ES2310009T3 - Procedimiento para comprobar el rendimiento de un citometro de flujo y un equipo estandar. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de comprobación del rendimiento de un instrumento de citómetro de flujo (10), en cuyo instrumento se cuenta el número de partículas o células en un flujo fluido, como por ejemplo leche, proporcionando datos representativos de un diagrama de altura de impulsos (PHA) de los impulsos registrados, caracterizado por proporcionar un lote de muestras estándar, que incluye solamente un tipo de microesferas substancialmente uniformes, que proporcionan datos representativos de un diagrama PHA óptimo (PHAO) de los impulsos registrados cuando se mide una muestra estándar de dicho lote en un instrumento de referencia, almacenándose dichos datos en una memoria situada en el propio instrumento (10), o en una memoria en unos medios de procesamiento de datos (26, 28) conectados al instrumento (10), o en unos medios desde los cuales los datos se pueden importar al instrumento (10) o en los medios de procesamiento de datos (26, 28) conectados al instrumento (10), medir un estándar en el instrumento (10) que se ha de comprobar, proporcionar datos que representan un diagrama PHA (PHAS) para los impulsos registrados durante la medición de la muestra estándar en el instrumento (10) que se ha de comprobar, comparar en los medios de procesamiento de datos (26, 28) conectados al instrumento (10) los datos que representan el diagrama PHAS con los datos almacenados que representan el diagrama PHAO, y analizar y/o evaluar en los medios de procesamiento de datos (26, 28) conectados al instrumento (10) dichos datos para determinar cualquier operación insuficiente o con fallos del instrumento (10).
Description
Procedimiento para comprobar el rendimiento de
un citómetro de flujo y un equipo estándar.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para comprobar el rendimiento de un citómetro de
flujo, comprendiendo el citómetro de flujo medios para suministrar
señales de impulsos eléctricos que indican la presencia de
partículas, tales como células somáticas o bacterias. La invención
está específicamente dedicada a análisis de leche, y más
específicamente a la determinación del número de células somáticas
en la leche. Además, según la presente invención del procedimiento
permite la inspección y la corrección de cualquier aglomeración de
partículas en una muestra estándar utilizada para comprobar el
rendimiento del citómetro de flujo. Además, la invención se refiere
a un aparato que comprende un equipo de procesamiento de datos
dispuesto para ejecutar el procedimiento anterior, así como a un
equipo estándar para la aplicación en el aparato.
Los citómetros de flujo son instrumentos
utilizados para el análisis de las partículas suspendidas en un
fluido, por ejemplo células biológicas en fluidos corporales, tal
como células somáticas en la leche. Brevemente, un citómetro de
flujo comprende un sistema de flujo del líquido y un sistema óptico
que intersectan entre sí en una cubeta de flujo, así como un
sistema electrónico, que detecta la fluorescencia o dispersión que
originan las partículas que pasan a través de la cubeta.
Preferiblemente, la muestra de fluido fluye en una única hilera
fina en el interior de la cubeta, permitiendo así que cualquier
partícula presente sea contada una a una. Además, en una
realización preferente, la hilera fina está rodeada mediante un
fluido de cubierta. Gracias al fluido de cubierta, las impurezas
casuales, presentes en el fluido que tienen un tamaño mayor que las
partículas o células que se han de contar y, en consecuencia,
mayores que el tamaño de la hilera de la muestra de fluido, no
provocarán que se atasquen. Podrían haberlo hecho si fluyeran en un
canal del líquido tan estrecho como la fina hilera interna.
El procedimiento según la invención está
específicamente desarrollado para citómetros de flujo aplicados para
la rápida determinación del número de células en una muestra de
leche o un producto de leche, y más específicamente para el tipo
fluorescente de citómetros de flujo, en los cuales las células o
partículas están todas teñidas mediante una tinta fluorescente, que
se vuelve fluorescente cuando se expone a iluminación. Una señal de
fluorescencia de tamaño adecuado, es decir por encima del ruido, se
considera que indica el paso de una partícula o célula. En la
realización preferente del citómetro de flujo, el agente o tinta
actualmente preferido es bromuro de etidio. El presente tipo de
citómetro de flujo tiene solamente un canal, es decir, está
optimizado para detectar solamente un tipo de fluorescencia o
dispersión.
Sin embargo, los citómetros de flujo pueden tener una pluralidad de canales, cada uno dedicado a un tinte específico.
Sin embargo, los citómetros de flujo pueden tener una pluralidad de canales, cada uno dedicado a un tinte específico.
El recuento de células somáticas se considera
una medida de la calidad de la leche (la leche de alta calidad
tiene un recuento de células bajo). En consecuencia, el recuento de
células se puede aplicar por parte de la industria lechera cuando
se ajusta el precio según el cual se le paga al granjero por la
leche suministrada. Para asegurar el pago correcto al granjero y
poner en evidencia cualquier leche de una calidad demasiado baja,
un funcionamiento adecuado del citómetro de flujo es crucial.
Para obtener unos resultados precisos y que se
puedan reproducir, los citómetros de flujo se han de alinear y
calibrar. Los rayos de luz desde la fuente de iluminación han de
incidir sobre la corriente de partículas y la óptica del detector
ha de concentrarse sobre la corriente de partículas cuando las
partículas iluminadas presentan fluorescencia. Además, la
adquisición y las características de los circuitos electrónicos que
procesan las señales detectadas y los procesos matemáticos
aplicados deben producir un número que indique el número verdadero
de partículas en la corriente con una precisión y una capacidad de
reproducción suficientes.
