte sólido puede estar en forma de una placa de
microtitulación, de membrana como la descrita en la solicitud
WO-A-94/12670, de una partícula o de
un biochip. Por biochip, se entiende un soporte sólido de
dimensión reducida donde se fijan una multitud de sondas de captura
en posiciones predeterminadas. El concepto de biochip, más
exactamente de chip de ADN, data del inicio de los años 90. En la
actualidad, este concepto se amplia ya que comienzan a
desarrollarse chips de proteínas. Se basa en una tecnología
multidisciplinar que integra micro-electrónica,
química de los ácidos nucleicos, análisis de imágenes e informática.
El principio de funcionamiento se basa en el fundamento de la
biología molecular; el fenómeno de hibridación, es decir el
emparejamiento mediante complementariedad de las bases de dos
secuencias de ADN y/o de ARN.
El método de los biochips se basa en el empleo
de sondas de captura fijadas en un soporte sólido sobre las que se
hace actuar una muestra de fragmentos nucleotídicos diana marcados
directa o indirectamente con fluorócromos. Las sondas de captura se
posicionan de manera específica en el soporte o chip y cada
hibridación da una información particular, en relación con el
fragmento nucleotídico diana. Las informaciones obtenidas son
acumulativas y permiten por ejemplo cuantificar el nivel de
expresión de un gen o de varios genes diana. Para analizar la
expresión de un gen diana, puede realizarse entonces un biochip que
lleve muchas sondas que correspondan a todo o a parte del gen
diana, que se transcribe a ARNm. A continuación se hibridan por
ejemplo los ADN complementarios de los ARNm obtenidos del o de los
genes diana que se desea analizar. Después de la hibridación, el
soporte o chip se limpia, se lee por ejemplo con un escáner y el
análisis de la fluorescencia se trata informáticamente. Pueden
mencionarse a título indicativo, los chips de ADN puestos a punto
por la compañía Affymetrix ("Accessing Genetic Information with
High-Density DNA Arrays", M. Chee et al.,
Science, 1996, 274, 610-614.
"Light-generated oligonucleotide arrays for
rapide DNA sequence analysis" A. Caviani Pease et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026),
para los diagnósticos moleculares. En esta tecnología, las sondas de
captura son generalmente de tamaño reducido, aproximadamente veinte
nucleótidos. Otros ejemplos de biochips se dan en las publicaciones
de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, Nº 16, págs.
40-44; F. Ginot, Human Mutation, 1997, Nº10; págs.
1-10; J. Chang et al., Molecular diagnosis,
1996, Nº1 (3), págs. 183-200; T. Livache et
al., Nucleic Acid Research, 1994, Nº 22(15), págs.
2915-2921; J. Cheng et al., Nature
Biotechnology, 1998, Nº16, págs. 541-546 o en las
patentes US-A-4.981.783,
US-A-5.700.637,
US-A-5.445.934,
US-A-5.744.305 y
US-A-5.807.522. También pueden
mencionarse los chips de baja densidad desarrollados por la compañía
Apibio tales como los descritos en la solicitud WO 03/098217. La
característica principal del soporte sólido debe ser conservar las
características de hibridación de las sondas de captura en los
fragmentos nucleotídicos diana mientras genera un ruido de fondo
mínimo para el método de detección. La presente invención está
particularmente adaptada a estos sistemas de chips de baja
densidad.
El método de acuerdo con la invención puede
realizarse para generar transcritos de ARN procedentes de diferentes
genes. Ésta es también una de las ventajas de la presente invención
que permite amplificar simultáneamente regiones diana de diferentes
genes, pudiendo localizarse dichas regiones diana en posición 3', 5'
o en medio del gen.
