ES2309996T3

ES2309996T3 - Nueva proteina de fusion, gen que la codifica, vector recombinante, virus recombinante, y su uso.

Info

Publication number: ES2309996T3
Application number: ES97914561T
Authority: ES
Inventors: Shuji Nippon Zeon Co. Ltd. SAITO; Yoshinari Nippon Zeon Co. Ltd. TSUZAKI; Noboru Nippon Zeon Co. Ltd. Yanagida
Original assignee: Zeon Corp
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-28
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2017-03-28
Also published as: EP0905140B9; US7348422B2; AU2176997A; JP3357071B2; EP0905140B1; WO1997036924A1; EP0905140A1; EP0905140A4; US20010014335A1; DE69738977D1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA PREPARACION DE UN ADN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA DE FUSION QUE COMPRENDE UN POLIPEPTIDO CON LA ANTIGENICIDAD DE MYCOPLASMA GALLISEPTICUM, Y A UN POLIPEPTIDO DERIVADO DE LA PROTEINA DE LA MEMBRANA EXTERNA DE HERPESVIRUS, EN DONDE EL POLIPEPTIDO DERIVADO DE DICHA PROTEINA DE LA MEMBRANA EXTERNA SE HA UNIDO AL POLIPEPTIDO QUE TIENE LA ANTIGENICIDAD DE MYCOPLASMA GALLISEPTICUM, EN EL EXTREMO N - TERMINAL DEL MISMO. DICHO ADN SE INSERTA EN UNA REGION NO ESENCIAL PARA EL CRECIMIENTO DEL VIRUS AVIPOX, Y SE PROPORCIONA UN VIRUS AVIPOX RECOMBINANTE RESULTANTE QUE ES UN VIRUS RECOMBINANTE MAS POTENTE COMO VACUNA ANTI-MYCOPLASMA.

Description

Nueva proteína de fusión, gen que la codifica, vector recombinante, virus recombinante, y su uso.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un polipéptido de fusión nuevo de un polipéptido que tiene la antigenicidad de Mycoplasma gallisepticum y de un polipéptido derivado de la proteína de la membrana externa de virus herpes, a un ADN híbrido que codifica el polipéptido de fusión y a un virus de la viruela aviar recombinante que alberga el ADN híbrido, así como a una vacuna que usa el virus de la viruela aviar recombinante.

Técnica antecedente

Mycoplasma gallisepticum (en adelante abreviado a veces como MG) es una bacteria que provoca una reducción del ritmo de puesta de huevos y del ritmo de eclosión de los huevos de las aves de corral, lo que incluye a los pollos. Esta MG patógena está muy extendida por todo el mundo, de forma que se ha causado un gran perjuicio a la cría de aves de corral. Para la prevención de MG actualmente se utiliza una vacuna inactivada o una vacuna atenuada. Sin embargo, esta vacuna atenuada supone las desventajas de procedimientos de inoculación complicados, corta duración de la inmunidad, costes elevados, etc. La vacuna inactivada tiene el defecto de que se podría desarrollar una enfermedad inesperada por el uso en combinación con una vacuna atenuada para otra enfermedad. Otra desventaja es que el sistema de reacción de aglutinación de MG, que hace posible la detección rápida de la infección por MG, no se puede usar para las vacunas inactivadas y atenuadas.

Se espera que una proteína derivada de MG, tal como su proteína antigénica para prevenir la infección por MG, se produzca mediante técnicas de ingeniería genética y se utilice como una vacuna.

El sistema de producción de la proteína antigénica de Mycoplasma gallisepticum mediante el uso de E. coli o levaduras por medio de ingeniería genética (documento JPA 2-111795, etc.) tiene tales problemas que, dependiendo de la proteína a expresar, la proteína antigénica se expresa solamente en una cantidad menor, se podrían generar proteínas del hospedador como subproductos y entremezclarse, el pirógeno derivado del hospedador se elimina con dificultades, etc. Por estas razones, los estudios se centran todavía en un virus recombinante para preparar proteínas antigénicas o en una vacuna atenuada recombinante.

Para la expresión de genes exógenos mediante el uso de virus recombinantes, en la mayoría de los casos se expresan genes de eucariotas o genes virales. Por esta razón, el modo de adición o de expresión de las cadenas de carbohidratos o similares es parecido al mecanismo de expresión de proteínas en las células infectadas. Así, la inducción de un título de anticuerpos hacia la proteína expresada fue relativamente fácil in vivo. Sin embargo, los genes de los procariotas casi nunca se expresan en virus recombinantes. Debido al modo de expresión diferente entre eucariotas y procariotas, fue difícil decir si se indujo de manera eficaz un anticuerpo específico (Austen et al., Protein Targeting and Selection, Oxford Univ. Press (1991)).

En cuanto a MG, los virus recombinantes en los que se ha incorporado un gen que codifica la proteína se conocen por los documentos JPA 5-824646 y JPA 7-133295, WO 94/23019, etc. En particular, el documento WO 94/23019 revela que cuando un virus recombinante capaz de expresar la proteína antigénica de MG que tiene una región de anclaje a la membrana viral, que se obtiene ligando la porción de señal de anclaje a la membrana del gen HN del virus de la enfermedad de New Castle (en adelante abreviado como NDV) con el gen antigénico de MG, se inocula como una vacuna atenuada recombinante, el anticuerpo se induce más eficazmente que con un virus recombinante capaz de expresar el gen antigénico de MG sólo.

