ES2311710T3 - Procedimiento para la identificacion de peptidos inmunoreactivos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para la identificación de ligandos MHC en las siguientes etapas: a) preparación de una muestra de tejido tumoral y su correspondiente tejido sano, b) determinación de la pauta de expresión tumoral específica de dicha muestra, c) aislamiento y análisis de los ligandos MHC de la muestra de tejido tumoral, d) comparación de los datos obtenidos en las etapas (b) y (c), e e) identificación de ligandos MHC sobre la base de los datos comparados.
Description
Procedimiento para la identificación de péptidos
inmunoreactivos.
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La exposición de la invención se refiere a un
proceso de identificación y a un proceso de preparación de péptidos
inmunoreactivos y los péptidos inmunoreactivos así
identificados/producidos.
Los péptidos de este tipo son utilizados, por
ejemplo, en la inmunoterapia de las enfermedades tumorales. La
identificación de antígenos asociados a tumores (TAA) mediante
componentes del sistema inmune desempeña un papel fundamental en la
destrucción de células tumorales por parte del sistema inmune. Este
mecanismo se basa en la condición de que entre las células
tumorales y las células normales existen diferencias cualitativas o
cuantitativas. Para desencadenar una respuesta
anti-tumoral, las células tumorales deben expresar a
los antígenos, lo cual provoca una respuesta inmunológica
suficiente para la destrucción del tumor.
Los linfocitos T citotóxicos que expresan la
molécula CD8 (en adelante, CTL) tienen un papel importante en el
rechazo a tumores. Para que se desencadene una reacción inmune de
este tipo a través de los linfocitos T citotóxicos, deben
presentarse proteínas o péptidos foráneos ante los linfocitos T. Los
linfocitos T sólo reconocen a los antígenos como fragmentos de
péptidos cuando éstos son presentados por moléculas MHC en la
superficie de la célula. Estas moléculas MHC (Major
Histocompatibility Complex) son receptoras de péptidos que,
normalmente, los unen dentro de la célula para transportarlos a la
superficie de la célula. Este complejo formado por péptidos y
moléculas MHC es reconocido por los linfocitos T. Las moléculas MHC
del ser humano también se conocen como "antígenos de leucocito
humano" (HLA).
En investigaciones pasadas, se ha comprobado la
eficacia del tratamiento del cáncer por medio de una inmunoterapia
específica de antígeno y basada en linfocitos T.
La inducción de una respuesta específica de CTL
dirigida contra un tumor depende de la identificación de ligandos
MHC de clase I procedentes de antígenos asociados a tumores (TAA).
Dichos antígenos asociados a tumores sólo pueden existir en células
malignas como, por ejemplo, productos de genes mutados. Otras clases
importantes de antígenos asociados a tumores son las estructuras
específicas de tejidos, como los antígenos CT
("cancer-testis"). Una tercera clase de
antígenos asociados a tumores la constituyen las proteínas que se
encuentran sobreexpresadas en los tumores.
Los métodos para la identificación y
caracterización de TAA, que representan el punto de partida de una
vacuna contra el cáncer, se basan en parte en la inserción de CTL o
anticuerpos ya inducidos en el paciente. Este enfoque inmunológico
se combina, o bien con la pauta de expresión génica, o bien con una
secuenciación de espectrometría de masas de los péptidos
identificados (véase van der Bruggen y col, 1991, A gene encoding
an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human
melanoma, "Science" 254:1643-1647; y Cox y
col, 1994, Identification of a peptide recognized by five
melanoma-specific human cytotoxic T cell lines,
"Science" 264:716-719). Algunos métodos para la
identificación de TAA, basados en la comparación del perfil de
transcripción del tumor con el de tejido normal, son la hibridación
y la inserción de micromatrices de ADN.
Celis y col. (1994, Induction of
anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans
using primary cultures and synthetic peptide epitopes, "Proc.
Natl. Acad. Sci." USA 91:2105-2109) aplicaron un
procedimiento que aprovecha la predicción de ligandos MHC de clase
I procedentes de un antígeno seleccionado asociado a un tumor y
mediante el cual, posteriormente, se demuestra la cualidad de
epítopos de linfocitos T de dichos ligandos. El problema de estos
procedimientos, basados en linfocitos T de pacientes, es el alto
coste del cultivo y el hecho de estar limitados a linfocitos T ya
existentes.
