ES2309463T3 - Peptidos antioxidantes de proteina de soja. - Google Patents
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Abstract
Método de reducción de la degradación oxidativa de grasas o aceites en una composición, que comprende añadir a dicha composición una cantidad eficaz de una proteína aislada que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias: GVAW; GVAWW; GVAWWM; GVAWWMY; GVAWWM*; y GVAWWM*Y, en las que M* es sulfóxido de metionina.
Description
Péptidos antioxidantes de proteína de soja.
La presente invención se refiere a péptidos
antioxidantes que resultan de la digestión proteolítica de la
proteína de soja. Los péptidos pueden usarse como aditivos en
composiciones farmacéuticas o dietéticas para proteger los
compuestos de la degradación oxidativa. Alternativamente, los
péptidos pueden usarse en sí mismos como o bien agentes
terapéuticos o bien complementos dietéticos.
Se ha notificado que la proteína de soja tiene
un número de importantes efectos promotores de la salud, incluyendo
una capacidad para reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular y
cáncer (Potter, Nutr. Rev. 56:231-235 (1998);
Greeves, J. Nutr. 130: 820-826 (2000); J. Nutr.
125:698S-708S (1995); J. Nutr. 125:7335
S-7435 (1995)). Una posible explicación para estos
efectos se sugiere por el hecho de que los péptidos generados a
partir de soja usando proteasas han mostrado tener actividad
antioxidante (Chen y cols. J. Agric. Food Chem.
46:49-53 (1998); Chen y cols. J. Agric. Food
Chem. 43:574-578 (1995); Suetsuna, J. Jpn. Soc.
Nutr. Food Sci. 52:225-228 (1999); véase también
Zhang, y cols. Ann. NY Acad. Sci. 864:
640-645 (1998)). Eliminando radicales libres y
especies oxidantes generadas en el transcurso de reacciones in
vivo, los péptidos pueden ayudar a proteger frente a procesos
patogénicos que implican la inactivación de enzimas, la mutación de
ADN y desnaturalización de proteínas (Szweda, y cols. J.
Biol. Chem. 268:3342 (1993); Reiss y cols. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 48:921 (1972)).
Además de tener un uso clínico potencial en la
reducción del riesgo de que los pacientes desarrollen enfermedad
cardíaca (Perticone, y cols., Diabetes
50):159-165 (2001); Krinksy, Annu. Rev. Nutr. 13:561
(1993)) y cáncer (Melov, y cols., Science
289:1567-1569 (2000)), los péptidos antioxidantes
pueden usarse para evitar daño oxidativo en productos alimenticios
y farmacéuticos. En los productos alimenticios, los péptidos pueden
usarse para evitar la oxidación de aceites y grasas, lo que se
asocia con la pérdida de valor nutritivo y que causa rancidez. En
los productos farmacéuticos, deben ayudar a mantener la integridad
estructural de los fármacos expuestos a radicales de oxígeno
destructivos.
El documento WO 03/097791 proporciona un método
de identificación de alfa-galactosidasas alcalinas.
También se proporcionan secuencias de polinucleótidos novedosas que
codifican para polipéptidos que tienen una actividad
alfa-galactosidasa alcalina, oligonucleótidos y
análogos de oligonucleótidos derivados de las secuencias de
polinucleótidos, péptidos y análogos de péptidos, anticuerpos que
reconocen los mismos y métodos para el uso de los mismos. Sin
embargo, no se menciona en el documento WO 03/097791 que los
péptidos dados a conocer en este respecto presenten propiedades
antioxidantes.
Sonnet y cols, Tetrahedron Letters 44
(2003) págs. 3293-3296 "First synthesis of
segetalins B and G: two cyclopentapeptides with
estrogen-like activity" dan a conocer la síntesis
de dos segetalinas B y G. Los péptidos lineales correspondientes se
sintetizaron usando métodos SPPS de flujo continuo automatizados
convencionales. Las posiciones de cierre de anillo se investigaron
para la segetalina B. La mejor actividad de cierre de anillo se
encontró entre Val y Gly. No se menciona en ese artículo de revista
que cualquiera de los péptidos dados a conocer en este respecto
presenta propiedades antioxidantes.
Saito y cols, Journal of Agricultural and
Food Chemistry 2003, 51, págs. 3668-3674 dan a
conocer dos series de bibliotecas tripeptídicas combinatorias,
basándose en un péptido antioxidante aislado de una hidrolasa de
proteína de soja. Una era una biblioteca de 108 péptidos que
contenía residuos o bien His o bien Tyr. Otra era una biblioteca de
114 péptidos relacionada con
Pro-His-His, que se identificó como
un núcleo activo del péptido antioxidante. Las propiedades
antioxidantes de estas bibliotecas se examinaron mediante varios
métodos, tales como la actividad antioxidante frente a la
peroxidación del ácido linoleico, la actividad reductora, la
actividad de eliminación de radicales y la actividad de eliminación
de peroxinitrito. Los tripéptidos que contienen dos Tyr mostraron
actividades más altas que los tripéptidos que contienen dos His en
la peroxidación del ácido linoleico.
Tyr-His-Tyr mostró un efecto
sinérgico fuerte con los antioxidantes fenólicos. Sin embargo, el
tripéptido sólo tuvo una actividad reductora mínima y una actividad
de eliminación de peroxinitrito moderada. Los tripéptidos que
contienen cisteína mostraron una actividad de eliminación de
peroxinitrito fuerte. El cambio de o bien el extremo
N-terminal o bien el extremo
C-terminal de
Pro-His-His por otros restos de
aminoácido no alteró significativamente su actividad antioxidante.
Los tripéptidos que contienen restos Trp o Tyr en el extremo
C-terminal tuvieron actividades de eliminación de
radicales fuertes, pero una actividad de eliminación de
peroxinitrito muy débil. Los presentes resultados permiten entender
por qué los digestos de proteína tienen tal variedad de propiedades
antioxidantes.