Sin embargo, la expresión hasta tal grado no es siempre suficiente para conseguir el efecto deseado como vacuna.

Por lo tanto, es una necesidad urgente hallar un método mejorado para un reconocimiento superior del antígeno para desarrollar una vacuna eficaz contra las infecciones por MG.

Se conocen también proteínas de la membrana externa distintas de las mencionadas anteriormente de NDV en el género Herpesvirus, etc. Con respecto a las glicoproteínas B(gB), C(gC), D(gD), H(gH) e I(gI) de los virus herpes simple; las proteínas gBh, gCh, gDh, gHh y gIh de los virus de la enfermedad de Marek (en adelante denominados a menudo como MDV) que corresponden a las glicoproteínas de virus herpes simple gB, gC, gD, gH y gI y a las proteínas del género Herpesvirus homólogas a las proteínas descritas anteriormente, etc., se conoce la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de estas proteínas. También se sabe que una parte de estas proteínas induce anticuerpos neutralizantes de virus herpes simple (Deluca et al., Virology, 122, 411-423 (1982)). Se sabe además que los anticuerpos neutralizantes se pueden inducir incorporando genes que codifican estas proteínas en virus vaccinia y expresando los genes (Blacklaws et al., Virology, 177, 727-736 (1990)).

Sin embargo, hasta ahora apenas se han hecho investigaciones para hacer uso de las secuencias señal de tales proteínas de la membrana externa del género Herpesvirus.

Descripción de la invención

En la situación del estado de la técnica indicada anteriormente, los presentes inventores han llevado a cabo estudios exhaustivos para proporcionar un virus recombinante capaz de expresar una proteína antigénica de Mycoplasma que tiene una actividad incrementada de prevención de la infección en grandes cantidades, lo que permite que un hospedador reconozca el antígeno de una manera sumamente eficaz. Como resultado, se ha descubierto que infectando un hospedador con un virus de la viruela aviar recombinante, en el que se ha insertado un ADN híbrido obtenido ligando un ADN de la proteína de la membrana externa del género Herpesvirus con un ADN de la proteína antigénica de Mycoplasma, se puede mejorar notablemente la capacidad de reconocimiento del antígeno del hospedador. Se ha llevado a cabo así la presente invención.

Por lo tanto, como se define adicionalmente en las reivindicaciones, la presente invención proporciona:

una proteína de fusión que comprende un polipéptido que tiene la antigenicidad de Mycoplasma gallisepticum (en adelante denominado a veces polipéptido derivado de Mycoplasma) y un polipéptido derivado de la proteína de la membrana externa de un virus herpes (en adelante denominado a veces polipéptido derivado de Herpesvirus), caracterizada porque el polipéptido derivado de la proteína de la membrana externa comprende la secuencia señal, pero no la secuencia de anclaje a la membrana, de la proteína de la membrana externa de Herpesvirus, y está ligado con el polipéptido que tiene la antigenicidad de Mycoplasma gallisepticum en su extremo N-terminal;

un ADN híbrido que codifica la proteína de fusión;

un virus de la viruela aviar en el que se ha incorporado el ADN híbrido; y

una vacuna atenuada que comprende el virus de la viruela aviar recombinante como ingrediente eficaz.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un dibujo para explicar el procedimiento de construcción de pNZ40K-S.

La Fig. 2 es un dibujo para explicar el procedimiento de construcción de pNZ40K-S.

La Fig. 3 es un dibujo para explicar el procedimiento de construcción de pNZ40K-S.

La Fig. 4 es un dibujo para explicar el procedimiento de construcción de pNZ40K-C.

La Fig. 5 es un dibujo para explicar el procedimiento de construcción de pNZ40K-C.

La Fig. 6 es un dibujo para explicar el procedimiento de construcción de pNZ40K-C.

La Fig. 7 muestra los resultados de la transferencia de Western mediante la cual se confirmó la expresión del polipéptido TTM-1.

La Fig. 8 muestra las puntuaciones de la lesión traqueal causada.

Mejor modo de llevar a cabo la invención Polipéptidos derivados de Mycoplasma y sus genes

En la presente invención, la expresión polipéptidos derivados de Mycoplasma significa las proteínas antigénicas que provocan una reacción antígeno-anticuerpo con suero inmune a MG o con suero infectado por MG y que derivan de MG. Estos polipéptidos no se limitan a las proteínas per se que expresa Mycoplasma gallisepticum nativo, y pueden incluir los polipéptidos modificados. Por ejemplo, se puede modificar uno o más aminoácidos de los polipéptidos de forma natural o artificial de una manera convencional, tal como mutación específica de sitio, etc. (documento JPB 6-16709, etc.) por medio de pérdida, adición, inserción, deleción, sustitución etc. Por supuesto, las proteínas, incluso después de tal modificación, deberían contener el epítopo que muestra la antigenicidad. Para la determinación de la región del epítopo, hay disponibles métodos conocidos basados en la técnica de barrido de péptidos tales como el método de Geysen et al. (J. Immunol. Meth., 102, 259-274 (1987)), el método de Hopp et al., (Proc. Natl. Acad. USA, 78, 3824-3828 (1981)), el método de Chou et al. (Advances in Enzymology, 47, 145-148 (1987)),
etc.