Para ello, la invención también se refiere a un
método para generar transcritos a partir
\bullet de al menos una primera secuencia de
ARN a amplificar que comprende una región "cebador" y una
región de interés y de un primer cebador de amplificación que
comprende una región promotora y una región capaz de hibridar con
dicha región "cebador" de la primera secuencia de ARN a
amplificar,
\bullet de al menos una segunda secuencia de
ARN a amplificar, diferente de dicha primera secuencia de ARN a
amplificar y que comprende una región "cebador" y una región de
interés y de un segundo cebador de amplificación que comprende una
región promotora y una región capaz de hibridar con dicha región
"cebador" de la segunda secuencia de ARN a amplificar,
realizándose dicho método a temperatura
constante y comprendiendo las siguientes etapas:
- a)
- se hibridan dichos primero y segundo cebadores con dichos primer y segundo ARN a amplificar
- b)
- se elongan dichos primero y segundo cebadores mediante una actividad enzimática de transcriptasa inversa para generar una primera secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del primer ARN a amplificar y una segunda secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del segundo ARN a amplificar,
- c)
- se cortan los primer y segundo ARN a amplificar, hibridados respectivamente en el primer y segundo ADNc, mediante una enzima que tiene una actividad ribonucleasa H, para obtener los primeros fragmentos de ARN a amplificar, hibridados con el primer ADNc y los segundos fragmentos de ARN a amplificar, hibridados con el segundo ADNc
- d)
- se elongan los extremos de dichos primer y segundo fragmentos de ARN a amplificar mediante una enzima transcriptasa inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener híbridos ARN-ADN/ADN
- e)
- se obtienen transcritos de dichos primer y segundo ARN a amplificar, a partir de los híbridos ARN-ADN/ADN formados durante la etapa d) mediante una enzima que tiene actividad ARN polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Este método puede aplicarse de manera comparable
para generar transcritos a partir de ARN a amplificar procedente de
3, 4, 5, 10 o más genes diferentes. Las etapas a) a e) se realizan
de forma comparable a las descritas anteriormente y se realizan
durante un tiempo suficiente para obtener un número suficiente de
transcritos, como se ha definido anteriormente.
Para la detección de los transcritos, se utiliza
preferiblemente, durante una etapa f), una primera sonda de
hibridación para detectar los transcritos del primer ARN a
amplificar y una segunda sonda de hibridación para detectar los
transcritos del segundo ARN a amplificar.
Preferiblemente, y como se ha definido
anteriormente, la enzima que tiene actividad ARN polimerasa es una
ARN polimerasa de bacteriófago y aún más preferiblemente, la ARN
polimerasa del bacteriófago T7.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras adjuntas se dan a modo de ejemplos
explicativos y no tienen ningún carácter limitante. Las figuras
permitirán entender mejor la invención.
La figura 1 representa esquemáticamente las
etapas del método de acuerdo con la invención.
La figura 2 representa la señal emitida por una
sonda de hibridación hibridada con los transcritos obtenidos de
acuerdo con la invención y tal como se describe en el ejemplo 2.
La figura 3 representa la regresión lineal
obtenida después de la amplificación de una gama de transcritos (1
x 10^{7}, 1 x 10^{8}, 1 x 10^{9} y 1 x 10^{10} copias) de
acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 3.
La figura 4 representa la señal emitida (media
de 3 réplicas) y su desviación típica a nivel de cada sonda
específica después de la hibridación y revelado de los productos de
amplificaciones obtenidas de acuerdo con el protocolo descrito en
el ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 1, se representan las secuencias de
naturaleza ribonucleica en trazo ondulado, mientras que las
secuencias de naturaleza desoxirribonucleica se representan en trazo
recto.
Durante la etapa a), se hibrida el cebador de
naturaleza ADN (representado por un trazo en línea punteada larga)
en la región "cebador" (representada en negrita) del ARN
matriz, la secuencia promotora en posición 5' del cebador que no
hibrida en el ARN matriz. Para entender mejor la invención, la
secuencia de interés que se desea detectar después de la fase de
amplificación se representa en línea punteada corta, del lado 5' de
la región "cebador". Sin embargo, la secuencia de interés y la
secuencia "cebador" pueden ser una única y misma
secuencia.
Se hace actuar, durante la etapa b), una enzima
que tiene actividad de transcriptasa inversa (RT), para elongar, en
sentido 5'-3', el cebador hibridado con el ARN
matriz. Se obtiene un ADN (ADNc, representado en línea punteada)
cuya secuencia es complementaria a la del ARN matriz. De este modo
se obtiene, entre la región diana y el extremo 5' del ARN matriz,
una secuencia híbrida de doble cadena ARN matriz/ADNc. Debido a su
falta de complementariedad, la secuencia promotora del cebador y la
secuencia situada en el lado 3' de la región diana del ARN diana
siguen siendo secuencias no hibridadas (cadena sencilla).
