ES2311220T3 - Uso de trioxopirimidina para el tratamiento y prevision de enfermedades inflamatorias bronquiales. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto de trioxopirimidina que tiene una alta actividad inhibitoria contra MMP-1, MMP-2, MMP- 3, MMP-9 y MMP-14, definido como a) un valor de IC50 de menos de 5 µM para MMP-2, MMP-9, y MMP-14, cada una; b) un factor de relación de más de 100 para los valores de IC 50 de MMP-1 : MMP-2, MMP-1 : MMP-9, MMP-1 : MMP-14, y c) un factor de relación de más de 10 para los valores de IC 50 de MMP-3 : MMP-2, MMP-3 : MMP-9, MMP-3 : MMP-14, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades inflamatorias bronquiales, en un huésped mamífero, en necesidad de tal tipo de tratamiento, caracterizado por el hecho de que, el citado compuesto de trioxopirimidina, se selecciona de entre el grupo consistente en: 5-bifenil-4-il-5-[4-(4-nitro-fenil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2,4,6-triona 5-(4-fenoxi-fenil)-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il]-pirimidin-2,4,6-triona 5-[4-(4-cloro-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona 5-[4-(3,4-dicloro-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona 5-[4-(4-bromo-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona.

Description

Uso de trioxopirimidina para el tratamiento y previsión de enfermedades inflamatorias bronquiales.

La presente invención, se refiere al uso de un compuesto de trioxopirimidina para el tratamiento y previsión de enfermedades inflamatorias bronquiales.

Introducción

Las metaloproteasas de matriz (MMPs), son una familia de proteasas zinc- y calcio-dependientes, las cuales son capaces de degradar la matriz extracelular (ECM), y la membrana vítrea (Egeblad, M., y Werb, Z., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 161 - 174; Overall, C.M., y Lopez-Otin, C., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 557 - 672). Se cree que, éstas, tienen roles interpretativos fundamentales, en el desarrollo y crecimiento embriónico (Holmbeck, K., et al., Cell 99 (1999) 81 - 92; Vu. T.H. et al., Cell 93 (1998), 411 - 422), así como también en la remodelación y la reparación del tejido (Shapiro, S.D., Curr. Opin. Cell Biol. 10 (1998) 602 - 608; Lund, L.R., et al., EMBO J. 18 (1999) 4645 - 4656). La expresión excesiva o inapropiada de MMPs, puede por lo tanto contribuir a la patogénesis de muchos procesos destructivos de los tejidos, incluyendo la progresión tumoral (Egeblad, M., y Werb, Z., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 161 - 174; Overall, C.M. y Lopez-Otin, C., Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 657 - 672) y la formación de aneurismas (Carmeliet, P., et al., Nat. Gent. 17 (1997) 439 - 444). Los efectos de las MMP, están lejos de encontrarse restringidos a la degradación de la BCM (Chang, C., y Werb, D., Trenes Cell Biol. 11 (2001) S37 - 43). Los factores de crecimiento de los péptidos que se secuestran mediante las proteínas de ECM, se convierten en disponibles, una vez que se han degradado mediante MMP-9 (Manes, S., et al, J. Biol. Chem. 274 (1999) 6935 - 6945). Las MMPs, pueden incrementar la biodisponibilidad de los VEGF (Bergers, G. et al., Nat. Cell Biol. 2 (2000) 737 - 744), pero también generan inhibidores de angiogénesis, tal como angiostatina, mediante la segmentación de plasminógeno (Dong, Z., et al. Cell 88 (1997) 801 - 810).

La inhibición de MMPS, bien ya sea mediante inhibidores de tejidos de metaloproteasas (TIMPs) de origen natural, o bien ya sea con inhibidores de bajo peso molecular, tiene como resultado unos efectos anti-tumorales y anti-metastásicos, en modelos animales (Brown, P.D., Med. Oncol. 14 (1997) 1 - 10). La mayoría de los inhibidores de bajo peso molecular, de MMPs, se derivan de la clase de compuesto del ácido hidroxámico, e inhiben las MMPs, de una forma muy amplia, siendo no selectivos para MMP-2 y MMP-9, la MMPs clave, en la invasión del tumor, extensión metastásica, y angiogénesis. No obstante, las moléculas inhibidoras de MMPs procedentes de otra clase estructural, las trioxopiramidinas, se han descrito, por ejemplo, en los publicaciones de patentes internacionales WO 97/23 465 y WO 01/25 217. Esta clase de compuestos, es extremamente potente, y altamente selectivo, con una especificidad casi exclusiva para MMP-2, MMP-9, al mismo tiempo que escatiman la mayor parte de otros miembros de la familia de proteasas MMP.

Varios inhibidores de MMP, predominantemente, de la clase de la substancia del ácido hidroxámico, con una amplia especificidad del substrato, se encontraban, y en parte, todavía se encuentran, en tests de ensayos clínicos para tratamientos antitumorales. La totalidad de los resultados clínicos publicados con estos inhibidores, eran decepcionantes, mostrando poca eficacia clínica, o ninguna eficacia clínica (Fletcher, L, Nat. Biotechnol. 18 (2000) 1139 - 1139). La razón para esta falta de eficacia, desde el punto de vista clínico más razonable, reside en el hecho de que, los pacientes, no pudieron ser administrados con dosis lo suficientemente altas para la actividad anti-tumoral o anti-metastásica, debido a los efectos secundarios asociados con estos inhibidores de amplia actuación. Estos efectos laterales limitativos de la dosis, eran, de una forma predominante, artralgias y mialgias (Drummond, A.H. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 878 (1999) 228 - 235). Como una posible forma de salvar este problema, se procedió a evaluar la combinación de inhibidores de MMP con compuestos clásicos citostáticos/citotóxicos, en estudios animales. De hecho, en estos experimentos, los inhibidores de MMP, en combinación con fármacos citostáticos/citotóxicos, mostraron una eficacia inhibitoria tumoral mejorada (Giavazzi, R., et al, Clin. Cancer Res. 4 (1998) 985 - 992). Adicionalmente, además, la solicitud de patente internacional PCT/EP02/04 744, muestra la combinación de inhibidores de gelatinasa a base de trioxopiramida y compuestos citotóxicos/citostáticos, tales como la cisplatina, Paclitaxel, Gemcitambina o Etoposida.

Se han realizado una gran cantidad de intentos, para identificar compuestos que previenen o inhiben las enfermedades inflamatorias bronquiales. Los glucocorti-costeroides sintéticos inhalados, se vienen utilizando ampliamente, en el tratamiento del asma bronquial, en donde, éstos, proporcionan un tratamiento de primera línea muy efectivo. No obstante, una amplia gama de efectos secundarios no deseados y los a menudo complejos programas de dosificación asociados con estos fármacos, tienen como resultado, de una forma frecuente, una poca o pobre aceptación por parte del paciente. El loteprednol etabonato, un esteroide blando de metabolito inactivo, está siendo examinado en ensayos clínicos, en cuento a sus efectos en la inflamación de las vías aéreas o respiratorias (Azelenyi, I., et al., Drugs Today 36 (2000) 313 - 320). La ciclesonida, un asteroide blando pro-fármaco, ha demostrado su eficacia, sin efectos secundarios, en una formulación diaria de una vez, en pacientes con asma, y se está desarrollando para el tratamiento de ambos tipos de enfermedades, el asma, y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Rohatagi, S., et al., J. Clin. Pharmacol. 43 (2003) 365 - 378).

Así, por lo tanto, existe una necesidad en cuanto al hecho de poder disponer de substancias que pueden ser utilizadas para el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias bronquiales.