Existe también un enfoque que no depende de los
linfocitos T y en el que se combina la predicción de epítopos con
la búsqueda de los péptidos predichos en mezclas de péptidos
complejas, en donde los péptidos se identifican mediante
espectrometría de masas/cromatografía líquida capilar de alta
sensibilidad (LC-MS) (véase Schirle y col, 2000,
Identification of tumor-associated MHC class I
ligands by a novel T-cell independent approach,
"Eur. J. Immunol." 30:2216-2225).
La tecnología de micromatrices de ADN ofrece un
nuevo enfoque mediante el cual se puede establecer una comparación
entre la pauta de expresión de un tumor con el del tejido normal
autólogo correspondiente. Así por ejemplo, Young y col. (2001,
Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a
method for tumor classification and discovery of diagnostic
molecular markers, "Am J. Pathol."
158:1639-1651) demuestran que, con este
procedimiento, es posible identificar una gran cantidad de antígenos
asociados a tumores a partir de tumores aislados. Los ligandos MHC
de clase I, procedentes de proteínas sobreexpresadas o expresadas de
forma selectiva, representan así blancos potenciales para un
reconocimiento específico de CTL de tumores. Mathiassen y col.
(2001, Tumor-associated antigens identified by
mRNA expression profiling induce protective
anti-tumor immunity, "Eur. J. Immuno."
31:1239-1246) demostraron en un modelo de ratón que,
mediante la combinación del análisis de expresión y la predicción
de epítopos, es posible la preparación de una vacuna efectiva.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La predicción de epítopos presenta, sin embargo,
la desventaja de que sólo para unos pocos genes diana se determina
una gran cantidad de péptidos posibles, la mayoría de los cuales, ni
son presentados por moléculas MHC, ni puede desencadenar una
respuesta de CTL.
El objetivo de la presente invención es, por
tanto, el desarrollo de un nuevo procedimiento in vitro con
el que se puedan identificar de forma sencilla y precisa péptidos
inmunoreactivos.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención alcanza este objetivo mediante un
procedimiento in vitro para la identificación de ligandos
MHC, efectuado en las etapas:
- (a)
- preparación de una muestra de tejido tumoral y su correspondiente tejido sano,
- (b)
- determinación de la pauta de expresión tumoral específica de la muestra preparada,
- (c)
- aislamiento y análisis de los ligandos MHC de la muestra de tejido tumoral,
- (d)
- comparación de los datos obtenidos en las etapas (b) y (c), e
- (e)
- identificación de ligandos MHC sobre la base de los datos comparados.
Los inventores han descubierto que es posible
identificar candidatos específicos para una vacuna individual
mediante la combinación del análisis de expresión y los péptidos
antigénicos aislados y analizados de un tumor.
Con el aislamiento del péptido antigénico y la
comparación con la pauta de expresión de los genes de un tejido
tumoral se evita que se obtenga una cantidad excesivamente elevada
de péptidos potencialmente inmunoreactivos. Se identifican así de
manera más precisa los péptidos presentados por moléculas MHC y que,
por tanto, pueden actuar como péptidos inmunoreactivos.
El procedimiento conforme a la invención
permite, por tanto, la identificación de péptidos individuales por
paciente; es decir, ajustar al paciente el péptido empleado como
vacuna, por ejemplo, con el fin de desencadenar una respuesta
inmune precisa.
Tras la obtención de las muestras del paciente,
los grandes laboratorios, por ejemplo, pueden efectuar este
procedimiento de manera sistemática y eficaz, y, después de
identificar los péptidos inmunorreactivos adecuados, transmitir sus
secuencias a las clínicas de tratamiento, donde los péptidos son
sintetizados y administrados Pero un laboratorio solo también puede
efectuar tanto la identificación como la preparación de los péptidos
adecuados para cada
paciente.
paciente.
Así, este nuevo procedimiento se puede aplicar
tanto en el sector de servicios como en combinación con la entrega
de los péptidos inmunoreactivos identificados.
Los péptidos aislados en la etapa (c) son
ligandos MHC.
