ES2311529T3

ES2311529T3 - Procedimiento para la identificacion de sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados por hiperpolarizacion.

Info

Publication number: ES2311529T3
Application number: ES01951152T
Authority: ES
Inventors: Hans-Willi Jansen; Andrea Bruggemann; Holger Heitsch; Heinz Gogelein
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-02-12
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2021-01-24
Also published as: EP1257819B1; DE50114193D1; ATE403864T1; US7550257B2; US6979532B2; WO2001059153A2; US20070231849A1; EP1257819A2; US20030082513A1; JP4782967B2; DE10006309A1; DK1257819T3; JP2003522533A; AU2001228488A1; WO2001059153A3

Abstract

Procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad de canales catiónicos activados por hiperpolarización, en el que a) se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización; b) las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio; y c) se registra el cambio del potencial de membrana de las células, después del aporte simultáneo de iones sodio y de la sustancia a estudiar.

Description

Procedimiento para la identificación de sustancias que modulan la actividad de canales de cationes activados por hiperpolarización.

Es un objeto de la presente invención, un procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad de canales catiónicos activados por hiperpolarización y el uso de este procedimiento.

Algunos de los genes de los canales catiónicos activados por hiperpolarización de múridos y de humanos ya se conocen, por ejemplo, muHCN2(muHAC1) (Ludwig y col. (1998)), huHCN4 (Ludwig y col. (1999)), huHCN2 (Vaccari, T. y col. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1446(3): 419-425), documentos de patente WO 99/32615 y WO 99/42574.

Ludwig y col. (1998) mostraban que muHCN2 se puede transfectar de forma transitoria en células HEK293 y que el canal correspondiente en las células transfectadas se puede examinar fácilmente mediante métodos electrofisiológicos (estudios con una abrazadera puntual, del inglés "Patch-Clamp"). Las propiedades electrofisiológicas del canal clonado se corresponden con la corriente I_{f} o I_{h}, descrita en las células de marcapasos que, hasta la fecha, no se conocían a nivel molecular (Ludwig y col. (1998), Biel y col. (1999)). El canal se activa cuando el potencial de retención cambia hacia hiperpolarización (potencial de aproximadamente -100 hasta -160 mV). Sin embargo, la técnica de "Patch-Clamp" no se puede automatizar y no es adecuada para un escrutinio de alto rendimiento HTS (del inglés, "High Throughput Screening").

Empleando colorantes adecuados, se pueden medir las corrientes iónicas en un FLIPR (lector de placas con formación de imágenes fluorescentes, del inglés "Fluorescence Imaging Plate Reader"; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). El flujo de entrada o de salida de los iones conduce a cambios en el potencial de membrana, los cuales se pueden medir con un FLIPR en un escrutinio de alto rendimiento, empleando colorantes fluorescentes adecuados. Sin embargo, en contraposición con el método de Patch-Clamp, en el FLIPR no se pueden generar cambios del voltaje. Los cambios de voltaje son, sin embargo, un prerrequisito esencial para la activación de los canales catiónicos activados por hiperpolarización. Para poder analizar el mayor número posible de sustancias, se desarrolló un procedimiento que hace posible un escrutinio de alto rendimiento para los moduladores de un canal catiónico activado por hiperpolarización.

En este contexto, un objeto de la presente invención era encontrar una vía para hiperpolarizar las células que expresan el canal catiónico activado por hiperpolarización (es decir, activar el canal catiónico activado por hiperpolarización) y mantener esta hiperpolarización de la célula. Bajo condiciones fisiológicas, una hiperpolarización de la célula que sea suficiente para activar un canal catiónico activado por hiperpolarización, se anula de nuevo por la actividad de ese canal. Sólo cuando se puede mantener la hiperpolarización, se podrá medir, por ejemplo con un FLIPR, la despolarización de la célula causada, bajo condiciones adecuadas, por una sustancia que modula la actividad del canal catiónico activado por hiperpolarización.

Es un objeto de la presente invención un procedimiento para examinar canales catiónicos activados por hiperpolarización, en donde células que expresan los canales catiónicos activados por hiperpolarización, se hiperpolarizan, es decir, el canal catiónico activado por hiperpolarización se activa, y esta hiperpolarización de las células, que se anula bajo condiciones fisiológicas por la actividad del canal catiónico activado por hiperpolarización, se mantiene. Añadiendo iones de sodio extracelulares, el canal HCN activado en el FLIPR, tiene la posibilidad de transportar iones sodio a las células y, de este modo, despolarizar las células. Si se añaden de forma simultánea o antes de aportar las sustancias con iones de sodio, que modulan la actividad de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, se potencia la despolarización comparando con cuando únicamente se añaden iones sodio en el caso de activadores de HCN (por ejemplo, forskolina) y se reduce en el caso de inhibidores de HCN (por ejemplo, zatebradina = 3-[3-[[2-(3,4-dimetoxifenil)-etil]-metilamino]-propil]-1,3,4,5-tetrahidro-7,8-dimetoxi-2H-3-benzazepin-2-ona, de Reiffen y col. (1990)).

Al medir la despolarización de las células o los cambios de su potencial de membrana, es posible identificar sustancias que modulan la actividad del canal catiónico activado por hiperpolarización.

Es un objeto de la presente invención un procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, en donde

a): se emplean células que expresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;

b): las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio; y

c): se registra el cambio del potencial de membrana de las células, después del aporte simultáneo de iones sodio y de la sustancia que se va a examinar.

b): las células se hiperpolarizan en presencia de un colorante fluorescente sensible al potencial, empleando un tampón iso-osmolar, exento de iones sodio;

c): las células se incuban con una sustancia que se va a examinar; y

d): el cambio en el potencial de membrana de las células se registra después de añadir iones sodio.

Para la función de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, por ejemplo, los canales HCN (HAC), es importante la presencia de iones potasio extracelulares, es decir, el tampón exento de iones sodio, iso-osmolar, contiene iones potasio (K^{+}) - p. ej., en forma de cloruro potásico - preferentemente al menos aproximadamente K^{+} 0,5 mM o K^{+} 0,8 mM, preferentemente 2 mM, especialmente preferido aproximadamente K^{+} 5 mM.

Preferentemente, el tampón exento de iones sodio, iso-osmolar contiene otro catión que no es capaz de atravesar la membrana, en cantidades que se corresponden con la concentración normal de iones sodio extracelular, p. ej., colina^{+}, por ejemplo, en forma de cloruro de colina o NMDG (N-metil-D-glucamina).

