ES2311731T3 - Proteinas de accion pesticida y polinucleotidos que se pueden obtener a partir de especies de paenibacillus. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de selección de un cultivo de aislamiento de Paenibacillus para un gen que codifica una proteína seleccionada entre el grupo constituido por una proteína de complejo de toxina, en el que dicho procedimiento comprende al menos una de las siguientes etapas: (a) obtener ADN a partir de dicho cultivo y ensayar dicho ADN para evaluar la presencia de dicho gen; y (b) obtener proteína producida por dicho cultivo y ensayar dicha proteína para evaluar la presencia de una proteína que indica la presencia de una proteína que indica la presencia de dicho gen en dicho aislamiento, y al menos una de las siguientes etapas: (c) realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos un cebador que se hibrida en condiciones de PCR con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41, (d) inmunorreacción de un anticuerpo con dicha proteína en la que dicho anticuerpo se une a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41, e (e) hibridar una sonda de ácido nucleico con dicho ADN en el que dicha sonda se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada a alta con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41.

Description

Proteínas de acción pesticida y polinucleótidos que se pueden obtener a partir de especies de Paenibacillus.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional Nº de serie 60/392.633, presentada el 28 de junio de 2002, y a la solicitud provisional Nº de serie 60/441.647, presentada el 21 de enero de 2003.

Antecedentes de la invención

Los insectos y plagas cuestan a los granjeros miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cosechas y en gasto de mantenimiento de estas plagas bajo control. Las pérdidas provocadas por plagas de insectos en ambientes de producción agrícola incluyen disminuciones en el rendimiento de las cosechas, reducción en la calidad de la cosecha, y aumento de los costes de la recolección. Las plagas de insectos también son una carga para los cultivadores de hortalizas y frutos, a los productores de flores ornamentales y a los jardineros del hogar y a los dueños de la casa.

Los procedimientos de cultivo, tal como una rotación de cosechas y la aplicación de altos niveles de fertilizadores de nitrógeno, han dirigido parcialmente los problemas provocados por las plagas agrícolas. Sin embargo, las demandas económicas de la utilización de la tierra cultivada restringen el uso de la rotación de cosechas. Además, las características de hibernación de algunos insectos desbaratan las rotaciones de las cosechas en algunas áreas.

De este modo, los insecticidas químicos sintéticos confían en la mayor medida en lograr un nivel suficiente de control. Sin embargo, el uso de insecticidas químicos sintéticos puede tener varios inconvenientes. Por ejemplo, el uso de algunos de estos compuestos químicos puede afectar de manera adversa a los insectos beneficiosos. Los insectos diana también han desarrollado resistencia a algunos pesticidas químicos. Esto se ha aliviado parcialmente mediante diversas estrategias de dirección a la resistencia, pero existe una creciente necesidad de agentes alternativos de control de plagas. Además, grandes poblaciones de gorgojos, abundantes lluvias, y calibración impropia de equipo de aplicación de insecticida puede dar como resultado un escaso control. El uso inapropiado de insecticidas alcanza asuntos ambientales tales como la contaminación d suelo y de tanto los suministros de agua superficial como subterráneos. Los residuos también pueden permanecer en los frutos tratados, hortalizas y otras plantas tratadas. El trabajo con algunos insecticidas también puede plantear riesgos para las personas que los aplican. Por lo tanto, los insecticidas químicos sintéticos se están examinando de manera creciente por sus consecuencias ambientales potencialmente tóxicas. Las nuevas restricciones rigurosas en el uso de pesticidas y la eliminación de algunos pesticidas eficaces del mercado pueden limitar las opciones económicas y eficaces para el control de las plagas dañinas y costosas.

Debido a los problemas asociados al uso de pesticidas químicos sintéticos, existe una evidente necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. El reemplazo de pesticidas químicos sintéticos, o las combinaciones de estos agentes con pesticidas biológicos, puede reducir los niveles de compuestos químicos tóxicos en el ambiente.

Algunos agentes pesticidas biológicos que ahora se están usando con algo de éxito se derivan de microbios del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria Gram-positiva, formadora de esporas. La mayoría de las cepas de B.t. no muestran actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen, y se pueden caracterizar mediante, inclusiones de proteína cristalina parasporal. Estas inclusiones a menudo aparecen de manera microscópica como cristales configurados de manera característica. Algunas proteínas de B.t. son altamente tóxicas par alas plagas, tales como insectos, y son específicos en su actividad tóxica. Ciertas proteínas de B.t. están asociadas a las inclusiones. Estas "\delta-endotoxinas" son diferentes de las exotoxinas, que tienen una gama de huésped no específica. Otras especies de Bacillus también producen proteínas pesticidas.

Ciertos genes de la toxina de Bacillus se han aislado y secuenciado, y los productos a base de ADN recombinante se han producido y aprobado para uso. Además, con el uso de técnicas de ingeniería genética, se están perfeccionando diversos planteamientos para administrar estas toxinas a ambientes agrícolas. Éstos incluyen el uso de plantas modificadas por ingeniería genética con genes de toxinas para resistencia a insectos y el uso de células microbianas intactas estabilizadas como vehículos de distribución de toxinas. De este modo, los genes de toxina aislados de Bacillus llegan a ser valiosos desde el punto de vista comercial.

El uso comercial de los pesticidas de B.t. estaba inicialmente restringido a la dirección de un intervalo estrecho de plagas de lepidópteros (oruga). Las preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis subespecie kurstaki se han usado durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 produce una \delta-

\hbox{endotoxina que es tóxica para  las
larvas de numerosos insectos de lepidópteros.}

Más recientemente, se han identificado nuevas subespecies de B.t., y se han aislado los genes responsables de las proteínas activas de \delta-endotoxina. Höfte y Whiteley clasificaron los genes de la proteína cristalina de B.t. en cuatro clases principales (Höfte, H., H.R. Whiteley [1989] Microbiological Reviews 52 (2): 242 - 255). Las clases eran CryI (específica de Lepidoptera), CryII (específica de Lepidoptera y Diptera), CryIII (específica de Coleópteros), y CryIV (específica de Diptera). Se ha reseñado el descubrimiento de cepas específicamente toxicas para otras plagas. Por ejemplo, CryV y CryVI se propusieron para designar una clase de genes de toxina que son específicas de nematodos.

Las proteínas cristalinas CryI específicas de lepidópteros, en su estado natural, proteínas de aproximadamente 130 a 140 kDa, que se acumulan en las inclusiones cristalinas bipiramidales durante la esporulación de B. thuringiensis. Estas proteínas son protoxinas que se solubilizan en ambiente alcalino del intestino medio de insectos y se convierten de manera proteolítica mediante proteasas asociadas a cristal o del intestino medio de larvas en un fragmento del núcleo tóxico de 60 a 70 kDa. Esta activación también se puede llevar a cabo in vitro con una diversidad de proteasas. El dominio tóxico se localiza en la mitad N-terminal de la protoxina. Esto se demostró para las proteínas CryIA(b) y CryIC mediante la secuenciación de aminoácidos N- terminal de la toxina activada por tripsina. Höfte et al. 1989. La escisión se produce en el extreme C-terminal de una región conservada llamada "Bloque 5", que forma de esta manera el extremo C de la toxina del núcleo. Un segmento corto de protoxina N - terminal también se puede procesar fuera. El sitio de la escisión N-terminal está también altamente conservado para las proteínas CryIA y CryID, que sugiere que estas proteínas, el extremo N del fragmento tóxico se localiza en la misma posición. Sin embargo, CryIB, es diferente de las otras proteínas de CryI en esta región. Se ha sabido si esta proteína también se procesa en el extremo N. Höfte et al. 1989.

El análisis de supresión de varios genes cryI confirmó además que la mitad 3' de la protoxina no se requiere para la actividad tóxica. Uno de los fragmentos reseñados más cortos se localizó entre los codones 29 y 607 para CryIAb. Además la retirada de cuatro codones del extremo 3' u ocho codones de codones del extremo 5' completamente suprimían la actividad tóxica del producto génico. Se realizaron observaciones similares para los genes cryIA(a) y cryLA(c). Höfte et al. 1989.

Los genes cryII codifican las proteínas de 65 kDa que forman inclusiones en forma de cubo en cepas de varias subespecies. Estas proteínas cristalinas se designaron previamente proteínas "P2", como opuestas a las proteínas cristalinas de 130 kDa P1 presentes en las mismas cepas. Höfte et al. 1989.

Un gen A cryILA se clonó a partir de B. thuringiensis subsp. kurstaki HD- 263 y se expresó en Bacillus megaterium. Las células que producen la proteína CryIIA eran tóxicas para las especies de lepidópteros Heliothis virescens y Lymantria dispar así como para las larvas de los dípteros Aedes aegypti. Widner y Whitely (1989, J. Bacteriol. 171:965 - 974) dos genes clonados relacionados (cryIIA y cryIIB) de B. thuringgiensis subsp. kurstaki HD-1. Ambos genes codifican las proteínas de 633 aminoácidos con una masa molecular predicha de 71 kDa (ligeramente mayor que la masa molecular aparente determinada para las proteínas P2 producidas en B. thuringieiensis). Aunque las proteínas CryIIA y CryIIB son altamente homólogas (\sim 87% de identidad de aminoácidos), difieren en el espectro insecticida. CryIIA is es activa tanto contra una especie de lepidópteros (Manduca sexta) como una de dípteros (Aedes aegypti), mientras cryIIB es tóxica solamente para los insectos lepidópteros. Höfte et al. 1989. Las toxinas CryII, como grupo, tienden a ser relativamente más conservadas a nivel de secuencias (> 80% de identidad) que otros grupos. Por el contrario, existen muchas toxinas CryI, por ejemplo, incluyendo algunas que son menos de 60% idénticas.

El esquema de nomenclatura y clasificación de 1989 de Höfte y Whiteley para las proteínas cristalinas se basaba en tanto la secuencia de aminoácidos deducida como la gama de huésped de la toxina. Ese sistema se adaptó para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxinas que se dividieron en cinco clases principales. El esquema de nomenclatura de 1989 llegó a no poderse utilizar ya que se descubrieron más y más genes que codificaban proteínas con espectros variables de actividad pesticida. De este modo, se adoptó un esquema de nomenclatura revisado, que se basa solamente en la identidad de aminoácidos (Crickmore et al., 1998, Microbiology y Molecular Biology Reviews 62: 807 - 813). El código mnemotécnico "cry" se ha mantenido para todos los genes de toxinas excepto cytA y cytB, que mantiene una clase separada. Se han cambiado los números romanos por números árabes en la categoría primaria, y y se han eliminado los paréntesis en la categoría terciaria. Muchos de los nombres originales se han mantenido, con las excepciones indicadas, aunque se han vuelto a clasificar numerosas. Existen ahora al menos 37 clases primarias de proteínas Cry, y y dos clases primarias de toxinas cyt. Otros tipos de toxinas, tales como las de los documentos WO 98/18932 y WO 97/40162, se han descubierto a partir de B. thuringiensis.

Existen algunos obstáculos para el uso exitoso agrícola de proteínas pesticidas de Bacillus (y otras especies biológicas). Ciertos insectos pueden ser refractarios a las toxinas de Bacillus. Los insectos tales como los grillos de la cápsula del algodonero, gusano negro, y Helicoverpa zea, así como insectos adultos de la mayoría de las especies, no han demostrado hasta ahora ninguna sensibilidad significativa a muchas \delta-endotoxinas de B.t.

Otro obstáculo potencial es el desarrollo de resistencia a toxinas de B.t. por los insectos. Las toxinas de proteínas de B.t. se formularon inicialmente como agentes de control de insectos pulverizables. Una aplicación más reciente de la tecnología de B.t. ha sido aislar y transformar plantas con genes que codifican estas toxinas. Las plantas transgénicas posteriormente producen estas toxinas, proporcionando por lo tanto control de insectos. Véase Las patentes de Estados Unidos números 5,380,831; 5,567,600; y 5,567,862 de Mycogen Corporation. Las plantas de B.t. transgénicas son completamente eficaces, y se predice que el uso sea alto en algunos cultivos y áreas. Esto ha provocado que pueda surgir algún interés en los asuntos de manejo de resistencia más rápidamente que con las aplicaciones pulverizables. Aunque numerosos insectos se han seleccionado para la resistencia a toxinas de B.t. en el laboratorio, solamente la polilla de dorso diamante (Plutella xylostella) ha demostrado resistencia en un campo establecido (Ferre, J. y Van Rie, J., Annu. Rev. Entomol. 47: 501 - 533, 2002).

Las estrategias de manejo de resistencia en la tecnología de plantas transgénicas en B.t. han llegado a ser de gran interés (por ejemplo, como en una bacteria natural, se pueden exponer en la misma planta diversas toxinas múltiples, reduciendo por lo tanto en gran medida la posibilidad de que un insecto que podría ser resistente a una toxina sobreviviera para ampliar la resistencia). Se han sugerido diversas estrategias para conservar la capacidad de usar de manera eficaz toxinas de B. thuringiensis. Estas estrategias incluyen alta dosis con protección, y alternando con, o despliegue conjunto de, diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol 16: 144 - 146).

De este modo, existe una gran necesidad de desarrollar genes adicionales que se pueden expresar en plantas con el fin de controlar de manera eficaz diversos insectos. Además de intentar continuamente descubrir nuevas toxinas de B.t., sería completamente deseable descubrir otras fuentes bacterianas (distintas de B.t.) que producen toxinas que se podrían usar en estrategias de plantas transgénicas, o que se podrían combinar con B.t.s para producir plantas transgénicas que controlan insectos.

Los esfuerzos recientes para clonar genes de toxinas insecticidas a partir del grupo de bacterias Photorhabdus/Xenorhabdus presentan potenciales alternativas a las toxinas derivadas de B. thuringiensis. Se ha sabido en la técnica que las bacterias del género Xenorhabdus están asociadas de manera simbiótica con el nematodo Steinernema. Desafortunadamente, como se indica en numerosos artículos, las bacterias solamente tienen actividad pesticida cuando se inyectan en larvas de insecto y no mostraron actividad biológica cuando se administran por vía oral.

Ha sido difícil explotar de manera eficaz las propiedades insecticidas del nematodo su bacteria simbiótica. De este modo, sería totalmente deseable descubrir agentes proteináceos de las bacterias Xenorhabdus que tienen actividad oral se manera que los productos producidos a partir de ellos se podrían formular en forma de un insecticida pulverizable, o los genes bacterianos que codifican dichos agentes proteináceos se pueden aislar y usar en la producción de plantas transgénicas. El documento WO 95/00647 se refiere al uso de la toxina proteica de Xenorhabdus para controlar insectos, pero no reconoce toxinas activas por vía oral. El documento WO 98/08388 se refiere a agentes pesticidas administrados por vía oral de Xenorhabdus. La patente de Estados Unidos Nº 6.048.838 se refiere a complejos toxinas proteicas/toxina, que tienen actividad oral, que se puede obtener a partir de especies y cepas de Xenorhabdus.

Photorhabdus y Xenorhabdus spp. Son bacterias Gram negativas que de manera entomopatogénica y simbiótica están asociadas a nematodos del suelo. Estas bacterias se encuentran en el intestino de nematodos entomopatogénica que invaden y matan insectos. Cuando el nematodo invade un huésped insecto, las bacterias se liberan en el hemocoel de insectos (el sistema circulatorio abierto), y tanto las bacterias como los nematodos sometidos a múltiples rondas de replicación; el huésped insecto típicamente muere. Estas bacterias se pueden cultivar fuera de los huéspedes nematodos. Para una descripción más detallada de estas bacterias, véase Forst y Nealson, 60 Microbiol. Rev. 1 (1996), p. 21 - 43.

El género Xenorhabdus se define de manera taxonómica como un miembro de la familia Enterobacteriaceae, aunque tiene ciertos caracteres atípicos de esta familia. Por ejemplo, cepas de este género son típicamente negativas a la reducción de nitratos y catalasa negativas. Xenorhabdus se ha subdividido solamente recientemente para crear un Segundo género, Photorhabdus, que comprende especies individuales Photorhabdus luminescens (previamente Xenorhabdus luminescens) (Boemare et al., 1993 Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 249-255). Esta diferenciación se basa en varias características distintivas que se identifican fácilmente por los expertos en la técnica. Estas diferencias incluyen las siguientes: estudios de caracterización de ADN-ADN; presencia (Photorhabdus) o ausencia fenotípica (Xenorhabdus) de actividad catalítica; presencia (Photorhabdus) o ausencia (Xenorhabdus) de bioluminescencia; la Familia del huésped nematodo en la que Xenorhabdus se encuentra en Steinernematidae y Photorhabdus la pase encuentra en Heterorhabditidae); así como en comparación, análisis de ácidos grasos celulares (Janse et al. 1990, Lett. Appl. Microbiol. 10, 131 - 135; Suzuki et al. 1990, J. Gen. Appl. Microbiol., 36, 393 - 401). Además, recientes estudios moleculares centralizados en análisis de secuencia (Rainey et al. 1995, Int. J. Syst. Bacteriol., 45, 379 - 381) y de restricción (Brunel et al., 1997, App. Environ. Micro., 63, 574 - 580) de los genes de 16S rRNA también apoyan la separación de estos dos géneros.

Los caracteres esperados para Xenorhabdus son los siguientes: bastones Gram negativos, colonia de pigmentación amarilla/parda, presencia de cuerpos de inclusión, ausencia de catalasa, incapacidad de reducir nitratos, ausencia de bioluminiscencia, capacidad de aceptar tintes del medio, hidrólisis por gelatina positiva, crecimiento en medios selectivos de Enterobacteriaceae, crecimiento por debajo de una temperatura de 37ºC, supervivencia en condiciones anaeróbicas, y motilidad.

Actualmente, el género bacteriano Xenorhabdus comprende cuatro especies reconocidas, Xenorhabdus nematophilus, Xenorhabdus poinarii, Xenorhabdus bovienii y Xenorhabdus beddingii (Brunel et al., 1997, App. Environ. Micro., 63, 574 - 580). Se han descrito una diversidad de cepas relacionadas en la bibliografía (por ejemplo, Akhurst y Boemare 1988 J. Gen. Microbiol., 134, 1835 - 1845; Boemare et al. 1993 Int. J. Syst. Bacteriol. 43, p. 249 - 255; Putz et al. 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56, 181 - 186, Brunel et al.,1997,App. Environ. Micro., 63, 574 -5 80, Rainey et al. 1995, Int. J. Syst. Bacteriol., 45, 379- 381).

Las bacterias Xenorhabdus y Photorhabdus secretan una amplia diversidad de substancias en el medio de cultivo; estas secreciones incluyen lipasas, proteasa, antibióticos y lipopolisacáridos. La purificación de diferentes fracciones de proteasa se ha demostrado claramente que no están implicadas en la actividad tóxica oral del medio de cultivo de P. luminescens (que se ha determinado posteriormente que reside con las proteínas Tc solamente). Varias de estas sustancias han estado previamente implicadas en la toxicidad de insectos pero hasta recientemente no se había clonado ningún gen insecticida. Sin embargo, la purificación y separación de proteasas también facilitará un examen de de su papel supuesto en, por ejemplo, inhibición de las proteínas antibacterianas tal como cecropina. R.H. ffrench-Constant y Bowen, Current Opinions in Micriobiology, 1999, 12: 284 - 288. Véase R.H. ffrench-Constant et al. 66 AEM No. 8, p. 3310 - 3329 (agosto. 2000), para una revisión de los diversos factores implicados en la virulencia de Photorhabdus de insectos.

Ha habido un progreso sustancial en la clonación de genes que codifican toxinas insecticidas tanto de Photorhabdus luminescens como de Xenorhabdus nematophilus. El complejo de toxina que codifica los genes de P. luminescens se examinaron primero. Veáse, por ejemplo, el documento WO 98/08932. Los genes "Paralelos" se clonaron más recientemente a partir de X. nematophilus. Morgan et al., Applied and Environmental Microbiology 2001, 67: 2062 - 69.

