ES2311645T3 - Un proceso para la produccion de l-aminoacidos usando cepas de la familia de enterobacteriaceae que contiene un gen ic1r mejorado. - Google Patents
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Classifications
-
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract
Un proceso para la producción de L-aminoácidos, seleccionados del grupo de L-valina, L-homoserina, L-lisina y L-treonina, en el cual son realizados los siguientes pasos: a) fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriaceae que producen el(los) L-aminoácido(s) deseado(s) y en los cuales la sobreexpresión del gen iclR de la Escherichia coli o de secuencias de nucleótidos que codifican dicho gen iclR conduce a un incremento de al menos 10% de la actividad o concentración de dicha proteína iclR, con respecto a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida, b) acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos y c) aislamiento del L-aminoácido deseado, en el cual los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o fracciones de la misma (>0 a 100%) permanecen opcionalmente en el producto.
Description
Un proceso para la producción de
L-aminoácidos usando cepas de la familia de
Enterobacteriaceae que contiene un gen iclR mejorado.
La presente invención se refiere a un proceso
para la producción de L-aminoácidos, seleccionados
del grupo de L-valina, L-homoserina,
L-lisina y L-treonina usando cepas
de la familia Enterobacteriaceae, en la cual el gen iclR está
sobreexpresado.
Los L-amino ácidos, en
particular L-treonina, son usados en la medicina
humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimenticia y
muy particularmente en la nutrición animal.
Es conocido que los
L-aminoácidos son producidos mediante fermentación
de cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli
(E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran
importancia, constantemente son realizados esfuerzos para mejorar
el proceso de producción. Las mejoras en el proceso pueden referirse
a medidas concernientes a la tecnología de fermentación, tales como
por ejemplo la agitación y el suministro de oxígeno, o a la
composición de los medios nutrientes, tales como por ejemplo la
concentración de azúcar durante la fermentación o a trabajar para
producir el producto mediante, por ejemplo, cromatografía de
intercambio de iones, o a las características intrínsecas del
rendimiento del propio microorganismo.
Las características de rendimiento de estos
microorganismos son mejoradas usando métodos de mutagénesis,
selección y selección de mutante. De esta manera, son obtenidas
cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como por ejemplo
ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico
(AHV) análogo a la treonina, o son auxotróficas para metabolitos
regulatoriamente significativos y producen
L-aminoácidos, tales como por ejemplo
L-treonina.
Durante algunos años, métodos de la tecnología
del ADN recombinante han sido usados de la misma manera para
mejorar las cepas de la familia Enterobacteriaceae que produce
L-aminoácidos mediante la amplificación de genes de
biosíntesis de aminoácidos individuales e investigando el efecto en
la producción.
El objetivo de la invención es proporcionar
medidas novedosas para la producción fermentativa mejorada de
L-aminoácidos seleccionados del grupo de
L-treonina, L-valina,
L-homoserina, y L-lisina.
La invención proporciona un proceso para la
producción fermentativa de dichos L-aminoácidos,
usando microorganismos de la familia Enterobacteriaceae, la cual en
particular ya produce dichos aminoácidos y en la cual la secuencia
de nucleótidos del gen iclR está sobreexpresada.
Cualquier mención posterior a
L-aminoácidos o aminoácidos debe ser interpretada
como uno o más aminoácidos, incluyendo las sales de los mismos,
seleccionados del grupo que comprende L-treonina,
L-valina, L-homoserina, y
L-lisina. La L-treonina es
particularmente preferida.
En este sentido, el término "mejoramiento"
describe el incremento en la actividad intracelular de una o más
enzimas o proteínas en un microorganismo, cuyas enzimas o proteínas
son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo aumentando
el número de copias del gen o los genes, usando un promotor fuerte o
un gen o alelo que codifique a una enzima o proteína
correspondiente que tiene actividad elevada y opcionalmente
combinando estas medidas.
Las medidas de mejoramiento, en particular la
sobreexpresión, incrementan la actividad o concentración de la
proteína correspondiente en general en al menos 10%, 25%, 50%, 75%,
100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% y como máximo 1000% ó 2000% con
respecto a la actividad o concentración de la proteína de tipo
irregular, o la actividad o concentración del microorganismo de
partida.
La invención proporciona un proceso para la
producción de L-aminoácidos, seleccionados del grupo
de L-treonina, L-valina,
L-homoserina y L-lisina en el cual
son realizados los siguientes pasos:
- a)
- fermentación de los microorganismos modificados de la familia Enterobacteriaceae que producen el(los) L-aminoácido(s) deseado(s) y en los cuales la sobreexpresión del gen iclR de la Escherichia coli o de secuencias de nucleótidos que codifican el producto genético de dicho gen iclR conduce a un incremento de al menos 10% de la actividad o concentración de dicha proteína iclR, con respecto a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida,
- b)
- acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y
- c)
- aislamiento de dicho L-aminoácido, en el cual los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o fracciones (> 0 a 100%) de la misma permanecen opcionalmente en el producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos proporcionados por la
presente invención son capaces de producir dichos
L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melaza, opcionalmente almidón,
opcionalmente celulosa o glicerol y etanol. Ellos son
representantes de la familia Enterobacteriaceae seleccionados del
género Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Los géneros
Escherichia y Serratia son preferidos. Dentro del género
Escherichia, la especie Escherichia coli puede ser
mencionada en particular y dentro del género Serratia, la especie
Serratia marcescens.
