ES2310846T3 - Procedimiento para separar fibronectina de fracciones de plasma. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la producción de una composición que contiene un factor de coagulación, que abarca lo siguiente: a) se ajusta el valor del pH de una fracción de plasma en un valor inferior a 5,4, con lo que se forma un precipitado, siendo la concentración iónica inferior a 500 mM, y: b) se separa el precipitado formado.
Description
Procedimiento para separar fibronectina de
fracciones de plasma.
La invención se refiere a un procedimiento para
la producción de una composición que contiene un factor de
coagulación, que abarca el empobrecimiento en fibronectina a partir
de fracciones de plasma que tienen baja intensidad iónica, mediante
desplazamiento del pH hacia un valor bajo, de manera que se
precipite fibronectina y la misma se separe de la solución.
La fibronectina consiste en dos cadenas de
polipéptidos (cadenas \alpha y \beta) con un peso molecular que
en cada caso es de aproximadamente 220 kDa. Su forma soluble se
presenta en el plasma y en otros fluidos corporales, mientras que
su forma insoluble puede encontrarse en la matriz extracelular y en
la capa inferior de membranas. Las concentraciones de fibronectina
en el plasma humano tienen un valor promedio de 270 \mug/ml.
Debido a su afinidad con las superficies de las células y con muchas
macromoléculas diversas, posee una pluralidad de funciones, por
ejemplo la adhesión entre células, la adhesión entre células y
substratos, la división celular, la cicatrización de las heridas, y
muchas otras. Su elevada afinidad con las superficies y su capacidad
de construir estructuras reticuladas conduce a problemas en el
fraccionamiento del plasma humano para obtener productos
terapéuticos. Pueden formarse fracciones de plasma cuyo elevado
contenido en fibronectina dificulta manifiestamente las
filtraciones, ultrafiltraciones y pasos de cromatografía para la
producción de un producto plasma de elevada pureza, por ejemplo un
concentrado en proteínas de coagulación. El problema se manifiesta
frecuentemente en forma de saturaciones prematuras, o según el caso
en forma de bloqueos en los filtros y en las columnas de
cromatografía. La ampliación de las superficies de filtración o de
los volúmenes de columna de cromatografía, empleada como
contramedida, está asociada a un evidente aumento de los costos de
producción.
Se han descrito diversos procedimientos para la
producción de fracciones de fibronectina aisladas:
Horowitz et al. (Transfusion 24,
357-362 (1984): Preparation of antihemophilic factor
and fibronectin from plasma cryoprecipitate) describen un
procedimiento en el que un extracto de crioprecipitado sirve de
material de partida. Después de una precipitación de hidróxido de
aluminio se incuba idealmente el sobrenadante soluble a 10ºC y con
un pH 6,5, con lo que la fibronectina se precipita, y se la separa
mediante centrifugación. A efectos de producir una preparación de
fibronectina de elevada pureza se liga la fibronectina nuevamente
disuelta en una columna de gelatina-sefarosa, y se
la eluye a pH 5,5 mediante tampón que contiene bromuro de
sodio.
Ingham et al. (Molecular Immunology 20,
287-295 (1983): Interaction of plasma fibronectin
with gelatin and complement C1q) proponen un estudio mediante el
que se demostró que debido a interacciones específicas la
fibronectina en presencia de gelatina puede hacerse precipitar de
manera selectiva con PEG (polietilenglicol) 4000 a partir de
soluciones. En este caso resultó que para una concentración de
gelatina de 0,4 mg/ml ya basta una concentración de PEG 4000 de 3%,
para ocasionar la precipitación de 50% de la fibronectina, mientras
que en ausencia de gelatina se necesita 11% para ello.
La Patente Europea 0011231 B1 propone un
procedimiento para precipitar globulina (fibronectina) insoluble en
frío mediante adición de 1,8 - 2,6 mol/l de aminoácidos,
preferentemente glicina, y de 8 - 12% (peso/volumen) de sal neutra
a temperaturas > 18ºC, y para separarla del sobrenadante.
La Patente de los EE.UU. Nº 4,406,886 describe
un método para la producción de un preparado de Factor VIII que
mediante la adición de sales de cinc, fibrinógeno y fibronectina se
precipita en forma de complejos de cinc, que se separan.