Se han identificado cuatro diferentes complejos de toxinas (TCs)-Tca, Tcb, Tcc y Tcd en Photorhabdus spp. Cada uno de estos complejos de toxina resuelve tanto especies individuales como dímeras en un gel de agarosa nativo pero la resolución en un gel desnaturalizante revela que cada complejo consta de un intervalo de especies entre 25 - 280 kDa. Los ORF que codifican las TC de Photorhabdus, conjuntamente con los sitios de escisión de proteasas (flechas verticales), se ilustran en la Figura 1. Véase también R.H. ffrench-Constant y Bowen, 57 Cell. Mol. Life Sci. 828 - 833 (2000).

Las bibliotecas genómicas de P. luminescens se seleccionaron con sondas de ADN y con anticuerpos monoclonales y/o policlonales inducidos contra las toxinas. Se clonaron cuatro loci de tc: tca, tcb, tcc y tcd. El locus tca es un operón supuesto de tres marcos abiertos de lectura (ORFs), tcaA, tcaB, y tcaC transcritos a partir de la misma hebra de ADN, con un ORF terminal más pequeño (tcaZ) que se transcribe en la dirección opuesta. El locus tcc también comprende tres ORF supuestamente transcritos en la misma dirección (tccA, tccB, y tccC). El locus tcb es un único ORF grande (tcbA), y el locus tcd se compone de dos ORF (tcdA y tcdB); tcbA y tcdA, cada uno de aproximadamente 7,5 kb, codifican grandes toxinas de insectos. TcdB tiene homología con TcaC. Muchos de estos productos génicos se determinaron que estaban escindidos por proteasas. Por ejemplo, tanto TcbA como TcdA se escinden en tres fragmentos denominados i, ii y iii (por ejemplo, TcbAi, TcbAii y TcbAiii). Los productos de los ORFs tca y tcc también se escinden. Véase la Figura 1. Véase también R.H. ffrench-Constant y D.J. Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999, 12:284 - 288.

Los bioensayos de de los complejos de toxina Tca revelaron que eran altamente tóxicos para el gusano cornudo del tomate en primera fase (Manduca sexta) cuando se proporciona por vía oral (LD50 de 875 ng por centímetro cuadrado de dieta artificial). R.H. ffrench-Constant y Bowen 1999.

La alimentación se inhibió a dosis de Tca tan bajas como 40 ng/cm^{2}. dado el alto peso molecular predicho de Tca, en base molar, las toxinas de P. luminescens son altamente activas y relativamente pocas moléculas parecen ser necesarias para ejercer un efecto tóxico R.H. ffrench-Constant y Bowen, Current Opinions in Micriobiology, 1999, 12:284 - 288.

Ninguno de los cuatro loci mostraban similitud global con todas las secuencias de función conocida en GenBank. Las regiones de similitud de secuencia realzaban alguna sugerencia de que estas proteínas (TcaC y TccA) pueden superar la inmunidad de insectos mediante ataque a los hemocitos de insecto. R.H. ffrench-Constant y Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999, 12:284 - 288.

TcaB, TcbA, y TcdA todas muestran la conservación de aminoácidos (\sim 50% de identidad), comparados entre sí, inmediatamente alrededor de sus sitios de escisión de proteasas predicho. Esta conservación entre tres diferentes proteínas TC que sugieren que todas pueden estar procesadas por las mismas o similares proteasas. TcbA y TcdA también comparten \sim 50% de identidad global, así como un patrón pronosticado similar de la escisión tanto carboxi- como amino- terminal. Se postula que estas proteínas podrían así ser homólogas de otras. Además, el tamaño similar, grande de TcbA y TcdA, y también el hecho que ambas toxinas parece que actúan sobre el intestino del insecto, puede sugerir modos similares de acción. R.H. ffrench-

\hbox{Constant
y Bowen, Current Opinions  in Microbiology, 1999, 12: 284 -
288.}

Los estudios de supresión/inactivación genética sugieren que los productos de los loci tca y tcd loci son responsables de la toxicidad oral para los lepidópteros. La supresión de cualquiera de los genes tca o tcd reducía en gran medida la actividad oral contra Manduca sexta. Esto es, los productos de los loci tca y tcd loci son toxinas orales para los lepidópteros por sí mismas; su efecto combinado contribuía a la mayoría de la actividad oral secretado. R.H. ffrench-Constant y D.J. Bowen, 57 Cell. Mol. Life. Sci. 831 (2000). De manera interesante, la supresión de cualquiera de los loci tcb o tcc solo también reduce la mortalidad, los que sugiere que existen interacciones de complejo entre los productos génicos diferentes. De este modo, los productos del locus tca pueden potenciar la toxicidad de los productos tcd. Como alternativa, los productos tcd pueden modular la toxicidad de los productos tca y posiblemente otros complejos. Hay que hacer notar que lo anterior se relaciona con la actividad oral contra una única especie de insecto, los loci tcb o tcc pueden producir toxinas que son más activas contra grupos de insectos (o activos mediante la inyección directamente en la vía hemocoel de insectos-normal de administración cuando se secreta mediante las bacterias in vivo). R.H. ffrench- Constant y Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999, 12: 284 - 288.

El documento WO 01/11029 describe secuencias de nucleótidos que codifican TcdA y TcbA y tienen composiciones de base que se han alterado a partir de los genes nativos para hacerlos más similares a los genes de plantas. También se describen plantas transgénicas que expresan la Toxina A y Toxina B.

De las toxinas separadas aisladas de Photorhabdus luminescens (W- 14), las denominadas Toxina A y Toxina B han sido el sujeto de la investigación centralizada para su actividad contra especies de insecto diana de interés (por ejemplo, el gusano de la raíz del maíz). La toxina A comprende dos subunidades diferentes. El gen nativo tcdA codifica la protoxina TcdA. Como se determina mediante espectrometría de masas, TcdA se procesa por una o más proteasas para proporcionar la Toxina A. Más específicamente, TcdA es una proteína de aproximadamente 282,9 kDa (2516 aa) que se procesa para proporcionar TcdAi (los primeros 88 aminoácidos), TcdAii (los siguientes 1849 aa; una proteína de aproximadamente 208,2 kDa codificada por los nucleótidos 265 - 5811 de tcdA), y TcdAiii, una proteína de aproximadamente 63,5 kDa (579 aa) (codificada por los nucleótidos 5812 - 7551 de tcdA). TcdAii y TcdAiii parecen ensamblarse en un dímero (quizás ayudada por TcdAi), y los dímeros se ensamblan en un tetrámero de cuatro dímeros. La toxina B se deriva de manera similar de TcbA.

Aunque las interacciones moleculares exactas de las proteínas TC entre sí, y su mecanismo(s) de acción, no se entienden actualmente, se sabe, por ejemplo, que el complejo de toxina Tca de Photorhabdus es tóxico para Manduca sexta. Además, algunas proteínas TC se sabe que tienen actividad insecticida "autónomas", mientras otras proteínas de TC se sabe que potencian o aumentan la actividad de las toxinas autónomas. Se sabe que la proteína TcdA es activa, sola, contra Manduca sexta, pero que TcdB y TccC, conjuntamente, se pueden usar para potenciar la actividad de TcdA. Waterfield, N. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67:5017 - 5024. TcbA (existe solamente una proteína Tcb) es otra toxina autónoma de Photorhabdus. La actividad de esta toxina (TcbA) también se puede potenciar mediante TcdB conjuntamente con proteínas de tipo TccC.

La solicitud de Patente de Estados Unidos 20020078478 proporciona secuencias de nucleótidos para dos genes potenciadores, tcdB2 y tccC2, de la región genómica de tcd de Photorhabdus luminescens W-14. Se sabe en este documento que la coexpresión de tcdB y tccC1 con tcdA da como resultado niveles potenciados de toxicidad a los insectos oral comparada a la obtenida cuando tcdA se expresa solo. La expresión conjunta de tcdB y tccC1 con tcdA o tcbA proporciona actividad de insecto oral potenciada.

Como se indica en la Tabla a continuación, TccA tiene un nivel de homología con el extremo N de TcdA, y TccB tiene algún nivel de homología con el extremo C de TcdA. TccA y TccB son mucho menos activos sobre ciertos insectos de ensayo que es TcdA. TccA y TccB de la cepa Photorhabdus W-14 se llaman "Toxina D". "Toxina A" (TcdA), "Toxina B" (TcbA), y "Toxina C" (TcaA y TcaB) también se indican a continuación. Además, TcaA tiene algún nivel de homología con TccA y del mismo modo con el extremo N de TcdA. Incluso además, TcaB tiene algún nivel de homología con TccB y del mismo modo con el extremo N de TcdA. TccA y TcaA son de tamaño similar, como lo son TccB y TcaB. TcdB tiene un nivel significativo de similitud (tanto en secuencia como en tamaño) a TcaC.

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El epitelio del intestino medio de insectos contiene tanto células en forma de columna (estructurales) como de copa (secretorias. La ingestión de los productos de tca por M. sexta conduce a una ingestión apical de y formación de burbujas de grandes vesículas citoplásmicas por las células en forma de columna, que conducen a la extrusión eventual de núcleos de células en vesículas en el lumen del intestino. Las células de copa también están afectadas aparentemente de la misma manera. Los productos de tca actúan en el intestino medio después de cualquier administración oral o inyección. R.H. ffrench-Constant and D.J. Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999, 12: 284 - 288. Los productos purificados de tca han mostrado toxicidad oral contra Manduca sexta (DL_{50} de 875 ng/cm^{2}). R.H. ffrench-Constant y D.J. Bowen, 57 Cell. Mol. Life Sci. 828 - 833 (2000).

El documento WO 99/42589 y la patente de Estados Unidos Nº 6.281.413 describe los QRF de tipo TC de Photorhabdus luminescens. Los documentos WO 00/30453 y WO 00/42855 describen las proteínas de tipo TC de Xenorhabdus. Los documentos WO 99/03328 y WO 99/54472 (y las patentes de Estados unidos números 6.174.860 y 6.277.823) se refieren a otras toxinas de Xenorhabdus y Photorhabdus.

Los esfuerzos de clonación relativamente recientes en Xenorhabdus nematophilus también parecen haber identificado genes de toxina insecticidas novedosos con homología con los loci de P. luminescens tc. Véase, por ejemplo, el documento WO 98/08388 y Morgan et al., Applied y Environmental Microbiologyy 2001, 67: 2062 - 69. En R.H. ffrench-Constant y D.J. Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999,12: 284 - 288, clones de cósmidos se seleccionaron directamente para evaluar toxicidad oral a otros lepidópteros, Pieris brassicae. Se secuenció un clon de cósmido tóxico por vía oral. El análisis de la secuencia en el que el cósmido sugería que existen cinco ORF diferentes con similitud con los genes de Photorhabdus tc; orf2 y orf5 ambos tienen algún nivel se relación de secuencias a tanto tcbA como tcdA, mientras orf1 es similar a tccB, orf3 es similar a tccC y orf4 es similar a tcaC. De manera importante, numerosos de estos ORF también comparten el sitio de escisión supuesto documentado en P. luminescens, sugiriendo que las toxinas activas también se pueden procesar de manera proteolítica.

Existen cinco proteínas TC de Xenorhabdus típicas: XptA1, XptA2, XptB1, XptC1, y XptD1. XptA1 es una toxina "autónoma". XptA2 es otra proteína TC de Xenorhabdus que tiene actividad de la toxina autónoma. Véase GENBANK Nº de acceso AJ308438 para las secuencias de Xenorhabdus nematophilus. XptB1 y XptC1 son los potenciadotes de Xenorhabdus que pueden potenciar la actividad de o bien (o ambas) toxinas de XptA. XptD1 tiene algún nivel de homología con TccB. XptC1tiene algún nivel de similitud con TcaC. La proteína XptA2 de Xenorhabdus tiene algún grado de similitud con TcdA la proteína. XptB1 tiene algún grado de similitud con TccC.

El hallazgo de algo de similitud, los loci que codifican toxinas en estas dos diferentes bacterias es interesante en términos de los posibles orígenes de estos genes de virulencia. El cósmido de X. nematophilus también parece que contiene secuencias de tipo transposasa cuya presencia puede puede sugerir que estos loci se puedan transferir de manera horizontal entre diferentes cepas o especies de bacterias. Un intervalo de tales episodios de transferencia también puede explicar la organización genómica aparentemente diferente de los operones tc en las dos bacterias diferentes. Además, solamente un subconjunto de cepas de X. nematophilus y P. luminescens parecen tóxicas para M. sexta, sugiriendo o bien que diferentes cepas carecen de los genes tc o que pueden llevar un complemento del gen tc diferente. El análisis detallado de tanto una cepa como una filogenia de toxina dentro, y entre, estas especies bacterianas deben ayudar a clarificar el origen probable de los genes de toxina y cómo se mantienen en diferentes poblaciones de bacterias. R.H. ffrench- Constant y Bowen, Current Opinions in Microbiology, 1999, 12: 284 - 288.

Las proteínas y genes de TC se han descrito más recientemente a partir de otras bacterias asociadas a insectos tales como Serratia entomophila, un patógeno de insectos. Waterfield et al., TRENDS in Microbiology, Vol. 9, No. 4, April 2001.

En resumen, las proteínas del complejo de toxinas de P. luminescens y X. nematophilus parecen tener poca homología con las toxinas bacterianas identificadas previamente y deben proporcionar alternativas útiles a las toxinas derivadas de B. thuringiensis. Aunque tienen efectos tóxicos similares en el intestino medio de insecto a otras toxinas activas por vía oral, su modo preciso de acción permanece oscuro. El trabajo futuro podría clarificar su mecanismo de acción.

Aunque algunas proteínas TC de Xenorhabdus se encontraron que "corresponden" (tienen una función similar y algún nivel de homología de secuencias) con alguna de las proteína TC de Photorhabdus, una proteína de Photorhabdus dada comparte solamente aproximadamente 40% de identidad de secuencia con la proteína de Xenorhabdus "correspondiente". Esto se ilustra más adelante para cuatro toxinas "autónomas":

2

(Para una revisión más completa, véase, por ejemplo, Morgan et al., "Sequence Analysis of Insecticidal Genes from Xenorhabdus nematophiles PMFI296", Vol. 67, Applied y Environmental Microbiology, May 2001, p. 2062 - 2069).

Las bacterias del género Paenibacillus son distinguibles de otras bacterias mediante características de ARNr y fenotípicas distintivas (C. Ash et al. (1993), "Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks y Collins) usando un ensayo de sonda de PCR: Propuesto para la creación de un género nuevo Paenibacillus", Antonie Van Leeuwenhoek 64: 253 - 260). El análisis de secuencia de ARNr 16 S comparativo demostró que el género Bacillus constaba al menos de cinco líneas filéticas. Los bacilos del grupo 3 de ARN ribosómico (de Ash, Farrow, Wallbanks, y Collins (1991), que comprenden Bacillus polymyxa y estrechamente relacionados), está filogenéticamente así eliminado de Bacillus subtilis (las especies tipo del género y otros bacilos aerobios, formadores de endosporas) que se volvieron a clasificar como un nuevo género, Paenibacillus.

Algunas especies en este género se conocerá que son patogénicos para las abejas de miel (Paenibacillus Larvae) y larvas de escarabajos (P. popilliae y P. lentimorbus). Algunas otras especies de Paenibacillus se han encontrado que están asociados a las abejas de miel, pero no son patógenos. Al menos 18 especies adicionales se conocen en este género, incluyendo P. thiaminolyticus; no se ha conocido asociación a insectos (Shida et al., 1997; Pettersson et al., 1999). Los escarabajos (coleópteros) son plagas graves de césped, semilleros, y cultivos alimentarios por toda Norte América, y son de interés de cuarentena. Véase, la página web de Departamento de Agricultura de Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola.

P. larvae, P. popilliae, y P. lentimorbus se consideran patógenos de insectos obligados implicados en la bacteriosis lechosa de escarabajos (D.P. Stahly et al. (1992), "The genus Bacillus: insect pathogens", p. 1697 - 1745, en A. Balows et al., ed., The Procaryotes, 2ª Ed., Vol. 2, Springer-Verlag, New York, NY). Estas tres especies de Paenibacillus son característicamente organismos fastidiosos de lento crecimiento que provocan enfermedad mediante un procedimiento invasivo en el que las bacterias cruzan el intestino medio y proliferan hasta altos números en la hemolinfa y otros tejidos. Para estas tres especies se han propuesto algunas indicaciones generales de la implicación de proteína en la patogenicidad de insectos; sin embargo no se ha demostrado ningún papel específico para una proteína específica. Stahly et al. concluyeron para P. larvae que una cuestión de la implicación de una toxina es una abierta, y que la causa precisa de muerte en bacteriosis lechosa (de escarabajos) no se entiende.

Una toxina de escarabajo (coleóptero), Cry18, se ha identificado en cepas de P. popilliae y P. lentimorbus. Cry18 tiene aproximadamente 40% de identidad con las proteínas Cry2 (Zhang et al., 1997; Harrison et al., 2000). Mientras Zhang et al. (1997) especulan que Cry18 ataca al intestino medio para facilitar la entrada de células vegetativas al hemocoel, Harrison et al. Indican que no existe evidencia directa de este papel y además establecen que "el papel, si existe, de la proteína de parasporas en bacteriosis lechosa no se conoce" J. Zhang et al. (1997), "Cloning y Analysis of the First cry Gene from Bacillus popilliae", J. Bacteriol. 179: 4336 - 4341; H. Harrison et al. (2000), "Paenibacillus Associated with Milky Disease in Central y South American Scarabs", J. Invertebr. Pathol. 76(3):169 - 175.

Stahly et al., Zhang et al., y Harrison et al. todos apuntan al contraste en evidencia para el papel de proteínas cristalinas de B. thuringiensis en la intoxicación de insectos (donde la alta frecuencia de síntomas de insecto se pueden explicar mediante las proteínas de las proteínas cristalinas específicas), contra el caso de Paenibacillus y bacteriosis lechosa (donde no hay tal lazo para los efectos de una toxina específica).

De este modo, mientras que algunas especies de Paenibacillus se conoce que son patogénicos para ciertos coleópteros y algunas asociadas a ciertos coleópteros y algunas asociadas a abejas de miel, no era hasta ahora conocida ninguna cepa de Paenibacillus que fuera tóxica para lepidópteros. De manera similar, las proteínas TC y proteínas Cry tóxicas para lepidópteros nunca se han reseñado en Paenibacillus.

Breve sumario de la invención

Esta es la primera descripción conocida de las toxinas de proteínas de Paenibacillus que tienen actividad contra plagas de lepidópteros. Algunas especies de Paenibacillus se conoce que son insecticidas, pero no tienen actividad contra gorgojos/escarabajos/coleópteros. No se han conocido reseñas de una especie o cepa de Paenibacillus que tenga toxicidad para lepidópteros. De este modo, la invención presente se refiere en general a la selección de Paenibacillus spp. Para las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41, y su uso.

Más específicamente, la invención presente inicialmente provenía de un descubrimiento de una cepa novedosa de Paenibacillus mencionada en este documento como DAS1529. Esto era un sorprendente descubrimiento por una diversidad de razones. Esta cepa produce una única proteína tóxica para los lepidópteros. Esta cepa, así como DB482, producen proteínas únicas de tipo TC de complejo de toxinas (que tienen alguna similitud con las TC de Xenorhabdus/Photorhabdus).

Esta es la primera reseña conocida de Paenibacillus que tiene proteínas de tipo TC. De este modo, la invención presente se refiere a procedimientos de selección de Paenibacillus spp. Para los genes y proteínas de tipo TC como antes. Las proteínas Tc de Paenibacillus de la invención presente se muestra en el presente documento que son útiles para aumentar o potenciar la actividad de una proteína de toxina "autónoma" de Xenorhabdus, por ejemplo. Los genes de tipo TC -identificados en el presente documento no se conocía hasta ahora que existieran en el género Paenibacillus. El descubrimiento amplía el ámbito de organismos (género bacteriano en los que los genes de tipo TC se han encontrado. De este modo, la invención presente en general se refiere a proteínas de tipo TC como antes que se pueden obtener a partir de especies de Paenibacillus, a procedimientos de selección de especies de Paenibacillus para tales proteínas, y similares. Un ejemplo es Paenibacillus apairius, que también se encuentra que produce proteínas de tipo TC.