Cepas apropiadas del género Escherichia, en
particular cepas productoras de L-treonina, en
particular de la especie Escherichia coli son por ejemplo
- Escherichia coli TF427
- Escherichia coli H4578
- Escherichia coli KY10935
- Escherichia coli VNIIgentika MG442
- Escherichia coli VNIIgentika M1
- Escherichia coli VNIIgentika 472T23
- Escherichia coli BKIIM B-3996
- Escherichia coli kat 13
- Escherichia coli KCCM-10132
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas apropiadas productoras de
L-treonina del género Serratia, en particular de la
especie Serratia marcescens son por ejemplo
- Serratia marcescens HNr21
- Serratia marcescens TLr156
- Serratia marcescens T2000
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas productoras de
L-treonina de la familia Enterobacteriaceae,
preferiblemente tienen, inter alia, una o más de las
características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo:
resistencia al ácido
\alpha-amino-\beta-hidroxivalérico,
resistencia a la tialisina, resistencia a la etionina, resistencia
a la \alpha-metilserina, resistencia al ácido
diaminosuccínico, resistencia al ácido
\alpha-aminobutírico, resistencia a la
borrelidina, resistencia a la rifampicina, resistencia a análogos
de la valina tales como por ejemplo el hidroxamato de valina,
resistencia a los análogos de purina, tales como por ejemplo
6-dimetilaminopurina, dependencia de
L-metionina, opcionalmente dependencia parcial o
compensable de la L-isoleucina, dependencia del
ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto
a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a la
L-treonina, resistencia a la
L-homoserina, resistencia a la
L-lisina, resistencia a la metionina L, resistencia
al ácido L-glutámico, resistencia al
L-aspartato, resistencia a la
L-leucina, resistencia a la
L-fenilalanina, resistencia a la
L-serina, resistencia a la
L-cisteína, resistencia a L-valina,
sensibilidad al fluoropiruvato, treonina deshidrogenasa defectuosa,
habilidad opcional de usar sacarosa, mejoramiento del operón de
treonina, mejoramiento de la homoserina deshidrogenasa
I-aspartato quinasa I, preferiblemente la forma
resistente a la retroalimentación, mejoramiento de la homoserina
quinasa, mejoramiento de la treonina sintasa, mejoramiento de la
aspartato quinasa, opcionalmente la forma resistente a la
retroalimentación, mejoramiento de la aspartato semialdehído
deshidrogensa, mejoramiento de fosfoenolpiruvato carboxilasa,
opcionalmente la forma resistente a la retroalimentación,
mejoramiento de la fosfoenolpiruvato sintasa, mejoramiento de la
transhidrogenasa, mejoramiento del producto del gen RhtB,
mejoramiento del producto del gen RhtC, mejoramiento del producto
del gen YfiK, mejoramiento de una piruvato carboxilasa y atenuación
de la formación de ácido acético.
Ha sido descubierto que, después de la
sobreexpresión del gen iclR, los microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae producen dichos L-aminoácidos, en
particular L-treonina, de manera mejorada.
\newpage
Las secuencias de nucleótidos de los genes de
Escherichia coli son parte del arte anterior y también pueden
ser obtenidos por medio de la secuencia genómica de la
Escherichia coli publicada por Blattner y otros (Science 277:
1453-1462 (1997)).
gen iclR:
- Descripción:
- Regulador del metabolismo intermedio central, represor del operón aceBAK (IclR).
- Referencia:
- Sunnarborg y otros; Journal of Bacteriology 172(5): 2642-2649 (1990); Cortay y otros; EMBO Journal 10(3): 675-679 (1991)
- Número de acceso:
- AE000475
\vskip1.000000\baselineskip
- gen fadR:
- (no es parte de la invención)
- Descripción:
- Regulador y del metabolismo del acetato y del ácido graso (fadR)
- Referencia:
- DiRusso; Nucleic Acids Research 16 (16): 7995-8009 (1988); Raman y otros; Journal of Biological Chemistry 272(49): 30645-30650 (1997)
- Número de acceso:
- AE000217
- Nombres alternativos del gen:
- dec, ole, thdB.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de ácido nucleico pueden ser
obtenidas a partir de las bases de datos del National Center for
Biotechnoloy Information (NCBI), la National Library of Medicine
(Bethesda, MD, EE.UU.) la base de datos de secuencias de
nucleótidos de European Molecular Biology Laboratories (EMBL,
Heidelberg, Alemania o Cambridge, Reino Unido) o el DNA Data Bank de
Japón (DDBJ, Mishima, Japón).
Los genes descritos en las referencias
mencionadas pueden ser usados de acuerdo con la invención. Los
alelos de los genes surgidos de la degeneración del código genético
o de mutaciones de sentido funcionalmente neutrales también pueden
ser usados.
El mejoramiento puede ser logrado, por ejemplo,
incrementado la expresión genética o las propiedades catalíticas de
las proteínas. Ambas medidas pueden ser opcionalmente
combinadas.
La sobreexpresión puede ser lograda incrementado
el número de copias de los genes correspondientes o mutando el
promotor y la región de regulación o el sitio de unión de los
ribosomas localizados aguas arriba del gen estructural. Los casetes
de expresión incorporados aguas arriba del gen estructural actúan de
la misma manera. Es posible adicionalmente incrementar la expresión
durante la producción fermentativa de L-treonina por
medio de promotores inducibles. La expresión es mejorada también
por medio de medidas para extender la vida del ARNm. La actividad
enzimática es mejorada además evitando la degradación de la proteína
de la enzima. Los genes o las estructuras de los genes pueden estar
presentes en los plásmidos en un número variable de copias o estar
integrados en el cromosoma y ser amplificados. Alternativamente, la
sobreexpresión de los genes en cuestión puede ser lograda también
modificando la composición de los medios y las condiciones de
cultivo.
Un especialista en el arte encontrará
orientación en este sentido inter alia en Chang y Cohen (Journal of
Bacteriology 134: 1141-1156 (1978), en Hartley y
Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), en Amann y
Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), en de Broer y
otros, (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 80: 21-25 (1983)), en
LaVallie y otros (BIO/TECHNOLOGY 11: 187-193
(1993)), en PCT/US97/13359, en Llosa y otros (Plasmid 26:
222-224 (1991), en Quandt y Kipp (Gene
80:161-169 (1989)), en Hamilton y otros (Journal of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), en Jensen y
Hammer, (Biotechnology and Bioengineering 58:
191-195 (1998)) y en libros de textos conocidos
sobre genética y biología molecular.
Los vectores de plásmidos replicables en
Enterobacteriaceae, tales como por ejemplo los vectores de clonación
derivados del pACYC184 (Bartolomé y otros; Gene 102:
75-78 (1991)), pTrc99A (Amann y otros; Gene 69:
301-315 (1988)) o derivados del pSC101 (Vocke y
Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 80 (21): 6557-6561
(1983)), pueden ser usados. Una cepa transformada con un vector de
plásmido puede ser usada en un proceso de acuerdo con la invención,
en el cual el vector de plásmido posee al menos uno o más de los
genes seleccionados del grupo iclR y secuencias de nucleótidos que
los codifican.