Descripción de la invención

Se encontró, de una forma sorprendente, el hecho de que, los inhibidores de MMP a base de trioxopirimidina, los cuales son altamente selectivos para MMP-2, MMP-9 y MMP14, son de utilidad, para el tratamiento o prevención de enfermedades inflamatorias bronquiales.

La invención, proporciona adicionalmente el uso de un compuesto de trioxopirimidina que tiene una alta actividad inhibitoria contra MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 y MMP-14, definido como

a) un valor de IC_{50} de menos de 5 \muM para MMP-2, MMP-9, y MMP-14, cada una;

b) un factor de relación de más de 100 para los valores de IC_{50} de MMP-1 : MMP-2, MMP-1 : MMP-9, MMP-1 : MMP-14, y

c) un factor de relación de más de 10 para los valores de IC_{50} de MMP-3 : MMP-2, MMP-3 : MMP-9, MMP-3 : MMP-14,

para el tratamiento o la prevención de enfermedades inflamatorias bronquiales, en un huésped mamífero, en necesidad de tal tipo de tratamiento.

Los valores de IC_{50}, se miden, mediante un ensayo in vitro, para la actividad enzimática de MMP. Tal tipo de ensayo, se describe por parte de Stack, M.S., y Gray, R.D, J. Biol. Chem. 264 (1989), 4277 - 4281. Este ensayo, se basa en la determinación de la actividad enzimática de MMP, en un substrato de dinitrofenol, y la medición de la fluorescencia del substrato, después de la segmentación mediante MMPs.

La invención, proporciona adicionalmente el uso de compuestos de trioxopirimidina, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias bronquiales, en un paciente que sufre de tal tipo de enfermedad.

Las metaloproteinasas de matriz, son bien conocidas en el arte especializado de la técnica, y se definen, por ejemplo, mediante su número de EC (MMP-1 EC 3.4.24.7; MMP-2 EC 3.4.24.24; MMP-3 EC 3.4.24.17; MMP-9 EC 3.4.24.35; MMP-14 EC 3,4,24).

Las trioxopirimidinas de utilidad para la invención, son compuestos de una clase estructural bien conocida. Tales tipos de compuestos, se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses US nº 6.242.455 y US nº 6.110.924; y en los documentos de patente internacional WO 97/23 465, WO 98/58 915, WO 01/25 217, y en la publicación de Grams F., et al., Biol. Chem. 283 (2001) 1277 - 1285, y son efectivos y altamente selectivos para MMP-2, MMP-9, y MMP-14.

Los compuestos a ser utilizados en concordancia con la presente invención, son:

5-bifenil-4-il-5-[4-(4-nitro-fenil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2,4,6-triona

(Compuesto I)

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5-(4-fenoxi-fenil)-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il]-pirimidin-2,4,6-triona

(Compuesto II)

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5-[4-(4-cloro-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona

(Compuesto III)

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5-[4-(3,4-dicloro-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona

(Compuesto IV)

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5-[4-(4-bromo-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona

(Compuesto V).

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En concordancia con la invención, los inhibidores a base de trioxopirimidina, deben administrarse al paciente que sufre de tal tipo de enfermedad, durante un transcurso de tiempo de varias semanas o de años (especialmente, en el caso de prevención), al paciente que necesita tal tipo de terapia. Los compuestos de trioxopirimidina, se administran, de una forma preferible, como proyecciones pulverizadas (sprays), con dosis no tóxicas correspondientes a concentraciones que se encuentran comprendidas entre las concentraciones micromolares y las concentraciones nanomolares.

La invención, se refiere al uso para el tratamiento de enfermedades bronquiales, de una forma preferible, asma y enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD), en un mamífero huésped en necesidad de tal tipo de tratamiento, por ejemplo, un paciente que sufre de tal tipo de enfermedad, mediante la aplicación de un compuesto de trioxopirimidina en concordancia con la invención, a un paciente, en una cantidad farmacéuticamente efectiva. El asma, es una enfermedad inflamatoria de árbol bronquial, relacionada, o no, a una exposición con alergenos. Esta inflamación, provoca síntomas, en pacientes, mediante la estimulación de los músculos lisos bronquiales, para que se contraigan, intensificando la secreción de moco, e induciendo cambios morfológicos bronquiales, los cuales se cree que son un factor agravante con respecto al curso de la enfermedad. La hipersensibilidad de las vías respiratorias, es un signo o marca de la enfermedad, y ésta es responsable para la mayoría de los síntomas. El árbol bronquial, es un tejido muy complejo, con muchos tipos de células (células epiteliales, células del músculo liso, células inflamatorias, nervios, células productoras de moco, fibroblastos, y por el estilo), y los acontecimientos reorganizantes bronquiales, los cuales comprenden muchos aspectos consistentes, principalmente, en una deposición de componentes de matriz extracelulares, en las paredes bronquiales, y una hiperplasia de las células que producen moco. El uso de compuestos de trioxopirimidina en concordancia con la presente invención, inhibe el influjo de las células inflamatorias, en los compartimientos del lavado broncoalveolar y tejido periférico, e inhibe la hipersensibilidad definida como una respuesta anormal a los agentes estimulantes, tales como la metacolina. La enfermedad y los tratamientos actuales, se revisan, por ejemplo, en GINA Workshop Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention (NIH Publication No. 02 - 2659), - Reporte de trabajo de GINA, Estrategia global para el control y la prevención del asma (Nº de publicación NHI : nº 02 - 3659), y Fabbri, L.M. y Hurd, S.S., Eur. Respir. J. 22
(2003) 1 - 2.

La invención, por lo tanto, se refiere adicionalmente al uso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en un paciente que sufre de tal tipo de enfermedad, utilizando un compuesto de trioxopirimidina en concordancia con la invención, en una cantidad terapéuticamente efectiva.

La invención, se refiere adicionalmente al uso para el tratamiento de enfisema, en un paciente que sufre de tal tipo de enfermedad, utilizando compuestos de trioxopirimidina en concordancia con la invención. En tal tipo de enfermedad, las paredes alveolares, se destruyen mediante procesos proteolíticos y, esta destrucción, perjudica la transferencia de oxígeno a la sangre. Los problemas fisiológicos, acontecen, también, debido a la hiperinflamación derivada, la cual provoca anomalías en la ventilación, provocando una disfunción de los músculos respiratorios, y debido a una hipertensión en las arterias pulmonares, conduciendo a un fallo cardíaco, en casos avanzados.

En concordancia con la invención, el compuesto de trioxopirimidina, debe administrarse durante un transcurso de tiempo de varios meses, o años, al paciente que se encuentra en necesidad de tal tipo de terapia. Los compuestos de trioxopirimidina, se administran, de una forma preferible, mediante la aerosolación de una formulación líquida o en polvo, con dosis no tóxicas, las cuales correspondan a una gama de concentraciones comprendida dentro de unos márgenes que van desde las concentraciones micromolares, a las concentraciones nanomolares, por kg y
día.

La dosificación exacta de los inhibidores de MMP, variarán, pero puede determinarse fácilmente. De una forma general, la dosificación diaria preferida de los inhibidores, será la correspondiente a unas dosificaciones comprendidas dentro de unos márgenes situados entre 1 \mumol/kg y día y 100 mmol/kg y día.

Las composiciones farmacéuticas, son composiciones acuosas que tienen una compatibilidad fisiológica. Las composiciones, incluyen, adicionalmente, a las substancias auxiliares, tampones, conservantes, disolventes y/o agentes moduladores de la viscosidad. Los sistemas tampón apropiados, se basan en fosfato sódico, acetato sódico o borato sódico. Los conservantes, se requieren para prevenir la contaminación microbiana de la composición farmacéutica, durante su uso. Los conservantes apropiados son, por ejemplo, cloruro de benzalconio, clorobutanol, metilparabeno, propilparabeno, feniletilalcohol, ácido sórbico. Tales tipos de conservantes, se utilizan, de una forma típica, en una cantidad correspondiente a un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 0,01 a un 1% peso/volumen.

