ES2308836T3 - Sinergia de los anticuerpos anti-her-2 y de los ligands para l'apo-2. - Google Patents

Abstract

Uso del ligando Apo-2 y de un anticuerpo anti-Her-2 para la preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en células cancerosas de mamífero que sobre-expresan el receptor Her-2, en el que el ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2 inducen sinérgicamente una apóptosis.

Description

Sinergia de los anticuerpos anti-Her-2 y de los ligandos Apo-2.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a procedimientos para inducir la apóptosis en células de mamífero. En concreto, pertenece al uso del ligando Apo-2 y de un anticuerpo anti-Her-2 para inducir sinérgicamente la apóptosis en células de mamífero.

Antecedentes de la invención

Se cree que el control de los números de células en mamíferos está determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, algunas veces denominada muerte celular necrótica, se caracteriza comúnmente por una forma patológica de muerte celular como resultado de algún traumatismo o lesión celular. Por el contrario, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que habitualmente tiene lugar de un modo ordenado o controlado. Este modo ordenado o controlado de muerte celular es habitualmente denominado "apóptosis" [véase, p. ej., Barr et al. Bio/Technology, 12:487-493 (1994)]. La muerte celular apoptótica ocurre de forma natural en muchos procesos fisiológicos que incluyen el desarrollo embrionario y la selección clonal del sistema inmunológico [Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)]. Sin embargo, la disminución de los niveles de muerte celular apoptótica se ha asociado con una variedad de condiciones patológicas que incluyen el cáncer, el lupus y la infección por el virus del herpes [Thompson, Science, 267:1456-1462 (1995)].

La muerte celular apoptótica está comúnmente acompañada por uno o más cambios bioquímicos y morfológicos característicos en células, tales como la condensación del citoplasma, la pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación el núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Se cree que hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que desencadenan o provocan tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356:397-400 (1992); Steller, Science, 267:1445-1449 (1995); Sachs et al., Blood, 82:15 (1993)]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como las hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la retirada de ciertos factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356:314-317 (1992)]. También se ha informado de que algunos oncogenes identificados tales como myc, rel y EIA, así como supresores tumorales, como el p53, tienen un papel en la inducción de la apóptosis. Asimismo, se ha observado que hay fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación que tienen actividad inductora de la apóptosis [Thompson, supra].

Se han identificado diversas moléculas, tales como el factor-\alpha de la necrosis tumoral ("FNT-\alpha"), factor-\beta de la necrosis tumoral ("FNT-\beta" o "linfotoxina"), el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB y el ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95), como miembros de la familia de factores de la necrosis tumoral ("FNT") de las citoquinas [Véase, por ejemplo, Gruss y Dower. Blood, 85:3378-3404 (1995)].Entre estas moléculas, se ha informado que el FNT-\alpha, el FNT-\beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB y el ligando Apo-1 están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha informado de que tanto el FNT-\alpha como el FNT-\beta inducen a la muerte apoptótica a células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986): Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)].

Recientemente, se identificaron más moléculas consideradas miembros de la familia de los TNF de las citoquinas, informando de su implicación en la apóptosis. Por ejemplo, en Pitti et al., J. Biol. Chem.271:12687-12690 (1996), se describe una molécula denominada ligando Apo-2. Véase también el documento WO 97/25428 publicado el 17 de julio de 1997. Se informa que el ligando Apo-2 humano de longitud completa es un polipéptido de 281 aminoácidos que induce la apóptosis en diversas células de mamífero. Otros investigadores han descrito polipéptidos relacionados denominados TRAIL [Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995): WO 97/01633 publicado el 16 de enero de 1997] y AGP-1 [WO 97/46686 publicado el 11 de diciembre de 1997)].

Se han descrito varios receptores del ligando Apo-2. Estos receptores incluyen el Apo-2 (también denominado DR5) [Sheridan et al., Science. 277:818-821 (1997); Pan et al., Science. 277:815-818 (1997)], DR4 [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)], DcR1 (también denominado TRID) [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Pan et al., Science. 277:815-818 (1997)] y DcR2 (también denominado TRAIL-4) [Marsters et al., Current Biology, 7:1003-1006 (1997):Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)].

También se ha informado de que moléculas dirigidas a un número de proteínas quinasas receptoras de factores de crecimiento inducen a la apóptosis. Se cree que las proteínas receptoras tirosinas quinasas, que se dividen en un número de subfamilias, tienen la función principal de dirigir el crecimiento celular a través de la fosforilación de la tirosina estimulada por ligandos de sustratos intracelulares. La subfamilia de clase I de las proteínas receptoras de factores de crecimiento tirosina quinasas incluye el receptor del factor de crecimiento epidérmico de 170 kDa (RFCE) codificado por el gen erbB1. El erbB1 ha sido causalmente implicado en los tumores malignos humanos. En concreto, se ha observado un aumento de la expresión de este gen en carcinomas de mama, de vejiga, de pulmón, de cabeza, de cuello y de estómago. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el RFCE han sido evaluados como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales tumores malignos. Por ejemplo, Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995) informaron recientemente de que el anticuerpo monoclonal (Acm) anti-RFCE 225 (que inhibe competitivamente la unión al FCE y bloquea la activación de este receptor) podría inducir a la línea celular de carcinoma colorrectal humano DiFi (que expresa altos niveles de RFCE) a crecer, a detener su ciclo celular y a la apóptosis. Véase Baselga et al., Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994); Masui et al., Cancer research. 44:1002-1007 (1984).

El segundo miembro de la subfamilia de clase I, el p185^{neu}, se identificó originariamente como el producto del gen de transformación de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del proto-oncogén neu resulta de una mutación puntual (valina a ácido glutámico) en la región transmembrana de la proteína codificada. La amplificación del homólogo humano de neu (denominado Her-2 o erbB2) se observa en cánceres de mama y ovario, y generalmente guarda correlación con un pronóstico pobre [Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989)]. Por consiguiente, Slamon et al., en la patente estadounidense N.º: 4.968.603, describen análisis de diagnóstico para determinar la amplificación o la expresión del gen Her-2 en células tumorales. Hasta la fecha, no se ha informado de otra mutación puntual análoga a la del proto-oncogén neu para los tumores humanos. También se ha observado la sobre-expresión (frecuentemente, pero no uniformemente debida a la amplificación) de Her-2 en otros carcinomas incluyendo carcinomas de estómago, de endometrio, de glándula salival, de pulmón, de riñón, de colon, de tiroide, de páncreas y de vejiga. Véase entre otros: King et al., Science, 229:974 (1985); Yokota et al., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol. Cell. Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Research. 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Research, 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Research, 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Research, 50:5184 (1990): Park et al., Cancer Research. 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology. 59:46-52 (1991); y McCann et al., Cancer. 65:88-92 (1990).

Se han descrito ciertos anticuerpos dirigidos contra los productos proteicos Her-2 humano y neu de rata. Drebin et al., Cell, 41:695-706 (1985) se refieren a un anticuerpo monoclonal IgG2a que está dirigido contra el producto génico neu de rata. Este anticuerpo denominado 7.16.4 causa la modulación secuencia abajo de la expresión de p185 de la superficie celular sobre células B104-1-1 (células NIH-3T3 transfectadas con el proto-oncogén neu) e inhibe la formación de colonias de estas células. En Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:9129-9133 (1986), se demostró que el anticuerpo 7.16.4 inhibe el crecimiento tumorigénico de las células NIH-3T3 transformadas por neu, así como las células de neuroblastoma de rata (de las que se aisló inicialmente el oncogén neu) implantadas en ratones desnudos. Drebin et al., Oncogene, 2:387-394 (1988) describen la producción de un panel de anticuerpos contra el producto génico neu de rata. Se descubrió que todos los anticuerpos ejercían un efecto citostático sobre el crecimiento de las células transformadas por neu suspendidas en agar disuelto. Los anticuerpos de los isotipos IgM, IgG2a e IeG2b eran capaces de mediar la lisis in vitro de células transformadas por neu en presencia de complemento, mientras que ninguno de los anticuerpos era capaz de mediar niveles relativamente elevados de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) de células transformadas por neu. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) informan que las mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas de la molécula p185 resultan en efectos antitumorales sinérgicos sobre células NIH-3T3 transformadas por neu implantadas en ratones desnudos. En Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991), se revisan los efectos biológicos de anticuerpos anti-neu. Véase también el documento WO94/22478 publicado el 13 de octubre de 1994.

Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3):1165-1172 (1989) describen la generación de un panel de anticuerpos anti-Her-2 que fueron caracterizados usando la línea celular de tumor de mama humano SKBR3. Se determinó la proliferación celular relativa de las células SKBR3 tras una exposición a los anticuerpos mediante tinción con violeta cristal de las monocapas transcurridas 72 horas. Usando este análisis, se obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo denominado 4D5 que inhibió la proliferación celular en un 56%. Otros anticuerpos del panel, incluyendo el 7C2 y el 7F3, redujeron la proliferación celular hasta un grado menor en este análisis. Hudziak et al. concluyen que el efecto del anticuerpo 4D5 sobre las células SKBR3 fue citostático más que citotóxico, pues las células SKBR3 reanudaron el crecimiento a una velocidad casi normal tras la retirada del anticuerpo del medio. También se descubrió que el anticuerpo 4D5 sensibiliza a líneas celulares de tumor de mama que sobre-expresan p185^{erbB2} a los efectos citotóxicos del FNT-\alpha. Véase también el documento WO89/06692 publicado el 27 de julio de 1989. Los anticuerpos anti-Her-2 tratados en Hudziak et al. se caracterizan en mayor profundidad en Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro. 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2):979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunotherap., 37:255-263 (1993): Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research. 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 692(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); y D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 7202-7206
(1994).

Ciertos anticuerpos anti-Her-2 pueden inducir a la muerte de una célula de sobreexpresión de Her-2 (por ejemplo, la célula BT474, SKBR3, SKOV3 o Calu 3) mediante apóptosis. Ghetie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:7509-7514 (1997) describen la producción de un anticuerpo anti-Her-2 que, cuando es homodimerizado, induce la apóptosis en células tumorales. Además, Kita et al., Biochem. Biophys. Research Commun. describen la generación de un anticuerpo anti-Her-2 que provoca cambios de la morfología celular y la apóptosis en células transfectadas con el gen Her-2. Al contrario que el anticuerpo anti-RFCE apoptótico descrito en Wu et al., J. Clin. Investigation. 95:1897-1905 (1995), no se cree que esos anticuerpos anti-Her-2 provoquen la apóptosis afectando a un bucle autocrino.

Se han descrito en la técnica otros anticuerpos específicos para Her-2. Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991) describen dos anticuerpos que fueron seleccionados por su reactividad sobre la línea celular de adenocarcinoma de pulmón (Calu-3) que sobre-expresa Her-2. Se descubrió que uno de los anticuerpos, denominado MGR3, interioriza, induce a la fosforilación de Her-2 e inhibe el crecimiento celular tumoral in vitro.

McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989) generaron un panel de anticuerpos anti-Her-2, que incluía el anticuerpo denominado TA1. Se descubrió que este anticuerpo TA1 induce a la endocitosis acelerada de Her-2 [Véase Maier et al., Cancer Research, 51:5361-5369 (1991)]. Bacus et al., Mol. Carcinogenesis, 3:350-362 (1990) informaron de que el anticuerpo TA1 inducía a la maduración de las líneas celulares de cáncer de mama AU-565 (que sobre-expresa el gen Her-2) y MCF-7. Se descubrió que la inhibición del crecimiento y la adquisición de un fenotipo maduro en estas células estaban asociados con niveles reducidos de receptor Her-2 en la superficie celular y aumentos transitorios de los niveles en el citoplasma.

Stancovski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:8691-8695 (1991) generaron un panel de anticuerpos anti-Her-2, los inyectaron i.p. en ratones desnudos y evaluaron su efecto sobre el crecimiento tumoral de fibroblastos murinos transformados por la sobre-expresión del gen Her-2. Se detectaron varios niveles de inhibición tumoral para cuatro de los anticuerpos, pero uno de los anticuerpos (N28) estimulaba sistemáticamente el crecimiento tumoral. El anticuerpo monoclonal N28 indujo a una fosforilación significativa del receptor Her-2, mientras que los otros cuatro anticuerpos mostraron en general una actividad inductora de la fosforilación baja o nula. También se evaluó el efecto de los anticuerpos anti-Her-2 sobre la proliferación de las células SKBR3. En este análisis de proliferación de células SKBR3, dos de los anticuerpos (N12 y N29) causaron una reducción de la proliferación celular en relación con el control. Se evaluó la capacidad de diversos anticuerpos para inducir a la lisis celular in vitro por medio de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y la citotoxicidad dependiente de células mediada por anticuerpos (CDCA), concluyendo los autores del informe que la función inhibidora de los anticuerpos no se atribuía significativamente a la CDC ni a la CDCA.

Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992) caracterizaron en mayor profundidad los anticuerpos descritos en Bacus et al. (1990) y Stancovski et al. citados anteriormente. Partiendo de los estudios de i.p. de Stancovski et al., se evaluó el efecto de los anticuerpos tras una inyección i.v. en ratones desnudos que albergaban fibroblastos de ratón que sobre-expresaban el Her-2 humano. Según lo observado en su trabajo anterior, N28 aceleraba el crecimiento tumoral, mientras que N12 y N29 inhibían significativamente el crecimiento de las células que expresan Her-2. También se observó la inhibición tumoral parcial con el anticuerpo N24. Bacus et al. también analizaron la capacidad de los anticuerpos para promover un fenotipo maduro en las líneas celulares de cáncer de mama humano AU-565 y MOA-MB453 (que sobre-expresa Her-2) así como MCF-7 (que contenía niveles bajos del receptor). Bacus et al. observaron la correlación entre la inhibición tumoral in vivo y la diferenciación celular; el anticuerpo estimulador tumoral N28 no tuvo ningún efecto en la diferenciación ni en la acción inhibidora tumoral de N12. Los anticuerpos N29 y N24 mostraron una correlación con el grado de diferenciación que inducían.

Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993) evaluaron un panel de anticuerpos anti-Her-2 en cuanto a sus especificidades de unión a epítopos, así como a su capacidad para inhibir el crecimiento independiente del anclaje y dependiente del anclaje de las células SKBR3 (por anticuerpos individuales y en combinaciones), para modular Her-2 de la superficie celular e inhibir el crecimiento independiente del anclaje estimulado por ligandos. Véase también el documento WO94/00136 publicado el 6 de enero de 1994 y Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776(1992) sobre las combinaciones de anticuerpos anti-Her-2. En Hancock et al., Cancer Research, 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Research, 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Research, 54:3758-3765 (1994); y Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167 (1992), se describen otros anticuerpos anti-Her-2.

También se ha descrito otro gen relacionado con Her-2, denominado erbB3 o HER3. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.º: 5.183.884 y 5.480.968. ErbB3 es único entre la familia de receptores ErbB en tanto en cuanto posee poca o ninguna actividad de la tirosina quinasa intrínseca. Sin embargo, cuando ErbB3 es co-expresado con Her2, se forma un complejo de señalización activa y los anticuerpos dirigidos contra Her-2 son capaces de afectar a este complejo [Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)]. Además, la afinidad de ErbB3 por la heregulina (HRG) es aumentada hasta un estado de afinidad más elevado cuando se co-expresa con Her-2. Véase también, Levi et al., J. Neuroscience, 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:1431-1435 (1995); y Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteína ErbB3-
Her-2.

La subfamilia de clase I de las proteínas receptoras de factores de crecimiento tirosina quinasas ha sido ampliada para que incluya al receptor HER4/p180^{erbB-1}. Véase la solicitud de patente EP N.º: 599.274: Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 1746-1750 (1993): y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993). Plowman et al. encontraron ese aumento de la expresión de HER4 correlacionado con ciertos carcinomas de origen epitelial, incluyendo adenocarcinomas de mama. Este receptor, como el ErbB3, forma un complejo de señalización activa con Her-2 [Carraway y Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)].

Descripción de la invención

Los solicitantes han descubierto que, sorprendentemente, el ligando Apo-2 y un anticuerpo anti-Her-2 pueden actuar sinérgicamente para inducir la apóptosis en células de mamífero que sobre-expresan Her-2.

