ES2310019T3

ES2310019T3 - Utilizacion de activadores de ppar-gamma para tratar trastornos cutaneos.

Info

Publication number: ES2310019T3
Application number: ES98965293T
Authority: ES
Inventors: Michel Rivier; Irina Safonova; Serge Michel
Original assignee: Galderma Research and Development SNC
Current assignee: Galderma Research and Development SNC
Priority date: 1997-12-31
Filing date: 1998-12-28
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2018-12-28
Also published as: CA2314607C; JP2002500179A; NZ505089A; AU2057599A; FR2773075B1; NO20003414L; FR2773075A1; ATE402698T1; JP3773790B2; CA2314607A1; WO1999034783A1; US6403656B1; AU745187B2; DE69839815D1; EP1041977A1; BR9815340A; NO325171B1; NO20003414D0; EP1041977B1

Abstract

Utilización de al menos un activador de los receptores de tipo PPAR-gamma seleccionado entre el ácido 3-{4-[2- (Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico; ácido (+)-3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico; y ácido (-)-3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico en la preparación de una composición farmacéutica, más particularmente dermatológica, siendo la composición para tratar trastornos cutáneos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas seleccionada entre psoriasis, eccema, liquen plano, lesiones de la piel asociadas a lupus, dermatitis, tales como dermatitis atópica, seborreica o solar, queratosis, tales como queratosis seborreica, senil, actínica, foto-inducida o folicular, acné vulgar, queloides, nevi, verrugas e ictiosis.

Description

Utilización de activadores de PPAR-\gamma para tratar trastornos cutáneos.

La presente invención se refiere a la utilización de al menos un activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma seleccionado entre los compuestos indicados en las reivindicaciones 1 y 8, en la preparación de una composición farmacéutica, siendo la composición para tratar los trastornos cutáneos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas seleccionada entre las enfermedades enumeradas en las reivindicaciones 1 y 8.

Existen muchos trastornos cutáneos vinculados con una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas, pueden mencionarse como ejemplo, psoriasis, eccema, dermatitis, acné vulgar, queratosis, como la ictiosis y los cánceres cutáneos. Esta anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas generalmente está acompañada por una hiperproliferación de las células epidérmicas. Para tratar estos trastornos, se han previsto diferentes enfoques farmacéuticos. Pero, actualmente ningún tratamiento da una satisfacción total. De este modo, existe una necesidad de mejorar los tratamientos existentes.

Los peroxisomas son pequeños orgánulos cercanos a las mitocondrias que contienen una serie de enzimas propias del metabolismo del agua oxigenada (catalasa, urato-oxidasa, D-aminoácido-oxidasa) y enzimas de la \beta-oxidación de los ácidos grasos. Los proliferadores de los peroxisomas son principalmente grupos de productos químicos que comprenden los hipolipidemiantes, tales como clofibrato, herbicidas y plásticos industriales, tales como los ésteres de ftalato. Estos proliferadores de los peroxisomas son carcinógenos no genotóxicos que activan a los receptores denominados PPAR, que forman parte de la super-familia de los receptores nucleares esteroideos. Estos receptores pueden ser activados por los proliferadores de peroxisomas, también pueden ser activados por ácidos grasos naturales, de este modo estimulan la expresión de los genes que codifican enzimas implicadas en la \beta-oxidación peroxisomal y mitocondrial o también la P450-4A6 \beta-hidroxidasa de los ácidos grasos.

El conjunto de referencias sugiere un papel de los PPAR en la regulación del metabolismo y la homeostasis de los lípidos. Los receptores PPAR activan la transcripción y se unen a elementos de la secuencia de ADN, llamados elementos de respuesta de los proliferadores de peroxisomas (PPRE), en forma de heterodímero con los receptores X de los retinoides (denominados RXR).

Se han identificado y descrito tres sub-tipos de PPAR humanos: PPAR\alpha, PPAR\gamma y PPAR\delta (o NUC1).

En la solicitud de patente WO 96/33724 se ha descrito que los compuestos selectivos de los PPAR\gamma, tales como una prostaglandina-J2 o -D2 son activos potenciales para el tratamiento de la obesidad o la diabetes.

Buckle et al., describen la actividad anti-hiperglucemiante de derivados benzoxazoles incluyendo el ácido 3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico. Además, este documento precisa su similitud estructural con los agonistas de PPAR-gamma tales como ciglitazona y 5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona y concluye que los derivados benzoxazoles actúan al menos parcialmente como agonistas de PPAR-gamma ("Non Thiazolidinedione antihyperglycaemic agents. 1: \alpha-heteroatom substituted \beta-phenylpropanoic acids" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 6, Nº 17, 1996, páginas 2121-2126).

