ES2311403B1 - Extractos fenolicos de piel de almendra conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas, y su procedimiento de obtencion. - Google Patents
Extractos fenolicos de piel de almendra conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas, y su procedimiento de obtencion. Download PDFInfo
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Abstract
Extractos fenólicos de piel de almendra
conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas, y su
procedimiento de obtención.
Esta invención se refiere a extractos fenólicos
conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas
obtenidos a partir de la piel de la almendra [Prunus dulcis
(Mill.) D.A. Webb, Prunus amygdalus (L.) Batsch.,
Amygdalus dulcis (Mill.), Amygdalus communis (L.) o
Prunus communis (L.)]. En particular, se quieren conseguir
extractos ricos en proantocianidinas con enlaces de tipo A.
El procedimiento de obtención que también se
protege consiste en: a) una maceración del material vegetal con
disolventes orgánicos a 25-100ºC, b) una
purificación por extracción líquido-líquido y/o
cromatografía de adsorción o intercambio iónico, y c)
opcionalmente, un secado final. También se protegen las posibles
actividades/propiedades de estos extractos tales como la actividad
antioxidante y otras, que determinan su uso como ingrediente
alimentario o dietético, y en la industria cosmética y
farmacéutica.
Description
Extractos fenólicos de piel de almendra
conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas, y su
procedimiento de obtención.
Extractos fenólicos bioactivos de aplicación en
la industria alimentaria, dietética, cosmética y farmaceútica.
Las proantocianidinas o taninos condensados son
oligómeros y polímeros de
flavan-3-ol ampliamente
distribuidos en el reino vegetal. Las unidades de
flavan-3-ol más abundantes son
(+)-afzelequina, (+)-catequina y
(+)-galocatequina (formas 2R:3S) y sus
diasteroisómeros (-)-epiafzelequina,
(-)-epicatequina y
(-)-epigalocatequina (formas 2R:3R),
respectivamente. Las proantocianidinas constituidas exclusivamente
por (epi)catequina se denominan procianidinas. Las
propelargonidinas y prodelfinidinas contienen al menos una unidad de
(epi)afzelequina y (epi)galocatequina,
respectivamente, junto con unidades de (epi)catequina. En
las procianidinas/propelargonidinas/prodelfinidinas de tipo B, las
unidades de flavan-3-ol se
encuentran unidas por el carbono C-4 de la unidad
superior y el carbono C-6 o C-8 de
la unidad inferior, siendo más abundantes los isómeros
C4-C8 que los C4-C6. Además de este
enlace C-C interflavánico, las procianidinas de
tipo A presentan un enlace de tipo éter entre el carbono
C-2 de la unidad superior y el grupo hidroxilo del
carbono C-7 de la unidad inferior (Porter L.J.
(1988) Flavans and proanthocyanidins. In The flavonoids
(Harborne J.B., Ed.) Chapman and Hall, New York, pp.
21-62). Mientras que las proantocianidinas de tipo
B se encuentran en muchas especies de plantas, son escasas las
fuentes naturales en las que se han identificado proantocianidinas
de tipo A (arándano, cacahuete, aguacate, ciruela, canela y curry);
de igual forma, las procianidinas son mayoritarias respecto a
propelargonidinas y prodelfinidinas en el reino vegetal (Prior
R.L., Gu L. (2005) Occurrence and biological significance of
proanthocyanidin in the American diet. Phytochemistry 66,
2264-2280).
Los productos ricos en proantocianidinas más
comercializados actualmente se obtienen de fuentes como semillas de
uva, manzana, cacao, corteza de pino, etc., y contienen
mayoritariamente procianidinas de tipo B. Las proantocianidinas de
tipo A presentan propiedades/actividades potencialmente beneficiosas
para la salud humana, tal es la capacidad de inhibición de la
adhesión bacteriana en el tracto urinario -lo que reduce el riesgo
de infecciones urinarias- (Foo L.Y., Lu Y.R., Howell A.B., Vorsa N.
(2000) A-type proanthocyanidin trimers from
cranberry that inhibit adherence of uropathogenic
P-fimbriated Escherichia coli. J Nat.
Prod. 63, 1225-1228; Foo L.Y., Lu Y.R., Howell
A.B., Vorsa N. (2000) The structure of cranberry proanthocyanidins
which inhibit adherence of uropathogenic
P-fimbriated Escherichia coli in
vitro. Phytochemistry 54, 173-181), y la
actividad seudo-insulina -lo que mejora el
metabolismo de la glucosa en pacientes con diabetes del tipo
2-(Anderson R.A., Broadhurst C.L., Polansky M.M., Schmidt W.F.,
Khan A., Flanagan V.P., Shoene N.W., Graves D. J. (2004) Isolation
and characterization of polyphenol type-A polymers
from cinnamon with insulin-like biological
activity. J. Agric. Food Chem. 52, 65-70).
También se han demostrado actividades antioxidante (Barreiros
A.L.B.S., David J.P., de Queiroz L.P., David J.M. (2000)
A-type : proanthocyanidin antioxidant from
Dioclea lasiophylla. Phytochemistry 55,
805-808) y antiinflamatoria (Lin L.C., Kuo Y.C.,
Chou C.J. (2002) Immunomodulatory proanthocyanidins from
Ecdysanthera utilis. J. Nat. Prod. 65,
505-508) para las proantocianidinas de tipo A.
Dicho lo anterior, surge, pues, el interés por
nuevos productos ricos en los tres tipos de proantocianidinas - es
decir, procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas -,
especialmente con enlaces de tipo A. Algunas patentes previas
relacionadas con productos conteniendo proantocianidinas son las
siguientes:
- WO2005/072726: Compositions and methods of use
of A-type procyanidins, Schmitz, H. H.;
Kwik-Uribe, C.L.; Kelm, M.A.; Hammerstone, J.