Herraiz y cols., Free Radical Research
(marzo de 2004) volumen 38, número 3, páginas 323-31
da a conocer una serie de experimentos en los que un total de
veintinueve indoles y análogos se examinaron para determinar sus
propiedades como antioxidantes y eliminadores de radicales frente al
catión radical ácido
2-2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
ABTS. Sólo con unas pocas excepciones, los indoles reaccionaron de
una manera no específica y extinguieron este radical a pH
fisiológico proporcionando ABTS. Las indolaminas como triptamina,
serotonina y metoxitriptamina, neurohormonas (melatonina),
fitohormonas (ácido indolacético y ácido indolpropiónico),
aminoácidos indólicos como L-triptófano y derivados
(N-acetiltriptófano, L-abrina, éster
etílico de triptófano), alcoholes indólicos (triptofol e
indol-3-carbinol), péptidos pequeños
que contienen triptófano, y alcaloides
tetrahidro-beta-carbolina
(piridoindol) como el compuesto de la glándula pineal pinolina,
actuaron como eliminadores de radicales y antioxidantes en un
ensayo de ABTS que medía la actividad antioxidante total. Sus
valores de capacidad antioxidante equivalente al Trolox (TEAC)
oscilaron desde 0,66 hasta 3,9 mM, normalmente más altos que para
Trolox y ácido ascórbico (1 mM). Los valores antioxidantes más
altos se determinaron para melatonina,
5-hidroxitriptófano, trp-trp y
5-metoxitriptamina. Se consumieron compuestos de
indol activos durante la reacción con ABTS y algunos
tetrahidropiridoindoles (por ejemplo harmalina y éster etílico del
ácido
1-metil-1,2,3,4-tetrahidro-\beta-carbolina-3-carboxílico)
proporcionaron las correspondientes
\beta-carbolinas completamente aromáticas
(piridoindoles), que no eliminaron el ABTS. La actividad de
eliminación de radicales de indoles frente a ABTS fue más alta a pH
fisiológico que a pH bajo. Estos resultados apuntaron a los
compuestos estructurales con un resto indol como una clase de
eliminadores de radicales y antioxidantes. Esta actividad puede ser
de significancia biológica dando las concentraciones fisiológicas y
la distribución corporal de algunos indoles.
El documento EP0657520 proporciona un
antioxidante seguro aplicable a comidas, medicinas,
cuasi-fármacos y otros productos. El antioxidante
contiene un principio activo que comprende una sustancia
antioxidante sola o una mezcla de la misma con un inhibidor de
oxidación, seleccionándose dicha sustancia antioxidante del grupo
que consiste en productos de descomposición de lactoferrinas,
péptidos aislados de los productos de descomposición anteriores,
péptidos sintéticos que tienen cada uno la misma secuencia de
aminoácidos que la de cualquiera de los péptidos sintéticos y
mezclas arbitrarias de esos compuestos. Este antioxidante tiene un
efecto excelente de inhibir la oxidación de diversos lípidos, es
sumamente seguro para alimentos y fármacos, y presenta un efecto
antioxidante incluso en una pequeña cantidad, de manera que apenas
afecta al gusto, etc. del alimento o similares.
El documento JP 48-014942 da a
conocer un hidrolizado de proteína que puede añadirse a alimentos
para retardar la oxidación de aceites y grasas en esas alimentos.
La eficacia del hidrolizado se demostró añadiendo el
3-5% del hidrolizado a una disolución de alcohol al
20% de ácido linoleico que dio como resultado un retraso
significativo en la producción de peróxido. El hidrolizado se formó
mezclando 0,3 g de proteasa con 100 g de proteína de soja en 1,2
litros de agua. La mezcla se incubó a 45ºC durante 24 h. El
hidrolizado resultante, tras el secado, contenía el 1,3% de
aminoácidos y el 84,2% de péptidos.
La presente invención se basa en el aislamiento
y la caracterización de péptidos derivados de proteína de soja que
tienen un alto grado de actividad antioxidante. Estos péptidos
pueden incluirse en composiciones farmacéuticas o dietéticas con el
fin de eliminar radicales libres y evitar la descomposición
oxidativa de compuestos.
Ejemplos de tales péptidos consisten en una
cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos: GVAW (SEQ
ID NO:1); GVAWW (SEQ ID NO:2); GVAWWM (SEQ ID NO:3); GVAWWMY (SEQ ID
NO:4); GVAWWM* y GVAWWM*Y; en las que el símbolo M* se refiere a
sulfóxido de metionina y también puede abreviarse como o bien
Met(O) o bien MetS(O). Todas estas secuencias se
muestran como que comienzan en el extremo N terminal (a la
izquierda) y que terminan en el extremo C terminal (a la derecha).
Los péptidos sólo contienen los l-aminoácidos que en
la técnica se reconocen comúnmente que están presentes en las
proteínas de mamíferos o plantas.
Por tanto, según la presente invención se
proporciona un método de reducción de la degradación oxidativa de
grasas o aceites en una composición, que comprende añadir a dicha
composición una cantidad eficaz de una proteína aislada que
consiste en cualquiera de las siguientes secuencias:
GVAW;
GVAWW;
GVAWWM;
GVAWWMY;
GVAWWM*; y
GVAWWM*Y.
Los péptidos que tienen las secuencias de
aminoácidos representadas mediante SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:4, así
como los péptidos que contienen sulfóxido de metionina, parecen ser
todos el resultado de la digestión proteolítica de la subunidad G1,
G2 o G3 de glicinina (la fracción 11S de aislado de proteína de
soja). Los péptidos restantes parecen resultar de la digestión del
precursor G4 de glicinina, el precursor G5 de glicinina, el
precursor del polipéptido II de la citocromo C oxidasa o el
precursor de la proteína de unión a sacarosa de 62 K, todos los
cuales tienen secuencias que se conocen en la técnica. Los péptidos
pueden obtenerse tratando aislado de proteína de soja, concentrado
de proteína de soja y harina de soja usando los procedimientos
descritos en el presente documento o, alternativamente, pueden
sintetizarse usando métodos en fase sólida o líquida que son
rutinarios en la técnica de química de péptidos.