Cualquier defecto, o desajuste de los
caudales (o atasco) en el sistema de flujo y/o defectos o
desalineación del sistema óptico puede provocar que el recuento
aumente o disminuya comparado con el valor real.
La patente US 5,093,234 (Schwartz) describe un
procedimiento de alineación, compensación y calibración de un
citómetro de flujo para el análisis de muestras y un equipo estándar
de microesferas para el mismo punto del procedimiento se puede
aplicar en citómetros de flujo de múltiples canales. El
procedimiento incluye realizar mediciones de prueba en equipos
estándar; ajustar las tensiones PMT de los canales de fluorescencia
y adquirir la posición resultante del trazado de los puntos o feliz
programa cerca del origen del eje de cada uno de los canales de
fluorescencia; y ajustar la los niveles límite en cada canal para
indicar la intensidad de la fluorescencia. El equipo estándar
comprende una pieza inicial y/o un grupo de microesferas
autofluorescentes y por lo menos dos series de grupos de
microesferas calibradas etiquetadas con tinte(s)
fluorescente(s). La patente US 5,084,394 (Vogt et al)
describe un procedimiento similar para la calibración correctiva de
un citómetro de flujo utilizando una mezcla de microesferas
fluorescentes y células. Estos procedimientos proporcionan un
análisis avanzado, perfeccionado y de calidad de células simples,
tal como el de los linfocitos en la sangre.
La patente US 5,288,642 (Turner) describe un
estándar de calibración para máquinas cuentan células somáticas en
la leche.
El presente procedimiento se refiere a una
"comprobación de rendimiento", es decir, una monitorización del
rendimiento funcional, de un citómetro de flujo de un único canal
para contar células somáticas en la leche. El instrumento está
específicamente diseñado para una manipulación y recuento rápido de
muestras, permitiendo contar aproximadamente 500 muestras por hora.
Este tipo de citómetro de flujo cuenta las células basado en la
medición de solamente un parámetro, tal como la fluorescencia verde
o roja. El instrumento no está diseñado para estudios cualitativos
de las células. El procedimiento de comprobación del rendimiento se
basa en el uso de un fluido estándar y/o de calibración que
comprende solamente un tipo de partículas o microesferas que no
están tintadas hasta que entran en el proceso según la presente
invención. Por lo tanto, las muestras de fluido estándar son lo más
simple posible. Las muestras estándar son muy estables y adecuadas
para un almacenamiento de largo plazo, es decir, un gran número de
muestras estándar se pueden almacenar por parte del usuario durante
meses hubo años para un uso futuro, tal como una comprobación de
rendimiento regular cada mañana o cuando sea necesario.
Además de una comprobación completa el
funcionamiento del citómetro de flujo, el fluido estándar también se
podría aplicar para una calibración del citómetro de flujo.
La presente invención proporciona un
procedimiento tal como se define en la reivindicación 1, de
comprobación del rendimiento de un instrumento de citómetro de
flujo, en cuyo instrumento el número de partículas o células en un
fluido se cuentan proporcionando datos representativos de un
diafragma PHA (análisis de altura de impulsos), de impulsos
registrados. La invención se caracteriza por - proporcionar
un lote de muestras estándar, incluyendo solamente un tipo de
microesferas substancialmente uniformes, - proporcionar datos
representativos de un diagrama PHA óptimo (deseado) (PHA0) de los
pulsos registrados, cuando se mide una muestra estándar a partir
del lote en un instrumento de referencia, almacenándose dichos datos
en una memoria del propio instrumento 0, una memoria en medios de
procesamiento de datos conectados al instrumento, o en medios a
partir de los cuales los datos se pueden importar al instrumento o
a los medios de procesamiento de datos conectados al instrumento, -
medir una muestra estándar en el instrumento que se ha de comprobar,
- proporcionar datos que representan un diagrama PHA (PHAS) para
los pulsos registrados durante la medición de la muestra estándar
en el instrumento que se ha de comprobar, - comparar el diagrama PHA
presente (PHAS) con el diagrama PHA óptimo (PHA0), y analizar y/o
evaluar dichos datos para determinar cualquier funcionamiento
deficiente o fallido del instrumento. Mediante este procedimiento
el usuario puede comprobar el instrumento de una manera regular, y
el usuario puede estar fácilmente informado de cualquier precaución
que se ha de tomar. Preferentemente, las microesferas en el lote no
están teñidas hasta que entran en el instrumento. El uso de
microesferas no teñidas es específicamente favorable porque también
el proceso de teñido en el instrumento se controla cuando se mide
la muestra estándar.
Preferiblemente, por lo menos uno de los
siguientes parámetros se calcula: un recuento de partículas, una
pluralidad de recuentos de partículas en la misma muestra, una
desviación estándar, s, y/o un coeficiente de variación, CV, basado
en (por lo menos dos, preferiblemente tres) mediciones
repetidas/consecutivas en la misma muestra y substancialmente al
mismo tiempo, un valor medio de la señal, y una anchura de la señal,
es decir, la anchura de la curva campanular en el diagrama PHA -
los datos correspondientes para la muestra estándar del fluido
estándar medido en un instrumento de referencia, es decir, los
valores óptimos de dichos datos, que se proporcionan con el lote -
comparando por lo menos uno de los parámetros anteriores con la
medición real de la muestra estándar con los parámetros óptimos
correspondientes del fluido estándar, - y analizar dichos datos
para estimar si el instrumento está operando de una manera
substancialmente óptima, (es decir, dentro de los límites
preferentes) o si no está operando de una manera substancialmente
óptima (es decir, fuera de los límites preferentes), registrando
cualquier desviación fuera de los límites para una operación
óptima.