Mientras las proteínas de tipo TC sujeto tienen alguna conexión de secuencia, y características en común con las proteínas de tipo TC de Xenorhabdus y Photorabdus, las secuencias de las proteínas de tipo TC sujeto son muy diferentes de las proteínas de TC conocidas previamente. De este modo, la solicitud sujeto proporciona nuevas clases de proteínas y genes de tipo TC que codifican estas proteínas, que se pueden obtener a partir de bacterias en el género Paenibacillus,.

Otra característica sorprendente de la cepa DAS 1529 es que produce una única proteína Cry de tipo B.t. que es tóxica para los lepidópteros. La toxina Cry sujeto es comprimida/corta y parece que carece de una porción protoxina típica en su estado de tipo salvaje.

Esta cepa es el primer ejemplo conocido de una bacteria natural que produce tanto una toxina de tipo Cry y proteínas de tipo TC. Además es sorprendente que este es el primer ejemplo conocido de un gen de toxina cry que está estrechamente asociado a (en proximidad genética a) los genes de proteína TC. Estas observaciones pioneras tienen amplias implicaciones y de este modo permiten que los expertos en la técnica seleccionen especies apropiadas de bacterias para estos tipos de operones únicos y para estos tipos de componentes adicionales de operones
conocidos.

Una descripción adicional de la invención presente proviene del sorprendente descubrimiento de que la cepa DAS 1529 también produce una toxina de insecto soluble que se encontró que era muy similar a una tiaminasa. Era sorprendente que la proteína de tiaminasa de Paenibacillus se encontró que tenía actividad insecticida. Mientras esta proteína se conocía, no se esperaba de ninguna manera en la técnica que esta enzima hubiera mostrado actividad de tipo toxina contra plagas de insectos/de tipo insecto.

Otros objetos, ventajas, y características de la invención presente será evidente para los expertos en la técnica que tienen el beneficio de la descripción sujeto.

La Figura 4 muestra resultados de ensayo de tiaminasa purificada de DAS 1529 en CEW.

La Figura 5 muestra ORF3-ORF6 en pEt101D.

La Figura 6 muestra Cry1529 (ORF 7) contra el gusano de la yema de tabaco (TBW).

La Figura 7 muestra una comparación/alineación de la SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:5 (tcaB2 a tcaB1); los paréntesis muestran la conexión de ORF2.

La Figura 8 muestra un árbol filogenético de ORF7 de DAS1529 (Cry1529) comparado con otras proteínas de Cry.

Las Figuras 9 y 10 muestran los resultados de la digestión por tripsina de las proteínas Cry1529 de tipo salvaje y modificadas.

Las Figuras 11A y 11B muestran las alineaciones de secuencias para el diseño de cebador de tcaA.

Las Figuras 12A-D muestran las alineaciones de secuencias para el diseño de cebador de tcaB.

Las Figuras 13A y 13B muestran las alineaciones de secuencias para el diseño de cebador de tcaC.

Las Figuras 14A y 14B muestran las alineaciones de secuencias para el diseño de cebador de tccC.

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ácido nucleico de la inserción entera de SB12.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ácido nucleico de ORF1, que codifica una proteína de tipo tcaA (gen tcaA1, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente designación del gen tcaA1-1529).

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF1.

La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ácido nucleico de ORF2, con un elemento IS eliminado, que codifica una proteína de tipo tcaB (gen tcaB1, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente, designación del gen tcaB1-1529).

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF2.

La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ácido nucleico de ORF3, que codifica una proteína de tipo tcaA (gene tcaA2, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente, designación del gen tcaA2-1529).

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF3.

La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de ácido nucleico de ORF4, que codifica una proteína de tipo tcaB (gen tcaB2, la cepa IDEAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente, designación del gen tcaB2-1529).

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF4.

La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de ácido nucleico de ORF5, que codifica una proteína de tipo tcaC (gen tcaC, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente, designación del gen tcaC-1529).

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF5.

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de ácido nucleico de ORF6, que codifica una proteína de tipo tccC.

La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF6.

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de ácido nucleico de ORF7, que codifica una proteína de tipo Cry.

La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos codificada por ORF7.

La SEQ ID NO: 16 es la secuencia de ácido nucleico parcial del ADNr 16S de DAS 1529 usado para la colocación taxonómica.

SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos N-terminal para la toxina purificada de la fracción de caldo de DAS1529.

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de tiaminasa I de Bacillus thiaminolyticus (Campobasso et al., J. Biochem. 37(45): 15981 - 15989 (1998)).

La SEQ ID NO: 19 es una secuencia de aminoácidos alternativa codificada por la proteína de ORF6 (gen tccC, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus del organismo fuente, designación del gen tccC-1529).

La SEQ ID NO: 20 es el gen xptC1, cepa Xwide Xenorhabdus del organismo fuente, designación del gen xptC1-Xwi.

La SEQ ID NO: 21 es el gen xptB1, cepa Xwide Xenorhabdus del organismo fuente, designación del gen xptB1-Xwi.

La SEQ ID NO: 22 es el cebador SB101.

La SEQ ID NO: 23 es el cebador SB102.

La SEQ ID NO: 24 es el cebador SB103.

La SEQ ID NO: 25 es el cebador SB104.

La SEQ ID NO: 26 es el cebador SB105.

La SEQ ID NO: 27 es el cebador SB106.

La SEQ ID NO: 28 es el cebador SB212.

La SEQ ID NO: 29 es el cebador SB213.

La SEQ ID NO: 30 es el cebador SB215.

La SEQ ID NO: 31 es el cebador SB217.

La SEQ ID NO: 32 es una secuencia de nucleótidos de un gen de tipo tcaA de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 33 es una secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo TcaA de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 34 es una secuencia de nucleótidos de un gen de tipo tcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 35 es una secuencia de nucleótidos de un gen de tipo tcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 36 es una secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo TcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 37 es una secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo TcaB de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 38 es una secuencia de nucleótidos de un gen de tipo tcaC de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 39 es una secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo TcaC de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 40 es una secuencia de nucleótidos de un gen de tipo tccC de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 41 es una secuencia de aminoácidos de una proteína de tipo TccC de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius.

La SEQ ID NO: 42 es el gen tcdB1, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tcdB1-W14.

La SEQ ID NO: 43 es el gen tcdB2, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tcdB2-W14.

La SEQ ID NO: 44 es el gen tccC1, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tccC1-W14.

La SEQ ID NO: 45 es el gen tccC2, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tccC2-W14.

La SEQ ID NO: 46 es el gen tccC3, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tccC3-W14.

La SEQ ID NO: 47 es el gen tccC4, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tccC4-W14.

La SEQ ID NO: 48 es el gen tccC5, cepa W14 de Photorhabdus del organismo fuente, designación del gen tccC5-W14.

La SEQ ID NO: 49 es la secuencia de aminoácidos de la proteína TC de XptA2 de Xenorhabdus nematophilus Xwi.

Descripción detallada de la invención

La invención presente proporciona alternativas biológicas únicas para el control de plagas. Más específicamente, la invención presente proporciona fuentes nuevas de proteínas que tienen actividad de toxinas contra insectos, preferiblemente lepidópteros, y otras plagas similares. La invención también se refiere a nuevas fuentes de polinucleótidos novedosos que se pueden usar para codificar tales toxinas, y a procedimientos de preparación y procedimientos de uso de las toxinas y secuencias de ácido nucleico correspondientes para controlar insectos y otras plagas de plantas. La presente invención se refiere a la necesidad de agentes novedosos de control de insectos. La presente invención a proteínas novedosas pesticidas que se pueden obtener a partir de bacterias Paenibacillus.

La invención presente inicialmente proviene de un descubrimiento de una cepa novedosa de Paenibacillus. Esta cepa se denomina en el presente documento como DAS1529. Para demostrar las amplias implicaciones de este descubrimiento, también se ejemplifica el descubrimiento de otra cepa de Paenibacillus. Estas cepas se han depositado en la Colección de Cultivos De Patentes del Servicio de Investigación Agrícola (NRRL) en 1815 North University Street Peoria, Ill. 61604 Estados Unidos. Las cepas depositadas y las fechas de depósito correspondientes son como sigue:

2000

Estos cultivos se han depositado para los propósitos de esta solicitud de patente y se depositaron en las condiciones que aseguran que el acceso a los cultivos está disponible durante el estado pendiente de esta solicitud de patente a la determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas Comerciales que se denomina además 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. Estos depósitos estarán disponibles cuando se requieran por las leyes de patentes extranjeras en los países en los que las homólogas de la solicitud sujeto, o sus descendientes se presenten. Sin embargo se debe entender que al disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención presente en la derogación de de los derechos de patentes concedidos por la acción gubernamental.

Además, los depósitos de cultivo sujeto se realizaron de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest para el depósito de Microorganismos, es decir, se almacenarán con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante un período de al menos cinco años después de la petición más reciente para el suministro de una muestra del depósito, y en cualquier caso durante un período de al menos (30) años después de la fecha de depósito o para la vida ejecutiva de cualquier patente que puede publicar la descripción del cultivo. El depositante reconoce el deber de reemplazar el depósito el depositado debe ser incapaz de proporcionar una muestra cuando se requiera, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los depósitos de cultivo sujeto se eliminarán irrevocablemente tras la concesión de una patente que los describa.

El descubrimiento de la cepa DAS1529 sujeto fue sorprendentemente por una diversidad de rezones. La cepa produce una única proteína Cry tóxica para los lepidópteros. Esta cepa, así como DB482, también producen proteínas de tipo (TC) complejo de toxinas (que tienen alguna similitud con las TC de Xenorhabdus/Photorhabdus).

Esta es la primera descripción conocida de una toxina proteica de Paenibacillus que tiene actividad contra una plaga de lepidópteros. Esto fue un descubrimiento sorprendente. Algunas especies de Paenibacillus se conocía que tenían actividad insecticida contra gorgojos/escarabajos/coleópteros. No se han conocido reseñas de una especie o cepa de Paenibacillus que tenga toxicidad para los lepidópteros. De este modo, la invención presente en general describe especies de Paenibacillus que tienen actividad contra lepidópteros, y selección de cultivos de Paenibacillus, proteínas de los mismos, y genotecas de clones de los mismos, para actividad contra lepidópteros, y/o para genes que codifican "toxinas lep", y más particularmente, para proteínas Cry tóxicas para los lepidópteros.

Esta es también la primera reseña conocida de Paenibacillus que tiene proteínas de tipo TC. De este modo, la invención presente se refiere a procedimientos de selección de Paenibacillus spp. Para los genes y proteínas de tipo TC que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. Fue muy sorprendente encontrar que las cepas DAS 1529 y DB482 tienen operones de tipo TC y producen estas proteínas TC (que tienen algún nivel de similitud con las proteínas TC de Xenorhabdus y Photorhabdus). Las proteínas TC y genes identificados en el presente documento no se conocía hasta ahora que exista en el género Paenibacillus. Este descubrimiento amplía el ámbito de los organismos (géneros bacterianos) en los que se han encontrado los genes de las proteínas TC De este modo, la invención presente en general se refiere a proteínas TC que se pueden obtener a partir de especies de Paenibacillus que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41, y a procedimientos de selección de especies de Paenibacillus para tales proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID No. 13, y SEOQ ID No. 41. Un ejemplo de una especie de Paenibacillus encontrada usando los procedimientos de la invención presente es la cepa DB482 de Paenibacillus apairius. Esta cepa de P. apairius también produce proteínas únicas de tipo TC que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID
No. 41.

Aunque las proteínas TC sujeto tienen algunas características en común con las proteínasTC de Xenorhabdus y Photorabdus, las proteínas TC sujeto son únicas y diferentes de las proteínas TC conocidas previamente. De este modo, la aplicación sujeto proporciona nuevas clases de proteínas y genes de tipo TC que codifican estas proteínas que se pueden obtener a partir de bacterias en el género Paenibacillus.

La toxina Cry deDAS1529 es una toxina de la proteína Cry de tipo B.t.. Otra cepa de Paenibacillus, una cepa con actividad contra gorgojos, se sabía que producía una proteína Cry tóxica para los coleópteros. Esa era una proteína Cry18, que estaba más relacionada con las proteínas Cry2 (pero solamente aproximadamente 40% de identidad). La proteína Cry ejemplificada en el presente documento muestra solamente un bajo nivel de identidad y similitud de secuencia a las proteínas Cry conocidas previamente. Con eso indicado, de todas las proteínas Cry de B.t. Cry, la proteína Cry sujeto comparte la mayoría de la similitud con las proteínas Cry1. Un aspecto sorprendente de de la proteína Cry sujeto es que es muy corta, es decir incluso más corto que la toxina del núcleo Cry1Fa. La proteína Cry sujeto tiene una región 5 de bloque que se puede identificar en o cerca de su extremo C. Esta toxina en su estado de tipo salvaje no tiene la parte de protoxina, que se encuentra típicamente en las toxinas Cry1. La toxina Cry sujeto está sorprendentemente comprimida. Esta descripción es también significativa para la investigación de genes cry adicionales de Bacillus thuringiensis (B.t.). Como será evidente por los expertos en al técnica que tengan el beneficio de la descripción sujeto, otras bacterias, tales como B.t. y otras Bacillus spp. Se pueden seleccionar para para toxinas similares y genes de toxinas.

La cepa DAS1529 es el primer ejemplo conocido de una bacteria natural que produce tanto toxina de tipo Cry como las proteínas de tipo TC. Además sorprendentemente es que esto es el primer ejemplo conocido de un gen de toxina cry que está estrechamente asociado a (en proximidad genética c) genes de proteínas TC. Estas observaciones pioneras de este modo permiten a los expertos en la técnica seleccionar especies apropiadas de bacterias para estos tipos de operones únicos y para estos tipos de componentes adicionales de operones conocidos, Esto es un ejemplo interesante de una cepa de tipo salvaje que tiene un operón de tipo TC con genes de proteínas TC múltiples del mismo tipo general (es decir, en este caso, dos genes de tipo tcaA y dos de tipo tcaB). Estos descubrimientos sorprendentes tienen amplias implicaciones para el descubrimiento de genes adicionales.

Una descripción adicional se deriva del descubrimiento sorprendente que la proteína de tiaminasa de Paenibacillus tiene actividad insecticida. Aunque esta proteína se conocía, no se esperaba de ninguna forma en la técnica que esta enzima mostraría actividad de tipo toxina contra plagas de insectos/de tipo insecto.

Proteínas TC de Paenibacillus

Más específicamente con relación a las proteínas TC ejemplificadas, las siguientes proteínas TC de la cepa DAS 1529 se han caracterizado completamente en el presente documento: dos proteínas de tipo TcaA (TcaA1 y TcaA2), dos proteínas de tipo TcaB (TcaB1 y TcaB2), una proteína TcaC, y una proteína de tipo TccC. Las proteínas TcaA1 y TcaA2 son similares en gran medida entre sí a la secuencia a nivel de secuencia, y las proteínas tcaB1 y tcaB2 son similares en gran medida entre sí a nivel de secuencia. Las proteínas de tipo TC que se pueden obtener a partir de Paenibacillus apairius también se ejemplifican en el presente documento.

Las proteínas TC de la invención presente que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 se pueden usar como otras proteínas TC. Esto sería fácilmente evidente para los expertos en la técnica que tienen el beneficio de la descripción sujeto cuando se contempla a la luz de lo que conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, la sección de antecedentes anterior, que describe R.H. ffrench-Constant y Bowen (2000) y La patente de Estados Unidos Nº 6.048.838. Por ejemplo, se sabía que el complejo de toxina Tca de Photorhabdus es altamente tóxico para Manduca sexta.

Aunque las interacciones moleculares exactas de las proteínas TC entre sí, y su(s) mecanismo(s) de acción, no se entienden actualmente, algunas proteínas TC se sabían que tenían actividad insecticida "autónoma", y otras proteínas TC se sabía que potenciaban la actividad de las toxinas autónomas Producidas por el mismo organismo dado. Por ejemplo, se sabía que la proteína TcdA era activa contra Manduca sexta. TcaC y TccC, se pueden usar conjuntamente para potenciar la actividad de TcdA. TcdB se puede usar (en lugar de TcaC) con TccC como un potenciador. TcbA es otra proteína TC de Photorhabdus con actividad tóxica autónoma. TcaC (o TcdB) conjuntamente con TccC también se puede usar para aumentar/potenciar la actividad tóxica de TcbA.

Las proteínas TC de Photorhabdus y proteínas/genes de TC "correspondientes" de Paenibacillus se resumen a continuación.

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Como se ha indicado anteriormente, TccA tiene algún nivel de homología con el extremo N de TcdA, y TccB tiene algún nivel de homología con el extremo C de TcdA. Además, TcdA es de aproximadamente 280 kDa, y TccA conjuntamente con TccB son de aproximadamente el mismo tamaño, si se combinan, que TcdA. Además, TcaA tiene algún nivel de homología con TccA y del mismo modo con el extremo N de TcdA. Incluso además, TcaB tiene algún nivel de homología con TccB y del mismo modo con el extremo N de TcdA. TccA y TcaA son de tamaño similar, que TccB y TcaB.

Aunque algunas proteínas TC de Xenorhabdus se encontró que "corresponden" con algunas de las proteínas TC de Photorhabdus, las proteínas "correspondientes" comparten solamente aproximadamente 40% (aproximadamente) de identidad de secuencia entre sí. Las proteínas TC sujeto de TC de Paenibacillus tienen aproximadamente el mismo grado de conexión de secuencias (\sim 40% de identidad) con las proteínas TC anteriores.

Como se ha descrito en más detalle más adelante, una o más toxinas de la invención presente se pueden usar en combinación entre sí y/o con otras toxinas (es decir, el complejo Photorhabdus Tca se conocía que era activo contra Manduca sexta; diversas "combinaciones" de proteínas TC de Photorhabdus, por ejemplo, se pueden usar conjuntamente para potenciar la actividad de otras, toxinas de Photorhabdus autónomas; el uso de las toxinas de Photorhabdus "con" toxinas de B.t., por ejemplo, se ha propuesto para el manejo de resistencia). Además, las proteínas TC de Paenibacillus de la invención presente que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 se muestra en el presente documento que son útiles para aumentar o potenciar la actividad de una proteína de toxina de Xenorhabdus "autónoma", por ejemplo. La solicitud provisional No. 60/441,723 (Timothy D. Hey et al.), titulada "Mezcla y Emparejamiento de Proteínas TC para el Control de Plagas", se refiere al descubrimiento sorprendente que una proteína TC derivada de un organismo de un género tal como Photorhabdus se pueda usar de manera indistinta con una proteína TC "correspondiente" derivada de un organismo de otro género, Además los datos sorprendentes junto con estas líneas se presentan más adelante que además ilustran la utilidad de las proteínas TC de Paenibacillus de la invención presente que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. Una razón de que estos resultados pudieran ser sorprendentes es que existe solamente \sim 40% de identidad de secuencia entre las proteínas TC "correspondientes" de Xhenorhabdus, Photorhabdus, y Paenibacillus sujeto.

Proteínas y toxinas. La presente invención proteínas funcionales que se administran fácilmente que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. La presente invención también proporciona un procedimiento para distribuir toxinas insecticidas que son funcionalmente activas y eficaces contra muchos órdenes de insectos, preferiblemente insectos lepidópteros. Por "actividad funcional" (o "activo contra") significa en el presente documento que las toxinas proteicas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 funcionan como agentes de control de insectos activos por vía oral (solos o en combinación con otras proteínas), que las proteínas tienen un efecto tóxico (solos o en combinación con otras proteínas), o son capaces de interrumpir o detener crecimiento y/o alimentación de insectos que pueden o no pueden provocar muerte del insecto. Cuando un insecto se pone en contacto con una cantidad eficaz de una "toxina" de la invención presente distribuida la expresión de plantas transgénicas, composición(es) de proteína formulada(s), composición(es) de proteína pulverizable(s), una matriz de cebo u otro sistema de distribución, los resultados son típicamente muerte del insecto, inhibición del crecimiento y/o prevención de los insectos a partir de la alimentación sobre la fuente (preferiblemente una planta transgénica) que hace que las toxinas estén disponibles para los insectos. Las proteínas funcionales de la invención presente también pueden potenciar o mejorar la actividad de las otras toxinas proteicas. Los términos "tóxico", "toxicidad", y "actividad tóxica" como se usan en el presente significa que las "toxinas" sujeto tienen "actividad funcional" como se ha definido en el presente
documento.