La expresión "péptido aislado" tal como se
usa en el presente documento se refiere a un péptido que se ha
separado de otros componentes biológicos que lo acompañan y
normalmente debería comprender al menos el 85% de una muestra,
prefiriéndose porcentajes mayores. La pureza de las preparaciones
puede evaluarse usando procedimientos convencionales tales como
electroforesis, cromatografía y centrifugación analítica.
La expresión "que consiste esencialmente
en" incluye péptidos que tienen las secuencias exactas mostradas
así como péptidos que no difieren sustancialmente de aquellos
mostrados o bien en términos de estructura o bien de función. Se
reconoce bien que las sustituciones de aminoácidos conservativas,
por ejemplo, la sustitución de un aminoácido ácido, básico o neutro
por otro, pueden hacerse a menudo sin afectar a la actividad
biológica de un péptido o una proteína. De manera similar, a menudo
es posible añadir uno o más aminoácidos al extremo N o C terminal
de péptidos sin reducir sustancialmente la actividad. Variaciones
menores en secuencia de esta naturaleza se abarcan mediante la
expresión "que consiste esencialmente en" siempre que estos
cambios no reduzcan sustancialmente la actividad antioxidante. Para
los fines de la presente invención, las modificaciones en secuencia
se limitan a la sustitución de no más de un aminoácido por péptido
y/o la adición de no más de uno o dos aminoácidos al extremo N y/o
C terminal de un péptido. Cualquier cambio estructural que reduce
sustancialmente la actividad antioxidante (por ejemplo, en un 15% o
más tal como se determinó usando uno de los ensayos descritos en el
presente documento o usando otro ensayo aceptado en la técnica) da
como resultado un péptido que no es una parte de la invención.
Los péptidos antioxidantes usados en el método
de la presente invención pueden usarse en composiciones
farmacéuticas o dietéticas. Las composiciones farmacéuticas pueden
formularse usando procedimientos convencionales en la técnica y
pueden diseñarse para cualquier vía de administración. En algunas
composiciones farmacéuticas, los péptidos se añadirán con el fin de
evitar la destrucción oxidativa de agentes terapéuticos activos y
deberían estar presentes en una cantidad suficiente para eliminar
eficazmente radicales libres. Por ejemplo, un péptido puede estar
presente en composiciones líquidas a entre 0,1 \mug/ml y 1,0 mg/ml
y, en formas farmacéuticas sólidas, a entre el 0,0001% y el 10% del
peso total de la composición.
En otros casos, el propio péptido puede
constituir un principio activo primario en composiciones
farmacéuticas diseñadas para tratar afecciones patológicas
asociados con una oxidación excesiva. En estos casos, un péptido
constituirá normalmente un porcentaje mucho más alto de una forma
farmacéutica. Por ejemplo, puede constituir el
1-100% de una forma farmacéutica sólida o estar
presente en formas farmacéuticas líquidas a una concentración que
oscila desde 0,1 mg/ml hasta 10 mg/ml. El péptido puede constituir
el único principio activo o combinarse con otros agentes
terapéuticos, por ejemplo, otros antioxidantes. Las afecciones que
pueden tratarse usando composiciones farmacéuticas que contienen
los péptidos antioxidantes son afecciones hipertensivas, afecciones
inflamatorias, afecciones alérgicas y afecciones autoinmunitarias.
Ejemplos específicos incluyen artritis, diabetes, enfermedades
neurodegenerativas, cáncer y esclerosis múltiple. El uso de
antioxidantes también ha resultado ser recientemente útil en la
prevención del daño tisular tras una lesión traumática (por ejemplo,
en la columna vertebral), tras un accidente cerebrovascular o tras
un ataque al corazón. En general, los pacientes deberían poder
tolerar niveles muy altos de antioxidantes (por ejemplo, entre 50 mg
y 10 g por día) y las dosificaciones exactas pueden determinarse
usando métodos bien establecidos entre los médicos.
Los péptidos de la presente invención también
pueden servir como aditivos en composiciones dietéticas de dos
formas diferentes. En primer lugar, pueden añadirse a una
composición alimenticia con el fin de evitar la oxidación de
aceites o grasas. Bajo estas circunstancias, los péptidos pueden
estar presentes en un intervalo muy amplio de concentraciones. Por
ejemplo, puede constituir desde aproximadamente el 0,0001% hasta
aproximadamente el 10,0% del peso total de la composición
alimenticia. Ejemplos de aceites y grasas que pueden protegerse
usando los péptidos incluyen aceite para freír, aceite vegetal,
aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de palma,
aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de girasol, aceite de
semilla de algodón, grasas naturales, mantecas y grasas sintéticas.
Éstos y compuestos similares pueden estar presentes en un intervalo
muy amplio de productos alimenticios incluyendo carnes, productos
lácteos y alimentos elaborados.
Alternativamente, los péptidos pueden estar
presentes en un complemento diseñado para mejorar la dieta de una
persona. En este caso, el péptido puede constituir un porcentaje
mucho más alto del peso total del producto (por ejemplo, desde el
0,01% - 100%) y puede combinarse con otros complementos tales como
vitaminas y minerales. Los complementos dietéticos que contienen el
péptido pueden diseñarse para su consumo sin receta, en cuyo caso
los complementos estarán normalmente en forma de un comprimido,
cápsula o disolución. Alternativamente, los complementos pueden
diseñarse para la administración en un entorno hospitalario, en cuyo
caso pueden estar presentes como parte de una composición líquida
para administración parenteral. En general, la gente debe poder
tomar de manera segura en cualquier sitio desde 50 mg hasta 10 o más
gramos de un complemento peptídico por día.