La USP Nº 4,278,594 propone un procedimiento
para la producción de una fracción de fibronectina purificada. En
este caso, con ayuda de heparina se precipita fibrinógeno y
fibronectina en una recolección de plasma. El precipitado se
disuelve, se aplica sobre una columna de
DEAE-celulosa y se eluye de manera selectiva
fibrinógeno y fibronectina.
En la Patente Europea EP Nº 0503991 B1, para la
producción de un preparado de factor de von Willebrand se combinan
dos pasos de cromatografía de intercambio de aniones con una
cromatografía de afinidad con gelatina. En este caso, la columna de
afinidad sirve en especial para la separación de fibronectina.
En la Patente de los EE.UU. Nº 5,981,254 se
describe un procedimiento para la producción de un producto trombina
que contiene un precipitado de fibrinógeno, fibronectina y Factor
XII. En este caso se logra una precipitación mediante la adición de
elevadas concentraciones de sal bajo valores de pH neutros. Como
alternativa se describe cómo lograr la precipitación mediante la
adición de sales ácidas, que conducen a un pH de valor reducido.
Este procedimiento conduce a una intensidad iónica relativamente
elevada, que es necesario reducir para pasos ulteriores del
proceso.
Los procedimientos descritos son relativamente
laboriosos, en especial si se los emplea exclusivamente para una
separación de la fibronectina a partir de la fracción útil.
Frecuentemente se llevan a cabo cromatografías de afinidad de
costos intensivos. Es más sencilla una precipitación que por cierto
suele lograrse mediante el añadido de por ejemplo polietilenglicol
o mediante elevadas concentraciones de sal. La adición de agentes
de precipitación y las elevadas concentraciones de sal elevan el
peligro que el producto deseado (por ejemplo, el Factor de von
Willebrand) se coprecipite en parte a partir del sobrenadante.
Un objetivo de la presente invención consiste en
poner a disposición un procedimiento sencillo para la separación de
fibronectina a partir de fracciones de plasma, de modo que se
facilite un procesamiento adicional para la purificación final de
la proteína deseada. De manera sorprendente se ha comprobado que
mediante una titulación sencilla, de manera de obtener un pH de
bajo valor es posible precipitar fibronectina. Fue especialmente
sorprendente que durante la agitación los filamentos de
fibronectina se enrollaban alrededor del agitador, y forman allí un
"coágulo", por lo que era muy fácil separarlos de la
solución.
Por ello la presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de una composición que contiene un
factor de coagulación, caracterizado porque:
- (I)
- se ajusta el valor del pH de una fracción de plasma a un valor inferior a 4,5, por lo que se forma un precipitado, siendo la intensidad iónica inferior a 500 mM, y
- (II)
- se separa el precipitado formado.
La expresión "fracción de plasma" se
refiere a una composición que se obtuvo a partir de plasma y que
contiene diversas proteínas de plasma. La fracción de plasma que se
aplica en el paso (i) como composición de partida, es una
composición líquida. Es preferible que la composición líquida sea
una solución o una suspensión; lo más preferible es que la
composición sea una solución.
En una forma de realización especial, la
fracción de plasma es un crioprecipitado disuelto. Este
crioprecipitado disuelto puede haber sido prepurificado mediante
diversos procedimientos. Son ejemplos el tratamiento con hidróxido
de aluminio, el tratamiento con solvente/detergente y/o la
cromatografía de intercambio de aniones.
La concentración de cloruro de sodio o de
cloruro de potasio en la fracción de plasma es preferentemente de
50 a 250 mM, más preferentemente de 100 a 200 mM, y en especial de
120 a 150 mM.
Después del paso (i) y antes del paso (ii), la
intensidad iónica de la fracción de plasma es preferentemente
inferior a 500 mM, más preferentemente inferior a 300 mM, y más
preferentemente aún, inferior a 200 mM. Es preferible que la
intensidad iónica no se eleve fuertemente debido al ajuste del valor
del pH en el paso (i), es decir, es preferible que se mantenga
inferior a 500 mM, más preferentemente inferior a 300 mM, y de
manera especialmente preferida, inferior a 200 mM.
La fracción de plasma puede contener por ejemplo
las siguientes sustancias tampón: iones citrato, iones acetato,
iones fosfato y/o aminoácidos.