Se prefiere la letalidad completa para alimentar a los pero no se requiere que logre actividad funcional. Si un insecto evita la toxina o cesa en la alimentación, esa evitación será útil en algunas aplicaciones, incluso si los efectos son subletales o si la letalidad se retarda o es indirecta. Por ejemplo, si se desean plantas transgénicas resistentes a insectos, la renuncia de insectos a alimentarse sobre las plantas es tan útil como la toxicidad letal para los insectos debido a que el último objetivo es evitar el daño a las plantas inducido por insectos.

Existen otras muchas formas en las que las toxinas se pueden incorporar a una dieta de insectos. Por ejemplo, es posible adulterar la fuente de alimento de las larvas con la proteína de toxina pulverizando el alimento con una solución de proteína, como se describe en el presente documento. Como alternativa, la proteína modificada se puede modificar por ingeniería genética en otra bacteria diferente no dañina, que después se puede hacer crecer en cultivo, y o bien aplicar a la fuente de alimentación o permitir que resida en el suelo en un área en la que se deseará la erradicación del insecto. También, la proteína se puede modificar por ingeniería genética directamente en una fuente de alimento de insecto. Por ejemplo, la fuente de alimento principal para muchas larvas de insecto es material vegetal. Por lo tanto los genes que codifican las toxinas se pueden transferir al material vegetal de manera que dicho material de plante exprese la toxina de interés.

La transferencia de la actividad funcional a sistemas vegetales o bacterianos requiere típicamente secuencias de ácido nucleico, que codifican las secuencias de aminoácidos para las toxinas, integradas en un vector de expresión de proteína apropiado para el huésped en el que el vector residirá. Una forma de obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína con actividad funcional es aislar el material genético nativo a partir de las especies bacterianas que producen las toxinas, usando la información deducida de la secuencia de aminoácidos de la toxina, como se describe en el presente documento. Las secuencias nativas se pueden optimizar para la expresión en plantas, por ejemplo, como se describe en más detalle más adelante. El polinucleótido optimizado también se puede diseñar basándose en la secuencia de proteína.

La invención presente proporciona nuevas clases de toxinas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 que tienen actividades pesticidas ventajosas. Una forma de caracterizar tres clases de toxinas y los polinucleótidos que las codifican es mediante la definición de un polinucleótido por su capacidad de hibridarse, en un intervalo de condiciones especificadas, con una secuencia de nucleótidos ejemplificada (su complemento y/o una sonda o sondas derivadas de cualquier hebra) y/o por su capacidad a amplificarse mediante la PCR usando cebadores derivados de las secuencias ejemplificadas.

Existen numerosos procedimientos para obtener las toxinas pesticidas de la presente invención que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. Por ejemplo, anticuerpos para las toxinas pesticidas descritas y reivindicadas en el presente documento se pueden usar para identificar y aislar otras toxinas a partir de una mezcla de proteínas. De manera específica, los anticuerpos se pueden inducir para las partes de las toxinas que son las más constantes y las más diferentes de otras toxinas. Estos anticuerpos se pueden después usar para identificar específicamente toxinas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), o transferencia de western. Los anticuerpos para las toxinas descritas en el presente documento, o para toxinas equivalentes, o para fragmentos de estas toxinas, se pueden preparar fácilmente usando procedimientos convencionales. Las toxinas de la invención presente se pueden obtener a partir de una diversidad de fuentes/microorganismos fuente.

Los expertos en la técnica reconocerían fácilmente que las toxinas (y genes) de la invención presente se pueden obtener a partir de una diversidad de fuentes. Una toxina "de" o "que se puede obtener a partir de" el aislamiento sujeto DAS 1529 y/o el aislamiento de P. apiarius significa que la toxina (o una toxina similar) se puede obtener a partir de este aislamiento o alguna otra fuente, tal como otra cepa bacteriana o una planta transgénica. Por ejemplo, los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, dada la descripción de un gen bacteriano y toxina, se puede modificar por ingeniería genética una planta para producir la toxina. Las preparaciones de anticuerpo, sondas de ácido nucleico (ADN y ARN), y similares se pueden preparar usando el polinucleótido y/o secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento y usarse para seleccionar y recuperar otros genes de toxinas a partir de otras fuentes
(naturales).

Polinucleótidos y sondas. La invención presente además describe secuencias de nucleótidos que codifican las toxinas de la invención presente que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41. La invención presente además proporciona procedimientos de identificación y caracterización de genes que codifican toxinas pesticidas. En una realización, la invención presente describe secuencias de nucleótidos únicas que son útiles como sondas de hibridación y/o cebadores para las técnicas de PCR. Los cebadores producen fragmentos génicos característicos que se pueden usar en la identificación, caracterización y/o aislamiento de de genes de toxinas específicos. Las secuencias de nucleótidos como se ha descrito codifican toxinas que son distintas de las toxinas anteriormente descritas.

Los polinucleótidos como se describen se pueden usar para completar "genes" que codifican proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, como los expertos en la técnica reconocerán fácilmente, los polinucleótidos sujeto se pueden colocar de manera apropiada bajo el control de un promotor, en un huésped de interés, como se sabe fácilmente en la técnica.

Como saben los expertos en la técnica, el ADN existe típicamente, en una forma de doble hebra. En esta disposición, una hebra es complementaria a la otra hebra y viceversa. A medida que se replica el ADN en una planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias adicionales de AD, La "hebra codificante" a medida se usa en la técnica para referirse a la hebra que se une con la hebra no codificante. El ARNm se transcribe a partir de la hebra "no codificante" de ADN. La hebra "de sentido positivo" o "codificante" tiene una serie de codones (un codón son tres nucleótidos que se pueden leer como una unidad de tres restos para especificar un aminoácido particular) que se puede leer como un marco abierto de lectura (ORF) para formar una proteína o péptido de interés. Con el fin de expresar una proteína in vivo, una hebra de ADN se transcribe típicamente en una hebra complementaria de ARNm que se usa como el molde de proteína. De este modo, la invención presente describe el uso de los polinucleótidos ejemplificados mostrados en el listado de secuencia unida y/o equivalentes que incluyen las hebras complementarias. Se describen ARN y PNA (ácidos nucleicos de péptidos) que son funcionalmente equivalentes con el ADN
ejemplificado.

Los aislamientos bacterianos se pueden cultivar en condiciones que dan como resultado una alta multiplicación de del microbio. Después de tratar el microbio para proporcionar ácido nucleico genómico de una sola cadena, el And se puede poner en contacto con los cebadores de la invención y someterse a amplificación por la PCR. Los fragmentos característicos de genes que codifican toxina se amplificarán mediante el procedimiento, identificando de este modo la presencia del (de los) gen(es) que codifica(n) toxina.

Además se describen genes y aislamientos identificados usando los procedimientos y secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento. Los genes de este modo identificados codifican toxinas activas contra plagas.

Las toxinas que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID No. 13, y SEQ ID No. 41 y genes de la invención presente se pueden identificar y obtener usando sondas de oligonucleótidos, por ejemplo. Estas sondas son secuencias de nucleótidos detectables que se pueden detector en virtud de una etiqueta apropiada o se puede hacer fluorescente de manera interesante como se describe en la Solicitud internacional Nº. WO 93/16094. Las sondas (y los polinucleótidos de la invención presente) pueden ser ADN, ARN, o PNA. Además de la adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), y uracilo (U; para moléculas de ARN), sondas sintéticas (y polinucleótidos) de la invención presente también pueden tener inosina (una base neutra capaz de capaz de aparearse con las cuatro bases; algunas veces usadas en lugar de una mezcla de las cuatro bases en sondas sintéticas). De este modo, cuando un oligonucleótido sintético, degenerado se menciona en el presente documento, y "n" se usa< de manera genérica, "n" puede ser G, A, T, C, o inosina. Los códigos de ambigüedad como se usan en el presente documento están de acuerdo con las convenciones de nomenclatura IUPAC convencionales como la de la presentación de la solicitud sujeto (por ejemplo, R significa A o G, Y significa C o T, etc.).

Como se conoce bien en la técnica, si una molécula de sonda se hibrida con una muestra de ácido nucleico, se puede asumir de manera razonable que la sonda y muestra tienen homología/similitud/identidad sustancial. Preferiblemente la hibridación del polinucleótido se lleva a cabo primeramente mediante lavados en condiciones de baja, moderada, o alta rigurosidad mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como se describe en, por ejemplo, Keller, G.H., M.M. Manak (1987) ADN Probes, Stockton Press, Nueva York, NY, p. 169 - 170. Por ejemplo, como se establece en ese documento, se pueden lograr condiciones de baja rigurosidad mediante lavado con 2 x SSC Citrato Solución salina Estándar)/0,1% de SDS (Dodecil sulfato de Sodio) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se realizan típicamente dos lavados. Después se puede lograr una mayor rigurosidad reduciendo la concentración de sal y/o elevando la temperatura. Por ejemplo, al lavado descrito anteriormente puede seguir dos lavados con 0,1 x SSC/0,1% de SDS durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente seguido de posteriores lavados con 0,1 x SSC/0,1% SDS durante 30 minutos cada uno a 55ºC. Estas temperaturas se pueden usar con otros protocolos de hibridación y de lavado establecidos en el presente documento y como conocerán los expertos en la técnica (SSPE se puede usar como la sal en lugar de SSC, por ejemplo). El 2 x SSC/0,1% de SDS se puede preparar mediante la adición de 50 ml de 20 x SSC y 5 ml de 10% de SDS a 445 ml de agua. 20 x SSC se puede preparar mediante la combinación de NaCl (175,3 g/0,150 M), citrato de sodio (88,2 g/0,015 M), y agua hasta 1 litro, seguido de ajuste de pH a 7,0 con 10 N NaOH. 10% de SDS se puede preparar disolviendo 10 g de SDS en 50 ml de agua esterilizada en autoclave, diluyendo hasta 100 ml, y tomando alícuotas.

La detección de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si la hibridación se ha mantenido. Tal análisis de sonda proporciona un procedimiento rápido para identificar los genes que codifican toxina de la invención presente. Los segmentos de nucleótidos que se usan como sondas como se describe de acuerdo con la invención se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos convencionales. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden usar como cebadores de la PCR para amplificar genes de la invención
presente.

Las sondas para uso de acuerdo con la invención presente se pueden derivar de una diversidad de fuentes, tal como cualquier gen mencionado o sugerido en el presente documento. Por ejemplo, toda o parte de cualesquiera de los genes (codificantes y/o no codificantes o sus hebras complementarias) se pueden usar de acuerdo con la invención presente: tcaA, tcaB, tcaC, tcbA, tccA, tccB, tccC, tcdA, tcdB, xptA1, xptD1, xptB1, xptc1, xptA2, sepA, sepB, y sepC. Salvo que se especifique de otra manera, la referencia a un gen "tccC", por ejemplo, incluye todos los alelos específicos (tales como tccC1 y tccC2) de este tipo de gen. Lo mismo es verdad para todos los otros genes (por ejemplo, tcdB2, tccC3, y los alelos mencionados en la Tabla 17).

Las características de hibridización de una molécula se pueden usar para definir los polinucleótidos de la invención presente. De este modo, la invención presente describe polinucleótidos (y/o sus complementos, preferiblemente sus complementos completos) que se hibridan con un polinucleótido (o un oligonucleótido o cebador) ejemplificado o sugerido en el presente documento.

Como se usan en el presente documento condiciones "rigurosas" para hibridación se refiere a condiciones que logran el mismo, o aproximadamente, el mismo grado de especificidad de hibridización que las condiciones empleadas por los solicitantes actuales. De manera específica, la hibridación de ADN inmovilizado sobre transferencias de Southern con sondas específicas de gen marcadas con 32P se realizó mediante procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En general, la hibridación y posteriores lavados se pueden llevar a cabo en condiciones que permiten la detección de secuencias diana. Para las sondas de genes de ADN de doble cadena, la hibridación se llevó a cabo durante toda una noche 20 - 25ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6 x SSPE, 5x de solución de Denhardt, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizada. La temperatura de fusión se describe mediante la siguiente fórmula (Beltz, G.A., K.A. Jacobs, T.H. Eickbush, P.T. Cherbas, y F.C. Kafatos [1983] Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman y K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100: 266 - 285):

Tm = 81.5^{o}C\ +\ 16.6\ Log[Na+]\ +\ 0.41(%G+C) - 0.61(%formamida) - 600/longitud\ de dúplex\ en\ pares\ de\ bases.

Los lavados se llevan a caso típicamente como sigue:

(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1 x SSPE, 0,1% de SDS (lavado de baja rigurosidad).

(2) Una vez a Tm - 20ºC durante 15 minutos en 0,2 x SSPE, 0,1% de SDS (lavado con rigurosidad moderada).

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Para las sondas de oligonucleótidos, la hibridación se llevó a cabo durante toda una noche a 10 - 20ºC por debajo de la temperatura de de fusión (Tm) del híbrido en 6 x SSPE, 5 x de solución de Denhardt, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml de ADN desnaturalizado. Tm para sondas de oligonucleótidos se determinó mediante la siguiente fórmula:

Tm (^{o}C) = 2\ (número\ de\ pares\ de\ bases\ T/A) + 4\ (número\ de\ pares\ de\ bases\ G/C)

(Suggs, S. V., T. Miyake, E. H. Kawashime, M. J. Johnson, K. Itakura, y R. B. Wallace [1981] ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, Nueva York, 23: 683 - 693).

Los lavados se llevaron a cabo típicamente como sigue:

(1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos 1x SSPE, 0,1% SDS (lavado de rigurosidad baja).

(2) Una vez a la temperatura de hibridación durante 15 minutos en 1 x SSPE, 0,1% de SDS (lavado de rigurosidad moderada).

En general, la sal y/o temperatura se puede alterar para cambiar la rigurosidad. Con un fragmento de ADN > 70 o aproximadamente bases de longitud, se pueden usar las siguientes condiciones:

Bajo:

1 ó 2 x SSPE, temperatura ambiente

Bajo:

1 ó 2 x SSPE, 42ºC

Moderado:

0.2 x ó 1 x SSPE, 65ºC

Alto:

0,1 x SSPE, 65ºC.

La formación dúplex y estabilidad dependen de la complementariedad sustancial entre las dos hebras de un híbrido y dos hebras de un híbrido, y como se ha indicado anteriormente, se puede tolerar un cierto grado de discordancia. Por lo tanto, las secuencias de sonda como se ha descrito, incluyen mutaciones (tanto individuales como múltiples), supresiones, inserciones de las secuencias descritas, y sus combinaciones, en las que dichas mutaciones, inserciones y supresiones permiten la formación de híbridos estables con el polinucleótido diana de interés. Las mutaciones, inserciones, y supresiones se pueden producir en una secuencia de polinucleótido dada de muchas maneras, y estos procedimientos se conocen por los expertos en la técnica. Otros procedimientos se llegarán a conocer en el
futuro.

Tecnología de la PCR: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una síntesis repetitiva, enzimática, cebada de una secuencia de ácido nucleico. Este procedimiento se conoce bien y se usa de manera común por los expertos en la técnica (véanse Mullis, patentes de Estados Unidos números 4,683.195, 4.683.202. y 4.800.159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim "Enzymatic Amplification of \beta-Globin Genomic Sequences y Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230: 1350 - 1354). Las reacciones de la PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN de interés que está flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos que se hibridan con hebras opuestas de la secuencia diana. Los cebadores se orientan con los extremos 3 N que apuntan hacia otro. Los ciclos repetidos de desnaturalización por calor del molde, la hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias, y extensión de los cebadores hibridazos con una ADn polimerasa da como resultado la amplificación del segmento definido por los extremos 5 N de los cebadores de la PCR. El producto de extensión de cada cebador puede servir como un molde para el otro cebador, de este modo cada ciclo esencialmente doble la cantidad de fragmento de ADN producido en el ciclo anterior. Esto da como resultado la acumulación exponencial de los fragmentos diana específicos, hasta varios millones de veces en unas pocas horas. Mediante el uso de una ADN polimerasa termoestable tal como Taq polimerasa, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, el procedimiento de amplificación se puede automatizar completamente. Otras enzimas que se pueden usar son conocidas por los expertos en la técnica.

Las secuencias de ADN como se describen en la invención presente se pueden usar como cebadores para la amplificación por la PCR. En la realización de la amplificación por PCR, se puede tolerar un cierto grado de discordancia entre cebador y molde. Por lo tanto, las mutaciones, supresiones, e inserciones (especialmente adiciones de nucleótidos al extremo 5 N) de los cebadores ejemplificados caen dentro del ámbito de la invención presente. Las mutaciones, inserciones y supresiones se pueden producir en un cebador dado mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Modificaciones de genes y toxinas. Los genes y toxinas útiles de acuerdo con la invención presente no incluyen solamente las secuencias de longitud completa ejemplificadas específicamente, sino también porciones, segmentos y/o fragmentos (que incluyen supresiones internas y/o terminales comparadas con las moléculas de longitud completa) de estas secuencias, variantes, mutantes, quiméricas, y sus fusiones. Por ejemplo, toxinas de la invención presente se pueden usar en la forma de toxinas quiméricas producidas por la combinación de porciones de dos o más toxinas/proteínas.

Las proteínas de la invención presente pueden tener aminoácidos sustituidos mientras puedan mantenerla actividad pesticida/funcional característica de las proteínas ejemplificadas de manera específica en el presente documento. Genes "variantes" tienen secuencias de nucleótidos que codifican las mismas toxinas o toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida equivalente con una proteína ejemplificada. Los términos "proteínas variantes" y "toxinas equivalentes" se refieren a toxinas que tienen la misma o esencialmente la misma actividad biológica/funcional contra las plagas diana y secuencias equivalentes que las toxinas ejemplificadas. Como se usa en el presente documento, referencia a una secuencia "equivalente" se refiere a secuencias que tienen sustituciones, supresiones, adiciones, o inserciones de aminoácidos, que mejoran o no de manera adversa a la actividad pesticida. Los fragmentos que retienen la actividad pesticida también se incluyen en esta definición. Los fragmentos y otros equivalentes que retienen la misma o similar función, o "actividad de toxina", de un fragmento correspondiente de una toxina están dentro del ámbito de la invención presente. Se pueden realizar cambios, tales como sustituciones o adiciones de aminoácidos para una diversidad de propósitos, tal como incremento (o disminución) de la estabilidad de proteasa de la proteína (sin disminución materialmente/sustancialmente de la actividad funcional de la
toxina).

Las toxinas equivalentes y/o genes que codifican estas toxinas equivalentes se pueden obtener/derivar de bacterias de tipo salvaje o recombinante y/o de otros microorganismos de tipo salvaje o recombinante usando las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. Otras especies de Paenibacillus, por ejemplo, se pueden usar como aislamientos de fuente.

Se pueden construir fácilmente variaciones de genes usando técnicas convencionales para preparar mutaciones puntuales, por ejemplo. Además, la patente de Estados Unidos Nº 5.605.793, por ejemplo, describe procedimientos para generar diversidad molecular adicional mediante el uso de reensamblaje de ADN después de la fragmentación al azar. Se pueden usar genes variantes para producir proteínas variantes. Usando estas técnicas de "recomposición de genes", se pueden construir genes y proteínas equivalentes que comprenden cualesquiera 5, 10, ó 20 restos contiguos (aminoácidos o nucleótido) de cualquier secuencia ejemplificada en el presente documento. Como conocen los expertos en la técnica, la técnica de recomposición de genes se pueden ajustar para que tengan, por ejemplo, 1,2,3,4,5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ó 500 o más restos contiguos (aminoácidos o nucleótido), correspondientes a un segmento (del mismo tamaño) en cualquiera de las secuencias ejemplificadas (o los complementos (complementos totales) de los mismos). De manera similar segmentos ajustados de tamaño, especialmente aquellos par alas regiones conservadas, también se pueden usar como sondas y/o
cebadores.

