ES2310279T3

ES2310279T3 - Disminucion de celulas germinales primordiales en especies aviares.

Info

Publication number: ES2310279T3
Application number: ES04703077T
Authority: ES
Inventors: James N. Petitte; Samuel Lloyd Pardue
Original assignee: North Carolina State University
Current assignee: North Carolina State University
Priority date: 2003-01-16
Filing date: 2004-01-16
Publication date: 2009-01-01
Anticipated expiration: 2024-01-16
Also published as: ATE389728T1; CA2513744A1; EP1590435A2; CN1761756A; US7994388B2; DE602004012531D1; EP1590435B1; CA2513744C; HK1083864A1; WO2004065558A2; EP1590435A4; CN1761756B; US20060095980A1; MXPA05007613A; WO2004065558A8; WO2004065558A3; DE602004012531T2

Abstract

Procedimiento para modular el número de células germinales primordiales, CGP, en un embrión aviar, comprendiendo el procedimiento inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, a través del cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos para que el antígeno module el número de CGP endógenas en un embrión aviar presente dentro del huevo.

Description

Disminución de células germinales primordiales en especies aviares.

Campo técnico

El tema que se describe en la presente invención se refiere a procedimientos para modular el número de células germinales primordiales en una ave. Más particularmente, el tema que se describe en la presente invención se refiere al uso de anticuerpos que se unen a antígenos asociados a células germinales primordiales para modular el desarrollo de células germinales primordiales durante la embriogénesis en aves. Las células germinales primordiales de donante pueden administrarse al embrión aviar que se encuentra dentro de huevos producidos por aves tratadas con los procedimientos que se describen en la presente invención para crear aves quiméricas.

Técnica anterior

Las quimeras son organismos compuestos que comprenden células derivadas de más de un cigoto. Se han utilizado quimeras experimentales para estudiar interacciones célula a célula y para realizar análisis de destino celular y linaje durante el desarrollo (McLaren, Mammalian Chimeras. Cambridge University Press, Cambridge, Inglaterra, Reino Unido, 1976). El uso de células aisladas a partir de embriones en fases muy iniciales para producir quimeras puede dar como resultado organismos que se desarrollen con un complemento completo de tejidos somáticos parcialmente procedentes de descendientes de las células aisladas. Si el material de inicio incluye células germinales iniciales o sus precursoras, las quimeras resultantes pueden producir gametos tanto del genotipo del donante como del receptor. Además, las quimeras pueden ser intraespecíficas (es decir, que contienen células derivadas de dos o más cigotos de la misma especie) o interespecíficas (es decir, que contienen células derivadas de cigotos procedentes de por lo menos dos especies distintas).

Puede aumentarse la eficacia a la hora generar quimeras de una línea germinal mediante repoblación de las gónadas con las células germinales primordiales (CGP) del donante deseado reduciendo el número de CGP en el organismo receptor. Se han utilizado numerosos métodos para reducir las CGP con distinto grado de éxito. La exposición continua a radiación gamma (0,3-3,4 R/h de 60 Co durante 20 días) produjo la destrucción completa de oocitos a un nivel de exposición de 3,4 y 1,8 roentgens por hora (R/h; Mraz y Woody, Radiation Res 54: 63-68, 1973). No obstante, la frecuencia de eclosión se redujo a niveles de 0,9 R/h o superiores. La aplicación de radiación continua gamma de bajo nivel para reducir el número de CGP endógenas es limitada debido a la cantidad relativamente pequeña de huevos que pueden exponerse al mismo tiempo, al largo período de exposición necesario, así como a los posibles efectos teratogénicos de la propia radiación.

También se ha probado la exposición a corto plazo a una fuente gamma (Carsience y otros, Development 117: 669-75, 1993; Thoraval y otros, Poultry Sci 73: 1.897-1.905, 1994; Maeda y otros, Poultry Sci 77: 905-07, 1998). En estos estudios, se expusieron huevos sin incubar a 500-700 rads justo antes de la inyección de células blastodérmicas o del área pelúcida en la de fase X. La incidencia de quimerismo de línea germinal tras radiación gamma de corta duración fue muy variable. El motivo de estos resultados inconsistentes se adujo a "células de donante que habían sido inyectadas en un sitio inadecuado..." (Carsience y otros, Development 117: 669-75, 1993).

También se han descrito intentos para esterilizar el embrión del receptor utilizando luz ultravioleta (UV) (Reynaud, J Embryol Exp Morphol 21: 485-507, 1969; Reynaud, J Roux's Arch Devel Biol 179: 85-110, 1976; Aige-Gil y Simkiss, Br Poul Sci 32: 427-438, 1991). Aige-Gil y Simkiss concluyeron: "no es posible irradiar el creciente germinal, en particular en la fase 4 de la incubación, sin inducir alteraciones importantes". El grado de esterilidad se relacionaba al parecer positivamente con alteraciones en el desarrollo, lo que de este modo limitaba el uso práctico de la luz UV como medio para reducir las CGP endógenas.

La generación de quimeras de línea germinal produce varios posibles efectos positivos tanto para la humanidad como para las propias diversas especies aviares. Las quimeras de línea germinal pueden utilizarse como fuente de gametos con características deseables, que a continuación pueden utilizarse junto con programas de cría para aumentar el patrimonio genético (pool genético) aviar. La capacidad para producir más fácilmente gametos de especies aviares particulares sería de utilidad en los campos de la veterinaria aviar y la producción de aves de corral. En el caso de especies en peligro de extinción, tales como la grulla blanca, sería muy útil disponer de una reserva de espermatozoides a punto. En el caso de aves comerciales, tales como los pavos, sería deseable producir espermatozoides de un modo más rápido y económico. En el caso de aves productoras de carne, es deseable disponer de medios para aumentar la proporción de aves macho en el grupo. Por lo tanto, es necesario obtener por distintos medios espermatozoides
aviares.

Bresler M. y otros, "Manipulations of germ-cell populations in the gonad of the fowl", Poultry Sci., vol. 35, n.º 2, mayo de 1994, páginas 241-247, describen que el tratamiento del embrión de un gallo doméstico con busulfán esteriliza parcialmente las gónadas. La esterilización parcial se consigue inmunizando a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales. No obstante, en la presente invención no se describe que las proteínas o los péptidos específicos de una línea germinal primordial podrían ser causa de una modificación en el desarrollo de células germinales primordiales en el embrión.

Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad largamente sentida y continua de hallar medios para aumentar la eficacia de la producción de quimeras de línea germinal en aves. El tema que se describe en la presente invención trata de ésta y de otras necesidades de la técnica.

Resumen

El tema que se describe en la presente invención proporciona procedimientos para modular el número de células germinales primordiales en un embrión aviar. En una realización, el procedimiento comprende inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular la cantidad de CGP endógenas en un embrión aviar que haya dentro del huevo. En una realización, el ave hembra se selecciona del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense. En otra realización, el ave hembra es un pollo. En una realización, el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL. En una realización, la etapa de inmunización produce una disminución de la cantidad de células germinales primordiales en el embrión aviar. En otra realización, la etapa de inmunización produce un aumento de la cantidad de células germinales primordiales en el embrión aviar.

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para modular el desarrollo de células germinales primordiales en un embrión aviar. En una realización, el procedimiento comprende inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de CGP en un embrión aviar que haya dentro del huevo. En una realización, el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ-cell less, dead end, nanos, stella y fragilis y DAZL. En una realización, el ave hembra se selecciona del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense. En otra realización, el ave hembra es un pollo. En una realización, la etapa de inmunización produce inhibición del desarrollo de células germinales primordiales en el embrión aviar. En otra realización, la etapa de inmunización produce un aumento del desarrollo de células germinales primordiales en el embrión aviar.

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para una ave quimérica. En una realización, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales; (b) producir un huevo del ave hembra, en el que el huevo comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de CGP, la cantidad de CGP o combinaciones de los mismos; y (c) administrar las CGP de donante en los óvulos del embrión receptor aviar para producir una ave quimérica. En una realización, el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL. En una realización, las CGP de donante proceden de la misma especie aviar que el embrión receptor. En otra realización, las CGP de donante proceden de una especie aviar distinta de la del embrión receptor. En una realización, el procedimiento comprende además incubar el huevo que contiene el ave quimérica hasta la eclosión.

En una realización del procedimiento inmediato, el ave hembra se selecciona a partir del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense. En otra realización, las CGP de donante proceden de un embrión aviar seleccionado a partir del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla blanca. En otra realización, las CGP de donante son portadoras de un par de cromosomas determinantes masculinos (Z). Y aún en otra realización, las CGP de donante se seleccionan a partir del grupo que consiste en CGP gonadales, CGP sanguíneas y CGP del creciente germinal.

Y aún en otra realización, las CGP de donante son portadoras de un par de cromosomas determinantes femeninos (w). En una realización, la administración se lleva a cabo mediante inyección in ovo. En una realización, las CGP de donante se administran cuando el embrión receptor se halla aproximadamente entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y aproximadamente la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. En otra realización, las CGP de donante se administran cuando el embrión receptor ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. Y aún en otra realización, la etapa de administración se lleva a cabo inyectando al embrión receptor células blastodérmicas, y en la que las células blastodérmicas se diferencian en CGP de donante en el embrión receptor.

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para aumentar la proporción de aves macho en una diversidad de huevos de aves. En una realización, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales; (b) producir un huevo del ave hembra, mediante el cual el huevo comprenda una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP en una ave hembra receptora que haya dentro del huevo; (c) administrar in ovo CGP masculinas (ZZ) al ave hembra receptora; (d) incubar el huevo que contiene el ave hembra receptora hasta la eclosión; (e) criar el ave hembra receptora hasta la madurez sexual; y (f) producir a partir del ave hembra una diversidad de huevos, en los que la proporción de aves macho en la diversidad de huevos producidos por el ave hembra sea superior a la obtenida sin haber administrado in ovo CGP masculinas (ZZ) al ave hembra receptora. En una realización, el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL. En una realización, el ave hembra se selecciona del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense. En una realización, las CGP de donante proceden de la misma especie aviar que el embrión receptor. En otra realización, las CGP de donante proceden de una especie aviar distinta de la del embrión receptor. En otra realización, las CGP se seleccionan a partir del grupo que consiste en CGP gonadales, CGP sanguíneas y CGP del creciente germinal. Y aún en otra realización, las CGP de donante proceden de un embrión aviar seleccionado del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla blanca.

En una realización del procedimiento inmediato, la administración se lleva a cabo mediante inyección in ovo. En otra realización, las CGP de donante se administran cuando el embrión receptor se halla aproximadamente entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y aproximadamente la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. En otra realización, las CGP de donante se administran cuando el embrión receptor ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. Y aún en otra realización, la etapa de administración se lleva a cabo inyectando al embrión receptor células blastodérmicas, y en la que las células blastodérmicas se diferencian en CGP de donante en el ave hembra receptor.

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para producir gametos aviares procedentes de una segunda especie aviar en una primera especie aviar. En una realización, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una hembra de una primera especie aviar con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por la hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de CGP de una ave receptora de la primera especie que haya dentro del huevo; (b) introducir CGP de donante aisladas a partir de una ave de la segunda especie aviar al ave receptora de la primera especie aviar; (c) incubar el huevo que contiene el ave receptora de la primera especie aviar hasta la eclosión; y (d) criar el ave receptora de la primera especie aviar hasta la madurez sexual, en la que el ave receptora de la primera especie aviar produce gametos de la segunda especie aviar. En una realización, el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir de un grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL. En una realización, la primera especie aviar y la segunda especie aviar se seleccionan del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz, la grulla canadiense y la grulla blanca. En una realización, la primera especie aviar y la segunda especie aviar son la misma especie. En otra realización, la primera especie aviar y la segunda especie aviar son distintas.

En una realización del procedimiento inmediato, la administración se lleva a cabo mediante inyección in ovo. En una realización, las CGP de donante se administran cuando el ave receptora de la primera especie aviar se halla aproximadamente entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y aproximadamente la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. En otra realización, las CGP de donante se administran cuando el ave receptora de la primera especie ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. Y aún en otra realización, la etapa de administración se lleva a cabo inyectando al ave receptora de la primera especie aviar células blastodérmicas, y en la que las células blastodérmicas se diferencian en CGP de donante en el ave receptora de la primera especie aviar. En una realización, las CGP se seleccionan a partir del grupo que consiste en CGP gonadales, CGP sanguíneas y CGP del creciente germinal.

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para aumentar la transmisión de línea germinal de una molécula de ácido nucleico en una ave. En una realización, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de CGP en una ave receptora que haya dentro del huevo; (b) administrar una diversidad de CGP de donante que comprendan la molécula de ácido nucleico al ave receptora en condiciones suficientes que permitan que por lo menos una de las diversas CGP colonice una gónada del ave receptora; (c) incubar el huevo que contiene el ave hembra receptora hasta la eclosión; (d) criar el ave receptora hasta la madurez sexual, en la que el ave receptora produce gametos derivados de las CGP de donante. En una realización, el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir de un grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL. En una realización, el ave receptora y las CGP de donante se seleccionan del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz, la grulla canadiense y la grulla blanca. En una realización, las CGP de donante proceden de la misma especie aviar que el ave receptora. En otra realización, las CGP de donante proceden de una especie aviar distinta de la del ave receptora. En una realización, las CGP se seleccionan a partir del grupo que consiste en CGP gonadales, CGP sanguíneas y CGP del creciente germinal.

En una realización del procedimiento inmediato, las CGP de donante se administran cuando el ave receptora se halla aproximadamente entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y aproximadamente la etapa 0019 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. En otra realización, las CGP de donante se administran cuando el ave receptora ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton. En otra realización, la administración se lleva a cabo mediante inyección in ovo. En otra realización, la etapa de administración se lleva a cabo inyectando al ave receptora células blastodérmicas, y en la que las células blastodérmicas se diferencian en CGP de donante en el ave receptora.

Estos y otros aspectos del tema que se describe en la presente invención serán evidentes remitiéndose a la siguiente descripción detallada y figuras anexas. Además, en la presente invención se hace referencia a distintas publicaciones. Cualquier incoherencia entre estas patentes y publicaciones y la presente descripción debería resolverse a favor de la presente descripción.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1D representan análisis inmunohistológicos de las regiones gonadales de la etapa 27 de los embriones producidos por gallinas que habían sido inmunizadas con péptidos derivados del polipéptido VASA de pollo. Cada sección está teñida con un anticuerpo que es específico de SSEA-1.

La figura 1A representa secciones de un embrión control producido por una gallina que no había sido inmunizada. La figura 1B representa secciones de un embrión producido por una gallina que había sido inmunizada con un péptido Vasa-C (SEC ID N.º: 4). La figura 1C representa secciones de una gallina que había sido inmunizada con un péptido Vasa-N (SEC ID N.º: 3). La figura 1D representa secciones de un embrión producido por una gallina que había sido inmunizada con ambos péptidos Vasa-N y Vasa-C (SEC ID N.º: 3 y 4, respectivamente). Las células SSEA-1+ (células teñidas de oscuro) son mucho más abundantes en el embrión de control (figura 1A) que en cualquiera de los embriones expuestos a anticuerpos anti-VASA (figuras 1B-1D).

Las figuras 2A-2D representan análisis inmunohistológicos de las regiones gonadales de la etapa 27 del embrión producido por gallinas que habían sido inmunizadas con péptidos derivados del polipéptido DAZL de pollo. Cada sección está teñida con un anticuerpo que es específico de SSEA-1.

La figura 2A representa secciones de un embrión de control producido por una gallina que no había sido inmunizada. La figura 2B representa secciones de un embrión producido por una gallina que había sido inmunizada con un péptido DAZL-C (SEC ID N.º: 8). La figura 2C representa secciones de una gallina que había sido inmunizada con un péptido DAZL-N (SEC ID N.º: 7). La figura 2D representa secciones de un embrión producido por una gallina que había sido inmunizada con ambos péptidos DAZL-N y DAZL-C (SEC ID N.º: 7 y 8, respectivamente). Las células SSEA-1+ (células teñidas de oscuro) son mucho más abundantes en el embrión de control (figura 2A) que en cualquiera de los embriones expuestos a anticuerpos anti-DAZL (figuras 2B-2D).

Las figuras 3A y 3B representan análisis inmunohistológicos de las regiones gonadales de la etapa 27 de embriones producidos por gallinas que habían sido inmunizadas con péptidos derivados de ambos polipéptidos Vasa y DAZL de pollo. Cada sección está teñida con un anticuerpo que es específico de SSEA-1.

La figura 3A representa secciones de un embrión de control producido por una gallina que no había sido inmunizada. La figura 3B representa secciones de un embrión producido por una gallina que había sido inmunizada con los péptidos Vasa-N, Vasa-C, DAZL-N y DAZL-C (SEC ID N.º: 3, 4, 5 y 8). Las células SSEA-1+ (células teñidas de oscuro) son mucho más abundantes en el embrión de control (figura 3A) que en cualquiera de los embriones expuestos a ambos anticuerpos anti-DAZL y anti-VASA (figura 3B).