F.
Esta patente se refiere a formulaciones a
emplear en el tratamiento contra la hipertensión. Se incluyen
exclusivamente procianidinas de tipo A, es decir, formadas
exclusivamente por (epi)catequina.
- WO2004/112813: Litchi sinensis extracts
containing oligomeric proanthocyanidins, Rull, S.; Alaoui, I.;
Fabry, B.
Esta patente se refiere a la obtención de
extractos de litchi ricos en proantocianidinas de tipo A, aunque no
se incluyen identificaciones del tipo de moléculas contenidas en
el extracto.
- US2004/156925: Plant proanthocyanidin extract
effective at inhibiting utility, Howell, A. B.; Vorsa, N.
Esta patente se refiere a la obtención de
extractos de proantocianidinas para la prevención y tratamiento de
infecciones del tracto urinario causadas por Escherichia
coli tipo P. Los extractos contienen proantocianidinas con al
menos un enlace de tipo A, particularmente procianidinas.
- WO99/12541: Plant proantocyanidin extract
effective at inhibiting adherence of bacteria with
P-type fimbriae to surfaces, Howell, A. B.; Vorsa,
N.
Esta patente se refiere a la obtención de
extractos de proantocianidinas a partir de plantas de las familias
Ericaceae, Rosaceae, Pinaceae y Vitaceae,
preferiblemente Vaccinium macrocarpon. Los extractos se
emplean en la prevención y tratamiento de infecciones del tracto
urinario causadas por Escherichia coli tipo P.
- US2002/028260: Proanthocyanidin composition
extracted from Vaccinium useful in pharmaceutical compositions for
preventing or treating urogenital infection, Mickelsen, J. N.;
Mickelsen, R. A.; Walker, E. B.
Esta patente se refiere al uso de ciertas
procianidinas (A y B) contra infecciones urinarias y otros. Aunque
en el titulo se habla de proantocianidinas, en el texto se indica
que están formadas por unidades de (epi)catequina (es decir,
procianidinas).
- US2002/0228260: Plant proanthocyanidin
extracts, Walter, E. B.; Mickelsen, R. A.; Mickelsen, J. N.
Esta patente se refiere a extractos de plantas
conteniendo procianidinas con al menos un enlace de tipo A y su uso
en el prevención y tratamiento de infecciones urogenitales.
- ES2171142: Conjugados de flavanoles y
cisteamina. Torres, J. L.
Se refiere a nuevos productos que resultan de la
conjugación de extractos polifenólicos ricos en procianidinas y
prodelfinidinas con moléculas que contienen el grupo tiol.
Un punto importante en la invención y desarrollo
de productos ricos en compuestos potencialmente activos es su
coste, tanto de materia prima inicial como de procedimiento de
producción. En este sentido, los subproductos de la industria
agroalimentaria son fuentes atractivas de compuestos
bioactivos.
El tegumento o piel de la almendra, que se
separa de la almendra durante el procesamiento industrial de la
misma, es un subproducto con escaso valor económico, empleándose
mayormente como alimento para ganado. En la piel de la almendra, se
han identificado diversos compuestos fenólicos tanto de tipo
no-flavonoideo como flavonoideo (Sang, S.; Lapsley,
K.; Jeong, W-S.; Lachance, P.A.; Ho,
C-T; Rosen, R.T. (2002) Antioxidant phenolic
compounds isolated from almond skins (Prunus amygdalus Batsch).
J. Agric. Food Chem., 50, 2459-2463; Milbury
P.E., Chen C.Y., Dolnikowski G.G., Blumberg J.B. (2006)
Determination of flavonoids and phenolics and their distribution in
almonds. J Agric Food Chem 54, 5027-5033;
Wijeratne SSK, Abou-Zaid MM, Shahidi F. (2006)
Antioxidants polyphenols in almond and its coproducts. J Agric
Food Chem, 54, 312-318). En relación a los
flavan-3-oles, Brieskon, C.H.; Betz,
R. (1998) Procyanidin polymers crucial to the structure of the
almond seed coat. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 187,
347-353, identificaron los monómeros
(+)-catequina y (-)-epicatequina,
así como los dímeros de procianidinas B1, B3 y B4. Posteriormente,
Lazarus, S.A., Adamson, G.E., Hammerstone, J.F., Schmitz, H.H.
(1999) High performance liquid chromatography/mass spectrometry
analysis of proanthocyanidins in food and beverages. J. Agric.
Food Chem. 47, 3693-3701, confirman la
presencia de procianidinas de tipo B, demostrando a su vez la
ausencia de procianidinas de tipo A en los extractos que
obtuvieron a partir de piel de almendra.
El problema a resolver es la obtención de
extractos conteniendo proantocianidinas con propiedades/actividades
potencialmente beneficiosas para la salud humana. Además, se
buscan materias primas de bajo coste y procesos de producción
sencillos y rentables.
La invención se refiere a extractos fenólicos
conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas, y
obtenidos de la piel de la almendra [Prunus dulcis (Mill.)
D.A. Webb, Prunus amygdalus (L.) Batsch., Amygdalus
dulcis (Mill.), Amygdalus communis (L.) or Prunus
communis (L.)]. En particular, se quieren conseguir extractos
ricos en proantocianidinas con enlaces de tipo A. Es de esperar que
estos extractos presenten propiedades diferentes, cuando no
mejoradas, con respecto a los productos comercializados actualmente
y que contienen mayoritariamente procianidinas de tipo B. El
procedimiento de obtención, que también se protege, consiste en una
maceración del material vegetal con disolventes, seguido de una
etapa de purificación del extracto y, opcionalmente, un secado
final del extracto purificado. También se protegen las posibles
actividades o propiedades de estos extractos tales como la
actividad antioxidante y otras, que determinan su uso como
ingrediente alimentario o dietético y en la industria cosmética y
farmacéutica.