Los ejemplos específicos de los péptidos que tienen antigenicidad incluyen las proteínas antigénicas descritas en el documento JPA 2-111795 (Solicitudes de Patente de EE.UU. de n^{os} de serie 359.779, 07/888.320 y 08/299.662), el documento JPA 5-824646 (Patente de EE.UU. nº 5.489.430), el documento WO 94/23019 (Solicitud de Patente de EE.UU. de nº de serie 08/525.742, documento JPA 6-521927) y las proteínas de Mycoplasma gallisepticum que contienen las secuencias de aminoácidos de esas proteínas. Por supuesto, mientras el epítopo esté contenido en ellas, puede ser utilizable también una parte de los péptidos descritos anteriormente.

De estos péptidos, se prefieren los polipéptidos de alrededor de 40 kilodaltons (kd) descritos en el documento JPA 5-824646, el polipéptido de alrededor de 66 kd codificado por el gen TM-66 y el polipéptido de alrededor de 67 kd codificado por el gen TM-67 descrito en el documento JPA 5-521927, que se designan ahí como SEQ NO: 16 y SEQ NO: 27.

En la presente invención, los genes de los polipéptidos derivados de Mycoplasma albergan secuencias de ADN que codifican el polipéptido que tiene la antigenicidad de Mycoplasma gallisepticum descrita anteriormente. Tal ADN se puede obtener mediante síntesis, o se puede conseguir de bacterias nativas que pertenecen a Mycoplasma gallisepticum. Los ejemplos específicos de tales bacterias son las cepas R, S6, KP-13, PG31, etc. El ADN se puede obtener también de MG aislado de cepas nativas. Estos genes se pueden modificar también mediante pérdida, adición, inserción, deleción, sustitución, etc. de una manera convencional como se describe en Methods in Enzymology, etc.

Polipéptidos derivados de Herpesvirus y sus genes

Los polipéptidos derivados de Herpesvirus en la presente invención se refieren a polipéptidos derivados de proteínas que construyen una envoltura de virus que pertenecen al género Herpesvirus. Los polipéptidos derivados de Herpesvirus comprenden la secuencia señal, pero no la secuencia de anclaje a la membrana. Pueden no tener siempre la longitud completa de las proteínas. Cuando los polipéptidos se emplean para la secreción, los polipéptidos pueden contener solamente una secuencia señal para ese fin. Las proteínas de la membrana externa pueden ser del tipo I o del tipo II de las proteínas de la membrana externa. La secuencia señal y la secuencia de anclaje a la membrana son ambas fácilmente detectables analizando la secuencia de aminoácidos de la región peptídica hidrofóbica en su extremo carboxiterminal o en su extremo aminoterminal.

Los ejemplos específicos de proteína de la membrana externa incluyen gB, gC, gD, gH y gI que son glicoproteínas de virus herpes simple, y gBh, gCh, gDh, gHh y gIh de MDV que corresponden a las glicoproteínas de virus herpes simple gB, gC, gD, gH y gI, y las proteínas del género Herpesvirus homólogas a las proteínas descritas anteriormente.

Por supuesto, también se pueden ligar polipéptidos que albergan el epítopo distintos de la secuencia señal de las proteínas de la membrana externa con los polipéptidos anteriormente mencionados que tienen la antigenicidad. Mediante la ligadura se espera que el epítopo proporcione la inmunidad al organismo vivo in vivo.

En la presente invención, los genes de los polipéptidos derivados de Mycoplasma contienen secuencias de ADN que codifican los polipéptidos derivados de Herpesvirus descritos anteriormente, y tales ADNs se pueden sintetizar u obtener de virus herpes naturales. Estos genes se pueden modificar también mediante pérdida, adición, inserción, deleción, sustitución etc. de una manera convencional como se describe en Methods in Enzymology, etc.

Proteína de fusión y ADN híbrido

Las proteínas de fusión de la presente invención se obtienen incubando un ADN híbrido insertado en un virus de la viruela aviar recombinante, el cual se describirá más adelante, en células cultivadas tales como células de fibroblastos de embriones de pollo (en adelante denominadas células CEF) o células embrionarias de la membrana corioalantoidea, etc.

Las proteínas de fusión así obtenidas se pueden emplear como componente de una vacuna.

El ADN híbrido de la presente invención comprende el gen del polipéptido derivado de Mycoplasma y el gen del polipéptido derivado de Herpesvirus, que se ligan entre sí directamente o por medio de una secuencia de ADN opcional.

El ADN híbrido de la presente invención se puede producir de una manera convencional, por ejemplo, mediante un método en el cual la proteína de la membrana externa y la proteína antigénica de Mycoplasma gallisepticum se digieren con enzimas de restricción, respectivamente, y el fragmento de ADN ligable resultante que codifica la proteína de la membrana externa de virus herpes o la secuencia señal de la proteína de la membrana externa se liga con el fragmento de ADN ligable resultante que codifica la proteína antigénica de Mycoplasma gallisepticum, mediante el uso de una ligasa directamente o por medio de un espaciador apropiado.