Los aditivos aminoácidos se aplican
preferentemente en concentraciones que no conduzcan a una
precipitación de proteínas sin corrimiento del pH. Esto significa
por ejemplo para glicina, que su concentración sea inferior a 1,8
M, preferentemente inferior a 500 mM, más preferentemente inferior a
200 mM, y de manera especialmente preferida, inferior a 150 mM.
La concentración de fibronectina en la fracción
de plasma que se somete al paso (i), es por lo general de por lo
menos 0,05 g/l, preferentemente de por lo menos 0,1 g/l, más
preferentemente 0,25 g/l, y más preferentemente aún, de por lo
menos 0,5 g/l. La concentración de fibronectina en la fracción de
plasma puede ser por ejemplo de 0,1 a 5 g/l, preferentemente 0,1 a
2 g/l.
Conforme a la invención, en el procedimiento
reivindicado se ajusta el valor del pH a menos de pH 5,4. Con esto
se forma un precipitado que contiene fibronectina. Es preferible
ajustar el valor del pH a un valor inferior a pH 5,3, más
preferentemente aún, inferior a pH 5,2. Con ello el pH ajustado
tiene preferentemente un valor ajustado en un intervalo de pH 4,5 a
menos de pH 5,4, preferentemente en un intervalo de pH 4,7 a 5,3,
más preferentemente en un intervalo de pH 4,8 a 5,2, y en especial
en un intervalo de pH 4,9 a 5.1.
Por lo general se logra el ajuste del valor del
pH mediante la adición de un componente ácido. A título de
componentes ácidos pueden aplicarse diversos ácidos, por ejemplo
ácido clorhídrico, ácido fosfórico o ácido acético.
Los componentes ácidos se añaden usualmente a lo
largo de un intervalo de tiempo determinado, por ejemplo de a
gotas. Con ello se ajusta paso a paso un pH con un valor en un
intervalo arriba descrito más estrechamente ("titulado").
Durante y después del ajuste del valor del pH se
mantiene preferentemente la fracción de plasma bajo movimiento o
bajo un mezclado a fondo, por ejemplo por agitación. Además, se
prefiere que después del ajuste del pH se continúe con el mezclado
a fondo de la fracción de plasma durante un intervalo de tiempo
determinado (por ejemplo, mediante agitación), por lo general
durante por lo menos 10 minutos, preferentemente por lo menos 20
minutos, más preferentemente a lo largo de un intervalo de tiempo de
30 a 90 minutos. En este intervalo de tiempo se forman agregados
pegajosos que contienen una proporción considerable de fibronectina.
Por ello, conforme a una forma de realización preferida se ha
previsto la utilización de un dispositivo agitador adecuado, por
ejemplo un agitador de ancla o de paletas, a cuya hoja de agitación
se adhiere el precipitado. Con ello es fácil extraer de la solución
la fibronectina precipitada.
El procedimiento conforme a la invención puede
llevarse a cabo en un amplio espectro de temperaturas, por ejemplo
de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 37ºC. Los intervalos de
temperatura preferidos son de 4 a 35ºC, preferentemente de 10 a
30ºC; lo más preferible es que el procedimiento se lleve a cabo a de
20 a 25ºC.
La fracción de plasma aplicada para el
procedimiento conforme a la invención es preferentemente un
crioprecipitado disuelto que ha sido preparado mediante un
procedimiento de por si conocido por la persona con pericia en la
especialidad. De esta manera el crioprecipitado disuelto puede haber
sido previamente purificado mediante uno o varios de los pasos
siguientes: tratamiento con hidróxido de aluminio, tratamiento con
solvente/detergente y cromatografía de intercambio de aniones. La
ejecución de estos procedimientos es de por si conocida de la
persona con pericia en la técnica.
Gracias al procedimiento conforme a la invención
para la remoción de fibronectina a partir de fracciones de plasma,
es posible reducir en por lo menos un 50% la concentración de
fibronectina en la fracción de plasma. Es preferible que la
concentración de fibronectina en la fracción de plasma se reduzca en
un 70 a 99%, preferentemente de 80 a 99%, y más preferentemente
aún, en 90 a 98% o en 95 a 98%.
En una forma de realización especial, la pérdida
en proteína objetivo, por ejemplo en VWF, es a lo sumo de 50%,
preferentemente a lo sumo de 40%, más preferentemente a lo sumo 30%,
más preferentemente aún a lo sumo 20%, y de manera especialmente
preferida a lo sumo 10%.