La figura 4 es un gráfico de barras que compendia los resultados de la exploración de secciones descritas en las figuras 1-3. Las gallinas fueron inmunizadas con los péptidos respectivos y los huevos obtenidos se incubaron hasta que alcanzaron la fase embrionaria 27. Se procesaron los embriones para histología habitual, se seccionaron serialmente y se inmunotiñieron con anticuerpo mococlonal MC-480 (anti-SSEA-1) para identificar células germinales en las gónadas en desarrollo. Los datos presentados representan la cantidad promedio de CGP contadas en 10 secciones del borde gonadal de los embriones en huevos de 3 gallinas inmunizadas para cada péptido o combinación de
péptidos.

Breve descripción del listado de secuencias

Las SEC ID N.º: 1 y 2 son una secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos, respectivamente, de un marco de lectura abierto VASA de pollo (CVH) (GENBANK® n.º adquisición. AB004836 y BAB12337, respectivamente). Las SEC ID N.º: 3 y 4 son las secuencias de péptidos que comprenden epítopos de un polipéptido VASA de pollo que se utilizaron para inmunizar a los pollos hembra. La SEC ID N.º: 3 es un péptido N-terminal (Vasa-N) que corresponde a los aminoácidos 42-57 de GENBANK® n.º de adquisición BAB12337, y la SEC ID N.º: 4 es un péptido C-terminal (Vasa-C) que corresponde a los aminoácidos 645-660 de GENBANK® n.º de adquisición BAB12337. Las SEC ID N.º: 5 y 6 son una secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos, respectivamente, de un marco de lectura abierto DAZL de pollo (GENBANK® n.º adquisición. AY211387 y AAO26019, respectivamente). Las SEC ID N.º: 7 y 8 son las secuencias de péptidos que comprenden epítopos de un polipéptido DAZL de pollo que se utilizaron para inmunizar a los pollos hembra. La SEC ID N.º: 7 es un péptido N-terminal (Dazl-N) que corresponde a los aminoácidos 2-18 de GENBANK® n.º de adquisición AAO26019, y la SEC ID N.º: 8 es un péptido C-terminal (Dazl-C) que corresponde a los aminoácidos 266-282 de GENBANK® n.º de adquisición AAO26019.

Descripción detallada I. Definiciones

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado que habitualmente comprende un experto en la materia a la que pertenece el tema que se describe en la presente invención. Para mayor claridad de la presente memoria, de aquí en adelante se introducen algunas definiciones.

Siguiendo una convención legal de patentes de hace mucho tiempo, el término "uno" significa "uno o más" cuando se utiliza en la presente invención, incluido en las reivindicaciones.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje hace referencia a variaciones que rondan un 20% o un 10%, en otro ejemplo un 5%, en otro ejemplo un 1%, y aún en otro ejemplo un 0,1% de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para poner en práctica el tema que se describe en la presente invención. A no ser que se indique de otro modo, se entiende que todas las cifras que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de la reacción, etcétera, utilizadas en la memoria y las reivindicaciones han sido modificadas en todos los ejemplos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a no ser que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos anteriormente en esta memoria y en la reivindicaciones anexas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que pretendan obtenerse mediante el tema que se describe en la presente invención.

En algunas realizaciones, el tema que se describe en la presente invención utiliza anticuerpos contra antígenos asociados a células germinales primordiales. El término "anticuerpo", y las variaciones gramáticas del mismo, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina; es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígenos que se une específicamente a un antígeno. Como tal, el término se refiere a proteínas de inmunoglobulina, o a partes funcionales de las mismas, entre las cuales anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos híbridos, anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, un anticuerpo monocatenario representado en una genoteca fágica), anticuerpos mutagenizados, anticuerpos humanizados y fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígenos (por ejemplo, fragmentos Fab y Fv de anticuerpos). De este modo, entre los "anticuerpos" se incluyen pero no exclusivamente anticuerpos intactos monoclonales, quiméricos, recombinantes, sintéticos, semisintéticos o modificados químicamente que tienen por ejemplo fragmentos Fv, Fab, scFv o F(ab)_{2}. Las moléculas de inmunoglobulina del tema que se describe en la presente invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de una molécula de inmunoglobulina.

Las aves producen anticuerpos que pueden localizarse en la yema de los huevos, y estos anticuerpos se denominan "IgY" (anticuerpos de la yema, que comprenden principalmente anticuerpos del tipo IgG). Véase generalmente Bollen y otros, J Immunol Meth 191: 113-120, 1996; Schade y otros, (eds.), Chicken Egg Yolk Antibodies, Production and Application: IgY-Technology, Springer Verlag, Nueva York, Nueva York, Estados Unidos, 2000. En una realización, los anticuerpos del tema que se describe en la presente invención son anticuerpos IgY aviares. Los anticuerpos del tema que se describe en la presente invención pueden tener cualquier origen aviar. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos IgY de pollo.

Los anticuerpos del tema que se describe en la presente invención se unen a un antígeno asociado a células germinales primordiales. Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "asociado a células germinales primordiales" se refiere a antígenos que comprenden un epítopo que bien es expresado por un polipéptido expresado por una célula germinal primordial (por ejemplo, un marcador de superficie celular) o por una célula capaz de influir en la migración y/o desarrollo de una célula germinal primordial (por ejemplo, factores de migración, factores de crecimiento y polipéptidos expresados por células presentes en el microentorno en el que se encuentran o desarrollan las CGP). Entre tales antígenos se incluyen, pero no exclusivamente, epítopos presentes en polipéptidos SSAE-1, de proteína de tipo ovomucina (OLP), de Factor Steel (ligando de c-kit), de germ cell-less, de dead end, de VASA (incluido, pero no exclusivamente el homólogo VASA de pollo, CVH), de DAZL, de nanos, de stella y de fragilis, y los antígenos identificados por los anticuerpos EMA-1, QH-1, FC10.2, S-FC10.2, NC-1, 2C9, QCR1, AGC5, AGC7 y AGC13. Revisado en Tajima, Avian Poultry Biol Rev 13: 15-20, 2002. Véase también Buehr, Exp Cell Res 232, 194-207, 1997; D'Costa y Petifte, Intl J Devel Biol 43: 349-56, 1999; Urven y otros, Development 103: 299-304, 1988; Hay y otros, Cell 55: 577-587, 1988; Lasko y Ashburner, Nature 335: 611-617, 1988; Raz, Nature Genetics 4: 690-700, 2003; Houston y King, Development 127: 447-56, 2000; Cooke y otros, Hum Mol Genet 5: 513-516, 1996; Kimura y otros, Biochem Biophys
Res Commun 262: 223-30, 1999; Weidinger y otros, Curr Biol 13: 1.429-34, 2003; y referencias a ese respecto.

Tal como se utilizan en la presente, las expresiones "anticuerpo SSEA-1" y "anticuerpo anti-SSEA-1" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a un anticuerpo, en una realización un anticuerpo IgY y en otra realización un anticuerpo monoclonal, que se une al antígeno-1 embrionario específico de la etapa (SSEA-1; Buehr, Exp Cell Res 232, 194-207, 1997). El SSEA-1 es un epítopo carbohidrato determinado por una unión N-acetilglucosamina entre galactosa (\beta1\rightarrow4) y fucosa (\alpha1\rightarrow3) (Gooi y otros, Nature 292: 156-158, 1981). Se creó un anticuerpo monoclonal contra SSEA-1 mediante la fusión de células de mieloma murinas con células del bazo de un ratón que había sido inmunizado con células F9 de teratocarcinoma (Solter y Knowles, Proc Natl Acad Sci U S A 75: 5.565-5.569, 1978). El anticuerpo SSEA-1 es un marcador inmunohistoquímico conocido de células germinales aviares (Karagenc y otros, Dev Genet 19: 290-301, 1996). En una realización, un anticuerpo anti-SSEA-1 es el clon MC 480, que puede obtenerse del Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidad de Iowa, Iowa City, Iowa, Estados Unidos.

Tal como se utilizan en la presente invención, las expresiones "anticuerpo VASA" y "anticuerpo anti-VASA" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a un anticuerpo, en una realización un anticuerpo IgY, que se une a un polipéptido VASA aviar. VASA es una helicasa de ARN dependiente de ATP que pertenece a la familia DEAD-box (Asp-Glu-Ala-Asp). VASA y sus ortólogos se expresan en el plasma germinal de muchas especies, entre las cuales un pez cebra (Danio rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, y se ha identificado en las CGP de otras especies, entre las cuales Xenopus laevis, el ratón y el ser humano (revisado en Raz, Nature Genetics 4: 690-700, 2003). En estas especies, se ha involucrado a VASA y a polipéptidos afines en la aparición de células germinales, incluido el desarrollo, la proliferación y la diferenciación de las CGP de los polos, así como la gametogénesis. Id. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de VASA de pollo (también denominadas CVH) también pueden hallarse en GENBANK® n.º de adquisición AB004836 y BAB12337, respectivamente.

Tal como se utilizan en la presente invención, las expresiones "anticuerpo DAZL" y "anticuerpo anti-DAZL" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a un anticuerpo, en una realización un anticuerpo IgY, que se une a un polipéptido DAZL aviar. Se han aislado ortólogos de DAZL de diversas especies, entre las cuales un pez cebra (Danio rerio), Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, y se ha identificado en las CGP de otras especies, entre las cuales Xenopus laevis, el ratón y el ser humano (revisado en Raz, Nature Genetics 4: 690-700, 2003). El polipéptido DAZL (y ortólogos del mismo) es una proteína que se une a ARN que se expresa en el polo vegetal del huevo del pez cebra y en el plasma germinal de Xenopus, así como en el ovario y/o los testículos de varios organismos distintos. Id. En Xenopus, en el ratón y en el ser humano DAZL se expresa en las CGP y puede ser importante para el desarrollo y la supervivencia de células en la gónada de uno o ambos sexos. Véase Raz, Nature Genetics 4: 690-700, 2003; Xu y otros, Proc Natl Acad Sci USA 98: 7.414-7.419, 2001; Houston y King, Development 127: 447-56, 2000; Mita y Yamashita, Mech Dev 94: 251-255, 2000; Ruggiu y otros, Nature 389: 73-77, 1997; Reijo y otros, Nature Genetics 10: 383-393, 1995. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de DAZL de pollo pueden obtenerse en GENBANK® n.º de adquisición AY211387 y AA026019, respectivamente.

Tal como se utilizan en la presente, las expresiones "ave" y "especie aviar" se refieren a cualquier especie aviar, entre las cuales, pero no exclusivamente, el pollo, el pavo, el pato, el ganso, la codorniz, el faisán y el avestruz. Puede utilizarse cualquier otra especie distinta para poner en práctica el tema que se describe en la presente invención, en particular cuando se utiliza para la conservación de especies en peligro de extinción, tales como la grulla blanca (donde la especie receptora sería la grulla canadiense).

Tal como se utiliza en la presente invención y a no ser que se modifique de un modo específico, el término "huevo" se refiere a un huevo de ave que contiene un ave embrionaria viva. De este modo, el término "huevo" se refiere a un huevo de ave fertilizado, en una realización un huevo que contiene un embrión de ave con capacidad para llevar a cabo la embriogénesis normal.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "nativo" y "endógeno" se refieren a una célula o a un ácido nucleico que se encuentra de manera natural dentro del embrión. Como tal, una "CGP endógena" es una CGP que se encuentra en un embrión que se ha desarrollado directamente a partir de un huevo fertilizado sin la inntroducción de CGP exógenas o de donante. De un modo parecido, cuando se utiliza en el contexto de un polipéptido, un "polipéptido nativo" es un polipéptido que es codificado por un gen nativo de una ave sin transformar.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "de aparición natural" se refiere a un objeto que se encuentra en la naturaleza lo que lo diferencia de uno producido artificialmente por el ser humano. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o nucleótidos que se encuentra en un organismo (incluido un virus) en su estado natural, que no ha sido modificada o aislada intencionadamente por el ser humano en el laboratorio, es de aparición natural. Como tal, una secuencia de polipéptidos o nucleótidos se considera de "aparición no natural" si es codificada por una molécula recombinante o se encuentra dentro de la misma, incluso si la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos es idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos presente en la naturaleza.

Tal como se utilizan en la presente invención, las expresiones "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se refieren a un ácido desoxirribonucleico (ADN), un ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y fragmentos generados por cualquier unión, escisión, acción endonucleasa y acción exonucleasa.

La expresión "unido operativamente", cuando describe la relación entre dos regiones de ácidos nucleicos, se refiere a una yuxtaposición en la que las regiones están en una relación que permite que funcionen de la manera pretendida. Por ejemplo, una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está unida de tal modo que la expresión de la secuencia codificante se adquiere bajo condiciones compatibles con las secuencias de control, tal como cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, inductoras y polimerasas) están unidas a la secuencia o secuencias de control o reguladoras. De este modo, en una realización, la frase "unido operativamente" se refiere a un promotor conectado a una secuencia codificante de un modo tal que la transcripción de aquella secuencia codificante es controlada y regulada por aquel promotor. Las técnicas para unir operativamente un promotor a una secuencia codificante son bien conocidas en el estado de la técnica; la orientación y localización precisas relativas a una secuencia codificante de interés dependen, entre otras cosas, de la naturaleza específica del promotor.

De este modo, la expresión "unido operativamente" puede referirse a una región del promotor que se halla conectada a una secuencia de nucleótidos de un modo tal que la transcripción de aquella secuencia de nucleótidos es controlada y regulada por aquella región del promotor. De un modo parecido, se dice que una secuencia de nucleótidos se halla bajo el "control transcripcional" de un promotor al cual se halla unido operativamente. Las técnicas para unir operativamente una región del promotor a una secuencia de nucleótidos son conocidas en el estado de la técnica. La expresión "unido operativamente" también puede referirse a una secuencia de transcripción de finalización o a otro ácido nucleico que esté conectado a una secuencia de nucleótidos de un modo tal que la finalización de la transcripción de aquella secuencia de nucleótidos es controlada por aquella secuencia de finalización de la transcripción. Además, la expresión "unido operativamente" puede referirse a un potenciador, un silenciador u otra secuencia reguladora de ácidos nucleicos que cuando esté unida operativamente a un marco de lectura abierto modula la expresión de aquel marco de lectura abierto, bien de un modo positivo o negativo.

Tal como se utilizan en la presente invención, los términos "polipéptido", "proteína" y "péptido", que se utilizan de manera intercambiable en la presente, se refieren a un polímero de los 20 aminoácidos de las proteínas, o a análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. Aunque "proteína" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes y "péptido" se utiliza a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en el estado de la técnica se superpone y varía. El término "polipéptido" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a péptidos, polipéptidos y proteínas, a no ser que se indique de otro modo. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención cuando se refieren a un producto génico. El término "polipéptido" abarca proteínas de todas las funciones, incluidas las enzimas. De este modo, entre los polipéptidos ejemplares se incluyen productos génicos, proteínas de aparición natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores.

Tal como se utilizan en la presente invención, las expresiones "célula germinal primordial" y "CGP" se refieren a una célula diploide que se encuentra en el embrión inicial y que puede diferenciarse/desarrollarse en gametos haploides (es decir, espermatozoides y óvulos) en una ave adulta. Las células germinales primordiales pueden aislarse de distintas etapas del desarrollo y de varios sitios del embrión aviar en desarrollo, tal como saben los expertos en la materia, incluida la cresta genital, la gónada en desarrollo, la sangre y el creciente germinal. Véase por ejemplo, Chang y otros, Cell Biol Int 21: 495-9, 1997; Chang y otros, Cell Biol Int 19: 143-9, 1995; Allioli y otros, Dev Biol 165: 30-7, 1994; Swift, Am J Physiol 15: 483-516; y n.º de publicación internacional PCT WO 99/06533. La cresta genital es una sección de un embrión en desarrollo conocida por cualquier experto en la materia. Véase por ejemplo, Strelchenko, Theriogenology 45: 130-141, 1996; Lavoir, J Reprod Dev 37: 413-424, 1994. Habitualmente, las CGP están teñidas positivamente mediante técnica de ácido periódico Schiff (PAS). En varias especies pueden identificarse las CGP utilizando un anticuerpo anti-SSEA (una excepción notable son los pavos, las CGP de los cuales no muestran la región del antígeno SSEA). En el estado de la técnica se conocen varias técnicas para aislar y purificar las CGP, entre las cuales la concentración de las CGP de la sangre utilizando centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Yasuda y otros, J Reprod Fertil 96: 521-528, 1992).