Preferentemente, el tampón iso-osmolar, exento de iones sodio comprende un colorante sensible al potencial, p. ej., una sustancia fluorescente sensible al potencial, p. ej., derivados de oxonol, tal como 3-bis-ácido barbitúrico oxonol. Preferentemente, se emplean colorantes fluorescentes sensibles al potencial que son adecuados para examinar el potencial de membrana de células no excitables, por ejemplo, colorantes sensibles al potencial, de respuesta lenta, p. ej., bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-trimetina oxonol [DiBAC_{4}(3)], bis-(1,3-ácido dietiltiobarbitúrico)-trimetina oxonol [DiSBAC_{2}(3)] o bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-pentametina oxonol [DiBAC_{4}(5)]. Otros colorantes sensibles al potencial, conocidos y adecuados, son los colorantes de respuesta rápida (la mayoría de tipo estirilpiridinio), que se pueden utilizar preferentemente con células excitables, tales como neuronas, células cardiacas, etc. Estos colorantes sensibles al potencial reaccionan en un intervalo de milisegundos y no son muy sensibles (2-10% de cambio de la fluorescencia por 100 mV de cambio de potencial). Por otro lado, se pueden emplear colorantes lentos, como p. ej., del tipo de la carbocianina, p. ej., DiOC5(3) yoduro de 3,3'dipentiloxacarbo-cianina, DiOC6(3) yoduro de 3,3'-dihexiloxacarbocianina, etc.), JC-1 (yoduro de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina) así como rodamina 123; estos colorantes lentos, sensibles al potencial son adecuados principalmente para estudios del potencial de la membrana de mitocondrias.

Una realización particular de la invención se refiere al uso del colorante fluorescente procedente del "equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" (del inglés, "FLIPR Membrane Potential Assay Kit" (Molecular Devices Sunnyvale, CA, EE.UU.). La fluorescencia de este colorante se puede medir empleando un filtro de emisión convencional, que es transparente entre 510 y 580 nm, pero preferentemente con un filtro que es transparente por encima de 550 nm. No se conoce qué colorante o qué combinación de colorantes subyacen tras este equipo de reactivos. El fabricante ofrece para su equipo de reactivos diversas ventajas frente a DiBAC_{4}(3):

1): La medición de potenciales de membrana con este equipo de reactivos no es termosensible, muy al contrario que con DiBAC_{4}(3), en el que la temperatura se tiene que equilibrar antes de la medición real en el FLIPR.

2): El volumen añadido en el FLIPR, puede ser superior al empleado en el caso de DiBAC_{4}(3), en donde generalmente todas las sustancias se tienen que añadir en forma diez veces concentrada.

3): Las mediciones se pueden realizar mucho más rápido, puesto que el equipo de reactivos requiere un tiempo mucho menor para alcanzar la situación de equilibrio que DiBAC_{4}(3), que requiere normalmente entre 10-30 minutos.

4): Para muchos protocolos de medición, una etapa de lavado antes de la adición del colorante, ya no es necesaria.

5): El colorante no tiene que estar presente en cada solución.

Entre estas ventajas, las dos primeras tienen importancia para los canales catiónicos activados por hiperpolarización, especialmente en FLIPR II, que permite la medición en placas de 384 pocillos y que se prefiere para el escrutinio de alto rendimiento, cuyo temple es complicado y requiere mucho tiempo. En el caso de sustancias poco solubles, es ventajoso además, si se pueden añadir a las células cinco, tres o incluso dos veces concentradas, en lugar de diez veces concentradas.

En el procedimiento se emplean preferentemente células que tienen una concentración intracelular de AMPc elevada. Esto se puede conseguir, p. ej., añadiendo derivados de AMPc que sean capaces de atravesar la membrana, p. ej., dibutiril-AMPc y 8-bromo-AMPc. Otra posibilidad de aumentar la concentración del AMPc intracelular, es añadir un activador de la adenilatociclasa, p. ej., la forskolina, preferentemente en concentraciones de 1 \muM-100 \muM o inferiores a 1 \muM de forskolina, se prefiere especialmente la forskolina aproximadamente 10 \muM. En principio, también es posible emplear todas las sustancias o ligandos que activen la adenilatociclasa mediante la transducción de una señal en la línea celular empleada (p. ej., ligandos para receptores \beta-adrenérgicos, como p. ej., la adrenalina, el isoproterenol, la noraderenalina, etc., si la célula tiene receptores \beta-adrenérgicos endógenos).

Para la despolarización del potencial de membrana, en el FLIPR se añade Na^{+} (normalmente en forma de NaCl) a las células que se han hiperpolarizado con el tampón exento de iones sodio, preferentemente hasta obtener una concentración final de Na^{+} de 20-100 mM, especialmente preferida es una concentración final de Na^{+} de 50 mM. En caso de emplear los equipos de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.), la concentración final de Na^{+} puede estar a su vez entre 20-100 mM, preferentemente entre 40 a 80 mM.

En particular, la invención se refiere a procedimientos en los que el canal catiónico activable por hiperpolarización, es un canal HCN1, HCN2, HCN3, HCN4 (siendo HAC1=HCN2, HAC2=HCN1, HAC3=HCN3 y HAC4=HCN4) o un canal KAT1 (=AKT) (canal de potasio activado por hiperpolarización procedente de Arabidopsis thaliana) o un heteromultímero de estos canales (es decir, un canal que se compone de subunidades de diferentes canales catiónicos activados por hiperpolarización) o un canal catiónico activado por hiperpolarización quimérico (es decir, un canal sintético en el que las subunidades aisladas están compuestas por partes de distintos canales o de canales catiónicos activados por hiperpolarización). El canal catiónico activado por hiperpolarización es preferentemente un canal catiónico humano activado por hiperpolarización, p. ej., huHCN2 (SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2) o huHCN4 (SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO.4) o un canal catiónico activado por hiperpolarización de múrido muHCN2 (SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6). A nivel de aminoácidos, la identidad entre muHCN2 y huHCN2 es del 94,8%.

En principio, el procedimiento es adecuado para todos los canales catiónicos que se activen por hiperpolarización, es decir, p. ej., para HCN1-4 (o HAC1-4; véase, Biel y col. 1999).