Sólo los péptidos unidos a moléculas MHC pueden
desencadenar una respuesta celular inmune. Los péptidos que, por
ejemplo, proceden de genes sobreexpresados de un tumor pero no están
unidos a moléculas MHC no desencadenan una reacción inmune de CTL.
Por lo tanto, no todos los péptidos identificados por predicción de
epítopos son inmunoreactivos.
En otra forma de realización de preferencia, la
etapa (b) se efectúa mediante un análisis en micromatrices y/o una
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa.
En el análisis en micromatrices se compara,
mediante la utilización de determinadas micromatrices de ADN o de
gen, la pauta de expresión del tejido tumoral con el tejido normal
correspondiente y se identifican los genes expresados de forma
selectiva o sobreexpresados. Este procedimiento se conoce bien en
el estado de la técnica actual. Aparece descrito, por ejemplo, en
Schena y col, 1995, Quantitative monitoring of gene expression
patterns with a complementary DNA microarray, "Science"
270:467-470.
La reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa (en adelante, también RT-PCR)
se puede utilizar para cuantificar la expresión de un gen.
Para ello, se obtuvo ADNc a partir de ARN
aislado, por ejemplo, de células tumorales y se utiliza este a
continuación como plantilla para una PCR. Mediante el ADN
amplificado es posible comparar la fuerza de la transcripción de
cada gen.
En una forma de realización preferida, en la
etapa (c) se efectúa el análisis mediante espectrometría de
masas.
Mediante este procedimiento, es posible
identificar los péptidos aislados de forma precisa y eficiente con
gran rendimiento. La utilización de la espectrometría de masas para
la identificación de péptidos en tejido tumoral se describe, por
ejemplo, en Schirle y col, 2000, Identification of
tumor-associated MHC class I ligands by a novel
T-cell independent approach, "Eur. J.
Immunol." 30:2216-2225.
En otra forma de realización preferida, en la
etapa (c) se predicen, mediante la utilización de los bancos de
datos adecuados y a partir de la pauta de expresión, péptidos
antigénicos potenciales y se calibra el espectrómetro de masas con
respecto a estos antígenos predichos.
La utilización de bancos de datos para la
predicción de antígenos potenciales y la utilización de los datos
así obtenidos se describe, por ejemplo, en Schirle y col, 2001,
Combining Computer algorithms with experimental approaches
permits rapid and accurate identification of T-cell
epitopes from defined antigens, "J. Immunol. Methods",
257:1-16. Se pueden encontrar ejemplos de bancos de
datos en http://www.syfpeithi.de y http://www.paproc.de.
En otra forma preferida de realización del
procedimiento, tras la etapa (c) se efectúa, un paso adicional en
el que se analiza la reactividad de leucocitos periféricos,
preferentemente de leucocitos T, ante los péptidos antigénicos
aislados.
En una forma preferida de realización, se
analiza la reactividad de los leucocitos periféricos contra los
péptidos antigénicos aislados mediante la medición del
ARNm-interferón-\gamma y/o el
ARNm-citocina sintetizados por los leucocitos.
La prueba de
ARNm-interferón-\gamma o
ARNm-citocina permite analizar de forma precisa la
reactividad específica de los leucocitos, preferentemente de
linfocitos T, ante los péptidos antigénicos. Ambas sustancias son
secretadas por los linfocitos T activados tras su activación
mediante el péptido antigénico correspondiente.
Esta etapa adicional permite la identificación
de candidatos aún más precisos de entre los péptidos ya
identificados.
En otra forma preferida de realización del
procedimiento, tras la etapa (c) se efectúa un paso adicional en el
que se analiza la existencia de linfocitos T específicos.
Este procedimiento permite determinar en qué
medida ya existen en los pacientes linfocitos T reactivos ante los
péptidos aislados e identificados. Con este paso es posible aplicar
como vacuna tan sólo los péptidos para los que ya existen
linfocitos T en el paciente. Los péptidos pueden aplicarse entonces
para activar estos linfocitos T específicos.
En otro procedimiento preferido, el análisis de
la existencia de linfocitos T específicos se realiza mediante la
marcación de los leucocitos con complejos reconstruidos de moléculas
presentadoras de antígenos y péptidos antigénicos.