Los fragmentos de los genes de longitud completa se pueden preparar usando exonucleasas o endonucleasas disponibles comercialmente de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, enzimas tales como Bal31 o mutagénesis dirigida al sitio se pueden usar para cortar de manera sistemáticamente de los extremos de los extremos de estos genes. También, los genes que codifican fragmentos activos se pueden obtener usando una diversidad de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden usar para obtener directamente fragmentos activos de estas
toxinas.

Está dentro del ámbito de la invención como se describe en el presente documento que las toxinas pueden estar truncadas y todavía mantener la actividad funcional. Por " toxina truncada" se entiende que una porción de una proteína de toxina se puede escindir y todavía mantener la actividad funcional después de la escisión. La escisión se puede lograr mediante proteasas dentro o fuera del intestino del insecto. Además, las proteínas escindidas de manera efectiva se pueden producir usando técnicas de biología molecular en las que las bases de ADN que codifican dicha toxina se retiran o bien mediante digestión con endonucleasas de restricción u otras técnicas disponibles por los expertos en la técnica. Después del truncamiento, dichas proteínas se pueden expresar en sistemas heterólogos tales como E. coli, baculovirus, sistemas virales basados en plantas, levaduras y similares y después se colocan en ensayos de insecto como se describe en el presente documento para determinar la actividad. Se conoce bien en la técnica que las toxinas truncadas se pueden producir de manera exitosa de manera que retengan la actividad funcional mientras que tienen menos que la secuencia entera, de longitud completa. Se conoce bien en la técnica que las toxinas de B.t. toxinas se pueden usar en forma truncada (toxina del núcleo). Véase, por ejemplo, Adang et al., Gene 36: 289 - 300 (1985), "Characterized full-length y truncated plasmid clones of the crystal protein of Bacillus thuringiensis subsp kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta". Existen otros ejemplos de proteínas truncadas que retienen la actividad insecticida, incluyendo la hormona esterasa juvenil (Patente de Estados Unidos nº 5.674.485 de los Regenets de la Universidad de California). Como se usa en el presente documento, el término "toxina" también quiere decir que incluye truncamientos funcionalmente activos.

Ciertas toxinas de la invención presente se han ejemplificado de manera específica en el presente documento mediante la SEQ ID No. 13, y 41. Debe ser fácilmente evidente que la invención presente comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleótidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma o similar actividad pesticida de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendrán similitud (y/ o homología) de aminoácidos con una toxina ejemplificada. La identidad de aminoácidos típicamente será mayor que 60%, preferiblemente mayor que 75%, más preferiblemente mayor que 80%, incluso más preferiblemente mayor que 90%, y puede ser mayor que 95%. Los polinucleótidos y proteínas preferidos la invención presente también se pueden definir en términos de identidad más particular y/o intervalos de similitud. Por ejemplo, la identidad y/o similitud puede ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% cuando se compara con una secuencia ejemplificada en el presente documento. Salvo que se especifique de otra manera, como se usan en el presente documento porcentaje de identidad y/o similitud de secuencia de dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 - 2268, modificado en Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 - 5877. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 402 - 410. Las investigaciones de nucleótidos de BLAST se realizan con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabras = 12. Para obtener las alineaciones de huecos para propósitos de comparación, se usa, Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997), Nucl. Acids Res. 25: 3389 - 3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros por defecto de los programas respectivos (NBLAST y XBLAST). Véase la página web de NCBI/NIH. Las puntuaciones también se pueden calcular usando los procedimientos y algoritmos de Crickmore et al. Como se describe en la sección de antecedentes,
anteriormente.

La homología/similitud/identidad serán las mayores en las regiones críticas de la toxina que son responsables de la actividad biológica o están implicadas en la determinación de la configuración de tres dimensiones que es por último responsable de la actividad biológica. A este respecto, ciertas sustituciones de aminoácidos son aceptables y se puede esperar que sean toleradas. Por ejemplo, estas sustituciones pueden estar en regiones de la proteína que no son críticas para la actividad. El análisis de la estructura cristalina de una proteína, y modelado de la estructura de proteína basada en software, se pueden usar para identificar regiones de una proteína que se puede modificar (usando la mutagénesis dirigida al sitio, recomposición, etc.) para cambiar de manera real las propiedades y/o incrementar la funcionalidad de la proteína.

También se pueden cambiar diversas propiedades y características de 3 D diana de la proteína sin afectar de manera adversa la actividad/funcionalidad de la proteína. Las sustituciones de aminoácidos conservadas se puede esperar que sean toleradas/no afectar de manera adversa la configuración de tres dimensiones de la molécula. Los aminoácidos se pueden situar en las siguientes clases: no-polar, polar sin carga, básico, y ácido. Las sustituciones conservadoras por las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido del mismo tipo cae dentro del ámbito de la invención presente mientras que la sustitución no sea adversa a la actividad biológica del compuesto. La Tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de de aminoácidos que pertenece a cada clase.

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TABLA 1

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En algunos casos, también se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas sustituciones no deben disminuir de manera significativa de la actividad funcional/actividad biológica de la toxina.

Como se usa en el presente documento, referencia a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas" se refiere a estas moléculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con la que se unirían en la naturaleza. De este modo, la referencia a "aislado" y/o "purificado" significa la implicación de la "mano del hombre" como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un "gen" de toxina bacteriano de la invención presente puesto en una planta para la expresión es un "polinucleótido aislado". Del mismo modo, una proteína de Paenibacillus, ejemplificada en el presente documento, producido por una planta es una "proteína aislada".

Debido a la degeneración/redundancia del código genético, una diversidad de secuencias diferentes de ADN se pueden codificar las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento. Los expertos en la técnica saben bien crear secuencias d ADN alternativas que codifican la misma o esencialmente las mismas toxinas. Se describen estas secuencias variantes de ADN.

Optimización de secuencia para la expresión en plantas. Para obtener una alta expresión de genes heterólogos en plantas se puede preferir volver a modificar por ingeniería genética dichos genes de manera que se expresen de manera más eficaz en (el citoplasma de) células de plantas. El maíz es una de tales plantas donde puede ser preferible volver a diseñar el(los) gen(es) heterólogo(s) antes de la transformación para incrementar su nivel de expresión en dicha planta. Por lo tanto, una etapa adicional en el diseño de genes que codifican una toxina bacteriana se vuelve a modificar por ingeniaría genética de un gen heterólogo para la expresión óptima.

Una razón para volver a modificar por ingeniería genética una toxina bacteriana para la expresión en maíz se debe al contenido de G+C no óptimo del gen nativo. Por ejemplo, el muy bajo contenido de G+C de muchos genes bacterianos nativos (y posterior sesgado hacia alto contenido de A+T) da como resultado la generación de secuencias que imitan o duplican las secuencias de control de genes de plantas que se conocen que son altamente ricas en A+T. La presencia de algunas secuencias ricas en A+T con el(los) gen(es) de ADN introducidos en plantas (por ejemplo, regiones de casillas TATA que se encuentran normalmente en los promotores de genes) puede dar como resultado la transcripción aberrante del(de los) gen(es). Por otra parte, la presencia de otras secuencias reguladoras que residen en el ARNm trascrito (por ejemplo, secuencias de señal depoliadenilación (AAUAAA), o secuencias complementarias con los ARN nucleares pequeños implicados en el ayuste de preARNm) puede conducir a la inestabilidad de ARN. Por lo tanto, un objetivo en el diseño de genes que codifican una toxina bacteriana para la expresión de maíz, más preferiblemente denominado como gen(es) optimizados de plantas, es generar una secuencia de ADN que tiene un contenido de G+C mayor, y preferiblemente uno cercano a los genes de maíz que codifican enzimas metabólicas. Otro objetivo en el diseño del gen(es) optimizado(s) de plantas que codifican una toxina bacteriana es para generar una secuencia de ADN en el que las modificaciones de secuencia no impiden la
traducción.

La Tabla a continuación (Tabla 2) cómo de alto es el contenido de G+C en maíz. Para los datos en la Tabla 2, que codifican las regiones de los genes se extrajeron de las entradas del GenBank (Liberación 71), y composiciones de base se calcularon usando el programa MacVector.TM. (IBI, New Haven, Conn.). Las secuencias de intrones se ignoraron en los cálculos.

Debido a la plasticidad producida por la redundancia/degeneración del código genético (es decir, algunos aminoácidos se especifican por más de un codón), evolución de los genomas en organismos o clases diferentes de organismos ha dado como resultado un uso diferencial de codones redundantes. Esta "desviación de codón" se refleja en la composición de base media de regiones que codifican proteínas. Por ejemplo, organismos con contenidos relativamente bajos de G+C utilizan codones que tienen A o T en la tercera posición de codones redundantes, mientras que los que tienen contenidos de G+C mayores utilizan codones que tienen G o C en la tercera posición. Se cree que la presencia de codones "menores " dentro de un ARNm puede reducir la velocidad de traducción absoluta de ese ARNm, especialmente cuando la abundancia relativa del ARNt cargado que corresponde al menor codón es baja. Una extensión de esto es que la disminución de la velocidad de traducción por codones menores individuales sería al menos aditivo para codones múltiples. Por lo tanto, los ARNm que tienen altos contenidos relativos de codones menores tendrían velocidades de traducción relativamente bajas. Esta velocidad se reflejaría mediante bajos niveles posteriores de la proteína codificada.

En la remodificación por ingeniería genética de los genes que codifican una toxina bacteriana para la expresión en maíz (u otra planta, tal como algodón o soja), se ha determinado la desviación del codón de la planta. La desviación del codón para maíz es la distribución del codón estadística que usa la planta para codificar sus proteínas y el uso de codón preferido se muestra en la Tabla 3. Después de determinar la desviación, se determina el porcentaje de frecuencia de los codones en el gen(es) de interés. Los codones primarios preferidos por la planta se debe determinar así como la segunda y tercera elección de los codones preferidos. Después de esto, la secuencia de aminoácidos de la toxina bacteriana de interés se traslada de manera inversa de manera que la secuencia de ácido nucleico resultante codifica exactamente la misma proteína que el gen nativo que se desea que se exprese de manera heteróloga. La nueva secuencia de ADN se diseña usando la información de desviación de codón de manera que corresponda a la mayoría de los codones preferidos de la planta deseada. La nueva secuencia se analiza después para determinar los sitios de enzimas de restricción que se pudieran haber creado por la modificación. Los sitios identificados se modifican además reemplazando los codones con la segunda o tercera elección preferida de codones. Otros sitios en la secuencia que podrían afectar a la transcripción o traducción del gen de interés son las uniones exón : intrón (5' ó 3'), señales de adición de poli A, o señales de terminación de la ARN polimerasa. Además se analiza y modifica la secuencia para reducir la frecuencia de dobletes TA o GC. Además de los dobletes, los bloques de secuencia G o C que tienen más que aproximadamente cuatro restos que son el mismo pueden afectar a la transcripción de las secuencias. Por lo tanto, estos bloques también se modifican reemplazando los codones de la primera o segunda elección, etc., con el siguiente codón preferido de elección.

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TABLA 2

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Se prefiere que el(los) gen(es) que codifica(n) una toxina bacteriana contenga(n) aproximadamente 63% de la primera elección de codones, entre aproximadamente 22% y aproximadamente 37% de la segunda elección de codones, y entre aproximadamente 15% y aproximadamente 0% de la tercera elección de codones, donde el porcentaje total es 100%. Los más preferido es que el(los) gen(es) contengan aproximadamente 63% de la primera elección de codones, al menos aproximadamente 22% de la segunda elección de codones, aproximadamente 7.5% de la tercera elección de codones, y aproximadamente 7,5% de la cuarta elección de codones, donde el porcentaje total es 100%. El uso del codón preferido para la modificación por ingeniería genética de los genes para la expresión en maíz se muestra en la Tabla 3. El procedimiento descrito anteriormente permite a los expertos en la técnica modificar el(los) gen(es) que son extraños para una planta particular de manera que los genes se expresan de manera óptima en plantas. El procedimiento además se ilustra en la solicitud PCT WO 97/13402.

Con el fin de diseñar los genes optimizados de plantas que codifican una toxina bacteriana, la secuencia de aminoácidos de dicha proteína se traduce de manera inversa en una secuencia de ADN que utiliza un código genético no reducido de una tabla de desviación de codón para las secuencias de genes para la planta particular, como se muestra en la Tabla 2. La secuencia de ADN resultante, que es completamente homogénea en el uso de codón, se modifica además para establecer una secuencia de ADN que, además de tener un grado mayor de diversidad de codón, también contiene sitios de reconocimiento de enzimas colocados de manera estratégica, deseable composición de bases, y una carencia de las secuencias que podrían interferir en la transcripción del gen, o traducción del ARNm
producto.

TABLA 3

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De este modo, los genes sintéticos que son funcionalmente equivalentes a las toxinas de la invención presente se pueden usar para transformar huéspedes, incluyendo plantas. La guía adicional con relación a la producción de los genes sintéticos se pueden encontrar, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.380.831.

En algunos casos, especialmente durante la expresión en plantas, puede ser ventajoso usar genes truncados que expresan proteínas truncadas. Höfte et al. 1989, por ejemplo, descrito en la sección de antecedentes anteriormente, describían segmentos de protoxina y toxina de núcleo de las toxinas de B.t. Los genes truncados preferidos codificarán típicamente 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, S0, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ó 99% de la toxina de longitud completa.

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Huéspedes transgénicos. Los genes que codifican toxinas como se describe se pueden introducir en una amplia diversidad de huéspedes microbianos o de plantas. En las realizaciones preferidas, se usan las células de las plantas transgénicas y plantas. Las plantas preferidas (y células de plantas) son avena, maíz y algodón.

En las realizaciones preferidas, la expresión de un gen de toxina da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular (y mantenimiento) de las proteínas pesticidas. Las plantas se pueden hacer resistentes a insectos de esta manera. Cuando, las células huésped transgénicas/recombinantes/transformadas/transfectadas (o sus contenidos) se ingieren por las plagas, las plagas ingerirán las toxinas. Esta es la manera preferida que provoca el contacto de la plaga con la toxina. El resultado es el control (muerte o que enferme) de la plaga. Las plagas chupadoras también se pueden controlar de una manera similar. Como alternativa, se pueden aplicar huéspedes microbianos adecuados, por ejemplo Pseudomonas tal como P. fluorescens, se pueden aplicar cuando las plagas diana están presentes, los microbios pueden proliferar ahí, y se ingieren por las plagas diana. El microbio que alberga el gen de toxina se puede tratar en condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la célula. La célula tratada, que mantiene la actividad tóxica, se puede aplicar después al ambiente de la plaga diana.

Cuando el gen de toxina se introduce mediante un vector adecuado en un huésped microbiano, y dicho huésped se aplica al ambiente en un estado vivo, se deben usar ciertos microbios huésped. Los huéspedes de microorganismos se seleccionan para que ocupen la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, y/o rizoplano) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de de competir de manera exitosa en el ambiente particular (hábitat de cultivos y otros insectos) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionan el mantenimiento y expresión estable del gen que expresa el polipéptido pesticida, y, de manera deseable, proporcionan una mejora en la protección del pesticida de la degradación e inactivación ambiental.

Se conocen un gran número de microorganismos que inhabilitan el filoplano (la superficie de las hojas de las plantas) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las raíces de la planta) de una diversidad amplia de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De particular interés son los microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, los géneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, los géneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son especies de bacterias de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, y Azotobacter vinlandii; y especies de levadura de fotosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. También de interés son los microorganismo pigmentados.

Inserción de genes para formar huéspedes transgénicos. Se describe la transformación/infección de plantas, células de plantas y otras células huésped con polinucleótidos como se describe que expresa proteínas de la invención presente. Las plantas transformadas de esta manera se pueden volver resistentes al ataque de la(s) plaga(s) diana(s).

Están disponibles una diversidad de procedimientos para introducir un gen que codifica una proteína pesticida en el huésped diana en condiciones que permiten el mantenimiento estable y una expresión del gen. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, in Patente de Estados Unidos Nº 5.135.867.

Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de de las células transformadas están disponibles para la preparación de la inserción de genes extraños en las plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, la serie pBR322, pUC, serie M13mp, pACYC184, etc. De acuerdo con lo anterior, la secuencia que codifica la toxina se puede insertar en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, después se cosechan y se lisan. Se recupera el plásmido. El análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis, y otros procedimientos bioquímicos - moleculares - biológicos se llevan a cabo en general como procedimientos de análisis. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada se puede escindir y unir a la siguiente secuencia de AND. Cada secuencia de plásmido se puede clonar en el mismo u otro plásmido. Dependiendo del procedimiento de inserción de los genes deseados en la planta, otras secuencias de ADN pueden ser necesarias. Si, por ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usa para la transformación de la célula de plantas, entonces al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el izquierdo del T-ADN del plásmido Ti o Ri, tiene que unirse a la región flanqueante de los genes a insertar. El uso de T-ADN para la transformación de de las células de plantas se ha vuelto a investigar y descrito de manera intensiva en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, capítulo 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4: 1 - 46; y An et al. (1985) EMBO J. 4:277 - 287.

Están disponibles un gran número de técnicas para insertar el ADN en una célula huésped de plantas. Aquellas técnicas incluyen la transformación con T-ADN que usa Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolística (bombardeo de micropartículas), o electroporación así como otros procedimientos posibles. Si se usan Agrobacteria para la transformación, el ADN a insertar tiene que clonarse en plásmidos especiales, a saber o bien en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga debido a las secuencias que son homólogas a las secuencias en el T-ADN. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del T-ADN. Los vectores intermedios no se pueden replicar ellos mismos en Agrobacteria. El vector intermedio se puede transferir en Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar ellos mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de selección y un engarce o poliengarce que se encuadran mediante las regiones de borde de T-ADN derecha e izquierda. Se pueden transformar directamente en Agrobacteria (Holsters et al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163: 181 - 187). El Agrobacterium usado como célula huésped es para comprender un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del T-ADN en la célula vegetal. Puede estar contenido T-ADN adicional. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células vegetales. Los explantes de plantas se pueden cultivar de manera ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Después las plantas enteras se pueden regenerar a partir de material vegetal infectado (por ejemplo, partes de hoja, segmentos de tallo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para selección. Las plantas así obtenida se pueden después ensayar para determinar la presencia del ADN insertado. No se realiza ninguna demanda especial de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las células transformadas crecen en el interior de las plantas de la manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir el(los) carácter(es) a las plantas de progenie. Tales plantas se pueden desarrollar de la manera normal y cruzar con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.

Los genes que codifican la toxina bacteriana se pueden expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en el genoma de plantas. Preferiblemente, dichas unidades de transcripción son vectores recombinantes capaces de la integración estable en el genoma de plantas y permitir la selección de líneas vegetales transformadas que expresan ARNm que codifican las proteínas.

Una vez que se ha integrado el ADN insertado en el genoma, es relativamente estable ahí (y no sale de nuevo). Normalmente contiene un marcador de selección que confiere a las células de plantas transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, o cloranfenicol, inter alia. El marcador empleado individualmente debe de acuerdo con lo anterior permitir la selección de células transformadas en lugar de las células que no contienen el ADN insertado. El(los) gen(es) de interés se expresan preferiblemente o bien mediante promotores constitutivos o inducibles en la célula vegetal. Una vez que se ha expresado, el ARNm se traduce en proteínas, incorporando por lo tanto los aminoácidos de interés en la proteína. Los genes que codifican una toxina expresada en las células vegetales puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido, o un promotor inducible.