Figura 1: Ejemplos de las estructuras químicas
de las proantocianidinas que se encontrarían en los extractos
objeto de esta patente.
Figura 2: Análisis por MALDI-TOF
de la muestra obtenida en el ejemplo 1, ampliándose la zona
correspondiente a los tetrámeros. Se comprueba la presencia de
procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas desde dímeros
hasta heptámeros, conteniendo ambos tipos de enlaces, B y A. A
continuación se indican las señales m/z correspondientes a los
aductos sódicos [M+Na]^{+} de las proantocianidinas
detectadas.
Figura 3: Análisis por HPLC con columna de fase
inversa de la muestra obtenida en el ejemplo 1, con identificación
de picos cromatográficos correspondientes a dímeros y trimeros de
procianidinas de tipo B (m/z= 577 y 865, respectivamente) y
dimeros y trimeros de procianidinas de tipo A (m/z= 575 y
863, respectivamente).
Figura 4: Análisis por MALDI-TOF
de la muestra obtenida en el ejemplo 2, ampliándose la zona
correspondiente a los tetrámeros. Se comprueba la presencia de
procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas desde dímeros
hasta octámeros, conteniendo ambos tipos de enlaces, B y A. A
continuación se indican las señales m/z correspondientes a los
aductos sódicos [M+Na]^{+} de las proantocianidinas
detectadas.
Figura 5: Análisis por HPLC con columna de fase
inversa de la muestra obtenida en el ejemplo 2, con identificación
de picos cromatográficos correspondientes a dímeros y trímeros de
procianidinas de tipo B (m/z= 577 y 865, respectivamente),
dímeros y trímeros de procianidinas de tipo A (m/z= 575 y
863, respectivamente), dímeros y trimeros de propelargonidinas de
tipo B (m/z= 561 y 849, respectivamente), dímeros de
propelargonidinas de tipo A (m/z= 559), y dímeros de
prodelfinidinas de tipo A (m/z= 591).
La presente invención consiste en extractos
fenólicos de la piel (tegumento) de la almendra [Prunus
dulcis (Mill.) D.A. Webb, Prunus amygdalus (L.) Batsch.,
Amygdalus dulcis (Mill.), Amygdalus communis (L.) or
Prunus communis (L.)] caracterizados por contener
procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas. La piel de la
almendra es un subproducto agroalimentario de bajo coste por lo que
este procedimiento de obtención de extractos supondría una
valorización de dicho subproducto ya que se obtendrían productos de
mayor valor añadido. La piel podría emplearse tanto húmeda como
seca, separada del fruto por un proceso de escaldado y posterior
repelado, o por
tostación.
tostación.
Las procianidinas son polímeros formados
únicamente por (+)-catequina y/o
(-)-epicatequina. En cambio, las propelargonidinas
y prodelfinidinas son polímeros que contienen unidades de
(+)-afzelequina y/o
(-)-epiafzelequina -caso de las propelargonidinas- y
de (+)-galocatequina y/o
(-)-galoepicatequina -caso de las prodelfinidinas-,
pudiendo contener también unidades de (+)-catequina
y/o (-)-epicatequina. Las diferencias estructurales
entre (epi)catequina (dihidroxi-sustitución
en el anillo B) y (epi)afzelequina
(monohidroxi-sustitución en el anillo B) y
(epi)galocatequina (trihidroxi-sustitución
en el anillo B) justificarían posibles peculiaridades en las
propiedades/actividades fisiológicas de estos tres grupos de
proantocianidinas. Es de esperar, por tanto, que los extractos
conteniendo combinaciones de estos tres tipos de proantocianidinas
presenten propiedades diferentes, cuando no mejoradas, con respecto
a los productos comercializados actualmente y que contienen
únicamente procianidinas.
Otra característica estructural de las
proantocianidinas que determina sus propiedades/actividades
fisiológicas es el tipo de enlace (A ó B) entre las unidades
formadoras. La presente invención se refiere también a extractos de
piel de la almendra caracterizados por contener procianidinas,
propelargonidinas y prodelfinidinas de tipo A.
El contenido fenólico total del extracto se
determina por el método colorimétrico de Singleton V.L., Rossi J.A.
(1965) Colorimetry of total phenolics with
phosphomolibdicphosphotungstic acid reagent. Am J Enol Vitic
16, 144-158, que se basa en la oxidación en medio
básico de los grupos hidroxilos de los fenoles por el reactivo de
Folin-Ciocalteu. Los resultados se expresan como mg
de ácido gálico/g de extracto. De esta forma, los extractos
obtenidos siguiendo los procesos que a continuación se detallan
presentan un contenido fenólico total mínimo de 50 mg/g (5%).
Para confirmar que los extractos contienen los
tres tipos de proantocianidinas (procianidinas, propelargonidinas y
prodelfinidinas) unidas tanto por enlaces de tipo B ó A, se
realiza un análisis por espectrometría de masas, en concreto por
MALDI-TOF-MS
("matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass
spectrometry"). Para este análisis, el extracto se cristaliza en
una matriz sólida sobre la que incide el láser, que produce la
ionización de las moléculas contenidas en el extracto. Los iones
formados migran por el efecto de un campo eléctrico y lo hacen en
función de su relación masa/carga (m/z), lo que permite la
determinación de las masas moleculares de las sustancias contenidas
en el extracto. La energía de ionización baja y la eficacia de
transmisión alta hacen de esta técnica una de las más resolutivas
para el estudio de las proantocianidinas (Reed J.D., Krueger C.G.,
Vestling M.M. (2005) MALDI-TOF mass spectrometry of
oligomeric food polyphenols. Phytochemistry 66,
2248-2263).