Los ejemplos específicos de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión de la presente invención incluyen las SEQ NO: 2 y SEQ NO: 4. La secuencia de la proteína antigénica de 40 kilodaltons derivada de Mycoplasma gallisepticum se halla en los aminoácidos 64-456 de SEQ NO: 2 y en los aminoácidos 693-1086 de SEQ NO: 4. La secuencia señal de la proteína de la membrana externa gB derivada de MDV se halla en los aminoácidos 1-63 de SEQ NO: 2. En SEQ NO: 4, los aminoácidos 1-672 corresponden a casi toda la longitud de la proteína de la membrana externa gB derivada de MDV. Los ejemplos específicos de secuencias de nucleótidos de los ADNs híbridos que codifican estas proteínas de fusión son los mostrados en SEQ NO: 1 y en SEQ NO: 3.

Estas proteínas de fusión y los ADNs híbridos se proporcionan a modo de ejemplo, pero no se considera que sean limitantes.

Virus de la viruela aviar recombinante

El virus de la viruela aviar recombinante de la presente invención es un virus de la viruela aviar recombinante en el que el ADN o el ADN híbrido anteriormente mencionado se ha insertado en la región no esencial. El virus de la viruela aviar recombinante de la presente invención se puede construir de una manera convencional, p.ej., mediante el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa abierta a la inspección pública nº 1-168279. Es decir, la región no esencial del virus de la viruela aviar se incorpora en un fragmento de ADN para construir un primer vector recombinante.

Como región no esencial del virus de la viruela aviar que se usa en la presente invención, se describe una región del gen TK del virus de la viruela de la codorniz, una región TK del virus de la viruela del pavo y fragmentos de ADN en el documento JPA 1-168279, preferiblemente una región que provoca recombinación homóloga con el fragmento EcoRI de alrededor de 7,3 Kb, el fragmento HindIII de alrededor de 5,2 Kb, el fragmento EcoRI-HindIII de alrededor de 5,0 Kb, el fragmento BamHI de alrededor de 4,0 Kb, descritos en la memoria descriptiva de la patente anteriormente mencionada.

Los ejemplos del vector usado en la presente invención incluyen plásmidos tales como pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC7, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, y similares; fagos tales como fago \lambda, fago M13, etc.; cósmidos tales como pHC79 y similares.

El virus de la viruela aviar usado en la presente invención no está limitado particularmente mientras sea un virus que infecta a las aves. Los ejemplos específicos de tal virus incluyen el virus de la viruela de la paloma, virus de la viruela de aves de corral (en adelante abreviado como FPV), virus de la viruela del canario, virus de la viruela del pavo, preferiblemente virus de la viruela de la paloma, FPV y virus de la viruela del pavo, más preferiblemente virus de la viruela de la paloma y FPV. Los ejemplos específicos de los virus de la viruela aviar más preferidos incluyen FPVs tales como ATCC VR-251, ATCC VR-249, ATCC VR-250, ATCC VR-229, ATCC VR-288, cepa Nishigahara, cepa Shisui, cepa CEVA y una cepa viral entre los virus derivados de la cepa CEVA que forma una gran placa cuando se infecta en fibroblastos embrionarios de pollo, y un virus tal como una cepa NP (cepa Nakano del virus de la viruela de la paloma atenuada en embriones de pollo), etc., que es parecido a FPV y se usa como una cepa de vacuna atenuada de la viruela aviar. Estas cepas están disponibles comercialmente y son fácilmente accesibles.

A continuación, el ADN híbrido de la presente invención se inserta en la región no esencial del primer vector recombinante descrito anteriormente para construir un segundo vector recombinante. En general, el ADN híbrido empleado puede tener cualquier secuencia de nucleótidos, sin tener en cuenta si es sintético o natural, con tal de que el ADN híbrido funcione de manera eficaz como promotor en el sistema de transcripción poseído por los virus de la viruela aviar. Por lo tanto, se pueden usar también en la presente invención no solamente los promotores intrínsecos de los virus de la viruela aviar tales como los promotores de genes derivados del virus de la viruela aviar que codifican timidina quinasa, sino también ADNs derivados de virus distintos de los virus de la viruela aviar y ADNs derivados de eucariotas o procariotas, en la medida en que estas sustancias cumplan los requerimientos descritos anteriormente. Los ejemplos específicos de tales promotores incluyen los promotores de virus vaccinia (en adelante denominado a menudo VV) como se describe en Journal of Virology, 51, 662-669 (1984), más específicamente, un promotor de un gen de VV que codifica un polipéptido de 7,5 K, un promotor de un gen de VV que codifica un polipéptido de 19 K, un promotor de un gen de VV que codifica un polipéptido de 42 K, un promotor de un gen de VV que codifica timidina quinasa, un promotor de un gen de VV que codifica un polipéptido de 28 K, etc. Además, se puede usar un promotor sintético obtenido mediante modificación del método de Moss et al. (J. Mol. Biol., 210, 49-76 y 771-784, 1989), el promotor sintético de Davidson, un promotor obtenido modificando una parte del promotor de Davidson por medio de la deleción o cambio en una zona de forma que no se pierde la actividad del promotor (p.ej.,

TTTTTTTTTTTTGGCATATAAATAATAATAAATACAATAATTAATTACGCGTAAAAA TTGAAAAACTATTC
TAATTTATTGCACTC,

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATAATAAATACAATAATTAATTACGCGT AAAAATTGAAAAAC
TATTCTAATTTATTGCACTC etc.).

Además, considerando la detección fácil del virus recombinante, también se puede insertar un gen marcador tal como un ADN que codifica \beta-galactosidasa.