Preferentemente, las desviaciones fuera de los
límites registradas se consideran como síntomas que se muestran al
usuario.
Preferentemente, el equipo de procesamiento de
datos comprende medios para evaluar los síntomas observados,
proponiendo posibles defectos (realizando un diagnóstico), y
realizando recomendaciones para cómo remediar cualquier rendimiento
deficiente, y/o cualquier precaución que se deba tomar.
Preferentemente, los medios para evaluar los síntomas incluyen una
librería almacenada en medios de memoria dispuestos para ser
accedidos mediante los medios de procesamiento de datos.
Preferiblemente, los medios para comprobar el rendimiento/evaluar
los síntomas incluyen mostrar una lista de resultados consecutivos
al usuario en un monitor y/o proporcionar una impresión.
Preferiblemente, los medios para la comprobación del
rendimiento/evaluar los síntomas incluyen la visualización de los
resultados detallados y los datos de las mediciones recientes del
fluido estándar. Preferiblemente, los medios para comprobar el
rendimiento/evaluación de los síntomas incluyen mostrar un diagrama
PHA medido bajo solicitud por parte del usuario.
Preferiblemente, los medios para comprobar el
rendimiento/evaluar los síntomas incluyen mostrar una lista de
posibles situaciones que comprenden los síntomas definidos para cada
situación que presenta información sobre las posibles razones y las
acciones apropiadas para remediar el efecto.
La visualización de cualquier síntoma y acciones
para remediar cualquier operación con fallos es ventajosa porque el
propio usuario podrá ajustar el instrumento para obtener un
rendimiento óptimo. Por lo tanto, la visita de un ingeniero de
servicio se puede evitar. Por lo tanto, se evita la pérdida de un
tiempo de medición precioso debido al rendimiento deficiente.
El equipo estándar según la invención se define
en la reivindicación 9, y comprende un fluido estándar incluye una
pluralidad de microesferas no teñidas substancialmente uniformes y
medios asociados para llevar la información del lote, y
específicamente del contenido de las microesferas en el fluido
estándar.
El procedimiento y el equipo son específicamente
favorables porque las muestras de prueba (las muestras estándar)
son manipuladas de la misma manera que cualquier otra muestra, y
cualquier defecto en el instrumento, que puede influenciar el
resultado de una medición ordinaria también podrá influenciar el
resultado de la medición de prueba en la muestra estándar.
La figura 1 muestra un diagrama esquemático y
simplificado de un citómetro de flujo según la invención.
La figura 2 muestra un diagrama PHA típico.
La figura 3 muestra una visualización de
diagramas PHA según la invención indicando, por ejemplo, que el
ajuste de adquisición puede ser un poco demasiado alto.
La figura 4 muestra otra visualización de
diagramas PHA según la invención indicando, por ejemplo, un caudal
demasiado alto del fluido de cubierta.
La figura 5 muestra un diagrama que indica la
variación de los recuentos comparados con el recuento del lote.
La figura 6 muestra un diagrama que indica la
media de la señal comparada con el lote.
La figura 7 muestra la desviación estándar o el
coeficiente de variación, CV, comparado con el CV teórico.
La figura 8 muestra un recuento promedio
acumulativo comparado con los valores teóricos (recuento
acumulativo).
La figura 9 muestra una impresión de pantalla
que muestra tres "ventanas", 1) una lista de resultados, 2)
detalles de los resultados, y 3) datos del lote, en cuanto que la
impresión de la pantalla pueda parecer poco clara, todos los datos
están listados en las tablas en el texto.
La figura 10 muestra el diagrama PHA para una
medición específica (número 58.2).
La figura 11 muestra una impresión de pantalla
que muestra el diagrama PHA para una medición específica (número
58.2) y un diagrama PHA teórico deseado.
La figura 12 muestra un trazado de un diagrama
PHA para una primera situación específica.
La figura 13 muestra un trazado de un diagrama
PHA para una segunda situación específica.
La figura 14 muestra un trazado de un diagrama
PHA para una tercera situación específica.
La figura 15 muestra un diagrama PHA que indica
la aglomeración de partículas.
La figura 16 muestra un diagrama esquemático que
ilustra el procedimiento según la invención.
Las impresiones de pantalla mostradas en las
figuras 9 y 11 pueden parecer un poco confusas, y por motivos de
claridad todos los datos relevantes se representan en las tablas 1,
2 y 3.