Las células son preferentemente células de mamífero, por ejemplo, células CHO o HEK293. Preferentemente, se emplea CHO u otra línea celular con un número de canales de potasio endógenos que está comparablemente igual de reducido, ya que estos canales de potasio endógenos, interfieren con las mediciones del FLIPR. También se pueden emplear células cuyos canales de potasio endógenos no se expresen funcionalmente (p. ej., las células con los genes correspondientes desactivados).

Preferentemente, las células contienen un ADN que codifica el canal catiónico activado por hiperpolarización, preferentemente, el ADNc de un canal catiónico activado por hiperpolarización en un plásmido adecuado. Preferentemente, las células se preparan de modo que la línea celular de partida se transfecta con un plásmido que contiene el ADNc del canal catiónico activado por hiperpolarización.

En el caso de canales catiónicos activados por hiperpolarización, se tienen que registrar los cambios en el potencial de membrana de las células, que son el resultado de la activación o de la inhibición de estos canales. Los tres ácidos bis-barbitúricos oxonoles (información procedente de: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6^{a} edición, Molecular Probes, Eugene OR, EE.UU.), a los que se hace referencia generalmente como colorantes DiBAC, forman una familia de colorantes sensibles al potencial, con una excitación máxima a 490 nm (DiBAC_{4}(3)), 530 nm (DiSBAC_{2}(3)) y 590 nm (DiBAC_{4}(5)). Los colorantes entran en las células despolarizadas, uniéndose a proteínas o a membranas intracelulares, produciendo un incremento de la fluorescencia y un desplazamiento al rojo. La hiperpolarización produce la expulsión de los colorantes aniónicos y, de este modo, una disminución de la fluorescencia. Esta disminución de la fluorescencia se puede medir, p. ej., con el dispositivo de medición de FLIPR.

El FLIPR (del inglés: "Fluorescent Imaging Plate Reader", lector de placas con formación de imagen fluorescente; Fabricante: Molecular Devices, Sunnyvale CA, EE.UU.) es un dispositivo de medición con el que se pueden medir simultáneamente los cambios de la intensidad de la fluorescencia, en todos los pocillos de una placa de microtitulación. La excitación de los colorantes empleados tiene lugar a 488 nm con un láser de argón integrado en el sistema. El filtro de emisión convencional del sistema es transparente en el intervalo de 510 - 580 nm. La fluorescencia emitida se registra empleando una cámara CCD y el sistema permite el registro simultáneo, dentro de un intervalo mínimo de aproximadamente un segundo, de la fluorescencia en todos los pocillos de una placa de microtitulación con 96 o con 384 pocillos. Empleando un sistema de pipeteo incorporado en el mismo, se puede determinar la fluorescencia incluso durante la adición de la sustancia, lo que puede ser beneficioso, por ejemplo, en el caso de procesos rápidos. Por medio de una óptica especial, se puede registrar la fluorescencia en una capa aproximadamente de sólo 50 \mum, pero no en el pocillo completo. Esto es beneficioso para la reducción del ruido de fondo en todas las mediciones en las que el colorante fluorescente también está presente extracelularmente, como p. ej., también en el caso de mediciones de cambios en el potencial de la membrana empleando colorantes del tipo DiBAC. Aplicaciones convencionales del sistema, son mediciones de la concentración de calcio intracelular o del potencial de membrana de las células.

Entre los colorantes mencionados anteriormente, DiBAC_{4}(3) muestra la mayor sensibilidad hacia diferencias del voltaje, debido a que su máximo de excitación es el más adecuado para el láser de argón en el FLIPR.

Ya que la fluorescencia de DiBAC_{4}(3) puede reaccionar de forma sensible a los cambios de temperatura, se mide lo más rápido posible, preferentemente después de un tiempo de incubación determinado a 37ºC, p. ej., después de 30 minutos, ya que debido a un enfriamiento de la solución del colorante, se puede alterar el resultado de la medición. Preferentemente, antes de comenzar la medición se realiza una fase de incubación previa durante cinco minutos, para equilibrar los cambios de temperatura en la placa de microtitulación. La medición se realiza con los parámetros de temperatura (aproximadamente 37ºC) predeterminados por el fabricante del FLIPR, para la medición de potenciales de membrana.

Preferentemente, el volumen de la solución de la reacción en la que se realiza el proceso, se cambia lo menos posible (en el FLIPR), ya que la capacidad para reproducir la señal de DiBAC_{4}(3) es la mejor cuando en el FLIPR tienen lugar cambios de volumen relativamente reducidos. Preferentemente, las sustancias que se van a someter a ensayo se añaden por tanto diez veces concentradas a las células teñidas con DiBAC_{4}(3).

Ya que la medición de la fluorescencia con "el equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" no es sensible a la temperatura, se puede realizar simplemente a temperatura ambiente, lo que es especialmente ventajoso para el FLIPR II, con el que se pueden realizar mediciones de placas de microtitulación con 384 pocillos.

Otra ventaja del "equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" frente a DiBAC_{4}(3) es que no se tienen que añadir las sustancias diez veces concentradas.

Los canales de HCN se activan mediante hiperpolarización (p. ej., HCN2 a -100 mV hasta 50%) y causan una despolarización de las células. Incrementando la concentración intracelular de AMPc (p. ej., con dibutiril-AMPc o con forskolina) se puede desplazar el valor de la actividad semi-máxima aproximadamente 10 mV, a potenciales más positivos (Ludwig y col., 1998).

Electrofisiológicamente, los canales de HCN se pueden estudiar fácilmente sobre células transfectadas de forma estable, empleando el método de abrazadera puntual, "Patch-Clamp".

Por el contrario, en el FLIPR no es posible inducir cambios del voltaje y por ello, debido a la actividad de HCN, una hiperpolarización de las células sólo sería transitoria. No ha sido posible conseguir una hiperpolarización de las células transfectadas, añadiendo un inhibidor de HCN2 (zatebradina), puesto que el potencial de membrana de reposo de las células transfectadas está demasiado alejado de los potenciales con los que HCN2 está activado.