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La invención proporciona según las reivindicaciones, el uso del ligando Apo-2 y un anticuerpo anti-Her-2 en la preparación de un medicamento para su uso en un procedimiento para inducir la apóptosis en células de mamífero. Un procedimiento para inducir la apóptosis comprende exponer una célula cancerosa de mamífero que sobre-exprese Her-2 al ligando Apo-2 y a un anticuerpo anti-Her-2 en una cantidad eficaz para inducir sinérgicamente la apóptosis. La célula puede estar en un cultivo celular o en un mamífero, por ejemplo, en un mamífero que padezca cáncer. De este modo, la invención incluye el uso de una cantidad eficaz de ligando Apo-2 y anticuerpo anti-Her-2, según lo revelado en la presente memoria, en la preparación de un medicamento para su uso en un procedimiento para tratar un mamífero que padezca una condición caracterizada por una sobre-expresión del receptor Her-2. Según cualquiera de los procedimientos, se pueden usar uno o más anticuerpos anti-Her-2. Por ejemplo, se pueden emplear un primer anticuerpo anti-Her-2 tal como el anticuerpo 7C2 y un segundo anticuerpo anti-Her-2 (diferente del primer anticuerpo, tal como un anticuerpo que se una a un epítopo de Her-2 diferente). Preferiblemente, al menos uno de los anticuerpos anti-Her-2 es un anticuerpo que induce a la apóptosis.

La invención también proporciona composiciones que comprenden ligando Apo-2 y anticuerpo/s anti-Her-2. Opcionalmente, las composiciones de la invención incluirán vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones incluirán ligando Apo-2 y anticuerpo anti-Her-2 en una cantidad eficaz para inducir sinérgicamente la induce la apóptosis en células de mamífero.

La invención también proporciona artículos de fabricación y equipos que incluyen ligando Apo-2 y anticuerpo/s anti-Her-2 según lo definido en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra un diagrama de barras que ilustra el aumento de la actividad apoptótica (según lo determinado por la unión a la anexina V y la reabsorción de PI) del Apo-2L y del anticuerpo 7C2 sobre las células de tumor de mama BT474 y MCF7/HER2.

La figura 1B muestra un diagrama de barras que ilustra el aumento de la actividad apoptótica (según lo determinado por la unión a la anexina V y la reabsorción de PI) del Apo-2L y del anticuerpo 7C2 sobre las células de tumor de mama SKBR3.

La figura 2A muestra un gráfico de barras que muestra el descenso del número de células viables de SKBR3 y el aumento del número de células muertas (medido mediante la reabsorción de tinte azul de tripano) tras un tratamiento con el Apo-2L y anticuerpo 7C2 sobre las células de tumor de mama SKBR3 tras 3 días.

La figura 2B muestra un gráfico de barras que muestra el descenso del número de células viables de SKBR3 y el aumento del número de células muertas (medido mediante la reabsorción de tinte azul de tripano) tras un tratamiento con el Apo-2L y el anticuerpo 7C2 sobre las células de tumor de mama SKBR3 tras 6 días.

La figura 3 muestra un gráfico de barras que ilustra los cambios en el número de células de tumor de mama BT474 (número de células viables y muertas determinado por la reabsorción de tinte azul de tripano) tras un tratamiento con Apo-2L y anticuerpo 7C2.

Descripción detallada de la invención 1. Definiciones

Los términos "apóptosis" y "actividad apoptótica" se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que está comúnmente acompañada por uno o más cambios celulares característicos, incluyendo la condensación del citoplasma, la pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Esta actividad se puede determinar y medir, por ejemplo, mediante análisis de viabilidad celular, análisis FACS o electroforesis de ADN, y más específicamente, mediante la unión de la anexina V, la fragmentación del ADN, el encogimiento celular, la dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos).

Como se usa en la presente memoria, el término "sinergia" o "sinergismo" o "sinérgicamente" se refiere a la interacción de dos o más agentes tal que su efecto combinado es mayor que la suma de sus efectos individuales.

Los términos "ligando Apo-2" y "Apo-2L" se usan en la presente memoria para referirse a un polipéptido que incluye los residuos de aminoácido 114-281 inclusive, los residuos 91-281 inclusive, los residuos 92-281 inclusive, los residuos 41-281 inclusive, los residuos 15-281 inclusive, o los residuos 1-281 inclusive de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A de Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996), así como las variantes delecionales, insercionales o substitucionales de las secuencias anteriores. En una realización, la secuencia polipeptídica tiene al menos los residuos 114-281. Opcionalmente, la secuencia polipeptídica tiene al menos los residuos 91-281 o los residuos 92-281. En otra realización preferida, las variantes biológicamente activas tienen al menos una identidad secuencial del aproximadamente 80%, más preferiblemente, una identidad secuencial del al menos aproximadamente 90%, y todavía más preferiblemente, una identidad secuencial del al menos aproximadamente 95% con una cualquiera de las secuencias anteriores. La definición engloba el ligando Apo-2 aislado de una fuente de ligandos Apo-2, tal como de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o preparado mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. El término "ligando Apo-2" también se refiere a los polipéptidos descritos en el documento WO 97/25428; supra.

A no ser que se indique lo contrario, el término "Her-2", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a proteína Her-2 humana y a gen Her-2 humano. En Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986), se describen el gen Her-2 humano y la proteína Her-2 (número de acceso del banco de genes X03363). Por ejemplo, Her-2 comprende cuatro dominios (Dominios 1-4). El "dominio 1" está en el terminal amino del dominio extracelular de Her-2. Véase Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 1746-1750 (1993).

El "epítopo 7C2/7F3" es la región del terminal N del dominio extracelular de Her-2 a la que se unen los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 (cada uno depositado en la ATCC, véase a continuación). Para rastrear los anticuerpos que se unen al epítopo 7C2/7F3, se puede realizar un análisis de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se pueden realizar una cartografía de epítopos para establecer si el anticuerpo se une al epítopo 7C2/7F3 sobre Her-2 (es decir, uno cualquiera o más de los residuos de la región desde aproximadamente el residuo 22 hasta aproximadamente el residuo 53 de Her-2).

El "epítopo 4D5" es la región del dominio extracelular de Her-2 a la que se une el anticuerpo 4D5 (CRL de la ATCC 10463). Este epítopo está cerca de la región transmembrana de Her-2. Para rastrear los anticuerpos que se unen al epítopo 4D5, se puede realizar un análisis de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar una cartografía de epítopos para establecer si el anticuerpo se une al epítopo 4D5 de Her-2 (es decir, uno cualquiera o más de los residuos de la región desde aproximadamente el residuo 529, por ejemplo, aproximadamente el residuo 561, hasta aproximadamente el residuo 625 inclusive).

Una célula que "sobre-expresa" Her-2 tiene niveles de Her-2 significativamente mayores de lo normal en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Comúnmente, la célula es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula de mama, de ovario, de estómago, de endometrio, de glándula salival, de pulmón, de riñón, de colon, de tiroide, de páncreas o de vejiga. La célula también puede ser una línea celular tal como SKBR3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKOV3.

La "heregulina" (HRG), cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido que activa los complejos proteínico Her-2-ErbB3 y Her-2-ErbB4 (es decir, induce la fosforilación de residuos de tirosina en el complejo tras la unión al mismo). Diversos polipéptidos de heregulina englobados por este término se revelan en, por ejemplo, Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); WO 92/20798: Wen et al., Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919 (1994): y Marchionni et al. Nature, 362:312-318 (1993). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido de HRG natural, tales como un fragmento del dominio de tipo FCE del mismo (por ejemplo, HRG\beta1_{177-244}).

El "complejo proteínico Her-2-ErbB3" y el "complejo proteínico Her-2-ErbB4" son oligómeros asociados de forma no covalente del receptor Her-2 y el receptor ErbB3 o el receptor ErbB4 respectivamente. Los complejos se forman cuando una célula que expresa ambos de estos receptores se expone a la HRG, y se pueden aislar mediante la inmunoprecipitación y analizar mediante SDS-PAGE según lo descrito en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994).

Los "anticuerpos" (Ac) y las "inmunoglobulinas" (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan una especificidad de unión hacia un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles elevados por los mielomas.