La invención se explicará con mayor detalle en
el siguiente ejemplo no limitativo de una realización preferida
según la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización preferida de un citómetro de
flujo según la invención se muestra esquemáticamente en la figura
1. El citómetro de flujo 10 comprende un sistema de flujo 12
adaptado para aspirar una muestra de leche de una copa de muestra
14; el sistema de flujo está dispuesto para mezclar la muestra con
un tinte fluorescente. El sistema de flujo que incluye una cubeta
transparente 16 a través de la cual una hilera fina de muestra de
leche pasa rodeada por un fluido de cubierta un sistema óptico 18
incluye una fuente de luz 20, una óptica que dirige un rayo de luz,
pasando a través de la cubeta transparente 16, incidiendo sobre la
hilera fina de la muestra de leche, recogiendo otras ópticas
cualquier luz fluorescente emitida mediante las células teñidas de
la muestra de leche que pasan a través de la cubeta 16, detectando
un detector fotográfico 24 la luz fluorescente, es decir,
transfiriendo la luz fluorescente en señales electrónicas, y un
equipo de procesamiento de las señales electrónicas y datos 26.
Preferiblemente, el equipo de procesamiento de datos incluye un
ordenador personal 28. Además, el equipo de procesamiento de datos
incluye un monitor 30 o una unidad de visualización similar. El
citómetro de flujo está específicamente diseñado para su uso en
industrias lácteas y laboratorios que analizan la leche
suministrada por los granjeros.
Las características del procedimiento se
ilustran esquemáticamente en la figura 16 y se explican en detalle
a continuación:
El usuario del citómetro de flujo recibe del
fabricante del citómetro de flujo u otro proveedor un llamado
"lote", que es una serie de muestras estándar, es decir, una
pluralidad de pequeños recipientes llenos con un fluido estándar.
Las características del fluido estándar se han analizado
adecuadamente por parte del proveedor. Las muestras estándar
actualmente preferidas comprenden 30 ml de agua, aditivos y una
serie de esferas de plástico, con un tamaño de aproximadamente 6
\mum. Como las esferas de plástico tienden a colocarse en el
fondo de la copa de muestra, una agitación cuidadosa de las muestras
estándar actualmente aplicadas es esencial para obtener un buen
resultado.
El fluido estándar también se puede aplicar para
la calibración del citómetro de flujo, pero este uso no es el
objeto principal de esta solicitud de patente.
La información sobre las características de las
muestras estándar del lote se suministran al usuario,
preferiblemente en medios de almacenamiento, tal como un disquete o
un CD-ROM, que también comprende un software
previsto para el análisis de las señales detectadas y los recuentos
obtenidos mediante el instrumento de citómetro de flujo. El usuario
importa los datos del lote desde el disco al equipo de procesamiento
de datos 26-28 fijado al citómetro de flujo. Como
alternativa, el equipo estándar que incluye el lote puede comprender
medios como por ejemplo una identificación del usuario y/o una
contraseña que permita el acceso a los medios de almacenamiento que
contienen la información, por ejemplo, información para su acceso a
través de Internet.
En general, las muestras estándar se manipulan y
se cuentan en el citómetro de flujo de la misma manera que las
muestras de leche ordinarias. Regularmente, por ejemplo
aproximadamente cada 2 horas, el usuario introduce una muestra
estándar bien agitada en el citómetro de flujo. Cuando una porción
del fluido de la muestra estándar se aspira en el citómetro de
flujo, se mezcla con un tinte fluorescente tal como bromuro de
etidio. El sistema de flujo 12 incorpora medios de mezcla de
retraso del tiempo apropiados para asegurar que algo del tinte se
ha adherido a cada célula o partículas que se ha de contar. Las
células o partículas teñidas pasan preferiblemente una a una en una
hilera de fluido de muestra rodeada mediante un fluido de cubierta.
Un rayo de luz desde la fuente de luz óptica 20 pasa a través de la
hilera de partículas, iniciando así la fluorescencia de las
partículas teñidas. Cada destello de fluorescencia se detecta
mediante un detector fotográfico muy sensible 24 conectado al
equipo de procesamiento de señal y datos 26-28, en
el cual se realiza el recuento.
El recuento de las partículas se puede analizar
mediante el uso del llamado diagrama PHA (PHA significa análisis de
altura de impulsos). Es un diagrama o histograma que muestra el
número de pulsos respecto al tamaño de la señal (altura). Un
diagrama PHA típico se muestra en la figura 2. Es evidente a partir
de la sección de curva 32 del diagrama que un gran número de pulsos
de baja señal se han detectado. En general, indican un ruido. La
sección en forma de campana 34 (en la mitad del diagrama) que tiene
un máximo indica la aparición de señales mayores, que se
interpretan como provocadas por las partículas que se han de contar.
El área de dicha porción indica el número de partículas. El
diagrama PHA es muy útil para indicar el ruido y, en consecuencia,
permite la discriminación del ruido. En una realización preferida,
todas las señales de un tamaño menor que un valor ajustable D,
igual o próximo al mínimo M mostrado en la figura 2, se consideran
como ruido. Todas las señales de un tamaño mayor a D se consideran
que representan partículas, y en consecuencia, se cuentan.
Según la presente invención, el diagrama PHA
(figuras 2, 3, 4) es extremadamente útil para diagnosticar el
rendimiento (funcionamiento) del instrumento. Según la invención, el
diagrama PHA (o curva) obtenido para la muestra estándar se puede
mostrar al usuario en el monitor adjunto 30 (o unidad de
visualización) junto con un segundo diagrama PHA (o curva), PHAO.