También es posible introducir mutaciones que
afecten la expresión de genes particulares en varias cepas mediante
el intercambio de secuencia (Hamilton y otros; Journal of
Bacteriology 171: 4617-4622 (1989)), conjugación o
transducción.
Además pudiera ser ventajoso para la producción
de dichos aminoácidos, en particular L-treonina, con
cepas de la familia Enterobacteriaceae, además de sobreexpresar el
gen iclR, sobreexpresar una o más enzimas de la trayectoria
biosintética conocida de la treonina o enzimas de metabolismo
anaplerótico o enzimas para la producción de fosfato de
dinucleótido adenina nicotinamida reducido o enzimas de glicolisis o
enzimas PTS o enzimas de metabolismo del azufre.
Por ejemplo, es posible sobreexpresar
simultáneamente uno o más de los genes seleccionados del grupo:
- \bullet
- el operón thrABC, que codifica para la aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa (US-A-4,278,765),
- \bullet
- el gen pyc, de Corynebacterium glutamicum, que codifica para la piruvato carboxilasa (WO 99/18228),
- \bullet
- el gen pps, que codifica para la fosfoenolpiruvato sintasa (Molecular and General Genetics 231 (2): 332-336 (1992)),
- \bullet
- el gen ppc, que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxilasa (Gene 31: 279-283 (1984)),
- \bullet
- los genes pntA y pntB, que codifican para la transhidrogenasa (European Journal of Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
- \bullet
- el gen rhtB, que imparte resistencia a la homoserina (EP-A-0 994 190),
- \bullet
- el gen mqo, que codifica para la malato: quinona oxidoreductasa (Journal of Bacteriology 182: 6892-6899 (2000)),
- \bullet
- el gen rhtC, que imparte resistencia a la treonina (EP-A-1 013 765),
- \bullet
- el gen thrE de Corynebacterium glutamicum, que codifica para la proteína exportadora de treonina (EP-A-1 085 091),
- \bullet
- el gen gdhA, que codifica para la glutamato deshidrogenasa (Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene 23: 199-209 (1983)),
- \bullet
- el gen hns, que codifica para la proteína HLP-II de enlace de ADN (Molecular and General Genetics 212: 199-202 (1988)),
- \bullet
- el gen pmg, que codifica para la fosfoglucomutasa (Journal of Bacteriology 176: 5847-5851 (1994),
- \bullet
- el gen fba, que codifica para la fructosa bifosfato aldolasa (Biochemical Journal 257: 529-534 (1989)),
- \bullet
- el gen ptsH del operón ptsHIcrr que codifica para la proteína fosfohistidina fosfotransferasa hexosa del sistema de fosfotransferasa, PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsI del operón ptsHIcrr que codifica para la enzima I del sistema de fosfotransferasa, PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen crr del operón ptsHIcrr que codifica para el componente IIA específico de glucosa del sistema de fosfotransferasa, PTS (Journal of Biological Chemistry 262: 16241-16253 (1987)),
- \bullet
- el gen ptsG, que codifica al componente IIBC específico de glucosa (Journal of Biological Chemistry 261: 16398-16403 (1986)),
- \bullet
- el gen lrp, que codifica para el regulador del regulón de leucina (Journal of Biological Chemistry 266: 10768-10774 (1991)),
- \bullet
- el gen mopB, que codifica para la chaperona 10 kD (Journal of Biological Chemistry 261: 12414-112419 (1986)), el que también es conocido con el nombre de groES,
- \bullet
- el gen ahpC del operón ahpCF que codifica para la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen ahpF del operón ahpCF que codifica para la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7617-7621 (1995)),
- \bullet
- el gen cysK, que codifica para la cisteína sintasa A (Journal of Bacteriology 170: 3150-3157 (1988)),
- \bullet
- el gen cysB, que codifica para el regulador del regulón de cys (Journal of Biological Chemistry 262: 5999-6005 (1987)),
- \bullet
- el gen cysJ del operón cysJIH que codifica para la flavoproteína de la NADPH-sulfito reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989)), (Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen cysI del operón cysJIH que codifica para la hemoproteína de la NADPH-sulfito reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989)), (Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen cysH del operón cysJIH que codifica para la adenilil sulfato reductasa (Journal of Biological Chemistry 264: 15796-15808 (1989)), (Journal of Biological Chemistry 264: 15726-15737 (1989)),
- \bullet
- el gen phoB del operón phoBR que codifica para el regulador positivo PhoB del regulón de Pho (Journal of Molecular Biology 190 (1): 37-44 (1986)),
- \bullet
- el gen phoR del operón phoBR que codifica para la proteína sensora del regulón de Pho (Journal of Molecular Biology 192 (3): 549-556 (1986)),
- \bullet
- el gen phoE, que codifica para la proteína E de la membrana celular exterior (Journal of Molecular Biology 163 (4): 513-532 (1983))),
- \bullet
- el gen malE que codifica para la proteína de enlace periplasmática de transporte de maltosa (Journal of Biological Chemistry 259 (16): 10606-10613 (1984)),
- \bullet
- el gen pykF, que codifica para la piruvato quinasa I estimulada con fructosa (Journal of Bacteriology 177 (19): 5719-5722 (1995)),
- \bullet
- el gen pfkB, que codifica para la 6-fosfofructoquinasa II (Gene 28 (3): 337-342 (1984)),
- \bullet
- el gen talB, que codifica para la transaldolasa B (Journal of Bacteriology 177 (20) 5930-5936 (1995)),
- \bullet
- el gen rseA del operón rseABC que codifica para una proteína de membrana con actividad anti-sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355-371 (1997),
- \bullet
- el gen rseC del operón rseABC que codifica para el regulador global del factor sigmaE (Molecular Microbiology 24 (2): 355-371 (1997),
- \bullet
- el gen sodA, que codifica para la superóxido dismutasa (Journal of Bacteriology 155 (3): 1078-1087 (1983)),
- \bullet
- el gen sucA del operón sucABCD que codifica para la subunidad de decarboxilasa de 2-quetoglutarato deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 141 (2): 351-359 (1984)),
- \bullet
- el gen sucB del operón sucABCD que codifica para la subunidad de dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-quetoglutarato deshidrogenasa (European Journal of Biochemistry 141 (2): 361-374 (1984)),
- \bullet
- el gen sucC del operón sucABCD que codifica para la subunidad \beta de succinil-CoA sintetasa (Biochemistry 24 (22): 6245-6252 (1985)), y
- \bullet
- el gen sucD del operón sucABCD que codifica para la subunidad \alpha de la succinil-CoA sintetasa (Biochemistry 24 (22): 6245-6252 (1985))
- \bullet
- el gen fadR que codifica para el regulador fadR del metabolismo del acetato y del ácido graso (Nucleic Acids Research 16 (16): 7995-8009 (1988).