Los "anticuerpos nativos" y las "inmunoglobulinas nativas" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro entre cadenas espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácido forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre anticuerpos, y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye igualmente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR, Complementarity Determining Region) o regiones hipervariables, ambas en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan el marco (FR, Framework). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en buena parte una configuración de lámina \beta, conectada por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina \beta. Las CDR de cada cadena son mantenidas muy próximas entre sí por las regiones FR, y con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígenos de los anticuerpos (véase Kabat et al., NIH Publ. No.91-3242, Vol. 1, páginas 647-669 (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

La digestión de la papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígenos idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígenos y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad por cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación con antígenos y no ha perdido su capacidad de entrecruzar antígenos.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de y de unión a antígenos completo. Esta región está constituida por un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígenos sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Conjuntamente, las seis CDR confieren al anticuerpo una especificidad de unión a antígenos. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda sólo tres CDR específicas de un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque a una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el terminal carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación de la presente memoria para los Fab' en los que el/los residuo/s de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} fueron producidos originariamente como pares de los fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados se puede asignar a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Las inmunoglobulinas se pueden asignar a clases diferentes en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de éstas se pueden dividir en subclases (isotipos), por ejemplo: IgG1. IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \Delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras subunitarias y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada.

"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente, la región de unión a antígenos o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades traza. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, al contrario de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en tanto en cuanto se sintetizan mediante el cultivo de hibridomas, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El adjetivo "monoclonal" indica que el anticuerpo se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpretará que implique la necesidad de producir el anticuerpo mediante cualquier procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán según la presente invención pueden ser elaborados mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden ser elaborados mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo: la patente estadounidense n.º: 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de genotecas de anticuerpos expresados en fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de una determinada especie o pertenecientes a una determinada clase o subclase de anticuerpos, mientras que el resto de la/s cadena/s es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada (patente estadounidense n.º: No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas o fragmentos de inmunoglobulinas de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras secuencias de unión a antígenos de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como el ratón, la rata, el conejo con la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos ejemplo, los residuos de la región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias marco. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y maximizar el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos un, y comúnmente dos, dominios variables en los que todas o sustacialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquéllas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), comúnmente, aquélla de una inmunoglobulina humana. Para más información, véase Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988): y Presta. Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM} en el que la región de unión a antígenos del anticuerpo está derivada de un anticuerpo producido inmunizando monos macacos con el antígeno de interés.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv de una sola cadena" o "scFv" comprenden dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, estando estos dominios presentes en una sola cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un ligador de polipéptidos entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite a scFv formar la estructura deseada para la unión a antígenos. Para hacer un repaso sobre los scFv, véase Pluckthun en "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag. Nueva York. pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígenos, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un ligador que sea demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:6444-6448 (1993).

Como se usa en la presente memoria, el término "epítopo silvestre de unión a receptores" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG.

"Aislado", cuando se usa para describir las diversas proteínas reveladas en la presente memoria, significa proteína que ha sido identificada y separada y/o recuperada de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que interferirían comúnmente con los usos de diagnóstico o terapéuticos de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos y no proteínicos. En realizaciones preferidas, la proteína será purificada (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria o (2) hasta su homogeneización mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinte plata. La proteína aislada incluye proteína in situ de células recombinantes, pues al menos habrá un componente del medio natural de la proteína que no estará presente. Sin embargo, normalmente, la proteína aislada será preparada mediante al menos una etapa de purificación.

"Tratamiento" o "terapia" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas.

"Mamífero" a efectos de tratamiento o terapia se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos o de granja y de zoo, deportivos o animales de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está comúnmente caracterizada por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más concretos de tales cánceres incluyen cáncer de las células espinales, cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y de cuello.

II. Procedimientos y materiales

En general, en los usos médicos de la invención, los procedimientos para inducir la apóptosis en células de mamífero comprenden exponer las células a una cantidad eficaz de ligando Apo-2 y anticuerpo anti-Her-2. La cantidad de Apo-2L y anticuerpo anti-Her-2 empleada estará en cantidades eficaces para inducir sinérgicamente la apóptosis. Esto se puede realizar in vivo o ex vivo según, por ejemplo, los procedimientos descritos a continuación y en el ejemplo. Se contempla la posibilidad de usar la presente invención para tratar diversas condiciones caracterizadas por una sobre-expresión y/o una activación del receptor Her-2. Los ejemplos de condiciones o trastornos por ser tratados con ligando Apo-2 y anticuerpo anti-Her-2 incluyen cáncer benigno y maligno. Los procedimientos para determinar los niveles de expresión de Her-2 antes de exponer las células al ligando Apo-2 y al anticuerpo anti-Her-2 son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Slamon et al., patente estadounidense n.º: 4.968.603, describen diversos análisis de diagnóstico para determinar la amplificación o la expresión del gen Her-2 en células tumorales.

A. Materiales

El Apo-2L que se puede emplear en los procedimientos incluye los polipéptidos Apo-2L descritos en Pitti et al., supra, y en el documento WO 97/25428, supra. Se contempla el uso de diversas formas de Apo-2L, tales como el polipéptido de longitud completa, así como las formas solubles de Apo-2L que comprenden una secuencia del dominio extracelular (ECD, Extracellular Domain). Los ejemplos de tales secuencias solubles del DEC incluyen polipéptidos que comprenden los aminoácidos 114-281; 91-281 o 92-281 de la secuencia de Apo-2L mostrada en la figura 1A de Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996). Actualmente, se cree que el polipéptido que comprende los aminoácidos 92-281 es una forma escindida de forma natural del Apo-2L. Los solicitantes han expresado el Apo-2L humano en células CHO y han descubierto que el polipéptido de 92-281 es la forma expresada de Apo-2L. Se incluyen las formas modificadas de Apo-2L, tales como las formas modificadas covalentemente descritas en el documento WO 97/25428. En concreto, se incluye el Apo-2L ligado a un polímero no proteínico tal como polietilenglicol para su uso en los presentes procedimientos. El polipéptido Apo-2L se puede elaborar según cualquiera de los procedimientos descritos en el documento WO 97/25428.

Se contempla el empleo alternativo de una molécula que imite la actividad apoptótica de Apo-2L en los procedimientos revelados actualmente. Los ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos agonistas que pueden inducir la apóptosis de una manera similar a Apo-2L. En concreto, estos anticuerpos agonistas comprenderían anticuerpos frente a uno o más de los receptores de Apo-2L y que pudieran estimular la apóptosis. Los anticuerpos agonistas dirigidos contra al menos uno de estos receptores, denominados Apo-2, se han preparado usando técnicas de fusión tales como las descritas a continuación. Uno de los anticuerpos agonistas del receptor Apo-2 se denomina 3F11.39.7 y ha sido depositado en la CCTA con el número de depósito HB-12456 el 13 de enero de 1998. La actividad agonista de los anticuerpos de receptor Apo-2L se puede determinar usando diversos procedimientos de análisis de la actividad apoptótica. Muchos de estos análisis de la apóptosis se describen más detalladamente en la presente memoria.

Los anticuerpos anti-Her-2 que se pueden emplear en los procedimientos incluyen los anticuerpos monoclonales 7C2 y 7F3. Se contempla la posibilidad de usar uno o más anticuerpos anti-Her-2. Al menos uno de los anticuerpos anti-Her-2 será un anticuerpo inductor de la apóptosis. Preferiblemente, el anticuerpo que induce la apóstosis es uno que da como resultado de aproximadamente 2 a 50 veces más, preferiblemente, de aproximadamente 5 a 50 veces más y, lo más preferible, de aproximadamente 10 a 50 veces más, de inducción de la unión a la anexina en comparación con células no tratadas. Un segundo anticuerpo anti-Her-2 usado en combinación con un primer anticuerpo anti-Her-2 puede, por ejemplo, ser un anticuerpo que inhiba el crecimiento celular pero que no induzca la apóptosis. Opcionalmente, los anticuerpos se unirán a una región del dominio extracelular de Her-2, por ejemplo, a un epítopo del dominio 1 de Her-2. Preferiblemente, los anticuerpos se unirán al epítopo Her-2 unido mediante los anticuerpos 7C2 y/o 7F3 descritos en la presente memoria. Los anticuerpos de particular interés son aquellos que, además de las propiedades anteriormente descritas, se unen al receptor Her-2 con una afinidad de al menos aproximadamente 10 nM, más preferiblemente de al menos aproximadamente 1 nM.