Por un lado, la hiperpolarización es necesaria para la activación de HCN, pero por otro lado, bajo condiciones fisiológicas, un HCN activado conduce inmediatamente a una despolarización. Por tanto, en la presente invención se proporcionan unas condiciones bajo las cuales se pueden activar los canales de HCN mediante hiperpolarización, pero que bajo las cuales es inicialmente imposible una despolarización mediante el canal de HCN activado. Para ello, las células sembradas en las placas de microtitulación se lavan en un tampón iso-osmolar en el que el NaCl se reemplaza por cloruro de colina. Este tampón de lavado contiene todavía KCl 5 mM, ya que el K^{+} extracelular es necesario para la actividad de HCN (Biel y col. 1999). Este tampón de lavado, que sirve para la hiperpolarización de las células HCN, contiene a la vez DIBAC_{4}(3) 5 \muM, para medir los cambios del potencial de membrana en el FLIPR. Al eliminar el Na^{+} extracelular, las células se hiperpolarizan, es decir, el HCN también se activa. Sin embargo, el HCN no puede provocar una despolarización de las células, ya que faltan los gradientes de concentración necesarios de los iones Na^{+} o K^{+} transportados por HCN. Un HCN activado sólo podría ahora conducir a una hiperpolarización más pronunciada. Esto se refleja en el hecho de que la fluorescencia inicial medida para las células HCN en el FLIPR, con forskolina 10 \muM, es menor que la que se obtiene sin forskolina, mientras que en las células no transfectadas no hay diferencia.

En el FLIPR se añade Na^{+} a las células, de modo que el HCN activado (después de unos segundos en los que hay unos efectos mezclados) provoca una despolarización de las células, a partir de aproximadamente 15 segundos después de la adición de Na^{+}, la cual se vuelve visible por un incremento de la fluorescencia. La detección de moduladores de HCN depende de una diferencia clara entre las células con un canal de HCN activo (sólo adición de Na^{+}) y células con un canal de HCN bloqueado (Na^{+} + CsCl 8 mM). Una activación del canal de HCN mediante una incubación previa con forskolina 10 \muM, aumenta claramente la diferencia entre el valor al 100% sin inhibición y el valor al 0% con inhibición (véase, la Figura 1).

Una realización especial de la invención se refiere a la determinación comparativa del cambio en el potencial de la membrana de al menos dos poblaciones celulares que se incuban con concentraciones diferentes de una de las sustancias que se va a examinar.

Las sustancias cuya actividad se va a examinar que se denominan sustancias que se van a someter a ensayo, y que son activas, es decir que modulan la actividad del canal catiónico activado por hiperpolarización, pueden ser inhibidoras (inhiben el canal y reducen la despolarización o la evitan totalmente) o ser activadoras (activan el canal y producen una despolarización más pronunciada o más rápida) del canal catiónico activado por hiperpolarización.

El procedimiento se puede emplear en el escrutinio de alto rendimiento (HTS) para identificar inhibidores y/o activadores de un canal catiónico activado por hiperpolarización. Se pueden emplear sustancias identificadas de este modo como compuestos farmacéuticamente activos, por ejemplo, en una forma farmacéuticamente aceptable.

Un procedimiento para la preparación de un medicamento comprende la identificación de una sustancia cuya actividad inhibe o activa un canal catiónico activado por hiperpolarización y finalmente la mezcla de la sustancia identificada, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, un procedimiento para la preparación de un medicamento comprende

a): la identificación de una sustancia que modula la actividad de canales catiónicos activables por hiperpolarización;

b): la preparación de la sustancia;

c): la purificación de la sustancia; y

d): la mezcla de la sustancia con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También es objeto de la invención un equipo de reactivos para ensayos, para determinar si una sustancia modula la actividad de un canal catiónico activable por hiperpolarización, que comprende

a): células que hiperexpresan un canal catiónico activado por hiperpolarización;

b): un tampón iso-osmolar exento de iones sodio, para la hiperpolarización de la célula y

c): reactivos para la detección.

Como medida de la actividad de una sustancia, se mide el cambio del potencial de membrana de la célula, preferentemente con ayuda de un colorante fluorescente sensible al potencial, p. ej., con un derivado de oxonol, preferentemente, ácido 3-bis-barbitúrico oxonol.

Una realización especial de la invención se refiere a la medición del potencial de membrana en un lector de placas con formación de imágenes fluorescentes (FLIPR).

Figuras

Fig. 1: La Figura muestra el curso del tiempo de la fluorescencia medida como valor medio de cada uno de los 24 pocillos. Para poder distinguir claramente el curso del tiempo entre 60 y 290 segundos, la fluorescencia, medida en cada pocillo (la suma de los grados de luminosidad en un número constante de píxel en un pocillo concreto y en todos los pocillos) con ayuda del programa del FLIPR, a los 60 segundos (se corresponde con 40 segundos después de la adición de Na^{+}), se definió como "0". Las curvas A y B se obtuvieron con células que durante la tinción contenían forskolina 10 \muM en el medio de tinción; C y D son curvas de células que no recibieron forskolina. En A y C se añadió NaCl en el FLIPR, hasta tener una concentración final de 50 mM, mientras que B y D recibieron adicionalmente CsCl 8 mM para inhibir el canal HCN2. Con el programa del FLIPR, se definieron los valores de la curva A (con forskolina; NaCl 50 mM + CsCl 8 mM) como testigos negativos. Las curvas B, C y D representan los cambios de la fluorescencia en relación con el curso de la curva A. En el caso de la curva B (con forskolina; sin inhibición con CsCl) se observa en contraposición con A, una clara despolarización. Las células que no se habían incubado previamente con forskolina, pero que con la adición de NaCl, recibieron simultáneamente CsCl 8 mM (curva C), muestran, en comparación con la curva A, un curso descendente. Por ello se puede reconocer que la forskolina en este ensayo también influye sobre el potencial de membrana de las células, independientemente del canal HCN2 expresado. En contraposición a la curva C, la curva D (sin forskolina, sin inhibición con CsCl) muestra también de nuevo una clara despolarización. Ya que la distancia entre las curvas A y B, en el intervalo de tiempo a partir de 60 segundos, es siempre mayor que la distancia entre las curvas C y D, se puede observar que la forskolina activa el canal HCN2 expresado.

