ES2310732T3 - Evaluacion de vacunas adyuvantes. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro de evaluar la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de un antígeno proteico molecular y un portador en la forma de hidróxido de aluminio, en donde la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, a la cual se une por lo menos una parte del antígeno, el método comprende las etapas de: i) someter la vacuna a una o más mediciones que se seleccionan del grupo que consiste de: 1) la actividad inmunológica de la mezcla, 2) la actividad inmunológica del antígeno en la fase líquida, 3) la actividad inmunológica del antígeno en la fase sólida, 4) la actividad inmunológica del antígeno en la fase líquida ante el tratamiento de la mezcla para desplazar el antígeno de la fase sólida, y 5) la actividad inmunológica del antígeno de la fase sólida ante el tratamiento de la mezcla para desplazar el antígeno de la fase sólida, en donde la medición de la actividad inmunológica se selecciona del grupo que consiste de: a) capacidad de unión de anticuerpo utilizando un inmunoensayo que utiliza un anticuerpo específico de antígeno unido a una fase sólida de anticuerpo, b) capacidad de activar células efectoras, y c) potencial para inducir anafilaxia; y ii) utilizar los resultados de medición para evaluar la actividad inmunológica de la vacuna.
Description
Evaluación de vacunas adyuvantes.
La presente invención se relaciona con un método
in vitro para evaluar la actividad inmunológica, que incluye
la actividad alergénica en potencial para inducir reacciones
alérgicas, por ejemplo, un potencial para inducir anafilaxia de una
preparación de vacuna en la forma de una mezcla de un antígeno
proteico molecular y un portador en fase sólida en forma de
hidróxido de aluminio, en donde la mezcla comprende una fase líquida
y una fase sólida, a la cual se une por lo menos una parte del
antígeno.
Las vacunas por ejemplo para inyección
subcutánea se pueden preparar al mezclar una solución acuosa de un
antígeno y un portador en fase sólida, por ejemplo gel de hidróxido
de aluminio, para producir una mezcla en donde por lo menos una
parte del antígeno se adsorbe a la fase sólida y una parte o nada
del antígeno está en fase líquida. El portador en fase sólida puede
servir como un adyuvante, es decir, potencia a la respuesta
inmunológica del antígeno, aunque el mecanismo de potenciación no
siempre se comprende completamente. Además, el mecanismo y
naturaleza de la adsorción del antígeno al portador en fase sólida
no siempre se comprende completamente y puede depender en gran
medida del tipo de antígeno involucrado. No obstante, teóricamente
la adsorción a geles de hidróxido de aluminio involucra parcialmente
fuerzas electrostáticas. para las proteínas, se considera que los
grupos fosfato de proteínas fosforiladas también interactúan con el
gel de hidróxido de aluminio y posiblemente en cierta medida
sustituyen a los grupos hidróxido en la estructura de gel.
En consecuencia, el grado de adsorción varía con
la naturaleza de la proteína específica en cuestión. Además, en el
caso de un antígeno en forma de un extracto de un material
biológico, por ejemplo un extracto de alergenos de polen de pasto,
el extracto contiene una cantidad de iones y moléculas diferentes,
las cuales potencialmente interfieren con la unión de los alergenos
al portador en fase sólida.
Se puede medir la actividad inmunológica en un
método in vivo que involucra la administración de la vacuna
al animal de prueba para generar anticuerpos hacia el antígeno,
recolectar una muestra biológica y realizar un ensayo de la muestra
para medir la cantidad de anticuerpos generados. La actividad
alergénica y el potencial para inducir reacciones alérgicas se
puede probar por inyección intradérmica en los animales
sensibilizados y por medición del grado de las reacciones de roncha
e inflamación (Kildsgaard et al., Assessment of the in
vivo allergenic potency of new allergy vaccines by intradermal
testing in sensitised mice, Clinical Immunology and Allergy in
Medicine, Proceedings of the 21^{st} EAACI Congress 2002, Nápoles,
Italia). No obstante, tales métodos in vivo son laboriosos y
consumen tiempo y necesitan el uso de animales de prueba, lo cual es
indeseable.
El documento
SU-A-1 746 318 describe un método de
determinación cuantitativa de antígeno en una preparación de vacuna
de encefalitis transmitida por garrapata, en donde el antígeno se
adsorbe sobre hidróxido de aluminio, el método comprende hacer
reaccionar la preparación de vacuna con una cantidad en exceso de
anticuerpos específicos en amortiguador de fosfato, seguido por
determinación inmunoenzimática de la cantidad de anticuerpos en el
sobrenadante. Se utiliza una gráfica de calibración para obtener
resultados cuantitativos.
Chang et al. (Vaccine 19 (2001)
2884-2889) describe un estudio que examina el grado
de adsorción de lisozima a gel de hidróxido de aluminio en la
vacuna y en fluido intersticial y su efecto sobre la respuesta
inmunológica en conejos. Las vacunas se tratan previamente con
anión fosfato para producir vacunas que tienen grados de adsorción
que varían de 3 a 90%. Se ha encontrado que el grado de adsorción de
las vacunas que muestran 3, 35 u 85% de adsorción cambian a 40% en
la siguiente hora de mezclado con fluido intersticial para simular
la administración subcutánea. De acuerdo con esto, la respuesta de
anticuerpo antilisozima es la misma para vacunas que tienen grados
diferentes de adsorción.
Shi et al. (Vaccine 20 (2002)
80-85) describe un estudio de la capacidad del
fluido intersticial para cambiar el grado de adsorción de
ovalbúmina a adyuvante de hidróxido de aluminio y lisozima a
adyuvante de fosfato de aluminio. La ovalbúmina y la lisozima se
eluyen casi completamente después de exposición a 37ºC en fluido de
linfa. La capacidad del fluido de linfa para eluir la lisozima del
adyuvante de fosfato de aluminio no cambia conforme envejece la
vacuna. Únicamente 60% de la ovalbúmina adsorbida al hidróxido de
aluminio se eluye durante la exposición a fluido de linfa después
de que la vacuna envejece por 11 semanas a 4ºC.
Lyer et al. (Vaccine 21 (2003)
1219-1223) describe el hallazgo de que la ovalbúmina
y la caseína \alpha desfosforilada se adsorben en una vacuna de
hidróxido de aluminio pero se eluyen completamente cuando se exponen
a fluido intersticial. No obstante, la vacuna produce
inmunopotenciación en comparación con una solución de la proteína.
En contraste, la caseína \alpha se adsorbe completamente a
hidróxido de aluminio tanto en la vacuna como ante la exposición a
fluido intersticial. La inmunopotenciación por hidróxido de aluminio
también se observa para caseína \alpha. Los resultados indican
que las células presentadoras de antígeno pueden captar antígeno
desorbido desde el fluido intersticial así como antígeno adsorbido a
adyuvante que contienen aluminio.
Katz et al. (Journal of Virological
Methods, 25 (1989) 101-108) describe una prueba de
ELISA para determinar el contenido antigénico de vacunas de virus
con adyuvante de hidróxido de aluminio. La prueba de ELISA se
establece para suplementar una prueba in vivo. Otros métodos
in vitro comprenden radioinmunoensayo y métodos que
requieren desorción de antígeno a partir de hidróxido de aluminio. A
diferencia de tales métodos in vitro, la prueba de ELISA no
sufre de interferencia significativa del hidróxido de aluminio
excepto a altas concentraciones de hidróxido de aluminio. Se
menciona que los intentos anteriores en una prueba de ELISA de
vacunas intactas adolece de inhibición muy fuerte por hidróxido de
aluminio. El artículo establece diversas explicaciones por las
cuales funciona la presente prueba de ELISA. En el último párrafo se
sugiere que el método puede ser aplicable a vacunas de virus con
adyuvante de hidróxido de aluminio, como una clase.
Thraenhart et al. (Journal of Biological
Standardisation, (1989) 17, 291-309) describe una
prueba de ELISA para determinar la potencia in vitro de la
vacuna del virus de la rabia por determinación de glucoproteína de
virus de la rabia. La influencia del hidróxido de aluminio sobre la
medición de potencia se examina y se encuentra que no hay
influencia.
El documento
US-A-4 127 385 (Weeke) describe un
método que comprende mezclar extractos de alergeno de pelo de
caballo e incrustaciones adheridas a un alhydrogel con suero de un
paciente alérgico para unir IgE libre del suero al alergeno
alhydrogel y posteriormente agregar anti-IgE
radiomarcado y medir la radioactividad. Se indica que el método se
puede utilizar para determinar la fuerza de la duración de
almacenamiento de extractos de alergeno adheridos al alhydrogel.
Este tipo de inmunoensayo de la técnica anterior tiene la desventaja
de que los anticuerpos no específicos para el alérgeno, hasta
cierto punto, se unirán al alhydrogel-alergeno y
darán como resultado una medición incorrecta.