En la tabla siguiente se indican las masas
monoisotópicas correspondientes a los aductos sódicos de las
procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas de tipo B y A
que se encontrarían en los extractos objeto de esta patente. La
asignación de la estructura a la masa observada [M+Na]^{+}
(m/z) se hace teniendo en cuenta el cálculo teórico:
m/z = 290.08*(CAT) + 274.08*(AFZ) + 306.07* (GAL) -
2.02* (B) -4.04* (A) + 22.99, donde CAT, AFZ y GAL
corresponden, respectivamente, al número de unidades de
(epi)catequina, (epi)afzelequina y
(epi)galocatequina que componen la molécula de
proantocianidina; B y A corresponden, respectivamente, al número de
enlaces de tipo B y A entre las unidades constitutivas. A modo de
ejemplo, a continuación, se recogen las señales m/z
correspondientes a procianidinas, propelargonidinas [hasta con 2
unidades de (epi)afzelequina] y prodelfinidinas [hasta con 2
unidades de (epi)galocatequina] con enlaces de tipo B y
A.
\vskip1.000000\baselineskip
Señales
MALDI-TOF-MS [M+Na]^{+}
(m/z)
Señales
MALDI-TOF-MS [M+Na]^{+}
(m/z)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Además del análisis MALDI-TOF,
los extractos se analizan por cromatografía líquida de alta
eficacia acoplada a espectrometría de masas (HPLC/MS) para separar
entre sí los distintos isómeros de los dimeros y trímeros de
procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas, tanto con
enlaces de tipo B como de tipo A. Dado que apenas existen patrones
comerciales de proantocianidinas, la identificación de los picos
cromatográficos se basa en su espectro de masas, que nos permite
conocer las unidades formadoras (sin bien sin distinguir entre
diasteroisómeros). La asignación de la estructura a la masa
observada [M-H]^{-} (m/z) se hace de
acuerdo a la siguiente expresión: m/z = 290.08*(CAT) +
274.08*(AFZ) + 306.07* (GAL) - 2.02* (B) -4.04* (A) - 1.01, donde CAT, AFZ y GAL corresponden, respectivamente, al número de unidades de (epi)catequina, (epi)afzelequina y (epi)galocatequina que componen la molécula de proantocianidina; B y A corresponden, respectivamente, al número de enlaces de tipo B y A entre las unidades constitutivas. A modo de ejemplo, a continuación, se recogen las señales m/z correspondientes a dímeros y trímeros de procianidinas, propelargonidinas, y prodelfinidinas con enlaces de tipo B y A.
274.08*(AFZ) + 306.07* (GAL) - 2.02* (B) -4.04* (A) - 1.01, donde CAT, AFZ y GAL corresponden, respectivamente, al número de unidades de (epi)catequina, (epi)afzelequina y (epi)galocatequina que componen la molécula de proantocianidina; B y A corresponden, respectivamente, al número de enlaces de tipo B y A entre las unidades constitutivas. A modo de ejemplo, a continuación, se recogen las señales m/z correspondientes a dímeros y trímeros de procianidinas, propelargonidinas, y prodelfinidinas con enlaces de tipo B y A.
\newpage
Señales ESI-MS
[M-H]^{-}
(m/z)
Algunos ejemplos de las estructuras químicas de
las proantocianidinas que se encontrarían en los extractos objeto
de esta patente se incluyen en la figura 1.
Para la cuantificación de las proantocianidinas
identificadas se utiliza un detector de fluorescencia operando en
condiciones específicas para
flavan-3-oles
(\lambda_{excitación}=280 nm, \lambda_{emisión}=310 nm). Los
contenidos de cada compuesto se expresan como mg de
(-)-epicatequina/g de extracto. De esta forma, los
extractos obtenidos presentan un contenido mínimo en monómeros,
dímeros y trímeros de proantocianidinas de 10 mg/g (1%).
El porcentaje de proantocianidinas de tipo A se
calcula dividiendo los contenidos de dímeros y trímeros de tipo A
entre los contenidos de los dímeros y trímeros de tipo A y B. De
esta forma, los extractos obtenidos presentan un porcentaje mínimo
de proantocianidinas de tipo A del 15%. Otro aspecto de la
invención es el procedimiento de obtención de los extractos
caracterizado porque se efectúan algunos de los siguientes
pasos:
- maceración del material vegetal con
disolventes
- purificación del extracto
- secado del extracto purificado.
Se parte de piel de almendra húmeda o seca
obtenida después del escaldado y posterior repelado, o después de
la tostación de la almendra. Si la muestra está seca, se puede
moler para reducir el tamaño. Para evitar posibles interferencias
de la grasa, la piel se puede desengrasar empleando disolventes
orgánicos (i.e., hexano).
La extracción se puede llevar a cabo con
metanol, etanol y agua puros o sus mezclas; a temperatura entre
25ºC y 100ºC, y de preferencia entre 50ºC a 70ºC; acidulado o no
con cualquier ácido de tipo inorgánico como por ejemplo HCl,
H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4} o cualquier ácido orgánico como
ácido acético, cítrico o alguna resina catiónica en forma
protonada. Se emplean sistemas habituales para las extracciones
sólido-líquido (incubador, reflujo, etc.),
pudiéndose emplear también un baño de ultrasonidos. El tiempo de
extracción puede estar comprendido según el tipo de equipo
utilizado entre 2 horas y 24 horas. Después de este tiempo, el
extracto líquido se separa del residuo sólido por centrifugación o
por prensado y/o filtración.