En este procedimiento se aplica la llamada
"técnica de tetrámero". La obtención de dichos complejos
reconstruidos (tetrámeros) y su aplicación se describen, por
ejemplo, en Altman y col, 1996, Phenotypic analysis of
antigen-specific T-lympnocytes,
"Science" 274:94-96.
Se describen péptidos inmunoreactivos que se
identifican y/o producen conforme al procedimiento de la presente
invención.
Tras su identificación, estos péptidos se pueden
producir de forma precisa y específica para cada paciente.
Se describe además una composición farmacéutica
que contiene uno o varios péptidos identificados y/o producidos
conforme al procedimiento de la invención.
Esta composición se puede administrar por vía
parenteral, como por ejemplo subcutánea, intradérmica o
intramuscular, o por vía oral. Para ello se disuelven o suspenden
los péptidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y,
preferentemente, acuoso, adicionalmente la composición puede
contener, además, adyuvantes como, por ejemplo, tampones,
aglutinantes, agentes de acoplamiento, etc. Los péptidos también
pueden administrarse junto con sustancias inmunoestimulantes, como
por ejemplo citocinas. Se puede encontrar una descripción completa
de adyuvantes para una composición de este tipo, por ejemplo, en A.
Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª Ed, 2000,
"American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical
Press".
El péptido se puede utilizar para el tratamiento
de enfermedades tumorales y para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades tumorales.
Entre las enfermedades tumorales que se pueden
tratar se encuentran los cánceres de riñón, mama, páncreas,
estómago, testículo y/o piel. La enumeración de enfermedades
tumorales es sólo un ejemplo, es decir, no limita el campo de
aplicación.
El péptido también se puede utilizar en la
evaluación de un tratamiento contra una enfermedad tumoral.
En otras inmunizaciones u otros tratamientos
también se puede aplicar el péptido para la monitorización. Por lo
tanto, el péptido no sólo es útil para el tratamiento, sino también
para el diagnóstico.
Los péptidos también se pueden utilizar para la
preparación de un anticuerpo.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse de
manera convencional mediante la inmunización de animales con una
inyección de los péptidos y la posterior tinción de la
inmunoglobulina.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse
por protocolos estándar, como se describe, por ejemplo, en
"Methods Enzymol." (1986), 121, Hybridoma technology and
monoclonal antibodies.
Se describen moléculas de ácidos nucléicos,
codificantes del péptido aislado mediante el procedimiento conforme
a la invención.
Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser
moléculas de ADN o ARN y, en caso necesario, también se pueden
aplicar en la inmunoterapia del cáncer.
Las moléculas de ácidos nucléicos también pueden
encontrarse en un vector.
Se describe una célula que ha sido modificada
con ayuda de la molécula de ácidos nucleicos de forma que produce
un péptido identificable.
Se describe un procedimiento para la preparación
de un péptido inmunoreactivo mediante el cual se identifica un
péptido y se sintetiza químicamente, in vitro o in
vivo.
Los péptidos pueden producirse mediante enlace
químico de aminoácidos; por ejemplo, mediante el método de
Merrifield, conocido por los expertos en la materia (véase
Merrifield RB, 1963, "J. Am. Chem. Soc."
85:2149-2154).
Los péptidos se pueden producir in vitro,
por ejemplo, en sistemas sin células; in vivo, se producen
con el uso de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe un procedimiento para la preparación
de una vacuna en las siguientes etapas:
- a)
- realización del procedimiento descrito anteriormente,
- b)
- preparación de los péptidos inmunoreactivos identificados y
- c)
- formulación del péptido inmunoreactivo producido.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se presentan y explican, en el
ejemplo y las figuras, ejemplos de realización de la invención. Las
figuras muestran:
Fig. 1 el análisis de expresión de genes
seleccionados mediante RT-PCR cuantitativa;
Fig. 2 la detección de linfocitos T CD8^{+}
específicos de queratina 18
Ejemplo
El departamento de urología de la Universidad de
Tubinga facilitó dos muestras de pacientes que presentaban tumor de
células del riñón confirmado histológicamente. Ninguno de los
pacientes había recibido tratamiento preoperatorio. El paciente n.º
1 (en adelante, RCC01) presentaba la siguiente tipificación HLA:
HLA-A*02 A*68 B*18 B*44; el paciente n.º 2 (en
adelante, RCC13), HLA-A*02 A*24 B*07 B*40.