Fig. 2: La Figura muestra el efecto de la zatebradina sobre el curso de la fluorescencia. En esta Figura, todas las células recibieron forskolina 10 \muM durante la tinción. La curva A muestra el curso sin inhibición (sólo NaCl 50 mM), la curva E el curso inhibido con CsCl (NaCl 50 mM + CsCl 8 mM), las curvas B-D la influencia de zatebradina: B: 12,5 \muM, C: 25 \muM y D: 50 \muM. Las curvas A y E representan cada valor medio de los valores medidos en 12 pocillos, las curvas B, C y D en 6 pocillos. Los valores medidos con la adición de CsCl 8 mM (curva E) se definieron como testigos negativos, de modo que las curvas A-D reflejan el cambio relativo en relación con la curva E. Se observa claramente que la despolarización que aparece después de añadir NaCl, disminuye con una concentración creciente de zatebradina. A partir de los valores de la fluorescencia medida en el FLIPR, se pudo calcular el valor CI_{50} para la zatebradina (26 \muM), después de exportar a Excel.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de células transfectadas

El plásmido pcDNA3-muHCN2 contiene ADNc de HCN2 (muHCN2) de múrido (nº de entrada en Genbank: AJ225122) desde la posición 22-2812 (secuencia codificadora: pos. 36-2627), clonado dentro de los sitios de corte de EcoRI y Notl de pcDNA3, y se obtuvo gracias a M. Biel, TU Munich (Ludwig y col., 1998). En cada caso, se emplearon 6 \mug de este ADN plasmídico para transfectar las células CHO o HEK293. Para transfectar las células CHO o HEK, se empleó el reactivo LipofectAmine^{R} de la Firma LifeTechnologies (Gaithersburg, MD, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se transfirieron desde las placas de cultivo a frascos para cultivos celulares de 75 cm^{2}. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se sometieron a selección con 400 \mug/ml del antibiótico G418 (Calbiochem, Bad Soden, Alemania). Después de seleccionar durante dos semanas, las células supervivientes se desprendieron de los frascos, empleando tripsina-EDTA, se contaron en un contador de células Coulter Z1 y se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos de modo que estadísticamente tenía que estar presente 1 célula por pocillo. Las placas de microtitulación se controlaron regularmente con microscopio y únicamente se continuaron cultivando las células que procedían de pocillos en los que sólo crecía una colonia.

A partir de esas células, se aisló el ARN total con ayuda de los equipos de reactivos QlAshredder y RNeasy de la Firma Qiagen (Hilden, Alemania). Este ARN total se examinó con RT-PCR en busca de expresión de muHCN2 (cebador 1): 5'- GCCAATACCAGGAGAAG -3' [SEQ ID NO. 7], se corresponde con la pos. 1354-1370 en AJ225122, y el cebador 2: 5'-TGAGTAGAGGCGACAGTAG -3' [SEQ ID NO. 8], se corresponde con la pos. 1829-1811 en AJ225122; banda esperada con RT-PCR: 476 pb.

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Ejemplo 2

Examen de las células con abrazadera puntual (Patch Clamp)

Con el método de Patch-Clamp se examinaron electrofisiológicamente las células con expresión de ARNm detectable, en la configuración de célula completa, para estudiar la expresión funcional de muHCN2. Este método ha sido descrito detalladamente por Hamill y col. (1981). Las células se fijaron a un potencial de retención de -40 mV. Partiendo de este potencial de retención, se activaron los canales iónicos mediante un cambio del voltaje a -140 mV, durante un segundo. La amplitud de la corriente se determinó al final de este impulso. Entre las células HEK transfectadas, se encontraron algunas que tenían corrientes de aproximadamente 1 nA, pero debido a las corrientes endógenas que interferían, no fue posible construir un ensayo para estas células en el FLIPR.

Sin embargo, en las células HEK, se encontró claramente que un canal HCN2 funcionalmente activo sólo era detectable en células que tenían una expresión pronunciada del ARNm. En las células CHO, la correlación entre la expresión del ARNm y la función se confirmó. En general, la expresión del ARNm en las células HEK era aproximadamente tres veces mejor que en las células CHO. En los estudios de Patch-Clamp fue posible mostrar una corriente débil en algunas células de una de las líneas celulares de CHO con expresión más pronunciada.

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Ejemplo 3

Preparación de células doblemente transfectadas

Ya que la expresión funcional parecía estar fuertemente correlacionada con la expresión del ARNm, realizamos una segunda transfección con el ADNc de muHCN2 que se había insertado previamente por clonación, en el sitio de EcoRI y Notl del vector pcDNA3.1 (+)zeo. Después de seleccionar durante dos semanas con G418 y zeocina (Invitrogen, Groningen, NL), se aislaron los clones de células aisladas, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. Después de aislar el ARN total a partir de estas células, se realizó en primer lugar una RT-PCR con los cebadores mencionados en el Ejemplo 1 y a continuación una RT-PCR con los siguientes cebadores que comprenden una región que contiene el extremo 3' de la secuencia codificadora de muHAC1 (cebador 3: 5'- AGTGGCCTCGACCCACTGGACTCT -3' [SEQ ID NO. 9], se corresponde con la pos. 2553-2576 en AJ225122, y el cebador 4: 5'- CCGCCTCCTAAGCTACCTACGTCCC -3' [SEQ ID NO. 10], se corresponde con la pos. 2725-2701 en AJ225122;

Algunas de estas células transfectadas doblemente mostraban una expresión considerablemente más pronunciada en la RT-PCR y en el análisis "Patch-Clamp", que las células que se habían transfectado sólo una vez. Electrofisiológicamente se midieron corrientes de hasta 11 nA. Estas células se emplearon para construir un ensayo con FLIPR para HCN2.

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Ejemplo 4

Construcción de un ensayo con FLIPR para los canales HCN

Las células sembradas en las placas de microtitulación se lavaron en un tampón iso-osmolar en el que se había sustituido el NaCl por cloruro de colina. Este tampón de lavado contiene todavía KCl 5 mM, ya que el K^{+} extracelular es necesario para la actividad de HCN (Biel y col. 1999). Este tampón de lavado, que sirve para la hiperpolarización de las células HCN, contiene a la vez DIBAC_{4}(3) 5 \muM para medir los cambios del potencial de membrana en el FLIPR. Al eliminar el Na^{+} extracelular, las células se hiperpolarizan, es decir el canal HCN también se activa. Sin embargo, el HCN no puede provocar una despolarización de las células, ya que faltan los gradientes de concentración necesarios de los iones Na^{+} o K^{+} transportados por los canales HCN. Un HAC activado podría dar ahora como resultado a lo sumo una hiperpolarización más pronunciada. Esto se refleja de nuevo en el hecho de que la fluorescencia inicial medida en las células HAC en el FLIPR con forskolina 10 \muM, es menor que la que se obtiene sin forskolina, mientras que en las células no transfectadas no hay diferencia.

Puesto que la fluorescencia de DiBAC_{4}(3) puede ser sensible a las variaciones de temperatura, la medición se realiza lo más rápido posible después de una incubación a 37ºC durante 30 minutos; un enfriamiento de la solución de tinción puede afectar a los resultados de la medición. Preferentemente, antes de la medición, la muestra se somete a una fase de cinco minutos de regulación de la temperatura en el FLIPR.

