ES2310237T3 - Amplificacion por recombinasa polimerasa. - Google Patents
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Abstract
Un proceso de RPA para la amplificación de ADN de una secuencia diana bicatenaria, comprendiendo dicha secuencia diana una primera y una segunda cadena de ADN, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un agente recombinasa con un primer y un segundo cebador de ácido nucleico en presencia de ATP, RecO, RecR y RecF para formar un primer y segundo cebador de nucleoproteína; (b) poner en contacto el primer y segundo cebador de nucleoproteína con dicha secuencia diana bicatenaria formando así una primera estructura bicatenaria en una primera parte de dicha primera cadena y formando una estructura bicatenaria en una segunda parte de dicha segunda cadena de manera que los extremos 3'' de dicho primer cebador de ácido nucleico y dicho segundo cebador de ácido nucleico están orientados uno hacia el otro en la misma molécula de ácido nucleico molde; (c) extender el extremo 3'' de dicho primer y segundo cebador de nucleoproteína con una o más polimerasas y dNTP para generar un primer y segundo ácido nucleico bicatenario y una primera y segunda cadena de ácido nucleico desplazada; (d) continuar la reacción mediante la repetición de (b) y (c) hasta que se alcance un grado de amplificación deseado en el que el agente recombinasa es la proteína RecA y en el que dicho primer o dicho segundo cebador de ácido nucleico está marcado con un resto detectable.
Description
Amplificación por recombinasa polimerasa.
La capacidad de amplificar ADN es un aspecto
central de la investigación biológica y médica moderna. Esto se
debe a que la mayoría de las técnicas de biología molecular cuentan
con muestras que contienen muchas moléculas idénticas para
incrementar la sensibilidad de un ensayo o para preparar material
suficiente para un procesamiento adicional. De entre las diferentes
técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) es la más habitual debido a su sensibilidad
y eficacia en la amplificación de secuencias cortas de ácidos
nucleicos.
Aunque la PCR es de gran utilidad, también está
limitada de diferentes formas. La primera limitación de la PCR es
que se basa en múltiples ciclos de fusión térmica
(desnaturalización) a temperaturas altas seguido de hibridación y
elongación a una temperatura reducida. Para maximizar la eficacia y
para minimizar el ruido, se requiere un control complejo de la
temperatura de múltiples reacciones. Esto necesita la utilización de
un bloque termociclador controlable con un
calentamiento/enfriamiento rápido hecho con material exótico (por
ejemplo, bloques de plata chapados en oro) o un mecanismo robótico
para mover las muestras entre zonas con temperatura controlada.
Debido a la alta temperatura requerida para fundir el ADN en
condiciones fisiológicas de sal, la tecnología PCR requiere bien la
adición de polimerasa fresca por ciclo o la utilización de
polimerasas termoestables. El método que implica la adición de
polimerasa fresca no ha sido automatizado y es, por lo tanto,
laborioso y tendente a errores (por ejemplo, contaminación, caída de
tubos, errores de etiquetado). Además, la necesidad de añadir
enzimas y de mezclar cada reacción individualmente presenta serios
inconvenientes que han limitado la adaptación de los métodos de PCR
con adición de enzima a pequeña escala.
Comparada con los métodos que implican la
adición de polimerasa fresca, la utilización de polimerasas
termoestables en PCR es lo que se utiliza más ampliamente. Este
método adolece del hecho de que las polimerasas termoestables se
encuentran en un número limitado de organismos y que los mecanismos
de replicación utilizados por organismos termofílicos son poco
conocidos. El repertorio disponible de polimerasas termoestables
está limitado a enzimas polimerasas con un único polipéptido
implicadas en la reparación del ADN y/o en la síntesis de la cadena
retardada. Las polimerasas de la reparación del ADN y/o de la
cadena retardada son malas elecciones para la amplificación del ADN
porque exhiben una procesividad pobre (síntesis distributiva). En
parte como consecuencia de la utilización de polimerasas de
reparación y/o de cadena retardada (por ejemplo, polimerasas Taq,
Pfu, Vent) y debido a la formación de estructuras secundarias o
terciarias de ácidos nucleicos inhibidoras después de la fusión
térmica, los protocolos actuales de PCR no amplifican fácilmente
secuencias más largas de varios millares de pares de bases. La
síntesis (y amplificación) eficaz de moldes más largos se basará en
polimerasas y complejos enzimáticos auxiliares que exhiban en
conjunto unos niveles mucho más altos de procesividad,
desplazamiento de cadena y resolución de estructura secundaria, así
como que limiten la formación de estructuras de ácidos nucleicos de
un orden mayor inhibidoras que pueden formarse en el enfriamiento
del ADN desnaturalizado con calor.
Una segunda limitación de la PCR es que se basa
en la hibridación en disolución entre oligonucleótidos (cebadores
de PCR) y ADN molde desnaturalizado (es decir, el ADN que se quiere
amplificar) en un entorno acuoso. Para ser eficaces, las reacciones
de PCR se llevan a cabo en un tiempo corto porque la actividad de
las polimerasas termoestables disminuye rápidamente a las
temperaturas de la PCR. Además, para conseguir una hibridación
eficaz en un tiempo corto, una característica crítica para un
cambio rápido, es necesario llevar a cabo la PCR en un entorno con
concentraciones altas de oligonucleótidos. La concentración alta de
oligonucleótidos también asegura una interacción rápida de las
secuencias diana con los oligonucleótidos que compiten con la cadena
complementaria desnaturalizada con calor que todavía está presente
en la disolución. Las concentraciones altas de cebadores
oligonucleotídicos pueden causar problemas, particularmente cuando
el número de copias de la secuencia diana es bajo y está presente
en una mezcla compleja de moléculas de ADN. Éste sería el caso, por
ejemplo, de una PCR de un genoma para determinar el polimorfismo
genético en un locus.
Un problema con la utilización de
concentraciones altas de oligonucleótidos es que incrementa el grado
de cebado erróneo en secuencias sólo parcialmente complementarias
en la mezcla compleja de ADN. El cebado erróneo se refiere a la
hibridación de un cebador con un ADN molde en PCR incluso cuando la
secuencia cebadora no es completamente complementaria al ácido
nucleico molde, lo que puede dar lugar a una amplificación no
específica de ácidos nucleicos. El ruido, debido al cebado erróneo,
se incrementa con la concentración de oligonucleótidos y la
complejidad del ADN inicial total. Además, la posibilidad de cebado
erróneo se incrementa al disminuir el número de copias de las
secuencias diana. Cuando las condiciones para el cebado erróneo son
favorables (es decir, concentración alta de oligonucleótidos,
complejidad alta, número bajo de copias), las secuencias
amplificadas erróneas pueden convertirse en un producto dominante de
la reacción. Consecuentemente, puede ser difícil identificar las
condiciones, y los oligonucleótidos, para una amplificación limpia
de las secuencias diana de una muestra de ADN sin un exceso de
cebado erróneo basal. Así, una desventaja adicional de utilizar la
PCR es el éxito limitado para la amplificación limpia de ADN dianas
raros a partir de mezclas complejas de secuencias.
Una solución a los problemas de especificidad y
al problema de fusión del molde en los que incurre la PCR es
emplear métodos basados en las propiedades biológicas de la proteína
bacteriana RecA o sus equivalentes procariotas y eucariotas. Estas
proteínas recubren ADN monocatenarios (ADNss) para formar
filamentos, que buscan en los ADN bicatenarios (ADNds) regiones con
homología de secuencia. Cuando se localizan secuencias homólogas,
la cadena de filamento nucleoproteico invade el ADNds creando un
híbrido corto y una burbuja en la cadena desplazada conocida como
bucle D. El extremo 3' libre de la cadena del filamento en el bucle
D puede ser extendida por las ADN polimerasas para sintetizar una
nueva cadena complementaria. La cadena complementaria desplaza a la
cadena originalmente hibridada al elongarse. Mediante la utilización
de pares de oligonucleótidos de una manera similar a la utilizada
en PCR sería posible amplificar secuencias de ADN diana de una forma
análoga pero sin ningún requerimiento de fusión térmica
(termociclado). Esto tiene la ventaja tanto de permitir la
utilización de polimerasas sensibles al calor que previamente no
podían utilizarse en PCR como de incrementar la fidelidad y
sensibilidad mediante la exploración del molde y la invasión de
cadena en lugar de la hibridación.
Aunque la utilización de RecA y de sus
homólogos para la amplificación in vitro de ácidos nucleicos
se ha descrito previamente (Patente de EEUU 5.223.414 de Zarling
et al., referida en la presente memoria como
"Zarling"), el método y los resultados están limitados. El
método de Zarling tiene fallos críticos, que han limitado su
capacidad de conseguir la amplificación exponencial de ADN
bicatenario. El fracaso del método de Zarling para conseguir la
amplificación exponencial puede deberse a su especificación para
utilizar ATP\gammaS en lugar de ATP. El método de Zarling
recomienda la utilización de ATP\gammaS en lugar de ATP en el
ensamblaje de los filamentos nucleoproteicos de RecA porque resulta
en una estructura de filamento RecA/ADNss más estable. Normalmente,
los filamentos se ensamblan en una dirección 5' a 3' y se
desensamblan espontáneamente en la misma dirección 5' a 3' al
hidrolizar RecA el ATP. Este proceso es dinámico porque el
ensamblaje y desensamblaje ocurren al mismo tiempo y la cantidad de
filamentos ensamblados está en equilibrio. Si se utiliza el análogo
de ATP no hidrolizable, ATP\gammaS, se inhibe la hidrólisis de
ATP\gammaS y el desensamblaje de 5' a 3' de los filamentos. La
gran estabilidad de los filamentos RecA/ATP\gammaS, tanto antes
como después del intercambio de cadena, aunque es útil en el método
de búsqueda de dianas (es decir, el método Zarling), es perjudicial
y nada práctico para la amplificación de ADN.
En el método Zarling, la proteína RecA implicada
en la invasión de cadena permanecerá asociada con la parte
bicatenaria del material intercambiado después del intercambio de
cadena. Esta interacción ocurre porque el nuevo dúplex formado está
unido al sitio de alta afinidad de RecA. La cadena desplazada ocupa
un sitio diferente de baja afinidad, a no ser que se una a otra
proteína de unión de ADN monocatenario (SSB), tal como SSB de E.
coli. Si se había utilizado ATP para generar la estructura de
intercambio, puede ocurrir un desensamblaje espontáneo 5' a 3',
aunque el complejo de intercambio puede ser bastante estable y puede
requerir factores adicionales para estimular el desensamblaje
dependiente de ATP. Independientemente de si es espontáneo o
estimulado, en presencia de ATP\gammaS, se inhibe el
desensamblaje de 5' a 3' del filamento de RecA (Paulus, B.F. y
Bryant, F.R. (1997). Biochemistry 36, 7832-8;
Rosselli, W. y Stasiak, A. (1990). J Mol Biol 216,
335-52; Shan, Q. et al., (1997). J Mol Biol
265, 519-40). Estos complejos RecA/ADNds son
precisamente los sitios diana de los complejos de cebador
RecA/ADNss utilizados para iniciar los ciclos posteriores de
invasión y síntesis. Con la RecA unida, los ADNds no pueden ser ya
invadidos por los complejos de cebador RecA/ADNss y no son, por lo
tanto, amplificables a partir de este punto. Puede ocurrir una
síntesis adicional a partir de estos moldes si se inicia en el otro
extremo del molde, que no tiene RecA, y esto puede dar lugar
eventualmente al desplazamiento de la RecA unida. Sin embargo, no
está claro si muchas polimerasas pueden desplazar RecA de esta
manera. Además, el sitio de inicio para este ciclo sintético estará
ahora "bloqueado". En dicha situación, la amplificación es
sólo lineal con el tiempo y generará predominantemente productos de
amplificación que serán ADN monocatenarios. Así, el método Zarling
descrito generará probablemente, como mucho, poco más de pequeñas
cantidades de copias de ADNss a partir de cada molde. Además, la
amplificación lineal proporcionada por el método Zarling sólo
ocurrirá en presencia de SSB, ya que la cadena desplazada seguirá
uniéndose al segundo sitio de interacción de RecA y no se liberará
ADN monocatenario (Mazin, A.V. y Kowalczykowski, S.C. (1998). Embo
J 17, 1161-8). Esto explica probablemente por qué el
método Zarling observaba fragmentos adicionales de migración más
rápida cuando incluían SSB. Estos fragmentos adicionales eran lo más
probablemente fragmentos monocatenarios desplazados. Por lo tanto,
en el método Zarling sólo ocurrirá la amplificación lineal de ADN
monocatenario. Existe, por lo tanto, en la técnica una necesidad de
un método de amplificación de ADN dependiente de recombinasa
mejorado.
Se describen dos estrategias nuevas de
amplificación que evitan cualquier requerimiento de fusión térmica
de ADN o componentes termoestables. Estas estrategias también
solucionarán las ineficacias del método Zarling. De la misma manera
que la estrategia Zarling, estos métodos se basan en las propiedades
biológicas de la proteína RecA bacteriana o sus equivalentes
procariotas y eucariotas. Sin embargo, al contrario que el método
Zarling, estos métodos están ideados para conseguir la
amplificación exponencial de ADNds. Consiguen esto al permitir una
rápida regeneración de secuencias que pueden ser diana en el ácido
nucleico diana en presencia de filamentos RecA/ADN dinámicos.
Además, uno de los métodos obvia cualquier requerimiento de inicio
de la replicación en fase a partir de ambos extremos del ácido
nucleico diana mediante el acoplamiento de la síntesis de la cadena
líder y retardada para generar simultáneamente 2 productos
bicatenarios.