Algunas tiazolidindionas incluyendo 5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona se han descrito como agonistas específicos de los receptores PPAR\gamma (Lehmann et al., "An antidiabetic thizolidinedione is a high affinity ligand for peroxisome proliferator-activated receptor \gamma", Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, Nº 22, 2 de junio de 1995, páginas 12953-12956).

Por otro lado, se ha descrito en la solicitud de patente WO 95/35108 que las tiazolidindionas, más particularmente la ciglitazona, presentan una actividad en el tratamiento de la psoriasis inhibiendo la proliferación de los queratinocitos. Finalmente, el documento WO 98/08089 describe un modelo in vitro de glándula sebácea: este modelo permite identificar compuestos para tratar trastornos vinculados a la formación del sebo. Este documento menciona también las composiciones tópicas a base de estimuladores no andrógenos tales como particularmente el agonista de PPAR-gamma 5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona para tratar trastornos resultantes de una producción insuficiente de sebo, tales como eccema, ictiosis y líquenes.

La Solicitante acaba de descubrir que, cuando la diferenciación de queratinocitos humanos se induce con una concentración elevada de calcio, el índice de expresión de los PPAR, más particularmente de PPAR\gamma, aumenta. También, la solicitante ha constatado que el índice de expresión de los PPAR, más particularmente de PPAR\gamma, en las pieles lesionadas psoriáticas se reduce de forma notable con respecto a la de las pieles no lesionadas.

De este modo, la presente invención se refiere a la utilización de al menos un activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma seleccionado entre los compuestos indicados en las reivindicaciones 1 y 8 en la preparación de una composición farmacéutica, siendo la composición para tratar trastornos cutáneos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas seleccionada entre las enfermedades enumeradas en las reivindicaciones
1 y 8.

La composición farmacéutica es, preferiblemente, una composición dermatológica.

Por activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma, se entiende de acuerdo con la invención cualquier compuesto que presenta en un ensayo de transactivación, tal como el descrito en el documento Kliewer et al., Nature 358, 771-774, 1992, una CA50 con respecto al PPAR-\gamma inferior o igual a 1 \muM.

Preferiblemente, el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma presenta una CA50 relativa a PPAR-\gamma inferior o igual a 200 nM y ventajosamente inferior o igual a 50 nM.

Preferiblemente, el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma es específico, es decir que presenta una proporción R1 de CA50 relativa a PPAR-\gamma con respecto a la CA50 relativa a PPAR\alpha inferior o igual a 10^{-1}. Preferiblemente, R1 es inferior o igual a 0,05 y más ventajosamente inferior o igual a 0,02.

Una CA50 es la concentración de compuesto "activador" necesaria para presentar el 50% de una actividad enzimática (luciferasa) indicadora de la activación debida al compuesto mediante uno de los receptores PPAR y más particularmente de tipo PPAR-\alpha o PPAR-\gamma.

Los compuestos utilizados en la presente invención son:

5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona

ácido 3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico;

ácido (+)-3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico;

ácido (-)-3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico.

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Tanto más sorprendente es que los compuestos utilizados en la presente invención traten este tipo de trastornos cutáneos, en la medida en que algunos de éstos presentan una reducida, o incluso no presentan ninguna, actividad inhibidora de la proliferación de los queratinocitos, tales como 5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona.

Preferiblemente, el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma utilizado presenta un % de inhibición de la proliferación de los queratinocitos inferior o igual al 20% cuando se utiliza a una concentración inferior o igual a 100 nM (véase el ejemplo a continuación).

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención comprende un medio fisiológicamente aceptable.

Otras características, aspectos, objetos y ventajas de la invención surgirán aún más claramente con la lectura de la siguiente descripción, así como de los diversos ejemplos concretos, pero en absoluto limitantes, que la ilustrarán.

Entre los trastornos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas, más particularmente de los queratinocitos, pueden mencionarse más particularmente psoriasis, eccema, liquen plano, lesiones de la piel asociadas a lupus, dermatitis, tales como dermatitis atópica, seborreica o solar, queratosis, tales como queratosis seborreica, senil, actínica, foto-inducida o folicular, acné vulgar, queloides, nevi, verrugas e ictiosis.

Entre los trastornos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas, se mencionan preferiblemente, las anomalías de la función barrera, tales como dermatitis atópica, eccema y psoriasis.

La administración de la composición de acuerdo con la invención puede realizarse por vía enteral, parenteral o tópica. Preferiblemente, la composición farmacéutica se envasa en una forma adecuada para una aplicación por vía tópica.

Por vía enteral, la composición, más particularmente la composición farmacéutica, puede presentarse en forma de de comprimidos, de cápsulas, de grageas, de jarabes, de suspensiones, de soluciones, de polvos, de gránulos, de emulsiones, de microesferas o naoesferas o vesículas lipídicas o poliméricas que permiten una liberación controlada. Por vía enteral, la composición puede presentarse en forma de soluciones o suspensiones para perfusión o para inyección.