Los péptidos usados en el método de la presente
invención se preparan mediante la digestión de aislado de proteína
de soja (disponible comercialmente, por ejemplo, de Protein
Technology International, St. Louis, MO, o usando procedimientos
bien establecidos en la técnica) con una proteasa para producir una
disolución de hidrolizado acuosa. Las proteasas que pueden usarse
para la digestión incluyen quimosina, papaína, neutrasa, Promod, y
Flavozima y, preferiblemente, o bien alcalasa o bien corolasa. La
proteasa puede proceder de fuentes fúngicas, vegetales o
bacterianas. La disolución de hidrolizado acuosa se extrae con un
disolvente orgánico, preferiblemente acetona, y la fase orgánica se
selecciona para tratamiento adicional. Tras la extracción, el
disolvente puede eliminarse a presión reducida para concentrar el
péptido y la preparación se fracciona entonces mediante
cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC) en fase inversa. Las
fracciones recogidas durante este procedimiento pueden someterse a
ensayo para determinar la actividad antioxidante usando métodos
tales como los descritos en la sección de ejemplos en el presente
documento. La identificación de fracciones que contienen el péptido
puede basarse en la presencia de actividad antioxidante y en el
tiempo de retención durante la cromatografía. La identidad del
péptido dentro de las fracciones puede confirmarse mediante el
análisis de secuencias.
Figura 1: la figura 1 es una representación
esquemática que muestra un método para el tratamiento de proteína
de soja, por ejemplo aislado de proteína de soja, para purificar
parcialmente proteínas antioxidantes. La disolución y el
precipitante finales mostrados en la figura se tratan adicionalmente
mediante HPLC en fase inversa.
Figura 2: Espectro de HPLC en fase inversa de
los péptidos antioxidantes aislados a partir de hidrolizado de
proteína de soja. La proteína de soja, por ejemplo aislado de
proteína de soja, se digirió con o bien alcalasa o bien corolasa y
se trató tal como se describe en la sección de ejemplos. La etapa
final en la purificación implica HPLC en fase inversa y un
cromatograma obtenido a partir de esta etapa se muestra en la figura
2. Los diversos picos mostrados en la figura son tal como sigue:
P5: GVAWW (SEQ ID NO:2); P5S: FWWPF (SEC ID NO:6); P6: GVAWWM (SEC
ID NO:3); P6O: GVAWWM*; P7: GVAWWMY (SEC ID NO:4) y P7O:
GVAWWM*Y.
La presente invención se basa en la
identificación de péptidos antioxidantes producidos mediante la
hidrólisis enzimática de proteína de soja. Se encontró que varios
de los péptidos eran fragmentos de subunidades G1, G2 y G3 de
glicinina, la proteína de soja más abundante. El análisis
espectroscópico de los péptidos purificados indicó que sus pesos
eran 431, 617, 748, 764, 911 y 927 Daltons. Experimentos de
secuenciación revelaron secuencias de: GVAW (SEQ ID NO:1); GVAWW
(SEQ ID NO:2); GVAWWM (SEQ ID NO:3); GVAWWM*; GVAWWMY (SEQ ID NO:4)
y GVAWWM*Y. Los péptidos derivados de soja adicionales que se
encontró que tenían actividad antioxidante que se mencionan en el
presente documento sólo a modo de ejemplo y no caen dentro del
alcance de la reivindicación fueron: WWMY(SEQ ID NO:5);
SWWPF (SEQ ID NO: 6) y WTY.
Preferiblemente, los péptidos antioxidantes se
producen a partir de aislado de proteína de soja usando los
procedimientos descritos a continuación en la sección de ejemplos.
Sin embargo, también pueden usarse procedimientos alternativos. Por
ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse químicamente usando
procedimientos en fase líquida o sólida que son rutinarios en la
técnica (véanse por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc.
85:7129(1963); Meienhofer, y cols., J. Pept. Prot.
Res. 13:35(1979); y Fields y cols. Pept. Res. 4
95(1991)). Alternativamente, los péptidos pueden producirse
de manera recombinante construyendo una secuencia de ácido nucleico
que codifica para el péptido, incorporando esto en un vector de
expresión en el que la secuencia codificante se sitúa bajo el
control de un promotor, transformando una célula huésped apropiada
con el vector y entonces incubando la célula huésped transformada
en las condiciones mediante las que se sintetiza el péptido. El
péptido puede purificarse o bien a partir de la célula huésped o
bien a partir del medio en el que se hace crecer la célula.
Los péptidos antioxidantes pueden usarse en
composiciones cosméticas, farmacéuticas o dietéticas. En cada caso,
el péptido pueden estar presente en una cantidad relativamente baja
(por ejemplo el 0,0001% - 10% del peso total de la composición y
preferiblemente desde el 0,001% hasta el 1%) con el fin de eliminar
radicales libres y evitar que otros compuestos experimenten
degradación oxidativa. Alternativamente, el propio péptido puede
ser un principio activo para el tratamiento de una enfermedad o
afección asociadas con oxidación excesiva o puede servir como un
complemento dietético. En estos casos, el péptido puede constituir
desde el 0,01% hasta el 100% de una composición sólida o estar
presente en una composición líquida a entre 0,1 mg/ml y 10
mg/ml.
Como agentes farmacéuticos, los péptidos
antioxidantes son compatibles con cualquier forma farmacéutica o
vía de administración. Específicamente, los péptidos pueden
administrarse por vía intranasal, por vía parenteral o por vía
transdérmica. Las formas farmacéuticas pueden incluir comprimidos,
cápsulas, comprimidos oblongos, pastillas para chupar,
formulaciones parenterales, líquidos, polvos y formulaciones
diseñadas para la implantación o administración en la superficie de
la piel. Se espera que las formas farmacéuticas orales sean las más
convenientes en la mayoría de los casos pero las formulaciones
parenterales también pueden ser útiles en un entorno hospitalario.
Por ejemplo, los péptidos pueden incluirse como parte de un goteo
intravenoso administrado a un paciente tras una lesión traumática,
accidente cerebrovascular o ataque al corazón. Todas las formas
farmacéuticas pueden prepararse usando métodos que son
convencionales en la técnica (véase por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., A. Oslo ed., Easton,
PA(1980)).