El anticuerpo seleccionado puede ser uno como 7C2 que se une específicamente al Her-2 humano y no reacciona significativamente por cruzamiento con otras proteínas tales como aquéllas codificadas por los genes erbB1, erbB3 y/o erbB4. A veces, el anticuerpo puede no reaccionar significativamente por cruzamiento con la proteína neu de rata, por ejemplo, según lo descrito en Schecter et al., Nature, 312:513 (1984) y Drebin et al., Nature, 312:545-548 (1984). En tales realizaciones, el grado de unión del anticuerpo a estas proteínas (por ejemplo, unión en la superficie celular al receptor endógeno) será menor del aproximadamente 10% determinado mediante una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA).

Opcionalmente, el anticuerpo será uno que bloquee la unión a HRG/la activación del complejo Her-2/ErbB3 (por ejemplo, anticuerpo 7F3). Alternativamente, el anticuerpo es uno que no bloquea significativamente la activación del complejo receptor Her-2/ErbB3 mediante HRG (por ejemplo, 7C2). Además, el anticuerpo puede ser uno como 7C2 que no provoca una gran reducción del porcentaje de células en fase S (por ejemplo, uno que sólo provoque una reducción del aproximadamente 0-10% en el porcentaje de estas células en relación con el control).

En una realización, el segundo anticuerpo seleccionado inhibirá el crecimiento de células SKBR3 en cultivo celular en aproximadamente el 50% al 100% y, opcionalmente, se unirá al epítopo sobre Her-2 al que se une el anticuerpo 4D5.

El antígeno Her-2 para ser usado para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de Her-2; un péptido tal como un péptido del dominio 1 o una porción del mismo (por ejemplo, que comprenda el epítopo 7C2 o 7F3). Alternativamente, se pueden usar células que expresen Her-2 en su superficie celular; o una línea celular de carcinoma tal como células SKBR3, véase Stancovski et al., PNAS (EE.UU.), 88:8691-8695 (1991)), para generar anticuerpos. Otras formas de Her-2 útiles para generar anticuerpos resultarán evidentes para aquéllos expertos en la técnica.

Para identificar o seleccionar anticuerpos que induzcan la apóptosis, se evalúa en comparación con un control la pérdida de integridad de la membrana según lo indicado por, por ejemplo, PI, azul de tripano o reabsorción de 7AAD. El análisis preferido es el "análisis de reabsorción de PI usando células BT474". Según este análisis, se cultivan células BT474 (que se pueden obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA)) en medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM): HAM F-12 (50:50) complementado con SBF desactivado por calor al 10% (Hyclone) y L-glutamina 2 mM. (Así, el análisis se realiza en ausencia de complemento y de células efectoras inmunes). Se siembran las células BT474 a una densidad de 10^{6} por placa en placas de 60 x 15 mm y se permite la unión durante 2-3 días. Luego se retira el medio y se reemplaza con medio recién preparado solo o medio que contiene 10 \mug/ml del Acm apropiado. Se incuban las células durante un período de 3 días. Tras cada tratamiento, se lavan las monocapas con PBS y se separan mediante tripsinización. Entonces se centrifugan las células a 1.200 rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se vuelve a suspender la pella en 1 ml de tampón de unión a Ca^{2+} enfriado con hielo (Hepes 10 mM; pH 7,4; NaCl 140 mM; CaCl_{2} 2,5 mM) y se extraen alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con filtro de 35 mm (1 ml por tubo) para la eliminación de los agregados celulares. Entonces los tubos reciben PI (0,1 \mug/ml). Se pueden analizar las muestras usando un citómetro de flujo de FACSCAN^{TM} y el programa informático CellQuest de FACSCONVERT^{TM} (Becton Dickinson). Se pueden seleccionar aquellos anticuerpos que induzcan niveles estadísticamente significativos de apóptosis determinados mediante la reabsorción de PI.

Para seleccionar los anticuerpos que induzcan la apóptosis, se puede realizar un análisis de unión a anexina usando células BT474 según lo descrito en el ejemplo que se presenta a continuación. Las células BT474 se cultivan y se siembran en placas según lo descrito en el párrafo anterior. Luego se retira el medio y se reemplaza con medio recién preparado solo o medio que contiene 10 \mug/ml del Acm. Tras un período de incubación de tres días, se lavan las monocapas con PBS y se separan mediante tripsinización. Entonces se centrifugan las células, se vuelven a suspender en tampón de unión a Ca^{2+} y se extraen en tubos según lo descrito anteriormente para el análisis de la muerte celular. Los tubos reciben entonces anexina marcada (por ejemplo, anexina V-FITC) (1 \mug/ml). Se pueden analizar las muestras usando un citómetro de flujo de FACSCAN^{TM} y el programa informático CellQuest de FACSCONVERT^{TM} (Becton Dickinson). Aquellos anticuerpos que induzcan niveles estadísticamente significativos de unión a anexina en comparación con el control se seleccionan como anticuerpos inductores de la apóptosis.

Además del análisis de unión a anexina descrito en el párrafo anterior, se puede utilizar un análisis de tinción de ADN usando células BT474. Para realizar este análisis, se incuban células BT474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés según lo descrito en los dos párrafos anteriores con 9 \mug/ml de HOECHST 33342^{TM} durante 2 horas a 37ºC, luego se analizan en un citómetro de flujo de EPICS ELITE^{TM} (Coulter Corporation) usando el programa informático MODFIT LT^{TM} (Verity Software House). Con este análisis, los anticuerpos que induzcan un cambio en el porcentaje de células apoptóticas que sea dos veces mayor o más (y preferiblemente, 3 veces mayor o más) que las células sin tratar (hasta 100% de células apoptóticas) se pueden seleccionar como anticuerpos apoptóticos.

Para identificar o seleccionar los anticuerpos que se unen a un epítopo sobre Her-2 unido por un anticuerpo de interés, se puede realizar un análisis de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Alternativamente, se puede realizar una cartografía de epítopos.

Para identificar anticuerpos anti-Her-2 que inhiban el crecimiento de las células SKBR3 en cultivo celular en un 50-100%, se puede realizar el análisis de SKBR3 descrito en el documento WO89/06692. Según este análisis, las células SKBR3 se cultivan en una mezcla 1:1 de F12 y de medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina y penicilina/estreptomicina. Se colocan las células SKBR3 en placas a 20.000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (placa de 2 ml/35 mm). Se añaden 2,5 \mug/ml de anticuerpo anti-Her-2 por placa. Tras seis días, se cuenta el número de células, en comparación con células no tratadas usando un contador celular electrónico de COULTER^{TM}. Se pueden seleccionar aquellos anticuerpos que inhiban el crecimiento de las células SKBR3 en un 50-100% para su combinación con anticuerpos apoptóticos según lo deseado. También se conocen en la técnica metodologías alternativas para evaluar la inhibición del crecimiento de células tales como SKBR3, por ejemplo, aquéllas que utilizan violeta cristal para teñir las células. Véase, por ejemplo, Phillips et al., Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993).

Se pueden usar diversos tipos de anticuerpos Her-2 en los procedimientos, describiéndose tales tipos de anticuerpos de manera general a continuación en los subapartados (i)-(vii).

(i) Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales se elevan preferiblemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie por ser inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de semilla de soja usando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, maleimidobenzoil-sulfosuccinimida-éster (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2} o R^{1}N=C=NR, en el que R y R' son grupos alquilo diferentes.

Se inmunizan los animales frente al antígeno, los conjugados inmunogénicos o los derivados combinando, por ejemplo, 100 \mug o 5 \mug de la proteína o del conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y se les inyecta la solución intradérmicamente en múltiples zonas. Un mes más tarde, se vuelve a inyectar a los animales 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o el conjugado en adyuvante completo de Freund mediante la inyección subcutánea en múltiples zonas. De siete a 14 días después, se sangran los animales y se analiza el suero para determinar los niveles de anticuerpos. Se vuelve a inyectar a los animales hasta que los niveles se estancan. Preferiblemente, se aplica al animal una inyección complementaria del conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento diferente. También se pueden elaborar los conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. Además, se usan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para aumentar la respuesta inmune.