Los compuestos utilizados de acuerdo con la invención se administran generalmente a una dosis diaria de aproximadamente 0,001 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal en de 1 a 3 tomas.

Por vía tópica, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es más particularmente para el tratamiento de la piel y de las mucosas y puede presentarse en forma de ungüentos, de cremas, de leches, de pomadas, de polvos, de tampones impregnados, de soluciones, de geles, de pulverizadores, de lociones o de suspensiones. Esta composición también puede presentarse en forma de microesferas o nanoesferas o vesículas lipídicas o poliméricas o de parches poliméricos y de hidrogeles que permiten una liberación controlada. Esta composición por vía tópica puede presentarse en forma anhidra o en forma acuosa.

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Las composiciones se utilizan por vía tópica a una concentración generalmente comprendida entre el 0,001% y el 10% en peso, preferiblemente entre el 0,01 y el 1% en peso, con respecto al peso total de la composición.

Las composiciones tales como se han descrito anteriormente pueden contener además, por supuesto, aditivos inertes o incluso farmacodinámicamente activos o combinaciones de estos aditivos y particularmente: agentes humectantes; agentes despigmentantes tales como hidroquinona, ácido azelaico, ácido cafeico o ácido kójico; emolientes; agentes hidratantes como glicerol, PEG 400, tiamorfolinona y sus derivados o también la urea; agentes anti-seborreicos o anti-acné, tales como S-carboximetilcisteína, S-bencil-cisteamina, sus sales o sus derivados o el peróxido de benzoílo; agentes antifúngicos tales como ketoconazol o las polimetilen-4,5 isotiazolidonas-3; antibacterianos, carotenoides y, particularmente, \beta-caroteno; agentes anti-psoriáticos tales como antralina y sus derivados; los ácidos eicosa-5,8,11,14-tetranoico y eicosa-5,8,11-triinoico, sus ésteres y amidas y finalmente los retinoides.

Estas composiciones también pueden contener agentes de mejora del sabor, agentes conservantes tales como los ésteres del ácido parahidroxibenzoico, agentes estabilizantes, agentes reguladores de la humedad, agentes reguladores del pH, agentes modificadores de la presión osmótica, agentes emulsionantes, fibras UV-A y UV-B, antioxidantes, tales como \alpha-alfatocoferol, butilhidroxianisol o butilhidroxitolueno.

Por supuesto, el especialista en la técnica se encargará de seleccionar el o los eventuales compuestos a añadir a estas composiciones de tal manera que las propiedades ventajosas vinculadas intrínsecamente a la presente invención no se alteren o no se alteren sustancialmente por la adición prevista.

A continuación se proporcionarán, a título en absoluto limitante, varios ejemplos que ilustrarán la presente invención.

Ejemplo 1 CA50 y R1 de los productos activadores de PPAR\gamma tales como se han descrito anteriormente

El método utilizado para determinar las CA50 es el descrito por Kliewer et al., Nature 358, 771-774, 1992. De este modo, el poder activador de moléculas mediante PPAR\gamma o PPAR\alpha puede evaluarse con un ensayo de transactivación en el que se han cotransfectado células HeLa con un vector de expresión que codifica estos receptores y un plásmido informador que contiene un elemento de respuesta PPRE dado cadena arriba de una parte del promotor del virus SV40 y del gen de luciferasa. Las células cotransfectadas se tratan durante 24 horas con las moléculas a ensayar y la actividad de la luciferasa se determina mediante luminiscencia.

La tabla 1 reúne los resultados. Para cada molécula, los resultados se expresan en nM por el valor de CA50 que representa por lo tanto la concentración de molécula a ensayar que proporciona el 50% de la actividad máxima.

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TABLA 1

1

Ejemplo 2 Determinación de la proliferación de los queratinocitos

Los queratinocitos utilizados se han obtenido a partir de muestra de piel procedente de cirugía plástica. Se utilizan en el segundo paso.

Los queratinocitos se cultivan a 37ºC en una atmósfera húmeda (5% de CO2) de acuerdo con el método de Rheinwald y Green en presencia de fibroblastos 3T3 tratados con mitocina en medio MEM que contiene el 10% de suero fetal de ternero (SFT), 0,4 \mug/ml de hidrocortisona, 10 ng/ml de EGF y 10^{-9} M de toxina del cólera. Las células 3T3 se siembran 24 horas antes que los queratinocitos a razón de 15000 células por cm^{2} en pocillos cluster de 10 cm^{2}. A continuación, se siembran los queratinocitos a razón de 4000 células por cm^{2}.