La naturaleza de adsorción de antígeno molecular
a los portadores en fase sólida es muy compleja y desconocida en
gran medida, y también varía entre antígenos diferentes dependiendo
de la naturaleza química y estructural del antígeno. Además, la
influencia del portador en fase sólida en la reacción entre IgE
específica de antígeno y antígeno unido a un portador en fase
sólida es muy compleja y no se conoce por completo. Por lo tanto,
hasta ahora se ha considerado que no es posible medir in
vitro la actividad inmunológica, incluyendo la actividad y el
potencial alergénico para inducir reacciones alérgicas de vacunas de
portador en fase sólida listas para utilizarse que comprendan
antígenos moleculares o por lo menos que no es posible medirlas con
precisión. Por lo tanto, hasta ahora ha sido una práctica común
evaluar la actividad inmunológica de una vacuna in vitro en
base a la medición de la actividad inmunológica de la solución del
antígeno molecular utilizado para la preparación de una vacuna
portadora en fase sólida lista para utilizarse. El objetivo de la
presente invención es proporcionar un método in vitro para
evaluar la actividad inmunológica de vacunas de antígeno proteico
molecular portadora en fase sólida, listas para utilizar, donde el
portador en fase sólida está en forma de hidróxido de aluminio.
\vskip1.000000\baselineskip
Este objetivo se obtiene con la presente
invención, la cual se refiere a los siguientes aspectos.
Un método in vitro de evaluación de la
actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una
mezcla de un antígeno proteico molecular y un portador en forma de
hidróxido de aluminio, en donde la mezcla comprende una fase
líquida y una fase sólida, a la cual se une por lo menos una parte
del antígeno, el método comprende las etapas de:
i) someter la vacuna a una o más mediciones que
se seleccionan del grupo que consiste de:
- 1)
- la actividad inmunológica de la mezcla,
- 2)
- la actividad inmunológica del antígeno en la fase líquida,
- 3)
- la actividad inmunológica del antígeno en la fase sólida,
- 4)
- la actividad inmunológica del antígeno en la fase líquida ante una tratamiento de la mezcla para desplazar el antígeno de la fase sólida, y
- 5)
- la actividad inmunológica del antígeno en la fase sólida ante un tratamiento de la mezcla para desplazar el antígeno de la fase sólida,
- en donde la medición de la actividad inmunológica se selecciona del grupo que consiste en: a) capacidad de unión de anticuerpo utilizando un inmunoensayo que utiliza un anticuerpo específico de antígeno unido a una fase sólida con anticuerpo, b) capacidad para activar células efectoras, y c) potencial para inducir anafilaxia; y
ii) utilizar los resultados de la medición para
evaluar la actividad inmunológica de la vacuna.
\newpage
Un método para preparar una preparación de
vacuna en forma de una mezcla de un antígeno proteico molecular y
un portador en fase sólida en forma de hidróxido de aluminio, en
donde la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, a la
cual se une por lo menos parte del antígeno, el método
comprende:
i) mezclar el antígeno y el portador,
ii) medir la actividad inmunológica de la vacuna
utilizando el método de evaluación de la actividad inmunológica de
una preparación de vacuna de acuerdo con la invención, y
iii) repetir las etapas i) y ii) hasta que se
obtenga una actividad inmunológica deseada.
La presente invención se basa en el hallazgo
novedoso y sorprendente de que en realidad es posible realizar
mediciones de la actividad inmunológica, incluyendo la actividad y
potencial alergénico para inducir reacciones alérgicas, es decir,
un potencial para inducir anafilaxia en un portador en fase sólida
listo para utilizarse, por ejemplo gel, vacunas utilizando, por
ejemplo inmunoensayos competitivos convencionales, ensayos de
liberación de histamina y ensayos de proliferación de células T,
sin que el portador en fase sólida impida que se realicen
mediciones válidas y con significado. En particular, la presente
invención se basa en el hallazgo novedoso y sorprendente de que
cuando se mide la actividad inmunológica como la capacidad de unión
de anticuerpo, es posible evitar la influencia alterante en la
medición por el portador en fase sólida mediante la utilización de
anticuerpo unido a una fase sólida de anticuerpo. Se considera que
la razón para esto es que la fase sólida de anticuerpo evita la
unión no específica de anticuerpo al sistema portador en fase sólida
con antígeno. Este hallazgo es sorprendente dado que se esperaría
que resultaría difícil para los anticuerpos acoplados a una fase
sólida de anticuerpo obtener contacto con los antígenos de un
sistema portador en fase sólida con antígeno. Las mismas
consideraciones se aplican a la situación en donde se mide la
actividad inmunológica como la capacidad para activar células
efectoras, en donde los anticuerpos específicos de antígeno se unen
a células efectoras, por ejemplo mastocitos y basófilos, los cuales
recuerdan a una fase sólida de anticuerpo en forma de
partículas.
La invención se basa adicionalmente en el
reconocimiento de que el problema de la complejidad e incertidumbres
de la naturaleza de la adsorción de antígeno a portadores en fase
sólida y la variabilidad de un tipo de antígeno a otro se pueden
eliminar: 1) al comparar los resultados de medición obtenidos con
resultados históricos del mismo tipo de antígeno, 2) al relacionar
los resultados de medición para las vacunas almacenadas con los
resultados de una vacuna recién preparada, o 3) al obtener una
caracterización detallada de la vacuna al medir un número de
parámetros característicos de la vacuna, que incluyen la
distribución del antígeno entre la fase líquida y la fase sólida y
la fuerza de adsorción del antígeno al portador en fase sólida.
La figura 1 muestra la capacidad del extracto de
Phl p adsorbido a un gel de hidróxido de aluminio (Alutard Phl p)
para inhibir la unión de IgE a extracto de Phl p biotinilado
utilizando extracto de Phl p en solución (Phl p) como referencia y
extracto Bet v (Alutard Bv) como control negativo.
La figura 2 muestra los niveles de liberación de
histamina de una vacuna en forma de alergeno de extracto Phl p
adsorbido a un adyuvante de gel de hidróxido de aluminio (vacuna A)
del sobrenadante de vacuna A después de sedimentación y de la fase
sólida de la vacuna A después de sedimentación.
La figura 3 muestra los niveles de liberación de
histamina de una vacuna en forma de extracto de alergeno Phl p
adsorbido a un adyuvante de gel de hidróxido de aluminio (+alum) y
de alergeno de extracto Phl p en solución (-alum).
La figura 4 muestra la estimulación de células T
utilizando CD69 como marcador para cuatro geles de aluminio de
extracto Phl p, los sobrenadantes de los mismos, para dos extractos
de Phl p en solución y para Phl p 1 y Phl p 5 purificados en
solución.
Las figuras 5-6 muestran el
desplazamiento (desorción) de alergeno a partir de vacunas de gel de
hidróxido de aluminio (Alutard) que comprende a los alergenos Phl p
1 y Phl p 5, respectivamente.
En relación con la presente invención,
"antígeno" significa cualquier sustancia inmunogénica, es
decir, cualquier sustancia capaz de activar al sistema
inmunológico.
En relación con la presente invención,
"antígeno proteico molecular" significa cualquier sustancia en
forma de una molécula única o una mezcla de moléculas únicas, en
donde las moléculas únicas son proteínas, así como análogos y
derivados de las mismas. La expresión "antígeno molecular"
excluye células virales y microbianas, tales como células
bacterianas y micóticas.
\newpage
El antígeno proteico molecular se puede
seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste de alergenos
proteicos, medicamentos proteicos, y sustancias nutricionales
proteicas y nucleótidos así como análogos o derivados de los
mismos.
Los ejemplos de antígenos de proteínas
moleculares son alergenos proteicos, péptidos, así como análogos o
derivados de los mismos. Los ejemplos de sustancias nutricionales
proteicas son enzimas proteicas, así como análogos o derivados de
los mismos. Los ejemplos de medicamentos proteicos son anticuerpos,
péptidos, hormonas proteicas, enzimas proteicas, así como análogos
o derivados de los mismos.
En el presente contexto, el término análogos o
derivados se pretende que incluya forma modificadas de la sustancia
biológicamente activa. La modificación se puede realizar por
modificación química de o modificación sintética, por ejemplo por
biotinilación, desaminación, maleinación, sustitución de uno o más
aminoácidos, por reticulado, por glucosilación o por otra
tecnología recombinante. También se pretende que el término incluya
mutaciones que se encuentran en la naturaleza, isoformas y análogos
retroinversos.