Las muestras de tumor sometidas a shock térmico
se procesaron como se describe en Schirle, M. y col.
(Identification of tumor-associated MHC class I
ligands by a novel T cell-independent approach,
2000, "European Journal of Immunology",
30:2216-2225). Los péptidos se aislaron con
protocolos estándar mediante el uso del anticuerpo monoclonal
W6/32, específico para la molécula HLA de clase I, o del anticuerpo
monoclonal BB7.2, específico para HLA-A2.
Barnstable, C.J. y col. (Production of monoclonal antibodies to
group A erythrocytes, HLA and other human cell surface
antigens-new tools for genetic analysis, 1978,
"Cell", 14:9-20) y Parham, P. & Brodsky,
F.M. (Partial purification and some properties of BB7.2. A
cytotoxic monoclonal antibody with specificity for
HLA-A2 and a variant of HLA-A28,
1981, "Hum. Immunol.", 3:277-299) describen la
preparación y uso de estos anticuerpos.
Los péptidos obtenidos a partir del tejido
tumoral del paciente RCC01 se separaron mediante HPLC en fase
invertida (sistema SMART, \muRPC C2/C18 SC 2.1/19, Amersham
Pharmacia Biotech) y las fracciones obtenidas se analizaron
mediante nano espectroscopia de masas ESI. Se procedió como se
describe en Schirle, M. y col, Identification of
tumor-associated MHC class I ligands by a novel T
cell-independent approach, 2000, "European
Journal of Immunology", 30:2216-2225.
Los péptidos obtenidos a partir de tejido
tumoral del paciente RCC13 se identificaron, como se ha
mencionado, mediante LC MS capilar, pero con ligeras
modificaciones: 100 \mul de muestra se cargaron, desmineralizaron
y preconcentraron en una precolumna de 300 \mum * 5 mm C18 \mu
(LC Packings). El disolvente y la muestra se administraron con una
bomba de inyección (PHD 2000, Harvard Apparatur, Inc.) con una
inyección impermeabilizada de 100 \mul (1710 RNR, Hamilton) a una
velocidad de 2 \mul/min. Para la separación de los péptidos se
conectó una columna de preconcentración a 75 \mum * 250 mm
C-18 (LC Packings). Finalmente, se efectuó un
gradiente binario con 25-60% B en 70 min, en el que
se redujo la tasa de flujo de 12 \mul/min a, aproximadamente, 300
nl/min, mediante el uso de una conexión TEE (ZT1C, Valco) y una
columna de 300 \mum * 150 mm C-18.
Con el fin de asegurar que el sistema estaba
libre de péptidos sobrantes, se realizó una medición de una muestra
vacía. Se efectuaron fragmentaciones en línea, como se ha descrito,
y los espectros de los fragmentos fueron analizados
manualmente.
Los análisis de las bases de datos (NCBInr, EST)
se efectuaron con MASCOT (http://www.matrixscience.com).
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos de tejido de riñón normal y
maligno se dividieron, se sometieron a shock térmico y se
homogeneizaron con nitrógeno líquido en TRIZOL (Life Technologies),
con ayuda de un mortero y un homogeneizador de rotación
(Heidolph-Instrumente). El ARN completo se depuró
conforme al protocolo del fabricante y, a continuación, se volvió a
depurar con RNeasy (QIAGEN). El ARN completo de tejido humano se
adquirió de Clontech (Human total RNA Master Panel II).
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando Superscript RT II (Life Technologies)
con transcripción inversa se sintetizó ADN bicatenario de 40 \mug
del ARN completo. Los cebadores utilizados para ello (Eurogentec)
fueron fijados por el protocolo de Affymetrix. La transcripción
in vitro se efectuó mediante la utilización del kit
BioArray^{TM} High Yield^{TM} RNA Transkript Labeling
(ENZO Diagnostics, Inc.). Posteriormente, se realizó la
fragmentación e hibridación en GenChips de Affymetrix (HuGeneFL).