La invención proporciona un método de
amplificación de ADN, denominado RPA, que comprende las etapas
siguientes. En primer lugar, se pone en contacto un agente
recombinasa con un primer y un segundo cebador de ácido nucleico
para formar un primer y un segundo cebador nucleoproteico en
presencia de ATP, RecO, RecR y RecF. En segundo lugar, el primer y
segundo cebador nucleoproteico se ponen en contacto con una
secuencia diana bicatenaria para formar una primera estructura
bicatenaria en una primera parte de dicha primera cadena y formar
una estructura bicatenaria en una segunda parte de dicha segunda
cadena de manera que los extremos 3' de dicho primer cebador de
ácido nucleico y dicho segundo cebador de ácido nucleico están
orientados uno hacia el otro en una molécula de ADN molde dada. En
tercer lugar, el extremo 3' de dicho primer y segundo cebador
nucleoproteicos se extienden mediante ADN polimerasas para generar
un primer y segundo ácido nucleico bicatenarios y primera y segunda
cadenas desplazadas de ácido nucleico. Finalmente, la segunda y
tercera etapas se repiten hasta que se logra un grado deseado de
amplificación. El agente recombinasa es la proteína RecA.
La invención también proporciona un método de
RPA anidada. En una RPA anidada, se amplifica una primera región de
ácido nucleico mediante RPA para formar una primera región
amplificada. Después, se amplifica una segunda región de ácido
nucleico que se encuentra totalmente en la primera región
amplificada utilizando RPA para formar una segunda región
amplificada. Este proceso puede repetirse tantas veces como sea
necesario. Por ejemplo, puede amplificarse una tercera región de
ácido nucleico, que se encuentra totalmente en la segunda región, a
partir de la segunda región amplificada mediante RPA. Además del
primer, segundo y tercer ciclos de RPA discutidos anteriormente, la
invención también contempla al menos 4, y preferiblemente al menos 5
ciclos de RPA anidada.
También se proporcionan métodos para detectar un
genotipo utilizando RPA. Este método es útil para genotipar, para
detectar una condición normal o patológica, una predisposición o una
falta de disposición para una condición patológica. Además, RPA
puede utilizarse para detectar la presencia de un genoma, tal como
por ejemplo, un genoma de un patógeno. En esta utilización, el
método es útil para diagnóstico y detección.
Figura 1 representa una representación
esquemática de Carga de RecA/Cebador.
Figura 2 representa un esquema de etapas
sucesivas, mostradas en los paneles (a) y (b) de la Amplificación
por Recombinasa Polimerasa de la Cadena Líder (RPAls).
Figura 3 representa un esquema de etapas
sucesivas, mostradas en los paneles (a) (b) (c) y (d) de
Amplificación por Recombinasa Polimerasa de la Cadena Líder y
Retardada.
Figura 4 representa un ejemplo de cebadores
anidados elegidos para RPA anidada.
Figura 5 representa ejemplos de moldes de ácidos
nucleicos bicatenarios adecuados.
Figura 6 representa en los paneles (a) y (b) las
diferentes orientaciones de los pares de cebadores RPA en la
hibridación con el ácido nucleico diana.
Figura 7 los paneles (a), (b) y (c) representan
una representación esquemática de una reacción de RPA en
progreso.
Figura 8 representa (a) ejemplos de cebadores
bicatenarios (b) cebadores bicatenarios después de elongación e
hibridación del segundo miembro de un par de cebadores (c) después
de elongación del segundo miembro de un par de cebadores con la
cadena desplazada no invasora.
La presente invención proporciona la
Amplificación por Recombinasa- Polimerasa (RPA) - un método para la
amplificación de polímeros de ácido nucleico diana. Un beneficio de
RPA es que puede llevarse a cabo sin la necesidad de la fusión
térmica de moldes bicatenarios, por lo tanto, también se elimina la
necesidad de termocicladores caros. Se describen dos estrategias
relacionadas mediante las que RPA puede configurarse para permitir
la amplificación exponencial de polímeros de ácido nucleico
diana.
En la Amplificación por
Recombinasa-polimerasa de la cadena líder (RPAls) se
dirigen cebadores de ácido nucleico monocatenarios o parcialmente
monocatenarios a secuencias homólogas bicatenarias o parcialmente
bicatenarias utilizando agentes recombinasa que formarán
estructuras de bucle D. Los cebadores monocatenarios invasores, que
son parte de los bucles D, se utilizan para iniciar las reacciones
de síntesis de la polimerasa. Una especie única de cebador
amplificará una secuencia de ácido nucleico diana a través de
múltiples ciclos de invasión bicatenaria seguido de síntesis. Si se
utilizan dos cebadores opuestos, puede conseguirse la amplificación
de un fragmento-la secuencia diana-. RPAls se
describe brevemente en las Figuras 1 y 2.
La secuencia diana que se quiere amplificar, en
cualquiera de los métodos de la invención, es preferiblemente un
ADN bicatenario. Sin embargo, los métodos de la invención no están
limitados a ADN bicatenario porque otras moléculas de ácido
nucleico, tales como un ADN o ARN monocatenario, pueden convertirse
en ADN bicatenario por un experto en la técnica utilizando métodos
conocidos. El ADN diana bicatenario adecuado puede ser ADN genómico
o un ADNc. Una RPA de la invención puede amplificar un ácido
nucleico diana al menos 10 veces, preferiblemente al menos 100
veces, más preferiblemente al menos 1.000 veces, aún más
preferiblemente al menos 10.000 veces y lo más preferiblemente al
menos 1.000.000 de veces.
La secuencia diana se amplifica con la ayuda de
agentes recombinasa. Un agente recombinasa es una enzima que puede
recubrir ADN monocatenario (ADNss) para formar filamentos, que
buscan en los ADN bicatenarios (ADNds) regiones con homología de
secuencia. Cuando se localizan secuencias homólogas, la cadena de
filamento nucleoproteico (que comprende el agente recombinasa)
invade el ADNds creando un híbrido corto y una burbuja en la cadena
desplazada conocida como bucle D. Los agentes recombinasa adecuados
incluyen la proteína RecA de E. coli o cualquier proteína o
complejo de proteínas homólogo de cualquier phyla. Estos homólogos
de RecA se denominan de manera general Rad51 por el primer miembro
de este grupo que se identificó. Pueden utilizarse otros agentes
recombinasa en lugar de RecA, por ejemplo como RecT o RecO. Los
agentes recombinasa requieren generalmente la presencia de ATP,
ATP\gammaS u otros nucleósidos trifosfato y sus análogos. Se
prefiere que los agentes recombinasa se utilicen en un entorno de
reacción en el que la regeneración de sitios diana pueda ocurrir
poco después de un ciclo de síntesis estimulada de bucle D. Esto
evitará una parada de la amplificación o una amplificación lineal
ineficaz de ADNss causada por la síntesis oscilante de un único lado
desde un extremo al otro.
Naturalmente, cualquier derivado y análogo
funcional del agente recombinasa anterior también puede funcionar
como un agente recombinasa y estos derivados y análogos también se
contemplan como realizaciones de la invención. Por ejemplo, puede
utilizarse un péptido pequeño de recA que se ha visto que retiene
algunos aspectos de las propiedades de recombinación de recA. Este
péptido comprende los restos 193 a 212 de recA de E. coli y
puede mediar el apareamiento de oligos ss (Oleg N. Voloshin, Lijang
Wang, R. Daniel Camerini-Otero, Homologous DNA
Pairing Promoted by a 20-amino Acid Peptide Derived
from RecA. Science Vol. 272 10 mayo 1996).
Debido a que la utilización de ATP\gammaS
resulta en la formación de complejos estables agente
Recombinasa/ADNds que probablemente son incompatibles con una
amplificación eficaz, es preferible utilizar ATP y enzimas
auxiliares para cargar y mantener los complejos de cebador agente
Recombinasa/ADNss. Alternativamente, las limitaciones de la
utilización de ATP\gammaS pueden superarse mediante la utilización
de componentes adicionales de la reacción capaces de quitar la recA
unida a ATP\gammaS de los complejos de intercambio. Este papel
pueden realizarlo las helicasas tales como el complejo
RuvA/RuvB.
Los términos "polímero de ácido nucleico" o
"ácidos nucleicos" tal y como se utilizan en esta descripción
pueden interpretarse de manera amplia e incluyen ADN y ARN así como
otras moléculas semejantes a ácidos nucleicos que puedan hibridar
tales como las que tienen núcleos sustituidos, por ejemplo ácidos
nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos con núcleo morfolino o
con bases y azúcares modificados.
En una realización preferida, RPA se lleva a
cabo con varias enzimas auxiliares que pueden promover el
desensamblaje eficaz de complejos agente Recombinasa/ADNds después
del inicio de la síntesis de ADN. Estas enzimas auxiliares incluyen
las que son capaces de estimular el desensamblaje 3' a 5' y las
capaces de activar el desensamblaje 5' a 3'.
Las enzimas auxiliares incluyen varias
polimerasas que pueden desplazar a RecA en la dirección 3' a 5' y
pueden estimular el desensamblaje 3' a 5' de los complejos agente
Recombinasa/ADNds (Pham et al., 2001). Estas ADN polimerasas
incluyen PolV de E. coli y polimerasas homólogas de otras
especies. Normalmente en la vida de E. coli, el
desplazamiento de RecA en la dirección 3' a 5' ocurre como parte de
la síntesis SOS activada por una lesión junto con SSB, pinzas
deslizantes y ADN polimerasa. La polimerasa esencial para esta
actividad en E. coli es PolV, un miembro de la recientemente
descubierta superfamilia de polimerasas que incluye UmuC, DinB,
Rad30 y Rev1, cuya función in vivo es copiar moldes de ADN
lesionado. Es crítico para RPA que el desensamblaje 3' a 5' in
vitro de los filamentos de RecA no puede estar catalizado por
PolI, PolIII o PolIV solo. Sólo PolV, junto a SSB, tiene una
actividad mensurable de desensamblaje 3' a 5' independiente de ATP
de RecA/ADNds. En efecto, PolV empuja y elimina RecA del ADN en una
dirección 3' a 5' por delante de la polimerasa (Pham et al.,
2001; Tang et al., 2000). La inclusión de PolV o un homólogo
funcional puede mejorar la eficacia de la amplificación.
Otras enzimas auxiliares incluyen una clase de
enzimas denominadas helicasas que pueden utilizarse para promover
el desensamblaje de RecA del ADNds. Éstas promueven el desensamblaje
tanto en la dirección 5' a 3' como 3' a 5'. Las helicasas son
componentes esenciales del proceso de recombinación in vivo y
su función es mover los puntos de ramificación de los intermedios
de recombinación de un lugar a otro, separar las cadenas y
desensamblar y reciclar los componentes unidos al ADN. Después de
que se haya producido el primer ciclo de invasión/síntesis en RPA,
dos nuevos dúplex de ADN están "marcados" por la presencia de
RecA unida al sitio al que los cebadores deben unirse para ciclos
adicionales de síntesis. En dicha situación, el ADNds tiende a
ocupar el sitio de alta afinidad en RecA hasta que es desplazado
activamente, bien por disociación dependiente de ATP en la dirección
5' a 3', que puede ser limitante, o mediante la disociación 3' a 5'
mediante otro proceso activo. Un complejo de helicasa ideal para
estimular el desensamblaje de RecA de los intermedios consiste en
las proteínas de E. coli RuvA y RuvB. El complejo RuvAB
promueve la migración de las ramificaciones y disocia la proteína
RecA, permitiendo que RecA se recicle (Adams et al., 1994).
Normalmente, el complejo RuvAB está dirigido a intermedios de
recombinación, particularmente estructuras semejantes a la unión
Holliday. Al operar, el complejo RuvAB rodea el ADN y extrae RecA
fuera del ADN en una translocación dirigida por ATP (Cromie y Leach,
2000; Eggleston y West, 2000). Esta actividad de disociación de
RecA se ha demostrado utilizando ADNds superenrollado unido a RecA,
que no posee uniones Holliday (Adams et al., PNAS 1994). El
complejo RuvAB puede reconocer estructuras ramificadas en el ADN
recubierto por RecA. La incorporación de RuvAB en la mezcla RPA
promoverá la disociación de RecA del ADNds después del intercambio
y desplazamiento de cadena, permitiendo una síntesis renovada del
molde duplicado a partir del mismo sitio. Además, el complejo RuvAB
puede actuar junto a RuvC, que finalmente corta y resuelve las
uniones Holliday. Si se añade RuvC a la mezcla de reacción RPA,
pueden resolverse estructuras complicadas tales como uniones
Holliday formadas en los sitios de invasión. La actividad resolvasa,
tal como la proporcionada por RuvC, es particularmente importante
cuando los oligonucleótidos diana son parcialmente bicatenarios. En
dichas situaciones, la prolongación del apareamiento en sentido
inverso puede generar uniones Holliday, que pueden resolverse por
el complejo RuvABC, para generar productos de amplificación limpios
y separados.
Otras enzimas auxiliares adicionales incluyen la
proteína RecG de E. coli. RecG puede estimular el
desensamblaje de estructuras ramificadas. In vivo esta
proteína funciona revirtiendo las horquillas de replicación en
sitios con daño en el ADN desenrollando tanto las cadenas líderes
como las retardadas dirigiendo la horquilla de replicación hacia
atrás para generar una unión de 4 elementos (Cox et al.,
2000; Dillingham y Kowalczykowski, 2001; Singleton et al.,
2001). In vivo dichas uniones funcionan como sustratos para
el cambio de las cadenas para permitir evitar la lesión. In
vitro RecG se unirá a los bucles D y dará lugar a una
disminución de las estructuras de bucles D dirigiendo la
prolongación del apareamiento en sentido inverso. RecG prefiere una
unión con elementos bicatenarios en cada lado, por lo que serían
ideales los oligonucleótidos bicatenarios diana homólogos al sitio
diana tanto en las regiones monocatenarias como bicatenarias. Esto
estimularía el apareamiento prolongado en sentido inverso y la
formación de una unión Holliday, que puede resolverse por el
complejo RuvABC. In vivo RecG y RuvAB pueden competir para
proporcionar diferentes resultados de recombinación ya que la
prolongación del apareamiento estará activada en las dos direcciones
(McGlynn y Lloyd, 1999; McGlynn et al., 2000). En ambos
casos, las proteínas tienen como diana el ADN de unión recubierto
con RecA y lo desensamblan de una manera activa.