El segundo diagrama o curva indica el diagrama óptimo (deseado = el
mejor posible) para el lote medido (el segundo diagrama se obtiene a
partir de los datos suministrados en el disco INFO proporcionado
por el proveedor junto con el lote). Si el nuevo diagrama PHA (PHAS
= PHA de la muestra estándar (obtenido para la muestra estándar
cubre o es idéntico (o casi idéntico) al diagrama óptimo PHAO, el
funcionamiento del citómetro de flujo es bueno. Se puede utilizar
cualquier diferencia para el diagnóstico, tal como se explica a
continuación. Las diferencias que superen los límites predefinidos
son útiles como síntomas, indicando un funcionamiento/rendimiento
deficiente del citómetro de flujo. Para evaluar las diferencias se
calcula una señal media (media de Gauss).
La información suministrada por parte del
fabricante incluye una "librería" para encontrar fallos. En la
librería, una serie de síntomas están relacionados con avisos
adecuados que indican al usuario las acciones que ha de tomar para
remediar cualquier operación/rendimiento deficiente. En una
realización preferida, la librería está almacenada en un disco,
preferiblemente un CD-Rom o un disco similar de alta
capacidad. Un ejemplo de la información almacenada se muestra en
las páginas 11-14 como la tabla 1. El ejemplo según
la tabla 1 muestra una manera actualmente preferida de mostrar los
síntomas y las recomendaciones de diagnóstico. Se describen 14
situaciones o llamadas "versiones" diferentes en la tabla. El
número 0.0, es decir el primero, es el caso perfecto, todos los
valores están dentro de los límites y cerca de los valores óptimos.
Todos los siguientes 13 casos representan indicaciones de algún
tipo de desajuste. La primera columna a la izquierda muestra los
síntomas observados. (En algunos casos, los mismos síntomas aparecen
en diferentes versiones a, b, c). La columna de la derecha incluye
los mensajes proporcionados al usuario en la ventana del lado
derecho en la parte inferior de la figura 10. Estos mensajes
incluyen: a) síntomas detallados adicionales, b) indicaciones tales
como posibles propuestas para diagnósticos que podrían ser la razón
del pobre rendimiento, y c) qué hacer para remediar la
situación.
Los síntomas típicos que indican un
deficiente rendimiento son: señal media baja, señal media demasiado
baja, señal media muy baja, señal media alta, señal media demasiado
alta, el PHA es amplio, el PHA es bajo, PHA sesgado o doble.
\vskip1.000000\baselineskip
Los diagnósticos típicos pueden ser:
ganancia electrónica demasiado baja o demasiado
alta: necesita el ajuste de la ganancia en los medios de
procesamiento de la señal electrónica;
obstrucciones o atasco en el sistema de
flujo;
flujo de cubierta demasiado bajo, demasiado
alto, o muy alto: ajuste del índice de flujo de la muestra
necesario;
mezcla incorrecta de la muestra y de la
tinta;
defecto de la lámpara;
desajuste de la lámpara o del microscopio:
necesita un ajuste o alineación óptica de la lámpara y/o del
microscopio.
Los principios de una realización preferida de
la presente invención se muestran esquemáticamente en la figura 16.
La entrada en el instrumento es una muestra de fluido estándar 161 y
un portador de información tal como un disco 162, que comprende
información sobre el lote y el software.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes acciones/operaciones se
realizan:
- cada 2 horas un ordenador avisa al usuario
para insertar una muestra estándar 161 (a partir de un lote
suministrado por el proveedor)
- el citómetro de flujo mide la muestra estándar
una pluralidad de veces, por ejemplo tres veces, es decir, obtiene
tres recuentos, c1, c2, c3, cada uno de los cuales representa el
número de partículas que pasan durante un período de tiempo de
medición predeterminado de unos pocos segundos, por ejemplo 2
segundos (preferiblemente, un período de tiempo según un modo de
operación normal de instrumento). A la cuenta se les asignaba un
registro por número de registro consecutivo, por ejemplo, número
58.1, 58.2, 58.3, 59.1, etc.
- el equipo de procesamiento de datos que
incluye un software apropiado calcula
- el número de partículas C1, C2, C3
- la recuento medio, c = (C1 + C2 + C3)/3
(cuenta en la figura 5, también mostrada como 165 en la figura
16)
- el tamaño de la señal
- el tamaño medio de la señal (señal media en la
figura 6), y
- la desviación estándar se calcula a partir de
las tres mediciones,
\vskip1.000000\baselineskip
- o el Coeficiente de Variación:
100% * s/c
(CV se muestra en la figura 7, comparado con el
CV teórico que se calcula según estadísticas de muestra de
Poisson); también mostrado como 167 en la figura 16;
un valor medio acumulado de toda las cuentas
obtenidas mediante el instrumento:
\Sigmaci, (cuenta acumulativa en la figura 8 y
168 la figura 16)
- los resultados calculados se comparan con la
información proporcionada con el lote (por parte del proveedor del
lote) incluyendo los límites operativos óptimos superior e inferior
(números de referencia 51, 52, etc. en las figuras 5 a 8) (por
ejemplo tamaño medio de la señal, cuenta, CV),
- y comentarios para cada medición y resultados
medios que se muestran usuario, por ejemplo, tal como se muestra en
la lista de resultados en la figura 9, para llamar la atención del
operador de cualquier rendimiento pobre. Por motivos de claridad,
extractos de la lista de resultados se vuelven a mostrar en la tabla
3.