\vskip1.000000\baselineskip
Además pudiera resultar ventajoso para la
producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de sobreexpresar el gen iclR,
atenuar, en particular suprimir o reducir la expresión de uno o más
genes seleccionados del grupo
- \bullet
- el gen tdh, que codifica para la treonina deshidrogenasa (Journal of Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
- \bullet
- el gen mdh, que codifica para la malato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.37) Archives in Microbiology 149: 36-42 (1987)),
\newpage
- \bullet
- El marco de lectura abierta yjfA (orf) (número de acceso AAC77180 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- El marco de lectura abierta ytfP (orf) (número de acceso AAC77179 del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EE.UU.)),
- \bullet
- El gen pckA, que codifica para la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Journal of Bacteriology 172: 7151-7156 (1990)),
- \bullet
- El gen poxB, que codifica para la piruvato oxidasa (Nucleic Acids Research 14 (13): 5449-5460 (1986)),
- \bullet
- El gen aceA, que codifica para la enzima isocitrato liasa (Journal of Bacteriology 170: 4528-4536 (1988)),
- \bullet
- El gen dgsA, que codifica para el regulador DgsA del sistema de la fosfotransferasa (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59: 256-251 (1995)) el que también es conocido con el nombre de gen mlc,
- \bullet
- El gen fruR, que codifica para el represor de fructosa (Molecular and General Genetics 226: 332-336 (1991)), el que también es conocido con el nombre de gen cra,
- \bullet
- El gen rpoS, que codifica para el factor Sigma^{38} (WO 01/05939), el que también es conocido con el nombre de gen katF,
- \bullet
- El gen aspA, que codifica para la aspartato amonio liasa de (aspartasa) (Nucleic Acids Research 13 (6): 2063-2074 (1985)) y
- \bullet
- El gen aceB, que codifica para la malato sintasa A (Nucleic Acids Research 16 (19): 9342 (1988)).
\vskip1.000000\baselineskip
En este sentido, el término "atenuación"
significa reducir o suprimir la actividad intracelular de una o más
enzimas (proteínas) en un microorganismo, cuyas enzimas son
codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo usando un
promotor débil o un gen o un alelo que codifica para una enzima
correspondiente que tiene una baja actividad o inactiva la
correspondiente enzima (proteína) o gen y opcionalmente combinando
estas medidas.
Las medidas de atenuación reducen la actividad o
la concentración de la proteína correspondiente en general de 0 a
75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ó 0 a 5% de una proteína de tipo
salvaje, o la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida.
Por otra parte, pudiera resultar ventajoso para
la producción de dichos L-aminoácidos, en particular
L-treonina, además de sobreexpresar el gen iclR,
suprimir las reacciones secundarias no deseadas (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" en:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek
(eds.) Academic Press, Londres, Gran Bretaña, 1982).
Los microorganismos producidos de acuerdo con la
invención pueden ser cultivados usando el proceso por lotes, el
proceso por lotes alimentados o proceso repetido por lotes
alimentados. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos aparece
en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere
Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a ser usado debe satisfacer
adecuadamente los requerimientos de las cepas en particular. Los
medios de cultivo para varios microorganismos son descritos en el
"Manual of Methods for General Bacteriology" de la American
Society for Bacteriology (Washington, D.C., EE.UU., 1981)
Las fuentes de carbón que pueden ser usadas
incluyen azúcares y carbohidratos, tales como por ejemplo glucosa,
sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y
opcionalmente celulosa, aceites y grasas, tales como por ejemplo
aceite de soya, aceite de girasol, aceite de maní y aceite de coco,
ácidos grasos, tales como por ejemplo, ácido palmítico, ácido
esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tales como por ejemplo
glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido
acético. Estas sustancias pueden ser usadas individualmente o como
una mezcla.
Las fuentes de nitrógeno que pueden ser usadas
comprenden compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como
peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de
malta, licor de maíz, harina de soya y urea, o compuestos
inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio,
fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las
fuentes de nitrógeno pueden ser usadas individualmente o como una
mezcla.
Las fuentes de fósforo que pueden ser usadas son
ácido fosfórico, dihidrógeno fosfato de potasio o hidrógeno fosfato
de dipotasio o las sales correspondientes que contienen sodio. El
medio de cultivo debe contener adicionalmente sales de metales
tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro por ejemplo, que
son necesarias para el crecimiento. Finalmente, sustancias
esenciales promotoras del crecimiento tales como aminoácidos y
vitaminas pueden ser usadas además de las sustancias mencionadas
con anterioridad. Adicionalmente pueden ser añadidos al medio de
cultivo precursores apropiados. Las sustancias de alimentación antes
mencionadas pueden ser añadidas al medio de cultivo como un solo
lote o pueden ser añadidas apropiadamente durante el cultivo.
Compuestos básicos, tales como hidróxido de
sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua de amoniaco, o
compuestos ácidos, tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico son
usados apropiadamente para controlar el pH del cultivo. La espuma
puede ser controlada usando agentes antiespumantes tales como por
ejemplo ésteres de poliglicol de ácido graso. Sustancias apropiadas
que actúan selectivamente, tales como por ejemplo antibióticos,
pueden ser añadidas al medio con el fin de mantener la estabilidad
de los plásmidos. Oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno,
tales como por ejemplo aire, son introducidos en el cultivo a fin de
mantener las condiciones aeróbicas. La temperatura del cultivo es
normalmente de 25ºC a 45ºC y preferiblemente de 30ºC a 40ºC. El
cultivo es continuado hasta que se haya formado la cantidad máxima
de L-aminoácidos o L-treonina. Este
objetivo es logrado normalmente dentro de 10 a 160 horas.