Las substancias auxiliares y formulaciones farmacéuticas apropiadas, se describen en Remington's Phamaceutical Sciences (Ciencias Farmacéuticas de Remington), 16ª edición, 1980, Marck Publishing Co., editado por Oslo et al. Típicamente, en las formulaciones, se utiliza una cantidad apropiada de sales farmacéuticamente aceptables, para convertir a la formulación en isotónica. Los ejemplos de substancias farmacéuticamente aceptables, incluyen al suero fisiológico salino, a la solución de Ringer y a la solución de dextrosa. El valor pH de la solución, de una forma preferible, se encuentra comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8, encontrándose éstos comprendidos, de una forma más preferible, dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 7,5.

Un objeto adicionalmente preferido de la presente invención, es una composición farmacéutica de una trioxopirimidina en concordancia con la presente invención, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias bronquiales, y su uso, que contienen un complejo de trioxopirimidina - ciclodextrina (inclusión de la trioxopirimidina en la ciclodextrina), formada de tal tipo de trioxopirimidina o una sal de ésta, y una ciclodextrina, de una forma preferible, un derivado de ciclodextrina soluble en agua (definiéndose, el término de soluble en agua, como una solubilidad de por lo menos 0,5 g/100 ml de agua, a una temperatura de 25ºC). En el complejo, de una forma preferible, se compleja 1 mol de trioxopirimidina, y se incluye mediante 1 mol de una \alpha-, \beta- ó \gamma-dextrina, o un derivado de ésta. Las ciclodextrinas preferidas, son

- alfa-ciclodextrina, y sus derivados sintéticos, tales como las HP\alphaCD, \alphaCD metiladas, hidroxibutil-\alphaCD, maltosil-\alphaCD, glucosil \alphaCD.

- beta-ciclodextrina y sus derivados sintéticos, tales como las HP\betaCD, SBE\betaCD, RM\betaCD, DIME\betaCD, TRIME\beta
CD, hidroxibutil-\betaCD, glucosil-\betaCD, maltosil-\betaCD.

gama-ciclodextrina, y sus derivados sintéticos, tales como las HP\gammaCD, RM\gammaCD y DIME\gammaCD, hidroxibutil-\gammaCD, glucosil-\gammaCD y maltosil-\gammaCD.

Las ciclodextrinas de utilidad en concordancia con la presente invención, son oligosacáridos cíclicos producidos mediante degradación enzimática de almidón, los cuales se encuentran compuestos por un número variable de unidades de glucopiranosa, mayormente, 6, 7, u 8; esta ciclodextrinas,, se denominan, respectivamente, ciclodextrinas \alpha, \beta y \gamma (\alphaCD, \betaCD y \gammaCD). Las ciclodextrinas en concordancia con la presente invención, son ciclodextrinas en sí mismas, o derivados de ciclodextrina, los cuales son por lo menos solubles en agua, en una cantidad correspondiente a un valor de 0,5 gr/100 ml, a una temperatura de 25ºC.

El derivado de ciclodextrina soluble en agua preferiblemente utilizado en la presente invención, se refiere a un derivado que tiene un solubilidad en agua de por lo menos el correspondiente al de una \beta-ciclodextrina. Los ejemplos de tales tipos de derivados de ciclodextrina solubles en agua, son la sulfobutilciclodextrina, la hidroxipropilciclodextrina, la maltosilciclodextrina, y las sales de éstas. De una forma particular, sulfobutil-\beta-ciclodextrina, hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, maltosil-\beta-ciclodextrina, y sales de éstas.

Los derivados preferidos en concordancia con la presente invención, son también metilciclodextrinas (producto de metilación de ciclodextrinas), dimetilciclodextrinas (DIMEB)(preferiblemente sustituidas en 2 y en 6), trimetilciclodextrinas (preferiblemente sustituídas en 2, 3 y 6), ciclodextrinas "aleatorias metiladas" (RAMEB) (de una forma preferible, sustituidas aleatoriamente en 2, 3 y 6), trimetilciclodextinas (preferiblemente, sustituidas aleatoriamente en 2, 3 y 6, pero con un número de 1,7 a 1,9 metilos, por unidad de glucosopirano), hidroxi-propilciclodextrinas (HPCD), ciclodextrinas hidroxi-propiladas, de una forma preferible, sustituidas aleatoriamente, principalmente en la posición 2 y 3 (HP-\betaCD, HP-\gammaCD), sulfobutiléterciclodextrinas (SBECD), hidroxi-etilciclodextrinas, carboximetiletilciclodextrinas, etil-ciclodextrinas, ciclodextrinas anfífilas obtenidas mediante el injerto de cadenas hidrocarbonadas en los grupos hidroxilo, y siendo capaces de formar nanopartículas, ciclodextrinas de colesterol y ciclodextrinas de triglicéridos, obtenidas mediante el injerto de ciclodextrinas monaminadas (con un brazo distanciador).

El complejo de trioxopirimidin-ciclodextrina de la presente invención, puede obtenerse procediendo a producir una solución acuosa que contenga un compuesto de trioxopirimidina de éste, y un derivado de ciclodextrina soluble en agua. El derivado de ciclodextrina soluble en agua, se utiliza en una cantidad correspondiente a un mol, o más, por mol de trioxopirimidina, de una forma preferible, 1 - 10 mol, y de una forma particularmente preferida, 1 - 2 mol de ciclodextrina por mol de trioxopirimidina.

Cuanto mayor es la concentración de derivados de ciclodextrina solubles en agua, mayor es la solubilidad de los incrementos de trioxopirimidina. No se impone una limitación particular, en el procedimiento para producir la solución acuosa y, por ejemplo, ésta se produce mediante la utilización de agua, o un tampón, en una gama de temperaturas correspondiente a un nivel comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente -5ºC hasta aproximadamente 35ºC.

Cuando se procede a agitar una solución de ciclodextrinas, con un exceso de una trioxopirimidina, existe una formación de complejos entre estas dos moléculas. La filtración de esta solución, permite recuperar el complejo de una trioxopirimidina en solución, en el filtrado, siendo, el complejo, soluble en agua. El complejo, puede también obtenerse procediendo a mezclar una cantidad solubilizada conocida de una trioxopirimidina en solución acuosa, con una cantidad solubilizada conocida de CD, procediendo a calcular las proporciones apropiadas.

Otra forma de obtener un complejo, es la consistente en añadir una solución de una trioxopirimidina en un disolvente (por ejemplo, alcohol, acetona, etc.), a una solución acuosa de ciclodextrina. El complejo, puede formarse después de una agitación suficiente, bien ya sea después de la evaporación del disolvente, o bien ya sea incluso en presencia del disolvente.

La liofilización de la nebulización de las soluciones del complejo en concordancia con la presente invención, permite que el complejo se obtenga en forma sólida. Así, de este modo, puede obtenerse un complejo en forma de una materia amorfa en polvo. Es también posible obtener el complejo, en estado sólido, después de la disolución de la CD y una trioxopirimidina, en un disolvente orgánico apropiado, y la evaporación adicional del disolvente.

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Pueden utilizarse otros procedimientos, para la preparación de complejos sólidos, los cuales son la agitación vigorosa de una suspensión de una trioxopirimidina y CD, en una cantidad muy pequeña de agua, después, la recolección del complejo, después del secado, o el uso de CO_{2}, en un estado supercrítico, para mezclar una trioxopiridina y CD, en presencia de CO_{2}, en un estado crítico.