Existen varias técnicas para introducir vectores recombinantes extraños en las células vegetales, y para obtener plantas que mantienen y se expresan de manera estable el gen introducido (Patentes de Estados Unidos Números 4.945,050 de Cornell y 5.141.131 de DowElanco, ahora Dow AgroSciences, LLC). Además, las plantas se pueden transformar usando tecnología de Agrobacterium, véase Patente de Estados Unidos Nº 5.177.010 de La Universidad de Toledo; 5.104.310 de Texas A&M; Solicitud de Patente Europea 0131624B1; Solicitud de Patente Europea 120516, 159418B1 y 176.112 de Schilperoot; Patentes de Estados Unidos Números 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 y 4.940,838 y 4.693,976 de Schilperoot; Solicitudes de Patente Europea 116718, 290799, 320500 todas de Max Planck; Solicitudes de Patente Europea 604662 y 627752, y Patente de Estados Unidos Nº 5.591.616, de Japan Tobacco; Solicitudes de Patente Europea 0267159 y 0292435, y Patente de Estados Unidos Nº 5.231.019, todas de Ciba Geigy, ahora Novartis; Patentes de Estados Unidos Números 5.463.174 y 4.762.785, ambas de Calgene; y Patentes de Estados Unidos Números 5.004.863 y 5.159.135, ambas de Agracetus. Otra tecnología de transformación incluye la tecnología de patillas. Véase Patentes de Estados Unidos Números 5.302.523 y 5.464.765, ambas de Zeneca. También se ha usado tecnología de electroporación para transformar plantas. Véase el documento WO 87/06614 del Instituto Boyce Thompson; Patentes de Estados Unidos Números 5.472.869 y 5.384.253, ambas de Dekalb; y el documento WO 92/09696 y WO 93/21335, ambos de Plant Genetic Systems. Además, también se pueden usar vectores virales para producir plantas transgénicas que expresan la proteína de interés. Por ejemplo, se pueden transformar plantas monocotiledóneas con un vector viral usando los procedimientos descritos en las Patentes de Estados Unidos Números 5.569.597 de Mycogen Plant Science y Ciba-Giegy, ahora Novartis, así como las Patentes de Estados Unidos Números 5.589.367 y 5.316.931, ambas de Biosource.

Como se ha mencionado anteriormente, la manera en la que la construcción de ADN se introduce en la planta huésped no es crítica. Se puede emplear cualquier procedimiento que proporcione la transformación eficaz. Por ejemplo, se describen en el presente documento varios procedimientos para la transformación de células de plantas e incluyen el uso de plásmidos Ti o Ri y similares para realizar la transformación mediada por Agrobacterium. En muchos casos, será deseable que tengan la construcción usada para la transformación que bordea uno o ambos lados por bordes de T-ADN, más específicamente el borde derecho. Esto es particularmente útil cuando la construcción usa Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como un modo de transformación, aunque los bordes de T-ADN pueden encontrar uso con otros modos de transformación. Cuando se usa Agrobacterium para la transformación de células vegetales, se puede usar un vector que se puede introducir en el huésped para la recombinación homóloga con T-ADN o el plásmido Ti o Ri presente en el huésped. La introducción del vector se puede realizar mediante electroporación, emparejamiento tri-parental y otras técnicas para transformar las bacterias gram-negativas que con conocidas por los expertos en la técnica. El medio del vector de transformación en el huésped de Agrobacterium no es crítico. El plásmido de Ti o Ri que contiene el T-ADN para recombinación puede ser capaz de o incapaz de provocar la formación de agallas, y no es crítico mientras que los genes vir estén presentes en dicho huésped.

En algunos casos cuando se usa Agrobacterium para la transformación, la construcción de la expresión que está dentro de los bordes de T-ADN se insertará en un vector de alto espectro tal como pRK2 o sus derivados como se describe en Ditta et al., (PNAS USA (1980) 77: 7347 - 7351 y EPO 0 120 515, que se incorporan en el presente documento por referencia. Incluidos dentro de la construcción de expresión y el T-ADN estará uno o más marcadores como se describe en el presente documento que permite la selección de Agrobacterium transformado y células vegetales transformadas. El marcador particular empleado no es esencial, dependiendo del marcador preferido del huésped y construcción usados.

Para la transformación de células vegetales que usan Agrobacterium, se pueden combinar explantes e incubar con el Agrobacterium transformado durante tiempo suficiente para permitir su transformación. Después de la transformación, los Agrobacteria se matan mediante selección con el antibiótico apropiado y las células vegetales se cultivan con el medio selectivo apropiado. una vez que se forman callos, la formación de brotes se puede estimular empleando las hormonas de plantas apropiadas de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la técnica de cultivo de tejidos de plantas y regeneración de plantas. Sin embargo, una fase intermedia de callo no es siempre necesario. Después de la formación de brotes, dichas plantas vegetales se pueden transferir al medio que estimula la formación de raíces completando por lo tanto la regeneración de plantas. Después las plantas se pueden cultivar hasta semilla y dicha semilla se pueden usar en el establecimiento de generaciones futuras. Independientemente de la técnica de transformación, el gen que codifica una toxina de bacteria se incorpora de manera preferible en un vector de transferencia de genes adaptado para expresar dicho gen en una célula vegetal incluyendo en el vector un elemento regulador de promotor de plantas, así como regiones de terminación de la transcripción no traducida en 3' tal como Nos y
similares.

Además de las numerosas tecnologías para la transformación de plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños puede variar también. Tal tejido incluiría pero no se limitaría a tejido embriogénico, tejido de callo tipos I, II, y III, hipocotilo, meristemo, tejido radicular, tejidos para la expresión en el floema, y similares. Casi todos los tejidos de plantas se pueden transformar mediante la dediferenciación usando técnicas apropiadas descritas en el presente documento.

Como se ha mencionado anteriormente, se puede usar una diversidad de marcadores que se pueden seleccionar, si se desea. La preferencia de un marcador está a la discreción del experto en la técnica, pero cualquiera de los marcadores que se puede seleccionar se puede usar junto con cualquier otra otro gen no enumerado en el presente documento que podría funcionar como un marcador que se puede seleccionar. Tales marcadores que se pueden seleccionar incluyen pero no se limitan a gen de aminoglicósido fosfotransferasa de transposón Tn5 (Aph II) que codifica la resistencia a los antibióticos kanamicina, neomicina y G418, así como aquellos genes que codifican la resistencia o tolerancia a los herbicidas glifosato; higromicina; metotrexato; fosfinotricina (bialafos); imidazolinonas, sulfonilureas y triazolopirimidina, tales como clorsulfuron; bromoxinil, dalapon y similares.

Además de un marcador que se puede seleccionar, puede ser deseable usar un gen indicador. En algunos casos se puede usar un gen indicador con o sin un marcador que se puede seleccionar. Los genes indicadores son genes que típicamente no están presentes en el organismo o tejido receptor y típicamente codifican proteínas que dan como resultado algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Los ejemplos de tales genes se proporcionan en K. Wising et al. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988). Los genes indicadores preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de cloramfenicol acetil transferasa de Tn9 de E. coli, la proteína verde fluorescente de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria, y los genes de luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis. Un ensayo para detectarla expresión del gen indicador se puede después realizar en un tiempo adecuado después de que dicho se haya introducido en las células receptoras. Uno de tales ensayos preferidos supone el uso del gen que codifica la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli como describe Jefferson et al., (1987 Biochem. Soc. Trans. 15, 17 - 19) para identificar células transformadas.

Además de los elementos reguladores de los promotores de plantas, los elementos reguladores de los promotores de una diversidad de fuentes se pueden usar de manera eficaz en células vegetales para expresar los genes extraños. Por ejemplo, los elementos reguladores de los promotores de origen bacteriano, tales como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de mannopina sintasa; promotores de origen viral, tal como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S), 35T (que es un promotor remodificado por ingeniería genética 35S, véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.166.302, especialmente el ejemplo 7E) y similares se pueden usar. Los elementos reguladores del promotor de plantas incluyen pero no se limitan a la subunidad pequeña de ribulosa-1,6-bisfosfato (RUBP) carboxilasa (ssu), promotor de beta-conglicinin, promotor de beta-faseolin, promotor de ADH, promotores de choque térmico, y promotores específicos de tejidos. Otros elementos tales como regiones de unión a matriz, regiones de unión a andamio, intrones, potenciadores, secuencias de poliadenilación y similares pueden estar presentes y de este modo, pueden mejorar la eficacia de transcripción o integración de ADN. Tales elementos pueden o no pueden ser necesarios para la función del ADN, aunque pueden proporcionar una mejor expresión o funcionamiento del ADN afectando a la transcripción, estabilidad de ARNm, y similares. Tales elementos pueden estar incluidos en el ADN según se desee para obtener la realización óptima del ADN transformado en la planta. Los elementos típicos incluyen pero no se limitan a Adh-intrón 1, Adhintrón 6, la secuencia guía de la proteína de revestimiento del virus del mosaico de la alfalfa, la secuencia guía de la proteína de revestimiento del virus del rayado de maíz, así como otros disponibles por los expertos en la técnica. Los elementos reguladores de los promotores constitutivos también se pueden usar por lo tanto dirigiendo la expresión del gen continuo en todos los tipos de células y en todos los momentos (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S, y similares). Los elementos reguladores de los promotores específicos de tejidos son responsables de la expresión génica en tipos de células o tejidos específicos, tales como hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y éstos también se pueden usar.

Los elementos reguladores de los promotores también pueden ser activos durante una cierta fase del desarrollo de las plantas así como activos en tejidos y órganos de plantas. Los ejemplos de tales incluyen pero no se limitan a elementos reguladores de los promotores específicos de polen, específicos de embrión, específicos de seda de maíz, específicos de fibra de algodón, específicos de raíces, específicos de endospermo de semilla y similares. En ciertas circunstancias puede ser deseable usar un elemento regulador de los promotores, que es responsable de la expresión de genes en respuesta a una señal específica, tal como un estímulo físico (genes de choque térmico), luz (RUBP carboxilasa), hormona (Em), metabolitos, compuesto químico, y estrés. Se pueden usar otros elementos de transcripción y traducción deseables que funcionan en plantas. Se conocen en la técnica numerosos vectores de transferencia de genes específicos de plantas.

Se pueden usar técnicas de biología molecular para clonar y secuenciar las toxinas descritas en el presente documento. Se puede encontrar información adicional en Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, que se incorpora en el presente documento por
referencia.

Manejo de resistencia. Con el incremento del uso comercial de proteínas insecticidas en plantas transgénicas, una consideración es el manejo de la resistencia. Esto es, existen numerosas compañías que usan toxinas de Bacillus thuringiensis en sus productos, y existe un asunto sobre insectos que desarrollan resistencia a toxinas de B.t.. Una estrategia para el manejo de la resistencia sería combinar las toxinas de TC toxinas producidas por Xenorhabdus, Photorhabdus, y similares con las toxinas tales como B.t., toxinas cristalinas, proteínas insecticidas solubles de cepas de Bacillus (véase, por ejemplo, los documentosWO98/18932 y WO99/57282), u otras toxinas de insectos. Las combinaciones se pueden formular para una aplicación pulverizable o pueden ser combinaciones moleculares. Las plantas se pueden transformar con genes bacterianos que producen dos o más toxinas de insecto diferentes (véase, por ejemplo, Gould, 38 Bioscience 26 - 33 (1988) y La patente de Estados Unidos Nº 5.500.365; del mismo modo, la solicitud de patente europea 0 400 246 A1 y las patentes de Estados Unidos números 5.866.784; 5.908.970; y 6.172.281 también describen la transformación de una planta con dos toxinas cristalinas de B.t.). Otro procedimiento de producción de una planta transgénica que contiene más de un gen de resistencia a insecto sería primero producir dos plantas, conteniendo cada planta un gen de resistencia a insectos gene. Estas plantas se pueden después cruzar usando las técnicas de mejora de plantas tradicionales para producir una planta que contiene más de un gen de resistencia a insecto. De este modo, debe ser evidente que la frase "que comprende un polinucleótido" como se usan en el presente documento significa al menos un polinucleótido (y posiblemente más, contiguo o no) salvo que se indique específicamente de otra
manera.

Formulaciones y otros sistemas de distribución. Los gránulos de cebo formulados que contienen esporas y/o cristales del aislamiento sujeto de Paenibacillus, o microbios recombinantes que comprenden los genes que se pueden obtener a partir del aislamiento descrito en el presente documento, se pueden aplicar al suelo. El producto formulado también se puede aplicar en forma de un recubrimiento de semilla o tratamiento de raíz o tratamiento de planta total en las fases tardías del ciclo de cultivo. Los tratamientos de planta y suelo de células se pueden emplear en forma de polvos o gránulos o polvos humectables, mezclando con diversos materiales inertes, tales como minerales orgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez, y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes de dispersión - adherencia, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas, o tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden ser en base acuosa o no acuosa y emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables, o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes, o polímeros.

Como apreciarán los expertos en la técnica, la concentración de pesticida variará ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, particularmente si es un concentrado o se va a usar directamente. El pesticida estará presente en al menos 1% en peso y puede ser un 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán entre aproximadamente 1 - 95% en peso del pesticida mientras que las formulaciones líquidas en general estarán entre aproximadamente 1 - 60% en peso de los sólidos en la fase líquida. Las formulaciones en general tendrán entre aproximadamente 10^{2} y aproximadamente 10^{4} células/mg. Estas formulaciones se administrarán a aproximadamente 50 mg (líquido o seco) hasta 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones se pueden aplicar al ambiente de la plaga, por ejemplo, suelo y follaje, mediante pulverización espolvoreado, rociado, o similares.

Otro esquema de distribución es la incorporación del material genético de las toxinas en un vector de baculovirus. Los baculovirus infectan huéspedes de insectos particulares, incluyendo los dirigidos de manera deseable con las toxinas. Los baculovirus infecciosos que albergan una construcción de expresión para las toxinas se pueden introducir en áreas de infestación de insectos para intoxicar por lo tanto o envenenar insectos infectados.

Los virus de insectos, o baculovirus, se sabe que infectan y afectan de manera inversa ciertos insectos. La afectación de los virus o insectos es lenta, y los virus no detienen inmediatamente la alimentación de insectos. De este modo, los virus no se contemplan que sean óptimos como agentes de control de plagas de insectos. Sin embargo, la combinación de los genes de toxinas en un vector de baculovirus puede proporcionar una forma eficaz de de transmitir las toxinas. Además, ya que diferentes baculovirus son específicos para diferentes insectos, puede ser posible usar una toxina particular para dirigir de manera selectiva particularmente dañando las plagas de insectos. Un vector particularmente útil para los genes de toxinas es el virus de polihedrosis nuclear. Los vectores de transferencia que usan este virus se han descrito y son ahora los vectores de elección para transferir genes extraños a insectos. El recombinante del gen de la toxina de virus se puede construir en una forma que se puede transmitir por vía oral. Los baculovirus normalmente infectan las víctimas de insectos a través de la mucosa intestinal del intestino medio. El gen de la toxina insertado detrás de un promotor de la proteína de recubrimiento viral fuerte se expresaría y debe matar rápidamente el insecto infectado.

Además de un virus o baculovirus de insecto o sistema de distribución de plantas par alas toxinas de las proteínas de la presente invención, las proteínas se pueden encapsular usando la tecnología de encapsulación de Bacillus thuringiensis tal como pero no limitada a las Patentes de Estados Unidos números 4.695.455; 4.695.462; 4.861.595 que se incorporan todas en el presente documento por referencia. Otro sistema de distribución para las toxinas de proteínas de la presente invención es la formulación de la proteína en una matriz de cebo, que después se puede usar encima y debajo de las estaciones de cebo de insectos molido. Los ejemplos de tal tecnología incluyen pero no se limitan a la solicitud de patente PCT WO 93/23998, que se incorpora en el presente documento por
referencia.

Los sistemas basados en virus de ARN de plantas también se pueden usar para expresar toxina bacteriana. Haciendo esto, el gen que codifica una toxina se puede insertar en la región del promotor de recubrimiento que infectará la planta huésped de interés. La toxina se puede expresar después proporcionando de esta manera la protección de la planta del daño de insecto. Los sistemas basados en virus de ARN de plantas se describen en las Patentes de Estados Unidos números 5.500.360 de Mycogen Plant Sciences, Inc. y las Patentes de Estados Unidos números 5.316.931 y 5.589.367 de Biosource Genetics Corp.

Además de producir una planta transformante, existen otros sistemas de distribución donde puede ser deseable volver a modificar por ingeniería genética el(los) gen(es) bacterianos. Por ejemplo, una toxina de proteína se puede construir mediante fusión conjuntamente con una molécula atractiva para los insectos como una fuente de alimento con una toxina. Después de la purificación en el laboratorio tal agente tóxico con cebo "construido dentro" se puede empaquetar dentro de alojamientos de trampa de insectos convencionales.

Mutantes. Los mutantes del aislamiento DAS1529 de la invención se pueden preparar mediante procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un mutante asporógeno se puede obtener mediante etil metano sulfonato (EMS) mutagénesis de un aislamiento. Los mutantes se pueden realizar usando luz ultravioleta y nitrosoguanidina mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.

A continuación están los ejemplos que ilustran procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no se deben considerar como limitantes. Todos los porcentajes están en peso y todas las proporciones de mezcla de disolvente están en volumen salvo que se indique de otra manera.

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Ejemplo 1

Aislamiento y descubrimiento de la actividad insecticida de DAS1529 como un Paenibacillus sp

Una cepa bacteriana, denominada DAS1529, se encontró que produce factores que eran inhibidores de crecimiento de neonatos de insectos lepidópteros, gusano de la mazorca de maíz (Heliothis zea; CEW), gusano de las yemas del tabaco (Heliothis virescens; TBW), y Gusano cornudo del tabaco (Manduca sexta; THW).

DAS 1529 se cultivó en 2% de medio de Proteasa Peptona No. 3 (PP3) (Difco Laboratorios, Detroit, MI) suplementado con 1,25% de NaCl o en medio JB suplementado con 0,2% de glucosa. El cultivo bacteriano se desarrolló a 25ºC durante \sim 40 horas a 150 rpm.

Los factores activos de manera insecticida se encontraron inicialmente en el caldo de fermentación que se concentró sobre filtros de corte de peso molecular de 5 kDa. Los factores que eran lábiles al calor (inactivados mediante calentamiento a 85ºC durante 20 minutos). Estos datos indicaron que los factores eran proteináceos. Véase también el final del Ejemplo 4.

Para identificar los factores activos en los sedimentos celulares, el cultivo bacteriano se centrifugó a 8000 rpm a 4ºC durante 15 minutos, se lavó una vez con agua destilada estéril, y se volvió a suspender a 33X del volumen de cultivo original en agua destilada estéril, y posteriormente a bioensayo de insectos como se describe más adelante en el Ejemplo 3. Los datos de bioensayo para la cepa DAS 1529 se resume en la Tabla 4. Los datos mostraron que el caldo de cultivo y las células bacterianas DAS 1529 concentradas conferían buena actividad contra CEW (30 a 50% de mortalidad a 33X) y TBW (100% de mortalidad a 33X). Aquellos factores de toxina en DAS 1529 tenían una significación relativa para el desarrollo de productos transgénicos comerciales que dirigen los insectos lepidópteros (por ejemplo, CEW y TBW) en maíz y algodón.

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8

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Ejemplo 2

Clasificación de DAS 1529

La filogenia molecular se realizó para determinar la afiliación taxonómica de la cepa DAS 1529. La secuencia de nucleótidos del ADNr 16S de DAS 1529 se determine y usó para análisis de similitud y filogenéticos (usando el kit MicroSeq Kit de ABI). La secuencia se proporciona como la SEQ ID NO:16. Los resultados de investigación de BLAST son como sigue:

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10

\newpage

Estas mismas secuencias de puntuación superiores de la investigación BLAST se compararon también usando la rutina Gap (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48; 443 - 453 (1970)) de GCG versión 10.2, con los siguientes resultados:

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Un número de secuencias relacionadas, que incluyen las secuencias de puntuación superiores indicadas anteriormente, también se recortaron y se alinearon como se ha descrito por Shida et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 289 - 298, 1997), usando el programa de alineación de secuencias CLUSTAL W (Thompson, J.D., D. G. Higgins, y T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22: 4673 - 4680, 1994). Los resultados claramente colocan DAS1529 en el subgrupo Paenibacillus popilliae/Paenibacillus lentimorbus del género Paenibacillus identificado por Pettersson et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 531 - 540,1999), y son consistentes con los análisis reseñados anteriormente. Este subgrupo incluye las especies asociadas a insectos P. popilliae y P. lentimorbus, así como P. thiaminolyticus, Paenibacillus sp. T-168 y C-168, y "Bacillus tipchiralis", que no se conoce que tengan una asociación a insectos (Pettersson et al., 1999). Como se ha indicado por Wayne et al. (Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 463 - 464, 1987) y Vandamme et al. (Microbiol. Rev. 60: 407 - 438), Las secuencias de ADNr que son mayores que 97% de identidad no se pueden usar en general para asignar una cepa bacteriana a una especie particular en la ausencia de información adicional. En el caso de DAS1529, la actividad insecticida sobre lepidópteros y evidencia de una tiaminasa no son consistentes con P. popilliae y P. lentimorbus conocidas, y la asociación de insectos no es consistente con P. thiaminolyticus conocida (así como las otras especies del subgrupo).