El análisis de los aminoácidos puede ser
realizado por cromatografía de intercambio aniónico con la
subsiguiente derivación de ninhidrina, como es descrito en Spackman
y otros (Analytical Chemistry, 30. 1190-1206 (1958))
o puede ser realizada por HPLC de fase inversa, como es descrito en
Lindroth y otros (Analytical Chemistry 51: 1167-1174
(1979)).
El propósito del proceso de acuerdo con la
invención es la producción fermentativa de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo de
L-treonina, L-valina,
L-homoserina, y L-lisina, en
particular L-treonina.
La presente invención es ilustrada con mayor
detalle por los siguientes ejemplos prácticos.
El medio mínimo (M9) y el medio completo (LB)
usado para la Escherichia coli son descritos por J. H. Millar
(A Short Course in Bacterial Genetics (1992)), Cold Spring Harbor
Laboratory Press). El aislamiento del ADN plásmido de la
Escherichia coli y todas las técnicas de restricción, de
ligación, de Klenow y de tratamiento de fosfatasa alcalina fueron
realizadas de acuerdo con Sambrook y otros, (Molecular Cloning - A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). A
menos que sea planteado lo contrario, la transformación de la
Escherichia coli fue realizada de acuerdo con Cheng y otros,
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 86: 2172-2175 (1989)).
La temperatura de incubación durante la
producción de cepas y transformantes es 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen fadR de la E. coli K12 es
amplificado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y
oligonucleótidos sintéticos. Los cebadores de PCR son sintetizados
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) sobre la base de la secuencia de
nucleótidos del gen fadR en E. coli K12 MG1655 (número de
acceso AE000217, Blattner y otros (Science 277:
1453-1462 (1997)).
Las secuencias de cebador son modificadas de
manera que sean obtenidos sitios de reconocimiento para enzimas de
restricción. La secuencia de reconocimiento para XbaI es
seleccionada para el cebador fadR3, mientras que la secuencia de
reconocimiento para HindIII es seleccionada para el cebador fadR4,
estas secuencias siendo indicadas por las porciones subrayadas de
la secuencia de nucleótidos mostrada a continuación:
El ADN cromosómico de la E. coli K12
MG1655 usado para la PCR es aislado usando "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (Qiagen, Hilden, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un fragmento de ADN
de aproximadamente 800 bp puede ser amplificado con los cebadores
específicos en condiciones de PCR estándares (Innis y otros (1990)
PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press)
usando polimerasa de ADN Pfu (Promega Corporation, Madison,
EE.UU.). El producto de la PCR es ligado de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO
PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y transformado
en la cepa de E. coli TOP10. Las células portadoras de
plásmidos son seleccionadas en agar LB que ha sido combinado con 50
\mug/ml de kanamicina. Después del aislamiento del ADN plásmido,
el vector pCR-Blunt
II-TOPO-fadR es segmentado con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de la separación,
el fragmento fadR es aislado en 0.8% de gel agarosa usando el
QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) es segmentado con las
enzimas HindIII y XbaI y ligado con el fragmento aislado de fadR.
La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene,
La Jolla, EE.UU.) es transformada con el lote de ligación y las
células portadoras de plásmidos son seleccionadas en agar LB, que ha
sido combinado con 50 \mug/ml de ampicilina. El éxito de la
clonación puede ser verificado después del aislamiento del ADN
plásmido realizando una segmentación de prueba con las enzimas AccI,
HincII y SspI. El plásmido es denominado pTrc99AfadR (figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442 de E. coli productora de
L-treonina es descrita en la patente
US-A-4, 278,765 y ha sido depositada
como CMIM B-1628 en la Russian National Collection
of Industrial Microorganisms (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 es transformada con el plásmido de
expresión pTrc99AfadR descrito en el Ejemplo 1a y el vector pTrc99A
y las células portadoras de plásmidos son seleccionadas en agar con
50 \mug/ml de ampicilina. De este modo, son obtenidas las cepas
MG442/pTrc99AfadR y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas son entonces multiplicadas de nuevo sobre medio
mínimo de las siguientes composiciones: 3.5 g/l de
Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1.5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
de NH_{4}Cl, 0.1 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l de glucosa,
20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de
L-treonina es verificada en 10 ml de cultivo por
lotes en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Dicho cultivo es inoculado
con 10 ml de medio de precultivo de la siguiente composición: 2 g/l
de extracto de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4},
1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0.5 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 15
g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina e
incubado durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de
Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo son
transferidas a 10 ml del medio de producción (25 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
de MgSO_{4}*7H_{2}O, 0.03 g/l de FeSo_{4}*7H_{2}O, 0.018
g/l de MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de
glucosa, 50 mg/l de ampicilina) e incubadas durante 48 horas a 37ºC.
La formación de la L-treonina por la cepa de
partida MG442 es verificada de la misma manera, pero sin la adición
de ampicilina al medio. Después de la incubación, la densidad
óptica (OD) de la suspensión del cultivo es determinada a una
longitud de onda de medición de 660 nm usando un fotómetro LP2W de
la compañía Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania).
La concentración de L-treonina
formada es entonces determinada en el sobrenadante del cultivo
filtrado estéril usando un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónica y reacción posterior en columna
con detección de ninhidrina.
La Tabla 1 muestra el resultado de la
prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El gen iclR de E. coli K12 es amplificado
usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los
oligonucleótidos sintéticos. Los cebadores de PCR son sintetizados
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) sobre la base de la secuencia de
nucleótidos del gen iclR en E. coli K12 MG1655 número de
acceso AE000475, Blattner y otros, (Science 277:
1453-1462 (1997)). Las secuencias de cebadores son
modificadas de manera tal que sean obtenidos los sitios de
reconocimiento para las enzimas de restricción. La secuencia de
reconocimiento para XbaI es seleccionada para el cebador iclR3,
mientras la secuencia de reconocimiento para HindIII es seleccionada
para el cebador iclR4, estas secuencias siendo indicadas por las
porciones subrayadas de la secuencia de nucleótidos mostrada a
continuación:
El ADN cromosómico de E. coli K12 MG1655
usado para la PCR es aislado usando "Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un fragmento de ADN
de aproximadamente 950 bp puede ser amplificado con los cebadores
específicos usando condiciones estándares de PCR (Innis y otros,
(1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic
Press) usando polimerasa de ADN Pfu (Promega Corporation, Madison,
EE.UU.). El producto de la PCR es ligado de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con el vector
pCR-Blunt II TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit,
Invitrogen, Groningen, Países Bajos) y transformado en la cepa de
E. coli TOP10.
Las células portadoras de plásmidos son
seleccionadas en agar LB que ha sido combinado con 50 \mug/ml de
kanamicina. Después del aislamiento del ADN plásmido, el vector
pCR-Blunt
II-TOPO-fadR es segmentado con las
enzimas de restricción HindIII y XbaI y, después de la separación,
el fragmento iclR es aislado en 0.8% de gel agarosa usando el
QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). El vector
pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) es segmentado con las
enzimas HindIII y XbaI y ligado con el fragmento aislado de iclR.