Se hace actuar, durante la etapa c, una enzima
que tiene una actividad ARNasa H para inducir cortes en el ARN
matriz. Estos cortes no son específicos y permiten liberar el
extremo 3' OH (representado mediante una cruz) de fragmentos de
ARN, hibridados con el ADNc.
Los extremos 3' OH liberados de este modo se
elongan durante la etapa d) mediante una enzima que tiene actividad
transcriptasa inversa y actividad de desplazamiento de cadena. La
elongación termina en la síntesis de la cadena complementaria de la
secuencia promotora del cebador. De este modo, se obtienen
diferentes secuencias híbridas de doble cadena
ARN-ADN/ADN, que comprenden una región promotora de
doble cadena (representada mediante un círculo), capaz, bajo la
acción de una ARN polimerasa dependiente de ADN, de iniciar una
transcripción. De este modo, a título indicativo se representan dos
híbridos diferentes, obtenidos a partir de dos sitios de corte
diferentes.
La acción de una enzima ARN polimerasa
dependiente de ADN permite obtener, durante la etapa e) transcritos
de ARN correspondientes a los diferentes híbridos obtenidos durante
la etapa d). De este modo se obtiene una población de transcritos,
de tamaño diferente pero que todos comprenden la región de interés
que se desea detectar.
Los siguientes ejemplos se dan a título
ilustrativo y no tienen ningún carácter limitante, estos ejemplos
permitirán entender mejor la invención.
\newpage
Una primera secuencia de ARN a amplificar,
correspondiente a la SEC ID Nº 1:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HML-4 en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Secuencia pasa a página
siguiente)
\newpage
De manera comparable, una segunda secuencia de
ARN a amplificar, de SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno
HERV-E4.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la amplificación de la secuencia de ARN de
SEC ID Nº 1, se utilizaba una secuencia cebador de SEC ID Nº 3: SEC
ID Nº 3: TAATACGACT CACTATA GGG AGATCTAGCA
GCATAGGGGG GGCTGTGCAG AGGAGATCAT CC que comprende
\bullet una región promotora que comprende un
promotor de la T7 ARN polimerasa (indicado en cursiva en la SEC ID
Nº 3) y un sitio de iniciación de la transcripción (indicado en
negrita en la SEC ID Nº 3)
\bullet una región capaz de hibridar en una
región cebador de la secuencia de ARN a amplificar (indicada
subrayada en la SEC ID Nº 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Este cebador no estaba bloqueado en posición
3'.
Nótese que la región capaz de hibridar con la
región cebador puede ser más corta y comprende particularmente de
15 a 30 pares de bases: Nótese también que entre el sitio de
iniciación y la región capaz de hibridar con la región cebador,
está comprendida una secuencia que favorece la iniciación, que
limita la formación de transcritos aborti-
vos.
vos.
Para la amplificación de la secuencia de ARN de
SEC ID Nº 2, se utilizaba una secuencia cebador de SEC ID Nº 4: SEC
ID Nº 4: TAATACGACT CACTATA GGG AGATCTAGCA
GCATACAGCA AAAGGTCATC AACGTACTGG AG que comprende
\bullet una región promotora que comprende un
promotor de la T7 ARN polimerasa (indicado en cursiva en la SEC ID
Nº 4) y un sitio de iniciación de la transcripción (indicado en
negrita en la SEC ID Nº 4)
\bullet una región capaz de hibridar con una
región cebador de la secuencia de ARN a amplificar (indicada
subrayada en la SEC ID Nº 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Este cebador no estaba bloqueado en posición
3'.
Nótese que la región capaz de hibridar con la
región cebador puede ser más corta y comprende particularmente de
15 a 30 pares de bases. Nótese también que entre el sitio de
iniciación y la región capaz de hibridar con la región cebador,
está comprendida una secuencia que favorece la iniciación, que
limita la formación de transcritos abortivos.
La generación de transcritos se realizaba en una
mezcla de reacción (NucliSens Basic Kit biMérieux) que comprende
una enzima que tiene actividad de transcriptasa inversa,
(AMV-RT), una enzima que tiene actividad ARNasa H
(ARNasa H) y una enzima que tiene actividad ARN polimerasa (T7 ARN
polimerasa).