El antígeno proteico molecular preferiblemente
se puede seleccionar del grupo que consiste de:
Enzimas proteicas tales como uroquinasa,
activador de plasminógeno tisular (TPA), factor VIII de coagulación
y estreptocinasa;
sustancias inmunogénicas tales como proteínas
naturales, recombinantes o modificadas o fragmentos de las mismas,
antígenos proteicos, alergenos proteicos (véase abajo), péptidos,
componentes proteico molecular de material parasitario o toxinas
proteicas, por ejemplo tales como las que se derivan de
toxoide tetánico, toxoide de difteria,
subunidades A y B de toxina de cólera, rubéola, raptovirus (rabia),
mioxovirus, paramioxivirus similar a el virus de parainfluenza,
paperas y sarampión. picornavirus como poliovirus, coxaquievirus,
ecovirus y rinovirus, reovirus, poxivirus como el virus de viruela,
virus de vaccinia y virus de vacuna, papovavirus como virus de
polioma, virus de papiloma y SV-40, adenovirus, EBV
como el virus de mononucleosis, parvovirus como HPV B19, herpes
virus como el virus de herpes simple el virus de herpes zoster
(virus de varicela), citomegalovirus (CMV), arbovirus como el de
fiebre amarilla y fiebre de dengue, retrovirus como VIH, virus de
hepatitis como hepatitis A, hepatitis B, y hepatitis C,
Haemophilius influenzae tipo B, Mycobacterium como
M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. avium, M.
intracellulare, M. kansasii, M. gordonae, M. paratuberculosis y
M. lepramurium, género Borrelia como B. burgdorferi
en particular B. burgdorferi sensu lato y B. burgdorferi
sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. duttoni y B.
recurrentis, Bordetella pertussis (tosferina), género
Salmonella como S. typhimurium y S. typhi,
género Treponema como T. pallidum, género
Leptospira, género Campylobacter, como C.
jejuni, género Helicobacter como H. pylori, género
Pseudomonas, género Legionella, género
Neisseria como N. gonorrhoea y N. menigitidis,
género Chlamydia como C. trachomatis, C. pneumonia y
C. psittae, género enterobacter, género
Klebsiella, género Yersinia, género Vibrio
como Vibrio cholerae, género Gardnerella, género
Rickettsia, género Clostridium como C. difficile,
C. botulinum y C. tetani, género Lactobacillus,
género Listeria y género Mycoplasma como M.
pneumoniae, M. hominis, Plasmodium falciparum y Leishmania
donovani,
mohos y hongos tales como Clahdosporium,
Alternaria, Aspergillus, Besidiomycetes, Candida albicans y
Penicillinum,
medicamentos proteicos tales como enzimas,
hormonas proteicas, por ejemplo LHRH, insulina y hormona del
crecimiento humana, hemolíticos/hemostáticos proteicos, por ejemplo
eritropoyetina \alpha o \beta.
otros medicamentos proteicos como compuestos
relacionados con cáncer tal como TNF\alpha, análogos de LHRH,
citostáticos y anticuerpos anticancerígenos tales como anticuerpos
contra células de cáncer de mama, por ejemplo anticuerpos contra el
receptor HER-2, células de cáncer de colon y células
de linfoma de células B, por ejemplo anticuerpos contra CD20 en
células B malignas;
así como análogos o derivados de los mismos.
En una modalidad preferida de la invención, el
antígeno proteico molecular es un alergeno. En una modalidad
preferida de la invención el alergeno es una proteína como se
encuentra en la naturaleza que se ha reportado que induce
reacciones alérgicas, es decir, mediadas por IgE ante su exposición
repetida a un individuo. Los ejemplos de alergenos que se
encuentran de manera natural incluyen alergenos de polen (alergenos
de árboles, hierbas, malezas y polen de pasto), alergenos de
insectos (inhalantes, saliva y alergenos de veneno, por ejemplo
alergenos de picaduras, alergenos de cucarachas y jejenes, alergenos
de veneno de himenópteros), alergenos de pelo de animales y caspa
(por ejemplo de perro, gato, caballo, rata, ratón, etcétera) y
alergenos de alimentos. Los alergenos de polen importantes de
árboles, pastos y hierbas son aquellos que se originan de los
órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y
platanaceae que incluyen, por ejemplo, abedul
(Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus),
carpe (Carpinus) y oliva (Olea), cedro
(Cryptomeria y Juniperus), plátano falso
(Platanus), el orden de Poales que incluye, por
ejemplo, pastos de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon,
Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los órdenes
de Asterales y Urticales que incluyen, por ejemplo,
hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y
Parietaria. Otros alergenos de inhalación importante son
aquellos de ácaros del polvo casero del género
Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de
almacenamiento por ejemplo Lepidoglyphys, Glycyphagus y
Tyrophagus, aquellos de cucarachas, jejenes y moscas, por
ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y
Ctenocepphalides y aquellos de mamíferos tales como gatos,
perros y caballos, alergenos de veneno que incluyen y que se
originan de picaduras o piquetes de insectos tales como aquellos de
los órdenes taxonómicos de Hymenoptera que incluyen abejas
(superfamilia Apidae), avispas (superfamilia Vespidea)
y hormigas (superfamilia Formicoidae). Los alergenos de
inhalación importantes de hongos son, por ejemplo, aquellos que se
originan de los géneros Alternaria y Cladosporium.
En una modalidad más preferida de la invención
los alergenos son Bet v 1, Aln g 1, Cor a 1 y Car b 1, Que a 1, Cry
j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Jun a 1, Jun a 2, jun a 3, Ole e 1,
Lig v 1, Pla l 1, Pla a 2, Amb a 1, Amb a 2, Amb t 5, Art v 1, Art
v 2 Par j 1, Par j 2, Par j 3, Sal k 1, Ave e 1, Cyn d 1, Cyn d 7,
Dac g 1, Fes p 1, Hol l 1, Lol p 1 y 5, Pha a 1, Pas n 1, Phl p 1,
Phl p 5, Phl p 6, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sor h 1, Der
f 1, Der f 2, der p 1, Der p 2, Der p 7, Der m 1, Eur m 2, Gly d 1,
Lep d 2, blo t 1, Tyr p 2, Bla g 1, Bla g 2, Per a 1, Fel d 1, Can
f 1, Can f 2, Bos d 2, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Mus m 1, Rat n 1,
Apis m 1, Api m 2, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol
m 5, Pol a 1, Pol a 2, Pol a 5, Sol i 1, Sol i 2, Sol i 3 y Sol i
4, Alt a 1, Cla h 1, Asp f 1, Bos de 4, Mal d 1, Gly m 1, Gly m 2,
Gly m 3, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5 o híbridos de
combinación de la cría molecular de cualquiera de estos.
En la modalidad más preferida de la invención,
el alergeno es alergeno de polen de pasto o un alergeno de ácaro de
polvo o un alergeno de ambrosía o un polen de cedro o un alergeno de
gato o alergeno de abedul.
En otra modalidad adicional de la invención, la
vacuna comprende por lo menos dos especies diferentes de alergenos
que se originan de la misma fuente alérgica o que se originan de
fuentes alergénicas diferentes, por ejemplo alergenos de pasto del
grupo 1 y pasto del grupo 5 o alergenos de ácaros del grupo 1 y del
grupo 2 de especies diferentes de ácaros y pasto, respectivamente,
antígenos de maleza como alergenos de ambrosía corta y gigante,
alergenos de hongos diferentes como alternaria y cladosporium,
alergenos de árboles como abedul, avellana, carpe, roble y aliso,
alergenos de alimentos como cacahuete, frijol de soja y alergenos de
leche.
El alergeno incorporado en la vacuna puede estar
en forma de un extracto, un alergeno purificado, un alergeno
modificado, un alergeno recombinante o un mutante de un alergeno
recombinante. Un extracto alergénico puede contener de manera
natural una o más isoformas del mismo alergeno, mientras que un
alergeno recombinante típicamente representa sólo una isoforma de
un alergeno. En una modalidad preferida el alergeno está en forma de
un extracto. Preferiblemente se mide la actividad inmunológica de
dos o más alergenos mayores o menores del extracto. Además se puede
medir la actividad inmunológica del extracto completo.
En otra modalidad preferida, el alergeno es un
alergeno recombinante. En una modalidad preferida adicional, el
alergeno es un mutante de baja unión a IgE, que se encuentra de
manera natural o un mutante de baja unión a IgE recombinante.
Los alergenos pueden estar presentes en
cantidades equimolares o la proporción de los alergenos presentes
puede estar en el intervalo de 1:1 a 1:40, de manera preferible de
1:1 a 1:20, y de manera más preferible de 1:1 a 1:10.
En una modalidad adicional de la invención, los
alergenos de baja unión a IgE son alergenos de acuerdo con WO
99/47680 o WO02/40676.
El portador en fase sólida está en forma de
hidróxido de aluminio.
En una modalidad de la invención, el tratamiento
de desplazamiento comprende poner en contacto la mezcla con un
reactivo que contiene proteína. Se considera que el potencial de
desplazamiento se incrementa al incrementar la carga electroquímica
de la proteína y por lo tanto se prefieren proteínas cargadas. Se
puede utilizar cualquier proteína para llevar a cabo el
desplazamiento de antígeno a partir del portador en fase sólida. Los
reactivos preferidos que contienen proteína son fluidos corporales
tales como fluido de linfa, fluido intersticial, plasma sanguíneo,
suero sanguíneo, fracciones purificadas de fluidos corporales y
proteínas aisladas de fluidos corporales tales como albúmina sérica
humana (HAS). Preferiblemente, el fluido corporal es suero
sanguíneo. El uso de fluidos corporales para el desplazamiento de
antígeno a partir del portador en fase sólida vuelve posible
simular las condiciones in vivo, a las cuales se somete a la
vacuna después de administración.
En una segunda modalidad, el tratamiento de
desplazamiento comprende poner en contacto a la mezcla con aniones
tales como iones fosfato, iones citrato, iones lactato, iones
acetato, iones sulfato, iones borato y iones oxalato,
preferiblemente iones fosfato.
Preferiblemente, el desplazamiento se lleva a
cabo a un pH de 4 a 10, de manera más preferible de 5 a 9 y de
manera mucho más preferible de 6 a 8. Preferiblemente, el
desplazamiento se lleva a cabo a una temperatura de 32ºC a 42ºC, de
manera más preferible de 35ºC a 39ºC, y de manera mucho más
preferible de 36ºC a 38ºC.