Las células se tratan 4 horas después de la siembra de los queratinocitos con los productos diluidos en DMSO. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo no supera el 0,2% (v/v). Después de tres días de cultivo, la solución de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU, cell proliferation kit de Boehringer ref 1 674629) diluida a 1/100 se añade al medio de cultivo.

Después de la desnaturalización del ADN, se añade el anticuerpo anti- BrdU-POD (peroxidasa) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 1 hora de incubación, la solución de sustrato se añade y se realiza la lectura de la densidad óptica a 370 nM en un lector ELISA.

De este modo, el compuesto A descrito en el ejemplo 1 presenta un % de inhibición de la proliferación de los queratinocitos inferior o igual al 20% cuando se utiliza a una concentración inferior o igual a 100 nM.

Ejemplo 3 Materiales y métodos Condiciones de cultivo de las células

Los queratinocitos humanos normales (QHN) se han aislado de la piel humana obtenida después de una cirugía plástica y se han cultivado mediante el método de Rheinwald y Green (Rheinwald J.G. y Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975, 6, 331-343). Las células se han cultivado en un medio completo (MCDB 153) que contiene 0,5 mM de CaCl_{2}. El medio completo MCDB 153 está constituido por un medio basal (KMB, Clonetics, San Diego, CA) al que se ha añadido el 0,4% (v/v) de extracto de pituitaria bovina, 5 \mug/ml de insulina y 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF). Cuando las células han alcanzado aproximadamente el 60% de confluencia (día 0), el medio se sustituye por un medio completo MCDB 153 que contiene 0,15 mM de CaCl_{2} (medio de bajo contenido en calcio) o 1,15 mM de CaCl_{2} (medio de alto contenido en calcio). El medio se cambia cada dos días.

Epidermis reconstruida sobre un equivalente dérmico de colágeno de tipo I

Las células de la epidermis interfolicular adulta, aisladas de la piel del seno humano obtenida después de una cirugía plástica, se han amplificado (Rheinwald J.G. y Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975, 6, 331-343) y almacenado en nitrógeno líquido. Las células se han descongelado y sembrado en un equivalente de dermis de colágeno de tipo I (Asselineau, D., Bernard, B.D. y Darmon, M. Three-dimensional culture of human keratinocytes on a dermal equivalent. A model to study epidermal morphogenesis and differentiation in vitro. En: Maibach, H., Lowe, N. (eds.) Models in Dermatology. Karger, Baset, 1987, 1987, 1-7). Los cultivos se han almacenado en un primer momento sumergidos en el medio de cultivo durante una semana para obtener una monocapa confluyente (día 0) y a continuación se han puesto en el interfaz aire-líquido para producir un epitelio estratificado y queratinizado. El medio de cultivo ha consistido en un medio mínimo esencial (MEM) al que se la ha añadido el 10% (v/v) de suero fetal de ternero, EGF (10 ng/ml), hidrocortisona (0,4 \mug/ml) y una toxina de cólera (10^{-9} M). Se ha cambiado el medio tres veces por semana.

La morfología de la piel reconstruida se ha evaluado tiñendo cortes verticales parafinizados con hemalun-phloxin-saffron.

Biopsias

Se han obtenido biopsias a partir de piel psoriática implicada y no implicada después del consentimiento de los pacientes. Las biopsias se han sumergido inmediatamente en una solución de extracción de ARN (tiocianato de guanidio 4 M). A continuación se han congelado en nitrógeno líquido y se han almacenado a -80ºC hasta su utilización.

Aislamiento de los ARN

Todos los ARN procedentes de los queratinocitos en cultivo o de piel reconstruida se han aislado utilizando el método del Trizol (Gibco BRL), de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se han almacenado a -80ºC hasta su utilización. Todos los ARN procedentes de las biopsias de piel se han preparado tal como se ha descrito por Chomczynski y Saachi (Chomczynski, P. y Saachi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extration. Anal. Biochem., 1987, 162, 156-159).

RT-PCR y PCR semi-cuantitativa

Los oligonucleótidos de PCR fueron sintetizados por Gibco BRL (Francia) y tienen la secuencia descrita a continuación:

oligonucleótido sentido GAPDH (5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3) y oligonucleótido antisentido (5'GTCAT
CATATTTGGCAGGTT-3'); oligonucleótido sentido para PPAR\alpha (5'-TCATCAAGAAGACGGAGTCG-3') y oligonucleótido antisentido (5'-CGGTTACCTACAGCTCAGAC-3'); oligonucleótido sentido para PPAR\gamma (5'-ATGA
CAGCGAACTTGGCAATA-3') y oligonucleótido antisentido (5'-CGAACTGGAAGAAGGGAAAT-3'); oligo-
nucleótido sentido para queratina 1 (5'-AGTTCCAGCGTGAGGTTTGT-3') y oligonucleótido antisentido (5'-GG
GACTGAGATTGCCACTGA-3'); oligonucleótido sentido para loricrina (5'-ACCACGGAGGCCGAAGGAGTT-3') oligonucleótido antisentido (5'-CTGGGGTTGGGAGGAGGTAGTTG-3'); oligonucleótido sentido para transglutaminasa de tipo I (TGI) (5'-GCGGCAGGAGTATGTTCTTA-3') y oligonucleótido antisentido (5'-AGGGATGTGTCT
GTGTCGTG-3'). Los productos amplificados son iguales a 558 pb para GAPDH; 211, 287 y 341 para PPAR\alpha, \delta y \gamma, respectivamente; 250 pb para la queratina 1; 189 pb para la loricrina y 444 pb para la TGI.