Otras enzimas auxiliares útiles en una mezcla de
reacción RPA son las que permiten una generación continua de
filamentos de nucleoproteína RecA en presencia de ATP y SSB. Con el
fin de permitir la eliminación de RecA en los momentos apropiados,
se prefiere utilizar ATP en lugar de ATP\gammaS en una reacción
RPA. Desgraciadamente, los filamentos RecA/ADNss formados con ATP
se despolimerizan espontáneamente en la dirección 5' a 3' y en
presencia de SSB como se requiere aquí, la repolimerización no se
producirá a velocidades significativas. La solución a este problema
es la utilización de las proteínas RecO, RecR y posiblemente RecF.
En presencia de SSB y ATP, los filamentos RecA/ADNss se disocian
(Bork et al., 2001; Webb et al., 1995; Webb et
al., 1997; Webb et al., 1999). Si RecA/ADNss se incuba
en presencia de las proteínas RecO y RecR esta disociación no
ocurre. En efecto, la proteína RecR permanece asociada con el
filamento y estabiliza la estructura indefinidamente. Incluso si el
ADNss está unido por SSB, en presencia de RecR y RecO, los
filamentos de RecA pueden volver a ensamblarse desplazando a SSB.
Así, es posible obviar la utilización de ATP\gammaS, si es
necesario, utilizando ATP en presencia de RecO y RecR para mantener
la integridad del filamento RecA/ADNss. La proteína RecF
interacciona con el sistema RecO y RecR de una manera aparentemente
opuesta. RecF compite con RecR lo que tiende a producir el
desensamblaje del filamento in vitro. Es probable que los
tres componentes funcionen in vivo juntos para controlar la
generación de estructuras invasoras, a la vez que limitan el grado
de recubrimiento del ADNss por RecA. En otra realización preferida,
RecF se incluye en las reacciones RPA a una concentración apropiada
para recapitular las dinámicas de los procesos in vivo.
Además, RecF puede facilitar la disociación de intermedios
recubiertos con RecA después de que se haya producido la
invasión.
invasión.
Como se ha descrito, la utilización de ATP en
lugar de ATP\gammaS, y/o la utilización de polimerasas y helicasas
que producen desplazamiento (por ejemplo, el complejo RuvA/RuvB),
RecO, RecR y RecF permitiría la amplificación exponencial de ADN
bicatenario al producir la regeneración continua de sitios diana.
Este método, sin embargo, sigue siendo susceptible de responder a
diferencias en la velocidad de inicio que pueden ocurrir en los dos
sitios diana opuestos. Dichas diferencias pueden dar lugar a una
disminución de la eficacia de la amplificación y a la producción de
algo de ADN monocatenario. El método de PCR evita en gran medida
estas complicaciones ya que la temperatura de los ciclos da lugar a
la síntesis coordinada a partir de los dos sitios. En otra
realización, puede inducirse una situación análoga a la condición de
PCR descrita utilizando mutantes de RecA sensibles a la temperatura
(ts) que no son funcionales a 42ºC pero que funcionan a temperaturas
más bajas en el intervalo de 25 a 37ºC (Alexseyev et al.,
1996; Hickson et al., 1981). En este caso, la síntesis a
partir de los dos extremos puede sincronizarse por el descenso
periódico hasta la temperatura permisiva y después subiendo la
reacción hasta una temperatura no permisiva para la función de la
proteína RecA mutante pero permisiva para los demás componentes.
Mediante la realización de RPA con mutantes RecAts en
combinación con ciclos de temperaturas de la reacción, puede
controlarse el número de moléculas de ADN producidas. Aunque esto
requerirá algún mecanismo para proporcionar los ciclos de
temperatura, las temperaturas son mucho más bajas que las que
requeriría la utilización de proteínas derivadas de termófilas. En
efecto, para controlar dichos ciclos de reacción puede ser
suficiente un dispositivo sencillo de poca potencia para producir
los ciclos de temperatura basado en química o
portátil.
portátil.
RPA, como los demás métodos de amplificación de
ácidos nucleicos actuales, emplea polimerasas para generar copias
de moléculas de ácido nucleico molde. Para la mayoría de las
polimerasas de ácidos nucleicos es necesario que la incorporación
requiera un resto 3'-hidroxilo libre en el azúcar
terminal de una cadena corta de ácido nucleico bicatenario
adyacente al sitio de nueva síntesis. Esta cadena de ácido nucleico
bicatenario se forma típicamente en un molde por una secuencia
complementaria corta, denominada cebador, que sirve como un sitio
de inicio para la reacción de síntesis de la polimerasa. En algunos
casos, puede utilizarse una modificación en 3', tal como un
sulfhidrilo, para cebar la reacción de síntesis. El ácido nucleico
cebador, que es complementario al molde y se extiende por la
polimerasa, puede ser ARN o ADN. In vivo, durante la
replicación del ADN genómico, se sintetizan secuencias cebadoras de
ARN de novo en ADN molde por enzimas primasas. Típicamente,
para las reacciones in vitro, el cebador se proporciona como
un ADN monocatenario, corto, frecuentemente sintetizado
químicamente (o ADN o ARN modificado) y se refiere habitualmente
como un cebador oligonucleotídico. El cebador tiene frecuentemente
una secuencia específica aunque también pueden utilizarse cebadores
aleatorios. El cebador está dirigido a secuencias complementarias
gracias a su capacidad de apareamiento de bases específica. La
formación de híbridos entre el cebador oligonucleotídico y el ácido
nucleico diana se forman típicamente mediante la incubación de los
dos en disolución en condiciones de sal, pH y temperatura que
permiten la hibridación espontánea.
En el caso de la PCR, el cebador
oligonucleotídico está presente frecuentemente en un exceso amplio
por dos razones principales. En primer lugar, la concentración alta
producirá una hibridación rápida. En segundo lugar, al avanzar la
reacción a través de ciclos de fusión, hibridación y extensión, el
cebador se consume y se vuelve limitante. Los ácidos nucleicos
diana de la PCR son frecuentemente de carácter bicatenario
inicialmente y si no lo son se vuelven bicatenarios después del
primer ciclo sintético. Dichas moléculas bicatenarias no pueden
hibridar con oligonucleótidos nuevos en las condiciones de
temperatura y disolvente apropiadas para la actividad catalítica y
estabilidad de la mayoría de las proteínas procariotas y eucariotas.
Consecuentemente, con el fin de permitir ciclos de amplificación el
molde original y las nuevas cadenas sintetizadas deben separarse en
primer lugar antes de que la hibridación pueda ocurrir de nuevo. En
la práctica, esto se consigue por fusión térmica. Para la PCR, se
requieren temperaturas de al menos 80ºC para la fusión térmica de la
mayoría de las moléculas de ácido nucleico bicatenarias con
longitudes mayores de 100 pares de bases. En la mayoría de los
protocolos de PCR se aplica una temperatura de 90 a 100ºC para
fundir el ADN. Dichas temperaturas sólo permiten la utilización de
enzimas termoestables poco comunes. Estas polimerasas se obtienen
típicamente de procariotas termofílicos.
La ventaja de RPA es que permite la formación de
cadenas cortas de ácidos nucleicos bicatenarios que tienen un
3'-OH libre para lograr la extensión a partir de
moldes bicatenarios sin fusión térmica. Esto se logra utilizando la
proteína RecA de E. coli (o un equivalente de RecA de otros
phyla). En presencia de ATP, dATP, ddATP, UTP, ATP\gammaS y
posiblemente otros tipos de nucleósidos trifosfato y sus análogos,
RecA formará un filamento de nucleoproteína alrededor de ADN
monocatenario. Este filamento explorará el ADN bicatenario. Cuando
se localizan secuencias homólogas, RecA catalizará una reacción de
invasión de cadena y apareamiento del oligonucleótido con la cadena
homóloga del ADN diana. La cadena de apareamiento original es
desplazada por la invasión de cadena dejando una burbuja de ADN
monocatenario en la región.
La proteína RecA puede obtenerse de fuentes
comerciales. Alternativamente, puede purificarse según protocolos
estándar, por ejemplo (Cox et al., 1981; Kuramitsu et
al., 1981). Se han purificado homólogos de RecA a partir de
organismos termofílicos incluyendo Thermococcus kodakaraensis
(Rashid et al., 2001), Thermotoga maritima (Wetmur
et al., 1994), Aquifex pyrophilus (Wetmur et
al., 1994), Pyrococcus furiosus (Komori et al.,
2000), Thermus aquaticus (Wetmur et al., 1994),
Pyrobaculum islandicum (Spies et al., 2000) y
Thermus thermophilus (Kato y Kuramitsu, 1993). RecA también
se ha purificado a partir de otros procariotas, por ejemplo,
Salmonella typhimurium (Pierre y Paoletti, 1983), Bacillus
subtilis (Lovett y Roberts, 1985), Streptococcus
pneumoniae (Steffen y Bryant, 2000), Bacteroides fragilis
(Goodman et al., 1987), Proteus mirabilis (West et
al., 1983, Rhizobium meliloti (Better y Helinski, 1983),
Pseudomonas aeruginosa (Kurumizaka et al., 1994), a
partir de eucariotas, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae
(Heyer y Kolodner, 1989), Ustilago maydis (Bennett y
Holloman, 2001), incluyendo vertebrados, por ejemplo, Rad51 humana
(Baumann et al., 1997) y Xenopus laevis (Maeshima
et al., 1996), así como plantas incluyendo brécol (Tissier
et al., 1995).
Para aclarar la descripción, el método de
Amplificación por Recombinasa-Polimerasa de la
cadena líder (RPAls) puede dividirse en cuatro fases.
\vskip1.000000\baselineskip
RPA se inicia localizando las secuencias diana
mediante la utilización de oligonucleótidos sintéticos recubiertos
con RecA o un homólogo funcional. Con el fin de permitir la
amplificación exponencial, se emplearán dos de dichos
oligonucleótidos sintéticos de una manera tal que sus extremos 3'
libres estén orientados uno hacia el otro. Los filamentos de
nucleoproteína que comprenden estos oligonucleótidos y la proteína
RecA identificarán dianas en ADN complejo rápidamente y
específicamente. Una vez localizadas la proteína RecA cataliza el
intercambio de cadena de manera que se forman estructuras con bucle
D. Puede ser necesario utilizar ATP en lugar de ATP\gammaS en el
procedimiento para una amplificación eficaz. Si se utiliza ATP,
pueden ser esenciales las moléculas RecO, RecR y/o RecF para una
amplificación eficaz.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ADN polimerasas detectarán y se unirán al
híbrido entre los oligonucleótidos invasores y el ADN molde e
iniciarán la síntesis de ADN desde el 3'-hidroxilo
libre expuesto en el híbrido. La exposición de este
3'-hidroxilo, y la síntesis de ADN posterior,
requerirá probablemente el desensamblaje de la proteína RecA del
híbrido bicatenario formado por el intercambio de cadenas. Para
conseguir este desensamblaje será necesario probablemente emplear
ATP que puede ayudar en el desensamblaje espontáneo de RecA de los
complejos invasores. Un desensamblaje adicional puede
estimularse/incrementarse mediante la utilización de otras proteínas
contenidas en la mezcla de reacción tales como RuvA, RuvB, RuvC,
recG, otras helicasas u otros componentes estimuladores, que pueden
actuar para separar RecA del producto resultante del intercambio de
cadenas.
\vskip1.000000\baselineskip
Al sintetizar las ADN polimerasas copias
complementarias de ADN molde utilizando los
3'-hidroxilos libres de oligonucleótidos invasores,
o sus productos parcialmente extendidos, las polimerasas desplazan
los ADN monocatenarios, que pueden estar recubiertos con proteínas
que se unen a una cadena (SSB) incluidas en la reacción. En una
configuración ideal, la invasión de oligonucleótidos en ambos
extremos de la secuencia de ácido nucleico diana ocurrirá en marcos
de tiempo similares, de manera que dos polimerasas en el mismo ácido
nucleico molde progresarán inicialmente una hacia la otra. Cuando
estos complejos que se están extendiendo se encuentran, el molde
original resultará apartado y las polimerasas continuarán
sintetizando sin la necesidad de un desplazamiento de cadena,
copiando ahora el molde de ADNss unido a SSB. Debido a restricciones
estéricas, las polimerasas se disociarán del molde temporalmente
cuando las polimerasas se encuentren para permitir la separación de
las dos cadenas molde.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que las cadenas molde se han separado,
las polimerasas pueden completar la extensión hacia el extremo del
molde (o después de la secuencia que actúa como el segundo sitio
diana, opuesto, si el molde original es mayor que el producto
deseado). Para permitir una amplificación exponencial es necesario
que los productos nuevos sean diana y se repliquen de una manera
similar a los moldes originales, esto es desde los dos extremos
diana. El nuevo sitio diana sintetizado estará dispuesto para ser
diana de los filamentos RecA/oligonucleótido. El sitio utilizado
inicialmente para cebar la síntesis también debería haberse liberado
como consecuencia de la utilización de condiciones en la reacción
que favorezcan el desensamblaje de RecA de los productos del
intercambio de cadenas. Si la re-invasión en este
último sitio ocurre en menos tiempo que el que requiere la
polimerasa para sintetizar después del segundo sitio diana, ser
cebada en este segundo sitio, y volver al primer sitio, entonces el
ADN monocatenario no será el producto principal y se producirá una
amplificación exponencial. El hecho de tener múltiples complejos
sintéticos operando en el mismo molde ofrece la posibilidad de que
se consigan tiempos muy cortos de amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
En nuestra descripción de RPAls (RPA de cadena
líder) detallamos un sistema con múltiples componentes con la
capacidad de regenerar secuencias diana permitiendo así la
amplificación exponencial de ADN bicatenario. Al contrario que el
método Zarling, RPAls evita la producción lineal de ADN
monocatenario. Existe otro método para resolver este problema que
evita completamente la posibilidad de productos monocatenarios y un
requerimiento para el inicio terminación simultánea. Este método
implica necesariamente una mezcla de reacción más compleja. Sin
embargo, todos los componentes requeridos se conocen bien y deberían
ser capaces de ensamblarse en un único sistema. Este sistema
recapitulará eventos que se producen durante el ciclo de replicación
normal de las células para permitir la síntesis acoplada de cadenas
líder y retardadas. Este método, RPA de cadenas líder/retardadas,
se describe brevemente en las Figuras 1 y 3.