En relación con la presente invención, la
expresión "capacidad de unión de anticuerpo" significa el nivel
de epítopo de célula B disponible en la vacuna para unir
anticuerpo. Se puede llevar a cabo la medición de la capacidad de
unión de anticuerpo de la preparación de vacuna utilizando cualquier
método adecuado o inmunoensayo capaz de realizar dicha medición, en
donde el anticuerpo se une a una fase sólida de anticuerpo. Los
tipos adecuados de ensayos incluyen: 1) ensayos en donde el
antígeno que se determina está unido pasivamente a una fase sólida,
y 2) ensayos en donde el antígeno que se va a determinar es retenido
por un primer anticuerpo específico para antígeno acoplado a una
fase sólida. Para ambos ensayos, tipo 1) y 2), el antígeno unido a
la fase sólida se puede a) hacer reaccionar con un segundo
anticuerpo específico para antígeno, o b) con un antígeno
modificado.
Cuando se utiliza la opción a), i) el segundo
anticuerpo específico para antígeno se puede marcar (ensayo
directo) o ii) se puede hacer reaccionar con un anticuerpo marcado
específico para el segundo anticuerpo específico para antígeno
(ensayo indirecto). Cuando se utiliza la opción b), el antígeno
modificado se puede marcar o se puede adaptar para ser acoplado a
una etiqueta, por ejemplo un sistema enlazante. Un ejemplo de tal
sistema enlazante es el sistema
biotina-avidina/estreptavidina.
La marca puede ser cualquier sistema de marca
adecuado utilizada convencionalmente en inmunoensayos que comprende
marcas cromogénicas, marcas luminiscentes, marcas
quimioluminiscentes, marcas de enzimas, marcas de radioactividad,
marcas fluorescentes y marcas de absorbancia, preferiblemente marcas
quimioluminiscentes.
En una modalidad preferida de la invención, el
compuesto con marca (iv) es un compuesto quimioluminiscente unido
covalentemente a avidina, estreptavidina o un derivado funcional del
mismo.
La marca quimioluminiscente preferiblemente es
un compuesto de acridinio tal como éster de dimetilacridinio
(DMAE).
El primero y el segundo anticuerpos específicos
para antígeno y el antianticuerpo pueden, todos, independientemente
entre sí, ser monoclonales o policlonales.
El ensayo de tipo 2)a) comúnmente se
denomina como ensayo tipo emparedado o un ensayo de dos sitios. El
ensayo de tipo b) comúnmente se denomina como un ensayo de
inhibición, cuando el antígeno que se va a determinar se permite
que se una a la fase sólida antes de agregarlo al antígeno
modificado. El ensayo de tipo b) comúnmente se denomina como un
ensayo de competencia, cuando el antígeno que se va a determinar y
el antígeno modificado se mezclan antes de que se unan a la fase
sólida.
En una modalidad preferida de la presente
invención, el inmunoensayo es un ensayo competitivo o un ensayo de
inhibición, preferiblemente un ensayo competitivo.
En un tipo preferido de inmunoensayo competitivo
se mide la actividad inmunológica de una vacuna como el grado de
inhibición de la unión entre el antígeno biotinilado estandarizado e
IgE específica de antígeno por la vacuna que contiene antígeno. El
inmunoensayo comprende las etapas de: 1) mezclar la preparación de
vacuna que contiene antígeno con antígeno biotinilado para formar
una mezcla de antígeno. 2) incubar la mezcla de antígeno con IgE
específica de antígeno acoplada a una fase sólida con anticuerpo,
por ejemplo un portador en formas de partícula tal como partícula
paramagnéticas, para formar un inmunocomplejo, y 3) opcionalmente
lavar y posteriormente incubar el inmunocomplejo con estreptavidina
marcada con éster de acridinio y 4) lavar y posteriormente medir la
cantidad de luz emitida. El inmunoensayo se puede llevar a cabo
utilizando, por ejemplo, ADVIA Centaur (Bayer).
Los ejemplos de inmunoensayos adecuados son
ensayos basados en ELISA y RAST.
En un inmunoensayo adecuado adicional para
llevar a cabo el método de la invención: 1) se hace reaccionar una
cantidad cuantificada de anticuerpo específico de antígeno con la
vacuna de antígeno que se va a determinar, 2) en la mezcla de
reacción resultante se separa la fase líquida de la fase sólida, y
3) se mide la cantidad remanente de anticuerpo no unido en la fase
líquida. La medición del anticuerpo en la fase líquida se puede
llevar a cabo utilizando cualquier método convencional para
cuantificar anticuerpo. En una variante de este inmunoensayo, la
fase líquida no se separa de la fase sólida antes de la medición del
anticuerpo no unido.
El tipo de anticuerpo utilizado o detectado en
el inmunoensayo determina el tipo de epítopos medidos. Por lo
tanto, en base en el tipo de anticuerpo, por ejemplo IgA, IgE, IgG e
IgM utilizada o detectada, es posible medir selectivamente los
epítopos de IgA, IgE, IgG e IgM, respectivamente. En una modalidad
preferida de la invención, el anticuerpo utilizado o detectado se
seleccionan del grupo que consiste de Iga, IgE, IgG e IgM y
combinaciones de los mismos. En una modalidad particular de la
invención, los anticuerpos utilizados o detectados son ambos IgE e
IgG. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo
utilizado o detectado es IgE.
La fase sólida de anticuerpo puede ser cualquier
fase sólida utilizada convencionalmente en inmunoensayos, que
incluye placas de microtitulación y partículas, por ejemplo
partículas paramagnéticas.
En una modalidad preferida del método de la
invención, se mide la actividad inmunológica como la capacidad para
activar células efectoras del sistema inmunológico.
En una modalidad de la invención se utiliza
sangre completa para la activación de células efectoras. En una
segunda modalidad, las células efectoras son células aisladas de una
muestra biológica. En una tercera modalidad, las células efectoras
son células aisladas de una muestra biológica y cultivadas. En una
cuarta modalidad, las células efectoras son células aisladas de una
muestra biológica, cultivadas y modificadas, por ejemplo modificadas
genéticamente.
Preferiblemente, las células efectoras se
seleccionan del grupo que consiste de mastocitos, basófilos,
eosinófilos, células T, células B y células presentadoras de
antígeno (APC) y combinaciones de los mismos. Otras células
efectoras preferidas son células efectoras modificadas, es decir,
células derivadas y que tienen por lo menos algunas características
de las células efectoras, que incluyen células modificadas
genéticamente y células transformadas malignas.
En una modalidad de la invención se mide la
capacidad de activación de la célula efectora al medir el nivel de
un marcador de célula efectora. El marcador preferiblemente se
selecciona del grupo que consiste de moléculas secretoras,
moléculas de superficie y moléculas intracelulares. Preferiblemente,
la molécula secretora se selecciona del grupo que consiste de
mediadores, citoquinas, proteínas citotóxicas y receptores
solubles.
Los ejemplos del mediador que se va a medir son
mediadores que se seleccionan del grupo que consiste de histamina,
leucotrienos (LTB_{4}, LTC_{4}, LTD_{4} y LTE_{4}),
prostaglandinas (PGD_{2}, PGE_{2} y PGF_{2a}), tromboxano,
factor activante de plaquetas (PAF), proteína básica mayor (MBP),
ECF, ECP, EDN, EPO, bradiquiinina, adenosina, sustancia P,
neuroquinina A, factores de complemento (por ejemplo C3d), que
incluye fragmentos de complemento; serotonina, radicales oxígeno,
basogranulina y mastocitos y basófilo proteasas que incluyen
triptasa, quimasa, carboxipeptidasa y catepsina.
Los ejemplos de la citoquina que se va a medir
son citoquinas que se seleccionan del grupo que consiste de
interleuquinas (IL-1 a IL-27),
factores de crecimiento hematopoyéticos, factores estimuladores de
la colonia de granulocitos-macrófagos (por ejemplo
CM-CSF), interferones (IFN\alpha, IFN\beta,
IFN\gamma), moléculas relacionadas con factor de necrosis tumoral
(TNF) (TNF y linfotoxina), miembros de la superfamilia Ig
(IL-1), la familia TGF-\beta y
las quimioquinas (IL-8, RANTES y otras). Los ensayos
para medir las siguientes citoquinas están ampliamente diseminados:
IL-2, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-10, IL-12,
IL-13, IFN-\gamma,
TNF-\alpha y TGF-\beta.
Los ejemplos de la proteína citotóxica que se va
a medir son proteínas citotóxicas que se seleccionan del grupo que
consiste de proteína catiónica de eosinófilos (ECP), proteína básica
mayor (MBP) y EDN.