(ii) Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades traza. De este modo, el adjetivo "monoclonal" indica que el anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos diferenciados.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar usando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden ser elaborados mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo: la patente estadounidense n.º: 4.816.567).

En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, para hacer que los linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos se unan específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Entonces se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Se siembran y se cultivan las células de hibridoma así preparadas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas comúnmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidita (medio HAT) cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son aquéllas que se fusionan eficazmente, que soportan una producción a un alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras del anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como aquéllas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, EE.UU. Para la producción de anticuerpos monoclonales, también se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", pp. 51-63 (Marcel Dekker. Inc., Nueva York. 1987)).

Se analiza el medio de cultivo en el que están cultivadas las células de hibridoma en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante análisis de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis inmunoabsorbente ligada a enzimas (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, la afinidad y/o la actividad deseadas, se pueden subclonar los clones mediante procedimientos de dilución restrictivos y cultivarlos mediante procedimientos estándar (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado a este efecto incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, se pueden cultivar las células de hibridoma in vivo como tumores Ascitis de un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados adecuadamente del medio de cultivo, del fluido ascítico o del suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, la proteína A-Sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN codificante de anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes codificantes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, se puede colocar el ADN en vectores de expresión que luego son transfectados a células huésped, tales como, células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en células huésped recombinante. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN codificante del anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

En otra realización más, se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de genotecas de anticuerpos expresados en fagos generadas usando técnicas descritas en McCafferty et al., Nature. 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos humanos y murinos, respectivamente, usando genotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de los nM) mediante el intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como mediante la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia de construcción de genotecas de fagos de muy grandes dimensiones (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas del hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

También se puede modificar el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente estadounidense n.º: 4.816.567: Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 81:851 (1984)), o mediante la unión con enlace covalente a una secuencia codificante de inmunoglobulinas de toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido que no sea una inmunoglobulina.

Comúnmente tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas están sustituidos para los dominios constantes de un anticuerpo, o están sustituidos para los dominios variables de un sitio de combinación con antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación con antígenos que tenga una especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígenos que tenga una especificidad por otro antígeno diferente.

(iii) Anticuerpos humanizados y humanos

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en su interior procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos son habitualmente denominados residuos "de importación", que son comúnmente tomados de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias CDR o CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense n.º: 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos de la CDR y, posiblemente, algunos residuos de la región FR por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para ser usados en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento denominado del "mejor ajuste", se rastrea la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor frente a una genoteca completa de secuencias humanas de dominios variables conocidas. Entonces de acepta como marco (FR) humano la secuencia humana que sea más próxima a la del roedor para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento usa un determinado marco derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un determinado subgrupo de cadenas ligeras o pesadas. Se puede usar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Es más importante que los anticuerpos sean humanizados conservando la afinidad alta por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y parentales. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y resultan familiares a los expertos en la técnica. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales posibles de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. El examen de estas muestras permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, se pueden seleccionar los residuos de la FR y combinarlos desde el receptor e importar secuencias, tal que se logre obtener la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el/los antígeno/s diana. En general, los residuos de la CDR están directamente y más sustancialmente implicados en influir sobre la unión a
antígenos.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras una inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de una producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión a cadenas pesadas de anticuerpos (J_{H}) en ratones mutantes de la línea germinal y quimérica resulta en la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del alineamiento de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana de tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío antigénico. Véase, por ejemplo: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993): Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993). También es posible derivar anticuerpos humanos de genotecas de expresión en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991): Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)).

(iv) Fragmentos de anticuerpos

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo: Morimoto et al., "Journal of Biochemical and Biophysical Methods", 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, actualmente es posible producir estos fragmentos directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpos de las genotecas de anticuerpos expresados en fagos descritas anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli y acoplarlos químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, es posible aislar fragmentos F(ab')_{2} directamente de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos resultarán evidentes al experto en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv). Véase el documento WO 93/16185.

(v) Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos distintos. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos distintos de la proteína Her-2. Por ejemplo, un brazo se puede unir a un epítopo del dominio 1 de Her-2, tal como el epítopo 7C2/7F3, y el otro se puede unir a un epítopo de Her-2 distinto, por ejemplo: el epítopo 4D5. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión a Her-2 con un sitio/s de unión para RFCE, ErbB3 y/o ErbB4. Alternativamente, se puede combinar un brazo de anti-Her-2 con un brazo que se una a una molécula desencadenante sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3) o receptores Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celulares hacia la célula que expresa Her-2. También es posible usar los anticuerpos biespecíficos para ubicar agentes citotóxicos hacia células que expresen Her-2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a Her-2 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-\alpha, alcaloide de la vinca, cadena A del ricino, metotrexato o hapteno de isótopo radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab')_{2}).

Opcionalmente, los anticuerpos biespecíficos pueden incluir anticuerpos que combinan un sitio de unión a Her-2 con un sitio/s de unión para un receptor del Apo-2L. Tales receptores incluirían el receptor Apo-2 y el receptor DR4 (que están descritos en al apartado de antecedentes). Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede tener un brazo que se una a un epítopo de Her-2 y otro brazo que se una a un receptor del ligando Apo-2.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, teniendo las dos cadenas especificidades distintas (Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que habitualmente se hace mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda de realizar, siendo los rendimientos del producto bajos. En el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EVIBO J., 10:3655-3659 (1991), se revelan procedimientos
similares.

Según un enfoque diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo y antígeno) con secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. Es preferible que la fusión sea con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprenda al menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para unirse a cadenas ligeras, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN codificantes de de las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan a un organismos huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad del ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales dé como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no sean de particular
relevancia.

En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, pues la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se revela en el documento WO 94/04690. Para más información sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., "Methods in Enzymology", 121:210 (1986). Según otro enfoque descrito en el documento WO96/27011, se puede diseñar genéticamente la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del domino C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, se reemplazan una o más cadenas pequeñas laterales de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo por cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de un tamaño idéntico o similar a la/s cadena/s lateral/es larga/s en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas largas laterales de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar la producción del heterodímero frente a otros productos finales no deseados tales como
homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos "heteroconjugados" o entrecruzados. Por ejemplo, se puede acoplar uno de los anticuerpos del heteroconjugado con avidina, el otro, con biotina. Se han propuesto tales anticuerpos, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunológico hacia células no deseadas (Patente estadounidense n.º: 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos de heteroconjugados usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son conocidos en la técnica y se revelan en la patente estadounidense n.º: 4.676.980 junto con un número de técnicas de entrecruzamiento.

También se han descrito en la bibliografía técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab')_{2}. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente complejante de ditiol arsenita de sodio para estabilizar ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos de Fab' generados son entonces convertidos en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB es entonces reconvertido en el Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los progresos recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli que pueden ser apareados químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de F(ab')_{2} de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado de E. coli y sometido a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado era capaz de unirse a células que sobre-expresaban el receptor Her-2 y células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos frente a dianas tumorales de mama humana.

También se han descrito diversas técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun fueron unidas a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios de V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios de V_{L} Y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígenos. También se ha descrito otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros Fv de una sola cadena (scFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Quedan englobados los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991).

(vi) Diseño genético de funciones efectoras

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora para, por ejemplo, aumentar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se puede(n) introducir residuo/s de cisteína en la región Fc permitiendo así la formación de enlaces de tipo disulfuro entre las cadenas de esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una mejor capacidad de interiorización y/o una mayor capacidad de matar células mediada por complementos y una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (CCDA). Véase Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992). También se pueden preparar anticuerpos homodiméricos con una mayor actividad antitumoral usando ligadores de entrecruzamiento heterobifuncionales según lo descrito en Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar genéticamente un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y pueda así tener mayores capacidades de lisis de complementos y de CCDA. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989).

(vii) Fusiones de epítopos de unión de receptores silvestres-anticuerpos

En ciertas realizaciones de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto para, por ejemplo, aumentar la penetración tumoral. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo para aumentar su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión a receptores silvestres en un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, mediante la mutación de la región apropiada del fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en una etiqueta peptídica que luego sea fusionada con el fragmento de anticuerpo en cualquier extremo o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o de péptidos).