La amplificación se realiza en presencia de:
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 3
(0,5 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº
1,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 4
(0,5 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº
2,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 3
(0,5 \muM) y la secuencia cebador de SEC ID Nº 4 (0,5 \muM)
para amplificar simultáneamente la secuencia de ARN de SEC ID Nº 1 y
la secuencia de ARN de SEC ID Nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
De este modo, se realizaba la amplificación de
las secuencias de ARN SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2, con la
incorporación de biotina:
\bullet independientemente una de otra:
Para ello, una cantidad conocida de ARN de SEC
ID Nº 1 o de ARN de SEC ID Nº 2 en solución acuosa (1 x 10^{9} o
1 x 10^{10} copias en 5 \mul de H_{2}O) se mezcla con 10 pl de
mezcla de reacción (NucliSens Basic Kit) a la que previamente se le
ha añadido UTP-biotina (0,6 mM) y el cebador que
permite la amplificación de la SEC ID Nº 1 o de la SEC ID Nº 2.
\bullet simultáneamente:
Para ello, una cantidad conocida de ARN de SEC
ID Nº 1 y de ARN de SEC ID Nº 2 en solución acuosa se han mezclado
con 10 pl de mezcla de reacción (NucliSens Basic Kit) a la que
previamente se le ha añadido UTP-biotina y los
cebadores que permiten la amplificación de la SEC ID Nº 1 y de la
SEC ID Nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada una de las reacciones de
amplificación, el volumen resultante era de 15 \mul (csp H_{2}O
sin nucleasa). La mezcla se incubaba a continuación 5 minutos a
65ºC y después 5 minutos a 41ºC para permitir la hibridación del
cebador con el ARN a amplificar.
A continuación se añadía un volumen de 5 \mul
de mezcla enzimática (NucliSens Basic Kit). La mezcla de un volumen
de 20 \mul se incubaba 90 minutos a 41ºC para permitir
1) la hibridación del cebador con el ARN a
amplificar
2) la elongación del cebador mediante la
actividad enzimática de transcriptasa inversa para generar una
secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del
ARN a amplificar.
3) el corte del ARN a amplificar, hibridado con
dicho ADNc, mediante la enzima que tiene la actividad ribonucleasa
H, para obtener fragmentos de ARN a amplificar, hibridados con dicho
ADNc,
4) la elongación de los extremos de dichos
fragmentos de ARN a amplificar mediante la enzima transcriptasa
inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener híbridos
ARN-ADN/ADN
5) la obtención de los transcritos de ARN a
partir de los híbridos ARN-ADN/ADN formados durante
la etapa d) con la enzima que tiene una actividad ARN
polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos de ARN obtenidos se han
analizado mediante el método ELOSA (Mallet F. y col. 1993). Este
método permite la detección específica de secuencias de ácidos
nucleicos mediante la hibridación de éstos con sondas
oligonucleotídicas (llamadas sondas de detección) injertadas en el
fondo de pocillos de placas de microtitulación.
La sonda que permitía la detección de la SEC ID
Nº 1 era la secuencia SEC ID Nº 5: CAACCTGTCAGCCAT
CAGTTTC
CAGTTTC
La sonda que permitía la detección de la SEC ID
Nº 2 era la secuencia SEC ID Nº 6: CTCGAGACCTCCA
GAAGTTTCC
GAAGTTTCC
El marcado de los transcritos de ARN con biotina
permitía la revelación de la hibridación gracias a la acción de un
conjugado de estreptavidina-enzima y del sustrato
correspondiente y las DO se leían mediante espectrometría. La DO
era proporcional a la cantidad de transcritos generados mediante el
método de acuerdo con la invención.
Los resultados obtenidos se presentan en la
figura 1. Las letras A a D correspondían a condiciones de
amplificación de las SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 independientemente
una de otra (A: 1 x 10^{9} copias de SEC ID Nº 1; B: 1 x 10^{9}
copias de SEC ID Nº 2; C: 1 x 10^{10} copias de SEC ID Nº 1; D: 1
x 10^{10} copias de SEC ID Nº 2), mientras que las letras E a H
correspondían a amplificaciones de las SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2
simultáneamente (E: 1 x 10^{9} copias de SEC ID Nº 1 y 1 x
10^{9} copias de SEC ID Nº 2; F 1 x 10^{10} copias de SEC ID Nº
1 y 1 x 10^{10} copias de SEC ID Nº 2; G: 1 x 10^{9} copias de
SEC ID Nº 1 y 1 x 10^{10} copias de SEC ID Nº 2; H: 1 x 10^{10}
copias de SEC ID Nº 1 y 1 x 10^{9} copias de SEC ID Nº 2). Los
transcritos obtenidos se detectaban mediante la presencia de una
sonda de detección de SEC ID Nº 5 (columnas grises) o mediante la
presencia de una sonda de detección de SEC ID Nº 6 (columnas
negras).