Después de la separación del precipitado que
contiene fibronectina a partir de de la fracción de plasma, pueden
tener lugar otros pasos de purificación para la purificación final
de por lo menos un factor de coagulación. Es preferible que se
continúe con la purificación del factor de coagulación de von
Willebrand (VWF). En una forma de realización especial, después de
la precipitación por pH para la separación de fibronectina se lleva
a cabo una cromatografía de hidroxilapatita. La hidroxilapatita es
una forma de fosfato de calcio con la composición
Ca_{5}(PO_{4})_{3}OH o según el caso,
Ca_{10}(PO_{4})_{6}OH_{2}, que puede emplearse
como fase estacionaria para la cromatografía de proteínas, ácidos
nucleicos y otras macromoléculas. Además de la forma cristalina de
hidroxilapatita es también posible utilizar una forma cerámica
obtenible por sinterización. La hidroxilapatita puede comprarse por
ejemplo a la Firma Biorad (Munich, Alemania). Esta hidroxilapatita
cerámica se pone a disposición en dos formas (Tipo 1 y Tipo 2).
Debido a sus superficies más grandes el material de Tipo 1 tiene
una mayor capacidad de unión para moléculas más pequeñas, por
ejemplo proteínas pequeñas. En cambio, el material de Tipo 2
presenta poros más grandes en las partículas, lo que permite una
penetración y con ello una mejor unión de moléculas grandes, por
ejemplo ADN o partículas grandes. Es preferible que los materiales
presenten las siguientes propiedades:
La hidroxilapatita cristalina o cerámica puede
obtenerse sin restricciones. En el estado de la técnica se conocen
procedimientos para su producción.
En una primera variante la cromatografía con
hidroxilapatita abarca: (i) después de la separación del precipitado
de fibronectina sedimentado, poner en contacto la fracción de
plasma con una matriz de hidroxilapatita, de manera que el
fibrinógeno y/o la fibronectina queden ligados a la matriz de
hidroxilapatita, mientras que en lo esencial el VWF no se liga a la
matriz de hidroxilapatita, y eventualmente a continuación; (ii) se
separa el VWF (Factor de von Willebrand) no ligado, de la matriz de
hidroxilapatita. En la presente solicitud esta variante recibe la
denominación de "cromatografía pasante", por cuanto el VWF no
se liga a la matriz de hidroxilapatita. El procedimiento puede
llevarse a cabo en forma de una cromatografía de columna o en el
procedimiento de a partidas; se prefiere la realización de una
cromatografía de columna. En el caso de una cromatografía de columna
el VWF se encuentra en el material pasante, y por lo menos una
proteína que constituye una impureza, por ejemplo fibronectina y/o
fibrinógeno, se liga a la hidroxilapatita.
Conforme a esta primera variante se lleva a cabo
la cromatografía de hidroxilapatita con un pH de valor 6,5 a 8,5,
preferentemente 6,8 a 8,5, más preferentemente 6,8 a 7,5, más
preferentemente aún 7,0 a 7,5. Lo usual es que el tampón de pasada,
el tampón de lavado y el tampón de elución, así como la solución de
proteína a aplicarse, tengan el mismo valor de pH. Sin embargo,
también hay variantes practicables, en las que estas soluciones
presentan pHs de distintos valores. La composición que es puesta en
contacto con la matriz de hidroxilapatita, contiene preferentemente
fosfato de sodio y/o fosfato de potasio. La concentración total de
fosfato de sodio y/o fosfato de potasio en la solución es de por
ejemplo 0 a 100 mM, preferentemente 0 a 50 mM, más preferentemente
20 a 40 mM; es decir, como tampón de pasada puede emplearse una
solución tampón con las concentraciones mencionadas. La composición
se aplica con una baja concentración de sal de 0 - 100 mM de fosfato
de potasio o de sodio, preferentemente 10 - 50 mM, con un pH de
aproximadamente 6,8 a 8,5, de manera especialmente preferida con un
pH de 7,0 - 7,5, sobre una columna de hidroxilapatita. En esta
variante la hidroxilapatita es preferentemente hidroxilapatita
cerámica, de manera especialmente preferida de Tipo 1, como el
vendido por Biorad (Munich, Alemania). Bajo estas condiciones la
mayor parte de la molécula de VWF no se liga a la matriz, y se
encuentra en el material pasante, mientras que las proteínas que
constituyen impurezas, como por ejemplo fibrinógeno o fibronectina,
se ligan en su mayor parte a la matriz.