Una alternativa que acelera el proceso anterior
y reduce el volumen de líquido extractante, es la extracción con
líquidos sobrecalentados. El vehículo de extracción puede ser
también metanol, etanol y agua puros o sus mezclas, y acidulados o
no con los mismos ácidos comentados anteriormente. En este caso se
emplea un equipo extractor específico que permite utilizar líquidos
a elevadas temperaturas y presiones. Las condiciones de trabajo
serán presiones entre 500 psi y 3000 psi y temperaturas entre 60ºC
y 180ºC, con preferencia 100ºC a 140ºC. El tiempo de extracción con
líquidos sobrecalentados puede estar comprendido según las
condiciones empleadas entre 1 minuto y 6 horas.
En cuanto a la etapa de purificación del
extracto, uno de los métodos que se contemplan es la extracción con
disolventes orgánicos como acetato de etilo, acetona,
n-butanol, iso-propanol o sus
mezclas y acidulados con los mismos ácidos utilizados en el proceso
de extracción.
Otra alternativa es la purificación por
cromatografía de adsorción o intercambio fónico sobre resinas tipo
Dowex o Amberlite por elución en gradiente de alcoholes tipo
metanol o etanol entre 20% y 80% en alcohol.
El extracto se puede secar de diversas formas,
si bien se debe caracterizar por trabajar a temperaturas inferiores
a 40ºC. La liofilización, concentración y/o secado a vacío, secado
con aire, y atomización también se contemplan como formas de
secado.
En cuanto a sus propiedades, los extractos de
piel de almendra objeto de esta patente presentan capacidad
antioxidante, evaluada in vitro por el método ORAC
(capacidad de absorción de radicales de oxígeno) empleando
fluoresceína como sustancia fluorescente. Los antioxidantes
presentes en el extracto neutralizan los radicales peroxilo
generados por la descomposición térmica de AAPH, evitando así su
reacción con la fluoresceína. Los resultados se expresan como
mmoles de Trolox/g de extracto, siendo el Trolox un compuesto
sintético, análogo hidrosoluble de la vitamina E. El método ORAC es
uno de los recomendados para la medida de las propiedades
antioxidantes de alimentos y productos dietéticos, así como del
control de la calidad de los mismos (Prior R.L., Wu X., Schaich K.
(2005) Standardized methods for the determination of antioxidant
capacity of phenolics in foods and dietary supplements. J.
Agric. Food Chem. 53, 4290-4302).
Actualmente, se admite que el estrés oxidativo o
sobrecarga oxidativa está implicado en multitud de enfermedades
degenerativas, como el cáncer, la aterosclerosis, la enfermedad de
Alzheimer o el proceso mismo de envejecimiento. No obstante, los
mecanismos etiopatogénicos no se conocen completamente. Frente al
estrés oxidativo como causa de estas enfermedades, se considera que
una estrategia preventiva es la dieta rica en compuestos
antioxidantes, entre ellos, los compuestos fenólicos. Ahora bien,
el hecho de que un extracto presente buenas propiedades in
vitro no implica necesariamente que actúe como antioxidante
efectivo in vivo. Otros factores como biodisponibilidad,
metabolismo, interacciones entre nutrientes, etc. pueden
condicionar la actividad en el medio fisiológico de los compuesto/s
potencialmente bioactivos presentes en el extracto.
En cualquier caso, la metodología ORAC es una
buena aproximación experimental para la optimización de procesos
de obtención, control de calidad y comparativa entre extractos
potencialmente activos. A modo de referencia, podemos mencionar los
valores ORAC para algunos extractos fenólicos comerciales. Las
diferencias en la capacidad antioxidante entre productos se deben
no sólo a la fuente empleada, que determina las estructuras
fenólicas activas, sino también al proceso de obtención del
extracto.
\vskip1.000000\baselineskip
Monagas M.,
Hernández-Ledesma B., Garrido I.,
Martin-Alvarez P.J.,
Gómez-Cordovés C., Bartolomé, B.
(2005). Quality assessment of commercial dietary antioxidant
products from Vitis Vinifera 1. grape seeds. Nutr.
Cancer, 53, 244-254.
Monagas M.,
Hernández-Ledesma B.,
Gómez-Cordovés C., Bartolomé, B.
(2006). Commercial dietary ingredients from Vitis
vinifera L. leaves and grape skins: antioxidant and chemical
characterization. J. Agric. Food Chem., 54,
319-327.
Garrido I., Bartolomé B.,
Gómez-Cordovés C. (2007). Hydrophilic
and lipophilic antioxidant capacities of commercial dietary
antioxidant supplements. Ital. J. Food Sci., en prensa.
Los extractos objeto de esta patente presentan
una capacidad antioxidante similar o superior a la encontrada para
muchos de los extractos fenólicos comercializados en la actualidad.
En cualquier caso, estos extractos también pueden presentar otras
actividades/propiedades de interés para la industria alimentaria,
dietética, cosmética y farmacéutica que también se incluirían en
esta invención. Así, por ejemplo, es de esperar que los extractos
conteniendo procianidinas, propelargonidinas y prodelfinidinas de
tipo A presenten actividades descritas para moléculas aisladas como
la capacidad inhibitoria de la adhesión bacteriana en el tracto
urinario y cierta actividad seudo-insulina.
Estos extractos se podrían emplear como
ingredientes en alimentos, para la elaboración de suplementos
dietéticos y de cosméticos y en la fabricación de medicamentos.
Para una mejor compresión de la invención se
adjuntan dos ejemplos que no son limitantes en cuanto a su
aplicación.