Los resultados mostraban que las señales
detectadas eran comparables entre las amplificaciones independientes
y las amplificaciones realizadas en dúplex.
De este modo, el número de transcritos generados
era comparable, ya tuviera el ARN a amplificar una SEC ID Nº 1 o
una SEC ID Nº 2 (la DO leída era comparable durante la amplificación
de acuerdo con la condición A y la condición B). Además, el número
de transcritos generados era mayor cuando la cantidad de ARN a
amplificar aumentaba (la DO leída era inferior durante la
amplificación de acuerdo con la condición A que de acuerdo con la
condición C; análogamente, la DO leída era inferior durante la
amplificación de acuerdo con la condición B que de acuerdo con la
condición D).
Finalmente, el número de transcritos generados
durante la amplificación simultánea de las SEC ID Nº 1 y la SEC ID
Nº 2 era comparable al número de transcritos generados durante la
amplificación de las SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2
independientemente una de otra. Incluso cuando la amplificación
simultánea se realizaba en cantidades de transcritos que difieran
en un log, las señales siguen siendo idénticas a las obtenidas
durante la amplificación de las SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 2
independientemente una de otra.
Se obtenían resultados comparables mediante el
análisis de los tratamientos generados en un chip OLISA. Los chips
OLISA son chips de ADN de baja densidad (hasta 128 sondas por chip)
dispuestos en un formato convencional de placa de 96 pocillos. Las
sondas de detección oligonucleotídicas, distribuidas en corona, se
injertan en el fondo de los pocillos. La revelación colorimétrica
de los híbridos sonda/diana se realiza con ayuda de un conjugado de
estreptavidina-enzima que implica un marcado con
biotina de la diana.
Una etapa suplementaria de digestión
suplementaria con ARNasa confirmaba que el producto detectado es un
ARNc.
Estos resultados demuestran que el método de
acuerdo con la invención está por lo tanto particularmente adaptado
a la amplificación de transcritos con vistas a su análisis
cuantitativo en chip de ADN. En efecto, el hecho de que este método
sea transcripcional y que los productos de amplificación no se
vuelvan nunca matrices para la amplificación, otorga a esta
amplificación un carácter lineal perfectamente adaptado a una
cuantificación en biochip de los transcritos.
Experimento
3
Este ejemplo se realizó a partir de la SEC ID Nº
2 utilizada como secuencia ARN a amplificar y la SEC ID Nº 4
utilizada como cebador de amplificación.
El método para generar los transcritos se
realiza de acuerdo con las condiciones descritas en el ejemplo 2.
En este caso, el cebador de SEC ID Nº 2 se utiliza a una
concentración de 0,5 \muM. Se amplifica una gama de transcritos
(1 x 10^{7}, 1 x 10^{8}, 1x 10^{9} y 1 x 10^{10}) y los
productos de la reacción se analizan en un chip OLISA con ayuda de
la sonda SEC ID Nº 6, de acuerdo con un principio comparable al
desarrollado en el ejemplo 2.
La regresión lineal realizada a partir de las
medias obtenidas para al menos 4 mediciones de cada punto conduce a
la obtención de una recta de coeficiente de correlación R^{2} =
0,9781, tal como se presenta en la figura 3. Por lo tanto, esto
atestigua la linealidad de la amplificación del método de acuerdo
con la invención.
Experimento
4
Para este experimento, el protocolo de
amplificación se ha realizado como se ha descrito anteriormente en
los ejemplos 1 y 2.