Preferiblemente, la molécula de superficie se
selecciona del grupo que consiste de receptores de superficie y
moléculas de adhesión tales como selectinas, integrinas y la
superfamilia de inmunoglobulinas (ICAM-1,
VCAM-1), VLA4, CD11B, CD11C, CD18 y
\alpha-d. Las moléculas de superficie que se sabe
que son reguladas por aumento o disminución en células efectoras
por activación de antígeno son: CD23, CD69, CD203C
(I-NPP3), CD31, CD162 y CD162L. Otras moléculas de
superficie incluyen basogranulina. Preferiblemente, el marcador de
célula efectora es histamina, triptasa, basogranulina, leucotrieno
LTC_{4}, CD63, CD69 y CD203C. Se puede medir la histamina, por
ejemplo, en un método basado en ELISA que se basa en la competencia
entre la histamina que se va a determinar y su conjugado
enzimático, histamina-fosfatasa alcalina utilizada
como trazador para unión a un anticuerpo recubierto sobre
micropozos. La monoamina histamina es demasiado pequeña para ocupar
completamente el sitio de unión del anticuerpo. Por lo tanto se han
obtenido anticuerpos monoclonales de alta afinidad dirigidos contra
histamina modificada. La histamina en la muestra debe ser
derivatizada (debe formar un derivado) de la misma manera que la
histamina del conjugado. Esto se obtiene de manera fácil y
reproducible con un reactivo acilante a pH ligeramente alcalino. La
histamina acilada de la muestra y el conjugado de
histamina-fosfatasa alcalina, cuando se agregan a
los pocillos de microtitulación, compiten por la unión en un número
limitante de sitios de anticuerpo. Después de la incubación, los
pocillos se enjuagan con el fin de reparar los componentes no
unidos. Después se mide la actividad enzimática unida por la adición
de un sustrato cromogénico (pNPP). La intensidad del color depende
inversamente de la concentración de histamina en la muestra. Se
calcula la concentración en base en una curva estándar que se
obtiene con estándares. Este inmunoensayo enzimático se puede
llevar a cabo utilizando un equipo que se puede obtener de
"IMMUNOTECH" (Marsella,
Francia).
Francia).
En una segunda modalidad de la invención se mide
la capacidad de activación de la célula efectora al medir la
proliferación de células T. Se puede medir la proliferación de
células T por un método que se basa en la incorporación de
^{3}H-timidina o la reducción de marcado de
fluorescencia y se puede llevar a cabo utilizando leucocitos recién
aislados de la sangre de sujetos sensibilizados o se utilizan líneas
de células T específicas para alergeno establecido. Además, la
producción de citoquinas de las células activadas se puede
investigar por análisis de los sobrenadantes de célula por ELISA o
por métodos basados en esfera.
Los eventos tempranos en la activación de
células T se pueden investigar a través de análisis citométrico de
flujo o expresión de células T de diferentes receptores de
superficie tales como CD25, 26, 27, 39, 45 RA/O, 69, 70, 96, 97,
108, 109, 134 (OX40), 153, 154 (OX40L), 166, 178 (FasL), 183
(CXCR3), 212 (IL-12Rb1), 223, los cuales son
regulados por aumento o disminución en puntos de tiempo diferentes
durante la activación de las células T.
La activación de las células T puede ser
alterada por la etapa de diferenciación y activación de las células
presentadoras de antígeno (APC) lo cual puede ser investigado por
análisis de citometría de flujo de las siguientes moléculas de
superficie: CD14, 25, 26, 40, 80/86, 83, 105, 166.
Finalmente, se puede describir el efecto
inmunológico de las vacunas sobre la activación de células B vía la
expresión de superficie de CD25, 26, 39, 80/86, 97, 126, 138 y la
expresión de superficie así como la secreción de diferentes
isotipos de anticuerpo. Como una alternativa adicional, se pueden
investigar la mayor parte de los parámetros descritos en lo
anterior a nivel de ARNm a través de análisis Taqman, análisis de
chip de gen u otro método para cuantificar la expresión de un
gen.
La administración de una vacuna involucra cierto
nivel de riesgo e inducir efectos secundarios mediados por IgE,
por ejemplo anafilaxia. En un aspecto particular del método de la
invención se mide la actividad inmunológica de la preparación de
vacuna como el potencial para inducir anafilaxia. Preferiblemente,
se mide el potencial para inducir anafilaxia al medir el nivel de
un marcador de anafilaxia de una célula efectora que se selecciona
del grupo que consiste de los marcadores de células efectoras
mencionadas antes. Preferiblemente, el marcador de anafilaxia de la
célula efectora es histamina, triptasa, basogranulina, leucotrieno
LTC4, CD63, CD69 y CD203C. La histamina es liberada de los
mastocitos y basófilos. Se puede medir la histamina, por ejemplo,
en un método basado en ELISA descrito antes. Además, se puede medir
la histamina utilizando ensayos basados en fibra de vidrio.
En una modalidad preferida de este aspecto de la
invención se mide el potencial para inducir anafilaxia en sangre
completa. Preferiblemente la sangre completa utilizada para la
medición se ha extraído de un sujeto en un máximo de cinco horas,
de manera más preferible dos horas antes de la medición.
Se prefiere que la vacuna y la sangre completa
se mezclen en una proporción que corresponda a una proporción in
vivo calculada la cual podría presentarse en un sujeto como
resultado de una administración accidental de una dosis de vacunas
en la corriente sanguínea de un sujeto. Además se prefiere utilizar
sangre completa ajustada a la temperatura corporal.
En una modalidad alternativa de esta invención
se mide el potencial para inducir anafilaxia 1) en células
efectoras aisladas de una muestra biológica, 2) en células efectoras
aisladas de una muestra biológica y cultivada, o 3) en células
efectoras aisladas de una muestra biológica, cultivadas y
modificadas, por ejemplo modificadas genéticamente.
Preferiblemente, las células efectoras se
seleccionan del grupo que consiste de mastocitos, basófilos,
eosinófilos, células T, células B y células presentadoras de
antígeno (APC) y combinaciones de los mismos. Otras células
efectoras preferidas son células efectoras modificadas, es decir
células derivadas y que tienen por lo menos algunas características
de las células efectoras que incluyen células modificadas
genéticamente y células transformadas de manera maligna. Las
células modificadas genéticamente pueden ser, por ejemplo, células
modificadas genéticamente de manera que expresen una o más
proteínas las cuales no se expresan en células nativas, que
incluyen proteínas intracelulares y proteínas de superficie, por
ejemplo proteínas receptoras. Las células transformadas de manera
maligna pueden ser, por ejemplo, una línea de células cancerosas,
por ejemplo una célula de cáncer capaz de crecimiento continuo
in vitro sin estimulación.
En una modalidad de la invención, la vacuna se
somete únicamente a una medición de la actividad inmunológica de la
mezcla de la fase líquida y la fase sólida (medición 1)).
En una segunda modalidad de la invención, la
vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad
inmunológica del antígeno en la fase líquida por tratamiento de la
mezcla para desplazar el antígeno de la fase sólida (medición
4)).
En una tercera modalidad de la invención, la
vacuna se somete tanto a una medición de la actividad inmunológica
de la mezcla de la fase líquida como de la fase sólida (medición 1))
y a una medición de la actividad inmunológica de antígeno en la
fase líquida (medición 2)).
En una cuarta modalidad de la invención, la
vacuna se somete tanto a una medición de la actividad inmunológica
del antígeno en fase líquida (medición 2)) como a una medición de la
actividad inmunológica del antígeno en su fase sólida (medición
3)).
En una quinta modalidad de la invención, la
vacuna se somete tanto a una medición de la actividad inmunológica
de mezcla de la fase líquida y de la fase sólida (medición 1)) así
como a una medición de la actividad inmunológica del antígeno en la
fase líquida ante un tratamiento de la mezcla para desplazar al
antígeno de la fase sólida (medición 4)).
Una modalidad preferida del método de la
invención es aquel en donde se mide la actividad inmunológica,
incluyendo la actividad alergénica y el potencial para inducir
reacciones alérgicas, por ejemplo potencial para inducir anafilaxia
de un producto intermedio que contiene antígeno utilizado para
preparar la vacuna, y en donde la evaluación de la actividad
inmunológica de la vacuna se basa en una comparación del resultado
de la medición que se obtiene para el producto intermedio y los
resultados de medición que se obtienen para una o más mediciones
1)-5). Preferiblemente, la vacuna se somete a
mediciones inmediatamente al momento de su preparación.
Una modalidad preferida de la invención es
aquella en donde la vacuna se somete a las mediciones inmediatamente
después de la preparación y después de 1 o más períodos de
almacenamiento y en donde la evaluación de la actividad
inmunológica de la vacuna se basa en una comparación entre los
resultados de medición inicial y final.
Una modalidad adicional de la invención es
aquella en donde la evaluación de la actividad inmunológica de la
vacuna se basa en una comparación entre los resultados de medición
obtenidos para la vacuna y los resultados de medición
correspondientes previos del mismo tipo de vacuna o de otro tipo de
vacuna.
La preparación de vacuna sometida al método de
la presente invención puede ser cualquier preparación lista para
utilizarse en forma de una mezcla de un antígeno proteico molecular
y un portador en fase sólida en forma de hidróxido de aluminio, en
donde la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida a la
cual se une parte del antígeno, o cualquier preparación para
preparar una formulación lista para utilizarse.
La preparación lista para utilizarse puede ser
para administración parenteral y para administración por mucosa.