El virus de la viruela aviar recombinante se puede construir mediante transfección del segundo vector recombinante descrito anteriormente en células animales en cultivo, que se han infectado previamente con el virus de la viruela aviar, y provocando la recombinación homóloga entre el ADN del vector y el ADN del genoma viral. Las células animales en cultivo usadas aquí pueden ser cualesquiera células, siempre que el virus de la viruela aviar pueda crecer en las células. Los ejemplos específicos de tales células animales en cultivo son las células CEF, las células embrionarias de la membrana corioalantoidea de huevos, y similares.

El virus de la viruela aviar recombinante seleccionado como objetivo se aísla de las células hospedadoras infectadas con virus mediante hibridación de placas, etc.

Vacuna atenuada

El virus recombinante de la presente invención construido mediante el método descrito anteriormente se puede inocular a un ave en forma de una vacuna atenuada para la infección por Mycoplasma gallisepticum.

La vacuna atenuada de la presente invención se prepara, p.ej., mediante el siguiente método, aunque el proceso no se limita particularmente a él. El virus recombinante de la presente invención se infecta en células en las que el virus puede crecer (en adelante denominadas células hospedadoras). Después de que el virus recombinante haya crecido, las células se recuperan y se homogenizan. El homogeneizado se centrifuga para separar el precipitado y el sobrenadante de título elevado que contiene el virus recombinante. El sobrenadante resultante está sustancialmente exento de células hospedadoras, pero contiene el medio de cultivo celular y el virus recombinante, y por lo tanto se puede usar como una vacuna atenuada. El sobrenadante se puede diluir añadiendo un vehículo farmacológicamente inerte, p.ej. solución salina fisiológica, etc. El sobrenadante se puede liofilizar para suministrarlo para su uso en forma de una vacuna atenuada. El método para la administración de la vacuna atenuada de la presente invención a aves de corral no está limitado particularmente, y los ejemplos de administración incluyen un método para raspar la piel e inocular la vacuna atenuada en la raspadura, llevando a cabo la inoculación por medio de inyección, administración oral mezclando la vacuna atenuada con el pienso o el agua de bebida, inhalación mediante aerosol o nebulización, etc. Para usar la vacuna atenuada, la dosis puede ser la misma que para una vacuna atenuada habitual; por ejemplo, se inoculan aproximadamente 10^{2} a 10^{8} unidades formadoras de placas (en adelante abreviadas como UFP) por pollo. Cuando la inoculación se lleva a cabo mediante inyección, el virus recombinante de la presente invención se suspende en general en alrededor de 0,1 ml de un disolvente isotónico tal como solución salina fisiológica, y la suspensión resultante se suministra para su uso. La vacuna atenuada de la presente invención se puede liofilizar en condiciones habituales y se puede almacenar a temperatura ambiente. También es posible congelar la suspensión del virus a -20 hasta -70ºC y almacenar la suspensión congelada.

Especialmente cuando los genes que codifican los polipéptidos derivados de las proteínas de la membrana externa de los virus herpes descritos anteriormente son los que codifican polipéptidos que tienen más de un epítopo de los virus herpes, que tienen preferiblemente al menos un 90% de homología con las proteínas nativas de la membrana externa, la vacuna atenuada de la presente invención funciona como una vacuna tanto para la infección por Mycoplasma gallisepticum como para la infección por virus de la viruela aviar. Además, la vacuna atenuada de la presente invención puede funcionar también como una vacuna eficaz para la infección con el virus herpes que se origina de las proteínas de la membrana externa. Es decir, la vacuna atenuada de la presente invención se puede usar como una vacuna denominada trivalente.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de pNZ40K-S recombinante que alberga ADN híbrido que liga el ADN de la proteína TTM-1 inmediatamente después de la señal del gen gB del virus de la enfermedad de Marek (compárense las Figs. 1, 2 y 3)

Primero, se digirió el plásmido pUCgB que alberga el gen gB del virus de la enfermedad de Marek, descrito en el documento JPA 6-78764, con las enzimas de restricción BamHI y SalI para recuperar un fragmento de 3,9 kb.

Por separado se construyó el plásmido pGTPs digiriendo el plásmido pNZ1729R (Yanagida et al., J. Virol., 66, 1402-1408 (1992)) con HindIII y SalI, insertando el fragmento de ADN resultante de alrededor de 140 pb en pUC18 en su sitio HindIII-SalI, insertando además ADN sintético (5'-AGCTGCCCCCCCGGCAAGCTTGCA-3') en el sitio HindIII-PstI, insertando después ADN sintético (5'-TCGACATTTTTATGTGTAC-3') en el sitio SalI-EcoRI y finalmente insertando ADN sintético (5'-AATCGGCCGGGGGGGCCAGCT-3') en el sitio SacI-EcoRI.

El pGTPs así obtenido se digirió con las enzimas de restricción SalI y BamHI, y después se ligó con el fragmento de 3,9 kb anteriormente mencionado mediante el uso de una ligasa para obtener pGTPsMDgB. A continuación, pNZ2929XM1 descrito en el documento WO 94/23019 se digirió con EcoRI para recuperar un fragmento de 740 pb y después se obtuvo un extremo romo con ADN polimerasa de T4. Por otra parte, pGTPsMDgB se digirió también con XbaI y después se obtuvo un extremo romo con ADN polimerasa de T4. Posteriormente, pGTPsMDgB se ligó con el fragmento de 740 pb que tenía el extremo romo mediante el uso de una ligasa para construir un plásmido nuevo. Este plásmido nuevo se digirió con BgIII y SalI para recuperar un fragmento de 3,0 kb. El fragmento de 3,0 kb se ligó con el fragmento de 1,1 kb obtenido por medio de la digestión de pNZ2929XM1 con BgIII y SalI mediante el uso de una ligasa. Así, se obtuvo un plásmido que ligaba el extremo N-terminal del gen TTM-1 y el extremo C-terminal de la secuencia señal del gen gB del virus de la enfermedad de Marek.