De este modo, una primera secuencia de ARN a
amplificar, correspondiente a la SEC ID Nº 7:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HML-2 en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\newpage
De manera comparable, una segunda secuencia de
ARN a amplificar, de SEC ID Nº 8:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HML-5 en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\newpage
De manera comparable, una tercera secuencia de
ARN a amplificar, de SEC ID Nº 9:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HERV-H en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\newpage
De manera comparable, una cuarta secuencia de
ARN a amplificar, de SEC ID Nº 10:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno ERV-9 en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\newpage
De manera comparable, una quinta secuencia de
ARN a amplificar, de SEC ID Nº 11:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HERV-W en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\newpage
De manera comparable, una sexta secuencia de ARN
a amplificar, de SEC ID Nº 12:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HERV-R en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\newpage
De manera comparable, una séptima secuencia de
ARN a amplificar, de SEC ID Nº 13:
se ha producido a partir de
secuencias clonadas obtenidas de una región del gen pol del
retrovirus endógeno HERV-L en un vector Dual
promoter pCR-II-TOPO (Invitrogen) de
acuerdo con el protocolo recomendado por el proveedor. La
transcripción se ha realizado con ayuda del Kit Ampliscribe T7 Flash
(Epicentre) de acuerdo con el protocolo recomendado por el
proveedor.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación se ha realizado, como se ha
descrito en el ejemplo 2, en presencia de:
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 14
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACA CATAAAATAT CAT
CAACATA (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 7,
CAACATA (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 7,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 15
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGATG CAGAGGAGAT CATCCATGTA (0,75
\muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 1,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 16
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACT AGTAAAATAT CATC
CATAAA (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 8,
CATAAA (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 8,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 17
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAAA AGTAGAAGGT CATCAATATA (0,75
\muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 9,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 18
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAAG TAAATCATCC ACA
TACTGAA G (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 10,
TACTGAA G (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 10,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 19
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGAAA GTAAATCATC CACGTACCGA (0,75
\muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 11,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 20
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC AGCAAAAGGT CATCAACGTA (0,75
\muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 2,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 21
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGACC AAAAGAAGGT TGTCTATGTA (0,75
\muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 12,
\bullet la secuencia cebador de SEC ID Nº 22
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGATC ARCATAATGY CAT
CAATGTA (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 13.
CAATGTA (0,75 \muM) para amplificar la secuencia de ARN de SEC ID Nº 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transcritos de ARN obtenidos se han
analizado en un chip OLISA tal como se ha descrito en el ejemplo
2.
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 1 era la secuencia SEC ID Nº 5: CAACCTGTCAGGGAT
CAGTTTC
CAGTTTC
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 2 era la secuencia SEC ID Nº 6: CTCGAGACCTCCA
GAAGTTTCC
GAAGTTTCC
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 7 era la secuencia SEC ID Nº 23: CAACCAGTTA GAGA
CAAGTT TTCA
CAAGTT TTCA
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 8 era la secuencia SEC ID Nº 24: TTGCTCCCCA GTA
GAAAAGA ATT
GAAAAGA ATT
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 9 era la secuencia SEC ID Nº 25: GACAGCCCCC ATTACTT
CAG TCAAG
CAG TCAAG
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 10 era la secuencia SEC ID Nº 26: CCAAGATCTA GGC
CACTTCT CA
CACTTCT CA
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 11 era la secuencia SEC ID Nº 27: CATCTATTTG GCCAGG
CATT A
CATT A
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 12 era la secuencia SEC ID Nº 28: AGACCTCAAGGCATA
CACCC
CACCC
La sonda que permite la detección de la SEC ID
Nº 13 era la secuencia SEC ID Nº 29: GCTITGTGTC ATAATCT
TAT TCG
TAT TCG
Las medias y desviaciones típicas se calculan a
partir de cuatro amplificaciones independientes y se presentan en
la figura 4.
La técnica de acuerdo con la invención permite
amplificar transcritos en mezcla (en este documento, hasta 9
diferentes). Se constata, además, que existe una relación lineal
entre la señal medida y la cantidad de transcritos introducida en
el volumen de reacción en la gama ensayada (de 10^{6} a 10^{8}
copias para cada transcrito). Esto indica que esta técnica permite
amplificar simultáneamente y de manera específica varios
transcritos. De este modo, el análisis en chip de ADN (o mediante
otro método) de productos de amplificación obtenidos mediante este
método podría permitir una cuantificación de transcritos de la
muestra inicial.