La administración parenteral incluye las vías
intravenosa, intramuscular, intraarticular, subcutánea,
intradérmica, epicutánea/transdérmica e intraperitoneal. Las
vacunas para administración vía inyección se pueden formular de
manera que sean adecuadas por inyección con aguja o para inyección
sin agujas.
La administración por mucosa incluye la
administración oral, nasal, vaginal, sublingual, ocular, rectal,
urinaria, intramamaria, pulmonar, ótica (es decir, por el oído) o
bucal.
La vacuna puede estar en forma de una aspersión,
un aerosol, una mezcla, una suspensión, una dispersión, una
emulsión, un gel, una pasta, un jarabe, una crema, un ungüento,
implantes (oído, ojo, piel, nariz, rectal y vaginal), supositorios y
supositorios para el útero.
La presente invención se relaciona
adicionalmente con un método de preparación de una preparación de
vacuna en forma de una mezcla de un antígeno proteico molecular y
un portador en fase sólida en forma de hidróxido de aluminio, en
donde la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida a la
cual se une por lo menos una parte del antígeno, el método
comprende:
i) mezclar el antígeno y el portador,
ii) medir la actividad inmunológica de la vacuna
utilizando el método de acuerdo con la invención, y
iii) opcionalmente repetir las etapas i) e ii)
hasta que se obtiene una actividad inmunológica deseada.
La expresión "método in vitro"
significa un método el cual se puede llevar a cabo sin
inmunizaciones de los animales de prueba.
La expresión se "actividad inmunológica"
significa cualquier respuesta del sistema inmunológico que incluye
actividad alergénica y potencial para inducir reacciones alérgicas
que incluyen potencial para inducir anafilaxia.
La expresión "actividad alergénica"
significa actividad de unión de IgE.
La expresión "portador en fase sólida"
significa cualquier sustancia insoluble en agua capaz de formar una
unión covalente o no covalente con un antígeno, en donde la unión no
covalente incluye, por ejemplo adherencia, inclusión, encapsulación
y acoplamiento.
Las expresiones "fase sólida" y "fase
líquida" de una vacuna significan las fases que resultan de un
procedimiento de separación para la separación de una suspensión
del portador en fase sólida en el líquido dentro de una fase sólida
y una fase líquida, el proceso de separación puede ser, por ejemplo,
centrifugación, extracción o sedimentación simple.
La expresión "unido" significa cualquier
unión covalente o no covalente, en donde la unión no covalente
incluye, por ejemplo, adherencia, inclusión, encapsulación y
acoplamiento.
Se disuelve el alergeno liofilizado en un
amortiguador acuoso y se diluye hasta una concentración deseada. Se
agrega "Alhydrogel" (1,3%) a la solución de alergeno obtenida
mientras se agita y después se agrega agua estéril. Se permite que
la solución resultante repose al siguiente día y después se agrega
amortiguador lentamente mientras se agita para producir el gel de
hidróxido de aluminio de alergeno final.
Se realizan experimentos de inhibición de IgE en
un instrumento ADVIA centaur. Se mezclan diluciones seriadas
(realizadas con el equipo TECAN
(P-05-07F294)) del inhibidor
(antígeno en solución o vacuna de adyuvante de gel de antígeno) con
una cantidad fija de antígeno biotinilado y se incuba adicionalmente
con IgE absorbida en fase sólida. La cantidad de alergeno
biotinilado unida a la fase sólida se calcula como la luz emitida
después de incubación con estreptavidina marcada con éster de
acridinio. Los datos sin tratar se procesan en Excel y se
transfieren a GraphPad Prism v. 4.0 para el análisis final (ajuste
de curva, graficado y comparaciones estadísticas). Los datos se
ajustan a una función logística de cuatro parámetros (ecuación
1),
y las curvas ajustadas se
consideran paralelas si la pendiente de Hill (HS) de los ajustes
individuales no difiere significativamente. Se calcula CE_{50} a
partir de los ajustes limitados con un cálculo de HS común.
CE_{50} indica la concentración que resulta en 50% de
inhibición.
El ensayo de inhibición de IgE descrito en lo
anterior se utiliza para probar la actividad inmunológica de las
vacunas del adyuvante de gel de alergeno Phl P y alergeno Bet de v.
Los resultados se muestran en la figura 1.
La figura 1 muestra la capacidad del extracto de
Phl p adsorbido a un gel de hidróxido de aluminio (Alutard Phl p)
para inhibir la unión de IgE a extracto de Phl p biotinilado
utilizando extracto de Phl p en solución (Phl p) como referencia y
extracto de Bet v (Alutard Bv) como control negativo.
El extracto de alergeno en solución es el
extracto utilizado para preparar la vacuna adyuvante de gel y se
utiliza para propósitos de comparación.
A partir de la figura 1 se puede concluir lo
siguiente: Dado que el potencial de inhibición máximo del gel de
extracto Phl p corresponde al del extracto Phl p en solución, se
puede concluir que el presente inmunoensayo de inhibición de IgE es
capaz de medir la cantidad total y el alcance completo de
especificidad de actividad inmunológica del gel de extracto Phl p.
El gel de extracto Bet v de control negativo no muestra actividad
inhibidora.
Como será evidente de la figura 1, la curva de
inhibición de la vacuna de gel de alergeno se desplaza un poco a la
derecha, el curso de las curvas desplazadas es paralelo al del
alergeno en solución. Esto significa que una concentración mayor
del alergeno formulado en gel es necesario para obtener el mismo
grado de inhibición.
Se mide la histamina en un método basado en
ELISA sobre la competencia entre histamina que se va a determinar y
su conjugado enzimático, histamina-fosfatasa
alcalina utilizada como un trazador para unión a anticuerpo
recubierto sobre micropocillos. La monoamina histamina es demasiado
pequeña para ocupar completamente el sitio de unión en el
anticuerpo. Por lo tanto, se han obtenido anticuerpos monoclonales
de alta afinidad dirigidos contra histamina modificada. La
histamina en la muestra puede ser derivatizada de la misma manera
que la histamina del conjugado. Esto se obtiene con facilidad y de
manera reproducible con un reactivo acilante en un pH ligeramente
alcalino. La histamina acilada de la muestra y el conjugado de
histamina-fosfatasa alcalina, cuando se agregan a
los pocillos de microtitulación compiten por unión a un número
limitante de sitios de anticuerpo. Después de la incubación, los
pocillos se enjuagan con el fin de eliminar los componentes no
unidos. Después se mide la actividad enzimática unida mediante la
adición de un sustrato cromogénico (pNPP). La intensidad del color
depende inversamente de la concentración de histamina en la muestra.
La concentración se calcula en base en una curva estándar que se
obtiene con estándares. El inmunoensayo enzimático se lleva a cabo
utilizando un equipo que se puede obtener de "IMMUNOTECH"
(Marsella, Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
Liberación de histamina con alergeno formulado
con hidróxido de aluminio en condiciones que recuerdan las
condiciones in vivo en el caso de que la vacuna sea
administrada accidentalmente en la corriente sanguínea. Esto se
lleva a cabo al medir la liberación de histamina en sangre completa
no diluida a la cual se le agrega la vacuna. Después de la
estimulación, las células se sedimentan por centrifugación y se
elimina por separación el sobrenadante que contiene histamina.
Después se mide la concentración de histamina utilizando el equipo
Immunotech ELISA
2015.
2015.
\vskip1.000000\baselineskip
- Amortiguador Pipes, pH 7.4 BB LAB97350
- Tubos Falcon pp de 14 ml
- Sangre estabilizada con heparina Venojekt de vidrio VT-100SH
- Tubo de prueba de cultivo con fondo redondo de polipropileno PP: Elkay 12 x 75 mm
- 0002053001
- Tapones de PP
- Equipo de ELISA Immunotech 2015
- Lavador ELISA ELP-40
- Lector ELISA EL-340 con programa KC4
- Centrífuga con rotor para placas: Sigma 3-15
- Incubador 37ºC
- Coca 0.5%
- Mesa de agitación Titramax 1000
- Diversas pipetas solas, de 8 y de 12 canales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se precalienta a 37ºC la sangre completa
estabilizada con heparina. Las alícuotas de diversas vacunas y
controles se diluyen 1:200 en amortiguador Coca. Se pipetean 2
\mul en tubos Falcon y se diluyen 1:500 en sangre completa no
diluida recién extraída. La incubación se realiza a 37ºC durante 30
min.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tubos se centrifugan durante 10 min a 800 x
g. Los sobrenadantes se recolectan y ensayan utilizando la histamina
de histamina ELISA.
- 1.
- Acetilación de muestras y estándares:
- Los estándares se pipetean en las placas con las muestras
- + se agregan 25 \mul de amortiguador de acetilación por las pipetas
- + 25 \mul de reactivo de acetilación
- 2.
- Mezclado cuidadoso con una pipeta de 12 canales y se transfieren 50 \mul a una placa de ELISA recubierta previamente.
- 3.
- Se agregan 200 \mul de conjugado de histamina por pozo.
- 4.
- Incubación a 2-8ºC en refrigerador
- ya sea
- a: en una mesa de agitación > 2 de temporizador
- o
- b: sin agitación > 18 de temporizador
- 5.
- Lavado en el programa de lavadora ELISA:
- "Bot-wa-no-res 12" con el amortiguador de lavado anterior.
- 6.