Los procedimientos sistemáticos para preparar tales variantes de anticuerpo que tengan una mayor vida media in vivo comprenden varias etapas. La primera implica identificar la secuencia y la configuración de un epítopo de unión a receptores silvestres de una región Fc de una molécula de IgG. Una vez identificado este epítopo, se modifica el anticuerpo de interés para que incluya la secuencia y la configuración del epítopo de unión identificado. Una vez mutada la secuencia, se analiza la variante de anticuerpo para ver si tiene una mayor vida media in vivo que la del anticuerpo original. Si la variante de anticuerpo no tiene una vida media in vivo mayor tras el análisis, se sigue alterando la secuencia para que incluya la secuencia y la configuración del epítopo de unión identificado. Se analiza el anticuerpo modificado en cuanto a una vida media más prolongada, y se sigue realizando el procedimiento hasta que se obtenga una molécula que presente una vida media in vivo más larga.

El epítopo de unión a receptores silvestres así incorporado en el anticuerpo de interés es cualquiera de tales epítopos adecuados según lo definido anteriormente, y su naturaleza dependerá, por ejemplo, del tipo de anticuerpo que esté siendo modificado. La transferencia se realiza tal que el anticuerpo de interés siga poseyendo las actividades biológicas descritas en la presente memoria.

Preferiblemente, el epítopo constituye una región en la que uno cualquiera o más residuos de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc sean transferidos a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Todavía más preferiblemente, se transfieren tres o más residuos de uno o dos bucles del dominio Fc. Todavía más preferiblemente, se toma el epítopo del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se transfiere a la región CH1, CH3 o V_{H}, o a más de una de tales regiones del anticuerpo. Alternativamente, se toma el epítopo del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región C_{L} o a la región V_{L}, o a ambas, del fragmento de anticuerpo.

B. Formulaciones

El ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2 son preferiblemente administrados en un vehículo. Es posible administrar ambos en un solo vehículo o, alternativamente, se pueden incluir en vehículos separados. En "Remington's Pharmaceutical Sciences", XVI ed., 1980. Mack Publishing Co., editado por Oslo et al, se describen vehículos adecuados y sus formulaciones. Comúnmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en el vehículo para volver la formulación isotónica. Los ejemplos de vehículo incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a aproximadamente 7,8. Resultará evidente a aquéllos expertos en la técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles en función de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración del agente que esté siendo administrado. El vehículo puede

\hbox{estar en forma de una formulación  liofilizada o una
solución acuosa.}

Los vehículos, excipientes o estabilizadores son preferiblemente no tóxicos para las células y/o receptores en las dosis y a las concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquil-parabenos tales como metil- o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG).

La formulación también puede contener más de un compuesto activo según lo que sea necesario para la indicación concreta que esté siendo tratada, preferiblemente, aquéllos con actividades complementarias que se no afecten negativamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina o un agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces a los efectos deseados.

El Apo-2L y/o el anticuerpo anti-Her-2 también pueden estar confinados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales, (por ejemplo, liposomas, microesféras de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se revelan en "Remington's Pharmaceutical Sciences" XVI edición, Osol, A. Ed. (1980).

Las formulaciones para ser usadas en una administración in vivo deberían ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos con una determinada forma, por ejemplo: películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o alcohol poli(vinílico), polilactidas (Patente estadounidense n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos de tiempo.

C. Modos de administración

El Apo-2L y el anticuerpo Her-2 se pueden administrar conforme a procedimientos conocidos, tales como una administración intravenosa como un bolo o mediante infusiones continuas durante un período de tiempo, mediante vía intramuscular, intraperitoneal, intracero-brospinal, subcutánea, intra-arterial, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Opcionalmente, se puede realizar la administración a través de una infusión con mini-bomba usando diversos dispositivos disponibles comercialmente.

Las dosis y los regímenes posológicos eficaces para la administración del ligando Apo-2 y del anticuerpo Her-2 se pueden determinar empíricamente, siendo la realización de tales determinaciones competencia del experto en la técnica. Actualmente, se cree que una dosis o una cantidad eficaz de ligando Apo-2 usado solo puede variar de aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal o más al día. Se puede realizar un ajuste de la escala de las dosis entre especies de una manera conocida en la técnica, por ejemplo: según lo revelado en Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991). Los expertos en la técnica entenderán que la dosis de ligando Apo-2 que debe ser administrada variará en función de, por ejemplo, el mamífero que reciba el ligando Apo-2, de la vía de administración y de otros fármacos o terapias que estén siendo administradas al mamífero.

En función del tipo de células y/o de la gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para la administración, bien, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar de aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, en función de factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, se mantiene el tratamiento hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, hay otros regímenes posológicos que pueden ser útiles.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad por ser tratada, según lo definido anteriormente, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de si el anticuerpo se administra con objetivos preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, del historial clínico el paciente y de la respuesta al anticuerpo, y del criterio del médico. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en un determinado momento o durante una serie de tratamientos.

Se contempla el empleo de todavía más terapias en los procedimientos. La terapia o las terapias del resto de terapias pueden incluir, pero no se limitan a, quimioterapia y/o terapia de radiación, inmunoadyuvantes, citoquinas y otras terapias basadas en anticuerpos no Her-2. Los ejemplos incluyen interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6), factor inhibidor de la leucemia, interferones, FCT-heta-eritropoietina, trombopoietina y anticuerpo anti-FCEV. También se pueden emplear otros agentes conocidos por inducir la apóptosis en células de mamífero, y tales agentes incluyen FNT-\alpha, FNT-\beta (linfotoxina-\alpha), ligando CD30, ligando 4-1BB y ligando Apo-1.

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Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en la técnica y se encuentran comercialmente disponibles, tales como la Adriamicina, Doxorrubicina, 5-Fluorouracil, Arabinósido de citosina ("Ara-C"), Ciclofosfamida, Camptotecina, Leucovorina, Tiotepa, Busulfán, Citoxina, Taxol, Toxotere, Metotrexato, Cisplatina, Melfalán, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincreistina, Vinorrelbina, Carboplatina, Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina, Mitomicinas, Esperamicinas (véase la patente estadounidense N.º: 4.675.187). Melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También están incluidos agentes que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como tamoxifén y onapristona.

La preparación o los regímenes posológicos para tal quimioterapia se pueden usar según las instrucciones de los fabricantes o según lo determinado empíricamente por el experto en la técnica. La preparación o los regímenes posológicos para tal quimioterapia también se describen en "Chemotherapy Service" Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la administración con el Apo-2L y/o anticuerpo Her-2, o se puede administrar simultáneamente a la misma.

La quimioterapia se administra preferiblemente en un vehículo, tal como aquéllos descritos anteriormente. El modo de administración de la quimioterapia puede ser el mismo empleado para el ligando Apo-2 o el anticuerpo Her-2, o puede ser administrada mediante un modo diferente.

La terapia de radiación se puede administrar según protocolos comúnmente empleados en la técnica y conocidos por el experto en la técnica. Tal terapia puede incluir radiación de cesio, iridio, yodo o cobalto. La terapia de radiación puede ser una radiación a todo el cuerpo o puede ser dirigida localmente a una zona o a un tejido específico del o sobre el cuerpo. Comúnmente, la terapia de radiación se administra en pulsos durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. La terapia de radiación se puede administrar, sin embargo, durante períodos de tiempo más prolongados. Opcionalmente, la terapia de radiación se puede administrar en una sola dosis o en múltiples dosis consecutivas.

El ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2 (y una o más de otras terapias) se pueden administrar simultáneamente o consecutivamente. Tras la administración del ligando Apo-2 y del anticuerpo Her-2, se pueden analizar las células tratadas in vitro. Cuando se ha realizado un tratamiento in vivo, se puede controlar al mamífero tratado de diversos modos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, se puede observar la masa tumoral físicamente, mediante biopsia o mediante técnicas estándar de formación de imágenes por rayos X.

III. Artículos de fabricación

En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los envases pueden estar formados por una variedad de materiales tales como vidrio y plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos de la composición son el ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2. La etiqueta del o asociada con el envase indica que la composición se usa para tratar la condición seleccionada. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con las instrucciones de uso.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y sin fines restrictivos.