- Si se solicita, el equipo de procesamiento de
datos (con el software apropiado) del citómetro de flujo muestra un
diagrama PHA en el monitor adjunto 30 indicando el tamaño de la
señal.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada cuenta (referencia numérica 50 figura 5) se
compara con la cuenta del lote c0 (53), que es un número de cuenta
proporcionado por el lote y que representa el número real de
partículas en el lote presente. En consecuencia, la presente cuenta
ha de ser de una manera ideal igual a la cuenta del lote (53). Los
límites del lote (51, 52) que indican variaciones admisibles
también son suministrados con el lote. La figura 5 muestra la
cuenta (50) comparada con la cuenta del lote (53) para una
pluralidad de muestras estándar 0-72. El eje
horizontal indica el número de la muestra registrada y el eje
vertical indica la cuenta por 1000 partículas.
Las variaciones permisibles se indican mediante
los límites del lote superior e inferior (51, 52). En el presente
caso, la cuenta del lote/1000 es de 396 y los límites (51, 52) se
ajustan en 371 y 421. La línea o pista en negrita (50) indica las
cuentas reales/1000 encontradas. Parece que está dentro de los
límites (51, 52).
La figura 6 muestra una señal media (60)
comparada con una señal del lote (63) y los límites superior e
inferior (61, 62). Para ilustrar (como ejemplo) un posible fallo
con defecto, se llama la atención a la muestra número 48: una
disminución significativa en la señal parece que aparece después de
la muestra 48. Si se compara con el resultado detallado parece que
algo de la ganancia ha disminuido de 625 a 615.
La figura 7 muestra como un ejemplo una
secuencia de CV/R calculada (número de referencia 70, figura 7)
comparada con el valor teórico: CV/R = 1 (72). Un límite superior
(71) indica la variación admisible.
La figura 8 muestra una cuenta acumulativa (80)
comparada con los valores teóricos. El valor medio acumulado se
compara con los límites curvados (81, 82) (que son límites de
confianza en p%) que confinan una separación que se vuelve más
estrecha al aumentar el número de la muestra. Sin embargo, una serie
de muestras (llamada "lote") tiene un número limitado de
muestras y un nuevo lote puede tener un número diferente de
partículas por mililitro. Para evitar un desplazamiento de todos
los valores predefinidos, por ejemplo la media teórica (el
llamado recuento del lote), y los límites, se prefiere que el
valor medio acumulado (80) y los límites (81, 82) se normalicen, es
decir, se dividan por el número de lote, una cuenta media del lote
para permitir una supervisión continua, también cuando se cambia el
lote.
Cuando el usuario obtiene un mensaje o
indicación, por ejemplo, tal como se indica en la tabla 1 para los
registros 19, 49, 51, 58 y 59, ha de estudiar lo más pronto posible
los últimos resultados de la medición. El software es de base
Windows®, previendo la visualización de varias "ventanas". La
figura 9 muestra una lista de "mediciones de comprobación" o
resultados del mismo tipo mostrados en la tabla 3. La muestra
destacada número 58 tiene una indicación. En consecuencia, el
usuario ha solicitado visualizar los "detalles del resultado para
58". Los detalles del resultado se muestran en forma de tabla
(también mostrados en la tabla 2, página 15) que incluye seis filas
(comprendiendo las tres mediciones (rep1, rep2, rep3), un valor
promedio, CV% (una desviación estándar teórica), y el promedio del
lote), y ocho columnas (que comprende los valores encontrados para
la cuenta, R, señal media, (58), anchura de la señal (8), Z (un
valor que cuantifica el espacio de discriminación (separación)
entre el ruido y las señales), discriminador, nivel de ruido, e
indicaciones). En una tercera ventana se muestran los datos del
lote. Además, la pantalla facilita la visualización de un diagrama
PHA medido y un diagrama PHA teórico deseado (figura 10). Una
impresión de los diagramas PHA mostrados se muestra en la figura
11. Tal como es evidente a partir de la impresión de la pantalla en
la figura 10, el usuario puede seleccionar cualquier medición
registrada, por ejemplo el número 58.2, que se almacena en los
medios de almacenamiento de datos como una secuencia de números,
que comprende las ordenadas para la curva PHA obtenida para el
número 58.2. La curva PHA se muestra con la curva PHA obvio que la
media de la señal es demasiado baja (ver la figura 6). La sección
inferior de la pantalla comprende tres pequeñas ventanas adyacentes,
una ventana izquierda en la cual se destaca el síntoma "señal
media demasiado baja", una ventana central que muestra la imagen
sintomática de las curvas PHA, y una ventana en el lado derecho que
muestra los detalles de los síntomas y las indicaciones, que
comprende recomendaciones para cómo remediar el pobre rendimiento.
Otros ejemplos de síntomas y recomendaciones se muestran en la
tabla 1 en las páginas 11 a 14. En la tabla inferior "comprobar
librería" es una corta anotación para comprobar la calidad de la
librería.
Las figuras 12 a 14 muestran ejemplos de
diagramas PHA para varias situaciones. Las líneas verticales 91 y
92 son los límites del lote superior e inferior para el PHA para la
muestra FMA. La curva PHA 93 en gris muestra como ha de ser de una
manera ideal el PHA, la curva obscura no 24 muestra la curva de la
muestra realmente medida.