La expresión "promotor" o "región del promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos dentro de un gen que se halla en posición 5' respecto de una secuencia codificante y que actúa para dirigir la transcripción directa de la secuencia codificante. La región del promotor comprende un sitio de inicio transcripcional y adicionalmente puede incluir uno o más elementos reguladores. En una realización, un procedimiento del tema que se describe en la presente invención utiliza un promotor III de la ARN polimerasa.

Un "promotor mínimo" es una secuencia de nucleótidos que tiene los elementos mínimos necesarios para permitir que tenga lugar la transcripción a nivel basal. Como tales, los promotores mínimos no son promotores completos sino más bien subsecuencias de promotores que son capaces de dirigir un nivel basal de transcripción de una construcción indicadora en un sistema experimental. Entre los promotores mínimos se incluyen pero no exclusivamente el promotor mínimo CMV, el promotor mínimo HSV-tk, el promotor mínimo del virus 40 de los simios (SV40), el promotor mínimo humano \beta-actina, el promotor mínimo humano EF2, el promotor mínimo del adenovirus E1B y el promotor mínimo 70 de la proteína del choque de calor (hsp). Los promotores mínimos a menudo son potenciados con uno o más elementos reguladores transcripcionales para influir en la transcripción de un gen unido operativamente. Por ejemplo, pueden añadirse elementos reguladores transcripcionales específicos del tipo celular o específicos del tejido a promotores mínimos para crear promotores recombinantes que dirijan la transcripción de una secuencia de nucleótidos unidos operativamente de un modo específico para el tipo celular o para el tejido.

Promotores distintos tienen distintas combinaciones de elementos reguladores transcripcionales. Que un gen se exprese o no en una célula depende de una combinación de los elementos reguladores transcripcionales concretos que establecen el promotor del gen y los distintos factores transcripcionales que hay dentro del núcleo de la célula. Como tales, los promotores a menudo se clasifican como "constitutivos", "específicos del tejido", "específicos del tipo celular" o "inducibles", dependiendo de sus actividades funcionales in vivo o in vitro. Por ejemplo, un promotor constitutivo es aquel que es capaz de dirigir la transcripción de un gen en una variedad de tipos celulares. Entre los promotores constitutivos ejemplares se incluyen los promotores de los siguientes genes que codifican algunas funciones constitutivas o de "mantenimiento": hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), dihidrofolato reductasa (DHFR; Scharfmann y otros, 1991), adenosina desaminasa, fosfoglicerato cinasa (PGK), piruvato cinasa, fosfoglicerato mutasa, el promotor \beta-actina (véase por ejemplo Williams y otros, 1993) y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la materia. Por otro lado, los promotores "específicos de tejido" o "específicos de tipo celular" dirigen la transcripción en algunos tejidos y tipos celulares pero son inactivos en otros. Entre los promotores ejemplares específicos de tejido se incluyen aquellos promotores descritos de aquí en adelante con mayor detalle, así como otros promotores específicos de tejido y específicos de tipo celular conocidos por los expertos en la materia.

Cuando se utilizan en el contexto de un promotor, el término "unido" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una proximidad física de elementos del promotor tal como que funcionan juntos para dirigir la transcripción de una secuencia de nucleótidos unidos operativamente.

Las expresiones "secuencia reguladora transcripcional" o "elemento regulador transcripcional", tal como se utilizan en la presente invención, se refieren cada una a una secuencia de nucleótidos dentro de la región del promotor que da sensibilidad a un factor regulador de la transcripción. La sensibilidad puede abarcar una disminución o un aumento del resultado transcripcional y viene mediada por la unión del factor de transcripción a la molécula de ADN que comprende el elemento regulador transcripcional. En una realización, una secuencia reguladora transcripcional es una secuencia de finalización de la transcripción, a la que alternativamente se hace referencia en la presente invención como señal de finalización de la transcripción.

Tal como se utiliza en la presente invención, "significancia" o "significativo" se refiere a análisis estadístico de la probabilidad de que hay una asociación no aleatoria entre dos o más entidades. Para determinar si una relación es o no "significativa" o tiene "significancia", pueden llevarse a cabo manipulaciones estadísticas de los datos para calcular la probabilidad, expresada como "valor p". Aquellos valores p que caen por debajo de un punto de corte definido por el usuario se consideran significativos. En un ejemplo, un valor p inferior o igual a 0,05, en otro ejemplo inferior a 0,01, en otro ejemplo inferior a 0,005 y aún en otros ejemplo inferior a 0,001.

La expresión "secuencia reguladora" es una expresión genérica utilizada en toda la memoria para referirse a secuencias polinucleótidas, tales como secuencias señales de iniciación, potenciadoras, reguladoras, promotoras y de finalización, que son necesarias o deseables para influir en la expresión de secuencias codificantes y no codificantes a las que están unidas operativamente. En Goeddel, 1990, se describen secuencias reguladores ejemplares y entre ellas se incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos del virus 40 de los simios (SV40), el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, los sistemas TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por la ARN polimerasa T7, el principal operador y regiones promotoras del fago lambda, las regiones de control de la proteína fd de la cubierta (fd Coat protein), el promotor de 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento (a-mating factor) en levaduras, el promotor polihedro del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. La naturaleza y el uso de tales secuencias de control pueden diferir dependiendo del organismo huésped. En procariotas, tales secuencias reguladoras generalmente incluyen promotor, sitio de unión a ribosomas y secuencias de finalización de la transcripción. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de "partners" de fusión.

En algunas realizaciones, la transcripción de una secuencia de polinucleótidos se halla bajo el control de una secuencia promotora (u otra secuencia reguladora) que controla la expresión del polinucleótido en un tipo celular en el cual está prevista la expresión. También se dará por sobreentendido que el polinucleótido puede estar bajo el control de secuencias reguladoras que son iguales o distintas de aquellas secuencias que controlan la expresión de la forma del polinucleótido de aparición natural.

La expresión "gen indicador" se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína que es fácilmente detectable bien por su presencia o por su actividad, que incluye, pero no exclusivamente, luciferasa, proteína fluorescente (por ejemplo, proteína verde fluorescente), cloranfenicol acetil transferasa, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina de secreción placentaria, \beta-lactamasa, hormona humana del crecimiento y otros indicadores enzimáticos secretados. Generalmente, un gen indicador codifica un polipéptido por otro lado no producido por la célula huésped, que es detectable mediante análisis de la célula o células, por ejemplo, mediante análisis fluorométrico, radioisotópico o espectrofotométrico directos de la célula o células y habitualmente sin la necesidad de eliminar las células para el análisis de señal. En algunos ejemplos, un gen indicador codifica una enzima, la cual produce un cambio en las propiedades fluorométricas de la célula huésped, que es detectable mediante función cualitativa, cuantitativa o semicuantitativa o activación transcripcional. Entre las enzimas ejemplares se incluyen esterasas, \beta-lactamasa, fosfatasas, peroxidasas, proteasas (activador del plasminógeno tisular o urocinasa) y otras enzimas cuya función puede detectarse mediante sustratos cromogénicos o fluorogénicos adecuados conocidos por los expertos en la materia o que puedan aparecer en el futuro.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "factor de transcripción" se refiere a una proteína citoplasmática o nuclear que se une a un gen, o que se une a un transcrito de ARN de un gen, o que se une a otra proteína que se une a un gen o a un transcrito de ARN o a otra proteína que a su vez se une a un gen o a un transcrito de ARN, para modular de ese modo la expresión del gen. Tal modulación también puede conseguirse mediante otros mecanismos; la esencia de un "factor de transcripción para un gen" pertenece a un factor que altera de algún modo el nivel de transcripción del gen. La expresión "factor de transcripción" también puede referirse en general a una proteína que module la expresión del gen mediante interacción con un elemento regulador transcripcional y componentes celulares para la transcripción, entre los cuales ARN polimerasa, factores asociados a la transcripción (TAF), proteínas remodeladoras de la cromatina y cualquier otra proteína relevante que influya en la transcripción de los genes.

El término "vector" se refiere a un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector que puede utilizarse según el tema que se describe en la presente invención es un episoma, es decir, un ácido nucleico con capacidad de replicación extracromosómica. Entre otros vectores se incluyen aquellos con capacidad de replicación autónoma y de expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. En la presente invención, se hace referencia a los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos operativamente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante tienen a menudo la forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" se utilizan de manera intercambiable ya que el plásmido es el tipo de vector utilizado con mayor frecuencia. No obstante, el tema que se describe en la presente invención pretende incluir otros tantos tipos de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que a partir de aquí pasan a ser conocidos en el estado de la técnica.

La expresión "vector de expresión" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a una secuencia de ADN que puede dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos, en particular en una célula huésped apropiada, que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés que está unida operativamente a secuencias de finalización de la transcripción. Habitualmente también comprende las secuencias necesarias para la traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos. La construcción que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérica. La construcción también puede ser de aparición natural pero se ha obtenido en una forma recombinante de utilidad para la expresión heteróloga. También puede hacerse referencia a la secuencia de nucleótidos de interés, que incluye cualquier secuencia adicional, diseñada para efectuar la expresión apropiada de las secuencias de nucleótidos, como "caset de expresión".

Las expresiones "gen heterólogo", "secuencia de ADN heteróloga", "secuencia de nucleótidos heteróloga", "molécula exógena de ácidos nucleicos", o "segmento de ADN exógeno", tal como se utilizan en la presente invención, se refieren cada una a una secuencia que se origina a partir de una fuente extraña respecto de una célula huésped prevista o, si es de la misma fuente, que es modificada en su forma original. De este modo, un gen heterólogo en una célula huésped incluye un gen que es endógeno respecto de la célula huésped particular pero que ha sido modificado, por ejemplo, mediante mutagénesis o mediante aislamiento de secuencias reguladoras transcripcionales nativas. Las expresiones también incluyen copias múltiples de aparición no natural de una secuencia de nucleótidos de aparición natural. De este modo, las expresiones se refieren a un segmento de ADN que es extraño o heterólogo respecto de la célula, u homólogo respecto de la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula en la que el elemento no suele hallarse.

Dos ácidos nucleicos están "recombinados" cuando las secuencias de cada uno de los dos ácidos nucleicos se combinan en un ácido nucleico de la descendencia. Dos secuencias están "directamente" recombinadas cuando ambos ácidos nucleicos son sustratos para la recombinación. Dos secuencias están "indirectamente recombinadas" cuando las secuencias están recombinadas utilizando un intermediario tal como un oligonucleótido de entrecruzamiento. Para recombinación indirecta, no más de una de las secuencias es un sustrato real para recombinación y, en algunos casos, ninguna secuencia es un sustrato para recombinación.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "elementos reguladores" se refiere a secuencias de nucleótidos que intervienen en el control de la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores pueden comprender un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y a señales de finalización. Entre las secuencias reguladoras también se incluyen potenciadores y silenciadores. Habitualmente también abarcan las secuencias necesarias para la traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "aumento significativo" se refiere a un aumento en una cantidad (por ejemplo, una cantidad de CGP) que es superior al margen de error inherente en la técnica de medición, en una realización un aumento de aproximadamente un 10% o superior respecto de la cantidad inicial (por ejemplo, la cantidad promedio de las CGP presentes en una localización específica en una etapa específica del desarrollo en un embrión de tipo salvaje sin tratar), en otra realización un aumento de aproximadamente un 25% o superior, y en aún otra realización un aumento de aproximadamente un 50% o superior.

Tal como se utiliza en la presente invención, las expresiones "considerablemente inferior" y "considerablemente reducido" se refieren a una cantidad (por ejemplo, una cantidad de CGP) que se reduce en más del margen de error inherente a la técnica de medición, en una realización una reducción de aproximadamente un 10% o superior con respecto de la cantidad inicial (por ejemplo, la cantidad promedio de las CGP presentes en una localización específica en una etapa específica del desarrollo en un embrión de tipo salvaje sin tratar), en otra realización una reducción de aproximadamente un 25% o mayor, y en aún otra realización una reducción de aproximadamente un 50% o
mayor.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "unión específica", y las variantes gramaticales de la misma, se refieren a una afinidad de unión que un anticuerpo tiene respecto de un epítopo análogo. Con respecto a los procedimientos descritos, "unión específica" pretende abarcar una unión entre un anticuerpo (por ejemplo, una molécula IgY) y un antígeno en condiciones fisiológicas (por ejemplo, en una localización en la que las CGP pueden hallarse en un embrión aviar) que resultan en la modulación de la actividad biológica normal de la macromolécula que comprende el epítopo. Dicho de otro modo, en una realización, una interacción entre una molécula de IgY y un epítopo se considera específica si una actividad biológica de la macromolécula a la cual se une la molécula de IgY en un embrión en desarrollo se altera en relación con la actividad de la macromolécula en otro embrión en desarrollo en una etapa parecida en ausencia de la molécula IgY.

Como tales, las frases "se une específicamente (o selectivamente) a un anticuerpo" y "específicamente inmunorreactivo con", cuando se refiere a un epítopo presente en un polipéptido o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia del polipéptido en presencia de una población heterogénea de polipéptidos y otras sustancias biológicas. De este modo, en condiciones de inmunoanálisis señaladas, los anticuerpos especificados se unen a un polipéptido en particular y no se unen en una cantidad considerable a otros polipéptidos presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por un polipéptido en particular. Por ejemplo, pueden seleccionarse anticuerpos creados contra un antígeno asociado con las CGP para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con aquel antígeno y no con otros antígenos. Puede utilizarse una variedad de formatos de inmunoanálisis para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con un polipéptido en particular. Por ejemplo, de manera sistemática se utilizan inmunoanálisis ELISA de fase sólida, análisis de inmunotransferencia o inmunohistoquímica para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con un polipéptido. Véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, Estados Unidos, 1988, para una descripción de los formatos de inmunoanálisis y de las condiciones que pueden utilizarse para determinar inmunorreactividad específica. Habitualmente una reacción específica o selectiva tendrá una señal o ruido de fondo de por lo menos el doble y más habitualmente de más de 10 a 100 veces.

Tal como se utiliza en la presente, el término "transformación" se refiere a un proceso para introducir ADN heterólogo a una célula aviar, a un tejido aviar o a una ave. Se sobreentiende que la transformación en células aviares, tejido aviar y aves abarca no sólo el producto final de un proceso de transformación, sino también la descendencia transgénica de los mismos.

Tal como se utilizan en la presente invención, los términos "transformado", "transgénico" y "recombinante" se refieren a un organismo huésped tal como una CGP de ave en la que se ha introducido una molécula heteróloga de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede estar integrada de manera estable en el genoma del huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como molécula extracromosómica. Dicha molécula extracromosómica puede ser autorreplicante. Se sobreentiende que las células, tejidos o células transformados abarcan no sólo el producto final de un proceso de transformación, sino también la descendencia transgénica de los mismos. Un huésped "no transformado", "no transgénico" o "no recombinante" se refiere a un organismo de tipo salvaje, por ejemplo, una CGP aviar de tipo salvaje que no contiene la molécula heteróloga de ácido nucleico.

II. Inmunización de aves e introducción de anticuerpos en yema de huevo

Las aves, en particular los pollos, se han convertido en una fuente cada vez más común de producción a gran escala de anticuerpos policlonales debido a que son grandes las cantidades de anticuerpos que se transfieren del suero a las yemas de huevo durante la producción de huevos. Véase Rose y otros, Eur J Immunol 4: 521, 1974. El tema que se describe en la presente invención saca provecho de este fenómeno para llevar a cabo el desarrollo de las CGP en embriones inmunizando a aves hembra con antígenos asociados con las CGP, que se obtienen de la yema. Estos anticuerpos pueden unirse a continuación en sus antígenos análogos durante la embriogénesis aviar, influyendo por lo tanto en las actividades biológicas de polipéptidos asociados al desarrollo de las CGP.

A. Antígenos y epítopos

El tema que se describe en la presente invención incluye polipéptidos que comprenden, o que alternativamente consisten en, epítopos del polipéptido que puede utilizarse para generar anticuerpos IgY que se unen a los epítopos. En realizaciones alternativas y no limitantes, los polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos de las SEC ID N.º: 2 o 6, y los epítopos se encuentran en antígenos peptídicos que tienen una secuencia de aminoácidos de las SEC ID N.º: 3, 4, 7 o 8. Debería señalarse, no obstante, que los antígenos peptídicos descritos en la presente invención como vasa-N, Vasa-C, Dazl-N y Dazl-C pretenden únicamente ser representativos y otros péptidos y polipéptidos antigénicos, entre los cuales la versión en toda su longitud de un polipéptido asociado con el desarrollo de las CGP (incluido pero no exclusivamente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos presentada en las SEC ID N.º: 2 o 6) pueden utilizarse como inmunógenos.