La RT-PCR se ha realizado utilizando 5 \mug de los ARN extraídos de células cultivadas, de pieles reconstruidas o de biopsias de piel. Después de las desnaturalización en agua tratada con dietilpirocarbonato durante 10 minutos a 70ºC, los ARN se han transcrito de forma inversa a ADNc utilizando el kit "SuperScript II RNase H- reverse transcriptase" (10 unidades/reacción, Gibco BRL) y 0,5 \mug de oligo(dT) como cebador, a 42ºC durante 50 minutos, para un volumen de tampón total de 20 \mul (Tris-HCl 20 mM, pH 8,4 - KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 1 mM, DTT 10 mM, 20 unidades de inhibidor de RNase). La mezcla se ha inactivado a 70ºC durante 15 minutos y se ha tratado con RNaseH a 37ºC durante 20 minutos. En cada caso, se han incluido muestras que no contenían ninguna transcriptasa inversa (control negativo). La amplificación por PCR se ha realizado con un aparato de PTC (MJ Research), después de un periodo de un minuto de desnaturalización a 94ºC, en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, apareamiento a 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 30 segundos, en un total de 30 ciclos.

La mezcla de reacción contiene 20 mM de Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, 0,1 \muM de cebadores de oligonucleótidos, 100 \muM de dNTP, 0,5 unidades de Polymerase DNA Taq y 5 \mul de la mezcla de ADNc diluido a 1/100. El producto final se ha calentado durante 3 minutos a 72ºC. En cada caso, se han incluido controles positivos de RT (que contenían ADNc que codifica los PPAR) y un control negativo de PCR (sin ADN). Los productos de PCR se han separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% que contenía 1 \mug/ml de bromuro de etidio, se han fotografiado y su identidad se ha confirmado mediante transferencia de Southern.

La PCR semi-cuantitativa se ha realizado como se ha descrito anteriormente, excepto que las concentraciones de dNTP han sido de 100 \muM de dATP, dGTP, dTTO, 10 \muM de dCTP, 0,5 \muCi de [32P] dCTP. Los productos de PCR se han separado a continuación con geles de acrilamida al 6% (peso/v). La radiactividad de cada banda se ha cuantificado mediante la técnica de autorradiografía (phosphorimaging). Las pantallas se han seleccionado (scanned) utilizando un aparato FUJI BAS 2000 y la señal se ha cuantificado en unidades LPS (Photo Stimulating Luminescence) utilizando un programa de análisis de imágenes (Tina). Los resultados se han analizado para cada muestra comparando la intensidad de la banda con la de GAPDH. Se ha determinado un número óptimo de ciclos de PCR en la región de amplificación lineal. La mezcla de ADNc se ha diluido de 10 en 10 para controlar la correlación lineal entre la intensidad de la señal radiactiva y la cantidad inicial de ADN.

Resultados

Los primeros experimentos, que utilizan el análisis por transferencia de Northern de ARN totales procedentes de QHN en cultivo, han demostrado que PPAR\delta está presente en cantidades casi iguales en los queratinocitos no diferenciados y diferenciados, mientras que los PPAR\alpha y -\gamma no se han detectado.

Para analizar la expresión de los PPAR, el análisis por RT-PCR se ha realizado utilizando oligonucleótidos específicos de los sub-tipos de PPAR. Los productos de PCR de 211 pb, 287 pb y 341 pb que corresponden respectivamente al PPAR\alpha, -\delta y -\gamma se han obtenido después de la electroforesis. La especificidad de los productos de PCR se ha verificado utilizando plásmidos que contienen los ADNc que codifican los PPAR. Además, se ha realizado el análisis de transferencia de Southern para identificar los productos de PCR. Se han detectado los tres sub-tipos de PPAR a la vez en los QHN no diferenciados obtenidos al 60% de confluencia en un medio de bajo contenido en calcio y en los QHN diferenciados obtenidos después de 4 días de cultivo en un medio de alto contenido en calcio.