Las sustancias que se van a someter a ensayo se añaden preferentemente en una forma 10 veces concentrada, a las células que se han teñido con DiBAC_{4}(3).

En el FLIPR se añade Na^{+} a las células de modo que el HCN activado (después de unos segundos en los que hay unos efectos mezclados) provoca una despolarización de las células, a partir de aproximadamente 15 segundos después de la adición de Na^{+}, las cuales se vuelven visibles por un incremento de la fluorescencia. La detección de moduladores de HCN depende de una diferencia clara entre las células con un canal de HCN activo (sólo adición de Na^{+}) y células con un canal de HCN bloqueado (Na^{+} + CsCl 8 mM). Una activación del canal de HCN mediante una incubación previa con forskolina 10 \muM, aumenta claramente la diferencia entre el valor al 100% sin inhibición y el valor al 0% con inhibición (véase, la Figura 1). En comparación con los valores testigos, se puede detectar si una sustancia que se va a someter a ensayo es un activador (despolarización más rápida o más pronunciada) o un inhibidor (despolarización más lenta o inhibida, véase la Fig. 2: efecto de la zatebradina).

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Ejemplo 5

Determinación del valor CI50 de un bloqueador de HCN2

Empleando las células HCN transfectadas, se examinó el efecto de diversas concentraciones de la sustancia zatebradina, que se conoce como bloqueadora de l_{f} (véase la Fig. 2). La inhibición con zatebradina se calculó por el cambio relativo de la fluorescencia a partir de 60 segundos. Para cada concentración del inhibidor, se determinó el valor promedio en cada uno de los 6 pocillos de la placa de microtitulación. A partir de esos valores, se calculó el valor CI50 de la zatebradina de 26 \muM, un valor que se corresponde bien con el valor 31 \muM determinado electrofisiológicamente en las mismas células.

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Ejemplo 6

Uso del "equipo de reactivos para el ensayo de la membrana con FLIPR" (Molecular Devices, Sunnyvale, EE.UU.)

Las células sembradas el día anterior, se lavaron como anteriormente, tres veces en cada caso con 400 \mul de tampón de lavado por pocillo. Sin embargo, esta vez, el volumen que permanece por encima de las células, después de la última etapa de lavado, se escoge dependiendo de las concentraciones deseadas de Na^{+} y Cs^{+}. El colorante se añade al tampón de lavado y las células se incuban con el colorante durante 30 minutos a temperatura ambiente o a 37ºC, pero preferentemente a temperatura ambiente.

En el FLIPR, la despolarización se induce a continuación por adición de Na^{+} y en algunos pocillos testigos se inhibe de nuevo mediante la adición simultánea de Cs^{+}.

Puesto que en el colorante de Molecular Devices, un incremento de la fuerza iónica puede conducir a cambios en la fluorescencia, se tiene que asegurar que la fuerza iónica varíe en todos los pocillos de una placa de microtitulación del mismo modo. Permitiendo las concentraciones finales de iones sodio o cesio, se intenta no variar la osmolaridad. Para ajustar las concentraciones deseadas de Na+ y Cs+, se emplean otros dos tampones además del tampón de lavado que en lugar de cloruro de colina 140 mM, contienen NaCl 140 mM (tampón fosfato) o CsCl 140 mM CsCl (tampón de cesio).

Para las mediciones con el "equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR", Molecular Devices proporciona el siguiente protocolo estándar para placas de microtitulación de 96 pocillos (384 pocillos entre paréntesis): un día antes de la medición, las células se siembran en 100 \mul (25 \mul) de medio. Después de añadir 100 \mul (25 \mul) de colorante y 30 minutos de incubación a temperatura ambiente o a 37ºC; se añaden en el FLIPR 50 \mul (25 \mul) de la sustancia que se va a someter a ensayo en un tampón adecuado.

Empleando los volúmenes indicados por Molecular Devices, es posible sin cambiar la fuerza iónica, conseguir una concentración máxima de 28 mM para Na^{+} + Cs^{+} en placas de 96 pocillos y de 46,7 mM en placas de 384 poci-
llos.

Puesto que esta concentración, en particular en placas de 96 pocillos, es demasiado baja para obtener una actividad óptima de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, diferentes volúmenes se sometieron a ensayo para las etapas individuales.

Se ha observado que las concentraciones de colorante se pueden reducir a la mitad de las que se indican en el protocolo de Molecular Devices.

En las placas de 96 pocillos, se obtuvieron buenos resultados incluso con los siguientes volúmenes: 45 \mul de material sobrenadante del tampón de lavado sobre las células, 60 \mul de colorante en el tampón de lavado, 195 \mul de volumen de adición en el FLIPR.

Un volumen de adición tan elevado, permite una concentración máxima de Na^{+} + Cs^{+} de 91 mM, es decir, con CsCl 8-10 mM, la concentración final de NaCl puede ser 81-83 mM. Para Na^{+} 80 mM y Cs^{+} 8 mM se requieren 6,43 \mul de tampón de lavado, 171,43 \mul de tampón de sodio y 17,14 \mul de tampón de cesio, basándose en un volumen de adición de 195 \mul.

Materiales y métodos 1. Soluciones y tampones para la medición con DiBAC_{4}(3)

A:: DiBAC_{4}(3) bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-trimetina oxonol

\quad: Firma Molecular Probes, nº de cat. B-438, PM: 516,64 g/mol

\quad: Se prepara una solución base 10 mM de DIBAC_{4}(3) en DMSO (25 mg de DIBAC_{4}(3)/4,838 ml de DMSO). Se almacenan partes alícuotas de esta solución base a -20ºC. Concentración final durante la tinción y la adición: 5 \muM

B:: Forskolina, PM: 410,5 g/mol. Concentración final durante la tinción: 10 \muM.

\quad: Se almacenan partes alícuotas de una solución base 10 mM en DMSO a -20ºC

C:: Tampón de lavado: (cloruro de colina 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M KOH ajustado a pH 7,4).

D:: Solución de pre-impregnación para saturar las puntas de las pipetas: como el tampón de lavado + DIBAC_{4}(3) 10 \muM

\quad: ¡Esta solución sólo se emplea para la placa de pre-impregnación!

E:: Solución de la tinción: concentrada doblemente, es decir, tampón de lavado + DIBAC_{4}(3) 10 \muM + forskolina 20 \muM.