La tinción se efectuó con
estreptavidina-ficoeritrina y anticuerpos de
antiestreptavidina biotinilados, siguiendo el protocolo del
fabricante (Affymetrix).
Los datos se analizaron con un escáner GeneArray
de Affymetrix y el software Microarray Analysis Suite 4.0.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADNc que se preparó para las micromatrices
también se utilizó para el análisis cuantitativo de PCR.
Para cada gen se efectuó un enfoque doble (40
ciclos, 95ºC x 15 s, 60ºC x 1 min), en los que se aplicó el sistema
de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems)
utilizándose SYBRGreen. Las muestras se analizaron
independientemente unas de otras entre dos y tres veces. Los
cebadores (MWG-Biotech) fueron seleccionados a
ambos lados de un intrón; la eficiencia del PCR se analizó para
todos los pares de cebadores, dando como resultado aproximado
1.
Se analizó la pureza de los productos de la PCR
en gel de agarosa al 3%. Tras la clonación en el vector
pCR4-TOPO con el kit de clonación TOPO TA
(invitrogen), se verificaron sus secuencias. El análisis de los
datos comprendió el procedimiento C_{T} delta de la
cuantificación relativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de tejido intercaladas sometidas a
shock térmico fueron cortadas con un grosor de 6 \mum y
transformadas durante 15 minutos aproximadamente en etanol al 70%.
Los vehículos se incubaron durante 90 segundos en hematoxilina de
Mayer (Merck), se limpiaron con agua y se incubaron durante 1 minuto
en alcohol al 70%, posteriormente, se incubaron durante 1 minuto en
alcohol al 95%, durante 30 segundos en eosina Y alcohólica (Sigma)
al 1%, 2x2 minutos en etanol al 95%, 2x2 minutos en etanol al 100%
y, finalmente, 2x5 minutos en xileno. Después de dejar secar al
aire durante 15 minutos a los vehículos, se guardaron en un lugar
seco. Se aislaron células epiteliales tubulares normales y células
de carcinoma con el sistema PixCell II LCM (Arcturus Engineering),
mediante disección por captura láser (LCM). El ARN completo se
extrajo en 400 \mul de TRIZOL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron y congelaron células mononucleares
de sangre periférica (en adelante, PBMC) mediante centrifugación en
gradiente (FicoLite H) de dos donantes sanos (HD1 y HD2) tipificados
serológicamente como CMV positivos.
Los complejos de tetrámeros
HLA-A*0201 se prepararon de la siguiente manera, tal
y como describen Altman y col. (1996, Phenotypic analysis of
antigen-specific T-lympnocytes,
"Science" 274:94-96): los péptidos unidos a
HLA-A2, que se utilizaron para la reconstitución,
eran ALLNIKVKL de queratina 18 y NLVPMVATV de pp65 HCMVA. Los
tetrámeros se prepararon mediante la mezcla de los monómeros
biotinilados con estreptavidina-PE o
estreptavidina-APC y 2-3x10^{6}
células se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con ambos tetrámeros:
10 \mug/ml para cada monómero en PBS, 0,01% de NaN_{3}, 2 mM de
EDTA, 50% de suero fetal de ternero. A continuación se añadieron
los anticuerpos monoclonales
Anti-CD4-FITc
(Coulter-Immunotech) y
Anti-CD8-PerCP (Becton Dickinson)
durante 20 minutos. Después de tres lavados, las muestras se fijaron
en tampón FACS y folmaldehído al 1%. Se efectuó un análisis en
cuatro colores en un citómetro FACS Calibur (Becton Dickinson).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la expresión de, aproximadamente,
7000 genes de dos tumores de células de riñón y de su tejido normal
correspondiente. Se pudo comprobar que, en el tejido tumoral, entre
400 y 500 genes estaban sobreexpresados o expresados de forma
selectiva. En los tumores de ambos pacientes se encontraron 70 genes
sobreexpresados. En el paciente n.º 1 se detectaron 268 genes
sobreexpresados y 129 genes expresados de forma exclusiva. La
mayoría de los genes sobreexpresados están asociados al cáncer, es
decir, son oncogenes, genes supresores de tumor o genes que ya se
describieron como sobreexpresados en el cáncer, como por ejemplo el
CCND, el CA9, la sulfotransferasa Cerebrosid y la hormona similar a
la hormona paratiroidea. La proteína asociada al cáncer relacionada
con la diferenciación adiposa (ADFP o adipofilina) muestra el
segundo mayor grado de sobreexpresión. De esta proteína también se
puede decir que, en comparación con el tejido normal de otros
órganos (no sólo en comparación con el tejido normal del riñón) se
encuentra altamente sobreexpresada en el tejido tumoral.