A continuación, se ha realizado el análisis semi-cuantitativo de PCR para comparar el nivel de expresión de los sub-tipos de PPAR en los QHN cultivados en un medio de bajo contenido en calcio o en un medio de alto contenido en calcio. La expresión del gen de PPAR\alpha aumenta lentamente en un medio de bajo contenido en calcio del día 0 al día 4 (1,7 veces) y en un medio de alto contenido en calcio (2,6 veces). Después de 4 días, la expresión del gen de PPAR\delta ha aumentado tanto en los medios de bajo contenido en calcio como en los de alto contenido en calcio (4,5 y 5,8 veces respectivamente). El nivel de expresión del gen de PPAR\gamma sigue sin cambios durante 4 días en un medio de bajo contenido en calcio, mientras que aumenta de manera sorprendente entre el 3^{er} y el 4º día después de que las células se hayan cultivado en un medio de alto contenido en calcio (4,5 veces).

Como la diferenciación de los queratinocitos es incompleta en condiciones de cultivo sumergidas, se ha utilizado la piel reconstruida in vitro que muestra una estratificación y una queratinización de la epidermis más completa, para estudiar la expresión de PPAR. 2 días después de la emersión, únicamente están presentes dos o tres capas de queratinocitos, 2 días más tarde, los queratinocitos se organizan en un fino epitelio de múltiples capas, mientras que al cabo de 7 días, la epidermis está constituida por un epitelio que se asemeja a la epidermis humana normal. Los estudios por inmunofluorescencia han demostrado que los marcadores de diferenciación, tales como involucrina, filagrina y TGI (transglutaminasa I), se expresan y localizan tal como se ha descrito en el documento Asselineau, D., Bernard, B.D. y Darmon, M. Three-dimensional culture of human keratinocytes on a dermal equivalent. A model to study epidermal morphogenesis and differentiation in vitro. En: Maibach, H., Lowe, N. (eds.) Models in Dermatology. Karger, Basel, 1987, 1-7.

El nivel de expresión de los tres sub-tipos de PPAR durante la reconstrucción de la epidermis es el siguiente:

El ARN de PPAR\alpha aumenta ligeramente (2 veces) después de 7 días de emersión. El nivel de PPAR\delta permanece constante del día 0 al día 7. Por el contrario, la expresión de PPAR\gamma aumenta 7 veces entre el día 0 y el día 7.

El modo de expresión de los sub-tipos de PPAR durante la reconstrucción de la piel se ha comparado con el de los marcadores de diferenciación del queratinocito. La expresión máxima de la queratina 1, de la loricrina y de la TGI se ha observado 7 días después de la emersión.

Para analizar la expresión de los sub-tipos de PPAR en la piel humana, los ARN totales se han preparado a partir de epidermis psoriática no lesionada o lesionada y sometida al análisis semi-cuantitativo de RT-PCR. La expresión de PPAR\alpha simplemente disminuye ligeramente en la piel lesionada, mientras que la expresión de PPAR\gamma disminuye considerablemente (aproximadamente 3,5 veces). Sin embargo, la expresión de PPAR\delta aumenta en la epidermis lesionada con respecto a la epidermis no lesionada.