Gracias a la cromatografía pasante es posible
obtener preparaciones que sólo contienen pequeñas cantidades de
fibrinógeno y fibronectina. Por lo general la concentración de
antígeno fibronectina presente en la fracción de pasada es inferior
a 25 \mug/ml, preferentemente inferior a 15 \mum/ml, más
preferentemente inferior a 10 \mug/ml, y de manera especialmente
preferida es a lo sumo de 5 \mug/ml. La concentración de antígeno
fibronectina presente en la fracción de pasada es usualmente
inferior a 250 \mug/ml, preferentemente inferior a 150 \mug/ml,
más preferentemente inferior a 100 \mug/ml, y de manera
especialmente preferida es a lo sumo de 50 \mug/ml. La
concentración de antígeno fibrinógeno y de antígeno fibronectina,
también puede determinarse mediante procedimientos de por si
conocidos, por ejemplo como se describe en los ejemplos de la
presente solicitud.
La concentración de fibrinógeno en la fracción
de pasada es preferentemente menor del 10%, preferentemente menor
del 5%, más preferiblemente menor del 2,5% de la concentración de
fibrinógeno en la solución de aplicación (antes de la cromatografía
pasante). La concentración de fibronectina en la fracción de pasada
es preferentemente menor del 10%, más preferentemente menor del 5%,
más preferentemente aún menor del 2,5%, de la concentración de la
fibronectina en la solución de aplicación (antes de la cromatografía
pasante). La cromatografía pasante es especialmente adecuada para
la purificación final de VWF. Por lo tanto, el rendimiento en VWF de
la cromatografía pasante (referido al equilibrio de masas) es por
lo general superior al 50%, preferentemente superior al 60%, más
preferentemente aún, superior al 75%. La actividad específica
(actividad del cofactor ristocetina por mg de proteína total) puede
elevarse mediante la cromatografía pasante en por lo menos 100%,
preferentemente por lo menos 150%, más preferentemente aún, en por
lo menos 200%.
En el caso de una purificación final de VWF es
especialmente ventajosa una segunda variante de la cromatografía de
hidroxilapatita. En esta segunda variante, el VWF se liga a la
matriz de hidroxilapatita y seguidamente se eluye. En la presente
solicitud esta variante lleva la denominación "cromatografía
ligante". La cromatografía ligante abarca usualmente lo
siguiente:
- (a)
- se liga el VWF a la matriz de hidroxilapatita;
- (b)
- se extraen las impurezas por lavado y con bajas concentración de sal; y
- (c)
- seguidamente se eluye la fracción útil que contiene VWF, bajo concentraciones de sal más elevadas.
En el paso (a) una solución que contiene VWF y
una o varias proteínas que constituyen impurezas, es puesta en
contacto con la matriz de hidroxilapatita. La concentración total de
fosfato de sodio y/o de fosfato de potasio en esta solución es
usualmente 0 a 200 mM, preferentemente 1 a 200 mM, más
preferentemente 1 a 50 mM, y más preferentemente aún, 10 a 30
mM.
En el paso de lavado (b) se lava la matriz de
hidroxilapatita con un tampón que tiene una baja concentración de
sales. En este tampón de lavado, la concentración total de fosfato
de sodio y/o de fosfato de potasio es por lo general de 100 a 300
mM, preferentemente 150 a 250 mM, más preferentemente aún 180 a 240
mM.
En el paso (c) puede eluirse la fracción útil
que contiene VWF, con un tampón que tiene una mayor concentración
de sales. Por lo general, el tampón de elución contiene 200 a 500
mM, preferentemente 250 a 400 mM de fosfato de sodio y/o
potasio.
Es posible modificar el rendimiento y la pureza
mediante el corrimiento de las concentraciones de sal. Cuanto mayor
sea la concentración de sal en el tampón de lavado, tanto más limpia
será la fracción útil obtenida. Sin embargo, con ello se disminuye
el rendimiento en VWF. Además, el valor elegido para el pH influye
sobre la concentración óptima de sal para el tampón de lavado.