El complejo en concordancia con la presente, puede prepararse, por ejemplo, de una forma en sí misma conocida, a partir de una solución, o la utilización del procedimiento en pasta, en donde, el factor de relación, en peso, de ciclodextrina, con respecto a trioxopirimidina, debe encontrarse comprendido dentro de unos márgenes que van de 2 540 y, de una forma preferible, dentro de unos márgenes que va de 2 a 25 y, de una forma particularmente preferible, dentro de unos márgenes que van de 2,5 a 3,5 (para un complejo 1 : 1 con ciclodextrina), o dentro de unos márgenes que van de 5,2 a 6,2 (para un complejo 1 : 2 con ciclodextrina).

Es preferible el proceder a preparar el complejo, a partir de una preparación concentrada, acuosa, de ciclodextrina. La concentración de ciclodextrina de la preparación es, de una forma preferible, la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes que van de 50 a 400 mM. Se le da preferencia, a una concentración de ciclodextrina comprendida dentro de unos márgenes que van de 100 a 250 mM. Dependiendo de la consistencia, las mezclas, se mezclan o se amasan de un forma intensiva. El porcentaje en peso de la ciclodextrina, se basa en el peso total de la preparación acuosa de ciclodextrina.

La temperatura de reacción es, usualmente, la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 20ºC y 80ºC, de una forma preferible, entre 20ºC y 60ºC, de una forma particularmente preferida, entre 25ºC y 45ºC. El tiempo de reacción, depende de la temperatura, y éste, se encuentra comprendido entre una hora y algunos días. Se da preferencia a un tiempo de reacción de por lo menos 7 días, para alcanzar el equilibrio de la formación del complejo.

En concordancia con la invención, se ha establecido el hecho de que, los complejos entre un trioxopirimidina y una ciclodextrina, incrementan la solubilidad de una trioxopiridina en agua, de una forma extraordinaria. Es también evidente el hecho de que, la formación del complejo, no interfería con las propiedades farmacológicas de la trioxopirimidina.

Todas estas propiedades, permiten preparar las formulaciones líquidas, como soluciones, para la inyección o para la nebulización, y permiten mejorar la biodisponibilidad, de una forma particular, oralmente. Un complejo de trioxopirimidina-ciclodextrina de la presente invención, puede ser utilizado como tal, en forma de materia en polvo, la cual se obtiene procediendo a retirar el agua co-existente. Los ejemplos de este procedimiento para retirar el agua, incluyen la liofilización y el secado bajo presión reducida. Un producto en polvo obtenido mediante liofilización, es el que se prefiere.

El complejo de trioxopirdina-ciclodextrina de la presente invención, exhibe sus efectos, a través de, o bien ya sea la administración oral o bien ya sea la administración parenteral, y ésta se forma, de una forma preferible, convirtiéndola en una formulación para la administración parenteral, de una forma particular, una formulación para inyección o para la administración tópica, de una forma particular, una formulación para aerosol.

Los ejemplos de la forma de formulación, incluyen a las tabletas, cápsulas, materias en polvo, y gránulos. Éstas pueden producirse mediante una técnica conocida mediante el uso de aditivos típicos, tales como excipientes, lubricantes y ligantes.

Una formulación farmacéutica preferida para la nebulización, contiene trioxopiridina, ciclodextrina (CD), NaCl y agua. Se prefiere, de una forma especial, una combinación de (para 200 ml de solución):

Trioxopirimidina 0,05 - 0,2 g, de una forma preferible, 0,1 g; 10 - 50 g de CD, de una forma preferible, 20 g de CD, de una forma preferible HP\betaCD; cloruro sódico 1,2 - 1,5 g, de una forma preferible 1,42 g (isotonicidad) y agua de una forma preferible, agua exenta de pirógenos, estéril, ad 200 ml.

Tal tipo de formulación, es de utilidad para las enfermedades inflamatorias bronquiales.

La solución, se prepara procediendo a disolver CD en 100 ml de agua purificada, añadiendo trioxopirimidina y NaCl, mediante agitación, de tal forma que éstos se disuelvan y se complete con agua, de tal forma que se obtengan 200 ml de solución. De una forma preferible, la solución, se esteriliza mediante filtración, a través de una membrana de polipropileno de 0,22 \mum, o mediante procedimiento de esterilización mediante vapor.

Los siguientes ejemplos, referencias, y figuras, se proporcionan para ayudar en la comprensión de la siguiente invención.

Descripción de las figuras Figura 1

Efectos de la inyección intraperitoneal de una suspensión del compuesto I en cuentas eosinófilas de BAL figura 1a), y puntuación de evaluación de la inflamación peribronquial (figura b). Los controles, son ratones expuestos únicamente a PBS y no alergenos (PBS), y ratones expuestos a ova, mediante inhalación y placebo, mediante inyección intraperitoneal (OVA).

Figura 2

Efectos terapéuticos del compuesto 1-HP-\beta-CD, fluticasona y placebo (PLAC) administrados mediante aerosoles en eosinofilia BAL (2a), puntuación de evaluación de inflamación peribronquial (2b), y puntuación de evaluación de infiltración de eosionófilos en tejidos (2c) en un modelo de exposición de alergenos de un corto período de tiempo (5 días).

Figura 3

Efectos terapéuticos del compuesto 1-HP-\beta-CD, fluticasona y placebo (PBS) administrados mediante aerosoles en eosinofilia BAL (3a), puntuación de evaluación de inflamación peribronquial (3b), y puntuación de evaluación de infiltración de eosionófilos en tejidos (3c) en un modelo de exposición de alergenos de un largo período de tiempo (11 semanas). Ratones sensibilizados pero no expuestos a alergenos (PBS) y ratones sensibilizados y expuestos a OCA (PLAC), fueron tratados mediante inhalación de PBS.

Figura 4

Diagrama fase de solubilidad del compuesto I, con HP-\beta-CD, en agua purificada (\bullet), L-lisina 50 mM (x) ó L-Lisina 50 mM (\blacktriangle).

Figura 5

Curva de la concentración máxima en suero del compuesto I (\pm S.D.) (a), o logaritmo de la concentración máxima en suero del compuesto I (b), con respecto al tiempo, después de la administración intravenosa 5 mg/kg) a ovejas (n = 6).

Figura 5

Curva de la concentración máxima en suero del compuesto I (\pm S.D.) (a), o logaritmo de la concentración máxima en suero del compuesto I (b), con respecto al tiempo, después de la administración oral (15 mg/kg) de una solución (\bullet) y una suspensión (\blacktriangle), a ovejas (n = para la solución y n = 6 para la suspensión.

Abreviaciones

CD

ciclodextrina

HP\betaCD ó HP-\beta-CD,

hidroxipropil-\beta-ciclodextrina

LV.

intravenosa

MMP

metaloproteasa de matriz

OVA

ovalbúmina

PBS

\beta-ciclodextrina en tampón fosfato salino

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Ejemplo 1 Preparación de un complejo soluble del compuesto I y ciclodextrina (CD)

1.1 Pesar 20 mg del compuesto I. Añadir 2 ml de una solución de HP\betaCD 200 mM. Agitar durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 37ºC. Filtrar en filtro Milipore Millex HV 0,45 \mum. La solución obtenida después de la filtración, contiene el complejo compuesto I-CD, en solución.

1.2 Pesar 25 mg del compuesto I. Añadir 2 ml de una solución de HP\betaCD 200 mM. Agitar durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 37ºC, o hasta que el compuesto se haya disuelto. La solución de esta forma obtenida, contiene el complejo compuesto I-CD, en solución.