La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene,
La Jolla, EE.UU.) es transformada con el lote de ligación y las
células portadoras de plásmidos son seleccionadas en agar LB, que ha
sido combinado con 50 \mug/ml de ampicilina. El éxito de la
clonación puede ser verificado después del aislamiento del ADN
plásmido realizando una segmentación de prueba con las enzimas
BstEII, MluI y RsaI. El plásmido es denominado pTrc99AiclR (figura
2).
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa MG442 de E. coli productora de
L-treonina es descrita en la patente
US-A-4,278,765 y ha sido depositada
como CMIM B-1628 en la Russian National Collection
of Industrial Microorganisms (VKPM, Moscú, Rusia).
La cepa MG442 es transformada con el plásmido de
expresión pTrc99AiclR descrito en el Ejemplo 2a y el vector pTrc99A
y las células portadoras de plásmidos son seleccionadas en LB agar
con 50 \mug/ml de ampicilina. De este modo, son obtenidas cepas
MG442/pTrc99AiclR y MG442/pTrc99A. Las colonias individuales
seleccionadas son entonces multiplicadas de nuevo sobre un medio
mínimo de la siguiente composición: 3.5 g/l de
Na_{2}HPO_{4}*2H_{2}O, 1.5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
de NH_{4}Cl, 0.1 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 2 g/l de glucosa,
20 g/l de agar, 50 mg/l de ampicilina. La formación de
L-treonina es verificada en 10 ml de cultivo por
lotes en matraces Erlenmeyer de 100 ml. Dicho cultivo es inoculado
con 10 ml de medio de precultivo de la siguiente composición: 2 g/l
de extracto de levadura, 10 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4},
1 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0.5 g/l de MgSO_{4}*7H_{2}O, 15
g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de glucosa, 50 mg/l de ampicilina e
incubado durante 16 horas a 37ºC y 180 rpm en una incubadora ESR de
Kühner AG (Birsfelden, Suiza).
Porciones de 250 \mul de este precultivo son
transferidas a 10 ml del medio de producción (25 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 g/l de KH_{2}PO_{4}, 1 g/l
de MgSO_{4}*7H_{2}O, 0.03 g/l de FeSo_{4}*7H_{2}O, 0.018
g/l de MnSO_{4}*1H_{2}O, 30 g/l de CaCO_{3}, 20 g/l de
glucosa, 50 mg/l de ampicilina) e incubadas durante 48 horas a 37ºC.
La formación de L-treonina por la cepa de partida
MG442 es verificada de la misma manera, pero sin la adición de
ampicilina al medio. Después de la incubación, la densidad óptica
(OD) de la suspensión del cultivo es determinada a una longitud de
onda de medición de 660 nm usando un fotómetro LP2W de la compañía
Dr. Lange (Düsseldorf, Alemania).
La concentración de L-treonina
formada es entonces determinada en el sobrenadante del cultivo
filtrado estéril usando un analizador de aminoácidos de
Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por
cromatografía de intercambio iónico y reacción posterior en columna
con detección de ninhidrina.
La tabla 2 muestra el resultado de la
prueba.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: mapa del plásmido pTrc99AfadR que
contiene el gen fadR.
Figura 2: mapa del plásmido pTrc99AiclR que
contiene el gen iclR.
Las longitudes planteadas deben ser consideradas
aproximadas. Las abreviaturas y términos usados tienen el siguiente
significado:
- \bullet Amp:
- gen de resistencia a la ampicilina
- \bullet lacI:
- gen para la proteína represora del promotor trc
- \bullet Ptrc:
- región del promotor trc, inducible por IPTG
- \bullet fadR:
- región de codificación del gen fadR
- \bullet iclR:
- región de codificación del gen iclR
- \bullet 5s:
- región ARNr 5s
- \bullet rrnBT:
- región del terminador de ARNr
\vskip1.000000\baselineskip
Las abreviaturas para las enzimas de restricción
tienen el siguiente significado:
- \bullet AccI:
- endonucleasa de restricción de Acinetobacter calcoaceticus
- \bullet BstEII:
- endonucleasa de restricción de Bacillus stearothermophilus ATCC 12980
- \bullet HincII:
- endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae R_{c}
- \bullet HindIII:
- endonucleasa de restricción de Haemophilus influenzae
- \bullet MluI:
- endonucleasa de restricción de Micrococcus luteus IFO 12992
- \bullet RsaI:
- endonucleasa de restricción Rhodopseudomonas sphaeroides
- \bullet SspI:
- endonucleasa de restricción de la especie Sphaerotilus ATCC 13925
- \bullet XbaI:
- endonucleasa de restricción de Xanthomonas campestris.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Degussa AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proceso para la producción de
L-aminoácidos usando cepas de la familia
Enterobacteriaceae que contienen un gen fadR o iclR mejorado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 010455 BT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fadR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccaacttt gtctagatga gttatgg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fadR4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggggtttg aagcttaaac ggaaggg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iclR3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagttcagta tctagagcat gagctaac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iclR4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtatgatgg gcagaagctt gcctctgc
\hfill28
Claims (111)
1. Un proceso para la producción de
L-aminoácidos, seleccionados del grupo de
L-valina, L-homoserina,
L-lisina y L-treonina, en el cual
son realizados los siguientes pasos:
- a)