Finalmente, se ligó un fragmento de 1,4 kb obtenido mediante digestión de pGTPs40K-S con SalI y BamHI con un fragmento de 9,3 kb obtenido mediante digestión del plásmido pNZ1829R con SalII y BamHI mediante el uso de una ligasa. El plásmido objetivo pNZ40K-S de 10,7 kb se construyó así para su uso en la recombinación.

Ejemplo 2 Construcción de pNZ40K-C recombinante que alberga ADN híbrido que liga el ADN de la proteína TTM-1 en el extremo C-terminal del gen gB del virus de la enfermedad de Marek (compárense las Figs. 4, 5 y 6)

Después, el plásmido pGTPsMDgB obtenido en el Ejemplo 1 se digirió con la enzima de restricción MluI, y después se obtuvo un extremo romo con la ADN polimerasa de T4, lo cual fue seguido de digestión con la enzima de restricción XbaI para recuperar un fragmento de 1,9 kb. Por separado se digirió pBluescriptII (producido por Toyobo Co., Ltd., en adelante abreviado como pBSKSII) con las enzimas de restricción XbaI y SmaI. El fragmento resultante se ligó con el fragmento de 1,9 kb obtenido anteriormente mediante el uso de una ligasa para proporcionar un plásmido. El plásmido resultante se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y SalI. El fragmento resultante se ligó con el fragmento de 550 pb y el fragmento de 615 pb, ambos obtenidos mediante digestión de pNZ2929XM1 con las enzimas de restricción EcoRI y EcoT22I y con las enzimas de restricción EcoT22I y SalI, respectivamente, mediante el uso de una ligasa para construir un plásmido. El plásmido así obtenido se digirió con las enzimas de restricción XbaI y SalI. El fragmento de 2,7 kb resultante se ligó con el fragmento de 3,3 kb obtenido mediante la digestión de pGTPsMDgB con las enzimas de restricción XbaI y SalI mediante el uso de una ligasa. Se obtuvo así el plásmido pGTPs40K-C que ligaba el gen TTM-1 en su extremo N-terminal con el gen gB del virus de la enfermedad de Marek en su extremo C-terminal.

Finalmente, un fragmento de 2,7 kb obtenido mediante la digestión de pGTPs40K-C con SalI y BamHI se ligó con un fragmento de 9,5 kb obtenido mediante la digestión del plásmido pNZ1829R con SalI y BamHI mediante el uso de una ligasa. Se construyó así el plásmido objetivo pNZ40K-C de 12,2 kb para la recombinación.

Ejemplo 3 Construcción de FPV recombinantes 40K-C y 40K-S y su purificación

La cepa NP, que es una cepa de vacuna atenuada de la viruela aviar, se infectó en CEF en monocapa a una m.d.i. =
0,1. Tres horas después, estas células se separaron de la monocapa mediante tratamiento con tripsina para formar una suspensión de células. Después de mezclar 2 x 10^{7} células de la suspensión con 10 \mug de plásmido pNZ40K-C o pNZ40K-S para el uso en la recombinación, la mezcla se suspendió en solución salina G (cloruro sódico 0,14 M, cloruro potásico 0,5 mM, hidrogenofosfato disódico 1,1 mM, dihidrogenofosfato potásico 1,5 mM, cloruro magnésico hexahidrato 0,5 mM, 0,011% de glucosa). La suspensión se sometió a electroforesis en condiciones de 3,0 kV cm^{-1}, 0,4 mseg y 25ºC mediante el uso de un Gene Pulser (fabricado por Bio-Rad Co., Ltd.) a temperatura ambiente. Las células infectadas con plásmido se cultivaron después a 37ºC durante 72 horas. Las células se lisaron congelando y descongelando 3 veces para recuperar los virus que contenían el virus recombinante.

El virus recombinante recuperado se seleccionó como sigue. La disolución viral recuperada se infectó en CEF en monocapa y se cubrió con 10 ml de disolución de agar que contenía medio de cultivo. Después de calentar el agar a temperatura ambiente, se llevó a cabo la incubación a 37ºC hasta que aparecieron placas de FPV. Después se cubrió con medio de agar que contenía Bluo-gal en una concentración de 200 \mug/ml sobre el agar, seguido de incubación a 37ºC durante otras 48 horas. De todas las placas, alrededor del 1% de las placas se colorearon de azul. Estas placas azules se aislaron y se recuperaron. Mediante el mismo procedimiento, se repitió el aislamiento y la recuperación para purificar el virus hasta que todas las placas se tiñeron de azul. En general, los procedimientos repetidos se finalizaron en 3 a 4 días. Las cepas purificadas se nombraron 40K-C y 40K-S, respectivamente. En 40K-C y 40K-S, cada posición de los ADNs insertados se confirmó mediante hibridación de transferencia puntual e hibridación de transferencia de Southern.