El término "epítopos", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a partes de un polipéptido que tienen actividad antigénica o inmunogénica en una ave, en una realización un pollo. En una realización, el tema que se describe en la presente invención incluye un polipéptido que comprende un epítopo, así como el polinucleótido que codifica este polipéptido. Un "epítopo inmunogénico", tal como se utiliza en la presente invención, se define como una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos en una ave, tal como puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, mediante los procedimientos para generar anticuerpos descritos en la presente invención. La expresión "epítopo antigénico", tal como se utiliza en la presente invención, se define como una parte de una proteína a la cual puede unirse inmunoespecíficamente su antígeno, tal como puede determinarse mediante cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica, por ejemplo, mediante los procedimientos de inmunoanálisis descritos en la presente invención. La unión inmunoespecífica excluye la unión inespecífica pero no excluye necesariamente la reactividad cruzada con otros antígenos. Los epítopos antigénicos no tienen que ser necesariamente inmunogénicos. Se sobreentiende que tal como se utiliza en la presente invención, el término epítopo incluye cualquier parte de un polipéptido que tenga actividad antigénica o inmunogénica en una ave, entre los cuales, pero no exclusivamente, un subgrupo de los aminoácidos del propio polipéptido (a los que también se hace referencia en la presente invención como "antígeno peptídico"), pero también cualquier modificación del polipéptido que incorpore partes adicionales al polipéptido (por ejemplo, la adición postranscripcional de uno o más grupos carbohidratos).

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Los fragmentos que funcionan como epítopos pueden producirse por medio de cualquier procedimiento convencional. Véase por ejemplo, Véase, por ejemplo, Houghten, Proc Natl Acad Sci U S A 82: 5.131-5.135, 1985; descrito posteriormente en la patente de EE.UU. US 4.631.211.

En el tema que se describe en la presente invención, los epítopos antigénicos contienen en una realización una secuencia de por lo menos 4 aminoácidos, en otra realización de por lo menos 5, en otra realización de por lo menos 6, en otra realización de por lo menos 7, en otra realización de por lo menos 8, en otra realización de por lo menos 9, en otra realización de por lo menos 10, en otra realización de por lo menos 15, en otra realización de por lo menos 20, en otra realización de por lo menos 25, y aún en otra realización de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30. Los polipéptidos representativos que comprenden epítopos inmunogénicos o antigénicos son de por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 restos de aminoácidos de longitud. Los epítopos antigénicos son útiles, por ejemplo, para cultivar anticuerpos, entre los cuales anticuerpos IgY, que se unen específicamente al epítopo. Los epítopos antigénicos pueden utilizarse como moléculas diana en inmunoanálisis. Véase, por ejemplo, Wilson y otros, Cell 37: 767-778, 1984; Sutcliffe y otros, Science 219: 660-666, 1983.

Del mismo modo, pueden utilizarse epítopos inmunogénicos, por ejemplo, para inducir anticuerpos según procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, Sutcliffe y otros, supra; Wilson y otros, supra; Chow y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 82: 910-914, 1985; y Bittle y otros, J Gen Virol 66: 2.347-2.354, 1985. Pueden presentarse los polipéptidos que comprenden uno o más epítopos inmunogénicos para provocar una respuesta de anticuerpos junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, a un sistema aviar (tal como, por ejemplo, de pollo), o, si el polipéptido tiene suficiente longitud (por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos), puede presentarse el polipéptido sin ningún portador. No obstante, se ha visto que los epítopos inmunogénicos que comprenden tan pocos aminoácidos como de 8 a 10 son suficientes para crear anticuerpos que puedan unirse como mínimo a epítopos lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en análisis de inmunotransferencia).

Pueden utilizarse los polipéptidos que llevan epítopos del tema que se describe en la presente invención para inducir anticuerpos según procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica, entre los cuales, pero no exclusivamente, inmunización in vivo. Véase, por ejemplo, Sutcliffe y otros, supra; Wilson y otros, supra; y Bittle y otros, supra. Si se utiliza inmunización in vivo, las aves pueden inmunizarse con péptido libre; no obstante, la titulación de anticuerpos anti-péptido puede aumentarse acoplando el péptido a un portador macromolecular, tal como hemocianina de lapa (KLH), albúmina sérica bovina (BSA) o toxoide del tétanus. Por ejemplo, los péptidos que contienen restos de cisteína pueden acoplarse a un portador utilizando un enlazador tal como un éster de maleidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros péptidos pueden acoplarse a portadores que utilizan un agente de unión más general tal como glutaraldheído. Aves tales como, por ejemplo, pollos, se inmunizan bien con péptidos sin portador o bien con péptidos acoplados a portadores, por ejemplo, mediante inyección intramuscular (por ejemplo, en el músculo pectoral mayor) de emulsiones que contienen aproximadamente 10-1.000 microgramos de péptido o de proteína portadora y adyuvante de Freund o cualquier otro adyuvante conocido para estimular una respuesta inmunitaria. Pueden utilizarse varias inyecciones de recuerdo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas, para proporcionar una titulación suficiente de anticuerpos anti-péptido que pueda detectarse, por ejemplo, mediante análisis ELISA utilizando péptidos libres adsorbidos a una superficie sólida. La titulación de anticuerpos anti-péptido en suero procedente de un animal inmunizado puede aumentarse mediante selección de anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, mediante adsorción del péptido en un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados según procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica.

B. Conjugados y adyuvantes

Como es bien conocido en el estado de la técnica, una composición determinada puede variar en lo que respecta a su inmunogenicidad. Por lo tanto, a menudo es necesario estimular la respuesta del sistema inmunitario del huésped, lo que puede conseguirse conjugando un inmunógeno péptido o polipéptido con un portador. Los portadores representativos son la hemocianina de lapa (KLH) y la albúmina sérica bovina (BSA). Otras albúminas tales como la ovoalbúmina, la albúmina sérica murina o la albúmina sérica de conejo también pueden utilizarse como portadores. Los procedimientos para conjugar un polipéptido con una proteína portadora son bien conocidos en el estado de la técnica y entre ellos se incluyen el uso de glutaraldheído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y benzidina bis-diazotizada.

Como es bien conocido en el estado de la técnica, la inmunogenicidad de una composición inmunógena particular puede aumentarse mediante el uso de estimuladores inespecíficos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Entre los adyuvantes representativos se incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulador inespecífico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivado), adyuvante incompleto de Freund, hidróxido de aluminio y adyuvante TITERMAX® (TMA; CytRx Corp., Norcross, Georgia, Estados
Unidos).

La cantidad de composición inmunógena utilizada en la producción de anticuerpos policlonales varía en función de la naturaleza del inmunógeno así como del animal utilizado para la inmunización. Para administrar el inmunógeno pueden utilizarse una variedad de vías (subcutánea, intramuscular, intravenosa e intraperitoneal). En una realización, las aves son inmunizadas mediante inyección intramuscular de un preparado de antígenos en el músculo pectoral mayor. La producción de anticuerpos policlonales puede controlarse mediante la obtención de muestras sanguíneas del animal inmunizado en varios sitios después de la inmunización. También pueden administrarse posteriores inyecciones de recuerdo. El proceso de administrar inyecciones de recuerdo y titular se repite hasta que se consigue una titulación adecuada. Cuando se obtiene el nivel deseado de inmunogenicidad, puede extraerse sangre al animal inmunizado y el suero puede aislarse y almacenarse.

C. Aislamiento de anticuerpos de la yema

Los anticuerpos que se unen a antígenos asociados a las CGP se introducen en la yema de los huevos producidos por aves hembra inmunizadas con los antígenos (por ejemplo, con péptidos que comprenden los antígenos). En algunas realizaciones, pueden aislarse anticuerpos de la yema utilizando técnicas conocidas para los expertos en la materia. Véase por ejemplo, Akita y otros, J Immunol Meth 160: 207-214, 1993; Akita y otros, J Food Sci 57: 629-634, 1992; patente de EE.UU. US 4.357.272. Tal como se explica en la patente de EE.UU. US 4.357.272, el IgY puede purificarse de la yema mediante precipitación con polietilenglicol (PEG). En resumen, pueden recogerse las yemas y lavarse en agua destilada para eliminar la clara. Pueden hacerse pasar las yemas a través de un embudo de cristal hasta un cilindro medidor que hace que las cubiertas de la yema se rompan y se libere la yema, que se recoge en el cilindro. Se determina el volumen de la yema y se añade un volumen de tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato; PBS) equivalente a dos volúmenes de yema y se mezcla completamente. Se añade PEG (por ejemplo, PEG 6.000) hasta una concentración final de 3,5% (peso: volumen; w: v). Se remueve la mezcla hasta que el PEG esté disuelto por completo. A continuación se centrifuga la mezcla a 12.000 g durante diez minutos. La etapa de centrifugación da como resultado la producción de tres fases en los tubos de centrífuga. La capa superior es una capa grasienta de color amarillo, la capa del medio es una capa de sobrenadante clara y la capa inferior contiene el grueso de la yema y un "sedimento" proteínico. El líquido del sobrenadante que contiene IgY y la capa grasienta pueden decantarse en un embudo que contenga un tapón de algodón absorbente en el cuello del embudo. El tapón elimina la capa lipídica. A continuación se determina el volumen del filtrado claro y se añade PEG removiendo suavemente hasta una concentración final de 12 g PEG por 100 ml de extracto de yema. A esta concentración el PEG provoca el desplazamiento completo del IgY. A continuación se centrifuga el precipitado como antes. Los sedimentos pueden volver a disolverse en tampón fosfato hasta el volumen original y vuelve a precipitarse el IgY con PEG al 12% y se centrifuga. El PEG residual puede eliminarse mediante dos tandas de recentrifugación y aspiración de cualquier líquido (el IgY se encuentra en el sedimento). A partir de entonces, los sedimentos finales pueden volver a disolverse en un volumen de tampón fosfato equivalente a la mitad del volumen de yema a partir del cual se derivó, aunque, si se desea, disolviendo los sedimentos en un volumen inferior pueden obtenerse soluciones más concentradas. Para inyectar en animales, en los que es deseable una eliminación más completa de PEG, puede liberarse el IgY de los restos de PEG mediante precipitación del IgY con sulfato de amonio medio saturado seguido de concentración. El PEG forma una fase líquida en la fase acuosa de sulfato de amonio, mientras que el IgY forma una tercera fase en la parte inferior del tubo de centrífuga.

Puede utilizarse IgY purificado así, o mediante cualquier otro procedimiento conocido por los expertos en la materia, en inmunoanálisis entre los cuales, pero no exclusivamente, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunoprecipitación, etc., utilizando técnicas que son conocidas en el estado de la técnica. Pueden obtenerse reactivos secundarios estándar, tales como anticuerpos secundarios anti-IgY, de numerosos fabricantes entre los cuales Research Diagnostics Inc., Flanders, Nueva Jersey, Estados Unidos, y Aves Labs, Inc., Tigard, Oregón, Estados Unidos.

III. Procedimientos para modular la proliferación y el desarrollo de las CGP

El tema que se describe en la presente invención proporciona procedimientos para modular el desarrollo de las CGP en un embrión aviar. La modulación proporcionada por los procedimientos descritos puede adoptar la forma de una diferencia cualitativa o cuantitativa en las CGP del embrión, incluida pero no exclusivamente una reducción o un aumento del número de las CGP presentes en el embrión en desarrollo en relación con el número de las CGP normalmente halladas en un embrión de la misma especie y en la misma etapa que no ha sido expuesto a los procedimientos descritos en la presente invención. Alternativamente, la modulación puede adoptar la forma de interferencia con el desarrollo normal de las CGP en el embrión de manera que las CGP no pueden desarrollarse normalmente, bien en lo que respecta a migración hasta la gónada o bien en lo que respecta a su desarrollo una vez que se introducen en el microentorno de la gónada embrionaria.

Varios grupos han notificado el uso de sustancias químicas o radiación para modular el número de las CGP en embriones aviares. Una sustancia química concreta que se ha utilizado para reducir los niveles endógenos de las CGP es el busulfán (véase Aige-Gil y Simkiss, Res Vet Sci 50: 139, 1991; Vick y otros, J Reprod Fert 98: 637; Bresler y otros, Br Poutry Sci 35: 241, 1994; Hallett y Wentworth, Poultr Sci 70: 1619, 1991; publicación de solicitud de patente n.º 20030111016). El compuesto busulfán (1,4-butanediol dimetano sulfonato, BU) se ha utilizado como agente quimioterapéutico en el tratamiento de la leucemia (Bhagwatwar y otros, Cancer, Chemother Pharmacol 37: 401-08, 1996). En 1963, Hemsworth y Jackson demostraron que la administración de BU en ratas podía alterar notablemente el desarrollo de las CGP (Hemsworth y Jackson, J Reprod Dev 6: 229-33, 1963). La inyección de BU en la membrana de la yema del embrión de pollo produjo malformaciones múltiples (Swartz, Teratology 21: 1-8, 1980). Hallett y Wentworth (Poult Sci 70: 1619-23, 1991) también observaron una reducción significativa en la capacidad de eclosión tras la inyección de una suspensión albumen de BU en huevos de codorniz. En alguna codorniz tratada con BU se observó ausencia de células germinales en las gónadas, mientras que otras aves tratadas de un modo parecido eran normales. Los autores sugirieron que "inconsecuencias en la administración de BU al embrión" podrían explicar la variación observada. Concluyeron que sería necesario descubrir un sistema solvente no tóxico para eliminar los resultados inconsecuentes asociados al uso de la suspensión. Aige-Gil y Simkiss (Br Poult Sci 32: 427-438, 1991) utilizaron solución salina o suspensiones de aceite de sésamo de BU, o solubilizaron el BU en dimetil sulfóxido (DMSO) en embriones de pollo. La administración de únicamente DMSO produjo mortalidad embrionaria, retrasos en el desarrollo y malformaciones que excedieron las observadas con solución salina. Los efectos teratogénicos se minimizaron enormemente cuando se suspendió el BU en aceite de sésamo y se inyectó en la yema. La inyección de 100 \mug de BU en aceite de sésamo produjo un índice de esterilidad del 95+%. En un experimento posterior, Vick y otros (J Reprod Fertil 98: 637-41, 1993) observaron que la inyección de 25, 50 y 250 \mug de BU reducía considerablemente las células germinales primordiales en embriones de pollo. Calcularon que el tratamiento con BU aumentaba en 3,5 veces el índice de quimerismo de línea celular cuando se comparaba con embriones no tratados con BU. Bresler y otros, (Br Poult Sci 35: 241-47, 1994) demostraron que el tratamiento con BU y la posterior inyección de las CGP podría llevar a una repoblación considerable de la gónada. La inyección de 50 \mug de BU, suspendido en aceite de sésamo, redujo las CGP en las gónadas izquierda y derecha de embriones de pollo de 6 días en un 75 y 78% respectivamente. Tras la inyección de una suspensión de células del creciente germinal en un embrión tratado con BU, el número de las CGP aumentó hasta un 72 y un 115% en las gónadas izquierda y derecha, respectivamente, respecto de los controles. La variabilidad en la administración de BU a la gónada, así como la inconsecuencia resultante en la eficacia a la hora de reducir el número de las CGP, limita la utilidad de esta tecnología.

En la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.º 20030111016, los presentes coinventores utilizaron busulfán para reducir las CGP endógenas antes de administrar las CGP de donante. En resumen, se disolvieron 15 mg de busulfán en 5 ml de dimetil formamida (DMF) en un vial de cristal. Se añadieron 5 ml de aceite de sésamo a la solución. La mezcla se agitó completamente en el vórtex para crear una emulsión. La concentración de busulfán era de 1,5 \mug/\mul en la emulsión. Se preparó una emulsión de busulfán fresca para cada lote de inyecciones. Los huevos fertilizados se incubaron a 37,5ºC, humedad relativa del 60%, durante 22 horas. A continuación se colocaron los huevos horizontalmente en la incubadora durante 2 horas. El extremo romo de cada huevo se limpió con etanol al 70%. A continuación, con unas pinzas curvas, se hizo un pequeño orificio en la cáscara que recubre la cámara de aire sin dañar la membrana de la cáscara externa. Se inyectaron 50 \mul de emulsión de busulfán (que contenía 75 \mug de busulfán) horizontalmente a través de la cámara de aire hasta la yema utilizando una aguja hipodérmica (21G x 1,5 inch; 0,813 mm x 3,81 cm). La emulsión se agitó por completo en un vórtex antes de utilizarla. Los huevos se mantuvieron en posición horizontal durante todo el proceso de la inyección. El orificio de la cáscara se selló con celo. Los huevos se incubaron verticalmente tras la inyección.