Pueden usarse péptidos activos junto con
cualquiera de los vehículos y excipientes comúnmente empleados en
composiciones farmacéuticas, por ejemplo, talco, goma arábiga,
lactosa, almidón, estearato de magnesio, manteca de cacao,
disolventes acuosos o no acuosos, aceites, derivados de parafina,
glicoles, etc. Los agentes colorantes y aromatizantes también
pueden añadirse a preparaciones diseñadas para administración oral.
Las disoluciones pueden prepararse usando agua o disolventes
orgánicos fisiológicamente compatibles tales como etanol,
1,2-propilenglicol, poliglicoles, dimetilsulfóxido,
alcoholes grasos, triglicéridos, ésteres parciales de glicerina y
similares. Las composiciones parenterales que contienen péptidos
pueden prepararse usando técnicas convencionales e incluyen
solución salina isotónica estéril, agua,
1,3-butanodiol, etanol,
1,2-propilenglicol, poliglicoles mezclados con
agua, solución Ringer, etc.
La dosificación diaria administrada a un
paciente puede proporcionarse en un régimen o bien único o bien
múltiple dependiendo de una variedad de circunstancias clínicas.
Las dosificaciones óptimas se determinarán mediante métodos bien
conocidos en la técnica y estarán influenciadas por factores
clínicos tales como la edad y la afección del paciente y la
enfermedad o el trastorno que esté tratándose. En general, se espera
que un intervalo de dosificación adecuado para la administración
intravenosa esté entre 10 y 500 microgramos de péptido por
kilogramo de peso corporal del paciente. Cuando se administran por
vía oral, las dosificaciones normalmente serán significativamente
más altas y estarán, normalmente, en un intervalo de entre 50 mg por
día y 10 gramos por día. Cuando se usa como parte de un complemento
dietético, el péptido se administrará normalmente por vía oral en
forma de un comprimido, cápsula o líquido. Los péptidos pueden
combinarse con otros complementos dietéticos tales como vitaminas
y
minerales.
minerales.
Los péptidos antioxidantes usados en el método
de la presente invención pueden producirse a partir de proteína de
soja, preferiblemente aislado de proteína de soja. La primera etapa
de este procedimiento implica digerir la proteína de soja con una
proteasa en condiciones suficientes para dar como resultado la
generación del péptido. Aunque pueden usarse muchas proteasas
diferentes, se ha encontrado que la alcalasa y corolasa son
particularmente eficaces. Las condiciones exactas para la digestión
pueden variar en un amplio intervalo pero en una realización
preferida, la digestión se lleva a cabo a 50ºC durante un período de
aproximadamente tres horas. Tras la inactivación de la enzima, la
mezcla de digestión se extrae con disolvente orgánico. Por ejemplo,
la extracción puede tener lugar usando aproximadamente un volumen
igual de acetona. El sobrenadante de la extracción, es decir, la
fase orgánica se recupera y el disolvente se elimina a presión
reducida.
Tras recuperar el péptido de la extracción,
puede llevarse a cabo la cromatografía de líquidos a alta presión
en fase inversa usando, por ejemplo, una columna C18. Pueden usarse
una variedad de sistemas de disolvente para eluir la columna pero
se ha encontrado que un gradiente desde el 5-60% de
acetonitrilo en tampón fosfato a pH 6,8 es eficaz. Pueden someterse
a prueba las fracciones recogidas de la columna para determinar la
actividad antioxidante para identificar picos que son de interés.
Finalmente, los péptidos específicos pueden identificarse llevando
a cabo experimentos de secuenciación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron tres frascos de vidrio de fondo
plano que contenían 100 ml de aislado de proteína de soja PTI XT 34
al 5% en un baño de agua a 50ºC con 0,4 ml de alcalasa. Se detuvo la
incubación a 1 hora, 2 horas y 4 horas poniendo el frasco en un
baño de agua a 80-85ºC durante diez minutos. Se
obtuvieron preparaciones control inactivando en primer lugar la
enzima alcalasa a 80-85ºC durante al menos 10
minutos y entonces añadiendo la preparación de enzima inactivada a
100 ml de una disolución de SPI al 5%. Tras la centrifugación en una
microcentrífuga Eppendorf, se diluyeron los sobrenadantes 5 veces.
Se midieron los grupos amino libres como equivalentes de leucina
como una estimación del péptido liberado durante la hidrólisis y se
diluyeron las composiciones 10 veces y se usaron para llevar a cabo
ensayos de radical ABTS (descritos más ampliamente a continuación).
Los resultados indicaron que la actividad antioxidante aumentó a
medida que avanzaba la hidrólisis y se liberaban los péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una suspensión de proteína de soja
sólida total al 14% mezclando 700 g de aislado de proteína de soja
(SuproXT34) con 4300 g de agua caliente (aproximadamente 60ºC). Se
prepararon alícuotas con 750 g de la suspensión resultante y se
incubaron con enzima en las condiciones mostradas en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
- \sqbullet
- N-22: Proteasa NS 37022 (Novo Nordisk);
- \sqbullet
- Alcalasa (Novo Nordisk);
- \sqbullet
- 446: Glutamil-endopeptidasa (SP 446) (Novo Nordisk);
- \sqbullet
- Corolasa PN-L (Creanova Inc);
- \sqbullet
- Papaína 6000 (Valley Research Inc, Hammond IN);
- \sqbullet
- Promod 24L (Biocatalysts Ltd., Mid Glamorgan, RU);
- \sqbullet
- Flavozima (Novo Nordisk);
- \sqbullet
- Neutrasa: Proteasa bacteriana neutra (Medipharm AB, Kagerod Suecia).