Cuanto más baja sea el valor de pH, tanto más fuerte será la unión
o ligazón de VWF a la matriz de hidroxilapatita. De manera
correspondiente las concentraciones de sal elegidas con bajos
valores de pH pueden ser más elevadas, y en cambio pueden ser más
bajas para valores de pH más elevados. La cromatografía (ligante)
de hidroxilapatita se lleva a cabo bajo un pH 5 a 7,5,
preferentemente 5,5 a 6,8, más preferentemente de 6,0 a 6,5. Lo
usual es que el tampón de pasada, de lavado y de elución, así como
la solución de proteínas a ser aplicada, tengan el mismo valor de
pH. Sin embargo, también hay variantes practicables en las que
estas soluciones muestran pHs de distintos valores.
En esta segunda variante se aplica la solución
que contiene VWF, por ejemplo la fracción de plasma después de la
precipitación por pH y separación del precipitado de fibronectina,
con una baja concentración de sales, preferentemente 0 - 100 mM de
fosfato de potasio o de sodio, de manera especialmente preferida 10
- 30 mM, con un pH de valor 5,5 - 6,8, preferentemente 6,0 - 6,5,
sobre una columna de hidroxilapatita, por ejemplo hidroxilapatita
cerámica de Tipo 2. La mayor parte de la molécula de VWF se liga
bajo estas condiciones. Mediante lavado con una solución con
mayores concentraciones de sal con por ejemplo fosfato de potasio o
de sodio, por ejemplo 230 mM de fosfato de sodio pH 6,0, es posible
retirar por lavado las impurezas, por ejemplo fibronectina.
Seguidamente se eluye la fracción útil con concentraciones de sal
muy concentradas, por ejemplo soluciones de fosfato, como por
ejemplo 400 mM de fosfato de sodio pH 6,0.
Gracias a la cromatografía ligante es posible
obtener preparaciones de VWF que desde el punto de vista práctico
ya no contienen cantidades detectables en fibrinógeno y
fibronectina. Si la solución de aplicación, que es puesta en
contacto con la matriz de hidroxilapatita, es una fracción de plasma
y/o contiene fibrinógeno o fibronectina, es posible lograr una
remoción cuantitativa de las proteínas fibrinógeno y fibronectina
(que constituyen impurezas) de la solución. Por ello la
concentración de fibrinógeno en la fracción de elución es
preferentemente inferior al 25% de la concentración de fibrinógeno
en la solución de aplicación (antes de la cromatografía ligante).
La concentración de fibronectina en la fracción de elución es
preferentemente inferior a 10%, más preferentemente inferior al 5%
de la concentración de fibronectina en la solución de aplicación
(antes de la cromatografía ligante). Las concentraciones de
fibrinógeno o según el caso de fibronectina, en la fracción de
elución (fracción útil) se encuentran por lo general por debajo del
limite de detección de aproximadamente 1 \mug/ml.
Mediante la cromatografía ligante de
hidroxilapatita pueden obtenerse preparaciones de VWF de elevada
actividad específica. La actividad específica en la fracción de
elución puede ser superior a 50 E/mg de proteína; es
preferentemente superior a 75 E/mg de proteína, más preferentemente
superior a 85 E/mg, y más preferentemente aún, es de por lo menos
100 E/mg de proteína. La actividad de VWF se determina mediante el
ensayo del cofactor ristocina, que determina la capacidad de
ligazón de VWF al receptor de plaquetas glicoproteína Ib/IX bajo la
influencia del antibiótico ristocetina. La actividad específica de
VWF puede determinarse como se describe en los ejemplos.
Para la producción de un preparado de VWF
especialmente puro es posible combinar ambos procedimientos
descritos de la cromatografía de hidroxilapatita, entre si o con
otras técnicas de purificación. Específicamente, ha demostrado ser
especialmente adecuado llevar a cabo inmediatamente después del
proceso arriba descrito, una cromatografía pasante con
hidroxilapatita para el empobrecimiento de la concentración de las
principales impurezas. Seguidamente se titula la fracción útil por
ejemplo con HCl 1M hasta pH = 6,0. Como se describe para la
cromatografía ligante, la muestra se aplica sobre una columna de
hidroxilapatita. Las moléculas de VWF se ligan y se eluyen
selectivamente. Por ello, en una tercera variante de la
cromatografía de hidroxilapatita se lleva seguidamente a cabo una
cromatografía pasante con hidroxilapatita, en la que el VWF no se
liga a la hidroxilapatita, y seguidamente se efectúa una nueva
cromatografía pasante bajo condiciones ligantes, y se eluye la
fracción de VWF. Para la cromatografía pasante es conveniente, si
bien no indispensable, utilizar iones fosfato como sustancia
tampón. En el caso de la cromatografía ligante, para la elución de
VWF, el fosfato es un agente específico.