Los embriones tratados con busulfán se recogieron en la etapa 27 (HyH) y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Los embriones se incrustaron en parafina, se cortaron secciones de 7 \mum de grosor y se tiñieron inmunohistoquímicamente con anticuerpo SSEA-1. Se contó el número de las CGP en las gónadas izquierda y derecha de 10 secciones de cada embrión, seleccionadas aleatoriamente, y se calculó el índice de esterilidad (IS) utilizando la ecuación IS = (N--X)/N donde N es el número de las CGP de las gónadas de control y X es el número de las CGP del embrión tratado con busulfán (Reynaud, J Embrol Exp Morphol 21: 485-507, 1969). Se determinaron los efectos del tratamiento con aceite de sésamo, DMF y busulfán en la capacidad de supervivencia de los embriones de pollo hasta la etapa 27 y también se evaluó la capacidad de eclosión de las aves tratadas tras la administración de busulfán. Se observó que el busulfán reduce el número de las CGP, en particular a una dosis de 75 \mug emulsionada en aceite de sésamo y DMF, aunque la capacidad de supervivencia de los embriones tratados fue de una cuarta parte a la mitad de la observada en controles a los que no se había inyectado nada.

En algunas realizaciones, el tema que se describe en la presente invención proporciona un procedimiento para modular el número de células germinales primordiales en un embrión de pollo, comprendiendo el procedimiento inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos para que el antígeno module el número de las CGP endógenas en un embrión aviar presente dentro del huevo.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "modular" se refiere a un aumento, una disminución, u otra alteración de cualquier actividad o propiedad biológica, o de todas, de una entidad bioquímica, por ejemplo, una CGP. Como tal, el término "modular" puede referirse a un cambio en el número de las CGP presentes en el embrión en desarrollo en relación con un embrión no quimérico de la misma especie y en la misma etapa. Por ejemplo, el término "modular" puede significar "inhibir", "reducir" o "suprimir", pero el uso de la palabra "modular" no se limita a esta definición.

Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "inhibir", "reducir", "suprimir", "disminuir" y variantes gramaticales de los mismos se utilizan de manera intercambiable y se refieren a una actividad a través de la cual el número o desarrollo de las CGP presentes en un embrión se reduce por debajo del observado en ausencia de anticuerpos dirigidos contra un antígeno presente en un polipéptido asociado a las CGP. En una realización, la inhibición con una molécula de anticuerpo (por ejemplo, un IgY dirigido contra un VASA, DAZL, EMA-1, etc.) produjo una reducción del número de las CGP presentes en el embrión antes de la repoblación con las CGP de donante.

En otra realización, el número de las CGP presentes en un embrión aviar es mayor en presencia de anticuerpos dirigidos contra un antígeno presente en un polipéptido asociado a las CGP que en su ausencia.

El término "modulación" tal como se utiliza en la presente invención se refiere tanto al aumento (es decir, activación, potenciación, o estimulación) como la a disminución (es decir, inhibición, reducción, o supresión) del número de las CGP (o el desarrollo de las mismas) en el embrión antes de la repoblación con las CGP de donante. De este modo, el término "modulación", cuando se utiliza para hacer referencia a una propiedad funcional o a una actividad o proceso biológicos (por ejemplo, el desarrollo, incluida pero no exclusivamente la proliferación de las CGP), se refiere a la capacidad de aumentar (por ejemplo, activar, potenciar o estimular), de diminuir (por ejemplo, inhibir, reducir o suprimir) o de cambiar de otro modo una cualidad de dicha propiedad, actividad o proceso (por ejemplo, desarrollo y proliferación de las CGP).

En realizaciones particulares del tema que se describe en la presente invención, el número de las CGP endógenas en el ave receptora se reduce antes de introducir las CGP de donante. De esta manera, las CGP de donante pueden repoblar las gónadas del ave receptora y pueden aumentar la eficacia de la producción de aves quiméricas y la proporción de gametos (y la descendencia) que proceden del ave donante. Las CGP endógenas pueden reducirse en por lo menos aproximadamente un 10%, un 20%, un 30%, un 40%, un 50%, un 60%, un 70%, un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o incluso más. En otras realizaciones particulares, el ave receptora es fundamentalmente esterilizada, tal como el término se define en la presente invención. La reducción dirigida del número de las CGP endógenas en el ave receptora puede basarse en diversas consideraciones, entre las cuales pero no exclusivamente el número y la proporción deseados de gametos procedentes del ave donante, la reducción al mínimo de cualquier efecto adverso asociado al procedimiento de conseguir reducir las CGP endógenas y similares.

Alternativamente se afirmó que los procedimientos descritos en la presente invención pueden aplicarse de modo que la proporción de gametos (y/o descendencia) procedentes de las CGP de donante comparada con las CGP del ave receptora puede ser aproximadamente 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, 90/10, o superior. En algunas realizaciones, los procedimientos del tema que se describen en la presente invención pueden aplicarse de modo que menos del 50% de los gametos (y/o descendencia) procedan de las CGP de donante. Una proporción relativamente baja de gametos y/o descendencia procedente de las CGP de donante puede ser aceptable en aquellas aplicaciones en las que sólo un número relativamente reducido de gametos y/o descendencia de donante procedente de aves quiméricas es necesario y/o los gametos y/o descendencia de donante de aves quiméricas se hallan comercialmente disponibles.

En una realización, el número de las CGP del ave receptora es reducido debido a la presencia de anticuerpos maternos introducidos en la yema del huevo. Estos anticuerpos, a los generalmente se hace referencia como IgY, pueden influir en el desarrollo de las CGP en el embrión cuando se unen a antígenos presentes en polipéptidos asociados a las CGP, en una realización los antígenos presentes en polipéptidos que están asociados a migración o desarrollo de las CGP.

La reducción de las CGP se consigue inmunizando a una ave hembra con un antígeno asociado a las CGP. El antígeno puede hallarse en un polipéptido asociado al desarrollo de las CGP (por ejemplo, un polipéptido VASA), incluido pero no exclusivamente un antígeno peptídico (por ejemplo, un tramo de 4 o más aminoácidos de un polipéptido VASA) y un antígeno carbohidrato (por ejemplo, una parte carbohidrato añadida postraduccionalmente a un polipéptido en la superficie de una CGP). Cuando se inmuniza a una ave hembra con tal antígeno (o con una diversidad de antígenos), el ave puede generar una respuesta inmunitaria frente al antígeno. Cuando una ave inmunizada produce un huevo, se introducen anticuerpos contra el antígeno en el la yema del huevo. Aquellos anticuerpos son entonces capaces de unirse a sus antígenos análogos presentes en el embrión que se desarrolla en el huevo, modulando por lo tanto una actividad biológica de macromoléculas presentes dentro del embrión en desarrollo que contiene el antígeno.

IV. Procedimientos para producir aves quiméricas

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para producir una ave quimérica. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales; (b) producir un huevo del ave hembra, en el que el huevo comprenda una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos para que el antígeno module el desarrollo de las CGP, la cantidad de las CGP o combinaciones de los mismos; y (c) administrar in ovo las CGP de donante del embrión receptor aviar para producir una ave quimérica.

Se han producido aves quiméricas transfiriendo células blastodérmicas de donante al blastodermo de una ave receptora. Revisado en Etches y otros, Poult Sci 76: 1075, 1997. Las aves quiméricas, en particular las quimeras de una línea germinal, también se han producido mediante transferencia de CGP a embriones receptores, incluidas CGP procedentes del creciente germinal, CGP en circulación halladas en la sangre y CGP gonadales halladas en la cresta genital. Revisado en Tajima, Avian Poult Biol Rev 13: 15-30, 2002. Se ha observado que las células blastodérmicas contienen presuntas CGP (Kagami y otros, Mol Reprod Dev 48: 501, 1997; Ginsburg y Eyal-Giladi, J Embryol Exp Morphol 95: 53, 1986), lo cual si es cierto podría explicar la capacidad para generar aves quiméricas de línea germinal mediante transferencia de células blastodérmicas. En algunas realizaciones del tema que se describe en la presente invención, las células blastodérmicas y/o las CGP pueden introducirse en los embriones en desarrollo mediante técnicas que son conocidas en el estado de la técnica, entre las cuales inyección de células al seno terminal, inyección en la aorta, inyección en el creciente germinal, inyección en el celoma embrionario, etc.

En la mayor parte de la producción de quimeras aviares se ha utilizado el pollo. Véase por ejemplo, Naito y otros, Mol Reprod Dev 39: 153-161, 1994. No obstante, la producción de aves quiméricas no se limita a pollos. También se han producido quimeras de codorniz transfiriendo células blastodérmicas tempranas de codorniz a embriones de codorniz. Véase Ono y otros, Jpn Poult Sci 31: 119, 1994. Además, se han producido quimeras interespecíficas introduciendo células blastodérmicas de codorniz en el blastodermo de pollo (Watanabe y otros, Development 114: 331-338, 1992) e introduciendo células del creciente germinal y/o CGP disociadas de pavo a embriones de pollo (Reynaud, J Exbryol Exp Morphol 21: 485-507, 1969; patente de EE.UU. US 6.354.242; publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20030111016).

Los expertos en la materia sabrán apreciar que las CGP de donante pueden modificarse genéticamente antes de administrarlas al ave receptora, por ejemplo, mediante alteración génica y/o introduciendo una o más secuencias de nucleótidos heterólogas. Los procedimientos para introducir de manera transitoria o estable una secuencia heteróloga a células aviares son conocidos en el estado de la técnica (por ejemplo, véase patente de EE.UU. US 5.162.215 de Bosselman y otros). En una realización, la secuencia de nucleótidos heteróloga se incorpora de manera estable en la CGP. Los métodos para introducir ácidos nucleicos de interés en células receptoras son conocidos y entre ellos se incluyen la lipofección, la transfección, la microinyección, la transformación, las técnicas microproyectivas, etc. Puede utilizarse cualquier vector adecuado, incluidos plásmidos, virus (incluidos retrovirus), fagos y similares, bien en forma nativa o como derivados de la misma.

Las células CGP de donante pueden modificarse genéticamente para producir un resultado deseado en el ave receptora (por ejemplo, para expresar un transgén que efectúa determinación sexual). Alternativamente, puede pretenderse que la modificación genética pase a la descendencia del ave quimérica y produzca un efecto deseado en la misma.

La introducción de una o más secuencias de nucleótidos heterólogos (por ejemplo, una secuencia extraña o ajena o una copia extra o modificada de una secuencia endógena) puede utilizarse en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, para producir un polipéptido de interés en el ave (por ejemplo, en el plasma o los huevos de tales aves para recogida y purificación convenientes). Según esta realización, el ave puede utilizarse fundamentalmente como un biorreactor. Entre los polipéptidos de interés se incluyen polipéptidos terapéuticos (por ejemplo, para usos veterinarios o médicos) o inmunogénicos (por ejemplo, para vacunas), anticuerpos (incluidos pero no exclusivamente fragmentos de anticuerpo y anticuerpos monocatenarios), enzimas, (por ejemplo, enzimas industriales), hormonas y factores de crecimiento, o cualquier otra proteína de interés.

Alternativamente, el polipéptido puede ser un polipéptido indicador que actúe como marcador de las células donantes (por ejemplo, proteína verde fluorescente, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, \beta-lactamasa, neomicina fosfotransferasa y cloranfenicol acetiltransferasa). Los marcadores pueden utilizarse para controlar el desarrollo embrionario y/o analizar la grasa celular y la migración, entre otros propósitos (véase por ejemplo, Mozdziak y otros, Dev Dynamics 226: 439-445, 2003). Esta referencia documenta la primera línea de aves transgénicas satisfactoria para el análisis de grasa celular.

En otras realizaciones, el polipéptido es un polipéptido terapéutico o inmunogénico o cualquier otro polipéptido que tiene un efecto favorable o deseado en el ave receptora, por ejemplo, un polipéptido que tiene un efecto fenotípico deseado o que potencia la eficacia del crecimiento (incluido pero no exclusivamente un aumento de la musculatura y/o reducción de los depósitos de grasa y/o una mejora de la alimentación para ganar proporción), la producción de huevos, la tolerancia a las enfermedades y similares.

Como alternativa posterior, el ácido nucleico heterólogo de interés puede codificar un ácido nucleico no codificante, una ribozima (por ejemplo, tal como se describe en la patente de EE.UU. US 5.877.022) o cualquier otro ARN no traducido.

Los expertos en la materia sabrán comprender que la secuencia, o secuencias, de nucleótidos heterólogos de interés puede unirse operativamente a secuencias de control apropiadas. Por ejemplo, el ácido nucleico heterólogo puede unirse operativamente a elementos de control de la expresión incluidas, pero no exclusivamente, señales de control de la transcripción/traducción, orígenes de replicación, señales de poliadenilación y sitios internos de introducción de ribosomas (IRES), promotores, potenciadores y similares.

Posteriormente sabrá apreciarse que puede utilizarse una variedad de elementos promotores/potenciadores dependiendo del nivel y expresión específica de tejido deseada. El promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patrón de expresión deseado. El promotor/potenciador puede ser nativo o ajeno y puede ser una secuencia natural o sintética. Por ajeno o exógeno, se entiende que la región de inicio transcripcional no se halla en el huésped de tipo salvaje en el que se ha introducido la región de inicio transcripcional. En realizaciones particulares, la secuencia o secuencias de nucleótidos heterólogos se halla unida operativamente al promotor de la ovoalbúmina o al promotor de la lisozima.

En una realización, se utilizan los elementos promotores/potenciadores que son nativos respecto de la célula diana o sujeta a ser tratada. En otra realización, se utilizan los elementos promotores/potenciadores que son nativos respecto de la secuencia de ácidos nucleicos heterólogos. El elemento promotor/potenciador se elige para que funcione en la célula o células diana de interés. Y aún en otra realización, se utilizan elementos promotores/potenciadores aviares. El elemento promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible.

Los elementos inducibles de control de la expresión pueden utilizarse en aquellas aplicaciones en las que es deseable proporcionar regulación de la sobreexpresión de la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos heterólogos. Los elementos promotores/potenciadores para la transferencia génica pueden ser elementos promotores/potenciadores específicos de células o de tejidos. Otros elementos promotores/potenciadores inducibles son elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Entre los elementos promotores/potenciadores ejemplares se incluyen, pero no exclusivamente, un elemento Tet on/off, un promotor inducible mediante RU486, un promotor inducible mediante ecdisona, un promotor inducible mediante rapamicina y un promotor de la metalotioneína.

En realizaciones en las que la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos heterólogos se transcribirán y a continuación se traduciran en células diana, generalmente se requieren señales específicas de inicio para la traducción eficaz de las secuencias insertadas que codifican proteínas. Estas secuencias de control traduccional exógeno, entre las cuales el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes, pueden tener distintos orígenes, tanto natural como sintético.

V. Procedimientos para aumentar la proporción de aves macho en una diversidad de huevos de ave

En aves, a diferencia de en mamíferos, el macho es el sexo homogamético (ZZ) y la hembra el sexo heterogamético (Zw). Por lo tanto en aves es la hembra la que determina el sexo de la descendencia, ya que es ella la que produce los óvulos portadores del cromosoma que determina el sexo: es decir, el cromosoma Z o el w. De este modo, tal como se observa en la presente invención, transfiriendo células germinales primordiales de macho a huéspedes embrionarios hembra, el porcentaje de óvulos portadores de Z producido por aquel huésped aumenta y el porcentaje de la descendencia masculina aumenta. Un aumento en el porcentaje de la descendencia masculina de pollos para asar es económicamente deseable para la mayor proporción de conversión alimentaria y de este modo se obtiene una mayor producción de carne.

Cuando se administran las CGP ZZ a un embrión macho, no debería tener lugar alteración alguna en la proporción sexual en la descendencia del receptor independientemente de la extensión con que las CGP del donante colonicen la gónada del receptor. Sólo cuando se administran las CGP ZZ a un embrión receptor hembra (Zw) puede tener lugar alteración en la proporción sexual. De este modo, el procedimiento inmediato puede producir alteración en la proporción sexual cuando se administran CGP ZZ a embriones hembra (Zw).

El grado en que se producen óvulos portadores de Z en el embrión receptor hembra una vez que alcanza la madurez sexual, y de este modo el grado en que el receptor produce descendencia masculina, puede depender de la extensión con que las CGP ZZ de donante colonizan la gónada del embrión receptor. Son posibles diversos resultados. En un extremo del espectro, las CGP de donante no colonizan la gónada embrionaria y de este modo sería de esperar que el receptor produjera un 50% de óvulos Z y un 50% de óvulos w (es decir, no se produciría alteración en la proporción sexual). En el otro extremo del espectro, las CGP de donante colonizan por completo la gónada embrionaria hasta la exclusión de CGP endógenas, sería de esperar que el receptor produjera únicamente óvulos Z y de este modo toda la progenie del receptor serían machos. Por consiguiente, el porcentaje esperado de progenie masculina que produciría un receptor hembra puede calcularse como el 50% + (el porcentaje de colonización de la gónada embrionaria por parte de las CGP ZZ dividido por 2), asumiendo que las CGP de donante y las CGP endógenas son individualmente capaces de producir óvulos (es decir, los óvulos producidos reflejan el porcentaje de CGP endógenas y de donante presentes en la gónada embrionaria).