Se añadió un volumen de acetona para precipitar
polipéptidos grandes y/o proteínas intactas no hidrolizadas. Se
separó el residuo mediante centrifugación y se lavó con
aproximadamente un volumen de acetona al 50%. Entonces se eliminó
el disolvente orgánico usando un evaporador rotatorio a
40-60ºC. La muestra en esta etapa se denominó como
SP1-10. Entonces se añadió la mitad del peso de
SP1-10 de sulfato de amonio a los péptidos
hidrófobos y se centrifugó la mezcla. La fase I, que contenía
acetona era la fase "aceitosa" superior, y la fase II era la
fase acuosa inferior. Se extrajo adicionalmente la acuosa fase con
acetona y se combinó con la fase I. Se concentró el extracto y se
denominó como SE1-10. Entonces se determinó la
concentración de los péptidos del hidrolizado de proteínas por
parejas (SP con SE).
Se determinó la concentración de los péptidos en
muestras mediante el método del ácido trinitrobencenosulfónico
(TNBS) usando leucina como patrón (Adler-Nissen, J.
Agric. Food Chem. 27: 1256 (1979)). Se combinaron volúmenes iguales
de muestra en tampón fosfato aproximadamente 0,2 M, pH 8,2 y una
disolución de TNB al 0,1% y se incubaron a 50ºC durante una hora.
Se añadió un volumen de HCl 0,1 N igual al volumen total de la
muestra combinada y disolución de TNB para detener la reacción.
Entonces se enfrió la muestra hasta temperatura ambiente. Se
realizó una lectura de la absorbancia a 415 nm tras 30 minutos.
La tabla 2 muestra la concentración de los
péptidos en las muestras preparadas usando diferentes proteasas.
Los niveles de péptido cambian debido a diferencias en
especificidades de enzima, actividades, perfiles de producto y
condiciones de reacción. A continuación se muestran los resultados
para SP y SE porque estas muestras eran particularmente ricas en
actividad antioxidante de péptido. También se resume en la tabla 2
la actividad antioxidante de las muestras evaluadas mediante un
ensayo de radical ABTS.
\global\parskip0.950000\baselineskip
El procedimiento para hidrolizar proteína de
soja y extraer el péptido se muestra esquemáticamente en la figura
1. El procedimiento se realiza tal como sigue:
1. Se mezclan 18 g de aislado de proteína de
soja con 162 ml de agua para obtener una mezcla al 10%.
2. Se añade 1 ml de enzima y se incuba la
preparación en un baño de agua a 50ºC durante tres horas.
3. Se inactiva la enzima a
80-85ºC durante diez minutos.
4. Tras enfriar hasta temperatura ambiente, se
mezclan 160 ml de la mezcla tratada con 106 ml de acetona.
5. Se centrifuga la preparación a
15.000-22.000 g durante treinta minutos para obtener
el sobrenadante.
6. Se mezcla el sedimento de la etapa de
centrifugación con 200 ml de acetona al 50%.
7. Se repite la centrifugación y se combinan los
sobrenadantes. Si aparece un precipitado, se centrifuga la
preparación además se recupera el sobrenadante.
8. Se elimina la acetona a presión reducida bajo
un evaporador rotatorio.
9. Si aparece un precipitado, se centrifuga la
preparación.
10. Se disuelve la mitad de la cantidad en peso
de sulfato de amonio en el sobrenadante.
11. Se extrae la disolución con
1/3-1/2 volúmenes de acetona de dos a tres
veces.
12. Se concentra la fase orgánica y entonces se
almacena la muestra en un refrigerador antes del análisis. Si se
forma un precipitado durante el almacenado, tanto el sobrenadante
como el precipitante se usan para el aislamiento del péptido
antioxidante.
1. Aislado de proteína de soja
(ADM-891 tratado con alcalasa)
2. Aislado de proteína de soja
(ADM-891 tratado con
corolasa-PNL)
Con el fin de preparar muestras para HPLC, se
seca el sobrenadante mediante flujo de nitrógeno y se mezcla el
residuo con la fase móvil A (acetonitrilo (ACN) al 5% en tampón
fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8) y se centrifuga para eliminar el
material no disuelto antes del análisis y aislamiento. Se inyecta la
muestra preparada en un sistema de HPLC.
Se lleva a cabo la HPLC en fase inversa usando
una columna Lachrom Purospher RP-18, una bomba
Hitachi L-7100, un inyector automático
L-7200, un detector de red de diodos
L-7455 y un software de administración de sistemas
para HPLC D-7000 (Hitachi, Instruments, Inc. San
José, CA). Se usan dos fases móviles (eluyentes) en la separación
HPLC:
A: 5% de ACN en tampón fosfato de sodio 10 mM,
pH 6,8;
B: 60% de ACN, 40% de tampón fosfato de sodio 10
mM, pH 6,8.
Se fija la velocidad de flujo de columnas a 0,6
ml/min. y se fija la absorbancia ultravioleta a 275 nm. Se fija el
programa de elución en gradiente tal como sigue:
0-2 min., el 90% de fase móvil
A/el 10% de fase móvil B;
2-40 min., desde el 90% de fase
móvil A/el 10% de fase móvil B hasta el 100% de fase móvil B.
Se recogen las fracciones con actividad
antioxidante y se someten a purificación adicional. Esto se lleva a
cabo usando las fases móviles:
A: ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, ACN al
5%
B: TFA al 0,05%, ACN al 80%.
Se fija la velocidad de flujo a 0,6 ml/min.,
0,45 ml/min. o 0,4 ml/min. y se fija la absorbancia ultravioleta a
275 nm. Se fija el programa de elución en gradiente tal como
sigue:
0-2 min., el 90% de fase móvil
A/el 10% de fase móvil B;
2-25 min. desde el 90% de fase
móvil A/el 10% de fase móvil B hasta el 60% de fase móvil A/el 40%
de fase móvil B;
25-40 min., desde el 60% de fase
móvil A/el 40% de fase móvil B hasta el 10% de fase móvil A/el 90%
de fase móvil B.
Se recogen las fracciones con actividad
antioxidante y se someten a purificación adicional. En este caso,
se usan las mismas fases móviles. Se fija la velocidad de flujo a
0,4 ml/min. y se fija la absorbancia ultravioleta a 275 nm. Se fija
el programa de elución en gradiente tal como sigue:
0,2 min. el 70% de fase móvil A/el 30% de fase
móvil B;
2-40 min., desde el 70% de fase
móvil A/el 30% de fase móvil B hasta el 100% de fase móvil B.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelve el precipitante de la muestra
anterior o la muestra seca por soplado con nitrógeno en una
disolución de acetonitrilo al 80%, ácido trifluoroacético al 0,05%.