<110> bioMérieux
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para generar transcritos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 737
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 857
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV.E4.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-E4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV.E4.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 828
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 870
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 866
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ERV-9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 815
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 856
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 819
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ERV-9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV E4.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-L
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HML-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ERV-9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HERV-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HER-L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
Claims (8)
1. Método para generar transcritos a partir
\bullet de al menos una secuencia de ARN a
amplificar que comprende una región "cebador" y una región de
interés y
\bullet de un cebador de amplificación que
comprende una región promotora y una región capaz de hibridar con
dicha región "cebador" de la secuencia de ARN a amplificar,
realizándose dicho método a temperatura
constante y comprendiendo las siguientes etapas:
- a)
- se hibrida dicho cebador con el ARN a amplificar,
- b)
- se elonga el cebador mediante una actividad enzimática de transcriptasa inversa para generar una secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del ARN a amplificar,
- c)
- se corta el ARN a amplificar, hibridado con dicho ADNc, mediante una enzima que tiene una actividad ribonucleasa H, para obtener fragmentos de ARN a amplificar hibridados con dicho ADNc,
- d)
- se elongan los extremos de dichos fragmentos de ARN a amplificar con una enzima transcriptasa inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener híbridos ARN-ADN/ADN
- e)
- se obtienen transcritos de ARN a partir de los híbridos ARN-ADN/ADN formados durante la etapa d) con una enzima que tiene una actividad ARN polimerasa.
2. Método para generar transcritos de acuerdo
con la reivindicación 1, que comprende además la siguiente
etapa:
- f)
- se utiliza una sonda de hibridación específica de dicha región de interés para detectar los transcritos de ARN generados.
3. Método para generar transcritos de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de acuerdo con el
cual se realizan las etapas a) a e) durante un tiempo suficiente
para obtener un número suficiente de transcritos.
4. Método para generar transcritos de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la
enzima que tiene una actividad ARN polimerasa es una ARN polimerasa
de bacteriófago, preferiblemente ARN polimerasa del bacteriófago
T7.
5. Método para generar transcritos a partir
\bullet de al menos una primera secuencia de
ARN a amplificar que comprende una región "cebador" y una
región de interés y de un primer cebador de amplificación que
comprende una región promotora y una región capaz de hibridar con
dicha región "cebador" de la primera secuencia de ARN a
amplificar,
\bullet de al menos una segunda secuencia de
ARN a amplificar, diferente de dicha primera secuencia de ARN a
amplificar y que comprende una región "cebador" y una región de
interés y de un segundo cebador de amplificación que comprende una
región promotora y una región capaz de hibridar con dicha región
"cebador" de la segunda secuencia de ARN a amplificar,
realizándose dicho método a temperatura
constante y comprendiendo las siguientes etapas:
- a)
- se hibridan dichos primero y segundo cebadores con dichos primer y segundo ARN a amplificar
- b)
- se elongan dichos primero y segundo cebadores mediante una actividad enzimática de transcriptasa inversa para generar una primera secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del primer ARN a amplificar y una segunda secuencia de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) del segundo ARN a amplificar,
- c)
- se cortan los primer y segundo ARN a amplificar, hibridados respectivamente con el primer y segundo ADNc, mediante una enzima que tiene una actividad ribonucleasa H, para obtener los primeros fragmentos de ARN a amplificar, hibridados con el primer ADNc y los segundos fragmentos de ARN a amplificar, hibridados con el segundo ADNc
- d)
- se elongan los extremos de dichos primer y segundo fragmentos de ARN a amplificar mediante una enzima transcriptasa inversa y de desplazamiento de cadena, para obtener híbridos ARN-ADN/ADN
- e)
- se obtienen transcritos de dichos primer y segundo ARN a amplificar, a partir de los híbridos ARN-ADN/ADN formados durante la etapa d) mediante una enzima que tiene actividad ARN polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método para generar transcritos de acuerdo
con la reivindicación 5, que comprende además la siguiente
etapa:
- f)
- se utiliza una primera sonda de hibridación para detectar los transcritos del primer ARN a amplificar y una segunda sonda de hibridación para detectar los transcritos del segundo ARN a amplificar.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método para generar transcritos de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, de acuerdo con el
cual se realizan las etapas a) a e) durante un tiempo suficiente
para obtener un número suficiente de transcritos.
8. Método para generar transcritos de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la
enzima que tiene una actividad ARN polimerasa es una ARN polimerasa
de bacteriófago, preferiblemente ARN polimerasa del bacteriófago
T7.
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