Ejemplo 4 Expresión de polipéptido TTM-1 en células infectadas con 40K-C y 40K-S

Para confirmar que 40K-C y 40K-S podían expresar polipéptido TTM-1 en las células infectadas, se llevó a cabo transferencia de Western mediante el uso de sueros anti-cepa S6 de Mycoplasma gallisepticum. Se infectó el virus 40K-C o 40K-S en CEF y se cultivó a 37ºC hasta que se formaron placas. Las células se desprendieron después con un raspador de células y se centrifugaron a 8000G durante 20 minutos junto con el sobrenadante del cultivo. Se recuperaron los precipitados que contenían las células (en adelante denominados sedimentos). Después de lavar con PBS, los sedimentos se centrifugaron a 8000G durante 20 minutos, seguido de lavado para recuperar los sedimentos. Los sedimentos se suspendieron después en 150 \mul de PBS. De la suspensión, se tomaron 50 \mul y se les añadió el mismo volumen de tampón de Laemmli (que contenía un 10% de mercaptoetanol). Después de llevar a ebullición durante 3 minutos, la mezcla se sometió a electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (en adelante abreviado como SDS-PAGE) de acuerdo con el método de Laemmli (Nature, 227, 668-685 (1970)). Los polipéptidos aislados en el gel de SDS-PAGE completado se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (Immobilon Transfer Membrane, producida por Millipore Inc., en adelante denominada simplemente membrana) según el método de Burnett et al., (A. Anal. Biochem., 112, 195-203 (1970)) o mediante el método de Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 4350-4354 (1979)) por medio de electroforesis. La membrana se sumergió durante una hora en PBS que contenía un 3% de leche descremada para llevar a cabo un bloqueo para evitar la unión inespecífica. A continuación, la membrana
se sumergió durante una hora en PBS en el que se diluyó 1000 veces suero anti-cepa S6 de Mycoplasma gallisepticum.

Posteriormente, la membrana se aclaró con PBS y se sumergió durante una hora en PBS que contenía IgG anti-pollo conjugado a fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario. Después de aclarar la membrana con PBS se llevó a cabo una reacción de formación de color en 10 ml de una disolución que contenía Tris-hidrocloruro 100 mM (pH 7,5), cloruro sódico 0,15 M y cloruro magnésico 50 mM, mediante el uso de sal Nitroazul de Tetrazolio (NBT, fabricado por GIBCO-BRL Inc.) y p-toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato (BCIP, fabricado por GIBCO-BRL Inc.) como sustratos formadores de color.

Los resultados de la transferencia de Western se muestran en la Fig. 7.

Como se muestra en la Fig. 7, se pudieron confirmar las proteínas en las células infectadas tanto para 40K-S como para 40K-C como aquellas reactivas en las posiciones seleccionadas como objetivo. Se verificó así que las proteínas esperadas se podían expresar en las células infectadas con FPV recombinante.

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Ejemplo 5 Capacidad de inducción de anticuerpos de pollos inoculados con FPV recombinante

Después de cultivar 40K-C y 40K-S en CEF a 37ºC durante 48 horas, se repitió dos veces el procedimiento de congelación y descongelación para recuperar la suspensión celular. La suspensión celular se ajustó para que tuviera un título de virus de 10^{6} ufp/ml y después se inoculó a pollos SPF (Line M, Nippon Seibutsu Kagaku Kenkyusho) de 7 días de edad en la membrana del ala derecha a una dosis de 10 \mul por medio de una aguja. Después de la inoculación, se observó la formación de la pústula y los sueros se recogieron 2 semanas después de la inoculación. Se determinó el título de anticuerpos de los sueros recogidos mediante ELISA. El polipéptido TTM-1 purificado se disolvió en una disolución tampón de bicarbonato a una concentración de 1 \mug/pocillo. Después de la adsorción en una placa de microtitulación de 96 pocillos, se llevó a cabo el bloqueo con leche descremada para evitar la adsorción inespecífica posterior. A continuación, se cargó una dilución de la muestra de suero en cada pocillo y después se le añadió como anticuerpo secundario un anticuerpo anti-inmunoglobulina de pollo marcado con peroxidasa de rábano (anticuerpo de conejo). Después de lavar minuciosamente, se añadió como sustrato sulfonato de 2,2'-azinodietilbenzotiazolina a la mezcla y se midió el aumento de la dilución relativa del anticuerpo con un Immuno-Reader con respecto a la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm. Como anticuerpo principal de control se usó suero de pollo anti-polipéptido TTM-1. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1 Título de anticuerpos de pollos inoculados con rFPV mediante ELISA

1

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Como se muestra en la Tabla 1, los resultados revelan que cuando se inoculó 40K-C o 40K-S en pollos, el título de anticuerpos anti-TTM-1 en los sueros se incrementó hasta un nivel mayor que el título de anticuerpos en los sueros de los pollos inmunizados con el polipéptido TTM-1. A partir de los resultados se confirmó que el FPV recombinante podía inducir de manera significativa el título de anticuerpos en los pollos inoculados.

Ejemplo 6 Prueba de exposición a Mycoplasma en pollos inoculados con FPV recombinante

La prueba de exposición se llevó a cabo básicamente de acuerdo con el estándar para preparaciones biológicas para animales. El método se describe brevemente a continuación.