Se utilizaron muestras de piel de almendra
desprendidas durante la tostación del fruto en un horno a escala
industrial. Las pieles se molieron. La muestra molida se desengrasó
con hexano. La muestra desengrasada se mezcló con metanol/HCl
(1000:1 v/v) y se mantuvo durante 15 min. en un baño de
ultrasonidos a 25ºC. Se dejó reposar 15 min., repitiéndose la
operación dos veces en total. Posteriormente la mezcla se
centrifugó. El sobrenadante se retiró y el residuo se extrajo de
nuevo 2 veces más. Se unieron los sobrenadantes correspondientes y
la mezcla se llevó a sequedad a baja presión en un rotavapor. El
residuo se redisolvió en 40 mL de agua destilada y se extrajo con
acetato de etilo. Las fases orgánicas se combinaron.
Posteriormente, el extracto se llevó a sequedad en rotavapor a una
temperatura inferior a 40ºC para obtener un extracto seco. El
contenido en polifenoles de este extracto #1 fue de 78,3 mg/g,
siendo el rendimiento del proceso del 2.1%.
Se llevó a cabo el análisis
MALDI-TOF del extracto empleando ácido
2,5-dihidroxibenzoico (ácido gentísico) como
matriz. Así, se comprobó que el extracto contenía procianidinas,
propelargonidinas y prodelfinidinas hasta heptámeros (Figura 2). De
igual forma, se comprobó que las procianidinas, propelargonidinas y
prodelfinidinas encontradas correspondían a ambos tipos, A y B
(Figura 2, ampliación para tetrámeros). A continuación se indican
las señales m/z correspondientes a los aductos sódicos
[M+Na]^{+} de las proantocianidinas detectadas:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1: Señales
MAI,DI-TOF-MS [M+Na]^{+}
(m/z)
\vskip1.000000\baselineskip
También se realizó un análisis por HPLC
empleando una columna de fase inversa Waters
Nova-Pak® C_{18} [300 mm x 3,9 mm (diámetro
interno); tamaño de partícula: 4 \mum] y aplicando un gradiente
de elución compuesto por agua/ácido acético (98:2, v/v) y
agua/acetonitrilo/ácido acético, (73:25:2, v/v/v) con un flujo de
1,0 mL/min Se inyectó un volumen de muestra de 75 \muL de una
solución del extracto 21 mg/ml en metanol/agua (50:50, v/v).
Por un lado, se empleó un detector de masas
cuadrupolar acoplado a una interfase de ionización por electrospray
(ESI) que permitió identificar algunos picos cromatográficos como
dímeros y trímeros de procianidinas de tipo B (m/z= 577 y
865, respectivamente) y dímeros y trímeros de procianidinas de tipo
A (m/z= 575 y 863, respectivamente) (Figura 3). No fue
posible la asignación de picos cromatográficos correspondientes a
otros tipos de compuestos detectados por el análisis
MALDI-TOF (i.e., propelargonidinas y
prodelfinidinas) debido posiblemente a la baja concentración de los
mismos y/o coelución entre ellos.
Dado que se disponían de patrones de dímeros y
trímeros de procianidinas tipo B previamente aislados de otras
plantas, fue posible la asignación de la estructura química de los
compuestos: B3
[(+)-catequina-(4\alpha\rightarrow8)-(+)-catequina],
B1
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-(+)-catequina],
B2
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequina],
B7
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow6)-(+)-catequina],
B5
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow6)-(-)-epicatequina]
y C1
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequi-
na-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequina]. Sin embargo, no fue posible la asignación de estructuras al resto de picos cromatográficos por la falta de disponibilidad de patrones.
na-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequina]. Sin embargo, no fue posible la asignación de estructuras al resto de picos cromatográficos por la falta de disponibilidad de patrones.
Por otro lado, empleando un detector de
fluorescencia, se determinó el área de los picos cromatográficos
correspondientes a los compuestos identificados y se calculó su
contenido empleando la curva de calibrado de la
(-)-epicatequina. A continuación, se indica los
contenidos de las proantocianidinas de tipo B y A identificadas en
el extracto de piel de almendra:
\vskip1.000000\baselineskip
Extracto #1:
composición
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido total en compuestos
flavan-3-oles fue de 18,25 mg/g,
expresados como (-)-epicatequina. De ellos, 7,27
mg/g se corresponden con dímeros y trímeros de proantocianidinas.
De este total de proantocianidinas, 1,39 mg/g se corresponden con
dímeros de tipo A, es decir, el 19,0% de proantocianidinas
identificadas presentan un enlace de tipo A.
También se determinó la capacidad antioxidante
del extracto siguiendo el método ORAC que evalúa la capacidad de
absorción de radicales de oxígeno. Este extracto #1 presentó una
buena capacidad antioxidante, siendo su valor ORAC de 3,0 mmoles de
Trolox/g.
La piel de almendra húmeda desprendida del
escaldado industrial del fruto se extrajo con etanol acidulado con
HCl a pH=3, manteniéndose a reflujo durante 4 horas a una
temperatura próxima a su punto de ebullición. La relación
piel/etanol acidulado fue de 1/10. La mezcla se prensó y se
separaron por filtración sobre malla fina de 0,2 mm los restos de la
piel del líquido extractivo. El líquido resultante se sometió a
secado bajo vacío a una temperatura inferior a 60ºC.
El extracto seco se resuspendió en agua
acidulada con HCl a pH=3, con una relación extracto/agua de 1/10.
El residuo seco insoluble se filtró sobre filtro de papel de poro
fino. El residuo sólido depositado sobre el filtro se lavó con agua
(pH=3), y se recuperó el líquido filtrado, añadiéndose al líquido
anterior.
El extracto de piel de almendra purificado y
disuelto en agua se cargó en una columna llena de resina Amberlita
XAD-7, lavada previamente con 5 volúmenes de etanol
y 5 volúmenes de agua destilada acidulada a pH=3. Después del paso
de todo el líquido de extracción se lavó la resina con 2 volúmenes
de columna de solución acuosa de etanol al 20% y tras comprobar que
no salía a través de la columna materia seca disuelta se eluyó el
material retenido con 5 volúmenes de una disolución etanol/agua
(60/40). Esta última fracción se secó bajo vacío a una temperatura
inferior a 40ºC. El contenido en polifenoles totales de este
extracto #2 fue de 264.6 mg/g, siendo el rendimiento del proceso
del 3.3%.