- Se agregan 200 \mul de sustrato de color por pozo.
- 7.
- Se incuba a 18-25ºC (cubierto) en una mesa de agitación, en 30 min.
- 8.
- La reacción se detiene al agregar 50 \mul de solución de detención.
- 9.
- Lectura en un lector con KC4 a 405 nm.
- 10.
- Se calcula la concentración en KC4 por ajuste lineal de curva estándar.
En un primer experimento, una vacuna en forma de
un alergeno de extracto de Phl p adsorbido en adyuvante de gel de
hidróxido de aluminio (vacuna A), el sobrenadante de la vacuna A
después de sedimentación y la fase sólida de la vacuna A después de
sedimentación se ensayan utilizando el ensayo de liberación de
histamina descrito antes. Las muestras de sobrenadante y de fase
sólida se obtienen como sigue: se permite que la vacuna A repose
por un período de tres días en un frasco para precipitar la fase en
gel y se toma la muestra con una jeringa desde la parte superior
del frasco, y desde la parte inferior del frasco, respectivamente.
Los resultados se muestran en la figura 2.
Como aparecerá de la figura 2, únicamente una
cantidad muy pequeña del alergeno está presente en el sobrenadante
y casi la totalidad del alergeno está presente en la fase de gel de
la vacuna. Esto es indicativo de una vacuna de depósito eficaz e
inocua.
En un segundo experimento se determina una
vacuna en forma de alergeno de extracto Phl p adsorbida a adyuvante
de gel de hidróxido de aluminio (+alum) y alergeno de extracto Phl p
en solución (-alum) utilizando el ensayo de liberación de histamina
descrito antes. Los resultados se muestran en la figura 3.
Como aparece en la figura 3, la liberación de
histamina inducida por el gel de alergeno es del mismo nivel que la
de solución de alergeno, y por lo tanto el presente ensayo de
histamina es capaz de medir la actividad alergénica completa de la
vacuna de gel.
Los eventos tempranos en la activación de
células T se investigan a través del análisis de citometría de flujo
de la expresión de células T sobre el receptor de superficie CD69,
el cual es regulado por aumento en diferentes puntos de tiempo
durante la activación de células T. El análisis de citometría de
flujo se basa en la unión de anticuerpos antimarcador de superficie
conjugados para fluorescencia a la superficie celular y detección
subsiguiente de la intensidad de cantidad de fluorescencia en la
célula individual por análisis FACS.
Se prueban vacunas de extracto Phl p y
sobrenadantes de las vacunas de extractos Phl p almacenadas durante
14 meses, 8 meses, 4 meses y 1 mes. Además, se prueban dos extractos
Phl p (IMP 1 e IMP 4), Phl p 1 purificado y Phl p 5 purificado en
solución. Se utilizan como referencia superantígeno (SEB) y medio
(med).
Se estimulan cuatro líneas de células T
diferentes con vacunas de pasto completo o con los sobrenadantes de
las vacunas obtenidas después de centrifugación. La edad de las
vacunas difiere de 1 a 14 meses después de la producción y se
utiliza como lectura el porcentaje de células T (CD3+) que expresan
CD69. Los resultados se muestran en la figura 4, la cual demuestra
claramente que las vacunas de edad diferente inducen activación
comparable de células T y que es posible distinguir entre el
potencial de la vacuna completa y los sobrenadantes relacionados.
Además, las vacunas completas inducen activación de células T en la
misma cantidad que los extractos crudos (IMP 1 y 4). Se incluyen
como controles los alergenos purificados Phl p 1, Phl p 5 y
superantígeno SEB. En experimentos subsecuentes se demuestra que el
gel de hidróxido de aluminio sin alergeno no induce la expresión de
CD69 sobre células T específicas de alergeno.
Se prueban dos vacunas de gel de hidróxido de
aluminio (Alutard) que comprenden los alergenos Phl p 1 y Phl p 5.
Los agentes de desplazamiento utilizados son amortiguador fosfato
(NaH_{2}PO_{4}-Na_{2}PO_{4}) 200 mM, pH 7.4
diluido (en una vacuna de muestra) a amortiguador de fosfato 5.0 mM
o 50 MM, acumulado de suero construido de muestras a partir de
individuos no alérgicos (AG-525-) o acumulados de
suero que contiene fosfato 5 mM.
Los desplazamientos se realizan como sigue: se
mezcla 1 ml de una vacuna ya sea con un volumen apropiado de
amortiguador de fosfato 200 mM lo que proporciona una concentración
de fosfato final de 5 ó 50 mM y se incuba durante 1 ó 20 horas a
37ºC; o se diluye 1:1 ya sea con acumulado de suero solo o con
acumulado de suero y un volumen apropiado de amortiguador de
fosfato 200 mM lo que proporciona una concentración final de fosfato
de 5 mM. Después de incubación las muestras se centrifugan (10 min,
4000 rpm) y el sobrenadante se cosecha y almacena a -20ºC hasta que
se utiliza. Las muestras sirven como referencia o puntos cero y se
centrifugan y el sobrenadante se almacena a -20ºC hasta que se
utiliza.
La cantidad de los alergenos individuales Phl p
1 y Phl p 5 se determina a partir de experimentos de inhibición,
brevemente: se obtienen curvas estándar de cada alergeno a partir de
experimentos de inhibición utilizando alergeno purificado
biotinilado inhibido con alergeno purificado. Los datos se ajustan a
una función logística de cuatro parámetros (ecuación 1) y la
capacidad inhibidora medida para un sobrenadante de desplazamiento
dado se transforma en una concentración de alergeno utilizando la
ecuación 1 y se determina los parámetros para cada alergeno. La
totalidad de las concentraciones calculadas después se corrigen para
diluciones con los agentes de desplazamiento y todas las cantidades
reportadas se refieren a la cantidad en 1 ml de vacuna.
Los resultados se muestran en las figuras 5 y 6
utilizando las siguientes denominaciones:
Ninguno: significa que no hubo tratamiento de la
muestra, 1:1: significa desplazamiento realizado con suero humano y
las figuras molares se refieren a la concentración final de
amortiguador fosfato. Además, se indica la temperatura. Todas las
figuras representan la cantidad en las muestras iniciales (con
corrección de dilución).
Como será evidente de las figuras 5 y 6, el
desplazamiento de Phl p 1 a partir del gel de hidróxido de aluminio
es mucho menor que el desplazamiento de Phl p 5. No obstante, en
ambos casos la cantidad de desplazamiento es baja. Esto es
indicativo de una vacuna con un depósito eficaz e inocuo.
Claims (56)
1. Un método in vitro de evaluar la
actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una
mezcla de un antígeno proteico molecular y un portador en la forma
de hidróxido de aluminio, en donde la mezcla comprende una fase
líquida y una fase sólida, a la cual se une por lo menos una parte
del antígeno, el método comprende las etapas de: i) someter la
vacuna a una o más mediciones que se seleccionan del grupo que
consiste de: 1) la actividad inmunológica de la mezcla, 2) la
actividad inmunológica del antígeno en la fase líquida, 3) la
actividad inmunológica del antígeno en la fase sólida, 4) la
actividad inmunológica del antígeno en la fase líquida ante el
tratamiento de la mezcla para desplazar el antígeno de la fase
sólida, y 5) la actividad inmunológica del antígeno de la fase
sólida ante el tratamiento de la mezcla para desplazar el antígeno
de la fase sólida, en donde la medición de la actividad
inmunológica se selecciona del grupo que consiste de: a) capacidad
de unión de anticuerpo utilizando un inmunoensayo que utiliza un
anticuerpo específico de antígeno unido a una fase sólida de
anticuerpo, b) capacidad de activar células efectoras, y c)
potencial para inducir anafilaxia; y ii) utilizar los resultados de
medición para evaluar la actividad inmunológica de la vacuna.
2. Un método según la reivindicación 1, en donde
la actividad inmunológica se mide como la capacidad de unión del
anticuerpo.
3. Un método según la reivindicación 2, en donde
el anticuerpo utilizado o detectado se selecciona del grupo que
consiste de IgA, IgE, IgG, IgM y combinaciones de los mismos.
4. Un método según la reivindicación 3, en donde
los anticuerpos utilizados o detectados son ambos, IgE e IgG.
5. Un método según la reivindicación 3, en donde
el anticuerpo usado o detectado es IgE.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 2-5, en donde la actividad
inmunológica se mide en un inmunoensayo.
7. Un método según la reivindicación 6, en donde
el inmunoensayo es un inmunoensayo competitivo.
8. Un método según la reivindicación 1, en donde
la actividad inmunológica se mide como la capacidad para activar
células efectoras del sistema inmunológico.
9. Un método según la reivindicación 8, en donde
la sangre completa se utiliza para activación de células
efectoras.
10. Un método según la reivindicación 8, en
donde las células efectoras son células aisladas de una muestra
biológica.
11. Un método según la reivindicación 8, en
donde en donde las células efectoras son células aisladas de una
muestra biológica y cultivadas.
12. Un método según la reivindicación 8, en
donde las células efectoras son células aisladas de una muestra
biológica, cultivadas y modificadas.
13. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 10-12, en donde las células
efectoras se seleccionan del grupo que consiste de mastocitos,
basófilos, eosinófilos, células T, células B y células presentadoras
de antígeno (APC) y combinaciones de las mismas.
14. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 8-13, en donde la capacidad
activadora de células efectoras se mide al medir el nivel de un
marcador de célula efectora.
15. Un método según la reivindicación 14, en
donde el marcador se selecciona del grupo que consiste de moléculas
secretoras, moléculas de superficie y moléculas intracelulares.
16. Un método según la reivindicación 15, en
donde la molécula secretora se selecciona del grupo que consiste de
mediadores, citoquinas, proteínas citotóxicas y receptores
solubles.
17. Un método según la reivindicación 16, en
donde el mediador medido se selecciona del grupo que consiste de
histamina, leucotrienos (LTB_{4}, LTC_{4}, LTD_{4} y
LTE_{4}), prostaglandinas (PGD_{2}, PGE_{2} y PGF_{2a}),
tromboxano, factor activador de plaquetas (PAF), proteína básica
principal (MBP), proteína catiónica de eosinófilos (ECP),
neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN), peroxidasa de eosinófilos
(EPO), bradiquinina, adenosina, sustancia P, neuroquinina A,
factores de complemento (por ejemplo C3d) que incluyen fragmentos
de complemento; serotonina, radicales de oxígeno, basogranulina y
mastocitos y proteasas de basófilo que incluyen triptasa, quimasa,
carboxipeptidasa y catepsina.
18. Un método según la reivindicación 16, en
donde en donde la citoquina medida se selecciona del grupo que
consiste de interluquinas (IL-1 a
IL-27), factores de crecimiento hematopoyéticos,
factores estimuladores de colonias
granulocito-macrófago (por ejemplo
CM-CSF), interferones (IFN\alpha, IFN\beta,
IFN\gamma), TNF, linfotoxinas, miembros de la superfamilia
Inmunoglobiluna (molécula de adhesión intercelular-1
(ICAM-1), molécula de adhesión vascular celular
(VCAM-1), la familia TGF-beta y la
quimioquinas (IL-8, RANTES).
19. Un método según la reivindicación 16, en
donde la proteína citotóxica medida se selecciona del grupo que
consiste de proteína catiónica de eosinófilos (ECP), proteína básica
principal (MBP) y neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN).
20. Un método según la reivindicación 15, en
donde la molécula de superficie se selecciona del grupo que consiste
de receptores de superficie y moléculas de adhesión.
21. Un método según la reivindicación 20, en
donde la molécula de superficie se selecciona del grupo que consiste
de selectinas, integrinas, miembros de la superfamilia de
inmunoglobulinas (molécula de adhesión
intercelular-1 (ICAM-1), molécula
de adhesión a célula vascular-1
(VCAM-1)), antígeno de activación muy retardada
(VLA4), CD11B, CD11C, CD18, CD23, CD69, CD203C, CD31, CD162, CD162L
y basogranulina.
22. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 8-13, en donde la capacidad de
activación de las células efectoras se mide al medir la
proliferación de células T.
23. Un método según la reivindicación 1, en
donde la actividad inmunológica es el potencial para inducir
anafilaxia.
24. Un método según la reivindicación 23, en
donde el potencial para inducir anafilaxia se mide al medir el
nivel de marcador de anafilaxia en una célula efectora que se
selecciona del grupo que consiste de histamina, triptasa,
basogranulina, leucotrieno LTC4, CD63, CD69 y CD203C.
25. Un método según la reivindicación 23 ó 24,
en donde se mide el potencial para inducir anafilaxia en sangre
completa.
26. Un método según la reivindicación 25, en
donde la sangre completa utilizada para la medición ha sido extraída
de un sujeto en un máximo de cinco horas antes de la medición.
27. Un método según la reivindicación 25, en
donde la sangre completa utilizada para la medición se ha extraído
del sujeto un máximo de dos horas antes de la medición.
28. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 25-27, en donde la vacuna y la
sangre completa se mezclan en una proporción que corresponde a una
proporción calculada in vivo, la cual puede presentarse en un
sujeto como resultado de una administración accidental de una dosis
de vacuna en la corriente sanguínea de un sujeto.
29. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 25-28, en donde se utiliza sangre
completa ajustada a la temperatura corporal.
30. Un método según la reivindicación 23 ó 24
que comprende medir el potencial para inducir anafilaxia en células
efectoras aisladas de una muestra biológica.
31. Un método según la reivindicación 23 ó 24
que comprende medir el potencial para inducir anafilaxia en: 1)
células efectoras aisladas de una muestra biológica, 2) células
efectoras aisladas de una muestra biológica y cultivadas, o 3)
células efectoras aisladas de una muestra biológica, cultivadas y
modificadas.
32. Un método según la reivindicación 31, que
comprende medir el potencial para inducir anafilaxia en células
efectoras aisladas de una muestra biológica, cultivadas y
modificadas.
33. Un método según la reivindicación 32, en
donde las células efectoras modificadas son células modificadas
genéticamente o células transformadas malignas.
34. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 29 ó 30, en donde las células efectoras se
seleccionan del grupo que consiste de mastocitos, basófilos,
eosinófilos, células T, células B y células presentadoras de
antígeno (APC), y combinaciones de las mismas.
35. Un método según la reivindicación 1, en
donde la vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad
inmunológica de la mezcla de la fase líquida y la fase sólida
(medición 1).
36. Un método según la reivindicación 1, en
donde la vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad
inmunológica de antígeno en la fase líquida ante tratamiento de la
mezcla para desplazar el antígeno de la fase sólida (medición
4).
37. Un método según la reivindicación 1, la
vacuna se somete tanto a una medición de la actividad inmunológica
de la mezcla de la fase líquida y la fase sólida (medición 1) y a
una medición de la actividad inmunológica de antígeno en la fase
líquida (medición 2).
38. Un método según la reivindicación 1, en
donde la vacuna se somete tanto a una medición de la actividad
inmunológica de antígeno en la fase líquida (medición 2) como a una
medición de la actividad inmunológica de antígeno en la fase sólida
(medición 3).
39. Un método según la reivindicación 1, en
donde el tratamiento de desplazamiento comprende poner en contacto
la mezcla con un reactivo que contiene proteína o un anión.
40. Un método según la reivindicación 39, en
donde el reactivo que contiene proteína es un fluido corporal que
contiene proteínas.
41. Un método según la reivindicación 40, en
donde el fluido corporal es suero sanguíneo.
42. Método según la reivindicación 39, en donde
el anión es ión fosfato.
43. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde se mide la actividad
inmunológica de un producto intermedio que contiene antígeno
utilizado para preparar la vacuna, y en donde la evaluación de la
actividad inmunológica de la vacuna se basa en una comparación del
resultado de medición que se obtiene para el producto intermedio y
los resultados de medición obtenidos para una o más mediciones 1) -
5).
44. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la vacuna se somete a las
mediciones inmediatamente después de preparación.
45. Un método según la reivindicación 44, en
donde la vacuna se somete a las mediciones inmediatamente después
de la preparación y después de uno o más períodos de almacenamiento,
y en donde la evaluación de la actividad inmunológica de la vacuna
se basa entre la medición de resultados anterior y final.
46. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la evaluación de la actividad
inmunológica de la vacuna se basa en una comparación entre los
resultados de medición obtenidos para la vacuna y los resultados de
medición anteriores del mismo tipo de vacuna o de otro tipo de
vacuna, donde se utiliza el mismo tipo de medición de actividad
inmunológica para obtener los resultados de medición para la vacuna
y los resultados de medición anteriores.
47. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno proteico
molecular es un alergeno.
48. Un método según la reivindicación 47, en
donde el alergeno se selecciona del grupo que consiste de alergenos
de polen de árbol, alergenos de polen de pasto, alergenos de polen
de hierba, alergenos de ácaros, alergenos de veneno, alergenos de
pelo de animales y caspa y alergenos de alimentos.
49. Un método según la reivindicación 48, en
donde el alergeno es un alergeno de polen de pasto.
50. Un método según la reivindicación 48, en
donde el alergeno es un alergeno de ácaro del polvo.
51. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 47-50, en donde el alergeno es una
mezcla de por lo menos dos especies de alergeno diferentes.
52. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 47-51, en donde el alergeno está en
forma de un extracto, una alergeno purificado, un alergeno
modificado o un alergeno recombinante o un mutante de un alergeno
recombinante o cualquier combinación de los mismos.
53. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 47-52, en donde el alergeno está en
forma de un extracto.
54. Un método según la reivindicación 53, en
donde se mide la actividad inmunológica de dos o más alergenos
mayores o menores del extracto.
55. Un método según la reivindicación 54, en
donde se mide además la actividad inmunológica del extracto
completo.
56. Un método para preparar una preparación de
vacuna en forma de una mezcla de un antígeno proteico molecular y
un portador en fase sólida en la forma de hidróxido de aluminio, en
donde la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida a la
cual se une por lo menos una parte del antígeno, el método
comprende: i) mezclar el antígeno y el portador, ii) medir la
actividad inmunológica de la vacuna utilizando el método según
cualquiera de las reivindicaciones 1-54, y iii)
opcionalmente repetir las etapas i) y ii) hasta que se obtiene la
actividad inmunológica deseada.
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