Durante la replicación normal in vivo, el
ADN bicatenario se separa simultáneamente en 2 cadenas y ambas se
copian para proporcionar 2 nuevas moléculas de ADN bicatenario por
una maquinaria de replicación. Esta "maquinaria" acopla la
síntesis convencional 5' a 3' de la cadena líder con la síntesis de
la cadena retardada, en la que se sintetizan cebadores de ARN
cortos en los ácidos nucleicos molde por enzimas primasas. Durante
la síntesis de la cadena retardada, se producen fragmentos cortos de
ADN, denominados fragmentos de Okazaki, que se ligan entre sí para
formar cadenas retardadas contiguas. Esta síntesis simultánea de
cadena líder/cadena retardada es responsable de la duplicación del
genoma completo de organismos procariotas y eucariotas. Los
componentes esenciales de este sistema se han identificado y
caracterizado bioquímicamente. Los componentes pueden ensamblarse
in vitro para conseguir una amplificación más eficaz de la
que es posible utilizando sólo la síntesis de la cadena líder.
Actualmente, se conocen los componentes
esenciales de la "maquinaria" de replicación para E.
coli. Esta maquinaria comprende la holoenzima PolIII (Glover y
McHenry, 2001; Kelman y O'Donnell, 1995) y el primosoma (Benkovic
et al., 2001; Marians, 1999). La holoenzima PolIII está
formada por diez componentes polipeptídicos. Cada holoenzima
contiene dos estructuras centrales, orientadas asimétricamente, cada
una de las cuales consiste en una polimerasa (subunidad \alpha) y
dos componentes centrales adicionales, la subunidad \varepsilon,
que posee actividad exonucleasa 3' a 5', y la subunidad \theta.
Además del complejo central, otro conjunto de polipéptidos
proporciona a la holoenzima procesividad y acoplamiento de la
síntesis de cadenas líder y retardadas. La pinza deslizante dímero
\beta rodea el ADN molde fijando el complejo al molde con una
afinidad extremadamente alta. La pinza deslizante cargada en el ADN
por el cargador de pinza DnaX comprende las subunidades
polipeptídicas
\tau_{2}\gamma\delta\delta'\chi\psi.
Para aclarar la descripción, el método RPA puede
dividirse en cuatro fases. En realidad, todas las fases ocurren
simultáneamente en una única reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
La RPA se inicia identificando secuencias diana
mediante la utilización de oligonucleótidos sintéticos recubiertos
con RecA o un homólogo funcional. Dichos filamentos de
nucleoproteína identificarán dianas en ADN complejos rápidamente y
específicamente. Una vez localizadas, la proteína RecA cataliza el
intercambio de cadena de manera que se forma una estructura con
bucle D. Puede ser necesario utilizar ATP en lugar de ATP\gammaS
en el procedimiento para una amplificación eficaz. La unión de las
síntesis de cadena líder y retardada puede obviar, sin embargo, el
requerimiento de una liberación rápida de RecA después del inicio de
la síntesis. Si se utiliza ATP, pueden ser esenciales las moléculas
RecO, RecR y RecF para una amplificación eficaz.
\vskip1.000000\baselineskip
Los primosomas pueden ensamblarse en los bucles
D. Normalmente, las estructuras de bucles D se forman mediante RecA
como parte del mecanismo para rescatar ADN dañado in vivo o
durante otras formas de recombinación. El propósito de la acción
combinada del intercambio de cadena mediado por RecA y el ensamblaje
de primosomas es generar una horquilla de replicación. Una
horquilla de replicación es la estructura de nucleoproteína que
comprende las cadenas de ADN molde separadas y el replisoma. El
replisoma consiste en el complejo holoenzima polimerasa, el
primosoma y otros componentes necesarios para replicar
simultáneamente las dos cadenas del ADN molde. Los primosomas
proporcionan tanto las funciones de desenrrollamiento del ADN como
la de cebado del fragmento de Okazaki requeridas para la progresión
de la horquilla de replicación.
El ensamblaje de los primosomas se ha estudiado
intensamente mediante análisis genéticos y bioquímicos en E.
coli. El conjunto mínimo de polipéptidos requerido para este
proceso es muy conocido y existen como componentes purificados. Las
proteínas del ensamblaje del primosoma son PriA, PriB, PriC, DnaT,
DnaC, DnaB y DnaG. Se ha mostrado que estas proteínas son
suficientes para ensamblar un complejo de primosoma en el ADN del
bacteriófago \PhiX174 in vitro (Kornberg y Baker, 1992,
Marians, 1992). PriA se une al sitio de ensamblaje del primosoma
(PAS) en el cromosoma de \PhiX174. Después, PriB, DnaT y PriC se
unen secuencialmente al complejo PriA-ADN. PriB
parece que estabiliza PriA en el PAS y facilita la unión de DnaT
(Liu et al., 1996). PriC se requiere sólo parcialmente para
la reacción completa de ensamblaje. La omisión de PriC en la
reacción disminuirá el cebado de 3 a 4 veces (Ng y Marians, 1996a;
Ng y Marians, 1996b). La función de PriC en las bacterias es
genéticamente redundante con PriB. DnaC carga DnaB en el complejo de
una manera dependiente de ATP. Este complejo
PriABC-DnaBT es competente para translocarse a lo
largo del cromosoma. La primasa DnaG puede interaccionar
temporalmente con el complejo para sintetizar cebadores de ARN.
Durante la replicación en E. coli, DnaB y
DnaG funcionan como una helicasa y primasa, respectivamente. Estos
dos componentes se requieren continuamente en asociación con la
holoenzima PolIII para sintetizar cebadores para los fragmentos de
Okazaki. Por lo tanto, DnaB y DnaG son los componentes centrales del
primosoma móvil asociado con la horquilla de replicación. Los demás
componentes del primosoma descritos son esenciales para el
ensamblaje del primosoma en el ADN y para asociar una polimerasa
dimérica. Las proteínas del ensamblaje del primosoma se requieren
para el reestablecimiento de horquillas de replicación en
intermedios de recombinación formados por RecA y el intercambio de
cadenas. PriA puede iniciar el ensamblaje de un replisoma,
competente para la síntesis de ADN, en intermedios de
recombinación. Es posible identificar como dianas bucles D in
vitro con una mezcla de PriA, PriB y DnaT, que son entonces
competentes para incorporar DnaB y DnaC. Una vez que se ha formado
un primosoma en el bucle D, todo lo que resta para iniciar la
replicación es cargar un complejo de holoenzima en el
sitio.
sitio.
\vskip1.000000\baselineskip
Las horquillas de replicación se ensamblarán en
el sitio del ensamblaje del primosoma. La presencia de un extremo
3' libre en la cadena invasora del bucle D estimula el complejo
cargador de la pinza DnaX detallado anteriormente para ensamblar un
dímero \beta en este sitio para que actúe como una pinza
deslizante. La holoenzima y 2 unidades centrales se unen entre sí
por la subunidad andamio \tau. La subunidad \tau también tiene
superficies de interacción para el dímero \beta, para el cargador
de la pinza y para el componente helicasa DnaB del primosoma. Estas
múltiples interacciones son necesarias para coordinar la síntesis
tanto de las cadenas líder como retardadas utilizando los 2
complejos centrales de polimerasas unidos asimétricamente.
La primasa del primosoma, DnaG, sintetiza un
cebador de ARN corto en el ADN molde de cadena retardada
desenrollado. En presencia de la holoenzima, el cargador de la
pinza reconoce el dúplex ARN/ADN y carga un segundo dímero \beta
pinza en este sitio. La presencia de un primosoma activo y la
interacción de la subunidad \tau con DnaB son críticas para
asegurar la síntesis simultánea de la cadena líder/retardada. Sin
esta interacción, la polimerasa se alejará del sitio del primosoma
sin acoplarse.
Ahora se ensambla una horquilla de replicación.
La síntesis tanto de la cadena líder como retardada ocurrirá ahora
simultáneamente y la DnaB helicasa separará las cadenas molde por
delante de la holoenzima entrante. El núcleo de la holoenzima de
cadena retardada generará fragmentos de Okazaki de 1 a 2 kilobases
de longitud. Una vez que la polimerasa de la cadena retardada se
encuentra con el cebador de ARN previo, se disocia de la pinza
\beta y se inicia la síntesis a partir de un nuevo cargador de la
pinza ensamblado cerca de la parte delantera de la cadena líder. El
mismo núcleo de la holoenzima de cadena retardada se reutilizará ya
que está físicamente unido al núcleo de la cadena
líder.
líder.
Existe una interacción dinámica entre las pinzas
dímero \beta, las subunidades centrales y los cargadores de la
pinza. Sus afinidades pueden variar dependiendo de las
circunstancias físicas. El dímero \beta que ha sido
"abandonado" en el extremo de los fragmentos de Okazaki puede
reciclarse mediante eliminación activa por los cargadores de la
pinza o exceso de la subunidad \delta que puede estar
presente.
Los cebadores de ARN en los extremos de los
fragmentos de Okazaki se eliminan por la actividad exonucleasa 5' a
3' de la ADN polimerasa I. La ADN ligasa une entonces los fragmentos
de Okazaki entre sí formando una cadena retardada continua.
\vskip1.000000\baselineskip
En RPA, la replicación se inicia en dos sitios
distantes y las horquillas de replicación están orientadas una
hacia la otra. Al converger las horquillas de replicación, las dos
cadenas molde originales se disociarán una de la otra al separarse
completamente ambas por detrás y por delante de cada horquilla. El
núcleo de la cadena líder de cada horquilla completará la síntesis,
el resto de los cebadores de ARN se procesará y los productos
finales serán dos moléculas bicatenarias. Se puede esperar
razonablemente amplificar ADN en el orden de varias Megabases (Mb)
por dicho método. En esta descripción, megabase también engloba
megapares de bases. Tomando como base la velocidad sintética
conocida de la holoenzima PolIII se puede esperar que las horquillas
de replicación avancen a una velocidad de aproximadamente 1
Mb/1.000 segundos, es decir, aproximadamente 15 a 20 minutos por
ciclo para un fragmento de 1 Mb.
La consideración final es el mecanismo por el
que se conseguirá una amplificación exponencial rápida de ADN. La
clave de este proceso será el permitir una reinvasión eficaz de los
sitios diana mediante la utilización de mezclas de helicasas,
resolvasas y las proteínas RecO, RecR y RecF. En las condiciones
apropiadas, la reinvasión y el ensamblaje del primosoma serían
posibles poco después de que se haya eliminado una holoenzima del
sitio de ensamblaje de la horquilla. Las invasiones continuas no
presentarían problemas ya que el ADN simplemente se ramificaría en
muchos puntos. Cada ramificación se resolverá naturalmente al
encontrarse con la horquilla entrante. En estas condiciones puede
ser posible conseguir una amplificación muy grande en tiempos
similares al tiempo que se tarda en replicar el ADN sólo una vez.
Sin embargo, puede ser crítico el limitar las concentraciones de
los oligonucleótidos diana para evitar la depleción nucleotídica
antes de completarse la síntesis.
Además del complejo de la holoenzima, la
maquinaria de replicación emplea otro complejo conocido como el
primosoma, que sintetiza la cadena retardada y mueve las horquillas
de replicación hacia delante. El complejo del primosoma comprende
una helicasa codificada por DnaB y una primasa codificada por DnaG.
Finalmente, además de las proteínas de la holoenzima y el
primosoma, la replicación requiere la actividad de la proteína de
unión al ADN monocatenario (SSB), la ADN polimerasa I de
E.coli y la ADN ligasa. Estos dos últimos componentes se
requieren para procesar los fragmentos de Okazaki.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, la amplificación por RPA
puede llevarse a cabo en un proceso referido en la presente memoria
como "RPA anidada".
Una dificultad para detectar una secuencia poco
común es que puede existir una proporción alta de secuencia no
diana a secuencia diana. La capacidad de una RPA para discriminar
entre ADN diana y no diana y amplificar sólo las secuencias diana
es una aspecto clave para mejorar la sensibilidad. La discriminación
entre no diana y diana es un reflejo de la especificidad de los
cebadores y de las condiciones de la reacción. Cuanto más
específica es una reacción mayor es la cantidad relativa de la
secuencia diana específica producida y más sencillo es detectar el
producto. Un incremento en la especificidad puede también, por lo
tanto, incrementar la sensibilidad.