F:: solución 10 veces concentrada para la placa de adición: NaCl 500 mM en H_{2}O + DIBAC 5 \muM

\quad: Todas las sustancias se añaden a esta solución 10 veces concentradas.

\quad: Testigo positivo (concentración final): NaCl 50 mM

\quad: Testigo negativo (concentración final): NaCl 50 mM + CsCl 8 mM

2. Soluciones y tampones para medir con el "equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" de Molecular Devices

A:: "Equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR",

\quad: Firma Molecular Probes, nº de cat. R8034

B:: Tampón de lavado: (cloruro de colina 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M ajustado a pH 7,4)

C:: Tampón de la coloración: (contenido de una de las "ampollas de reactivo" del " equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" en 10 ml de tampón de lavado)

D:: Tampón de sodio: (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M ajustado a pH 7,4)

E:: Tampón de cesio: (CsCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, con KOH 1 M ajustado a pH 7,4)

3. Operaciones del cultivo celular

Las células CHO transfectadas con muHCN2 se sembraron un día antes de la medición, con una densidad de 35.000 células/pocillo, en cada caso en 200 \mul de medio completo, en placas de microtitulación de 96 pocillos negras. Las células se incubaron durante una noche a 37ºC y 5% de CO_{2}.

4. Tinción con DiBAC_{4}(3) y medición en el FLIPR

Antes de la tinción, las células se lavaron tres veces con 400 \mul de tampón de lavado. Después de la última etapa de lavado permanece un volumen residual sobre las células de 90 \mul de tampón de lavado/pocillo.

Las células lavadas (con 90 \mul de tampón de lavado/pocillo) se incuban en cada caso con 90 \mul de solución de tinción/pocillo durante 30 minutos a 37ºC, en una incubadora con CO_{2}. Después de este tiempo de incubación, las placas celulares se miden en el FLIPR a aproximadamente 37ºC (ajuste de la temperatura determinada por el fabricante de FLIPR, para las mediciones del potencial de membrana con DiBAC_{4}(3)), inmediatamente después o después de una fase de templado de cinco minutos.

La imagen instantánea (fluorescencia inicial antes del inicio de la medición), debe tener un valor promedio de aproximadamente 35.000 unidades. El FLIPR se puede determinar como máximo hasta aproximadamente 65.000 unidades.

Cuando el programa comienza, las puntas de las pipetas se saturan inicialmente mediante inmersión en una solución de preimpregnación con DiBAC_{4}(3). Después de esta etapa, comienza la medición real con la primera medición (t = 0 segundos). Puesto que DiBAC_{4}(3) es un colorante que reacciona lentamente, es suficiente determinar la fluorescencia en los pocillos de la placa de microtitulación cada 5 segundos. Después de 20 segundos, las sustancias que están presentes en la placa de adición en forma 10 veces concentrada, se añaden simultáneamente a la placa de microtitulación empleando un sistema de pipeteo. Ya que el volumen después de la tinción es de 180 \mul, se añaden 20 \mul a cada pocillo. La medición de la fluorescencia se puede terminar después de aproximadamente 5 minutos. Para la evaluación, se examina el cambio en la fluorescencia en el intervalo en el que es lineal y en el que las células transfectadas con HCN-2 sin inhibir difieren significativamente de las células inhibidas.

5. Tinción con el "equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" y medición en el FLIPR. Antes de la tinción, se lavan las células tres veces con 400 \mul de tampón de lavado. Después de la última etapa de lavado permanece un volumen residual sobre las células de 45-90 \mul de tampón de lavado/pocillo

Después de añadir la solución de la tinción (el volumen depende de las concentraciones finales deseadas), las muestras se incuban a temperatura ambiente (preferida) o a 37ºC, durante 30 minutos en un incubador con CO_{2}. Después de este tiempo de incubación, la placa celular se mide a temperatura ambiente en el FLIPR.

La imagen instantánea (la fluorescencia inicial antes del comienzo de la medición) puede ser en el caso del "equipo de reactivos para el ensayo del potencial de membrana con FLIPR" menor que durante la medición con DiBAC_{4}(3), ya que el equipo de reactivos para el ensayo es más sensible a los cambios en el potencial de membrana que DiBAC_{4}(3). Debido a la alta sensibilidad que se puede conseguir, la medición debería realizarse, siempre que sea posible (FLIPRII), empleando un filtro de emisión que sea transparente a la luz por encima de 550 nm. Sin embargo, también es posible realizar las mediciones empleando el filtro convencional que es transparente entre 510 y 580 nm.

Cuando se inicia el programa (t=0), el FLIPR determina inicialmente la fluorescencia de todos los pocillos de la placa, un número de veces, antes de que comience la despolarización, después de aproximadamente 20 segundos, mediante la adición de iones sodio. En cada caso, la solución de adición se mezcla a partir de los tres tampones (tampón de lavado, tampón de sodio o tampón de cesio), de modo que la adición dé como resultado que no haya ningún cambio de la osmolaridad o que haya un cambio que sea idéntico en todos los pocillos. La medición de la fluorescencia se puede terminar después de aproximadamente 5 minutos. Como testigo negativo, sirven los pocillos en los que además de Na^{+} se añadió Cs^{+} 8 mM para bloquear completamente el canal HCN. Si se abstraen estos valores de los otros, se obtiene una buena medida de la actividad del canal HCN bajo la influencia de la sustancia que se va a examinar. Para la evaluación, se examina el cambio de la fluorescencia en el intervalo en el que es lineal y en el que las células transfectadas con HCN-2 sin inhibición difieren significativamente de las células inhibidas.

Bibliografía

Biel M., Ludwig A., Zong X., Hofmann R. (1999) Hyperpolarization-activated cation channels: A multigene family. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 136: 165-181.

Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F.J. (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. 391: 85-100.

Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M., Hofmann F., Biel M. (1998) A family of hyperpolarization-activated mammalian cation channels. Nature 393: 587-591.

Ludwig A., Zong X., Stieber J., Hullin R., Hofmann R., Biel M. (1999) Two pacemaker channels from heart with profoundly different activation kinetics. EMBO J. 18: 2323-2329.

Reiffen A., Eberlein W., Müller P., Psiorz M., Noll K., Heider J., Lillie C., Kobinger W., Luger P. (1990) Specific bradycardiac agents. 1. Chemistry, pharmacology, and structure-activity relationships of substituted benzazepinones, a new class of compounds exerting antiischemic properties. J. Med. Chem. 33: 1496-1504.