El diagrama PHA de la figura 12 ilustra una
situación caracterizada porque la señal media es demasiado alta. El
valor de la señal media medida está fuera del límite superior del
valor medio de la señal del lote. El PHA es alto, estrecho y
asemeja el PHA del lote. Las indicaciones relacionadas con esta
situación son: el ajuste de la ganancia puede ser demasiado alto,
comprobar la ganancia en la lista de resultados, ¿ha cambiado? el
flujo de cubierta puede ser bajo, ¿se ha reducido el flujo de
cubierta? comprobar. Si el flujo es correcto: reducir ganancia.
El diagrama PHA de la figura 13 ilustra una
situación caracterizada porque la señal media es alta, el PHA es
ancho. El valor medio de la señal medida puede estar dentro o fuera
de los límites, y mayor que el valor medio de la señal del lote. El
PHA es menor y más ancho que el PHA del lote. Las indicaciones
relacionadas con esta situación son: el flujo de cubierta puede ser
bajo, ¿se ha reducido el flujo de cubierta? comprobar. Reajustar el
flujo a 10-10,5 ml/minuto en cuanto se pueda.
Finalmente ajustar la ganancia correctamente (es decir, la señal
media medida ha de estar cerca de la señal media del lote +/-
2).
El diagrama PHA de la figura 14 ilustra una
situación caracterizada porque el PHA está sesgado o doble. El
valor medio de la señal medida puede estar dentro o fuera del límite
del valor medio de la señal del lote. El PHA está sesgado o doble,
inferior y más ancho que el PHA del lote. Las indicaciones
relacionadas con esta situación son: 1) el ajuste del microscopio
no es correcto, 2) el flujo de cubierta puede no ser correcto.
Comprobar el flujo de cubierta y reajustar los es necesario a
10-10,5 ml/minuto. Reajustar el microscopio
suavemente para un PHA más estrecho y alto y ampliar la señal
promedio. Finalmente ajustar la ganancia correctamente (la señal
media medida está cerca de la señal media del lote +/- 2).
Se desprende de los ejemplos anteriores que el
procedimiento según la presente invención permite al propio usuario
realizar muchos ajustes ordinarios del instrumento. Así, se asegura
que el instrumento funcione con un rendimiento perfecto
substancialmente todo el tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
(Final de la tabla
1).
En una realización específicamente ventajosa de
la presente invención, los datos registrados y/o los parámetros
proporcionados se pueden transferir mediante un módem y medios de
comunicación adjuntos a un centro de servicio en un proveedor o
fabricante, que a cambio puede proporcionar recomendaciones para
remediar el defecto y/o enviar mensajes de corrección que controlen
los ajustes del aparato. De esta manera, también los casos difíciles
en los cuales el usuario tendería a pedir la visita de un ingeniero
de servicio se pueden controlar mediante control remoto.
\vskip1.000000\baselineskip
El diagrama PHA también proporciona una
compensación para la aglomeración de partículas en la muestra
estándar. La experiencia ha mostrado que ocasionalmente las
muestras estándar pueden incluir algunas partículas que se han
aglomerado dos a dos en dobletes, o tres a tres en tripletes. Cuanto
mayores son las partículas, mayores son las señales. En
consecuencia, el diagrama PHA puede ser como se indica en la figura
15.
La primera parte superior (101) representa
partículas simples (sencillas) en un número de 1166; la segunda
parte superior (102) representa partículas dobles (dobletes) en un
número de 429, y la tercera parte superior (103) representa
tripletes sin un número de 77. En consecuencia, el programa, es
decir, el software que controla el instrumento y evalúa las
mediciones, se puede colocar para compensar las partículas
aglomeradas mediante la adición de dobletes y tripletes dos y tres
veces, respectivamente.
La formación de dobletes y tripletes (y
posiblemente otros múltiplos) se cree que depende de la edad de las
partículas, de la agitación de la muestra, así como de la
temperatura de la muestra. Es difícil predecir la cantidad de
dobletes y tripletes en las muestras estándar y, en consecuencia, el
procedimiento de compensación anterior soluciona un problema
actual.
Es obvio para el experto en la materia que las
realizaciones según la invención descritas anteriormente se pueden
variar de diferentes maneras dentro del alcance de protección tal
como se define en las siguientes reivindicaciones de la
patente.