Se llevó a cabo el análisis
MALDI-TOF del extracto empleando ácido
2,5-dihidroxibenzoico (ácido gentísico) como
matriz. Así, se comprobó que el extracto #2 contenía procianidinas,
propelargonidinas y prodelfinidinas hasta octámeros (Figura 4). De
igual forma, se comprobó que las procianidinas, propelargonidinas y
prodelfinidinas encontradas correspondían a ambos tipos, A y B
(Figura 4, ampliación para tetrámeros). A continuación se indican
las señales m/z correspondientes a los aductos sódicos
[M+Na]^{+} de las proantocianidinas detectadas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Señales
MALDI-TOF-MS [M+Na]^{+}
(m/z)
\newpage
Señales
MALDI-TOF-MS [M+Na]^{+}
(m/z)
\vskip1.000000\baselineskip
También se realizó un análisis por HPLC
empleando una columna de fase inversa Waters
Nova-Pak® C_{18} [300 mm x 3,9 mm (diámetro
interno); tamaño de partícula: 4 \mum] y aplicando un gradiente
de elución compuesto por agua/ácido acético (98:2, v/v) y
agua/acetonitrilo/ácido acético, (73:25:2, v/v/v) con un flujo de
1,0 mL/min Se inyectó un volumen de muestra de 5 pL de una solución
del extracto de 43 mg/ml en metanol/agua (50:50, v/v).
Por un lado, se empleó un detector de masas
cuadrupolar acoplado a una interfase de ionización por electrospray
(ESI) que permitió identificar algunos picos cromatográficos como
dimeros y trímeros de procianidinas de tipo B (m/z= 577 y
865, respectivamente), dímeros y trimeros de procianidinas de tipo
A (m/z= 575 y 863, respectivamente), dímeros y trímeros de
propelargonidinas de tipo B (m/z= 561 y 849,
respectivamente), dimeros de propelargonidinas de tipo A
(m/z= 559) y dímeros de prodelfinidinas de tipo A
(m/z= 591) (Figura 5). No fue posible la asignación de picos
cromatográficos correspondientes a otros tipos de compuestos
detectados por el análisis MALDI-TOF (i.e., trimeros
de propelargonidinas y prodelfinidinas) debido posiblemente a la
baja concentración de los mismos y coelución entre ellos.
Dado que se disponían de patrones de dimeros y
trímeros de procianidinas tipo B previamente aislados de otras
plantas, fue posible la asignación de la estructura química de los
compuestos: B3
[(+)-catequina-(4\alpha\rightarrow8)-(+)-
catequina], B1
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-(+)-catequina],
B2
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequina],
B7
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow6)-(+)-catequina],
B5 [(-)-epicatequina-
(4\beta\rightarrow6)-(-)-epicatequina] y
C1
[(-)-epicatequina-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequi-
na-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequina]. Sin embargo, no fue posible la asignación de estructuras al resto de picos cromatográficos por la falta de disponibilidad de patrones.
na-(4\beta\rightarrow8)-(-)-epicatequina]. Sin embargo, no fue posible la asignación de estructuras al resto de picos cromatográficos por la falta de disponibilidad de patrones.
Por otro lado, empleando un detector de
fluorescencia, se determinó el área de los picos cromatográficos
correspondientes a los compuestos identificados y se calculó su
contenido empleando la curva de calibrado de la
(-)-epicatequina. A continuación, se indica los
contenidos de las proantocianidinas de tipo B y A identificadas en
el extracto de piel de almendra:
\newpage
Extracto #2:
composición
El contenido total en compuestos
flavan-3-oles fue de 114,02 mg/g,
expresados como (-)-epicatequina. De ellos, 53,39
mg/g se corresponden con dímeros y trímeros de proantocianidinas.
De este total de proantocianidinas, 11,40 mg/g se corresponden con
dímeros de tipo A, es decir, el 21,4% de proantocianidinas
identificadas presentan un enlace de tipo A.
También se determinó la capacidad antioxidante
del extracto siguiendo el método ORAC que evalúa la capacidad de
absorción de radicales de oxígeno. Este extracto #2 presentó una
buena capacidad antioxidante, siendo su valor ORAC de 12,1 mmoles
de Trolox/g.
Se partió de la misma muestra de piel de
almendra que en el ejemplo 2. También se empleó el mismo líquido
extractante (etanol acidulado con HCl a pH=3) pero se utilizó un
equipo extractor específico que permite utilizar líquidos a elevadas
temperaturas y presiones. Las condiciones de trabajo fueron 2000
psi de presión y 90ºC de temperatura, siendo el tiempo de
extracción de 30 min. El líquido resultante se sometió a secado
bajo vacío a una temperatura inferior a 60ºC. A partir de aquí se
operó de igual forma que en el ejemplo 2 y los análisis para la
caracterización del extracto y para la identificación de sus
componentes se realizaron del mismo modo, obteniéndose un extracto
sustancialmente equivalente al obtenido en el ejemplo 2.
Claims (20)
1. Extracto de piel de almendra [Prunus
dulcis (Mill.) D.A. Webb, Prunus amygdalus (L.) Batsch.,
Amygdalus dulcis (Mill.), Amygdalus communis (L.) o
Prunus communis (L.)] caracterizado por un contenido
fenólico > 50 mg/g (5%), por contener procianidinas,
propelargonidinas y prodelfinidinas y presentar capacidad
antioxidante.