Las cepas 40K-C y 40K-S se inocularon en pollos SPF (Line M, Japan Biological Science Laboratory) de 5 semanas de edad en la membrana del ala derecha a una dosis de 10 \mul por medio de una aguja. Después de la inoculación se observó la formación de la pústula para verificar la finalización de la inmunización. Dos semanas después de la inoculación, se forzó la administración intratraqueal de la cepa R de Mycoplasma gallisepticum a una dosis de 10^{4} a 10^{5} ufc/pollo, por lo que se aseguró la infección. En el día 14 después de la infección, los pollos se sacrificaron con Nembutal. Se prepararon cortes de tejidos de la lesión traqueal y se determinaron las puntuaciones de la lesión traqueal basándose en el grosor de la membrana mucosa traqueal y en los hallazgos histológicos. Las puntuaciones se determinaron también mediante el estándar anterior para preparaciones biológicas. La media de las puntuaciones de las lesiones traqueales observadas en cada pollo de los grupos se transformó en la puntuación de los grupos respectivos. A modo de información, los criterios para determinar las puntuaciones de las lesiones traqueales se muestran en la Tabla 2.

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TABLA 2 Criterios estándar para puntuar las lesiones traqueales

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2

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Los resultados de la evaluación se muestran en la Tabla 3 y en la Fig. 8.

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TABLA 3 Puntuaciones medias de las lesiones traqueales en pollos inoculados con FPV

3

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Como se observa claramente a partir de los resultados anteriores, las puntuaciones de las lesiones de los pollos inoculados con 40K-C y 40K-S son obviamente bajas en comparación con las de los pollos sin inocular, lo que indica que las vacunas de la presente invención confieren claramente a los pollos la prevención eficaz de la infección por exposición a Mycoplasma. Así, los resultados revelan que 40K-C y 40K-S podrían ser vacunas eficaces para Mycoplasma gallisepticum.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, se obtienen proteínas de fusión de polipéptidos derivados de las proteínas antigénicas de Mycoplasma gallisepticum y de polipéptidos derivados de las proteínas de la membrana externa de virus herpes. Las proteínas de fusión son eficaces como vacunas anti-infección por Mycoplasma, anti-viruela aviar o anti-enfermedad de Marek. Mediante el uso de los ADNs híbridos que codifican las proteínas de fusión, las proteínas antigénicas de Mycoplasma gallisepticum se pueden proporcionar de manera eficaz en la superficie de las células hospedadoras. Además, los ADNs híbridos pueden secretar las proteínas antigénicas de manera extracelular para obtener virus de la viruela aviar que pueden ser reconocidos de manera eficaz por las células del organismo hospedador que reconocen antígenos. Los virus de la viruela aviar recombinantes así obtenidos son útiles como vacunas potentes anti-infección por Mycoplasma.

SEQ NO: 1

Longitud de la secuencia: 1371

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Número de cadenas: bicatenario

Topología: lineal

Clase de secuencia: otro ácido nucleico, ADN híbrido (40K-S)

Secuencia:

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4

5

6

7

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SEQ NO: 2

Longitud de la secuencia: 456

Tipo de secuencia: aminoácido

Topología: lineal

Clase de secuencia: proteína

Secuencia:

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8

9

10

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SEQ NO: 3

Longitud de la secuencia: 3261

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Número de cadenas: bicatenario

Topología: lineal

Clase de secuencia: otro ácido nucleico, ADN híbrido (40K-C)

Secuencia:

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11

12

13

14

15

16

17

18

19

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SEQ NO: 4

Longitud de la secuencia: 1086

Tipo de secuencia: aminoácido

Topología: lineal

Clase de secuencia: proteína

Secuencia:

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20

21

22

23

24

25

Claims

1. Una proteína de fusión que comprende:

(a): un polipéptido que provoca una reacción antígeno-anticuerpo con suero inmune a Mycoplasma gallisepticum (MG) o suero infectado con MG y que deriva de MG; y

(b): un polipéptido de la proteína de la membrana externa de virus herpes, y dicho polipéptido contiene la secuencia señal, pero no la secuencia de anclaje a la membrana, de la proteína de la membrana externa, y dicho polipéptido está ligado con el polipéptido que tiene la antigenicidad de Mycoplasma gallisepticum en su extremo N-terminal.

2. Una proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de la membrana externa es de un virus herpes que exhibe infección en las aves de corral.

3. Una proteína de fusión según la reivindicación 2, en la que dicha proteína de la membrana externa es de un virus de la enfermedad de Marek.

4. Una proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que dicha proteína de la membrana externa es una proteína gB de un virus de la enfermedad de Marek.

5. Una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polipéptido de la proteína de la membrana externa de virus herpes es una secuencia señal de la proteína de la membrana externa de un virus herpes.

6. Un ADN híbrido que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector recombinante en el que se ha insertado un ADN que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Un virus de la viruela aviar recombinante en el que se ha insertado un ADN que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Una vacuna atenuada recombinante anti-infección por Mycoplasma gallisepticum de aves de corral que comprende como ingrediente eficaz un virus de la viruela aviar recombinante en el que se ha insertado un ADN que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Una vacuna atenuada recombinante según la reivindicación 9, en la que dicha vacuna es una vacuna atenuada trivalente anti-infección por Mycoplasma gallisepticum de aves de corral, anti-infección por virus de la viruela aviar y anti-infección por virus herpes; y dicho ADN codifica una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y dicho polipéptido de la proteína de la membrana externa de virus herpes contiene más de un epítopo de virus herpes.