Ejemplo 2 Mejora de la solubilidad del complejo soluble del compuesto I y ciclodextrina (CD), mediante la adición de una solución de L-lisina

Se procedió a realizar estudios de solubilidad, tal y como se describen por parte de Higuchi, T. and Connors, K,A. Advances en Analytical Chemistry and Instrumentation 4, - Avances es la química y la instrumentación analítica 4 -, (1965), 117 - 212. Se añadieron cantidades en exceso del compuesto I, para incrementar las concentraciones de HP-\beta-CD (0 - 200 mM), en 5 ml de medio de disolución, de bien ya sea agua purificada, o bien ya sea de soluciones de L-lisina (50 mM ó 500 mM). Se procedió a sellar los recipientes de vidrio y, las suspensiones, se agitaron, en un baño de agua, a una temperatura de 25ºC, hasta que se hubiese alcanzado el equilibrio de compensación (7 días). Se filtró un alícuoto, a través de un membrana de PVDF de 0,45 \mum, y se sometió a test de ensayó para valorar el contenido de compuesto I, mediante procedimiento de cromatografía líquida (LC) validada.

La figura 4, muestra el diagrama de fase de solubilidad del compuesto I, obtenido a una temperatura de 25ºC, en presencia de HP-\beta-CD en agua purificada, en una solución de L-lisina 50 mM, y en una solución de L-lisina 500 mM. En los tres casos, la solubilidad acuosa del compuesto I, se incrementa como una función de la concentración de CD. El diagrama de solubilidad obtenido en ausencia de L-lisina, confirma los resultados previamente mencionados; la solubilidad del compuesto I, en una solución de HP-\beta-CD 200 mM, es de aproximadamente 5,5 mg/ml (11 mM), la cual corresponde a un incremento de aproximadamente 10.000 veces, de la solubilidad acuosa del compuesto I.

En presencia de L-lisina, la solución del compuesto I, en HP-\beta-CD 200, es incluso mucho mayor. La solubilidad en un solución de HP-\beta-CD 200 mM, se incrementa en un valor situado entre aproximadamente 2 y 7 veces, en presencia de 50 mM y 500 mM de L-lisina, respectivamente. La tabla 8, muestra los datos de solubilidad del compuesto I, en el medio diferente. Los resultados, muestran un efecto sinérgico, entre L-lisina y HP-\beta-CD. La solubilidad, en presencia de ambos, L-lisina 500 mM y HP-\beta-CD 200 mM (38,14 mg/ml), es mayor que la esperada, mediante la adición del efecto de la HP-\beta-CD y la L-lisina, separadamente (5,53 mg/ml y 0,09 mg/ml). Este efecto sinérgico, entre la L-lisina y la HP-\beta-CD, permite un importante incremento de la solubilidad acuosa del compuesto I (70.000 veces mayor, con 500 mM de L-lisina y 200 mM de HP-\beta-CD).

TABLA 1 Solubilidad del compuesto I [mg/ml] en agua purificada y en L-lisina (50 mM y 500 mM) sin o con HP-\beta-CD 200 mM

1

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Ejemplo 3 Determinación de actividad enzimática MMP

Se procedió a someter a test de ensayo, inhibidores, en un ensayo de fluorescencia modificado, tal y como se describe por parte de M.S., y Gray, R.D., J. Biol. Chem. 264 (1998) 4227 - 4281. Las MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 y MMP-14, son comercialmente obtenibles en el mercado (por ejemplo, de la firma Calbiochem). La pro-enzimas, se activaron con APMA 1 mM (incubación durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 37ºC), inmediatamente antes de ser sometidas al test de ensayo. La enzima activada, se diluye a 100 ng/ml, en un tampón de incubación (30 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl_{2}, pH 7,6). Los compuestos, se disolvieron en DMSO al 100%. Para la determinación del IC_{50}, se prepararon 8 etapas de dilución, entre 0,5 - 100 nM. El substrato de DNP (Bachem M1855), 255 \muM), se disolvió en un tampón de incubación.

El tubo de ensayo, contiene 970 \mul de tampón de incubación, 10 \mul de solución de inhibidor y 10 \mul de solución de enzimas. La reacción, se inició procediendo a añadir 10 \mul de solución del substrato.

La cinética de la actividad, se determinó mediante la utilización de excitación, a 280 nm, y emisión a 346 nm, en un FluoroMax® (Spex Industries Inc., Edison, NJ, USA), en un transcurso de tiempo de 120 minutos. Se utilizó DMSO, como control, en lugar de la solución de inhibidor.

Las IC_{50}'s, se definen como la concentración de inhibidor que proporciona una señal que es un 50% del control de enzima positivo.

Los valores de IC_{50} (nM), se muestran en la tabla 1.

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TABLA 2

2

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Ejemplo 4 Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan diferentes composiciones de formulaciones a título de ejemplo no limitativo.

Un ejemplo preferido para una formulación inyectable, es:

HP-\beta-CD (200 mM); Compuesto I 1 mg/ml; agua estéril para inyección q.s.

Para 25 ml de solución:

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a) Preparación de la solución

Pesar 6,77 g de HP-\beta-CD (4,2% de H_{2}O) y disolverlos con 25 ml de agua mediante inyección. Añadir 25 mg del compuesto I y calentar en un baño de agua, hasta que, éste último, se haya disuelto completamente. Esterilizar mediante filtración.

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b) Características de la solución

La osmolalidad de la solución, es de 308 mOs/kg. El valor pH es de 7,2.

La concentración del compuesto I y/o de la CD, puede modificarse en función de los requerimientos. Es preferible el proceder a ajustar la tonicidad, mediante la adición de NaCl.

Una formulación preferible para la nebulización, es:

Para 200 ml de solución:

- Compuesto I

0,1 g

- HP-\beta-CD exenta de pirogénico

20,15 g (75 mM)

- Cloruro sódico

1,42 g (isotonicidad)

- Agua purificada, estéril y exenta de pirógenos

q.s. ad 200 ml

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a) Pesar 20,15 g de HP-\beta-CD exenta de pirogénico (3,2% H_{2}O, ROQUETTE) y disolverlos en 100 ml de agua purificada.

b) Pesar 0,1 de compuesto I, y 1,42 g de cloruro sódico y añadirlos a la solución (a), mediante la agitación mecánica, de tal forma que se disuelvan.

c) Completar con agua, de tal forma que se obtengan 200 ml de solución.

c) Esterilizar mediante filtración, a través de una membrana de polipropileno de 0,22 \mum.

Ejemplo 5 Uso de una formulación que contiene compuesto I y HP-\beta-CD para la terapia de la inflamación de las vías respiratorias, inducidas por alergenos, e hiper-responsabilidad bronquial, en un modelo múrido (del ratón) de asma Materiales

La HP-\beta-CD (grado de sustitución 0,64), tiene el origen de procedencia de la firma Roquette (Francia). El tampón fosfato salino apirogénico, se compró de procedencia de la firma Bio-Wittaker (Verviers, Bélgica), y la metacolina, de procedencia de la firma Sigma - Aldrich (Alemania). Todos los otros materiales, eran de grado analítico. En la totalidad de este estudio, se utilizó agua estéril. Se prepararon soluciones de CD, estériles, apirogénicas e isotónicas, a valores 20, 50 y 75 mM. Se compró una solución de fluticasona comercialmente obtenible para la inhalación (Flixotide^{(R)} 1 mg/ml), de procedencia de la firma Glaxo-Simthline (Genial, Bélgica).