Con el fin de verificar los datos obtenidos a
partir del análisis en micromatrices, se analizó la expresión de
genes seleccionados mediante PCR cuantitativa. En la figura 1 se
muestra el análisis de la expresión de genes seleccionados mediante
RT-PCR. La RT-PCR se efectuó
utilizando el mismo ADNc que se aplicó en el análisis en
micromatrices. El número de copias se indica con referencia al ARNr
18S y es normalizado en relación al tejido normal (=1) de los
pacientes. Las rayas negras representan el número en el tejido
tumoral del paciente RCC01, las rayas blancas el del tejido normal
y las rayas grises diagonales representan el número en el tejido
tumoral del paciente RCC13.
La sobreexpresión de adipofilina (ADFP) y
ciclina D1 (CCND1) probada por micromatriz se pudo comprobar PCR
cuantitativa. También se pudo comprobar que ets-1
(ETS1) en tejido normal y de tumor está fuertemente expresado. Los
niveles de expresión relativos detectados con ambas técnicas eran
semejantes.
La adipofilina mostró un factor de
sobreexpresión de 29,1 en el análisis en micromatriz del tejido
tumoral del paciente RCC01 y de 18,1 en la PCR cuantitativa (véase
la figura 1). En el paciente RCC13 se detectó un factor de 11,4 en
el análisis en micromatriz y de 6,7 en la PCR cuantitativa (véase
figura 1). La galectina 2 (LGALS2) aparecía sobreexpresada en el
paciente RCC01, la queratina 18 (KRT18) en el paciente RCC13.
Excepcionalmente, los datos de sobreexpresión de KIAA0367 y del
proto-oncogen met (MET) en el paciente RCC13
obtenidos en el análisis en micromatrices y los obtenidos en la PCR
cuantitativa no coincidieron.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron en total 85 ligandos de los
tejidos tumorales, ligados a los subtipos de HLA
HLA-A*02, HLA-A*68,
HLA-B*18 o HLA-B*44. Los péptidos
ligados a HLA-A*02 presentaron el motivo peptídico
específico de alelo (leucina, valina, isoleucina, alanina,
metionina en la posición 2; leucina, valina, isoleucina o alanina en
el C-terminal). La mayoría de los ligandos
provenían de las llamadas "proteínas de mantenimiento", pero
también se pudieron detectar ligandos de proteínas con asociación
demostrada a tumores, como, por ejemplo, YVDPVITSI del
proto-oncogen met, ALLNIKVKL de la queratina 18 y
SVASTITGV de la adipofilina.
Los ligandos HLA-A*68 se
identificaron por sus aminoácidos de anclaje treonina, isoleucina,
valina, alanina o leucina en la posición 2 y arginina o lisina en
el C-terminal. Con los ligandos
HLA-A*68 se pudieron identificar otros dos péptidos
de adipofilina: MTSALPIIQK y MAGDIYSVFR. Los ligandos con ácido
glutamínico en la posición 2 se clasificaron como
HLA-B*44 y el motivo peptídico de
HLA-B*18 todavía no se conoce, por lo que no fue
posible clasificar los ligandos de estas dos moléculas
HLA-B.
La comparación de los datos de las micromatrices
con los ligandos aislados demostró que 10 genes sobreexpresados
actuaban como fuente para los ligandos MHC: adipofilina, KIAA0367,
SEC14-similar 1, gen de translocación celular B 1,
Aldolasa A, ciclina Dl, anexina A4, catenina alfa 1, galectina 2 y
LMP2. Tres de estos genes ya aparecen en la base de datos SEREX:
KIAA0367, Aldolasa A y catenina alfa 1.