TABLA 1 SEQ ID NO: 1 Secuencia de proteínas de huHCN2

Número de entrada: AAC28444

1

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TABLA 2 SEQ ID NO: 2 Secuencia de nucleótidos de huHCN2

Número de entrada: AF065164

2

3

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TABLA 3 Secuencia de proteínas de huHCN4

Número de entrada: HSA132429

4

5

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TABLA 4 SEQ ID NO: 4 Secuencia de nucleótidos de huHCN4

Número de entrada: HSA132429

6

7

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TABLA 5 Secuencia de proteínas de muHCN2

Número de entrada: CAA12406

8

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TABLA 6 SEQ ID NO: 6 Secuencia de nucleótidos de muHCN2

Número de entrada: MMJ225122

9

10

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TABLA 7 Abreviaturas utilizadas

AKT: (Transporte de K+ en Arabidopsis thaliana)

AMPc: Monofosfato de adenosina cíclico (cyclic adenosine monophosphate)

CHO: (chinese hamster ovary); línea celular procedente de ovarios de hámster chino

EDTA: (ethylenediamine tetraacetic acid) Ácido etilendiamino tetraacético

FLIPR: (fluorescence imaging plate reader) lector de placas con formación de imagen fluorescente

HAC: (hyperpolarization-activated cation channel) canal catiónico activado por hiperpolarización; este nombre ha sido utilizado por diferentes grupos de trabajo

HCN: (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channel); esta es la nueva definición, aceptada en general

HEK: (human embryonic kidney); línea celular procedente de células renales embrionarias y humanas

HEPES: Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanosulfónico

HTS: (high throughput screening) escrutinio de alto rendimiento

KAT: (canal de K+ de Arabidopsis thaliana)

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH

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<120> Procedimiento para la identificación de sustancias que modulan la actividad de canales catiónicos activados por hiperpolarización

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<130> AVE D-2000/A006

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<140> 10006309.8

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<141> 12-02-2000

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 889

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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11

12

13

14

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<210> 2

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<211> 3372

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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15

16

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<210> 3

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<211> 1203

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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17

18

19

20

21

22

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<210> 4

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<211> 5065

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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23

24

25

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<210> 5

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<211> 863

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<212> PRT

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<213> Murinae gen. sp.

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<400> 5

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26

27

28

29

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<210> 6

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<211> 3102

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<212> ADN

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<213> Murinae gen. sp.

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<400> 6

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30

31

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<210> 7

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(17)

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<400> 7

\hskip1cm

32

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<210> 8

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(19)

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<400> 8

\hskip1cm

33

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<210> 9

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(24)

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<400> 9

\hskip1cm

34

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<210> 10

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(25)

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<400> 10

\hskip1cm

35

Claims

1. Procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad de canales catiónicos activados por hiperpolarización, en el que

c): se registra el cambio del potencial de membrana de las células, después del aporte simultáneo de iones sodio y de la sustancia a estudiar.

2. Procedimiento para identificar sustancias que modulan la actividad de los canales catiónicos activados por hiperpolarización, en el que

c): las células se incuban con una sustancia que se va a examinar; y

3 Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el tampón iso-osmolar exento de iones sodio, contiene una sal de potasio.

4. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampón iso-osmolar exento de iones sodio contiene al menos K^{+} 0,8 mM.

5. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tampón iso-osmolar exento de iones sodio contiene al menos K^{+} 5 mM.

6. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tampón iso-osmolar exento de iones sodio, contiene cloruro de colina o N-metil-D-glucamina.

7. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tampón iso-osmolar exento de iones sodio, contiene un colorante sensible al potencial.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el colorante sensible al potencial es un colorante fluorescente.

9. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 7 y 8, en el que el colorante sensible al potencial es un derivado del oxonol.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el derivado del oxonol es un 3-bis-ácido barbitúrico oxonol.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el 3-bis-ácido barbitúrico oxonol es bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-trimetina oxonol, bis-(1,3-ácido dietiltiobarbitúrico)-trimetina oxonol y/o bis-(1,3-ácido dibutilbarbitúrico)-pentametina oxonol.

12. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 11, en el que se emplean células en las que la concentración intracelular de AMPc está incrementada.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el contenido intracelular de AMPc está incrementada por la adición de dibutiril-AMPc o 8-bromo-AMPc.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la concentración intracelular en AMPc está incrementada por la adición de un activador de la adenilato ciclasa.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la concentración intracelular en AMPc está incrementada por la adición de forskolina.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la concentración intracelular de AMPc está incrementada por la adición de forskolina desde 1 \muM hasta 100 \muM.

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17. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la concentración intracelular en AMPc está incrementada por la adición de ligandos o de receptores.

18. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 17, en el que el canal catiónico activado por hiperpolarización es un canal HCN1, HCN2, HCN3, HCN4, KAT1 o un heteromultímero de estos canales.

19. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el canal catiónico activado por hiperpolarización es un canal catiónico humano, activable por hiperpolarización.

20. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 19, en el que las células son células de mamífero.

21. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 20, en el que las células son células CHO o HEK.

22. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células se transfectan con un plásmido que contiene el ADNc de un canal catiónico activado por hiperpolarización.

23. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 22, en el que las células se transfectan con un segundo plásmido que contiene el ADNc del mismo canal catiónico activado por hiperpolarización.

24. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 22, en el que las células se transfectan con un segundo plásmido que contiene el ADNc de otro canal catiónico activado por hiperpolarización, de modo que se pueden formar canales HCN heteromultímeros.

25. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 22, en el que las células se transfectan con un plásmido que contiene un ADNc sintético en el que se reúnen las subunidades que proceden de partes de canales diferentes o de los canales HCN.

26. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 25, en el que la variación del potencial de membrana se mide con ayuda de un colorante fluorescente sensible al potencial.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que el colorante fluorescente sensible al potencial es un derivado del oxonol, preferentemente el 3-bis-ácido barbitúrico oxonol.

28. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 27, en el que se efectúa la medición en un lector de placas con formación de imágenes fluorescentes, "Fluorescent Imaging Plate Reader".

29. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 28, en el que se determina por comparación la variación del potencial de membrana de al menos dos células.

30. Uso de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 29, en el escrutinio de alto rendimiento para identificar inhibidores y/o activadores de un canal catiónico activado por hiperpolarización.

31. Equipo de reactivos para ensayos, para determinar si una sustancia modula la actividad de una canal catiónico activado por hiperpolarización, que contiene

c): reactivos para la detección.