2. Extracto de piel de almendra según la
reivindicación 1 caracterizado por contener por contener
dímeros y trímeros de proantocianidinas de tipo A en un porcentaje
> 15% referido al total de dímeros y trímeros de
proantocianidinas de tipo A y B.
3. Procedimiento para la obtención de un
extracto según cualquiera de las reivindicaciones
1-2 caracterizado porque comprende los
siguientes pasos:
- -a)
- preparación del material vegetal que contenga la piel ya sea tanto húmeda como seca, separada del fruto por un proceso de escaldado y posterior repelado, o por tostación, pudiendo estar molida en el caso de estar seca para reducir el tamaño; así mismo opcionalmente para evitar posibles interferencias de la grasa, la piel se puede desengrasar empleando disolventes orgánicos como el hexano.
- -b)
- extracción de la piel con disolventes orgánicos, bien por maceración (incubador, reflujo, baño de ultrasonidos, etc.) a temperatura entre 25ºC y 100ºC, o bien empleando extractores que utilizan líquidos sobrecalentados a temperatura entre 60ºC y 180ºC, y presiones entre 500 psi y 3000 psi;
- -c)
- purificación del extracto mediante extracción con disolventes y/o cromatografía de adsorción o intercambio fónico,
- -
- y, opcionalmente
- -d)
- secado del extracto purificado.
4. Procedimiento de obtención de extractos
según la reivindicación 3 caracterizado porque en la etapa
de maceración se emplean disolventes como metanol, etanol y agua
puros o sus mezclas, a temperatura entre 25ºC y 100ºC,
preferentemente entre 50ºC y 70ºC, y tiempo de extracción
comprendido entre 2 horas y 24 horas, separándose el extracto
líquido del residuo sólido por centrifugación o por prensado y/o
filtración.
5. Procedimiento de obtención de extractos
según la reivindicación 4 caracterizado porque en la etapa
de maceración se emplean disolventes acidulados con ácidos
inorgánicos del grupo de HCl, H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4},
ácidos orgánicos del grupo del ácido acético, ácido cítrico o
alguna resina catiónica en forma protonada.
6. Procedimiento de obtención de extractos
según la reivindicación 3 caracterizado porque en la etapa de
extracción se emplean líquidos sobrecalentados como vehículo de
extracción, que puede ser agua, metanol o etanol puros o sus
mezclas, bajo presión (500 psi a 3000 psi) y una temperatura desde
60ºC hasta 180ºC, preferentemente entre 100ºC y 140ºC, y tiempo de
extracción comprendido entre 1 minuto y 6 horas.
7. Procedimiento de obtención de extractos según
la reivindicación 3 caracterizado porque en la etapa de
purificación se realiza una extracción con disolventes orgánicos
como acetato de etilo, acetona, n-butanol,
iso-propanol o sus mezclas.
8. Procedimiento de obtención de extractos según
la reivindicación 7 caracterizado porque en la etapa de
purificación se emplean disolventes acidulados con ácidos
inorgánicos del grupo de HCl, H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4},
ácidos orgánicos del grupo del ácido acético, ácido cítrico o
alguna resina catiónica en forma protonada.
9. Procedimiento de obtención de extractos según
la reivindicación 3 caracterizado porque en la etapa de
purificación se emplea cromatografía de adsorción o intercambio
iónico sobre resinas tipo Dowex o Amberlite por elución en
gradiente de alcoholes tipo metanol o etanol entre 20% y 80% en
alcohol.
10. Procedimiento de obtención de extractos
según la reivindicación 3 caracterizado porque en la etapa
de secado se trabaja a temperaturas inferiores a 40ºC.
11. Procedimiento de obtención de extractos
según la reivindicación 3 caracterizado porque se emplea
liofilización, concentración y/o secado a vacío, secado con aire, o
atomización.
12. Procedimiento de obtención de extractos
según las reivindicaciones 3 a 11, caracterizado porque en
el procedimiento de obtención se efectúan los siguientes pasos:
- maceración del material vegetal con
metanol/HCl (1000:1, v/v)
- purificación del extracto por extracción con
acetato de etilo
- concentración a sequedad del extracto
manteniendo la temperatura por debajo de 40ºC.
13. Procedimiento de obtención de extractos
según las reivindicaciones 3 a 11, caracterizado porque en
el procedimiento de obtención se efectúan los siguientes pasos:
- maceración del material vegetal con
etanol/HCl(pH=3)
- purificación del extracto por cromatografía
en columna
- secado a vacío del extracto manteniendo la
temperatura por debajo de 40ºC.
14. Aditivo, ingrediente o suplemento
alimentario funcional caracterizado por comprender el
extracto de piel de almendra con actividad antioxidante según las
reivindicaciones 1 y 2.
15. Producto alimentario o bebida funcional
caracterizado por comprender el extracto de piel de almendra
con actividad antioxidante según las reivindicaciones 1 y 2.
16. Composición farmacéutica caracterizada por
comprender el extracto de piel de almendra con actividad
antioxidante y/o favorable para prevenir infecciones microbianas,
y/o actividad antiglucémica según las reivindicaciones 1 y 2.
17. Uso de aditivo, ingrediente o suplemento
alimentario funcional según la reivindicación 14 en la elaboración
de un producto alimentario funcional con actividad
antioxidante.
18. Uso de aditivo, ingrediente según la
reivindicación 14 en la elaboración de un producto cosmético con
actividad antioxidante.
19. Composición farmacéutica según la
reivindicación 16 para su uso en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de infeccione urinarias por su capacidad
inhibitoria de la adhesión bacteriana en el tracto urinario.
20. Composición farmacéutica según la
reivindicación 16 para su uso en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de la diabetes por su actividad antiglucémica
como seudoinsulina.
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