En el paciente RCC13 se pudo identificar un
ligando especialmente interesante (ALAAVVTEV), codificado por un
marco de lectura que, en comparación con el polipéptido 3
DEAD/H-Box (DDX3) estaba desplazado por un
nucleótido. ALAAVVTEV es codificado por los nucleótidos
317-343 de la cadena codificante de DDX3, mientras
que los nucleótidos 316 a 342 codifican para GIGSRGDRS, de la
proteína DDX3.
Se analizaron PBMC de 6 pacientes de tumor de
células de riñón HLA-A2^{+} para buscar una
reacción a cuatro de los péptidos: ligandos unidos a
HLA-A*02 de adipofilina, queratina 18, KIAA0367 y
proto-oncogen met. Para ello se realizó un ensayo
de alta sensibilidad de PCR cuantitativo con el fin de comprobar,
tras una sensibilización in vitro con el péptido, la
producción de
interferón-\gamma-ARNm por los
linfocitos T CD8^{+}. Tras la estimulación con péptidos del
proto-oncogen met, queratina 18 o adipofilina, se
pudieron registrar respuestas esporádicas.
La tinción de PBMC con tetrámeros
HLA-A 0201 de pacientes de tumor e individuos sanos
se realizó con tetrámeros constituidos con adipofilina, con
queratina 18 o con el proto-oncogen met.
En la figura 2 se muestra la detección de
linfocitos T específicos de queratina 18. Se tiñeron PBMC de cuatro
donantes sanos HLA-A* 02^{+} (HD1, 2, 4, 6)
simultáneamente con tetrámeros de queratina
18-PE/HLA-A2, tetrámeros
CMV-APC /HLA-A2,
CD8-PerCP y CD4-FITC. Las
transferencias de puntos muestran los resultados de 1 a 3
experimentos independientes para 1x10^{6} PBMC. Los puntos
representan el porcentaje de células de tetrámeros positivos en la
población de CD8^{+} CD4^{-}.
Se encontró de forma inesperada una población
significante de linfocitos T CD8^{+} específicos para la queratina
18 (entre 0,02% y 0,2% de los linfocitos T CD8^{+}) en 4 de 22
individuos sanos. Esta población no presentó ningún tinte con un
tetrámero CMV, lo que demuestra que el enlace del tetrámero de
queratina 18 era específico.
En resumen, se puede afirmar que el repertorio
de linfocitos T humanos contiene linfocitos T CD8^{+} específicos
para el péptido de queratina 18.
Claims (8)
1. Procedimiento in vitro para la
identificación de ligandos MHC en las siguientes etapas:
- a)
- preparación de una muestra de tejido tumoral y su correspondiente tejido sano,
- b)
- determinación de la pauta de expresión tumoral específica de dicha muestra,
- c)
- aislamiento y análisis de los ligandos MHC de la muestra de tejido tumoral,
- d)
- comparación de los datos obtenidos en las etapas (b) y (c), e
- e)
- identificación de ligandos MHC sobre la base de los datos comparados.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque la etapa (b) se realiza por un análisis
en micromatriz y/o por reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa.
3. Procedimiento conforme a las reivindicaciones
1 o 2, caracterizado porque los análisis de la etapa (c) se
efectúan con un espectrómetro de masas.
4. Procedimiento conforme a la reivindicación 3,
caracterizado porque en la etapa (c) se predicen péptidos
antigénicos potenciales por el perfil de expresión y mediante la
utilización de bases de datos adecuadas, calibrándose el
espectrómetro de masas conforme a esto.
5. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, tras la etapa
(c), se efectúa un paso adicional en el que se analiza la
reactividad de leucocitos periféricos, preferentemente de linfocitos
T, ante los péptidos antigénicos aislados.
6. Procedimiento conforme a la reivindicación 5,
caracterizado porque el análisis de la reactividad se realiza
midiendo la citocina-ARNm y/o
interferón-\gamma-ARNm
sintetizadas por leucocitos.
7. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque, tras la etapa
(c), se efectúa otra etapa en la que se analiza la existencia de
linfocitos T específicos.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7,
caracterizado porque el análisis de la existencia de
linfocitos T específicos se realiza mediante marcación de los
leucocitos con complejos reconstruidos de moléculas presentadoras
de antígenos y péptidos antigénicos.
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