Se usa el mismo sistema de HPLC básico. Las fases móviles son:
A: TFA al 0,1%, ACN al 5%
B: TFA al 0,05%, ACN al 80%
Se fija la velocidad de flujo a 0,6 ml/min. y se
fija la absorbancia ultravioleta a 275 nm. Se fija el programa de
elución en gradiente tal como sigue:
0-2 min., el 90% de fase móvil
A/el 10% de fase móvil B
2-25 min. desde el 90% de fase
móvil A/el 10% de fase móvil B hasta el 60% de fase móvil A/el 40%
de fase móvil B.
25-40 min. desde el 60% de fase
móvil A/el 40% de fase móvil B hasta el 10% de fase móvil A/el 90%
de fase móvil B.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se muestra un cromatograma típico como figura
2.
Se determinaron mediante HPLC-EM
las secuencias de péptidos aislados mediante HPLC. Se seleccionaron
composiciones de fase móvil en gradiente que contenían TFA al 0,05%
en agua y TFA al 0,05% en acetonitrilo para la separación de
péptidos usando una HPLC Waters Alliance 2690 (Waters Corporation
Milford, MA). Se separaron los péptidos usando una columna Symmetry
C-18 de 2,1 x 150 mm, tamaño de partícula 3,5 \mum
de fase inversa (Waters Corporation Milford, MA) mantenida a 40ºC.
La velocidad de flujo era de 200 \mul/min. lo que se dividió a
80:120 entre el detector de absorbancia de longitud de onda UV dual
Waters 2487 y el espectrómetro de masas Finnegan MAT TSQ 700
(ThermoQuest, San José, CA). Se fijó el detector de absorbancia de
longitud de onda UV dual Waters 2487 para obtener datos UV a 214 y
280 nm. Se llevaron a cabo análisis de masa de péptido en el TSQ700
utilizando la interfaz de fuente de iones Finnigan API 1 en el modo
de ionización por electrospray positivo con un capilar calentado a
una temperatura de 260ºC. Se usó un método HPLC/EMEM automatizado en
dependencia del tiempo de retención para obtener el espectro de
masas tándem producto-ion usando un programa
informático añadido a la línea de control instrumental (ICL) de
TSQ700. Se obtuvieron todos los espectros de masas tándem con la
célula de colisión llena de argón a una presión de entre 2 y 3,5
mTorr y energías de colisión entre -10 y -44 eV. Se analizaron de
nuevo los datos de espectroscopia de masas tándem usando el programa
informático SEQUEST (autorizado por Therma Quest y operado en una
estación de trabajo Xcalibur Windows NT 4.0) para identificar
secuencias de péptidos en una base de datos de soja descargada bajo
"glicina" para Glycine max del Centro Nacional para la
Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology
Information). Se muestran las secuencias en la tabla 3.
Aquellas secuencias no usadas en el método de la presente invención
se incluyen sólo para fines a modo de ejemplo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica de la química del
amino, química alimenticia, química de las proteínas y/o de la
inmunología conocen bien los métodos para sintetizar péptidos. Por
ejemplo, se sintetizan los péptidos usando química Fmoc en fase
sólida según los principios inicialmente descritos por Merrifield
(J. Am. Chem. Soc. 85; 7129 (1963)) tal como se modificaron
posteriormente por Meienhofer y cols. (J. Peptide Prot. Res.
13; 35 (1979)) y Fields, y cols., Peptide Res. 4; 95 (1991)).
Normalmente, se lleva a cabo tal síntesis en sintetizadores de
péptidos automatizados, tales como los disponibles de Applied
Biosystems (Foster City, CA). Una vez sintetizadas, normalmente se
verifican las secuencias usando un secuenciador de péptidos
automatizado tal como un Porton modelo 2090 (Beckman Instruments
Inc., Mountain View, CA).
Este ensayo mide el poder de reducción total de
péptidos con respecto a un radical ABTS formado previamente según
los métodos de Pellegrini, y cols. (Meth. Enzymol. 299:379
1999)). En el ensayo, se combinan 0,175 ml de tampón fosfato 20 mM
(PB, pH 6,8) y 1,0 ml de disolución de radical ABTS (0,837 en A734
nm) en un tubo Ep. Se añaden 0,025 ml de muestra a la disolución.
Se agita la mezcla y se mide la absorbancia a 734 nm tras diez
minutos. Se usa el disolvente de la muestra como blanco si es
apropiado. Se prepara la disolución de trabajo de radical ABTS
añadiendo un volumen de una disolución madre de radical ABTS a 80
volúmenes de PB 20 mM (pH 6,8) y añadiendo, si es necesario,
disolución madre de PB o ABTS para ajustar la absorbancia hasta
aproximadamente de 0,83 a 734 nm. La disolución madre de radical
ABTS contiene K_{2}S_{2}O_{8} 2,5 mM y ABTS 6,9 mM.
Pueden llevarse a cabo análisis para determinar
la actividad antioxidante de los péptidos midiendo la extinción de
radicales alquilperoxilo. Se usó un ensayo de peróxido de
t-butoxilo/beta-caroteno basándose
en varios ensayos publicados (Akaike, y cols., J. Agric.
Food Chem. 43:1864 (1995); Nakao y cols., Phytochem.49:2379
(1998); Burton y cols., Science 224:569 (1984)). Este ensayo
implica dos reacciones consecutivas:
(i) t-BuOOH + MetMb ?
\equivt-BuOO^{\cdot}
(ii) t-BuOO^{\cdot} +
beta-caroteno ? blanqueo
La reacción del radical peroxilo con
beta-caroteno da como resultado la desaparición del
color amarillo asociado con el beta-caroteno (es
decir, blanqueo). La absorbancia medida a 452 nm indica que los
antioxidantes compiten eficazmente por el radical peroxilo e
impiden el blanqueo. Los resultados de esta prueba indican la
capacidad relativa de extinción del radical alquilperoxilo de los
péptidos en comparación con el beta-caroteno.