Es posible combinar entre si las formas de
realización descritas en esta solicitud.
Las soluciones, que pueden ser liberadas de
fibronectina mediante los procedimientos aquí descritos, son
fracciones de plasma, a partir de las cuales pueden obtenerse otros
componentes por purificación final. Puede tratarse de fracciones de
plasma a partir de los cuales se obtienen por ejemplo preparados de
coagulación como el factor de von Willebrand. Las fracciones de
plasma que pueden ser objeto de una elaboración final con este
procedimiento, contienen fibronectina como impureza principal, que
se encuentra presente en concentraciones > 0,1 g/l. La solución
se titula mediante adición de un componente ácido, por ejemplo ácido
clorhídrico 1 M, hasta un pH de valor < 5,4, preferentemente 5,4
a 4,8, de manera especialmente preferida, 5,2 a 5,0. Se somete la
solución a incubación bajo agitación durante > 10 minutos,
preferentemente durante 30 a 90 minutos. Se forman agregados
pegajosos que en el caso de utilizarse un dispositivo agitador
adecuado, por ejemplo un dispositivo agitador de ancla o de paleta,
se adhieren a la hoja de agitación y pueden ser retirados de esta
manera de la solución. Esto tiene la ventaja que una mayor parte
del precipitado no ha de removerse de manera laboriosa y costosa
mediante filtración o centrifugación. La intensidad iónica influye
sobre la efectividad de la formación de los filamentos. Se lograron
buenos resultados por ejemplo con soluciones tampón que contenían
NaCl 100 - 200 mM, preferentemente NaCl 120 - 150 mM. El
procedimiento puede llevarse a cabo en un amplio espectro de
temperaturas de por ejemplo 4ºC a 35ºC. Se prefiere llevar a cabo el
procedimiento a temperatura ambiente. La efectividad del
empobrecimiento de la fibronectina depende de la composición de la
solución, y se encuentra típicamente entre 70% y 95%.
Los ejemplos de realización siguientes explican
la invención con mayor detenimiento.
Ejemplo
1
Como material de partida se utilizó una solución
de crioprecipitado que había sido prepurificada mediante
precipitación de hidróxido de aluminio, tratamiento con Polysorbat
80/TNBP y cromatografía de intercambio de iones, como se describe
por ejemplo en el documento WO 9315105 A1. Para la aislación del
Factor de von Willebrand (VWF) fue preciso remover en primer
término fibronectina indeseable. Como componentes principales la
solución contenía
0,18 g/l de antígeno VWF (VWG-Ag), 0,05 g/l de antígeno fibrinógeno y 1,49 g/l de antígeno fibronectina. La solución contenía las siguientes sustancias tampón: citrato 10 mM, NaCl 160 mM, glicina 120 mM, CaCl_{2} 1 mM. Se tituló en cada caso 1 l de la solución a 4ºC, 20ºC o según el caso a 35ºC bajo agitación mediante adición de HCl 1M a pH 5,2. Durante la incubación durante 60 minutos se enrollaron en la totalidad de los tres casos filamentos de fibronectina blancos alrededor del dispositivo de agitación, y formaron un coágulo masivo. La solución remanente pudo ser filtrada sin problema mediante un filtro de membrana, y se obtuvo un líquido transparente.
0,18 g/l de antígeno VWF (VWG-Ag), 0,05 g/l de antígeno fibrinógeno y 1,49 g/l de antígeno fibronectina. La solución contenía las siguientes sustancias tampón: citrato 10 mM, NaCl 160 mM, glicina 120 mM, CaCl_{2} 1 mM. Se tituló en cada caso 1 l de la solución a 4ºC, 20ºC o según el caso a 35ºC bajo agitación mediante adición de HCl 1M a pH 5,2. Durante la incubación durante 60 minutos se enrollaron en la totalidad de los tres casos filamentos de fibronectina blancos alrededor del dispositivo de agitación, y formaron un coágulo masivo. La solución remanente pudo ser filtrada sin problema mediante un filtro de membrana, y se obtuvo un líquido transparente.