Como otras cepas de Paenibacillus se conocen como agentes causantes de la bacteriosis lechosa en larvas de escarabajos japoneses (Popillia jalonica; Harrison et al., 2000), la DAS 1529 se ensayó para determinar la actividad sobre escarabajos June, un pariente de los escarabajos Japoneses. No se encontró ninguna actividad para los cultivos desarrollados en medio JB y PP3. El examen microscópico de los cultivos revelaron bastones igualmente coloreados sin esporulación visible o cristales parasporales presentes. Los inventores son capaces de mostrar que DAS 1529 pueden esporular en medio definido y condiciones de cultivo y dentro de la hemolinfa de Manducca sexta. Se sabe las cepas de Paenibacillus activas contra el escarabajo japonés están típicamente asociados con cuerpos de paraspora y parasporales (Harrison et al., 2000).

Se necesitará un trabajo adicional para determinar si DAS 1529 pertenece o se debe asignar a una nueva denominación de especie.

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Ejemplo 3

Metodología de bioensayos de insectos

Se usaron dos procedimientos de bioensayos de insectos para obtener los resultados presentados más adelante. Un formato de 96 pocillos y yb formato de 128 pocillos se usaron para la selección primaria para determinar la actividad contra insectos de lepidópteros insectos. Un formato de de incorporación de dieta de 24 pocillos se usó para determinar la actividad específica 24- (CL_{50}) de la toxina.

Para el formato de 96 pocillos, se dispensó dieta artificial en placas de microtitulación de 96 pocillos. Cada pocillo media aproximadamente 0,32 cm y contenía 150 \mul de dieta artificial. Se aplicaron muestras/toxinas a una tasa de 50 \mul/pocillo para caldo de fermentación, sedimentos celulares, y toxinas purificadas. El control positivo (Cry1Ac) a dosis apropiadas y controles negativos (agua, blanco de medio, las cepas de huésped bacterianos que no expresan la toxina diana) a una dosis superior se incluyeron. Se dejó que las muestras se secaran durante aproximadamente 1 - 3 horas de manera que las muestras perdieron su humedad pero la dieta mantenía su humedad. Algunos huevos de insecto se dispersaron sobre la superficie de la dieta tratada con muestra, o una larva de insecto individual se sembró por pocillo. La placa infestada se sellaron o bien con recubrimiento mylar sobre hierro o se cubrieron con tapas adherentes con perforaciones. Se realizaron minúsculos agujeros para aire en el recubrimiento mylar para asegurar el suministro de aire a los insectos. Las placas se incubaron a 28ºC durante 5 días y se puntuaron para determinar la mortalidad y atrofia. Esto se realizó en una base por pocillo, ignorando el número de larvas por pocillo, a medida que se depositan con frecuencia múltiples huevos por pocillo. Después se asignaron puntuaciones de actividad a cada tratamiento: 0 = sin actividad, larvas sanas como los pocillos de control de agua, 1= se atrofiaron las larvas, o se atrofiaron con alguna mortalidad, 2 = todas las larvas estaban muertas.

Las actividades específicas (CL_{50}) de muestras/toxinas se determinaron mediante el bioensayo de incorporación de dieta en bandejas Nutrend de (Nu-Trend^{TM} Container Corp., Jacksonville, FL). La dieta artificial de insectos se realizó justo antes de usar y mantener en estado líquido a 55ºC en un baño de agua. Se realizaron diluciones en serie (\geq 5) mezclando 27 ml de dieta artificial con no más de 3 ml de muestras/toxinas. Un total de 30 ml de muestra y mezcla de dieta se agitó en un aparato vortex durante 30 segundos y después se distribuyeron igualmente en cada bandeja, llenando \sim 50% del volumen del pocillo. Se dejó que las bandejas se enfriaran durante al menos 30 minutos antes de la infestación. Se infectó un ensayo de insecto en cada pocillo, y se selló mylar transparente sobre la parte superior de cada bandeja para que contenga los insectos. Se perforaron pequeños agujeros con un alfiler de insectos en el mylar sobre cada pocillo para la circulación de aire. En general los ensayos se mantuvieron a 25ºC durante 6 días pero algunos se pueden haber mantenido a 30ºC durante 4 días si se necesitan resultados más rápidos. Un conjunto de controles positivos y negativos se desarrollaron para cada actividad. Los ensayos se clasificaron en base de mortalidad pero los datos sobre la atrofia no se registraron. Los procedimientos estadísticos se usaron para estimar los valores de CL_{50} para las muestras ensayadas y se expresaron como ng o \mug/ml de dieta.

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Ejemplo 4

Purificación y caracterización bioquímica de toxinas insecticidas de caldo de fermentación - tiaminasa de DAS1529

Los caldos de fermentación de DAS 1529 contenían actividad insecticida contra especies de lepidópteros, tales como gusano de las yemas del tabaco, gusano de la mazorca de maíz, y gusano carnudo del tabaco. La naturaleza de la actividad insecticida se investigó por la purificación bioquímica y caracterización. El bioensayo del gusano de la mazorca de maíz, como se describe en el Ejemplo 3, se usó durante el procedimiento de purificación para seguir las actividades insecticidas.

Los caldos de fermentación de DAS 1529 se produjeron usando 2% de PP3 suplementado con 1,25% de NaCl y se procesó como se describe en el Ejemplo 1. Se concentraron cuatro litros de caldo usando un cartucho de ultrafiltración espiral Amicon (Beverly, MA) Tipo S 1 Y 10 (corte de peso molecular de 10 kDa) unido a un dispositivo de filtración Amicon M-12 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El retenido se diafiltró con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0 (Tampón A) y se aplicó a 5 ml/min a una columna de intercambio aniónico Q cefarosa XL (1,6 x 10 cm). La columna se lavó con 5 volúmenes de lecho de tampón A para retirarlas proteínas no unidas. La actividad de la toxina se eluyó mediante 1,0 M NaCl en tampón A.

La fracción que contenía la actividad insecticida se cargó en alícuotas de 20 ml en una columna de filtración de gel Macro-Prep SE1000/40 (2,6 x 100 cm) que se equilibró con tampón A. La proteína se eluyó en tampón A a un caudal de 3 ml/min. Las fracciones con actividad contra el gusano de la mazorca de maíz se aplicaron a una columna MonoQ (1,0 x 10 cm) equilibrada con 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 (Tampón B) a un caudal de 1 ml/min. Las proteínas unidas a la columna se fluyeron con un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl en Tampón B a 2 ml/min durante 60 min. Se recogieron fracciones de dos mililitros y se determinó la actividad como se describe en el Ejemplo 1.

Se añadió sólido (NH_{4})_{2}SO_{4} a las fracciones de proteína activas anteriores hasta una concentración final de 1.7 M. Después las proteínas se aplicaron a una columna de fenil-Superosa (1,0 x 10 cm) equilibrada con 1,7 M (NH_{4})_{2}SO_{4} en 50 mM de tampón fosfato de potasio, pH 7 (Tampón C) a 1 ml/min. Después de lavar la columna con 10 mililitros de Tampón C, las proteínas unidas a la columna se fluyeron con un gradiente lineal de Tampón C a 5 mM fosfato de potasio, pH 7,0 a 1 ml/min durante 120 min. La mayoría de las fracciones activas determinadas mediante bioensayo se reunieron y se dializaron durante toda la noche contra el Tampón A.

La muestra dializada se aplicó a una columna de Mono Q (0,5 x 5 cm) que se equilibró con Tampón B a 1 ml/min. Las proteínas unidas a las columnas se eluyeron a 1 ml/min mediante un gradiente lineal de 0 a 1 M NaCl en Tampón B. Las fracciones activas se reunieron y se ajustaron hasta una concentración final de (NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,7 M. Las proteínas después se aplicaron a una columna de fenil-Superosa (0,5.0 x 5 cm) equilibrada con Tampón C a 1 ml/min. Las proteínas unidas a la columna se fluyeron con un gradiente lineal de Tampón C a 5 mM de fosfato de potasio, pH 7,0 a 0,5 ml/min durante 40 min. Las fracciones purificadas se reunieron y se dializaron durante toda una noche contra Tampón A.

El peso molecular de la toxina purificada final se examinó mediante una columna de filtración de gel Superdex S-200. La toxina mostró un peso molecular nativo de aproximadamente 40 kDa. SDS-PAGE de las toxinas purificadas mostraron una banda predominante de aproximadamente 40 kDa. Esto sugería que la toxina de DAS 1529 nativa (en esta fracción) era un monómero de aproximadamente 40 kDa.

La toxina purificada se sometió a electroforesis en 4 - 20% d SDS- PAGE y se realizó una inmunotransferencia a una membrana de PVDF. La transferencia se sometió a un análisis de aminoácido y secuenciación de aminoácidos N-terminal (SEQ ID NO. 17). La investigación de la base de datos de proteínas (NCBI-NR) que usa la secuencia como una duda reveló que es un 95% idéntica a la aproximadamente tiaminasa I de 42 kDa de Bacillus thiaminolyticus (Campobasso et al., 1998; GENBANK Nº de acceso 2THIA; SEQ ID NO:18). Las alineaciones parciales de la secuencia se ilustran en Figura 3, que tendrían la misma alineación con GENBANK Nº de acceso AAC44156 (precursor de la tiaminasa I; U17168 es la entrada correspondiente en GENBANK para el ADN, que se podrían expresar para conseguir una tiaminasa producida y secretada a partir de la célula bacteriana). La tiaminasa purificada de DAS 1529 se ensayó sobre gusano de mazorca de maíz (CEW), los resultados se muestran en la Figura 4. Esta toxina no mataba el gusano de mazorca de maíz (hasta una concentración de 8 mg/cm^{2}) pero mostró un 95% de inhibición de crecimiento a una concentración tan baja como 5 ng/cm^{2}. También se encontró que la tiaminasa purificada no se desactivó mediante la proteinasa K.

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Ejemplo 5

Clonación de Genes que codifican los factores insecticidas producidos por DAS 1529

En un intento de clonar la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el(los) factor(es) producido(s) DAS 1529, se construyó una genoteca de cósmidos usando el ADN aislado de DAS 1529 y se seleccionó para la actividad insecticida. Se identificaron seis clones de cósmidos recombinantes que producían actividad insecticida contra los neonatos del gusano de mazorca de maíz y gusano de la yema del tabaco. Tres de los clones de cósmidos produjeron factores lábiles al calor (cuando se calentó a 85ºC durante 20 minutos) que daban como resultado mortalidad de insectos. Los otros tres clones de cósmidos produjeron factores lábiles al calor que eran inibidores del crecimiento para los insectos. Uno de los cósmidos que producían mortalidad de insectos, denominados como cósmido SB12, se eligieron para análisis de secuencia de nucleótidos.

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A. Construcción de una genoteca de cósmido de DAS1529

Se aisló ADN total a partir de DAS1529 con un kit de purificación de ADN (Qiagen Inc., Valencia, CA). Vector y preparación, ligamiento, y empaquetado del ADN de inserción siguiendo las instrucciones del proveedor (Stratagene, La Jolla, CA). Las inserciones de ADN de DAS 1529 como los fragmentos de ADN Sau3A I se clonaron en el sitio BamHI del vector cósmido SuperCos 1. El producto ligado se se empaquetó con el extracto de empaquetamiento de oro Gigapack® III y se transfectó en células huésped XL1-Blue MRF'. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB- kanamicina. La genoteca de cósmido constaba de 960 colonias cogidas al azar que se desarrollaron en diez placas de microtitulación de 96 pocillos en 200 \mul de LB- kanamicina (50 \mug/ml) para la selección de la actividad de insecto y almacenamiento a largo plazo.

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B. Selección de la genoteca de cósmido de DAS1529 para evaluar la actividad insecticida

Para la selección primaria de clones activos contra insectos lepidópteros (CEW y TBW), se desarrollaron un total de 960 clones de cósmido como colonias individuales en cultivos de 2 ml en placas de 96 pocillos. Los cultivos se hicieron girar y se volvieron a suspender en medio de cultivo original a aproximadamente una concentración de 10 X y se sometieron a bioensayo. El vector SuperCos 1 (SB1) se incluyó como un control negativo. Se aislaron dieciséis clones positivos (SB2 a SB 17) a partir de la primera ronda de selección. La segunda y tercera ronda de selección se llevaron a cabo para seleccionar la actividad contra TBW y CEW; un clon del cósmido (SB 12) que mostraba consistentemente la mayor actividad se eligió para análisis adicional. La Tabla 5 resume el espectro de actividad (como se ensayó) del cósmido SB12. (BAW la rosquilla verde de la remolacha, Spodoptera exigua; ECB es el taladrador europeo del maíz, Ostrinia nubilalis; SCRWis gusano de la raíz del maíz del Sur, Diabrotica undecimpucata howardi.) El caldo del caldo de cultivo de SB 12 de E. coli no contenía ninguna actividad contra CEW; por lo tanto, los factores activos en SB12 eran diferentes de los factores activos en el caldo de cultivo de la cepa DAS
1529.

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C. Secuenciación de la inserción del cósmido SB12 e identificación de ORF de tipo tc y cry

La secuenciación de nucleótidos del cósmido SB12 mostró que contenía una inserción genómica de aproximadamente 34 kb. El análisis de esta secuencia reveló sorprendentemente la presencia de al menos 10 marcos abiertos de lectura supuestos (ORF) (véase la Figura 2). Seis de los ORF identificados se encontró sorprendentemente que tenían algún grado de identidad de secuencias de aminoácidos (38 - 48%) a tcaA, tcaB, tcaC, y tccC identificados anteriormente a partir de Photorhabdus luminescens (Waterfield et al., 2001), Xenorhabdus nematophilus (Morgan et al., 2001), Serratia entomophila (Hurst y Glare, 2002; Hurst et al., 2000), y Yersinia pestis (Cronin et al., 2001). Los genes de la proteína de TC de Photorhabdus, Xenorhabdus, y Serratia se ha mostrado que codifican los factores insecticidas. También era muy interesante que un DAS 1529 ORF tenía \sim 40% una identidad de secuencia d aminoácidos de Cry1Ac de Bacillus thuringiensis, otro gen identificado previamente como factor insecticida (Schnepf et al., 1998; de Maagd et al., 2001). Aquellos hallazgos tenían implicación significativa en el entendimiento de la distribución de genes de toxinas en el reino bacteriano y en el desarrollo de estrategias adicionales para la extracción y modificación por ingeniería genética de genes de toxinas.

Se determinó la secuencia de nucleótidos del cósmido SB 12. Se analizó además el ADN ensamblado de 41.456 pares de bases de longitud. Se localizaron tres huecos dos en el vector del cósmido y uno en la inserción. El análisis de la secuencia de nucleótidos del contiguo más largo aproximadamente 34,000 pares de bases reveló la presencia de al menos 10 marcos abiertos de lectura (ORF) supuestos, identificados como codones de partida potenciales mediante marcos abiertos de lectura extendidos. Este procedimiento se sabe que identifica de manera equivocada los sitios de partida de traducción en un 19% (Bacillus subtilis) y 22% (Bacillus halodurans) en los genomas relacionados con Paenibacillus (Besemer, J., Lomsadze, A., Borodovsky, M., Nucleic Acids Res. 29: 2607 - 2618,2001). Por lo tanto, la calidad y posición de las bases complementarias al extremo 5' del ARNa de 16S de B. subtilis (revisión en Rocha, E.P.C., Danchin, A., Viari, A., Nucleic Acids Res. 27: 3567 - 3576, 1999), la secuenciación de los aminoácidos N-terminal, y alineaciones relativas a los genes se consideraron en la identificación de los sitios de inicio de traducción nativos. Los ORF supuestos y anotaciones se resumen en la Tabla 6 y se describen en más detalle a
continuación.

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ORF1 comienza con el primer nucleótido del sitio de clonación para el ADN de DAS1529 en el cómido SB12, y por lo tanto no está su sitio de inicio de la traducción nativo. ORF1 comparte homología de la secuencia de ADN significativa con ORF3, y el análisis de comparación de secuencias sugiere que los 18 primeros pares de bases de ORF1 están truncados, y que los primeros seis codones codifican los aminoácidos Met-Val-Ser-Thr-Thr, como se encuentra en OFR3. El comienzo de la traducción de ORF1 es presumiblemente similar al de ORF3, desde aproximadamente las bases 9505 a 9523 de la SEQ ID NO:1. Dos secuencias predichas de aminoácidos se presentan para ORF2, ORF4, y ORF6 (SEQ ID NOs: 19 y 13), basándose en los sitios de inicio de la traducción alternativos, como se indica anteriormente. Para ORF2, la SEQ ID NO:5 se ha descrito anteriormente. El sitio de inicio alternativo, y preferido está en el resto 3295 de ORF1. De este modo, la proteína resultante desde este sitio de inicio comenzaría en el resto 9 de aminoácidos de la SEQ ID NO:5 (traducción desde RBS mejor). Del mismo modo, para ORF4, SEQ ID NO:9 se ha descrito anteriormente. El sitio de inicio alternativo, y preferido está en el resto 12.852 de la SEQ ID NO: 1. La proteína resultante tampoco tendría los primeros ocho aminoácidos de la SEQ ID NO:9 (Comenzando de este modo con el resto 9 de aminoácidos de la SEQ ID NO:8 - traducción desde RBS mejor).

Ejemplo 6

Análisis de secuencias de las TC "duplicadas"

Se determinó el grado de identidad de secuencia para los dos fragmentos de ORF2 (tcaB1) comparado con ORF4 (tcaB2), como era eso para ORF1 (tcaA1) comparado con ORF3 (tcaA2). Se observó una relación de secuencia similar para ambos pares de ORF.

ORF2 se construyó mediante combinación de dos fragmentos, debido a un elemento de tipo secuencia de inserción que se insertó en la naturaleza (aparentemente espontáneamente), y rompió este ORF. Véase la Figura 2. la localización de esta inserción se puede determinar analizando/comparando las secuencias enteras de ADNde SB 12 (SEQ ID NO:1) con la secuencia de la SEQ ID NO:4, la última de las cuales no refleja (no codifica) la inserción. Como se indica con paréntesis en la Figura 7, la secuencia del producto de traducción en 5' antes del resto 490 de la SEQ ID NO:4 y el producto de traducción de 3' del resto 491 en la alineación también con ORF4 (SEQ ID NO:8). La secuencia de ADN en el punto de inserción aparente muestra una repetición directa de 9 pares de bases encontrada de manera común que flanquean los elementos de inserción (CACCGAGCA, bases 4734 - 4742 y 6071 - 6080 de la SEQ ID NO:1).