Visto lo que se espera, maximizar el porcentaje de colonización de la gónada embrionaria mediante CGP ZZ debería maximizar el porcentaje de descendencia masculina del receptor hembra. Pueden utilizarse varios procedimientos para conseguir este objetivo. Un procedimiento de este tipo es administrar un número suficiente de CGP de donante al receptor, de modo que las CGP de donante superen considerablemente en número las CGP endógenas. Sería de esperar que este método fuera más eficaz cuando el embrión receptor se halla en una etapa anterior a la etapa en que las CGP migran a la gónada embrionaria.

Otro procedimiento es eliminar las CGP endógenas o inhibir su capacidad para colonizar la gónada embrionaria antes de administrar las CGP de donante. Esto puede llevarse a cabo eliminando físicamente las CGP endógenas del embrión, por ejemplo, eliminando la sangre del embrión en una etapa en la que las CGP endógenas circulan por la sangre embrionaria. Véase Naito y otros, Mol Reprod Develop 39: 153, 1994; Tajima y otros, J Exp Zool 280: 265, 1998. No obstante, se trata de una manipulación técnicamente exigente que corre el riesgo de afectar sustancialmente al propio embrión. Una alternativa es impedir que las CGP endógenas alcancen y/o colonicen la gónada embrionaria. En varias observaciones se describe el uso de sustancias químicas o de radiación para conseguir este objetivo, entre éstas el busulfán (véase Aige-Gil y Simkiss, Res Vet Sci 50: 139, 1991; Vick y otros, J Reprod Fert 98: 637; Bresler y otros, Br Poutry Sci 35: 241, 1994; Hallett y Wentworth, Poultr Sci 70: 1619, 1991), Concanavalin-A (Lee y otros, J Embryol Exp Morph 46: 5, 1978) y la radiación UV o gamma (Reynaud, J Embryol Exp Morphol 21: 485-507, 1969; Reynaud, J Roux's Arch Devel Biol 179: 85-110, 1976; Aige-Gil y Simkiss, Br Poul Sci 32: 427-438, 1991; Reynaud, C R Hebd Seances Acad Sci-D: Sci Natur 282: 1195, 1976; Mraz y Woody, Radiation Res 54: 63-68, 1973; Carsience y otros, Development 117: 669-75, 1993; Thoraval y otros, Poultry Sci 73: 1.897-1.905, 1994; Maeda y otros, Poultry Sci 77: 905-07, 1998). Sin embargo, el uso de sustancias químicas tóxicas y de radiación no es óptimo, sobre todo en el caso de especies aviares importantes a nivel agrícola.

En la presente invención se describe un método alternativo, en el que se introducen anticuerpos que reconocen antígenos asociados a las CGP en la yema del huevo en la que se desarrolla el embrión receptor como resultado de la inmunización de la gallina que produjo el huevo con el antígeno. En esta realización, las aves hembra se inmunizan con un antígeno asociado a las CGP. Los anticuerpos dirigidos contra el antígeno se depositan en la yema de los huevos producidos por las hembras inmunizadas. Entonces los anticuerpos se hallan disponibles para modular el desarrollo de las CGP en un embrión que crece dentro del huevo. En una realización, los anticuerpos producen una reducción del número de CGP presentes en la gónada embrionaria, de modo que cuando las CGP de donante se administran a un embrión receptor, las CGP de donante pueden colonizar la gónada y desarrollarse en la misma. A continuación se incuba el embrión receptor hasta la eclosión y se permite que alcance la madurez sexual.

Cuando se utiliza para aumentar el número o la proporción de aves macho eclosionadas de un grupo de huevos, el tema que se describe en la presente invención implica administrar in ovo células germinales primordiales aviares masculinas (es decir, ZZ) a una ave hembra. El sexo del ave puede predeterminarse in ovo o determinarse tras la eclosión. A continuación se incuba el ave hasta la eclosión, se determina el sexo del ave si es necesario, se cría hasta la madurez sexual y se reproduce cruzando el ave con un macho reproductor adecuado según técnicas conocidas. A continuación se obtiene una diversidad de huevos fértiles puestos por aquella ave y habitualmente se incuban hasta que eclosionan y se crían las aves resultantes durante por lo menos dos o tres semanas. La proporción de huevos de ave (o aves) macho frente a hembra producidos por el ave hembra es mayor que la obtenida si no se administran in ovo células germinales primordiales masculinas a dicha ave. Tales procedimientos suelen utilizarse en especies de aves que se crían para la producción de carne, tales como pollos, pavos, patos, etc.

VI. Procedimientos para producir gametos aviares

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para producir gametos aviares. En una realización, el procedimiento se utiliza para producir gametos aviares procedentes de una segunda especie aviar en una primera especie aviar. En una realización, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una hembra de una primera especie aviar con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por la hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP de una ave receptora de la primera especie aviar que hay dentro del huevo; (b) introducir las CGP de donante aisladas a partir de una ave de la segunda especie aviar al ave receptora de la primera especie aviar; (c) incubar el huevo que contiene el ave receptora de la primera especie aviar hasta la eclosión; y (d) criar el ave receptora de la primera especie aviar hasta la madurez sexual, en la que el ave receptora de la primera especie aviar produce gametos de la segunda especie aviar.

Cuando se utiliza para la producción y obtención de gametos aviares (espermatozoides, óvulos), las células germinales primordiales que se administran in ovo a una especie receptora pueden diferir de la especie donante de la cual se han obtenido las CGP de donante. A continuación se incuba el receptor hasta la eclosión y se cría hasta la madurez sexual, se obtienen espermatozoides u óvulos de la especie donante a partir del animal receptor, todo según técnicas estándar. Por ejemplo, en el caso de una especie en peligro de extinción, la especie aviar donante puede ser una grulla blanca y la especie aviar receptora una grulla canadiense. En otro ejemplo concerniente a la producción comercial de aves de corral, la especie aviar donante puede ser un pavo y la especie aviar receptora puede ser un pollo.

En la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.º 20030111016 se describen métodos de los coinventores actuales para repoblar la gónada embrionaria de una especie aviar con las CGP de donante de otra especie aviar. Los embriones de pollo Barred Plymouth Rock (BPR) se incubaron hasta la etapa 27-28 (HyH). Los embriones Barred Plymouth Rock se utilizaron como marcador de color porque son homocigotos recesivos (ii) en el locus I y expresan pigmento en el plumaje. Las gónadas de embriones macho se recogieron en DMEM, se complementaron con FBS al 10%, glutamina, antibiótico y solución antimicótica. La determinación del sexo de los embriones se realizó utilizando el procedimiento de Petitte y Kegelmeyer (Animal Biotechnol 6: 19-30, 1995). A continuación se limpiaron las gónadas dos veces en PBS y se incubaron en EDTA al 0,2% a 37ºC durante 15 minutos. Se añadió medio fresco y se separaron las gónadas.

Se recogió la suspensión celular y se centrifugó a 450 g durante 5 minutos. Se sustituyó el medio y se determinó la viabilidad celular utilizando la prueba de exclusión con azul de triptano. Se obtuvieron alícuotas de la suspensión celular y se tiñieron con anticuerpo SSEA-1 para determinar el número de CGP inyectadas. Se inyectaron aproximadamente 2-3 \mul de suspensión celular, que contenía 100-500 CGP, en los vasos sanguíneos de embriones White Leghorn (WL) que se hallaban en la etapa 14-17 del desarrollo (HyH). Los embriones WL sirvieron de receptores porque se sabía que eran homocigotos dominantes (II). Este genotipo codifica ausencia de pigmento en el plumaje. Tras la inyección de las CGP, se devolvieron los huevos a la incubadora hasta el desarrollo completo. En la eclosión, se anillaron los pollitos WL fenotípicos y posteriormente se criaron hasta la madurez sexual. Se realizaron los siguientes apareamientos de prueba para determinar so existían quimeras de línea germinal: macho BPR X hembra WL y macho WL X hembra BPR. Posteriormente se evaluó la descendencia de estos apareamientos de prueba para determinar si las CGP gonadales del macho BPR se habían incorporado a la WL. Puesto que sólo se utilizaron embriones BPR de macho como donantes, todos los pollitos "negros" (fenotipo BPR) procedentes de los apareamientos de prueba macho BPR X hembra WL serían machos.

Se incubaron los huevos fertilizados de pavo a 38,5ºC durante 8-8,5 días (etapa 27-28, HyH). Se disecaron los embriones para obtener las gónadas. A continuación se inyectaron aproximadamente 2-3 \mul de una suspensión de células gonadales, que contenía aproximadamente 150 CGP, en los vasos sanguíneos de embriones de pollos White Leghorn (WL) que se hallaban en la etapa 14 (HyH) del desarrollo. Se sellaron los huevos del receptor y se devolvieron a la incubadora. Se recogieron embriones del receptor en distintas etapas de la incubación (etapa 19 a etapa 25). Se limpiaron los embriones tres veces con PBS y a continuación se fijaron en formaldehído al 4% durante toda la noche. Se lavaron las muestras tres veces en PBS y a continuación se colocaron en etanol al 50%. A continuación se deshidrataron los tejidos, se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones. Las secciones resultantes se analizaron posteriormente inmunohistoquímicamente mediante tinción de SSEA-1 y reacción de ácido periódico Schiff (PAS). Investigaciones anteriores han identificado una diferencia relacionada con la especie en la expresión de SSEA-1 de las CGP de pavos y de pollos. Esta variación antigénica junto con la prueba PAS estándar puede utilizarse para identificar quimeras de línea germinal pavo-pollo. Las observaciones de la doble tinción de las secciones embrionarias de pollo verificaron que las CGP de pollo son tanto PAS positivas como SSEA-1 positivas. La doble tinción de las secciones de pavo en la etapa 24 con PAS y SSEA-1 permitió verificar que las CGP de pavo que migran a través del mesenterio dorsal y colonizan la gónada son PAS positivas y no expresan el epítopo SSEA-1. Por lo tanto la doble tinción de embriones de pollo y de pavo permite verificar que la técnica de doble tinción podría utilizarse como marcador para distinguir las CGP de pavo de las CGP de pollo.

La descendencia del cruce WL (II) X BPR (ii) expresaría habitualmente el fenotipo WL (ii) y mostraría una ausencia del pigmento melanina en el plumaje. La introducción de las CGP de macho BPR en receptores WL produjo una descendencia en la que se observó el patrón de pigmento negro del BPR. Estos datos respaldan la idea de que no hay barreras biológicas que puedan evitar la producción de una mayor descendencia masculina inyectando a embriones de pollo CGP aisladas de las gónadas de embriones macho. No obstante, la incidencia de transmisión de la línea germinal fue inferior al 1%. La baja incidencia de una descendencia procedente de donante en este sistema se relacionaba posiblemente con la considerable ventaja numérica mostrada por las CGP endógenas cuando se comparaban con el número de CGP de donante inyectadas. El tratamiento de embriones con una emulsión de BU + DMF + SO antes de inyectar las CGP de donante redujo el número de CGP endógenas en tanto como un 97%. Cuando se comparaba con BU + SO, la adición de DMF aumentaba la reducción de las CGP endógenas en aproximadamente un 15%.

Tras la doble tinción con SSEA-1 y PAS; se identificaron CGP de pollo y de pavo en la gónada embrionaria en función de distintos patrones de tinción. Debido a la presencia de glucógeno, tanto las CGP de pollo como las de pavo adquirieron un color magenta tras la tinción PAS. No obstante, las CGP de pavo dejaron de ser PAS positivas cuando asentaron en la gónada en desarrollo, diferenciándose de las CGP del pollo que son SSEA-1 positivas en esta etapa del desarrollo. Estos resultados indican que las CGP aisladas de la gónada de pavo embrionario pueden utilizarse para repoblar la gónada de pollo.

En la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.º 20030111016, los embriones white leghorn (WL) fueron tratados in ovo con una emulsión de busulfán (BU + DMF + aceite de sésamo) para reducir las CGP endógenas. Se obtuvieron las gónadas de embriones Barred Plymouth Rock (BPR) masculinos, se aislaron las CGP y se administraron las CGP aisladas in ovo a las aves tratadas con la emulsión de busulfán y a las aves de control sin tratar, fundamentalmente tal como se describe en el ejemplo anterior. Tras la eclosión, se criaron las aves quiméricas WL macho hasta la madurez sexual y se cruzaron con hembras BPR. La producción de una descendencia de color negro es indicativa de transmisión de los gametos procedentes de las CGP BPR por el progenitor quimérico Wl macho. Los resultados indicaban que el 25% (4/16) de los machos WL transmite gametos procedentes de las CGP BPR. Entre estas 4 aves quiméricas, el índice de transmisión se halla entre aproximadamente el 2% y el 23%. En las aves de control, que no fueron sometidas a tratamiento con busulfán, sólo en una ave se constató cualquier transmisión detectable de los gametos procedentes de las CGP BPR.

En algunas realizaciones, el tema que se describe en la presente invención implementa procedimientos para repoblar la gónada embrionaria de una especie aviar con las CGP de donante de otra especie aviar tal como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. n.º 20030111016. Evidentemente, en tales realizaciones, el tema que se describe en la presente invención también implementa la inmunización de una hembra de la primera especie aviar con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por la hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP de una ave receptora de la primera especie aviar que hay dentro del huevo.

VII. Procedimientos para potenciar la transmisión de líneas germinales de una molécula de ácido nucleico

El tema que se describe en la presente invención también proporciona un procedimiento para aumentar la transmisión de líneas germinales de una molécula de ácido nucleico en una ave. En una realización, el procedimiento comprende (a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP en una ave receptora que hay dentro del huevo; (b) administrar al ave receptora una diversidad de las CGP de donante que comprendan la molécula de ácido nucleico en condiciones suficientes que permitan que por lo menos una de las diversas CGP colonice una gónada del ave receptora; (c) incubar el huevo que contiene el ave hembra receptora hasta la eclosión; y (d) criar el ave receptora hasta la madurez sexual, en la que el ave receptora produce gametos derivados de las CGP de donante. En esta realización, la transmisión de líneas germinales pasa a ser más eficaz que los procedimientos del actual estado de la técnica, en los que una generación eficiente de quimeras de líneas germinales sigue siendo una necesidad en la técnica.

El presente procedimientoo se basa en los mismos principios discutidos de aquí en adelante que generalmente se refieren a la producción de quimeras de líneas germinales. No obstante, en esta realización, las CGP de donante son manipuladas in vitro antes de ser administradas al embrión receptor mediante introducción de una molécula exógena de ácido nucleico en el embrión receptor (es decir, un transgén). El procedimiento no está limitado ni por el propio ácido nucleico (por ejemplo, un marco de lectura abierto de interés unido operativamente a un promotor) ni por el procedimiento de introducción (por ejemplo, electroporación, transfección mediada por liposomas, etc.). Más bien, se introduce un ácido nucleico de interés a una diversidad de CGP de donante utilizando técnicas conocidas en el estado de la técnica y a continuación se administra a un embrión receptor que se desarrolla en un huevo producido por una ave hembra que ha sido inmunizada con un antígeno asociado a las CGP. Entonces, se permite que las CGP de donante colonicen la gónada del embrión, que cuando alcanza la madurez sexual puede transmitir el ácido nucleico a su descendencia.

VIII. Administración

Pueden proporcionarse y formularse las células germinales primordiales (CGP) para llevar a cabo el tema que se describe en la presente invención mediante cualquier técnica adecuada, y almacenarse, congelarse, cultivarse, o similares antes de utilizarlas como se desee. Por ejemplo, las células germinales primordiales pueden obtenerse de embriones donantes en una etapa embrionaria adecuada. Las etapas del desarrollo de las aves se refieren en la presente invención mediante uno de los dos sistemas de clasificación de etapas identificados en el estado de la técnica: el sistema de Eyal-Giladi y Kochav (EGyK; véase Eyal Giladi y Kochav, Dev Biol 49: 321-327, 1976), que utiliza numeración romana para referirse a etapas del desarrollo de la línea preprimitiva, el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton (HyH; véase por ejemplo, Hamburger y Hamilton, J Morphol 88: 49-92, 1951), que utiliza numeración arábiga para referirse a etapas posteriores a la puesta. A no ser que se indique de otro modo, las etapas a las que se hace referencia en la presente invención son etapas del sistema de clasificación de etapas HyH.

Por ejemplo, las CGP pueden aislarse en la etapa 4, o la etapa del creciente germinal, hasta la etapa 30, obteniéndose células de la sangre, de la cresta genital o de la gónada en las últimas etapas. Las células germinales primordiales tienen, en general, el doble de tamaño que las células somáticas y se distinguen y separan fácilmente de las mismas en función del tamaño. Las células germinales primordiales masculinas (u homogaméticas) (ZZ) pueden diferenciarse de las células germinales primordiales heterogaméticas (Zw) mediante cualquier técnica adecuada, tal como obtener células de un donante en particular y tipificar otras células de aquel donante, siendo las células obtenidas del mismo tipo de cromosoma que las células tipificadas.