Se lleva a cabo el ensayo combinando 725 ml de
tampón fosfato 20 mM (PB, pH 7,4) con 120 \mul de Tween 20 (2,4%)
y 120 \mul de MetMb (MetMb 50 \muM preparado mezclando 1:1 v/v
de mioglobina 100 \muM (Sigma, St. Louis, MO) y ferricianuro de
potasio 100 \muM (Aldrich, Milwaukee, WI) en PB). Se incuba la
mezcla a 37ºC. Se añade beta-caroteno (disolución
saturada en acetona a 37ºC) y se mezcla la disolución. Entonces, se
añaden 25 \mul de péptidos o patrón de Trolox (de 0,5 a 10 mM) y
150 \mul de t-BuOOH 50 mM en PB. Se mezcla la
muestra y se lee la absorbancia a 452 nM a 30 s. y entonces a
intervalos de un minuto durante aproximadamente 10 ó 12 minutos. Se
usa acetonitrilo al 50% como blanco si es apropiado.
El ácido graso insaturado es propenso a la
oxidación. Esto puede deberse a la oxidación directa mediante
oxígeno molecular o facilitarse mediante iones de metales de
transición u otros radicales. Los productos oxidados iniciales son
peróxidos. Se desarrolló este ensayo para evaluar la actividad de
los antioxidantes, incluyendo péptidos, en la prevención de la
oxidación de ácido linoleico. Se mide la concentración de peróxidos
generados según los métodos de Jiang, y cols. (Analyt.
Biochem. 202:384 (1992)) y Lowum, y cols. (J Food Biochem.
13:391 (1989)). Se preparan curvas patrón usando peróxido de
hidrógeno a una serie de concentraciones conocidas. Se lleva a cabo
el ensayo tal como sigue:
- 1.
- Emulsión: preparar dos 120 \mul de Tween 20, 1 ml de ácido linoleico de PB (20 mM, pH 7,4) o tampón ácido cítrico-fosfato (Na_{2}HPO_{4} 0,2125 M mezclado con ácido cítrico 0,1 a pH 4,1 y diluido de 30 ml a 200 ml) hasta un total de 32 ml en tubos de centrifugado tapados de 50 ml; agitar con vórtex aproximadamente cinco minutos hasta formar una emulsión blanca, similar a leche y mezclar las dos para tener la misma emulsión por triplicado de seis o siete muestras.
- 2.
- Muestra: 1,6 ml de dH_{2}O y 0,4 ml de ACN al 50% como control o muestra 2,5 mM o 5 mM en ACN al 50% en tubos de centrifugado tapados de 12 ml.
- 3.
- Tomar 8 ml de emulsión y mezclar con los 2 ml de control o muestra en el tubo de centrifugado tapado de 12 ml; agitar con vórtex dos minutos; tomar 3 ml en un vial de centelleo abierto de 20 ml con un agitador; preparar triplicados de cada muestra. Se usa el resto (aproximadamente 1 ml) para el momento cero de cada muestra y se mezcla con reactivo FOX como la etapa 5.
- 4.
- Incubar y agitar a 37ºC al aire libre.
- 5.
- En momentos determinados (normalmente intervalos de 30 minutos), preparar alícuotas con 50 \mul de la emulsión de reacción y mezclar con 950 \mul de reactivo FOX en un tubo Ep y agitar con vórtex.
- 6.
- Dejar reposar durante más de 30 minutos (40 minutos-1 hora), realizar una lectura a A560 nm (dH_{2}O como blanco).
Se prepara el reactivo FOX combinando 900 ml de
MeOH, 100 ml de H_{2}SO_{4} 250 mM, 880 mg de BHT, 76 mg de
naranja de xilenol y 98 mg de sulfato de amonio hexahidratado. Se
prepara una curva patrón diluyendo peróxido de hidrógeno hasta
obtener concentraciones de 25, 50, 100, 250, 500, 600, 800 y 1000
\muM con tampón apropiado y se mezclan 50 \mul de disolución
con 950 \mul reactivo FOX. Se toman las lecturas a 1 hora a A560
nm. La concentración de Trolox final en la reacción es 0,1 mM. La
concentración final de las muestras (genisteína o péptidos) es 0,2
mM.
Se lleva a cabo este análisis para evaluar la
capacidad de los péptidos para extinguir el ion superóxido. Se
lleva a cabo el ensayo de ion superóxido según los métodos de Yen,
y cols. (J. Agric. Food Chem. 43:27 (1995) y Nishikimi, y
cols. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 46:849 (1972)). Para este
ensayo, se combinan 830 \mul de PB (0,1 M, pH 7,4), 120 \mul de
metosulfato de fenacina (PMS) 0,15 mM en tampón fosfato 0,1 M, pH
7,4, 120 \mul de azul de nitro-tetrazolio (NBT)
0,375 mM en tampón fosfato y 50 \mul de muestra o disolvente de
la muestra en un tubo Ep. A esta disolución se le añaden 100 \mul
de disolución NADH 2,34 mM para hacer empezar la reacción. Se agita
la disolución y se realiza una lectura de la absorbancia a 560 nm
tras cinco minutos. Se usa el disolvente de la muestra como
control.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Kraft Foods Holdings, Inc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Antioxidantes peptídicos a partir de
proteína de soja
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P504815EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> todavía no conocido
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 04/05/2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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Claims (1)
1. Método de reducción de la degradación
oxidativa de grasas o aceites en una composición, que comprende
añadir a dicha composición una cantidad eficaz de una proteína
aislada que consiste en cualquiera de las siguientes
secuencias:
GVAW;
GVAWW;
GVAWWM;
GVAWWMY;
GVAWWM*; y
GVAWWM*Y, en las que M* es sulfóxido de
metionina.
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Family Applications (1)
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