La necesidad de una sensibilidad y especificidad
mejoradas puede plantearse utilizando RPA anidada. La RPA anidada
implica una primera RPA de una primera región de ADN. Después, la
mezcla de reacción se diluye, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 75 ó
100 veces o más para reducir la concentración del primer par de
cebadores y se introduce un segundo par de cebadores en la mezcla
de reacción y se repite la RPA. Según una realización, el segundo
par de cebadores se diseña para ser interno al primer par de
cebadores para amplificar una subsecuencia del primer producto de
RPA. El método incrementa la amplificación específica, es decir,
reduce los productos de la amplificación no específicos de fondo y,
por lo tanto, incrementa la sensibilidad. Dichos productos de la
amplificación no específicos, aunque se producen gracias a una
homología parcial fortuita con los cebadores que flanquean,
probablemente no tengan también una homología suficiente con los
cebadores anidados para continuar amplificándose. La detección y
especificidad de RPA puede mejorarse más marcando uno o los dos del
segundo par de cebadores de manera que sólo se detecten los
cebadores amplificados con uno o los dos del segundo par de
cebadores.
La RPA anidada no está limitada a la utilización
de dos conjuntos de cebadores. Naturalmente, pueden utilizarse más
conjuntos de cebadores para incrementar la especificidad o
sensibilidad. Así, pueden utilizarse tres, cuatro o cinco pares de
cebadores. Además, los diferentes conjuntos de cebadores, como otra
realización, pueden compartir cebadores comunes como se ilustra en
la Figura 4.
En la Figura 4, los conjuntos de cebadores se
diseñan para utilizarse secuencialmente. Por ejemplo, se lleva a
cabo una primera RPA con el conjunto de cebadores 1, se lleva a cabo
una segunda RPA utilizando el producto amplificado de la primera
RPA con un conjunto de cebadores 2, se lleva a cabo una tercera RPA
utilizando el producto amplificado de la segunda RPA con un
conjunto de cebadores 3, se lleva a cabo una cuarta RPA utilizando
la secuencia amplificada de la tercera RPA con un conjunto de
cebadores 4 y, finalmente, se lleva a cabo una quinta RPA
utilizando el producto amplificado de la cuarta RPA con un conjunto
de cebadores 5. En este caso, el conjunto de cebadores 1, 2 y 3
comparten un cebador común-cebador (a). Los
cebadores 3, 4 y 5 comparten un cebador
común-cebador
(b).
(b).
La RPA anidada puede llevarse a cabo utilizando
cualquiera de los dos métodos de RPA descritos así como una
combinación de los dos métodos en cualquier orden particular. Esto
es, la RPA puede llevarse a cabo sólo por RPA de la cadena líder,
sólo por RPA de la cadena líder y retardada o una combinación de RPA
de la cadena líder y RPA de la cadena líder y retardada en
cualquier orden particular.
Un beneficio de cualquiera de los métodos de RPA
descritos es el tamaño del producto amplificado. Mientras que los
métodos actuales de amplificación tales como PCR están limitados por
un límite superior de aproximadamente 10 Kb, los métodos de RPA son
capaces de amplificar regiones de ácidos nucleicos de hasta cientos
de megabases. Para la RPA de la cadena líder/retardada, los tamaños
de una secuencia diana que se quiere amplificar pueden ser cientos
de megabases, tal como, por ejemplo, menos de 500 megabases, menos
de 300 megabases, menos de 100 megabases, menos de 70 megabases,
menos de 50 megabases, menos de 25 megabases, menos de 10 megabases,
menos de 5 megabases, menos de 2 megabases, menos de una megabase,
menos de 500 kb, menos de 200 kb, menos de 100 kb, menos de 50 kb,
menos de 25 kb, menos de 10 kb, menos de 5 kb, menos de 2 kb, menos
de 1 kb. Para RPAls, los tamaños de una secuencia diana pueden
estar en el intervalo de megabases tal como, menos de 5 megabases,
menos de 2 megabases, menos de una megabase, menos de 500 kb, menos
de 200 kb, menos de 100 kb, menos de 50 kb, menos de 25 kb, o menos
de 10 kb, menos de 5 kb, menos de 2 kb, menos de 1 kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles de la RPA de la cadena líder, RPA
de la cadena líder y retardada y RPA anidada se han listado
anteriormente. Esta sección describirá la selección de reactivos y
parámetros para cualquiera de los tres métodos discutidos
anteriormente.
Un beneficio de la RPA es que el producto
amplificado de la RPA es ADN bicatenario que podría utilizarse para
otros procedimientos de biología molecular. Así, la RPA puede
combinarse con otros métodos de biología molecular. Por ejemplo, el
material de partida para la RPA puede ser un fragmento amplificado
por PCR. Alternativamente, el producto de una RPA puede utilizarse
para PCR.
Si es necesario, los productos de la RPA de
cualquiera de los métodos descritos pueden purificarse. Por ejemplo,
en el método de la RPA anidada, el producto amplificado puede
purificarse después de cada etapa de RPA antes de una etapa
posterior de RPA. Los métodos para la purificación de ácidos
nucleicos son conocidos en la técnica e incluirán, al menos,
extracción con fenol, precipitación del ácido nucleico (por ejemplo,
con sal y etanol), cromatografía en columna (por ejemplo, exclusión
por tamaño, columna iónica, columna de afinidad y semejantes) o
cualquier combinación de estas técnicas.
Como se ha discutido, los cebadores utilizados
en RPA pueden ser "bicatenarios" o "capaces de formar
estructuras bicatenarias". Estos términos se refieren a
moléculas de ADN que existen en una condición bicatenaria en una
disolución de reacción tal como una disolución de reacción RPA o una
disolución de reacción PCR. La composición de una disolución de PCR
es conocida. La composición de una reacción de RPA se lista en esta
sección de descripción detallada y en los Ejemplos.
Los cebadores pueden tener una región
monocatenaria para hibridar con el ADN diana en presencia de un
agente recombinasa. La región monocatenaria puede ser, por ejemplo,
de aproximadamente 10 bases a aproximadamente 15 bases,
aproximadamente 20 bases, aproximadamente 25 bases, aproximadamente
30 bases, aproximadamente 40 bases y aproximadamente 50 bases.
Pueden utilizarse regiones incluso más largas tales como
aproximadamente 75 bases, aproximadamente 100 bases,
aproximadamente 150 bases o más aunque no es necesario. La elección
de regiones monocatenarias dependerá de la complejidad del ácido
nucleico de partida de manera que, por ejemplo, un genoma humano
puede requerir un cebador más largo mientras que un plásmido puede
requerir un cebador mucho más
corto.
corto.
Las dos cadenas de ácido nucleico en un ADN
bicatenario no necesitan ser completamente complementarias. Por
ejemplo, la región bicatenaria de un ADN bicatenario puede diferir
hasta un 1% en secuencia. Esto es, la secuencia de dos cadenas de
ácido nucleico pueden diferir en una base en cien bases y existirá
aún en una condición bicatenaria en disolución. Los ácidos
nucleicos con una diferencia de un 1% en su secuencia complementaria
se contemplan como ADN bicatenarios para los propósitos de esta
descripción.
Además, el ácido nucleico diana (es decir, el
ácido nucleico que se quiere amplificar por los métodos RPA
descritos) puede ser parcialmente bicatenario y parcialmente
monocatenario. Por ejemplo, el ácido nucleico en cualquiera de las
configuraciones de la Figura 5 sería adecuado como un ácido nucleico
diana de la invención. Como se ha discutido, el ácido nucleico
diana puede ser ARN. El ARN puede convertirse en ADNc bicatenario
utilizando métodos conocidos y el ADNc bicatenario puede utilizarse
como el ácido nucleico diana. Como se muestra en la Figura 5, el
ácido nucleico molde puede tener cualquier combinación de extremos
seleccionados de 3' protuberante, 5' protuberante o extremos
romos.
El método de RPAls descrito comprende al menos
las etapas siguientes. En primer lugar, se pone en contacto un
agente recombinasa con dos cebadores de ácido nucleico (referidos en
la presente memoria como un primer y un segundo cebador) para
formar dos cebadores de nucleoproteína (referidos en la presente
memoria como un primer cebador de nucleoproteína y un segundo
cebador de nucleoproteína).
En segundo lugar, el primer y segundo cebador de
nucleoproteína se ponen en contacto con el ácido nucleico molde
para formar una estructura bicatenaria en una primera parte de la
primera cadena y una segunda estructura bicatenaria en una segunda
parte de la segunda cadena. Los dos cebadores se diseñan de manera
que cuando hibridan, se apuntan entre sí como se ilustra en la
Figura 6A. Alternativamente, el cebador 1 y el cebador 2 pueden
hibridar con diferentes ácidos nucleicos diana como se ilustra en la
Figura 6B.
En tercer lugar, los cebadores de nucleoproteína
se extienden en sus extremos 3' para generar un primer y un segundo
ácido nucleico bicatenario (Figura 7A). Cuando los cebadores
hibridan con diferentes ácidos nucleicos diana, la elongación de
los cebadores generará cadenas desplazadas (Figura 7B). En este
caso, las dos cadenas desplazadas que resultan de la elongación de
los cebadores pueden hibridar y formar un nuevo ácido nucleico
bicatenario molde (Figura 7C).
Las etapas dos y tres se repiten hasta que se
alcanza el grado deseado de amplificación. El proceso es un proceso
dinámico ya que se deja que la hibridación del cebador con el ácido
nucleico diana y la elongación progresen de manera continua. Una
ventaja es que la amplificación se lleva a cabo continuamente sin la
necesidad de ciclos de temperatura o adición de enzima después del
inicio de la reacción.
En una realización, las etapas dos y tres se
repiten al menos 5 veces. Preferiblemente, se repiten al menos 10
veces. Más preferiblemente, se repiten al menos 20 veces, tal como
al menos 30 veces. Lo más preferiblemente, las dos etapas se
repiten al menos 50 veces. Para repeticiones múltiples de la etapa
de amplificación (por ejemplo, etapa 2 y 3) una RPA de la invención
empieza preferiblemente con una proporción cebador a ácido nucleico
diana de al menos 100 a 1, preferiblemente al menos 300 a 1 y lo más
preferiblemente al menos 1.000 a 1. Esto es, hay al menos 100, 300
ó 1.000 copias del cebador por copia de un ácido nucleico diana.
En una etapa opcional, después de un ciclo
suficiente de amplificación, pueden añadirse componentes adicionales
a la reacción después de un periodo de tiempo para incrementar la
eficacia global de la amplificación. En una realización, los
componentes adicionales pueden ser uno o más de los siguientes:
agentes recombinasa, uno o más cebadores, polimerasa y uno o más
agentes adicionales (que se discuten en una sección independiente
más adelante).
En una realización preferida, una pequeña
fracción de una primera reacción de RPA se utiliza como suministro
de ADN molde para ciclos posteriores de amplificación por RPA. En
este método, se lleva a cabo una primera reacción de amplificación
por RPA en un ácido nucleico diana. Después de la primera reacción
de RPA, se utiliza una pequeña fracción de la reacción total como
sustituto del ácido nucleico diana para un ciclo posterior de
reacción de RPA. La fracción puede ser, por ejemplo, menos de
aproximadamente el 10% de la primera reacción. Preferiblemente, la
fracción puede ser menos de aproximadamente el 5% de la primera
reacción. Más preferiblemente, la fracción puede ser menos del 2%
de la primera reacción. Lo más preferiblemente, la fracción puede
ser menos del 1% de la reacción inicial.
El cebador utilizado en RPA es preferiblemente
ADN aunque PNA y ARN también son adecuados para utilizarse como
cebadores. Se indica que, de hecho, en la replicación del ADN las
ADN polimerasas elongan el ADN genómico a partir de cebadores de
ARN.
Los oligonucleótidos sintéticos pueden servir
como cebador de ADN y pueden utilizarse como sustratos para la
formación de filamentos de nucleoproteína con RecA o sus homólogos.
Las secuencias tan cortas como 15 nucleótidos son capaces de
localizar ADN bicatenario diana (Hsieh et al., 1992). Dichos
oligonucleótidos pueden sintetizarse según química de
fosforoamidato estándar o de otra manera. Las químicas de bases
modificadas y/o núcleo conector pueden ser deseables y funcionales
en algunos casos. Además, los oligonucleótidos pueden modificarse en
sus extremos, bien 5' ó 3', con grupos que sirven para varios
propósitos, por ejemplo, grupos fluorescentes, pantallas, grupos
protectores (bloqueantes) (reversibles o no), etiquetas magnéticas,
proteínas, etc. En algunos casos, pueden utilizarse
oligonucleótidos monocatenarios para la invasión de cadena, en otros
pueden utilizarse ácidos nucleicos sólo parcialmente
monocatenarios, habiéndose hibridado con anterioridad la cadena 5'
de la secuencia de un ácido nucleico invasor con un
oligonucleótido.
En otra realización, los cebadores pueden
comprender una región 5' que no es homóloga con el ácido nucleico
diana. Debe indicarse que los procesos de la invención deberían ser
funcionales incluso si los cebadores no son completamente
complementarios con el ácido nucleico diana. Los cebadores pueden no
ser complementarios por tener secuencias adicionales en su extremo
5'. Estas secuencias adicionales pueden ser, por ejemplo, la
secuencia para un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de
restricción o la secuencia que es complementaria a un cebador de
secuenciación. El sitio de reconocimiento de la endonucleasa de
restricción puede ser útil para la escisión posterior de la
secuencia amplificada. También se contempla la utilización de
endonucleasas de restricción que escinden el ácido nucleico fuera
del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. La
secuencia que es complementaria de un cebador de secuenciación puede
permitir una secuenciación rápida del ADN del producto amplificado
utilizando cebadores disponibles comercialmente o equipos de
secuenciación disponibles comercial-
mente.
mente.