Las CGP pueden formularse para la administración a animales disociando las células (por ejemplo, mediante disociación mecánica) y mezclando íntimamente las células con un portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Las células germinales primordiales son en una realización células germinales primordiales gonadales y en otra realización células germinales primordiales sanguíneas (haciendo referencia "gónada" o "sangre" al tejido de origen en el donante embrionario original). Las células germinales primordiales administradas pueden ser heterogaméticas (Zw) u homogaméticas (ZZ) dependiendo del objeto particular de la administración. Las CGP pueden administrarse en un portador farmacéuticamente aceptable, en una realización a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 o 8,5, en una cantidad adecuada para conseguir el efecto deseado (por ejemplo, 100 a 1.000 CGP por embrión). Las CGP pueden administrarse sin otros ingredientes o células, o pueden administrarse otros ingredientes o células junto con las CGP.

La administración in ovo de las células germinales primordiales del animal receptor puede llevarse a cabo en cualquier momento adecuado en el que las CGP aún puedan migrar a las gónadas en desarrollo. En una realización, la administración se lleva a cabo a partir de aproximadamente la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav (EGyK) y aproximadamente la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas del desarrollo embrionario de Hamburger y Hamilton, y en otra realización, en la etapa 15. En el caso de los pollos, el momento de la administración es de este modo durante los días 1, 2, 3 o 4 del desarrollo embrionario: en una realización entre el día 2 y el 2,5. La administración se realiza habitualmente mediante inyección en cualquier sitio diana adecuado, tal como la región definida por el amnios (incluido el embrión), la yema, etc. En una realización, la inyección se administra en el propio embrión (incluida la pared corporal del embrión) y en realizaciones alternativas puede utilizarse una inyección intravascular o intracelómica en el embrión. Los procedimientos del tema que se describen en la presente invención pueden realizarse con esterilización previa in ovo del ave receptora (mediante "esterilización" significa incapacitar parcial o completamente la producción de gametos procedentes de las CGP endógenas). Cuando se obtienen gametos de donante de tal receptor, pueden obtenerse como una mezcla con gametos del donante y del receptor. Esta mezcla puede utilizarse directamente, o bien puede procesarse posteriormente la mezcla para enriquecer la proporción de gametos de donante de la misma.

La administración de las CGP puede llevarse a cabo administrando las propias CGP, o administrando células precursoras que se convierten en las CGP en el sujeto (en particular cuando los procedimientos descritos en la presente invención se utilizan para alterar la proporción sexual de la descendencia). Por ejemplo, la administración puede llevarse a cabo inyectando al animal receptor células blastodérmicas, donde un subgrupo de células blastodérmicas se diferencia en células germinales primordiales in vivo en el ave.

La administración in ovo de las células germinales primordiales puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica adecuada, bien manualmente o de un modo automatizado. En una realización, la administración in ovo se lleva a cabo mediante inyección. El mecanismo de administración in ovo no es crítico, pero este mecanismo no debería afectar excesivamente a los tejidos y órganos del embrión o a las membranas extraembrionarias que lo circundan de modo que el tratamiento no disminuya excesivamente el índice de eclosión. Una jeringa hipodérmica cargada con una aguja de aproximadamente 18 a 26 gauge/1,219 a 0,457 mm es adecuada para el propósito. Dependiendo de la etapa exacta de desarrollo y de la posición del embrión, una aguja de 2,54 mm puede llegar al líquido que hay por encima del pollo o al propio pollo. Puede hacerse un orificio preliminar a través de la cáscara antes de insertar la aguja para evitar afectación o el embotamiento de la aguja. Si se desea, puede sellarse el huevo con material sellante impermeable a bacterias, tal como cera o similar, para prevenir la posterior entrada de bacterias indeseables. Se supone que un sistema de inyección de alta velocidad para embriones aviares será particularmente adecuado para poner en práctica el tema que se describe en la presente invención. Hay disponibles numerosos dispositivos de este tipo, siendo un dispositivo ejemplar el sistema EMBREX INOVOJECT^{TM} (descrito en las patentes de EE.UU. US 4.681.063 y 4.903.625 de Hebrank), así como dispositivos descritos en las patentes de EE.UU. US 4.040.388; 4.469.047; y 4.593.646 de Miller. Todos estos dispositivos, adaptados para poner en práctica los procedimientos descritos en la presente invención, comprenden un inyector que contiene la formulación de las principales células germinales primordiales tal como se describen en la presente invención, con el inyector posicionado para inyectar en un huevo, sostenido por el aparato, en la localización adecuada dentro del huevo tal como se ha comentado anteriormente. Además, puede proporcionarse un aparato sellante unido operativamente al aparato de inyección para sellar el orificio del huevo tras la inyección del mismo.

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Ejemplos

El tema que se describe en la presente invención se describirá ahora más completamente haciendo referencia de aquí en adelante a los Ejemplos anexos, en los cuales se muestran realizaciones representativas del tema que se describe en la presente invención.

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Ejemplo 1 Inmunización de aves hembra

Se identificaron las regiones peptídicas antigénicas de las proteínas homólogas DAZL de pollo y VASA de pollo, se sintetizaron y se conjugaron con hemocianina de lapa (KLH). Los péptidos seleccionados se muestran en la tabla 1.

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TABLA 1

1

Las soluciones stock (1.000 \mug/ml) de los diversos péptidos conjugados se mantuvieron a 4ºC. Inmediatamente antes de realizar la inmunización, se produjo una emulsión estable a partir de 0,5 ml de péptido conjugado y 0,5 ml de adyuvante TITERMAX® (TMA;CytRx Corp., Norcross, Georgia, Estados Unidos) utilizando dos jeringas conectadas a una aguja de emulsión de doble salida. El TMA es un copolímero en bloque no iónico y sintético de polioxietileno y polioxipropileno.

Las hembras Leghorn sexualmente maduras se inmunizaron por vía intramuscular con 100-200 \mug de un solo péptido conjugado o de una combinación de péptidos (pectoral mayor). Tras la inmunización se obtuvieron muestras sanguíneas, se dejaron coagular durante la noche a 4ºC y las muestras séricas resultantes se almacenaron a -20ºC para la posterior determinación de anticuerpos. Al cabo de 14 días se administró una segunda inmunización (50-100 \mug de péptido conjugado + TMA). También se obtuvieron muestras sanguíneas tres días después de la segunda exposición, tanto de las gallinas inmunizadas como de los controles que no habían sido inyectados. Las muestras séricas resultantes se almacenaron a -20ºC para la posterior determinación de anticuerpos.

Los títulos de anticuerpos anti-peptídicos se determinaron utilizando una técnica ELISA indirecta. Se prepararon disoluciones de anticuerpos (es decir, péptido conjugado con KLH) disolviendo el antígeno en agua destilada a una concentración de 20 \mug/ml (1 mg en 50 ml). Si el antígeno no era soluble de inmediato, se ajustaba el pH con NaOH 1 N o con HCl 1 N hasta que se disolvía el antígeno. Para preparar placas ELISA, se añadió solución de antígeno (0,1 ml) a cada pocillo de una placa de microtitulación de especificidad elevada de 96 pocillos. A continuación se cubrió la placa con film adhesivo y se incubó durante la noche a temperatura ambiente o durante dos horas a 37ºC. Tras el período de incubación, se lavaron las placas tres veces con 200 \mul de Tween-20/PBS al 0,05% (pH 7,4, vol: vol). A continuación se secaron las placas sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de Tween-20/PBS. A continuación se añadió solución de bloqueo (BSA al 1% en PBS, pH 7,4, almacenada a 4ºC) (150 \mul) en cada pocillo. Las placas se cubrieron con film adhesivo y se incubaron durante por lo menos 2 horas a temperatura ambiente o durante una hora a 37ºC o de manera indefinida a 4-8ºC.

A continuación se lavaron las placas otras tres veces con 200 \mul de Tween-20/PBS al 0,05% (pH 7,4, vol: vol) y se secaron sobre toalla de papel para eliminar el exceso de solución de lavado. Se diluyó de manera seriada el suero animal nativo o de prueba en tampón BSA/PBS al 1% (1:100-1:1.000.000). Se añadieron las muestras duplicadas de 100 \mul de las diluciones séricas de suero de pollo de prueba o de control (es decir, no inmunizadas). Las placas se cubrieron y se incubaron durante toda la noche a 4-8ºC o durante 2 horas a 37ºC.

Se lavaron las placas tres veces con 200 \mul de Tween-20/PBS al 0,05% (pH 7,4, vol: vol) y se secaron sobre toalla de papel para eliminar el exceso de solución de lavado. A cada pocillo se añadieron 100 \mul de solución conjugada HRP de cabra o de burro anti-pollo(IgM + IgG) (dilución 1: 6.000) en tampón BSA/PBS al 1%. Las placas se cubrieron con film adhesivo y se incubaron durante por lo menos 4 horas a temperatura ambiente o durante 2 horas a 37ºC o durante toda la noche a 4-8ºC. Tras la incubación, se lavaron las placas otras tres veces con 200 \mul de Tween-20/PBS al 0,05% (pH 7,4, vol: vol) y se secaron sobre toalla de papel para eliminar el exceso de solución de lavado.

Por último, se añadieron 100 \mul de solución sustrato en cada pocillo. La solución sustrato se preparó añadiendo 200 \mul de solución colorante 2,2'-azino-bis-(3-benztiazolina-6-ácido sulfónico (ABTS) preparada mediante disolución de 15 mg de colorante ABTS en 1 ml de agua ionizada) y 10 \mul de H_{2}O_{2} a 10 ml de tampón citrato 0,05 M, pH 4,0. Tras la adición del sustrato, se dejaron incubar las placas a temperatura ambiente y a continuación se analizaron en un lector de placas de 405 nm. Se asignaron los títulos tal como en la última dilución que produjo una señal que estadísticamente era significativamente mayor que el entorno (es decir, suero aislado a partir de una gallina de control no inmunizada) a 450 nm. Los títulos de anticuerpos de gallinas representativas se muestran en la tabla 2.

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TABLA 2 Títulos séricos frente a conjugados peptídicos VASA y DAZL de pollo tras la inmunización de gallinas ponedoras

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Ejemplo 2 Evaluación de las CGP en embriones de la etapa 27

Tras la inmunización, se recogieron los huevos, se almacenaron durante un máximo de 14 días y se incubaron hasta que alcanzaron la etapa 27 (HyH). Se sacrificaron los embriones en la etapa 27 (HyH) y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante toda la noche a 4ºC. A continuación se incrustaron los embriones en parafina y se cortaron serialmente en secciones de 7 \mum de grosor a lo largo de la región gonadal. Se seleccionaron las secciones que contenían región gonadal y se identificaron las CGP de las gónadas mediante tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal MC-480 (Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of lowa, lowa City, lowa, Estados Unidos) que reconoce el antígeno 1 embrionario específico de la etapa (SSEA-1). La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando fosfatasa alcalina conjugada con avidina-biotina (VECTASAIN® ABC-AP kit, Vector Laboratories, Burlingame, California, Estados Unidos) y sustrato BCIP/NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroazul de tetrazolio) (Amresco, Inc., Solon, Ohio, Estados Unidos). En resumen, después de bloquear en suero de cabra normal al 1,5% en PBS durante 30 minutos para eliminar la tinción inespecífica, se incubaron las secciones secuencialmente a temperatura ambiente con el primer anticuerpo (1: 1.000 ascitis diluido) durante 60 minutos y se lavaron tres veces con PBS, con el segundo anticuerpo biotinilizado durante 30 minutos y se lavaron tres veces con PBS, y con el reactivo ABC durante 30 minutos. Tras el último lavado en PBS, se tiñieron las secciones en sustrato de fosfatasa alcalina (solución NBT/BCIP, Amresco) durante 15 minutos y a continuación se colocaron en un medio de montaje acuoso. Las secciones representativas se muestran en las figuras 1-3.

En la figura 1, la gallina que produjo el huevo en el cual se desarrolló el embrión descrito se inmunizó con péptidos derivados del polipéptido VASA de pollo. Cuadro A: control (sin inmunización); Cuadro B: inmunización con péptido Vasa-C (SEC ID N.º: 4); Cuadro C: inmunización con péptido Vasa-N (SEC ID N.º: 3); Cuadro C: inmunización con ambos Vasa-N y Vasa-C. Las células SSEA-1+ (células teñidas de oscuro) son mucho más abundantes en el embrión de control que en cualquiera de los embriones expuestos a anticuerpos anti-VASA.

En la figura 2, la gallina que produjo el huevo en el cual se desarrolló el embrión descrito se inmunizó con péptidos derivados del polipéptido DAZL de pollo. Cuadro A: control (sin inmunización); Cuadro B: inmunización con péptido DAZL-C (SEC ID N.º: 8); Cuadro C: inmunización con péptido DAZL-N (SEC ID N.º: 7); Cuadro D: inmunización con ambos DAZL-N y DAZL-C. Las células SSEA-1+ (células teñidas de oscuro) son mucho más abundantes en el embrión de control que en cualquiera de los embriones expuestos a anticuerpos anti-VASA.

En la figura 3, la gallina que produjo el huevo en el cual se desarrolló el embrión descrito se inmunizó con péptidos derivados de ambos polipéptidos VASA y DAZL de pollo. Cuadro A: control (sin inmunización); Cuadro B: inmunización con péptidos Vasa-N, Vasa-C, DAZL-N y DAZLN-C (SEC ID N.º: 3, 4, 5 y 8). Las células SSEA-1+ (células teñidas de oscuro) son mucho más abundantes en el embrión de control que en el embrión expuesto a ambos anticuerpos anti-VASA y anti-DAZL.

La reducción de las CGP se determinó contando inmunohistoquímicamente las CGP teñidas en 10 secciones de ambas gónadas izquierda y derecha de cada embrión. Las 10 secciones se seleccionaron de la región media de las gónadas. Se saltaron por lo menos tres secciones entre cada dos secciones seleccionada para evitar contar cada una de las CGP más de una vez. Los resultados de este análisis se presentan en la figura 4. Tal como se muestra en la figura 4, cada uno de los antígenos peptídicos Vasa-N, Vasa-C, Dazl-N y Dazl-C pudieron inducir una respuesta inmunitaria en pollos, que consistió en la introducción de anticuerpos anti-antígenos en la yema de los huevos producidos por las hembras inmunizadas. La presencia de los anticuerpos en los huevos redujo el número de las CGP en los embriones que se hallaban en la etapa 27 del desarrollo. La inmunizaación de hembras con cada uno de los péptidos produjo una reducción de aproximadamente el 35-55% en la cantidad de CGP endógenas, mientras que la inmunización con dos o más péptidos produjo simultáneamente una reducción de aproximadamente el 55-70% de las CGP endógenas.

Análisis estadístico. Se analizaron las diferencias en el tratamiento para el número promedio de CGP/embrión utilizando el procedimiento GML del sistema SAS (SAS Institute Inc., Cary, Carolina del Norte, Estados Unidos). El modelo era CGP = gallina en tratamiento. Las diferencias fueron significativas a p <0, 0002. Las medias se separaron utilizando la prueba de intervalo múltiple de Duncan (Duncan's Multiple Range Test). Todos los tratamientos difirieron considerablemente del control a excepción de Vasa-N.

Ejemplo 3 Repoblación de células germinales en embriones tratados

Las aves producidas según los Ejemplos 1 y 2 se utilizan como receptoras y se administran CGP exógenas de aves donantes.

A. Preparación de células de donante

Se obtuvieron gónadas de embriones de pollo de 5,5 días en PBS. Las gónadas aisladas se mezclan en 250 \mul de EDTA al 0,02% en una placa de petri de 35 mm y se incuban a 37ºC durante 10 minutos. Las gónadas se separan con una aguja en la placa de petri y se incuban a 37ºC durante 5 minutos más. Se recogen las células en DMEM que contiene FBS al 20% y se centrifugan a 450 g durante 5 minutos. Las células se lavan y se resuspenden en DMEM. Se determina el número de células y la viabilidad. La concentración final de células viables se ajusta a aproximadamente 1.000 células/\mul.

B. Preparación de embriones receptores

Los embriones de pollo receptores se preparan tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los embriones se colocan en la incubadora hasta la etapa 14-17 (HyH).

C. Inyección de CGP de donante a embriones receptores

Se inyectaron aproximadamente de 2 a 3 \mul de una suspensión de células gonadales, que contenía aproximadamente 100 CGP, en los vasos sanguíneos de embriones de pollos receptores que se hallaban en la etapa 14-17 (HyH). Los huevos del receptor se sellaron y se incubaron a 37,5ºC, humedad relativa del 60%.