Sensibilización, exposición a alergenos y protocolos terapéuticos

Con objeto de estudiar la modulación de las inflamaciones de las vías respiratorias mediante la inyección intraperitoneal del Compuesto I, se procedió a sensibilizar ratones, con 10 \mug de ovalbúmina alumino-absorbida (Alumininyect, Perbio, Erembodegen, Bélgica), intra-peritonealmente inyectada, en los días 0 y 7, y a continuación, se expusieron a aerosoles de OVA 1% ó PBS, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, desde el día 21 al 24. Las inyecciones intraperitoneales, se realizaron durante un transcurso de 30 minutos, antes de las inhalaciones de OVA. Las diferentes formulaciones inyectadas, eran: Cremophor 10%-DMSO 10%-PBS 80%-Compuesto 130 mg/kg (suspensión); Cremophor 10%-DMSO 10%-PBS 80%-Compuesto 13,75 mg/kg (solución); HP\betaCD 200 mM. Todos los resultados, se compararon a ratones sensibilizados, y se expusieron a PBS y OVA tratada con PBS, intraperitonealmente inyectada. Con objeto de estudiar la modulación de la inflamación de las vías respiratorias mediante el compuesto I inhalado, los ratones, se sensibilizaron de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba. Se utilizaron dos protocolos, a los cuales se les hace referencia como estímulo de corto período de tiempo y estímulo de largo período de tiempo. En el estímulo de corto período de tiempo, se procedió a exponer ratones, a aerosoles del complejo del compuesto I, a unas concentraciones de 0,03 y 3 mg/ml de compuesto activo, en solución acuosa, desde el día 21 hasta el día 27, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en una cámara de exposición de Plexiglas (30 x 20 x 15 cm). Los ratones, se expusieron a aerosoles de OVA, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, después de la inhalación del compuesto I, desde el día 23 hasta el día 27. En el denominado estímulo de largo período de tiempo, se procedió a exponer ratones, a aerosoles del complejo del compuesto I, a unas concentraciones de 0,03 y 3 mg/ml, complejados con HP\betaCD, en una solución acuosa, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, cinco días, algunas semanas (las semanas pares), y aerosoles de OVA, 3 días, algunas semanas (las semanas pares), durante un transcurso de tiempo de 11 semanas.

El aerosol, se produjo utilizando un nebulizador ultrasónico del tipo SYSTAM (Système Asístanse Medical, Le Ledat, Francia), cuya frecuencia de vibración, es de 2,4 MHz, con una intensidad de vibración y unos niveles de ventilación, variables. La intensidad de la vibración, se fijó en la posición 6, y el nivel de ventilación, era de 25 (v_{1/2}) l/minuto.

Medición de la sensibilidad de las vías respiratorias

Después de veinticuatro de la última exposición a alergenos, se procedió a determinar las hiper-sensibilidad bronquial, midiendo el "Penh", utilizando un pletismógrafo barométrico, según se propone por parte de Hamelmann, E. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (1997) 766 - 775. El "Penh", se midió en la línea de base, y 5 minutos después de la inhalación de dosis incrementantes (25, 50, 75 y 100 mM) de metacolina (MCh).

Lavado broncoalveolar (BAL) e histología

Inmediatamente después de la valoración de la sensibilidad de las vías respiratorias, se procedió a sacrificar los ratones, y se instaló 1 ml de PBS exento de calcio y magnesio ionizados, pero suplementado con 0,05 mM EDTA sódica, 4 veces, vía una cánula traqueal, y se recuperó mediante aspiración manual suave. El fluido de lavado broncoalveolar recuperado (BAL), se centrifugó (1800 revoluciones por minuto), durante un transcurso de tiempo de 10 minutos, a una temperatura de 4ºC). El gránulo celular, se lavó dos veces y, finalmente, se resuspendió en 1 ml de PBS. Se realizó un recuento total de células, en preparaciones citocentrifugadas (Cytospin 2; Cytospin, Shandon Ltd. Runconrn, Cheshire, U.K.), utilizando un criterio morfológico standard, después de haber procedido a una tinción de marcaje, con Diff-Quick (Dade, Alemania). Después del BAL (lavado broncoalveolar), se procedió a abrir el tórax y, el bronquio principal izquierdo, se afianzó mediante abrazadera. El pulmón izquierdo, se extirpó, y se congeló inmediatamente en N_{2} líquido, para la química de proteínas y la extracción de mRNA, mientras que, el pulmón izquierdo, se procesó, para proceder a su histología. Tal y como se ha descrito previamente, arriba (Cataldo, D. D., et al. Am. J. Pathol. 161 (2002), 491 - 498), el pulmón izquierdo, se infundió con paraformaldehído al 4%, y se embebió en parafina. Se procedió a marcar secciones de 5 \mum de espesor procedentes de todos los lúbulos, mediante una tinción con hematoxolina y emosina. Se procedió a estimar la extensión de los infiltrados peribronquiales, mediante una puntuación de evaluación de la inflamación. Se procedió a codificar las platinas o pota-objetos y, la inflamación peribronquial, se graduó de una forma ciega, utilizando un sistema de puntuación de evaluación, descrito en otra parte (Cataldo, D.D., et al., Am. J. Pathol. 161 (2002) 491 - 498). A cada sección de tejido puntuada, según evaluación, se le otorgó un valor de 0 a 3, estimado según criterio. Se otorgó una puntuación de 0, cuando no era detectable ninguna inflamación, un valor de 1, para una acumulación o engrosamiento ocasional con células inflamatorias, un valor de 3, cuando la mayoría de los bronquios se encuentran rodeados por una fina capa (> 5 células) de células inflamatorias. Como se puntuaron mediante una evaluación, 5 - 7 secciones de tejido aleatoriamente seleccionado, por ratón, las puntuaciones de evaluación, pudieron expresarse como el valor medio por animal, y pudieron compararse entre grupos. Otra puntuación de evaluación, a la cual se le hace referencia como puntuación de evaluación de infiltración de eosinófilos en los tejidos, la cual refleja específicamente la cantidades de eosinófilos que se infiltran en la paredes bronquiales, se midió de la siguiente forma: después de una tinción de marcaje con rojo congo, se estudiaron siete bronquios por ratón. Se procedió a contar los eosinófilos alrededor de los bronquios, dentro de los límites de las paredes de las vías aéreas (vías respiratorias), se midió el perímetro de la membrana vítrea y, los resultados, se expresaron como el número de eosinófilos/mm de la membrana vítrea. El pulmón izquierdo, se congeló en breve tiempo en nitrógeno líquido, y se trituró, utilizando un microdesmembrador del tipo Mikro-Dismembrator S (Braun Biotech International, Melsungen, Alemania) y, los extractos, se almacenaron a una temperatura de -80ºC, antes de ser estudiados. Se extirparon los riñones, y éstos, se embebieron en parafina, procediendo a marcar mediante tinción, secciones de 5 \mum, mediante hematoxilina y eosina. Se procedió a realizar muestras de sangre, mediante punción cardíaca, y se almacenó el suero, a una temperatura de -80ºC, hasta que se hubo realizado el análisis.

Todas las manipulaciones in vivo, fueron aprobadas, por el comité local sobre ética veterinaria.

Inyección intraperitoneal del compuesto I

La inyección interperitoneal del compuesto I (bien ya sea en solución o bien ya sea como precipitado), redujo la inflamación eosinofílica inducida por alergenos en las BAL, a dosis correspondientes a una gama comprendida dentro de unos márgenes que van de 3,75 a 30 mg/kg, cuando se compara con placebo (figura 1a). A las mismas dosis, las puntuaciones de valoración de la inflamación peribronquial, se redujeron de una forma significativa, con el compuesto I, con una eficacia igual a la de todas las formulaciones sometidas a test de ensayo (Figura 1b). La puntuación de evaluación de la infiltración de eosinófilos en el tejido, se redujo de una forma significativa, mediante la inyección peritoneal del compuesto I, a dosis correspondientes a una gama comprendida dentro de nos márgenes que van de 7,5 a 25 mg/kg.