\vskip1.000000\baselineskip
Detalles del resultado para
58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Comprobación de Calidad
Fossomatic -
Resultados
Claims (13)
1. Procedimiento de comprobación del rendimiento
de un instrumento de citómetro de flujo (10), en cuyo instrumento
se cuenta el número de partículas o células en un flujo fluido, como
por ejemplo leche, proporcionando datos representativos de un
diagrama de altura de impulsos (PHA) de los impulsos
registrados,
caracterizado por
proporcionar un lote de muestras estándar, que
incluye solamente un tipo de microesferas substancialmente
uniformes, que proporcionan datos representativos de un diagrama PHA
óptimo (PHAO) de los impulsos registrados cuando se mide una
muestra estándar de dicho lote en un instrumento de referencia,
almacenándose dichos datos en una memoria situada en el propio
instrumento (10), o en una memoria en unos medios de procesamiento
de datos (26, 28) conectados al instrumento (10), o en unos medios
desde los cuales los datos se pueden importar al instrumento (10) o
en los medios de procesamiento de datos (26, 28) conectados al
instrumento (10), medir un estándar en el instrumento (10) que se
ha de comprobar, proporcionar datos que representan un diagrama PHA
(PHAS) para los impulsos registrados durante la medición de la
muestra estándar en el instrumento (10) que se ha de comprobar,
comparar en los medios de procesamiento de datos (26, 28) conectados
al instrumento (10) los datos que representan el diagrama PHAS con
los datos almacenados que representan el diagrama PHAO, y analizar
y/o evaluar en los medios de procesamiento de datos (26, 28)
conectados al instrumento (10) dichos datos para determinar
cualquier operación insuficiente o con fallos del instrumento
(10).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por calcular y/o proporcionar por lo menos uno
de los siguientes parámetros mediante procesamiento en los medios
de procesamiento de datos (26, 28) conectados al instrumento (10),
los datos que representan los diagramas PHA:
un recuento de partículas,
una pluralidad de recuentos de partículas sobre
la misma muestra,
un recuento medio,
una(s) desviación(es) estándar y/o
un Coeficiente de Variación (CV), basado en mediciones
repetidas/consecutivas sobre la misma muestra y substancialmente al
mismo tiempo,
un valor de señal medio, siendo la anchura de la
señal una anchura de la curva de campana en el diagrama PHA,
proporcionar los mismos datos para la muestra
estándar del fluido estándar medido en el instrumento de
referen-
cia,
cia,
comparar en los medios de procesamiento de datos
(26, 28) conectados al instrumento (10) por lo menos uno de los
parámetros anteriores para la medición real de la muestra estándar
con los correspondientes parámetros óptimos de fluido estándar
cuando se miden en un instrumento de referencia,
analizar en los medios de procesamiento de datos
(26, 28) conectados al instrumento (10) dichos datos para estimar
si el instrumento (10) está funcionando de una manera
substancialmente óptima dentro de unos límites preferentes o no
está funcionando de una manera substancialmente óptima situándose
fuera de los límites preferentes,
registrar cualquier desviación fuera de los
límites para una operación óptima.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque las microesferas no se tiñen hasta que
se aplican en el instrumento (10).
4. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque las desviaciones fuera de límites
registradas se consideran como síntomas que son indicados al
usuario mediante los medios de procesamiento de datos (26, 28).
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque un síntoma indicado al usuario mediante
los medios de procesamiento de datos (26, 28) está asociado con una
propuesta para remediar el defecto, considerado como generador del
síntoma.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado porque los datos
registrados y/o los parámetros proporcionados se transfieren
mediante un módem y unos medios de comunicación a un servicio
central en un proveedor o fabricante, que a cambio puede
proporcionar recomendaciones para remediar el defecto y/o enviar
mensajes de corrección controlando los ajustes del aparato (10).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por
analizar mediante los medios de procesamiento de
datos (26, 28) el diagrama PHAS para determinar cualquier partícula
aglomerada en la muestra estándar medida, y
si el diagrama PHAS revela otros máximos para
las señales dimensionadas por encima de la primera área en forma de
campana que comprende un primer máximo,
ajustar el número de partículas calculadas
mediante los medios de procesamiento de datos (26, 28) a partir del
área del primer máximo en el diagrama PHAS utilizando cálculos del
número de partículas son representadas mediante una segunda área
adyacente de un segundo máximo en el diagrama PHAS añadiendo el
doble del número de partículas calculadas en la segunda área al
número de partículas calculadas en la primera área.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque el número de partículas calculadas
mediante los medios de procesamiento de datos (26, 28) a partir de
las áreas del primer y segundo máximos en el diagrama PHAS se
ajustan utilizando cálculos del número de partículas representadas
mediante una tercera área adyacente de un tercer máximo en el
diagrama PHAS añadiendo tres veces el número calculado en la tercera
área al número calculado en la primera y la segunda áreas.
9. Un equipo estándar para su aplicación en el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
comprendiendo el equipo un fluido estándar que incluye una
pluralidad de microesferas substancialmente uniformes y
comprendiendo también unos medios de datos asociados para acceder a
los datos que representan información sobre las características del
fluido estándar y específicamente el contenido de las microesferas,
caracterizado porque las microesferas no están teñidas.
10. Equipo estándar según la reivindicación 9,
caracterizado porque el fluido se suministra como una serie
de muestras estándar en una pluralidad de recipientes de un tamaño
prescrito que contienen un volumen prescrito, como por ejemplo 30
ml de fluido estándar, comprendiendo el fluido agua, aditivos y una
pluralidad de esferas de plástico, y porque los medios de datos
asociados incluyen información sobre el número de esferas de
plástico existentes en el fluido.
11. Equipo estándar según cualquiera de las
reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque los medios de
datos asociados para acceder a los datos que representan
información sobre las características del fluido estándar están
adaptados para también acceder a información que comprende una
biblioteca de síntomas que indican un pobre rendimiento y
recomendaciones para cómo remediar cualquier rendimiento
insuficiente, y/o cualquier precaución que se debe tomar.
12. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado por proporcionar un valor medio acumulado (80),
y límites curvados (81, 82), cuyos límites son límites de confianza
en p% que confinan una separación que se hace más estrecha al
aumentar el número de muestras.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque el valor medio acumulado (80) y los
límites (81, 82) se normalizan dividiéndose mediante un número de
lotes (co), que es un recuento medio de lotes.
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