Discusión

Los tres sub-tipos de PPAR se han descrito en anfibios, roedores y seres humanos (Issemann, I. y Green, S. Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. 1990, Nature, 347, 647-650 - Sher, T., Yi, H.-F., McBride, O.W. y Gonzalez, F.J. cDNA cloning, chromosomal mapping, and functional characterization of the human peroxisome proliferator activated receptor. Biochemistry, 1993, 32, 5598-5604 - Zhu, Y., Alvares, K., Huang, Q., Rao, H.S. y Reddy, J.K. Cloning of a new member of the peroxisome proliferator-activated receptor gene family from mouse liver. J. Biol. Chem., 1993, 268, 26817-26280 - Greene, M.E., Blumberg, B. McBride, O.W., Yi, H.F., Kronquist, K., Kwan, K., Hsieh, L., Greene, G. y Nimer, S.D. Isolation of the human peroxisome proliferator activated receptor gamma cDNA: expression in hematopoietic cells and chromosomal mapping. Gene Expression, 1995, 4, 281-299 - Elbrecht, A., Chen, Y., Cullinan, C.A., Hayes, N., Leibowitz, M.D., Moller, D.E. y Berger, J. Molecular cloning, expression and characterization of human 1 and \gamma2. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1996, 224, 431-437 - Lambe, K.G. y Tugwood, J.D. A human peroxisome-proliferator-activated receptor-\gamma is activated by inducers of adipogenesis, including thiasolidinedione drugs Eur. J. Biochem., 1996, 239, 1-7 - Schmidt, A., Endo, N., Rutledge, S.J., Vogel, R., Shinar, D. y Rodan, G.A. Identification of a new member of a steroid hormone receptor superfamily that is activated by a peroxisome proliferator and fatty acids. Mol. Endocrinol., 1992, 6, 1634-1641 - Kliewer, S.A., Forman, B.M., Blumberg, B., Ong, E.S., Borgmeyer, U., Magelsdorf, D.J., Umesoto, K. y Evans, R.M. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 7355-7359 - Amri, E.Z, Bonino F., Ailhaud, G., Abumrad, N.A. y Grimaldi, P.A. Cloning of a protein that mediated transcripcional effects of fatty acids in preadipocytes. J. Biol. Chem., 1995, 270, 2367-2371 - Dreyer, C., Krey, G., Keller, H., Givel, F., Helftenbein, G. y Wahli, W. Control of the peroxisomal beta-oxydation pathway by a novel family of nuclear hormone receptors. Cell, 1992, 68, 879-887). PPAR\alpha se expresa fuertemente en tejidos que muestran un nivel elevado de oxidación de los ácidos grasos y de metabolismo peroxisomal tal como el hígado, corazón, riñón e intestino. PPAR\delta se expresa abundantemente y de manera omnipresente, mientras que la expresión de PPAR\gamma se encuentra de manera predominante en tejidos que presentan una lipogénesis activa tales como el tejido adiposo blanco pero también se encuentra en las células del sistema inmunitario (Issemann, I. y Green, S. activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators. 1990, Nature, 347, 647-650 - Kliewer, S.A., Forman, B.M., Blumberg, B., Ong, E.S., Borgmeyer, U., Magelsdorf, D.J., Umesoto, K. y Evans, R.M. Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 7355-7359 - Lehmann, J.M., Moore, L.B., Smih-Oliver, T.A., Wilkinson, W.O., Wilson, T.M. y Kliewer, S.A. An antidiabetic thiasolidinedione is a high affinity ligand for peroxisome proliferator activated receptors \gamma (PPAR\gamma) J. Biol. Chem., 1995, 270, 12953-12956 - Braissant, O., Foufelle, F., Scotto, C., Dauca, M y Wahli, W. Differential expression of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs): tissue distribution of PPAR-\alpha, -\beta and -\gamma in the adult rat, Endocrinology, 1996, 137, 354-366 - Tontonoz, P., Hu, E., Graves. R:A., Budavari, A.I. y Spiegelman, B.M. mPPAR\gamma2n tissue-specific regulator o fan adipocyte enhancer. Genes Dev., 1994, 8, 1224-1234). La distribución específica tisular de los tres sub-tipos de PPAR podría explicar su diferente acción fisiológica. El PPAR\alpha y el PPAR\gamma parecen regular las dos ramas de la homeostasis lipídica, es decir respectivamente el catabolismo de los ácidos grasos y la lipogénesis. Mientras que la omnipresente expresión de PPAR\delta sugiere una función biológica general pero que sigue siendo desconocida.

El proceso de diferenciación de los queratinocitos de la epidermis está acompañado por una acumulación de lípidos específicos responsables de la formación de la función barrera de la epidermis. Sin embargo, se sabe muy poco sobre el nivel de expresión y el papel de los sub-tipos de PPAR en la epidermis. Un estudio reciente ha demostrado que la expresión constitutiva de un mutante dominante negativo de RAR\alpha en las células suprabasales de la epidermis de un ratón da como resultado una función barrera de la piel disminuida (Imakado, S., Bickenbach, J.R., Bundman, D.S., Rothnagel, J.A., Attar, P.S., Wang, X.-J., Walczak, V.R., Wisniewski, S., Pote, J., Gordon, J.S., Heyman, R.A., Evans, R.M. y Roop, D.R. Targeting expression of a dominant-negative retinoic acid receptor mutant in the epidermis of transgenic mice results in loss of barrier function. Genes Dev., 1995, 9, 317-329). Se ha sugerido que el RAR\alpha mutado es capaz de secuestrar el RXR que es necesario para la formación del heterodímero PPAR-RXR (Keller, H., Dreyer, C., Medin, J., Mahfoudi, A., Ozato, K. y Wahli, W. Fatty acids and retinoids control lipid metabolism through activation of peroxisome proliferator-activated receptor - retinoid X receptor heterodimers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993: 90; 2160-2164 - Isserman, I., Prince, R.A. Tugwood, J.D. y Green, S. The retinoid X receptor enhances the function of the peroxisome proliferator activated receptor. Biochimie, 1993, 75, 251-256). Esto implica que la inactivación de PPAR\alpha es en parte responsable de la pérdida de la función barrera de la epidermis en ratones transgénicos.