Exposición inhalatoria al compuesto I y a los complejos HP\betaCD del compuesto I

Se procedió, en primer lugar, a valorar la actividad intrínseca del compuesto I, como un agente antiinflamatorio tópicamente activo, utilizando una solución de compuesto I de 40 mg/ml en DMSO puro, en una exposición de corto período de tiempo. Cuando se compara a la inhalación de DMSO solo, la inhalación de esta formulación, condujo a un significativo decrecimiento de la puntuación de avaluación de los eosinófilos en las BAL (p < 0,005), la puntuación de evaluación de la inflamación peribronquial (p < 0,01), así, como la hipersensibilidad peribronquial (p < 0,05).

En el protocolo de exposición a un corto período de tiempo, procedimos a valorar los efectos de las formulaciones que contenían los complejos de HP-\beta-CD del compuesto I, en la inflamación y la hipersensibilidad de las vías respiratorias. Los efectos de inhalación de las formulaciones que contenían el complejo de HP\betaCD del compuesto I, se compararon con los de aquéllas de placebo (PBS) ó fluticasona (1 mg/ml), usadas como terapia de referencia. La inhalación de aquéllas formulaciones que contenían el compuesto I, a dosis de 0,03 y 0,3 mg/ml, indujeron un significativo decrecimiento en la inflamación eosinofílica en las BAL, en una extensión comparable a la de la fluticasona, cuando se comparaba al placebo (p < 0,0001) (figura 2a). Las puntuaciones de valoración de la inflamación peribronquial, se redujeron, también, cuando se compararon con el placebo (p < 0,0001) (figura 2b), así como también la puntuación de evaluación de la infiltración de eosinófilos en el tejido (p < 0,01 (figura 2c).

Después de la exposición de largo período de tiempo, la eosinofilia de las BAL, decreció de una forma significativa, después del tratamiento mediante la inhalación con las formulaciones del compuesto I que contenían HP\betaCD (p < 0,001), en la misma extensión que las de fluticasona (figura 3a). La puntuación de evaluación de la inflamación peribronquial, se redujo también de una forma significativa, mediante la inhalación de las formulaciones del compuesto I que contenían HP\betaCD, así como con fluticasona (p < 0,0001) (figura 3b). La puntuación de evaluación de la infiltración de eosinófilos en el tejido, decreció, también, después del tratamiento mediante inhalación del compuesto I, en una extensión comparable a la de los ratones tratados con fluticasona (p < 0,01 (figura 3c).

Ejemplo 6 Estudios farmacocinéticos en la biodisponibilidad

Las soluciones para los estudios farmacocinéticos, se desarrollaron con una combinación de HP-\beta-CD y L-lisina, permitiendo una alta concentración del compuesto I, con un valor pH biocompatible.

Dosificación a partir de las preparaciones

La solución intravenosa de compuesto I/HP-\beta-CD, se obtuvo procediendo a disolver el compuesto I (10 mg/ml), en una solución que contenía HP-\beta-CD (200 mM), L-lisina (20 mM), y agua, para la inyección. Los valores de la osmolalidad (aproximadamente 325 mOsmol/kg) y del pH (aproximadamente 8,2) de esta solución, son compatibles con una inyección intravenosa. La solución, se esterilizó procediendo a hacerla pasar a través de un filtro de acetato de celulosa de 20 \mum, estéril, bajo condiciones asépticas.

Las solución oral de compuesto I/HP-\beta-CD, se preparó procediendo a disolver compuesto I (15 mg/ml), en una solución que contenía HP-\beta-CD (200 mM), L-lisina (50 mM) y agua.

La suspensión del compuesto I, se componía de compuesto I (15 mg/ml), polisorbato 80 (0,1 mg/ml) como agente humectante, simaldrato (VEEGUM HV®, 1% m/v), y metilcelulosa (METHOCEL A400®, 0,4% m/v), como agentes de viscosificantes.

Protocolo experimental en animales y administración de fármacos

Para este experimento, se utilizaron, como animales experimentales, seis ovejas sanas (2 machos y 4 hembras), de un peso corporal comprendido dentro de unos márgenes que van de 45 a 82 kg. Durante el test de ensayo, los animales, se alimentaron y se abastecieron de agua, "ad limitum".

El estudio experimental, el cual se realizó siguiendo el esquema de la tabla 3, incluía un diseño entrecruzado de dos maneras, para la administración oral, seguido de una administración intravenosa. Se permitió un período de lavado de 3 días, entre cada administración.

TABLA 3 Diseño experimental para animales, para administración de soluciones y suspensiones que contienen el compuesto I

3

Para las formas de dosificación oral, cada animal, recibió una dosis del compuesto I, igual a 15 mg/kg de peso corporal, procedente de ambas formulaciones. Las ovejas, se pesaron en el día de la administración del fármaco, con objeto de adaptar el volumen de la forma de administración. Se tomaron muestras de la vena yugular, antes y después de 0,25, 0,5, 1, 15, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 28, 32 48, 72, 96, 120, 144, 168 horas, después de la administración oral.

Para la forma de administración intravenosa, la totalidad de las seis ovejas, recibieron 5 mg del compuesto I/kg de peso corporal. La solución, se administró a través de la vena yugular izquierda, y se tomaron muestras de sangre desde la vena yugular derecha, antes y después de 5, 10, 15, 30, 45 minutos, 1, 1,5, 2, 3, 5, 6, 8, 10, 24, 28, 32, 48, 72 96, 120, 144, 168 horas después del inicio de la administración intravenosa.

Todas las muestras de sangre, se centrifugaron y, el suero, se almacenó a una temperatura de -80ºC, hasta que se sometieron al ensayo.

Método de bioanálisis

Se desarrolló un método completamente automatizado, para la determinación por LC (cromatografía líquida) de este compuesto en suero. La limpieza de las muestras, se realizó en un acoplamiento en línea de una pre-columna cargada con material de acceso restringido (RAM), a saber, LiChrospher RP-8 - ADS (alquil-diol-sílice), a la columna analítica, por mediación de la técnica de conmutación de columna. Los sorbentes de ADS, pertenecen al grupo de soportes de fase inversa de superficie interna, y se han aplicado de una forma exitosa para la limpieza de las muestras biológicas, previamente al análisis de LC (Yu, Z, y Westerlund, D. Chromatographia 44 (1997) 489 - 594. Hubert, PH, et al., S.T.P, Pharma Practiques 9 (1999), 160 - 180; Souverain, S., et al., Journal of Chromatography B 801 (2004)
141 - 156). Las condiciones operativas, se describen en un documento previo (Chiap, P. et al., Journal of Crhomatography B 817 (2005, 109 - 117). El procedimiento, se validó completamente, en concordancia con un nuevo método, basado en perfiles de precisión, tomando en consideración el error total de medición (Hubert, P., et al, Analytica Chimica Acta 391 (1999), 135 - 148; Hubert, Ph., et al. S. T. P. Pharma Practiques 13 (2003) 27 - 64; Hubert, Ph., et al., J. Pharma Biomed. Anal. 36 (2004) 579 - 586.

Para el estudio bioanalítico, la gama de dosificación del procedimiento, tuvo que aumentarse hasta 50 \mug/ml, debido a las altas concentraciones a ser determinadas. Se realizó una revalidación parcial, y se obtuvieron buenos resultados, con respecto a la función, veracidad, precisión, exactitud y linealidad de la respuesta.

Farmacocinética y análisis estadístico

Para el estudio de la administración intravenosa, se procedió a determinar los parámetros farmacocinéticos, para cada animal, utilizando un modelo lineal de dos compartimientos con una distribución y eliminación de primer orden (Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications, - Farmacocinética, Principios Aplicaciones -,
McGrow-Hill Companies, USA, 2002). Se procedió a calcular los valores de las áreas bajo la curva (AUCs_{0-168}), mediante la regla lineal trapezoidal, durante el período de muestreo. Los AUC extrapolados hasta valores infinitos (AUCs_{0-\infty}), los valores totales de aclaramiento corporal (Cl_{t}), la vida media biológica (T_{1/2\beta}) y el volumen total de distribución (Vd_{t}), se calcularon utilizando ecuaciones convencionales asociadas con el análisis compartimental (Boroujerdi, M., Pharmacocineticks, Principles and Applications, - Farmacocinética, Principios Aplicaciones -, McGrow-Hill Companies, USA, 2002).