La formación de filamentos de nucleoproteína
puede llevarse a cabo por incubación del cebador (oligonucleótidos)
con la proteína RecA o sus homólogos en presencia de ATP y proteínas
auxiliares tales como RecO, RecR y RecF. Cuando se incuba a 37ºC en
tampón RecA (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM
MgCl_{2}, 2 mM ATP, 2 mM DTT y 100 \mug/ml de Albúmina de Suero
Bovino), RecA formará filamentos helicoidales en ADNss con 6
protómeros por vuelta. El ADN está localizado en el interior de la
hélice de la proteína. En presencia de ADNds, el filamento de
nucleoproteína RecA/ADNss puede explorar el ADN a velocidades de al
menos 10^{7} pb por hora. El modo de exploración no está claro
pero se hace a una velocidad (>10^{3} pb por segundo) que puede
implicar sólo los pocos pares de bases iniciales a los que se puede
acceder fácilmente a lo largo de una cara del surco principal. La
unión exitosa puede resultar en una transición a un intermedio de
triple hélice, a la que sigue la invasión y desplazamiento de
cadenas para formar un bucle D. Dicha combinación de moléculas puede
formarse en condiciones similares a las descritas anteriormente
para la formación de filamentos helicoidales y, por lo tanto, en
presencia de ADNss, el ADNds homólogo, RecA, ATP, proteínas
auxiliares y condiciones adecuadas de tampón y temperatura, la
combinación de moléculas se formará espontáneamente. Si se utiliza
ATP el ensamblaje es irreversible y alcanzará el equilibrio aunque
los filamentos de RecA/ADNss pueden estabilizarse, incluso en
presencia de SSB, por las proteínas auxiliares RecO y RecR. En el
caso de proteínas termoestables la temperatura de incubación puede
ser más alta. Si se requiere un suministro renovable de ATP puede
incluirse en la reacción un sistema de regeneración estándar
de
ATP.
ATP.
Las ADN polimerasas pueden utilizar el
3'-hidroxilo libre de la cadena invasora para
catalizar la síntesis de ADN por incorporación de nuevos
nucleótidos. Varias polimerasas pueden utilizar el
3'-hidroxilo de la cadena invasora para catalizar
la síntesis y desplazar simultáneamente la otra cadena al producirse
la síntesis. Por ejemplo, la polimerasa II o III de E. coli
puede utilizarse para extender los bucles D invadidos (Morel et
al., 1997). Además, puede utilizarse la polimerasa V de E.
coli utilizada normalmente en mutaciones que son diana para el
sistema de lesión SOS en E. coli (Pham et al., 2001).
Todas estas polimerasas pueden convertirse en altamente procesivas
a través de sus interacciones y cooperación con la pinza dímero
\beta así como la proteína de unión al ADN monocatenario (SSB) y
otros componentes. También pueden utilizarse otras polimerasas de
procariotas, virus y eucariotas para extender la cadena
invasora.
invasora.
En otra realización, el cebador puede ser
parcialmente bicatenario, parcialmente monocatenario y con al menos
una protuberancia 3' monocatenaria. En esta realización, el cebador
puede comprender una cadena invasora y una cadena no invasora como
se muestra en la Figura 8A. En este caso, después de que la cadena
invasora hibride con el ADN diana y se elongue, sirve como un ácido
nucleico diana para un segundo cebador como se muestra en la Figura
8B. La elongación del segundo cebador desplazará a la cadena no
invasora como se muestra en la Figura 8C. En esta realización, al
amplificarse el ácido nucleico diana, la cadena no invasora del
cebador 1 se desplaza. Si tanto el cebador uno como el cebador dos
son cebadores parcialmente bicatenarios, las cadenas no invasoras
tanto del cebador uno como del cebador dos se acumularán en la
disolución al amplificarse el ácido nucleico
diana.
diana.
En una realización, al menos dos de los
cebadores en una reacción RPA son parcialmente bicatenarios y
parcialmente monocatenarios cada uno de ellos generado por
hibridación de una cadena invasora y una cadena oligonucleotídica
no invasora, que poseen secuencias con una complementariedad
suficiente para formar una región bicatenaria. Preferiblemente, las
dos cadenas oligonucleotídicas son suficientemente complementarias
respecto a la región relevante para formar una estructura
bicatenaria en las condiciones de la reacción RPA.
En una realización, los cebadores, incluyendo
los cebadores monocatenarios y parcialmente bicatenarios, se marcan
con un marcador detectable. Debe indicarse que un apantallador de
fluorescencia también se considera un marcador detectable. Por
ejemplo, el apantallador de fluorescencia puede ponerse en contacto
con un marcador fluorescente y se detecta la cantidad de
apantallamiento. El marcador detectable debe ser tal que no
interfiera con la reacción de elongación. Cuando el cebador es
parcialmente bicatenario con una cadena invasora y una cadena no
invasora, el marcador detectable debe estar unido de una manera tal
que no interfiera con la reacción de elongación de la cadena
invasora. La cadena no invasora de un cebador parcialmente
bicatenario no se elonga por lo que no hay limitaciones en el
marcaje de la cadena no invasora con la única excepción de que el
marcaje de la cadena no invasora no interfiera con la reacción de
elongación de la cadena invasora. Los cebadores marcados ofrecen la
ventaja de una detección más rápida del producto amplificado.
Además, la detección del marcador no incorporado, es decir, los
oligonucleótidos marcados que no se han extendido, permitirá el
seguimiento del estado de la
reacción.
reacción.
El seguimiento de una reacción RPA puede
implicar, por ejemplo, la eliminación de una fracción de una
reacción RPA, aislando la fracción no incorporada, y detectar el
cebador no incorporado. Como el tamaño del cebador no incorporado
puede ser menor de 50 pb, menor de 40 pb, menor de 30 pb o menor de
25 pb, y el tamaño del producto amplificado puede ser mayor de 1
Kb, mayor de 2 Kb, mayor de 5 Kb o mayor de 10 Kb, hay una gran
diferencia de tamaño entre el cebador incorporado y no incorporado.
El aislamiento del cebador no incorporado puede llevarse a cabo
rápidamente utilizando cromatografía de exclusión por tamaño tal
como, por ejemplo, una columna spin. Si un cebador está marcado,
puede llevarse a cabo un procedimiento de seguimiento que comprende
una columna spin y una determinación (por ejemplo, fluorescencia o
radiactividad) en menos de un minuto. Otra alternativa para separar
los cebadores elongados de los cebadores no elongados implica la
utilización de PAGE. Por ejemplo, el cebador elongado puede
separarse del cebador no elongado por electroforesis en gel en menos
de 5 minutos. Otra alternativa más para separar los cebadores
elongados implica la utilización de oligonucleótidos inmovilizados.
Por ejemplo, pueden utilizarse oligonucleótidos homólogos a las
secuencias encontradas únicamente en la secuencia de ADN
amplificada para capturar ácidos nucleicos producidos
específicamente por la elongación del cebador. Estos
oligonucleótidos de captura están inmovilizados en un chip u otro
sustrato. La captura de los oligonucleótidos elongados por los
oligonucleótidos de captura puede llevarse a cabo mediante métodos
mediados por la proteína RecA o mediante hibridaciones en disolución
tradicionales si es necesario.
En otra realización, un cebador bicatenario
puede marcarse de manera que pueda detectarse la separación de las
dos cadenas del cebador. Como se ha discutido anteriormente, después
de múltiples ciclos de elongación, se separan la cadena invasora y
las cadenas no invasoras de un cebador parcialmente bicatenario.
Después de esta separación, la cadena no invasora no participa en
la reacción RPA. Esta característica puede utilizarse para detectar
y hacer un seguimiento de una reacción RPA de varias maneras.
En esta solicitud, el marcador detectable puede
ser un marcador fluorescente o una enzima y el apantallador del
marcador (también referido como el inhibidor del marcador) puede ser
un apantallador de la fluorescencia o un inhibidor de la enzima. En
estos casos, el marcador se detecta por inhibición de la
fluorescencia o de la enzima. La detectabilidad del marcador será
la fluorescencia si se utiliza un marcador fluorescente o la
actividad enzimática si se utiliza una enzima.
En el primer método, la cadena invasora puede
marcarse con un marcador y la cadena no invasora puede marcarse con
un apantallador del marcador detectable. El marcador, situado cerca
del apantallador del marcador (inhibidor del marcador) en el
cebador parcialmente bicatenario no se detectará en gran medida.
Después de la RPA, la cadena invasora se separará de la cadena no
invasora y, así, el marcador y el apantallador del marcador se
separarán. La separación causará que el marcador sea más detectable.
Así, las reacciones RPA pueden seguirse determinando los
incrementos de la cantidad de marcador detectable.
El segundo método es similar al primer método
excepto en que la cadena invasora está modificada con un
apantallador del marcador mientras que la cadena no invasora está
modificada con un marcador. Después, se deja que la RPA continúe
con el resultado (el mismo que el del método 1) de que el marcador
se separa del apantallador del marcador. Así, se incrementará la
detectabilidad global del marcador.
El tercer método implica el marcaje de la cadena
no invasora de un cebador bicatenario con un marcador. Además, la
cadena no invasora de un segundo cebador bicatenario se marca con un
apantallador del marcador. Las dos cadenas no invasoras se diseñan
para ser complementarias entre sí. En esta configuración, la
reacción RPA es inicialmente fluorescente. Al progresar la reacción
RPA, las dos cadenas no invasoras se desplazan en disolución e
hibridan entre sí porque están diseñadas para ser complementarias.
Al hibridar, el marcador y el apantallador del marcador se
aproximan entre sí y disminuye la fluorescencia de la reacción. El
progreso de la reacción RPA puede determinarse haciendo un
seguimiento de la disminución de la detectabilidad del marcador.
En un cuarto método, las cadenas no invasoras de
un primer y segundo cebador bicatenario se marcan con un primer
marcador y un segundo marcador. Las dos cadenas no invasoras también
se diseñan para ser complementarias entre sí. Como en el tercer
método, después de la RPA, las dos cadenas no invasoras hibridan
entre sí y la cercanía de los dos marcadores será un reflejo del
progreso de la reacción RPA. La cercanía de los dos marcadores
puede determinarse, por ejemplo, por la observación directa o por el
aislamiento de las cadenas no invasoras. Como se ha discutido
anteriormente, el aislamiento de los cebadores y de otros ácidos
nucleicos pequeños puede conseguirse mediante columnas de exclusión
por tamaño (incluyendo columnas spin) o mediante electroforesis en
gel.
En otra realización, la cadena no invasora de
uno o de los dos cebadores es homóloga a una segunda región de
ácido nucleico de manera que el cebador puede hibridar con ella y
cebar la síntesis de ADN en la segunda región del ácido nucleico.
Utilizando este método, puede comenzar una segunda reacción RPA
utilizando la cadena no invasora del cebador de una primera RPA. El
producto de la segunda RPA puede seguirse para determinar el
progreso de la primera RPA.
En otra realización más, la cadena no invasora
se detecta mediante un biosensor específico para la secuencia de la
cadena no invasora. Por ejemplo, el biosensor puede ser una
superficie con una secuencia de ácido nucleico complementaria a la
cadena no invasora. El biosensor puede evaluar una característica
que resulta de la unión de la cadena no invasora. La característica
puede ser un marcador detectable.
Los marcadores detectables adecuados para
cualquiera de los métodos descritos incluyen enzimas, sustratos de
enzimas, coenzimas, inhibidores de enzimas, marcadores
fluorescentes, cromóforos, marcadores luminiscentes, radioisótopos
(incluyendo radionucleótidos) y un miembro de un par de unión. Los
ejemplos más específicos incluyen fluoresceína, ficobiliproteína,
tetraetil rodamina y beta-gal. Los pares de unión
pueden incluir biotina/avidina, biotina/estreptavidina,
antígeno/anticuerpo, ligando/receptor y análogos y mutantes de los
pares de unión.
El agente recombinasa puede ser RecA, RadA,
RadB, Rad51 o un análogo funcional u homólogos de estas proteínas.
Si se desea, la recombinasa puede ser un agente recombinasa sensible
a la temperatura (referido en la presente memoria como
"ts"). Si se utiliza una recombinasa ts, la
reacción RPA puede comenzar a una temperatura (la temperatura
permisiva) y terminar a otra temperatura (la temperatura no
permisiva). Las combinaciones de temperaturas permisivas pueden
ser, por ejemplo, 25ºC/30ºC, 30ºC/37ºC, 37ºC/42ºC y semejantes. En
una realización preferida, la proteína ts es reversible. Una
actividad reversible de la proteína ts se restaura cuando se
cambia de la temperatura no permisiva a la temperatura
permisiva.
En una realización preferida, la RPA se lleva a
cabo en presencia de ATP, un análogo de ATP u otro nucleósido
trifosfato. El análogo de ATP puede ser, por ejemplo, ATP\gammaS,
dATP, ddATP u otro nucleósido trifosfato análogo tal como UTP.
Otros reactivos útiles que pueden añadirse a una
reacción RPA incluyen nucleótidos trifosfato (es decir, dNTP tales
como dATP, dTTP, dCTP, dGTP y derivados y análogos de estos) y una
ADN polimerasa. Otros reactivos útiles para RPA líder/retardada
incluyen NTP (ATP, GTP, CTP, UTP y derivados y análogos de estos).
Una ventaja de la reacción RPA es que no hay límite en el tipo de
polimerasa utilizado. Por ejemplo, pueden utilizarse tanto
polimerasas eucariotas como procariotas. Las polimerasas procariotas
incluyen, al menos, pol I de E. coli, pol II de E.
coli, pol III de E. coli, pol IV de E. coli y polV
de E. coli. Las polimerasas eucariotas incluyen, por
ejemplo, complejos de polimerasa multiproteicos seleccionados del
grupo que consiste en pol-\alpha,
pol-\beta, pol-\delta y
pol-\varepsilon.