De este modo, en este documento se demuestra que los tres sub-tipos de PPAR se expresan en queratinocitos humanos. PPAR\delta muestra el nivel más elevado de expresión, mientras que PPAR\alpha y PPAR\gamma se expresan a un nivel muy reducido. La ausencia de expresión del gen de PPAR, presentada en los queratinocitos interfoliculares de rata (Braissant, O., Foufelle, F., Scotto, C., Dauca, M y Wahli, W. Differential expression of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs): tissue distribution of PPAR-\alpha, -\beta and -\gamma in the adult rat, Endocrinology, 1996, 137, 354-366), puede deberse a la insuficiente sensibilidad de la técnica de hibridación y/o a la diferencia de las especies estudiadas.

Nuestros resultados demuestran claramente que la expresión de PPAR\gamma y, en cierta medida, la de PPAR\alpha está vinculada a la diferenciación de los queratinocitos. La expresión de PPAR\gamma en los QHN cultivados durante cuatro días en un medio de alto contenido en calcio aumenta sensiblemente.

Esta observación se ha confirmado utilizando un modelo de piel reconstruida, en el que la expresión de PPAR\gamma aumenta durante la estratificación y la queratinización de la epidermis. La expresión de PPAR se ha comparado con el aumento de los diferentes marcadores (queratina 1, TGI y loricrina), particularmente expresados en el compartimento suprabasal de la epidermis normal. Esto sugiere en gran medida que la expresión de PPAR-\gamma tiene lugar en las capas suprabasales de la epidermis humana y está vinculada a la diferenciación de los QHN.

La expresión de los sub-tipos de PPAR se ha determinado también en epidermis psoriáticas lesionadas y no lesionadas. Se ha observado una disminución de los niveles de PPAR\alpha y PPAR\gamma en la epidermis lesionada hiperproliferativa, lo que demuestra, una vez más, que la expresión de los dos sub-tipos depende del estado de diferenciación de la epidermis. La expresión de PPAR\delta aumenta en las epidermis lesionadas, lo que sugiere que la expresión de este sub-tipo podría estar asociada a la proliferación de los queratinocitos.

En conclusión, se ha demostrado que utilizando cultivos sumergidos o expuestos al aire, la expresión de los genes de PPAR\alpha y \gamma aumenta durante la diferenciación de los queratinocitos, mientras que la expresión de PPAR\delta no se modifica. En la epidermis psoriática hiperproliferativa, la expresión de PPAR-\gamma disminuye, lo que demuestra que este sub-tipo está vinculado con la diferenciación de los queratinocitos.

Claims

1. Utilización de al menos un activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma seleccionado entre el ácido 3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico; ácido (+)-3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-
etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico; y ácido (-)-3-{4-[2-(Benzoxazol-2-il-metil-amino)-etoxi]-fenil}-2-etoxi-propiónico en la preparación de una composición farmacéutica, más particularmente dermatológica, siendo la composición para tratar trastornos cutáneos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas seleccionada entre psoriasis, eccema, liquen plano, lesiones de la piel asociadas a lupus, dermatitis, tales como dermatitis atópica, seborreica o solar, queratosis, tales como queratosis seborreica, senil, actínica, foto-inducida o folicular, acné vulgar, queloides, nevi, verrugas e ictiosis.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma presenta una CA50 con respecto al PPAR-\gamma inferior o igual a 200 nM y ventajosamente inferior o igual a 50 nM.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma es específico.

4. Utilización de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma presenta una proporción R1 de CA50 relativa a PPAR-\gamma con respecto a la CA50 relativa a PPAR\alpha inferior o igual a 0,05, ventajosamente inferior o igual a 0,02.

5. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma utilizado presenta un % de inhibición de la proliferación de los queratinocitos inferior o igual al 20% cuando se utiliza a una concentración inferior o igual a 100 nM.

6. Utilización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición farmacéutica está envasada en una forma adecuada para una aplicación por vía tópica.

7. Utilización de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque el activador de los receptores de tipo PPAR-\gamma se utiliza a una concentración comprendida generalmente entre el 0,001% y el 10% en peso, preferiblemente entre el 0,01 y el 1% en peso, con respecto al peso total de la composición.

8. Utilización de 5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona en la preparación de una composición farmacéutica tópica, más particularmente dermatológica, siendo la composición para tratar trastornos cutáneos vinculados a una anomalía de la diferenciación de las células epidérmicas seleccionada entre psoriasis, eccema, liquen plano, lesiones de la piel asociadas a lupus, dermatitis, tales como dermatitis atópica, seborreica o solar, queratosis, tales como queratosis seborreica, senil, actínica, foto-inducida o folicular, acné vulgar, queloides, nevi, verrugas e ictiosis, utilizándose dicha 5-{4-[2-(metil-piridin-2-il-amino)-etoxi]-bencil}-tiazolidin-2,4-diona a una concentración comprendida generalmente entre el 0,001% y el 10% en peso, preferiblemente entre el 0,01 y el 1% en peso, con respecto al peso total de la composición.