- fermentación de microorganismos modificados de la familia Enterobacteriaceae que producen el(los) L-aminoácido(s) deseado(s) y en los cuales la sobreexpresión del gen iclR de la Escherichia coli o de secuencias de nucleótidos que codifican dicho gen iclR conduce a un incremento de al menos 10% de la actividad o concentración de dicha proteína iclR, con respecto a la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida,
- b)
- acumulación del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado, en el cual los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o fracciones de la misma (>0 a 100%) permanecen opcionalmente en el producto.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, en el cual los L-aminoácidos deseados son
producidos mediante fermentación de microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae en la cual además al mismo tiempo la actividad o
concentración de una o más de las proteínas codificadas por los
genes seleccionados del grupo consistente en:
- 2.1
- el operón thrABC que codifica para la aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa,
- 2.2
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,
- 2.3
- el gen pps que codifica para la fosfoenolpiruvato sintasa,
- 2.4
- el gen ppc que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxilasa,
- 2.5
- los genes pntA y pntB que codifican para la transhidrogenasa,
- 2.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina,
- 2.7
- el gen mqo que codifica para la malato:quinona oxidoreductasa,
- 2.8
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina,
- 2.9
- el gen thrE que codifica para la proteína exportadora de treonina,
- 2.10
- el gen gdhA que codifica para la glutamato deshidrogenasa,
- 2.11
- el gen hns que codifica para la proteína HLP-II de enlace de ADN,
- 2.12
- el gen pmg que codifica para la fosfoglucoisomerasa,
- 2.13
- el gen fba que codifica para la fructosa bifosfato aldolasa,
- 2.14
- el gen ptsH que codifica para la proteína fosfohistidina fosfotransferasa hexosa,
- 2.15
- el gen ptsI que codifica para la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
- 2.16
- el gen crr que codifica para el componente IIA específico de la glucosa,
- 2.17
- el gen ptsG que codifica para el componente IIBC específico de la glucosa,
- 2.18
- el gen lrp, que codifica para el regulador del regulón de leucina,
- 2.19
- el gen mopB, que codifica para la chaperona 10 kD,
- 2.20
- el gen ahpC, que codifica para la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa,
- 2.21
- el gen ahpF, que codifica para la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa,
- 2.22
- el gen cysK, que codifica para la cisteína sintasa A,
- 2.23
- el gen cysB, que codifica para el regulador del regulón de cys,
- 2.24
- el gen cysJ, que codifica para la flavoproteína de NADPH-sulfito reductasa,
- 2.25
- el gen cysI, que codifica para la hemoproteína de la NADPH-sulfito reductasa,
- 2.26
- el gen cysH, que codifica para la adenilil sulfato reductasa,
- 2.27
- el gen phoB, que codifica para el regulador positivo de PhoB del regulón de Pho,
- 2.28
- el gen phoR que codifica para la proteína sensora del regulón de Pho,
- 2.29
- el gen phoE, que codifica para la proteína E de la membrana celular exterior,
- 2.30
- el gen malE, que codifica para la proteína de enlace periplasmática de transporte de maltosa,
- 2.31
- el gen pykF, que codifica para la piruvato quinasa I estimulada con fructosa,
- 2.32
- el gen pfkB, que codifica para la 6-fosfofructoquinasa II,
- 2.33
- el gen talB, que codifica para la transaldolasa B,
- 2.34
- el gen rseA, que codifica para una proteína de membrana que actúa como regulador negativo en la actividad sigmaE,
- 2.35
- el gen rseC, que codifica para un regulador global del factor sigmaE,
- 2.36
- el gen sodA, que codifica para la superóxido dismutasa,
- 2.37
- el gen sucA, que codifica para la subunidad de decarboxilasa de 2-quetoglutarato deshidrogenasa,
- 2.38
- el gen sucB, que codifica para la subunidad de dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-quetoglutarato deshidrogenasa,
- 2.39
- el gen sucC, que codifica para la subunidad \beta de la succinil-CoA sintetasa,
- 2.40
- el gen sucD, que codifica para la subunidad \alpha de la succinil-CoA sintetasa, y
- 2.41
- el gen fadR, que codifica para el regulador FadR del ácido graso y el metabolismo del acetato.
es incrementada en al menos 10%,
con respecto a la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida, mediante sobreexpresión de uno o más de
dichos
genes.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en el cual dichos L-aminoácidos son
producidos mediante fermentación de microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae en los cuales además al mismo tiempo la actividad
o concentración de una o más de las proteínas codificadas por los
genes seleccionados del grupo consistente
en:
en:
- 3.1
- el gen tdh, que codifica para la treonina deshidrogenasa,
- 3.2
- el gen mdh, que codifica para la malato deshidrogenasa,
- 3.3
- el marco de lectura abierta (orf) yjfA,
- 3.4
- el marco de lectura abierta (orf) ytfP,
- 3.5
- el gen pckA, que codifica para la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa,
- 3.6
- el gen poxB, que codifica para la piruvato oxidasa,
- 3.7
- el gen aceA, que codifica para la isocitrato liasa,
- 3.8
- el gen dgsA, que codifica para el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- 3.9
- el gen fruR, que codifica para el represor de fructosa,
- 3.10
- el gen rpoS, que codifica para el factor Sigma^{38},
- 3.11
- el gen aspA, que codifica para la aspartato liasa de amonio (aspartasa) y
- 3.12
- el gen aceB, que codifica para la malato sintasa A.