D. Evaluación de la repoblación de CGP

Los embriones se recogieron en la etapa 27 (HyH) y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante toda la noche. Los embriones se incrustaron en parafina, se cortaron secciones de 7 \mum de grosor y se tiñieron inmunohistoquímicamente con anticuerpo SSEA-1. Se contó el número de CGP en las gónadas izquierda y derecha de 10 secciones seleccionadas aleatoriamente a partir de embriones de control y de embriones sometidos a inyección. Los resultados se analizaron estadísticamente aplicando una prueba t realizada para comprobar la hipótesis nula según la cual la diferencia entre las medias de las poblaciones a partir de las cuales proceden las dos muestras equivale a 0,0 frente a la hipótesis alternativa de que la diferencia no es igual a 0,0. Si el valor p para esta prueba es inferior a 0,05, puede rechazarse la hipótesis nula con un nivel de confianza del 95,0%. También se determinó un intervalo de confianza del 95% para la diferencia entre las medias de las poblaciones. En un muestreo repetido, el 95,0% de todos estos intervalos contendrá la diferencia real.

Ejemplo 4 Producción de quimeras intraespecíficas de línea germinal de pollo tras la eliminación de CGP endógenas

El siguiente procedimiento se utiliza para producir quimeras intraespecíficas de línea germinal:

A. Producción de quimeras intraespecíficas de línea germinal de pollo

Los embriones de pollo Barred Plymouth Rock (BPR) se incubaron hasta la etapa 27-28 (HyH). Los embriones donantes Barred Plymouth Rock se utilizaron como marcador de color porque son homocigotos recesivos (ii) en el locus I y expresan pigmento en el plumaje. Las gónadas de embriones macho se recogieron en DMEM, se complementaron con FBS al 10%, glutamina, antibiótico y solución antimicótica. La determinación del sexo de los embriones se realizó utilizando el procedimiento de Petitte y Kegelmeyer (Animal Biotechnol 6: 19-30, 1995). A continuación se limpiaron las gónadas dos veces en PBS y se incubaron en EDTA al 0,02% a 37ºC durante 15 minutos. Se añadió medio fresco y se separaron las gónadas.

Se recogió la suspensión celular y se centrifugó a 450 g durante 5 minutos. Se sustituyó el medio y se determinó la viabilidad celular utilizando la prueba de exclusión con azul de triptano. Se obtuvieron alícuotas de la suspensión celular y se tiñieron con anticuerpo SSEA-1 para determinar el número de CGP inyectadas. Se inyectaron aproximadamente 2-3 \mul de suspensión celular, que contenía 100-500 CGP, en los vasos sanguíneos de embriones White Leghorn (WL) que se hallaban en la etapa 14-17 (HyH) del desarrollo. Los embriones WL sirvieron de receptores porque se sabía que eran homocigotos dominantes (II). Este genotipo codifica ausencia de pigmento en el plumaje. Tras la inyección de CGP, se devolvieron los huevos a la incubadora hasta el desarrollo completo. En la eclosión, se anillaron los pollitos WL fenotípicos y posteriormente se criaron hasta la madurez sexual. Se realizaron los siguientes apareamientos de prueba para determinar si existían quimeras de línea germinal: macho BPR X hembra WL (CGP BPR) y macho WL (CGP BPR) X hembra BPR. Posteriormente se evaluó la descendencia de estos apareamientos de prueba para determinar si las CGP gonadales del macho BPR se habían incorporado a la WL. Puesto que sólo se utilizaron embriones BPR de macho como donantes, todos los pollitos "negros" (fenotipo BPR) procedentes de los apareamientos de prueba macho BPR X hembra WL (CGP BPR) serían machos.

B. Preparación de embriones receptores

Los embriones de pollos receptores se prepararon tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los embriones se recogieron en la la etapa 27 (HyH) y se fijan en paraformaldheído al 4% durante toda la noche. Los embriones se incrustaron en parafina, se cortaron secciones de 7 \mum de grosor y se tiñieron inmunohistoquímicamente con anticuerpo SSEA-1. Se contó el número de las CGP en las gónadas izquierda y derecha de 10 secciones seleccionadas aleatoriamente a partir de embriones control y de embriones sometidos a inyección. El índice de esterilidad (IS) se calculó utilizando la ecuación IS = (N-X)/N donde N es el número de las CGP de las gónadas de control y X es el número de las CGP procedentes de embriones tratados (Reynaud, J Embryol Exp Morphol 21: 485-507, 1969).

C. Producción de quimeras interespecíficas de línea germinal embrionaria de pollo y pavo

Se incubaron los huevos fertilizados de pavo a 38,5ºC durante 8-8,5 días (etapa 27-28, HyH). Se disecaron los embriones para obtener las gónadas. A continuación se inyectaron aproximadamente 2-3 \mul de una suspensión de células gonadales, que contenía aproximadamente 150 CGP, en los vasos sanguíneos de embriones de pollos que se hallaban en la etapa 14 (HyH) del desarrollo. Se sellaron los huevos del receptor y se devolvieron a la incubadora. Se recogieron embriones del receptor en distintas etapas de la incubación (etapa 19 a etapa 25). Se limpiaron los embriones tres veces con PBS y a continuación se fijaron en paraformaldehído al 4% durante toda la noche a 4ºC. Se lavaron las muestras tres veces en PBS y a continuación se colocaron en etanol al 50%. A continuación se deshidrataron los tejidos, se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones. Las secciones resultantes se analizaron posteriormente inmunohistoquímicamente mediante tinción de SSEA-1 y reacción de ácido periódico Schiff (PAS).

D. Resultados

Tras la doble tinción con SSEA-1 y PAS; se identificaron CGP de pollo y de pavo en la gónada embrionaria de pollo en función de distintos patrones de tinción. Debido a la presencia de glucógeno, tanto las CGP de pollo como las de pavo adquirieron un color magenta tras la tinción PAS. No obstante, las CGP de pavo dejaron de ser SSEA-1 positivas cuando asentaron en la gónada en desarrollo, diferenciándose de las CGP del pollo que son SSEA-1 positivas en esta etapa del desarrollo.

La descendencia del cruce WL (II) X BPR (ii) expresaría habitualmente el fenotipo WL (li) y mostraría ausencia del pigmento melanina en el plumaje.

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Ejemplo 5 Producción de quimeras intraespecíficas y apareamiento de prueba

Utilizando protocolos similares a los descritos en los Ejemplos anteriores, se tratan los embriones white leghorn (WL) para eliminar CGP endógenas. Se recogieron las gónadas de embriones masculinos Barred Plymouth Rock (BPR), se aislaron las CGP y las CGP aisladas se administraron in ovo a las aves tratadas y a las aves de control sin tratar, fundamentalmente tal como se describe en el ejemplo anterior. Tras la eclosión, se criaron las aves quiméricas WL macho (CGP BPR) hasta la madurez sexual y se cruzaron con hembras BPR. La producción de una descendencia de color negro es indicativa de transmisión de los gametos procedentes las CGP BPR por el progenitor quimérico Wl macho (CGP BPR).

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias bibliográficas mencionada por el solicitante se muestra únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido una gran precaución al recopilar las referencias bibliográficas, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes declina cualquier responsabilidad al respecto.

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\bulletREYNAUD. C R Hebd Seances Acad Sci-D: Sci Natur, 1976, vol. 282, 1195 [0105]

\bulletPETITTE; KEGELMEYER. Animal Biotechnol, 1995, vol. 6, 19-30 [0110] [0145]

\bulletEYAL-GILADI; KOCHAV. Dev Biol, 1976, vol. 49, 321-327 [0119]

\bulletHAMBURGER; HAMILTON. J Morphol, 1951, vol. 88, 49-92 [0119]

<110> North Carolina State University

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Petitte, James

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Pardue, Samuel

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<120>DISMINUCIÓN DE CÉLULAS GERMINALES PRIMORDIALES EN ESPECIES AVIARES

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<130> 297/204 PCT

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<150> US 60/440,424

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<151> 2003-01-16

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<160> 8

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<170> Patente en Versión 3,2

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<210> 1

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<211> 1989

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<212> ADN

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<213> Gallus gallus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1).. (1989)

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 662

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 16

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<211> 1882

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<212>ADN

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<213>Gallus gallus

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<221>CDS

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<222>(174)..(1043)

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<210> 6

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<211> 289

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<213> Gallus gallus

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<210> 7

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<400> 7

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<400> 8

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> North Carolina State University

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<120>DISMINUCIÓN DE CÉLULAS GERMINALES PRIMORDIALES EN ESPECIES AVIARES

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<130> P19311

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<140> 04 703 077.0

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<141> 2004-01-16

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<150> US 60/440,424

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<151> 2003-01-16

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<160> 8

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<170> Patente en Versión 3,2

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<210> 1

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<211> 1989

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<212> ADN

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<213> Gallus gallus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1).. (1989)

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<400> 1

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20

21

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<210> 2

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<211> 662

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 2

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24

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<210> 3

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<211> 16

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<212> PRT

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<400> 3

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27

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<210> 4

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 4

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28

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<211> 1882

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<212> ADN

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<213> Gallus gallus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (174)..(1043)

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<400> 5

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29

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31

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<210> 6

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<211> 289

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 6

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<210> 7

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 8

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Claims

1. Procedimiento para modular el número de células germinales primordiales, CGP, en un embrión aviar, comprendiendo el procedimiento inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, a través del cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos para que el antígeno module el número de CGP endógenas en un embrión aviar presente dentro del huevo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el ave hembra se selecciona del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense, en el que el ave hembra es preferiblemente un pollo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL.

4. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de inmunización produce una disminución del número de células germinales primordiales en el embrión aviar, o en el que la etapa de inmunización produce un aumento del número de células germinales primordiales en el embrión aviar.

5. Procedimiento para modular el desarrollo de células germinales primordiales en un embrión aviar, comprendiendo el procedimiento inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP en un embrión aviar presente dentro del huevo.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ-cell less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL, o en el que el ave hembra se selecciona del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense, en el que preferiblemente el ave hembra es un pollo, o en el que la etapa de inmunización produce una inhibición del desarrollo de las células germinales primordiales en el embrión aviar, o en el que la etapa de inmunización produce un aumento del desarrollo de las células germinales primordiales en el embrión aviar.

7. Procedimiento para producir una ave quimérica, comprendiendo el procedimiento:

(a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales;

(b) producir un huevo a partir del ave hembra, en el que el huevo comprenda una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP, el número de las CGP o combinaciones de los mismos; en un embrión receptor que hay dentro del huevo; y

(c) administrar in ovo las CGP de donante al embrión receptor para producir una ave quimérica.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en SSEA-1, VASA, EMA-1, germ cell-less, dead end, nanos, stella, fragilis y DAZL.

9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que las CGP de donante proceden de la misma especie aviar que el embrión receptor, o en el que las CGP de donante proceden de una especie aviar distinta a la del embrión receptor, o preferiblemente que comprenda además incubar el huevo que contiene el ave quimérica hasta la eclosión, o además preferiblemente en el que el ave hembra se selecciona del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla canadiense.

10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que las CGP del donante proceden de un embrión aviar seleccionado del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla blanca, o en el que las CGP del donante son portadoras de un par de cromosomas de determinación masculina (Z), o en el que las CGP del donante son portadoras de un cromosoma de determinación femenina (w), o en el que la administración se lleva a cabo mediante inyección in ovo, o en el que las CGP del donante se administran cuando el embrión receptor se halla en la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y la etapa 30 según el sistema de clasificación de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP del donante se administran cuando el embrión receptor ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP del donante se seleccionan a partir del grupo que consta de CGP gonadales, de CGP sanguíneas y de CGP del creciente germinal o en el que la etapa de administración se efectúa inyectando al embrión receptor células blastodérmicas, y en el que las células blastodérmicas se diferencian en CGP del donante en el embrión receptor.

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11. Procedimiento para aumentar la proporción de aves macho en una diversidad de huevos de ave, comprendiendo el procedimiento:

(b) producir un huevo a partir del ave hembra, mediante el cual el huevo comprenda una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP en el ave hembra receptora que hay dentro del huevo;

(c) administrar in ovo las CGP masculinas (ZZ) al ave hembra receptora;

(d) incubar el huevo que contiene el ave hembra receptora hasta la eclosión;

(e) criar el ave hembra receptora hasta la madurez sexual; y

(f) producir a partir del ave hembra receptora una diversidad de huevos de ave, en los que la proporción de aves macho en la diversidad de huevos de ave producidos por el ave hembra receptora sea mayor de la que se obtendría sin haber administrado in ovo las CGP del macho (ZZ) al ave hembra receptora.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consta de SSEA-1, VASA, EMA-1, germ-cell less, dead end, nano, stella, fragilis y DAZL, o en el que las CGP del donante proceden de la misma especie aviar que el embrión receptor, o en el que las CGP del donante se seleccionan del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz y la grulla blanca, o en el la administración se lleva a cabo mediante inyección in ovo, o en el que las CGP del donante se administran cuando el embrión receptor se halla entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP se seleccionan a partir del grupo que consta de CGP gonadales, de CGP sanguíneas y de CGP del creciente germinal o en el que la etapa de administración se efectúa inyectando al embrión receptor células blastodérmicas, y en el que las células blastodérmicas se diferencian en CGP del donante en el ave hembra receptora.

13. Procedimiento para producir gametos aviares procedentes de una segunda especie aviar en una primera especie aviar, comprendiendo el procedimiento:

(a) inmunizar a una hembra de la primera especie aviar con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por la hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP de una ave receptora de la primera especie aviar que hay dentro del huevo;

(b) introducir las CGP del donante aisladas a partir de una ave de la segunda especie aviar a una ave receptora de la primera especie aviar;

(c) incubar el huevo que contiene el ave receptora de la primera especie aviar hasta la eclosión; y

(d) criar el ave receptora de la primera especie aviar hasta la madurez sexual, en la que el ave receptora de la primera especie aviar produce gametos de la segunda especie aviar.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consta de SSEA-1, VASA, EMA-1, germ-cell less, dead end, nano, stella, fragilis y DAZL, o en el que la primera especie aviar y la segunda especie aviar se seleccionan cada una del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz, la grulla canadiense y la grulla blanca, o en el que la primera especie aviar y la segunda especie aviar son la misma, la administración se efectúa mediante inyección in ovo, o en el que las CGP del donante se administran cuando el ave receptora de la primera especie aviar se halla entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP se administran cuando el ave receptora de la primera especie aviar ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP del donante se seleccionan del grupo que consta de CGP gonadales, de CGP sanguíneas y de CGP del creciente germinal, o en el que la etapa de administración se efectúa inyectando al ave receptora de la primera especie aviar células blastodérmicas, y en el que las células blastodérmicas se diferencian en las CGP del donante en el ave hembra receptora de la primera especie aviar.

15. Procedimiento para aumentar la transmisión de líneas germinales de una molécula de ácido nucleico en una ave, comprendiendo el procedimiento:

(a) inmunizar a una ave hembra con un antígeno asociado a células germinales primordiales, mediante el cual un huevo producido por el ave hembra comprende una concentración suficientemente elevada de anticuerpos específicos del antígeno para modular el desarrollo de las CGP en una ave receptora que hay dentro del huevo;

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(b) administrar una diversidad de CGP de donante que comprenden la molécula de ácido nucleico al ave receptora en condiciones suficientes que permitan por lo menos a una de las muchas CGP colonizar una gónada del ave receptora;

(c) incubar el huevo que contiene el ave receptora hasta la eclosión; y

(d) criar el ave receptora hasta la madurez sexual, en la que el ave receptora produce gametos procedentes de las CGP del donante.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el antígeno comprende un epítopo de un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consta de SSEA-1, VASA, EMA-1, germ-cell less, dead end, nano, stella, fragilis y DAZL, o en el que el las CGP del ave receptora y del donante se seleccionan cada una del grupo constituido por el pollo, el pavo, el pato, la codorniz, la grulla canadiense y la grulla blanca, o en el que las CGP del donante son de la misma especie aviar que el ave receptora, o en el que las CGP del donante son de distinta especie aviar que las CGP del ave receptora, o en el que la administración se efectúa mediante inyección in ovo, o en el que las CGP del donante se administran cuando el ave receptora se halla entre la etapa IX según el sistema de clasificación de etapas de Eyal-Giladi y Kochav y la etapa 30 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP se administran cuando el ave receptora ha superado la etapa 14 según el sistema de clasificación de etapas de Hamburger y Hamilton, o en el que las CGP del donante se seleccionan del grupo que consta de CGP gonadales, de CGP sanguíneas y de CGP del creciente germinal, o en el que la etapa de administración se efectúa inyectando al ave receptora células blastodérmicas, y en el que las células blastodérmicas se diferencian en CGP del donante en el ave hembra receptora.