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Ejemplo 1

Líneas celulares. Las células de tumor de mama humano establecidas BT474 (disponibles en la ATCC) y MCF7/
HER-2 (línea celular de tumor de mama de MCF7 transfectada a HER-2; células SKBR3 y MCF7 disponibles en la ATCC) se cultivaron en DMEM:HAM F-12 (50:50) (Gibco, Grand Island, NY) complementado con suero bovino fetal desactivado por calor al 10% (SBF) (HyClone, Logan, UT) y L-glutamina (2 mM).

Reactivos bioquímicos. Los reactivos bioquímicos usados para los estudios de la apóptosis fueron: Anexina V-FITC (BioW-hittaker, Inc.), yoduro de propidio (PI, Molecular Probes, Inc.) y HOECHST 33342^{TM} (Calbiochem).

Ligando Apo-2. El Apo-2L marcado con His que comprende los aminoácidos 114-281 de Apo-2L (según lo mostrado en la figura 1A de Pitti et al., J. Blot. Chem., 271:12687-12690 (1996)) se preparó según lo descrito en el documento WO97/25428.

Anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales murinos de la IgG_{l}K de anti-Her-2 específicos del dominio extracelular de Her-2 se produjeron según lo descrito en Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990) y el documento WO89/06692. En síntesis, se cultivaron células NIH 3T3/HER-2-3_{400} (que expresaban aproximadamente 1 x 10^{6} moléculas de Her-2/célula) producidas según lo descrito en Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 84:7159 (1987) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 25 mM y se usaron para inmunizar ratones BALB/c. Los ratones recibieron inyecciones i.p. de 10^{7} células en 0,5 ml de PBS en las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisuero que hizo inmunoprecipitar Her-2 marcado con ^{32}P recibieron inyecciones i.p. de aglutinina de germen de trigo-sefarosa (WGA) purificadas con extracto de membrana de Her-2 en las semanas 9 y 13. A continuación se aplicó una inyección i.v. de 0,1 ml de la preparación de Her-2 y se fusionaron los esplenocitos con línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Se rastrearon los sobrenadantes de hibridoma en cuanto a la unión a Her-2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación. Se usó MOPC-21 (IgG1) (Cappell, Durham. NC), como un control combinado con isótopo.

El Acm anti-Her-2 usado se denomina 7C2. El Acm de control combinado con isótopo 1766 se dirige contra la glicoproteína D del virus del herpes simple (VHS-1). Experimentos de citometría de flujo para medir la inducción a la apóptosis. Se sembraron células BT474 a una densidad de 10^{6} por placa en placas de 60 x 15 mm y se permitió la unión durante 2-3 días. Se sembraron células SKBR3 a una densidad de 5,0 x 10^{5} por placa en placas de 60 x 15 mm y se permitió la unión durante 2-3 días. Luego se retiró el medio y se reemplazó con medio recién preparado solo o medio que contenía ligando Apo-2 y el Acm denominado 7C2. Para la mayoría de los experimentos, se incubaron las células durante un período de 3 días. Las concentraciones de Acm usadas en los experimentos fueron de 0,25; 0,5, 1 y 10 \mug/ml. La concentración de ligando Apo-2 usada en los experimentos fue de 1 \mug/ml. Tras cada tratamiento, se recogieron individualmente los sobrenadantes y se mantuvieron en hielo, se separaron las monocapas mediante tripsinización y se mezclaron con el correspondiente sobrenadante. Entonces se centrifugaron las células a 1.200 rpm durante 5 minutos a 4ºC, se volvió a suspender la pella en 1 ml de tampón de unión a Ca^{2+} enfriado con hielo (Hepes 10 mM; pH 7,4; NaCl 140 mM; CaCl_{2} 2,5 mM) y se extrajeron alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con un filtro de 35 mm (1 ml por tubo) para la eliminación de los agregados de células. Cada tubo recibió entonces Anexina V-FITC (0,1 \mug/ml) o PI (10 \mug/ml) o anexina V-FITC más PI o azul de tripano. Se analizaron las muestras usando un citómetro de flujo de FACSCAN^{TM} y el programa informático CellQuest de FACSCONVERT^{TM} (Becton Dickinson).

Los resultados de los experimentos se muestran en las figuras 1-3. Las combinaciones del ligando Apo-2 y del Acm anti-Her-2 7C2 indujeron sinérgicamente la apóptosis en las líneas celulares que sobre-expresan Her-2 tal y como se demuestra mediante la unión a la anexina V, la reabsorción de PI o la reabsorción de azul de tripano.

Depósito de materiales

Los siguientes materiales han sido depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. (ATCC):

1

La realización de estos depósitos fue en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes y de las Regulaciones en virtud del mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de cultivos viables durante 30 años desde la fecha del depósito. Los depósitos serán puestos a disposición del público por parte de la ATCC en virtud de los términos y las condiciones del Tratado de Budapest, estando sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. Y la ATCG que garantiza (a) que el acceso a los cultivos será posible mientras dure el proceso de solicitud de la patente para la persona determinada por el Comisionado con derecho a ello en virtud de 37 CFR \NAK1.14 y 35 USC \NAK122, y (b) que todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los cultivos así depositados serán irrevocablemente retiradas tras la concesión de la patente.

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que en caso de que los cultivos en depósito murieran o se perdieran o se destruyeran al ser cultivados bajo condiciones adecuadas, serán reemplazados de inmediato bajo notificación por una muestra viable del mismo cultivo. La disponibilidad de los depósitos no será interpretada como una licencia de práctica de la invención en contravención de los derechos concedidos en virtud de la autoridad de cualquier gobierno según su legislación en materia de patentes.

Se considera que la memoria escrita precedente es suficiente para permitir que cualquier experto en la técnica ponga en práctica la invención. La presente invención no pretende ser limitada en cuanto al ámbito por los materiales depositados. El depósito del material de la presente memoria no implica que la descripción escrita contenida en la presente memoria sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni pretende restringir el ámbito de las reivindicaciones a la ilustración específica que ésta representa.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante se proporciona únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet US5480968A [0017]

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\bullet WO9404690A [0091]

\bullet WO9627011A [0091]

\bullet US4676980A [0092] [0092]

\bullet WO9100360A [0092]

\bullet WO92200373A [0092]

\bullet EP03089A [0092]

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Claims (17)

1. Uso del ligando Apo-2 y de un anticuerpo anti-Her-2 para la preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en células cancerosas de mamífero que sobre-expresan el receptor Her-2, en el que el ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2 inducen sinérgicamente una apóptosis.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que el ligando Apo-2 está ligado a un polímero no proteínico.

3. Uso de la reivindicación 2, en el que el polímero es polietilenglicol.

4. Uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-Her-2 se une al dominio 1 de Her-2.

5. Uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-Her-2 se une al epítopo 7C2 sobre Her-2.

6. Uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-Her-2 es un anticuerpo monoclonal.

7. Uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-Her-2 tiene residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) no humanos y residuos de la región marco (FR) humanos.

8. Uso de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-Her-2 tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo 7C2 depositado como N.º de ATCC: ATCC HB-12215.

9. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento comprende además uno o más agentes inhibidores del crecimiento.

10. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento comprende además uno o más agentes quimioterapéuticos.

11. Uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento es para la administración con radiación.

12. Uso de la reivindicación 1, en el que las células cancerosas comprenden células de cáncer de mama, de cáncer de ovario y de cáncer de pulmón.

13. Uso del ligando Apo-2 y de un anticuerpo anti-Her-2 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un mamífero, caracterizado por la sobre-expresión del receptor Her-2, en el que el ligando Apo-2 y el anticuerpo anti-Her-2 inducen sinérgicamente la apóptosis en células cancerosas.

14. Uso de la reivindicación 13, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de ovario o cáncer de pulmón.

15. Composición que comprende el ligando Apo-2 y un anticuerpo anti-Her-2 y un vehículo para inducir sinérgicamente la apóptosis en células cancerosas de mamífero que sobre-expresan el receptor Her-2.

16. Composición de la reivindicación 15, en la que el anticuerpo anti-Her-2 se une al dominio 1 de Her-2.

17. Equipo que comprende el ligando Apo-2 y un anticuerpo anti-Her-2 para su uso en combinación para inducir sinérgicamente la apóptosis en células cancerosas de mamífero que sobre-expresan el receptor Her-2.