En otra realización, el proceso de RPA se lleva
a cabo en presencia de un componente accesorio para mejorar la
procesividad o fidelidad de la polimerasa. Pueden utilizarse
componentes accesorios tanto de eucariotas como de procariotas.
Preferiblemente, el componente accesorio es una proteína accesoria
de E. coli. Las proteínas accesorias útiles incluyen
proteína de unión a una cadena, helicasa, topoisomerasa y resolvasa.
Otras proteínas accesorias útiles incluyen una pinza deslizante
seleccionada del grupo que consiste en una pinza deslizante dímero
\beta de E. coli, una pinza deslizante PCNA eucariota y una
pinza deslizante gp45 de T4. Otros componentes accesorios incluyen
un complejo de holoenzima de ADN Polimerasa III que consiste en
Pinza \beta, Cargador de Pinza DnaX y el Complejo Central de
Polimerasa. Otros componentes accesorios más incluyen RuvA, RuvB,
RuvC y RecG. Las propiedades que aporta la utilización de
componentes adicionales permitirán probablemente la amplificación
de ADN grandes que previamente no habían podido ser dianas exitosas
mediante los métodos actuales tales como
PCR.
PCR.
En otra realización, la RPA se lleva a cabo en
presencia de agentes utilizados para estabilizar filamentos de
nucleoproteína RecA/ADNss. Por ejemplo, el agente puede ser RecR,
RecO, RecF o una combinación de estas proteínas. Otros agentes
útiles incluyen PriA, PriB, DnaT, DnaB, DnaC y DnaG.
Un beneficio de los métodos descritos es que la
reacción RPA puede llevarse a cabo a temperaturas reducidas
comparado con una reacción PCR. Por ejemplo, el proceso de RPA puede
llevarse a cabo entre 20ºC y 50ºC. Preferiblemente, el proceso de
RPA se lleva a cabo a menos de 45ºC. Más preferiblemente, el proceso
de RPA puede llevarse a cabo a menos de 40ºC. Aún más
preferiblemente, el proceso de RPA puede llevarse a cabo a menos de
35ºC. Lo más preferiblemente, el proceso de RPA puede llevarse a
cabo a menos de 30ºC. Una de las razones por las que el proceso de
RPA puede llevarse a cabo a estas temperaturas reducidas es que RPA
se lleva a cabo sin la fusión inducida por temperatura del ácido
nucleico molde. Además, al contrario que la PCR, no se requiere un
control absoluto de la temperatura y la temperatura puede fluctuar
sin afectar adversamente la RPA. Por ejemplo, la magnitud de la
fluctuación puede estar en cualquier lugar dentro de las
temperaturas especificadas anteriormente. La temperatura necesaria
para fundir el ADN bicatenario también contribuye a la inactivación
prematura de la enzima, una desventaja ausente en los métodos de
esta invención.
La RPA puede llevarse a cabo para ensayar la
presencia o ausencia de un genotipo. El genotipo ensayado puede
estar asociado a una enfermedad o una predisposición a una
enfermedad. Alternativamente, el genotipo puede estar asociado a un
fenotipo normal o a un fenotipo que confiere una resistencia
especial a una enfermedad. El genotipo tal y como se ha descrito
anteriormente puede ser cualquier variante genética estándar tal
como una mutación puntual, una deleción, una inserción, una
inversión, una mutación en el marco de lectura, un evento de
entrecruzamiento o la presencia o ausencia de múltiples copias de
una secuencia genética (por ejemplo, la presencia de
minicromosomas).
minicromosomas).
Un método para detectar un genotipo es detectar
la distancia entre un par de cebadores en una reacción RPA. La
distancia entre un par de cebadores se refleja por el tamaño de la
secuencia amplificada. En este método, los dos cebadores se
seleccionan de manera que abarquen una región diana tal como, por
ejemplo, un gen. Entonces se lleva a cabo la RPA utilizando el par
de cebadores y se analiza el producto de la RPA. El análisis puede
implicar la determinación del tamaño o secuencia del producto
amplificado. Los métodos para determinar el tamaño de una secuencia
de ADN, incluyendo al menos técnicas tales como geles de agarosa,
geles de PAGE, espectroscopía de masa, geles de campo pulsado,
chips de genes, sedimentación en sacarosa y semejantes, son
conocidos. Existen muchos métodos de secuenciación de ADN y sus
variantes, tales como la secuenciación de Sanger utilizando
terminación didesoxi y electroforesis en gel desnaturalizante
(Sanger, F., Nichlen, S. y Coulson, A.R. Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 75, 5463-5467 (1977)), secuenciación de
Maxam-Gilber utilizando escisión química y
electroforesis en gel desnaturalizante (Maxam, A.M. y Gilbert, W.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560-564 (1977)),
pirosecuenciación con detección del pirofosfato (PPi) liberado
durante la reacción de la ADN polimerasa (Ronaghi, M., Uhlen, M. y
Nyren, P. Science 281, 363, 365 (1998)) y secuenciación por
hibridación (SBH) utilizando oligonucleótidos (Lysov, I.,
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Elder, J.K. Genomics 13, 1008-1017 (1992)).
Un método para detectar un genotipo es utilizar
cebadores que son específicos para un genotipo particular. Por
ejemplo, puede diseñarse un cebador para amplificar eficazmente un
genotipo pero ineficazmente o no amplificar otro genotipo. En una
realización, el cebador puede comprender una secuencia 3' que es
complementaria a un genotipo (por ejemplo, un genotipo de
enfermedad genética) pero no a otro genotipo (por ejemplo, un
genotipo
normal).
normal).
El genotipo que se quiere determinar puede ser
indicativo de una enfermedad tal como, por ejemplo, la presencia de
un oncogén activado; la presencia del gen para la enfermedad de
Huntington o la ausencia de un anti-
oncogén.
oncogén.
Las bases 3' de los cebadores son especialmente
importantes para determinar la especificidad y eficacia de una
reacción RPA. Un cebador puede diseñarse de manera que la base 3'
sea complementaria a un genotipo y no complementaria a otro
genotipo. Esto permitirá la RPA eficaz de un genotipo y una RPA
ineficaz (si existe) del segundo genotipo. Se indica que el método
es eficaz si uno solo de los cebadores del par de cebadores puede
diferenciar entre diferentes genotipos (por tener diferentes
eficacias de amplificación). En una realización preferida, ambos
cebadores en una reacción RPA pueden diferenciar entre diferentes
genotipos. En este ejemplo anterior, los cebadores son
complementarios a un genotipo y no son complementarios a un segundo
genotipo por una base en su extremo 3'. En una realización
preferida, el cebador no es complementario al segundo genotipo por
al menos una base en su extremo 3'. Preferiblemente, el cebador no
es complementario al segundo genotipo por al menos 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9 ó 10 bases en su extremo 3'. Lo más preferiblemente, el
cebador es completamente no complementario o no puede hibridar con
el segundo genotipo mientras que puede hibridar con dicho primer
genotipo.
En algunos de los métodos discutidos, la
presencia o ausencia de un producto amplificado proporciona la
indicación de la presencia o ausencia de un genotipo. En estos
casos, la reacción RPA puede evaluarse por los métodos discutidos a
lo largo de la especificación.
En una realización preferida, una reacción RPA
para genotipar amplificará una secuencia independientemente del
genotipo del paciente. Sin embargo, el genotipo de un paciente
alterará una característica de la secuencia amplificada. Por
ejemplo, la secuencia amplificada puede tener un tamaño o secuencia
diferente para un genotipo respecto al otro genotipo. En este
sentido, la reacción RPA contendrá un control interno para indicar
que la reacción de amplificación se ha llevado a cabo exitosamente.
Naturalmente, también se prevé un método de RPA que incluye uno o
más pares adicionales de cebadores como controles para el
rendimiento de la reacción de RPA.
En otra realización, una reacción RPA puede
utilizarse para determinar la presencia o ausencia de una molécula
de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede ser de
cualquier organismo. Por ejemplo, puede determinarse la composición
microbiana de una muestra utilizando una batería de reacciones RPA
dirigidas al ácido nucleico de diferentes microbios. La RPA es
especialmente útil para la detección de microbios. En una
realización, los patógenos se seleccionan de virus, bacterias,
parásitos y hongos. En realizaciones adicionales, los patógenos son
virus seleccionados de influenza, rubéola,
varicela-zoster, hepatitis A, hepatitis B, otros
virus de hepatitis, herpes simple, polio, viruela, virus de la
inmunodeficiencia humana, vaccinia, rabia, Epstein Barr, retrovirus
y rinovirus. En otra realización, los patógenos son bacterias
seleccionadas de Escherichia coli, Mycobacterium
tuberculosis, Salmonella, Chlamydia y
Streptococcus. En una realización adicional más, los
patógenos son parásitos seleccionados de Plasmodium,
Trypanosoma, Toxoplasma gondii y Onchocerca. Sin embargo,
no se pretende que los presentes métodos estén limitados a los
géneros y/o especies específicas listadas anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
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Ejemplo
1
Las secuencias de ADN pueden amplificarse
utilizando la síntesis de la cadena líder según el método de
amplificación por Recombinasa-Polimerasa (RPA)
representado en la Figura 1.
Se monta una reacción con la composición
siguiente:
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La reacción se monta de manera que la
concentración final satisface los Componentes de la
Formación/Resolución del Bucle D, Mezcla
Polimerasa/Helicasa/Resolvasa y Tampón de la Reacción añadiéndose la
ADN polimerasa y/o el molde lo último si es necesario. Por ejemplo,
puede hacerse una disolución concentrada 2X de Componentes de
Formación/Resolución del Bucle D y de la Mezcla
Polimerasa/Helicasa/Resolvasa en tampón de la reacción 1X. La
reacción puede iniciarse mezclando un volumen igual de cada uno de
los dos componentes (cada uno en tampón de la reacción 1x).
Opcionalmente, como se ha indicado anteriormente, la ADN polimerasa
o molde (ADN diana) puede añadirse lo último. La reacción se incuba
durante un tiempo suficiente hasta que los reactantes se hayan
consumido. Los tiempos típicos de incubación variarán de 1 hora, 2
horas, 3 horas, 5 horas, 10 horas o toda la noche (aproximadamente
16 horas). Al contrario que la PCR, que requiere volúmenes pequeños
para un cambio rápido de la temperatura, no existe límite para el
volumen de reacción de la RPA. Pueden utilizarse volúmenes de
reacción de 25 \mul, 50 \mul, 100 \mul, 1 ml, 10 ml y 100 ml o
mayores en un recipiente. La temperatura de incubación puede ser
las temperaturas típicas de laboratorio tales como 25ºC, 30ºC ó
37ºC.
Antes de la adición del ADN molde y/o
Polimerasa, RecA y SSB competirán para unirse a los cebadores
oligonucleotídicos monocatenarios. En presencia de RecR y RecO,
RecA se estabiliza selectivamente en los cebadores monocatenarios
formando los filamentos de nucleoproteína RecA en un complejo con
RecO y RecR. Este complejo es competente para invadir ADN
bicatenario para formar un bucle D en sitios homólogos a los
cebadores oligonucleotídicos. Alternativamente, RecA, RecO y RecR
pueden precargarse en cebadores oligonucleotídicos antes de la
introducción de SSB en la mezcla de reacción (Figura 1). Las
cadenas invasoras se extenderán por la polimerasa en una dirección
5' a 3'. Al formarse los bucles D y proceder la síntesis, el ADN
monocatenario desplazado se recubre con SSB. La liberación de RecA
del ADN bicatenario puede ocurrir mediante la hidrólisis de ATP en
una dirección 5' a 3' o como resultado de la actividad
helicasa/resolvasa o polimerasa (Figura 2A, B). Continuamente se
producirán nuevos ciclos de invasión/síntesis. El tercer ciclo de
invasión de cadenas/síntesis liberará productos discretos cuyos
extremos corresponden a los dos sitios opuestos del cebador. Estos
fragmentos se convertirán pronto en el producto predominante de la
reacción y se acumularán a niveles altos. Al avanzar cada complejo
sintético hacia el extremo del molde, la proteína RecA es
desplazada bien por la actividad de la polimerasa o por la
actividad de las helicasas, tales como RuvAB o resolvasas, tales
como RuvC. Una vez que se han consumido los cebadores, ATP,
desoxinucleósidos trifosfato o cualquier otro componente limitante,
la reacción se
detendrá.
detendrá.
La inclusión de mutantes de RecA sensibles a la
temperatura permitirá el inicio controlado de la síntesis de ADN.
En dicha situación, la reacción de inicio se lleva a cabo a 25 a
37ºC lo que permite la formación de bucles D. Las reacciones de
elongación se llevan a cabo a 42ºC, que no es permisiva para la
invasión bicatenaria mediada por RecA. El número de ciclos
determinará la cantidad del producto de la reacción. Las fases más
amplias de elongación permitirán la amplificación de ADN
extremadamente largos sin interferencia de reinvasión.
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Ejemplo
2
La reacción de RPA se lleva a cabo como se
describe en el Ejemplo 1. Una fracción de un décimo (1/10) y un
centésimo (1/100) de la reacción se toma y se utiliza en lugar del
ADN molde en un segundo ciclo de RPA. Para la RPA anidada pueden
utilizarse RPAls, RPA líder/retardada y combinaciones de estas.
\newpage
Ejemplo
3
Las secuencias de ADN pueden amplificarse
utilizando la síntesis simultánea de la cadena líder y retardada
según el método de amplificación por
Recombinasa-Polimerasa (RPA) representado en la
Figura 2.