Para el estudio de administración oral, se procedió a determinar los parámetros farmacocinéticos, para cada animal, y para ambas, la suspensión y la solución, utilizando un modelo de un compartimiento, con una entrada de datos de primer orden y una salida de datos de primer orden, (Boroujerdi, M., Pharmacokinetics, Principles and Applications, - Farmacocinética, Principios Aplicaciones -, McGrow-Hill Companies, USA, 2002). Las AUCs_{0-168}, se calcularon de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, mediante suma trapezoidal. Las AUCs_{0-\infty}, se estimaron mediante la siguiente ecuación (ecuación 1):

4

en donde, K y K_{a}, son respectivamente la constante de la tasa de eliminación total y constante de la tasa de adsorción_{ }y C_{0}, es la concentración extrapolada en el origen.

Se procedió a determinar las concentraciones máximas del fármaco en el plasma (C_{max}) y los correspondientes tiempos (T_{max}), para cada animal, mediante dos diferentes métodos: directamente a partir de los gráficos concentración -
tiempo (C_{max experimental} y T _{max experimental}), y calculados utilizando las ecuaciones siguientes (ecuación 2 y 3) C _{max calculada} y T _{max calculada}):

5

6

La biodisponibilidad absoluta (F_{absol}), se evaluó utilizando la siguiente relación (ecuación 4):

7

en donde, D_{oral} y D_{I.V.}, son las cantidades de fármaco administradas por vía oral y por vía I.V, respectivamente.

Todos los parámetros farmacocinéticos, se reportan como \pm desviaciones standard medias, excepto la biodisponibilidad absoluta, calculada a partir de la AUC_{0-\infty}.

Los datos se consideraron como aberrantes, cuando el valor individual de AUC, era superior o igual que las desviaciones standard \pm medias. En base a este concepto, se procedió a excluir una oveja de la determinación de los parámetros farmacocinéticos, después de la administración de la solución oral y para análisis estadísticos.

La comparación de los parámetros farmacéuticos para las dos formas orales de dosificación, se ha realizado con un análisis de variancia de dos formas o vías (two-way ANOVA - [ANOVA de dos vías]-). Después de una transformación de larga duración, con objeto de normalizar la distribución, se completaron los valores medios de cada parámetro. Los resultados, se consideraron como siendo significativos, al nivel crítico del 5% (p < 0,05).

Farmacocinética del compuesto I, después de la administración intravenosa

La concentración media de suero del compuesto I, con respecto al tiempo, obtenida después de una administración individual de la solución intravenosa (5 mg/kg) a ovejas, se reporta en la figura 5a y la figura 5b (curva del logaritmo de la concentración media de suero del compuesto I con respecto al tiempo), y ésta muestra que, la farmacocinética del compuesto I, sigue un modelo de dos compartimientos. Los diferentes parámetros farmacocinéticos calculados después de esta administración intravenosa, se encuentran recopilados en la tabla 4.

TABLA 4 Parámetros farmacocinéticos del compuesto I (\pmS.D. media), obtenidos después de la administración intravenosa (5 mg/kg) a ovejas (n = 6)

8

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La fase de distribución, es de corta duración (aproximadamente 30 minutos), mostrando el hecho de que, el compuesto I, se distribuye rápidamente en el organismo. El volumen total de distribución, es pequeño (aproximadamente 8 litros), lo cual indica el hecho de que, la distribución del compuesto I, se limitaría a fluidos extracelulares y que, la difusión del compuesto I en tejidos, no sería muy importante. Por otro lado, la vida media del compuesto I, es de larga duración (aproximadamente 15,5 horas) y, así, de este modo, la eliminación de fármacos, es muy lenta. Considerando su pequeño volumen de distribución, la acumulación en el organismo, no vendría provocada por el almacenaje, por ejemplo, de grasa, sino que ésta sería el enlace con proteínas, u otros componentes del plasma. Se procedió, también, a calcular el valor total de aclaramiento corporal, y éste es de aproximadamente 358,5 ml/h.

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Farmacocinética del compuesto I, después de la administración oral de una suspensión y una solución

Los perfiles de la concentración media de suero con respecto al tiempo, del compuesto I, obtenidos después de la administración oral, a dosis individuales (15 mg/kg) de solución y suspensión del compuesto I, se muestran en la figura 6a. Después de la transformación logarítmica de la concentración media de suero, parece que, la farmacocinética, después de la administración oral, seguiría un modelo de un compartimiento (figura 6b). Los parámetros farmacocinéticos, se recopilan en la tabla 5.

TABLA 5 Parámetros farmacocinéticos del compuesto I( \pm S.D media, excepto para F), obtenidos después de la administración oral (15 mg/kg)) a ovejas

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Las concentraciones de suero del compuesto I, después de la administración de la solución, son claramente mayores que aquéllas obtenidas con una dosis igual, administrada como una suspensión. La fase de adsorción observada con la solución (aproximadamente 4 horas), es más corta que la lograda después de la administración de la suspensión (aproximadamente 10 horas). Puede también observarse el hecho de que, los parámetros farmacéuticos de la solución y la suspensión, son significativamente diferentes (p < 0,05) (tabla 5). Las concentraciones pico medias de suero del compuesto I, son de aproximadamente de 54 y 5 \mug/ml, después de la administración de la solución y la suspensión, respectivamente. La C_{max} de la solución, es aproximadamente 10 veces mayor que la de la suspensión. Se obtiene un T_{max} tres veces más temprano, con la solución, (aproximadamente 3,8 horas), que con la suspensión (aproximadamente 11 h). Los valores de AUC, siguen la misma tendencia que la de los valores de C_{max}; los AUC, después de la administración de la solución, son aproximadamente 10 veces mayores que aquéllos obtenidos después de la administración de la suspensión. Por consiguiente, después de la comparación con la solución I.V., la biodisponibilidad absoluta, es mucho mayor con la solución (80%) que con la suspensión (8%).

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Claims (2)

1. Uso de un compuesto de trioxopirimidina que tiene una alta actividad inhibitoria contra MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 y MMP-14, definido como

a) un valor de IC_{50} de menos de 5 \muM para MMP-2, MMP-9, y MMP-14, cada una;

b) un factor de relación de más de 100 para los valores de IC_{50} de MMP-1 : MMP-2, MMP-1 : MMP-9, MMP-1 : MMP-14, y

c) un factor de relación de más de 10 para los valores de IC_{50} de MMP-3 : MMP-2, MMP-3 : MMP-9, MMP-3 : MMP-14,

para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades inflamatorias bronquiales, en un huésped mamífero, en necesidad de tal tipo de tratamiento,

caracterizado por el hecho de que, el citado compuesto de trioxopirimidina, se selecciona de entre el grupo consistente en:

5-bifenil-4-il-5-[4-(4-nitro-fenil)-piperazin-1-il]-pirimidin-2,4,6-triona

5-(4-fenoxi-fenil)-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il]-pirimidin-2,4,6-triona

5-[4-(4-cloro-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona

5-[4-(3,4-dicloro-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona

5-[4-(4-bromo-fenoxi)-fenil]-5-(4-pirimidin-2-il-piperazin-1-il)-pirimidin-2,4,6-triona.

2. Uso, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, el compuesto de trioxopirimidina, se compleja con una ciclodextrina soluble en agua.