es reducida a 0% ó como máximo a
75% de la actividad o concentración de la proteína en el
microorganismo de partida mediante atenuación de uno o más de dichos
genes.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae, que producen L-aminoácidos,
seleccionados del grupo de L-treonina,
L-valina, L-homoserina y
L-lisina en los cuales la actividad o concentración
de las proteínas codificadas por el gen iclR de Escherichia
coli o por secuencias de nucleótidos que codifican para la
proteína iclR y en los cuales la actividad o concentración de una o
más proteína(s) codificada(s) por uno o más
gen(es) adicional(es) es incrementada en al menos 10%,
con respecto a la actividad o concentración de las proteínas en el
microorganismo de partida en condiciones similares de fermentación
mediante sobreexpresión de dichos genes, en el cual dichos genes
adicionales son seleccionados del grupo consistente en:
- 4.1
- el operón thrABC que codifica para la aspartato quinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina quinasa y treonina sintasa,
- 4.2
- el gen pyc que codifica para la piruvato carboxilasa,
- 4.3
- el gen pps que codifica para la fosfoenolpiruvato sintasa,
- 4.4
- el gen ppc que codifica para la fosfoenolpiruvato carboxilasa,
- 4.5
- los genes pntA y pntB que codifican para la transhidrogenasa,
- 4.6
- el gen rhtB que imparte resistencia a la homoserina,
- 4.7
- el gen mqo que codifica para la malato:quinona oxidoreductasa,
- 4.8
- el gen rhtC que imparte resistencia a la treonina,
- 4.9
- el gen thrE que codifica para la proteína exportadora de treonina,
- 4.10
- el gen gdhA que codifica para la glutamato deshidrogenasa,
- 4.11
- el gen hns que codifica para la proteína HLP-II de enlace de ADN,
- 4.12
- el gen pmg, que codifica para la fosfoglucoisomerasa,
- 4.13
- el gen fba, que codifica para la fructosa bifosfato aldolasa,
- 4.14
- el gen ptsH, que codifica para la proteína fosfohistidina fosfotransferasa hexosa,
- 4.15
- el gen ptsI, que codifica para la enzima I del sistema de fosfotransferasa,
- 4.16
- el gen crr que codifica para el componente IIA específico de la glucosa,
- 4.17
- el gen ptsG que codifica para el componente IIBC específico de la glucosa,
- 4.18
- el gen lrp, que codifica para el regulador del regulón de leucina,
- 4.19
- el gen mopB, que codifica para la chaperona 10 kD,
- 4.20
- el gen ahpC, que codifica para la subunidad pequeña de alquil hidroperóxido reductasa,
- 4.21
- el gen ahpF, que codifica para la subunidad grande de alquil hidroperóxido reductasa,
- 4.22
- el gen cysK, que codifica para la cisteína sintasa A,
- 4.23
- el gen cysB, que codifica para el regulador del regulón de cys,
- 4.24
- el gen cysJ, que codifica para la flavoproteína de la NADPH-sulfito reductasa,
- 4.25
- el gen cysI, que codifica para la hemoproteína de la NADPH-sulfito reductasa,
\global\parskip0.950000\baselineskip
- 4.26
- el gen cysH, que codifica para la adenilil sulfato reductasa,
- 4.27
- el gen phoB, que codifica para el regulador positivo de PhoB del regulón de Pho,
- 4.28
- el gen phoR, que codifica para la proteína sensora del regulón de pho,
- 4.29
- el gen phoE, que codifica para la proteína E de la membrana celular exterior,
- 4.30
- el gen malE, que codifica para la proteína de enlace periplasmática del transporte de maltosa,
- 4.31
- el gen pykF, que codifica para la piruvato quinasa I estimulada con fructosa,
- 4.32
- el gen pfkB, que codifica para la 6-fosfofructoquinasa II,
- 4.33
- el gen talB, que codifica para la transaldolasa B,
- 4.34
- el gen rseAm, que codifica para una proteína de membrana que actúa como regulador negativo en la actividad sigmaE,
- 4.35
- el gen rseC, que codifica para un regulador global del factor sigmaE,
- 4.36
- el gen sodA, que codifica para la superóxido dismutasa,
- 4.37
- el gen sucA, que codifica para la subunidad de decarboxilasa de 2-quetoglutarato deshidrogenasa,
- 4.38
- el gen sucB, que codifica para la subunidad de dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-quetoglutarato de deshidrogenasa,
- 4.39
- el gen sucC, que codifica para la subunidad \beta de succinil-CoA sintetasa,
- 4.40
- el gen sucD, que codifica para la subunidad \alpha de succinil-CoA sintetasa, y
- 4.41
- el gen fadR, que codifica para el regulador FadR del metabolismo del acetato y del ácido graso.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Microorganismos de la familia
Enterobacteriaceae, que producen L-aminoácidos,
seleccionados del grupo L-treonina,
L-valina, L-homoserina y
L-lisina en los cuales la actividad o concentración
de las proteínas codificadas por el gen iclR de la Escherichia
coli o por secuencias de nucleótidos que codifican dicha
proteína es incrementada en al menos 10%, con respecto a la
actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de
partida, mediante sobreexpresión del gen y en los cuales la
actividad o concentración de una o más proteína(s)
codificada(s) por gen(es) adicional(es) es
reducida a 0 ó como máximo a 75% con respecto a la actividad o
concentración de dicha(s) proteína(s)
en el microorganismo de partida en condiciones de fermentación similares mediante atenuación de uno o más gen(es) adicional(es), en el cual dichos genes adicionales son seleccionados del grupo consistente en:
en el microorganismo de partida en condiciones de fermentación similares mediante atenuación de uno o más gen(es) adicional(es), en el cual dichos genes adicionales son seleccionados del grupo consistente en:
- 5.1
- el gen tdh que codifica para la treonina deshidrogenasa,
- 5.2
- el gen mdh que codifica para la malato deshidrogenasa,
- 5.3
- el marco de lectura abierta (orf) yjfA,
- 5.4
- el marco de lectura abierta (orf) ytfP,
- 5.5
- el gen pckA que codifica para la enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinasa,
- 5.6
- el gen poxB que codifica para la piruvato oxidasa,
- 5.7
- el gen aceA, que codifica para la isocitrato liasa,
- 5.8
- el gen dgsA que codifica para el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,
- 5.9
- el gen fruR que codifica para el represor de fructosa,
- 5.10
- el gen rpoS, que codifica para el factor Sigma^{38}.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 5 en los cuales los microorganismos son
originarios del género Escherichia.
7. Microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 4 ó 5 en los cuales los microorganismos son
originarios de la especie E. coli.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10154102 | 2001-11-02 | ||
| DE10154102A DE10154102A1 (de) | 2001-11-02 | 2001-11-02 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2311645T3 true ES2311645T3 (es) | 2009-02-16 |
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ID=7704558
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05004526T Expired - Lifetime ES2300888T3 (es) | 2001-11-02 | 2002-09-26 | Proceso para la produccion de l-aminoacidos utilizando cepas de la familia enterobacteriaceas que contienen un gen fadr intensificado. |
| ES02802285T Expired - Lifetime ES2311645T3 (es) | 2001-11-02 | 2002-09-26 | Un proceso para la produccion de l-aminoacidos usando cepas de la familia de enterobacteriaceae que contiene un gen ic1r mejorado. |
Family Applications Before (1)
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