Se monta una reacción con la composición
siguiente:
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La reacción se monta de manera que la
concentración final de todos los reactivos es como se ha listado
anteriormente. Así, por ejemplo, una disolución concentrada 5 veces
de cada uno de los componentes (Componentes de la
Formación/Resolución del bucle D, Mezcla Helicasa/Resolvasa,
Complejo de Primosoma, Complejo holoenzima de ADN Polimerasa III,
Mezcla de la Cadena Retardada) se hace en tampón de la reacción 1X.
Después, las cinco disoluciones se mezclan entre sí en volúmenes
iguales para iniciar la reacción. La reacción se incuba durante un
tiempo suficiente hasta que los reactantes se hayan consumido. Los
tiempos típicos de incubación variarán de 1 hora, 2 horas, 3 horas,
5 horas, 10 horas o toda la noche (aproximadamente 16 horas). Como
se ha indicado anteriormente, no existe límite para el volumen de
reacción de la RPA. Pueden utilizarse volúmenes de reacción de 25
\mul, 50 \mul, 100 \mul, 1 ml, 10 ml y 100 ml o mayores en un
recipiente. La temperatura de incubación puede ser las temperaturas
típicas de laboratorio tales como 25ºC, 30ºC ó 37ºC.
En primer lugar, el primosoma se carga en el
bucle D formado por la invasión del filamento de nucleoproteína
RecA. El primosoma sintetiza una cadena de cebador de ARN.
Finalmente, el primosoma recluta el cargador de la pinza, que
recluta tanto al dímero de pinza deslizante como al núcleo
asimétrico de la ADN polimerasa (Figura 3A).
La síntesis ocurre simultáneamente tanto en la
dirección líder como en la retardada. Eventualmente, la síntesis de
la cadena retardada se para y la pinza de la cadena retardada se
descarga. La síntesis de la cadena líder continúa hasta que se
forma un nuevo sitio de síntesis de la cadena retardada (Figura
3B).
Mientras que la síntesis de la cadena líder
continúa, se forma un nuevo sitio de síntesis de la cadena
retardada. La síntesis de la cadena retardada continúa hacia el
fragmento de Okazaki previo donde se descarga la pinza de la cadena
retardada (Figura 3C).
La ADN Polimerasa I elimina el cebador de ARN y
rellena el hueco mientras la ADN ligasa conecta los dos fragmentos
de Okazaki formando una cadena retardada continua (Figura 3D).
Claims (54)
-
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1. Un proceso de RPA para la amplificación de ADN de una secuencia diana bicatenaria, comprendiendo dicha secuencia diana una primera y una segunda cadena de ADN, que comprende las etapas de:(a) poner en contacto un agente recombinasa con un primer y un segundo cebador de ácido nucleico en presencia de ATP, RecO, RecR y RecF para formar un primer y segundo cebador de nucleoproteína;(b) poner en contacto el primer y segundo cebador de nucleoproteína con dicha secuencia diana bicatenaria formando así una primera estructura bicatenaria en una primera parte de dicha primera cadena y formando una estructura bicatenaria en una segunda parte de dicha segunda cadena de manera que los extremos 3' de dicho primer cebador de ácido nucleico y dicho segundo cebador de ácido nucleico están orientados uno hacia el otro en la misma molécula de ácido nucleico molde;(c) extender el extremo 3' de dicho primer y segundo cebador de nucleoproteína con una o más polimerasas y dNTP para generar un primer y segundo ácido nucleico bicatenario y una primera y segunda cadena de ácido nucleico desplazada;(d) continuar la reacción mediante la repetición de (b) y (c) hasta que se alcance un grado de amplificación deseadoen el que el agente recombinasa es la proteína RecA y en el que dicho primer o dicho segundo cebador de ácido nucleico está marcado con un resto detectable. - 2. El proceso de la reivindicación 1, en el que en la etapa (c) la cadena desplazada de ácido nucleico se amplifica por una reacción de RPA concurrente.
- 3. El proceso de la reivindicación 2, en el que la cadena desplazada de ácido nucleico se amplifica: (a) poniendo en contacto el primer o el segundo cebador de nucleoproteína con dicha cadena desplazada; y (b) extendiendo dicho primer o segundo cebador de nucleoproteína con una polimerasa y dNTP.
- 4. El proceso de la reivindicación 1, en el que dicha primera y dicha segunda cadenas desplazadas son al menos parcialmente complementarias entre si y pueden hibridar para formar un ácido nucleico hijo bicatenario que puede servir como ácido nucleico molde bicatenario en una etapa posterior (b) y etapa (c).
- 5. El proceso de la reivindicación 1, en el que dicha primera y dicha segunda cadenas desplazadas son al menos parcialmente complementarias a dicho primer o dicho segundo cebador y pueden hibridar con dicho primer o dicho segundo cebador.
- 6. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicho cebador de ácido nucleico es ADN, ARN, PNA o una combinación de estos.
- 7. El proceso de la reivindicación 1, en el que dicho cebador de ácido nucleico tiene al menos una región 3' monocatenaria.
- 8. El proceso de la reivindicación 1, en el que al menos un cebador es parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario, en el que dicho cebador está comprendido por una cadena invasora larga que posee una secuencia cebadora 3' específica y una cadena no invasora más corta que es complementaria al extremo 5' de la cadena invasora más larga.
- 9. El proceso de la reivindicación 8, en el que dicho primer cebador de ácido nucleico comprende una primera cadena no invasora y dicho segundo cebador de ácido nucleico comprende una segunda cadena no invasora y dicha primera y segunda cadenas no invasoras son complementarias entre sí.
- 10. El proceso de la reivindicación 9, en el que dicha cadena invasora, dicha cadena no invasora o tanto dicha cadena invasora como dicha cadena no invasora están marcadas con un resto detectable.
- 11. El proceso de la reivindicación 10, en el que dicho resto detectable se selecciona del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un apantallador de la fluorescencia, un inhibidor de una enzima, un marcador radiactivo y una combinación de estos.
- 12. El proceso de la reivindicación 10, en el que tanto dicha cadena invasora como dicha cadena no invasora están marcadas y en el que la cadena invasora está marcada con un primer fluorocromo o una primera enzima y en el que la cadena no invasora está marcada con un segundo fluorocromo, una segunda enzima, un apantallador de la fluorescencia o un inhibidor de una enzima.
- 13. El proceso de la reivindicación 10, en el que tanto dicha cadena invasora como dicha cadena no invasora están marcadas y en el que la cadena no invasora está marcada con un primer fluorocromo o una primera enzima y en el que la cadena invasora está marcada con un segundo fluorocromo, una segunda enzima, un apantallador de la fluorescencia o un inhibidor de una enzima.
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- 14. El proceso de la reivindicación 1, en el que uno o los dos cebadores de ácido nucleico es un cebador monocatenario.
- 15. El proceso de la reivindicación 1, en el que dicho resto detectable se selecciona del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un apantallador de la fluorescencia, un inhibidor de una enzima, un marcador radiactivo y una combinación de estos.
- 16. El proceso de la reivindicación 1, en el que la etapa (d) causa el desplazamiento de la cadena no invasora.
- 17. El proceso de la reivindicación 9, en el que la cadena invasora y la cadena no invasora están marcadas y se detecta la separación de la cadena invasora y la cadena no invasora.
- 18. Un proceso según la reivindicación 1, en el que la cadena liberada de un oligonucleótido invasor parcialmente bicatenario es la secuencia complementaria de la cadena liberada del otro oligonucleótido invasor bicatenario.
- 19. Un proceso según la reivindicación 18, en el que el oligonucleótido liberado es complementario a, e hibrida con, un molde monocatenario diana y ceba la síntesis de ADN desde su extremo 3'.
- 20. Un proceso según la reivindicación 1, en el que el agente recombinasa es sensible a la temperatura, en el que dicho agente recombinasa sensible a la temperatura posee una actividad de invasión de cadena a una temperatura permisiva y no posee una actividad de invasión de cadena a una temperatura no permisiva.
- 21. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicha una o más polimerasas es una polimerasa procariota o una polimerasa eucariota.
- 22. El proceso de RPA de la reivindicación 21, en el que dicha polimerasa procariota se selecciona del grupo que consiste en pol I de E. coli, pol II de E. coli, pol III de E. coli, pol IV de E. coli, polV de E. coli o una combinación de éstas.
- 23. El proceso de RPA de la reivindicación 21, en el que dicha polimerasa eucariota es un complejo de polimerasa multiproteico eucariota seleccionado del grupo que consiste en pol-\alpha, pol-\beta, pol-\delta, pol-\varepsilon y una combinación de estos.
- 24. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicho grado de amplificación deseado es al menos 10 veces, al menos 100 veces, al menos 1.000 veces o al menos 1.000.000 de veces.
- 25. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicha primera parte y segunda parte abarcan una secuencia de ADN diana intermedia.
- 26. El proceso de RPA de la reivindicación 25, en el que dicha secuencia de ADN diana intermedia es al menos 1 megabase.
- 27. El proceso de RPA de la reivindicación 1 que se lleva a cabo en presencia de uno o más componentes accesorios.
- 28. El proceso de RPA de la reivindicación 27, en el que dicho uno o más componentes accesorios son de E. coli.
- 29. El proceso de RPA de la reivindicación 28, en el que dicho componente accesorio se selecciona del grupo que consiste en proteína de unión a una cadena, helicasa, resolvasa y una combinación de éstas.
- 30. El proceso de RPA de la reivindicación 28, en el que el uno o más componentes son proteína de unión a una cadena, RuvA, RuvB, RuvC, RecG, PriA, PriB, DnaT, DnaB, DnaC, DnaG, pinza deslizante dímero \beta de E. coli, cargador de la pinza DnaX, complejo central de polimerasa, ADN ligasa.
- 31. El proceso de RPA de la reivindicación 28, en el que dicho componente accesorio es una pinza deslizante seleccionada del grupo que consiste en pinza deslizante dímero \beta de E. coli, una pinza deslizante PCNA eucariota, una pinza deslizante gp45 de T4 y una combinación de estos.
- 32. Un proceso según la reivindicación 28, en el que ese componente accesorio es un complejo holoenzima de ADN Polimerasa III que consiste en Pinza \beta, Cargador de la Pinza DnaX y el Complejo Central de Polimerasa.
- 33. Un proceso según la reivindicación 28, en el que el componente accesorio se selecciona del grupo que consiste en proteína de unión a una cadena (SSB), una pinza deslizante, una helicasa, una resolvasa y una combinación de estos.
- 34. El proceso de la reivindicación 33, en el que la proteína de unión a una cadena (SSB) es de E. coli.
- 35. El proceso de la reivindicación 34, en el que dicha pinza deslizante es la pinza deslizante dímero \beta de E. coli, la pinza deslizante PCNA eucariota o la pinza deslizante de T4 (gp45).
- 36. Un proceso según la reivindicación 28, en el que el componente accesorio es RuvA, RuvB, RuvC y RecG.
- 37. Un proceso según la reivindicación 28, en el que el componente accesorio es un complejo de Primosoma que consiste en PriA, PriB, DnaT, DnaB, DnaC y DnaG.
- 38. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicho proceso se lleva a cabo entre 20ºC y 50ºC.
- 39. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicho proceso se lleva a cabo entre 20ºC y 40ºC.
- 40. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicho proceso se lleva a cabo entre 20ºC y 30ºC.
- 41. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que dicho proceso se lleva a cabo sin fusión inducida por temperatura del ácido nucleico molde.
- 42. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que los dos cebadores de nucleoproteína están cada uno presente en una proporción molar de al menos 1.000:1 cebador:ácido nucleico bicatenario diana.
- 43. El proceso de la reivindicación 1, en el que las etapas (b) y (c) se repiten al menos una vez.
- 44. El proceso de la reivindicación 1, en el que las etapas (b) y (c) se repiten al menos cinco veces.
- 45. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que al menos un cebador contiene uno o más nucleótidos, que no son complementarios a la secuencia específica que se quiere amplificar.
- 46. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que al menos un cebador contiene uno o más nucleótidos, que no son complementarios a la secuencia diana en su extremo 5'.
- 47. El proceso de RPA de la reivindicación 46, en el que dicho al menos un nucleótido es un oligonucleótido que comprende la secuencia de un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción.
- 48. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico amplificado contiene al menos una mutación específica que está asociada con una enfermedad genética.
- 49. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácido nucleico amplificada está contenida en un organismo patogénico, un oncogén, un oncogén activado o un oncogén reprimido.
- 50. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que al menos un cebador es complementario a una secuencia asociada con una enfermedad genética.
- 51. El proceso de RPA de la reivindicación 1, en el que al menos un cebador es complementario a una secuencia de ácido nucleico en un organismo patogénico, un oncogén, un oncogén activado o un oncogén reprimido.
- 52. Un proceso de amplificación por RPA anidada que comprende las etapas de:(a) amplificar una región de ADN utilizando el proceso de RPA de la reivindicación 1 utilizando un primer y un segundo cebador para producir un primer producto amplificado;(b) amplificar dicho producto amplificado utilizando un tercer y un cuarto cebador utilizando el proceso de RPA de la reivindicación 1 para producir un segundo producto amplificado,en el que dicho segundo producto amplificado es una secuencia más pequeña contenida en dicho primer producto amplificado.
- 53. El proceso de la reivindicación 52, en el que dicho primer cebador, dicho segundo cebador, dicho tercer cebador y dicho cuarto cebador son diferentes entre sí.
- 54. El proceso de la reivindicación 52, en el que uno de dicho primer y dicho segundo cebador es idéntico a uno de dicho tercer y cuarto cebador.
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