Se comprobó que en el intervalo de temperaturas
de 4ºC a 35ºC es muy adecuada una precipitación de corrimiento de
pH para separar fibronectina en grandes cantidades. En este caso, la
pérdida en proteína objetivo VWF era a lo sumo 22% (4ºC) junto con
un empobrecimiento en fibronectina de por lo menos 93% a 97%.
La concentración de antígeno VWF se determinó
con ayuda del STA ® Compact de la Firma Diagnostica Stago (Roche
Diagnostics, Mannheim) y de los reactivos de ensayo (STA LIA
vWF).
Para la determinación de la cantidad en antígeno
fibrinógeno y de antígeno fibronectina se utilizaron métodos
nefelométricos para la determinación cuantitativa de la
concentración de antígeno fibrinógeno y del antígeno fibronectina
en el Beckman-Array ® 360 (Beckman Coulter,
Monheim).
Ejemplo
2
Se utilizó una solución de proteína que había
sido prepurificada como en el Ejemplo 1 y que se encontraba en el
mismo sistema tampón. Se titularon 40 l de esta solución a
temperatura ambiente a pH 5,2, y se sometió a incubación durante 60
minutos bajo agitación. Los agregados de fibronectina se separaron
de la solución en su mayor parte por su adhesión a la hoja de
agitación del dispositivo agitador. Después de filtración hasta
transparencia sobre un filtro de membrana, pudo continuarse con la
elaboración de manera de obtener un preparado de VWF.
Con una pérdida de tan solamente 5% en la
proteína objetivo VWF fue posible separar el 90% de la
fibronectina.
A título complementario se mencionan las
siguientes referencias bibliográficas relacionadas con diversos
métodos analíticos:
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Meyer D (1998): Laboratory diagnosis of von Willebrand
disease. Int J Lab Res 28 (4): 201-210.
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methods in patients receiving streptokinase therapy. Clin
hem.: 36(4):698-699.
Claims (16)
1. Procedimiento para la producción de una
composición que contiene un factor de coagulación, que abarca lo
siguiente:
a) se ajusta el valor del pH de una fracción de
plasma en un valor inferior a 5,4, con lo que se forma un
precipitado, siendo la concentración iónica inferior a 500 mM,
y:
b) se separa el precipitado formado.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque se ajusta el valor del pH de la fracción
de plasma en un valor entre pH 4,7 y pH 5,3.
3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1
ó 2, caracterizado porque la intensidad iónica es inferior
a
300 mM.
300 mM.
4. Procedimiento conforme a la reivindicación 1
a 3, caracterizado porque la intensidad iónica es inferior
a
300 mM.
300 mM.
5. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque después del
ajuste del valor del pH en el paso (i) se efectúa una agitación
durante por lo menos 10 minutos.
6. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la separación de
la mayor parte de la fibronectina precipitada tiene lugar mediante
la paleta de agitación de un agitador.
7. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la concentración
de fibronectina en la fracción de plasma antes del paso (i) es de
por lo menos 0,1 g por litro.
8. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la concentración
de NaCl o de KCl en la fracción de plasma es de 100 a 200 mM.
9. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la solución de
partida contiene glicina en una concentración inferior a 500
mM.
10. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la solución de
partida contiene glicina en una concentración inferior a 200
mM.
11. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la solución de
partida contiene glicina en una concentración de 50 a 200 mM.
12. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la solución de
partida contiene glicina en una concentración de 100 a 150 mM.
13. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la fracción de
plasma es un crioprecipitado disuelto.
14. Procedimiento conforme a la reivindicación
13, caracterizado porque el crioprecipitado disuelto ha sido
prepurificado por tratamiento con hidróxido de aluminio, tratamiento
con solvente/detergente y cromatografía de intercambio de
aniones.
15. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque después del
paso (ii) se efectúa la purificación final de por lo menos un
factor de coagulación.
16. Procedimiento conforme a la reivindicación
15, caracterizado porque el factor de coagulación es el
factor de von Willebrand.
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