Ejemplo 7

Análisis de secuencia adicional

En resumen, de acuerdo con los análisis de vector NTI clustalW, GCG, y/o Blastp, seis de los ORF identificados (ORF1 a ORF6) tenía 38 - 48% de identidad de secuencia de aminoácidos con tcaA, tcaB, tcaC, y tccC (previamente identificados los genes Photorhabdus tc). El ORF7 codificaba una proteína que compartía \sim 40% de identidad de secuencia de aminoácidos con Cry1Ac de Bacillus thuringiensis, otro gen identificado previamente como un factor insecticida. Se generó un filogramamediante la incorporación de la secuencia de ORF7 (Cry1529) con un gran número de proteínas Cry (Figura 8). Este árbol filogenético sugiere que Cry1529 está relacionado de manera distante con otras secuencias de P. popilliae Cry tal como la de Cry18s (Zhang et al., 1997, Zhang et al., 1998) que están más cerca de Cry2s; Cry1529 disminuye (remotamente pero no más cercanamente) en un grupo de proteínas Cry que contienen de manera común toxinas encontradas en lepidópteros (Cry1, Cry9), coleópteros (Cry3, Cry8, Cry7), y dípteros (Cry4), que es un grupo distinto comparado con los que incluyen toxinas de nematodos Cry5, -12, -13, -14, y -21 y Cry2, -18.

Fue un descubrimiento sorprendente y novedosos encontrar los genes de proteínas Cry y TC (en la inserción genómica de SB12) en Paenibacillus. La identificación de nuevos genes de proteínas Cry y TC tiene relevancia con el entendimiento de la técnica de Photorhabdus y Xenorhabdus, y Bacillus thuringiensis, y amplia el ámbito del género de bacterias en el que los genes de proteínas Cry y TC se han encontrado. El tamaño de Cry 1529 de longitud completa identificada en el presente documento corresponde a la toxina del núcleo de Cry1s; Cry1529 representa una nueva clase de proteínas de Cry que también tienen implicaciones para aislar genes cry de Bacillus thuringiensis y Paenibacillus.

Para verificar que estas observaciones sorprendentes no eran el resultado de la contaminación de cepas (es decir, para confirmar que la inserción de 34 kb que lleva TC y Cry ORF era de hecho del ADN de DAS1529), se llevó a cabo análisis molecular mediante hibridación de transferencia de Southern y PCR. Para la validación de PCR, cebadores específicos de ORF6 (tipo tccC) y ORF7 (Cry1529) (Ejemplo 8, Tabla 8) se usaron para amplificar ORF6 y ORF7 desde el cósmido SB 12 y ADN total de DAS 1529. Para ORF6, se realizaron amplificaciones de PCR en un ciclador térmico PE9600 (Perkin Elmer) con los siguientes parámetros: la desnaturalización inicial a 95ºC durante 2 minutos; 30 ciclos cada uno con desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación a 60ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos, y una extensión final durante 10 minutos a 72ºC. Para ORF7, los parámetros de amplificación eran los mismos que ORF6, excepto que la temperatura de hibridación era 55ºC durante 30 segundos y extensión a 72ºC durante 4 minutos. Los productos de PCR específicos con una sola banda de tamaños esperados se amplificaron para tanto ORF6 como ORF7.

La hibridación inicial de transferencia southern se basó en una secuencia parcial de AND de SB 12 ADN y se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo estándar (Sambrock et al., 1990). Las muestras de ADN incluían ADN total de DAS1529 de dos preparaciones independientes, ADN del cósmido SB 12, y una muestra de ADN de control negativo de NC1 (Photorhabdus). Ambas muestras de ADN de DAS1529 eran ADNr de 16S confirmó que era de origen Paenibacillus sp., y se usó uno originalmente para la construcción de la genoteca de cósmido; la otra era una nueva preparación. Se digirieron muestras de ADN con EcoRI, se transfirieron a membrana, y se hibridaron con 180 pares de bases marcadas del producto de PCR amplificado fuera de SB 12 Roche DIG System (Roche). Los cebadores de PCR son 5' CCT CAC TAA AGG GAT CAC ACG G 3' que se hibridaron parcialmente con el vector y ORF1 truncado (comparado con ORF3 de longitud completa), y 5' GGC TAA TTG ATG AAT CTC CTT CGC 3' que se hibrida a ORF1 truncado (tipo tcaA) y ORF3 de longitud completa (tipo tcaA). Un total de tres fragmentos de ADN (0,85, 2,7, y 8,0 kb) que se hibrida a la sonda PCR se detectaron, 0,85 y 8,0 en el SB12 y 2,7 y 8,0 en los ADN de DAS 1529. No se detectó ninguna señal en el control negativo. El de 0,85 kb (del fragmento interno de EcoRI ORF1 al primer sitio de EcoRI en el vector) y 8,0 kb (del primer sitio 5'EcoRI en ORF3 al tercer sitio EcoRI en ORF1) coincidía con los tamaños calculados de los fragmentos de ADN diana de SB12. La detección del fragmento del fragmento de 2,7 kb sugiere la presencia de un sitio EcoRI de 2,7 kb inmediatamente cadena arriba del sitio EcoRI dentro de ORF1 en el ADN de DAS 1529. Th. Los resultados muestran que la inserción de SB12 era del ADN total de DAS 1529 y, basándose en el análisis de hibridación y de restricción, todas las copias de los ORF eran responsables de ello.

Ejemplo 8

Caracterización de las actividades insecticidas de las proteínas codificadas por los ORF del cósmido

La mutagénesis de inserción de trasposones al azar (para interrumpir el ORF individual o un operón entero) y la expresión heteróloga (que expresa los ORF individuales u operones completos) se abordaron para aislar el(los) ORF(s)
individual(es) u operones que confieren las actividades insecticidas en el cósmido SB 12.

A. Mutagénesis de transposones al azar del cósmido SB12

Se generó una mutagénesis de Tn a partir del cósmido SB12 de DAS1529 A Tn usando el GPS-1 Genome Priming System (New England BioLabs, Beverly, MA) siguiendo las instrucciones del kit. En resumen, 2 \mul de tampón 10 X GPS, 1 \mul de donante de ADN de pGPS2.1 (0.02 \mug), 1 \mul de cósmido SB12 (0,1 \mug) y 18 \mul de H_{2}O estéril se añadieron a un tubo de 0,5 ml. Se añadió un ml de TnsABC Transposasa; la mezcla se agitó en un aparato Vortex y se hizo girar brevemente para recoger los materiales en el fondo del tubo. Esta mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a 37ºC. Se añadió un \mul de solución de partida y se mezcló pipeteando arriba y abajo varias veces. La reacción se incubó a 37ºC durante 1 hora y después se inactivó a 75ºC durante 10 minutos. Un \mul de la mezcla de reacción se diluyó 10 veces con H_{2}O estéril; 1 \mul de la reacción diluida se sometió a electroforesis en 100 \mul de Electro MAX DH5\alpha-E E. coli (Gibco BRL, Rockville, MD). Después de 1 hora de crecimiento en medio de SOC a 37ºC, 10 \mul o 100 \mul se sembraron en placas de agar LB que contenían 20 \mug/ml de Kanamicina y 15 \mug/ml de cloramfenicol, seguido de la incubación durante toda una noche a 37ºC.

Se sembraron por estría colonias individuales de la mutagénesis Tn de SB12 en placas de agar LB recientes que contenían 20 \mug/ml de Kanamicina y 15 \mug/ml de cloramfenicol. A partir de las estrías, cultivos de 50 ml de LB que contenía 20 \mug/ml de Kanamicina y 15 \mug/ml cloramfenicol se inocularon y se desarrollaron a 28ºC, 200 rpm durante 48 horas. Después las células se recogieron mediante centrifugación a 3500 rpm durante 20 minutos. Se retiró el sobrenadante y se volvió a suspender el sedimento en 2,5 ml del sobrenadante del cultivo para una concentración de 20 X. El sedimento de células concentrado se ensayó después para determinar la actividad contra el gusano de la mazorca de maíz. Se aplicaron en superficie cuarenta \mul del concentrado 20 X a dieta artificial usando 8 pocillos por muestra en placas de 128 pocillos. Se añadieron larvas del gusano de mazorca de maíz recientemente incubados y se dejó que se alimentaran durante 5 días, momento en el que se registraron la mortalidad y pesos.

Se ensayaron un total de 184 clones para determinar la pérdida de actividad contra el gusano de la mazorca de maíz. Los resultados se resumen en la Tabla 7. Los bioensayos de los clones de Tn revelaron que una inserción de Tn en el gen Cry1529 que da como resultado la pérdida completa de actividad. El bioensayo inicial mostró que las actividades de los clones que llevaban las inserciones de Tn en los genes tc eran variables. Los análisis posteriores de los clones en los que los cultivos se normalizaron todos hasta la misma densidad de células antes del bioensayo no mostró ninguna pérdida de actividad cuando se compara con SB12. Los resultados del análisis de Tn sugieren ORF7 (Cry1529) es el componente activo de manera insecticida clave del cósmido SB 12.

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B. Expresión heteróloga de ORF/operón de SB12

Cry1529 (ORF7) y cinco ORF de tc (véase la Tabla 8 más adelante) se expresaron en el sistema pET101D®. Véase la Figura 5. Este vector de expresión tiene todos los atributos de del sistema de expresión pET regulado por T7 (Dubendorff y Studier, 1991; Studier y Moffatt, 1986) y permite la clonación direccional de un producto de PCR de extremo ciego en un vector para la expresión regulada de alto nivel, y purificación de proteína simplificada en E. coli. La amplificación óptima de PCR empleó la ADN polimerasa de lata fidelidad PfuTurbo^{TM} que es altamente termoestable y posee una actividad a prueba de de lectura de la exonucleasa en 3' a 5' para corregir los errores de incorporación equivocada de nucleótidos (Stratagene, La Jolla, CA). Cuando se usa la ThermalAce^{TM} polimerasa (Invitrogen), se introdujeron mutaciones puntuales en los ORF de tc, que corrigieron mediante el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick-Change^{TM} XL basada en PfuTurbo^{TM} (Stratagene). La cepa de E. coli BL21 Star^{TM} (DE3), se usó como un huésped para la expresión ya que contiene la mutación rne131 (López et al., 1999) que en general potencia la estabilidad de ARNm y la producción de las proteínas recombinantes.

Los ORF individuales se amplificaron mediante la PCR fuera del cósmido SB12 con cebadores específicos de ORF (Tabla 8) en condiciones definidas. Como un requerimiento de clonación direccional, los cebadores directos de la PCR se diseñaron para que contuviera la secuencia, CACC, en el extremo 5' para asegurar el par de bases del producto de la PCR con la secuencia saliente, GTGG, en el vector pET101.D. Los cebadores inversos cuando se aparean con cebadores directos amplificarán cada ORF, respectivamente. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 50 \mul de mezcla de reacción que contiene 50 ng del ADN del cósmido SB12, 1 X de tampón de reacción Pfu (Stratagene), 0,2 mM cada uno de dNPT, 0,25 mM de cada cebador, y 2 U de ADN polimerasa de PfuTurbo (Stratagene).Las amplificaciones mediante la PCR se realizaron sobre un ciclador térmico PE9600 (Perkin Elmer) con los siguientes parámetros: desnaturalización inicial a 95ºC durante 2 minutos, 35 ciclos cada uno con desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos por kb de ORF, y una extensión final durante 10 minutos a 72ºC.

TABLA 8 Resumen de los cebadores de la PCR para la clonación de ORF1-7

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Los productos de PCR para cada ORF se clonaron en pET101.D siguiendo las instrucciones del proveedor (Invitrogen). El ORF clonado se purificó como ADN de plásmido de pET101.D y se verificó la secuencia. Ya que el análisis de Tn indicó que el ORF7 es el componente clave de SB 12 para el control de las plagas ensayadas, el análisis bioquímico y y el bioensayo de insectos se centró en las proteínas de ORF7 expresadas de manera heteróloga. Para los clones de expresión de ORF7, el análisis de secuencia de ADN mostró un 100% de concordancia con la secuencia de ADN de SB12 original. La expresión de ORF7 se indujo mediante 0,5 mM IPTG durante 4 horas de acuerdo con las instrucciones del kit (Invitrogen).

C. Bioensayo para determinar las actividades insecticidas de ORF7 y operón tc

Las muestras de bioensayo se prepararon células de E. coli enteras, lisados de células, y toxinas purificadas. El espectro y actividad específica de ORF7 (Cry1529) se resume en la Tabla 10. Cry1529 es más activo contra el gusano cornudo del tabaco (Manduca sexta) y altamente activo (CL_{50} de 10 \mug/ml de dieta) contra el gusano de la yema del tabaco (Heliothis virescens); se observó un 100% de mortalidad para ambos insectos. A dosis mayores, Cry1529 confería alguna mortalidad (20 a 60%) e inhibición de crecimiento substancial sobre el gusano de la mazorca de maíz (Heliothis zea), rosquilla verde de la remolacha (Spodoptera exigua), y gusano cortador negro (Agrotis ipsilon). Para el taladrador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), Cry1529 tenía alguna inhibición de crecimiento a dosis mayores. Para algunas otras especies de insectos (oruga negra otoñal, grillo de la cápsula del algodonero, gusano de la raíz de sur, mosquito), no detectó ninguna actividad. Los valores de CL_{50}de Cry1529 para las colonias de la polilla negra diamante resistentes (DBMr) y polilla negra diamante sensibles (DBM) a Cry1A (Cry1Ac) y son > 50 \mug/ml y < 1,0 \mug/ml, respectivamente, sugiriendo una resistencia cruzada potencial. Cry1529 no confería actividad detectable sobre gorgojos de hierba, un pariente de los escarabajos japoneses.

Para ensayar la actividad de otros factores no-Cry1529 en DAS 1529, un clon de cósmido SB12 inactivado de Cry1529 tn (tn67) se ensayó contra TBW, CEW, SCRW, ECB, BW, BAW, THW, y gorgojos de la hierba; no se encontró ninguna actividad contra estas plagas. Para dirigir la distribución de la no expresión o baja expresión de tc ORF en la formación de SB 12, se ensayaron independientemente tc ORF expresados de manera y en combinación con otros TC de DAS 1529; no se encontró ninguna actividad contra TBW, CEW, y gorgojos de la hierba. Además, se expresaron cuatro ORF en forma de un solo operón hasta niveles muy altos en células de E. coli. Cuando se ensayó in vitro, las células enteras no contenían ninguna actividad detectable sobre TBW, CEW, y gorgojos de la hierba. Aunque la carencia de actividad de gorgojo es algo interesante, estos resultados no son sorprendente porque Paenibacillus infecta típicamente un intervalo estrecho de huésped de gorgojos, podría seguir que el espectro de actividad de las toxinas insecticidas pudieran ser relativamente estrechas. De este modo, las selecciones (usando procedimientos conocidos) que implican un intervalo más amplio de plagas, y tiempo adicional, se requeriría para identificar las plagas susceptibles. Los resultados presentados en el presente documento no deben conducir a nadie fuera de reconocer que las proteínas sujeto TC tienen utilidad como lo hacen otras proteínas TC de Xenorhabdus, Photorhabdus, y similares.

Las proteínas solubles se extrajeron con fosfato de sodio 25 mM pH 8,0, cloruro sódico 100 mM y se analizaron sobre gel de gradiente NuPAGE al 4 - 12% con 1 X de tampón MES (Invitrogen). La proteína de ORF7 se purificó usando procedimientos convencionales y la secuenciación N-terminal reveló la secuencia esperada: MNSNEPNLSDV. Se realizó un bioensayo con células enteras de E. coli, con densidad de células normalizada, que expresan proteínas diana. Véase Figura 6. La proteína purificada a gran escala de ORF7 se usó para obtener los valores de CL_{50} para ORF7 mediante un bioensayo in vitro. El análisis de estabilidad térmica del ORF7 purificado indicaba que un tratamiento de a 5 minutos a 75ºC es suficiente para abolir su actividad contra TBW. Véase Tabla 9.

TABLA 9 Estabilidad térmica de purificada Cry1529 (ORF7)

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Para los genes tc, se usaron clones sin error de ORF3 y ORF6 como clones intermedios para generar clon de operón tc que expresa ORF3 (tcaA), ORF4 (tcaB), ORF5 (tcaC), y ORF6 (tccC). Para construir el operón tc en pET101.D, el fragmento NsiI/SacI que contiene tcaA parcial, tcaB entero y tcaC, y se escindió tccC parcial fuera del cósmido SB 12 para reemplazar la inserción NsiI/SacI en pET101.D-tcaA; a esto siguió la inserción de un fragmento de 208 pares de bases SacI de pET101.D-tccC. Véase Figura 5. Los cuatro ORF se expresaron a altos niveles mediante la introducción estándar de IPTG. Para el ORF6 (tccC) expresado en el operón tc, el tamaño de la proteína expresada era significativamente más pequeño que el ORF6 predicho por el vector NTI del 5'-la mayoría ATG (SEQ ID NO:18) y que se expresa de manera independiente. Por lo tanto, el ORF6 anotado (SEQ ID NO:13) basándose en la presencia de un ribosoma que se une al sitio de consenso es probablemente la proteína nativa producida en SB 12 y
DAS1529.

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D. Actividad de espectros de Toxinas

El espectro de actividad de toxina de Cry1529 (ORF7) se resume en la Tabla 10.

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Solamente un intervalo limitado de de plagas se usó en ensayos en un intento inicial para determinar el espectro de actividad de los ORF de TCs/tc sujeto. Se obtuvieron los siguientes datos, que usan el operón ORF3-OR6:

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De nuevo, aunque esta ronda inicial de selección no reveló la actividad de estas plagas, los expertos en la técnica no dudarán que las proteínas sujeto son útiles, como son las correspondientes proteínas de Photorhabdus/Xenorhabdus. además, véase el Ejemplo 10, más adelante.

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Ejemplo 9

Uso de cebadores de PCR para identificar homólogos de Cry1529 de otros géneros, especies, y cepas bacterianas

Para la selección adicional homólogos de cry1529 de ORF7 de otras cepas (Paenibacillus u otros), cebadores de la PCR específicos de genes y degenerados se diseñaron para amplificar las secuencias de ADN de ORF7 diana de 1 kb. Los cebadores de la PCR se dedujeron de motivos de proteínas bien conservados (QAANLHL, dominio I, núcleo de bloque 1 para el cebador director; GPGFTGGD, dominio III, bloque 3 para el cebador inverso) altamente conservado en proteínas Cry. Los cebadores se enumeran en la Tabla 12 y se validaron sobre DAS 1529. Las amplificaciones de la PCR se realizaron sobre un ciclador térmico PE9600 (Perkin Elmer) con los siguientes parámetros: desnaturalización inicial a 95ºC durante 2 minutos; 35 ciclos cada uno con desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación a 47ºC durante 45 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos, y una extensión final durante 10 minutos a 72ºC. Se usaron los pares de cebadores para seleccionar una colección de cultivo bacteriano (no B. thuringiensis) mediante PCR. Cinco de 192 cepas (tres Paenibacillus, un Bacillus, y uno no identificado) produjeron productos de PCR de tamaños esperados. Estas cepas también se encontró que tenía actividad CEW de acuerdo con una selección de bioensayo primario. Sin embargo, el análisis de secuencia de los amplicones obtenidos a partir de una de estas cepas. Sin embargo, el análisis de secuencia de los amplicones obtenido de una de estas cepas usando diferentes cebadores mostró que los amplicones no se derivaban de un gen cry.

A pesar de esto, y como estas selecciones no eran exhaustivas, la invención presente incluye procedimientos de selección de Paenibacillus spp., Bacillus spp. (incluyendo Bacillus thuringiensis y sphaericus), y similares para los genes y proteínas de tipo Cry1529. Dada la naturaleza significativa del descubrimiento de las proteínas Cry tóxicas para lepidópteros -en Paenibacillus, la invención presente también incluye procedimientos de selección de Paenibacillus spp., en general, para las proteínas y genes de Cry tóxicos para lepidópteros. Se conocen en la técnica diversos procedimientos de selección, incluyendo técnicas de la PCR (como se ha ejemplificado anteriormente), sondas y ensayos de alimentación (donde las células enteras se alimentan a las plagas diana). Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente, procedimientos de selección de la invención presente incluyen la preparación y uso de genotecas de clones (tales como genotecas de cósmido) en estas selecciones.

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Ejemplo 10

Complementación de la toxina de la proteína TC de Xenorhabdus XptA2 TC con proteínas de DAS1529 TC

Este ejemplo proporciona evidencia experimental de la capacidad de las proteínas de DAS 1529TC, expresada aquí con un único operón (los ORF 3 - 6; tcaA, tcaB, TcaC y tccC; véase la sección C del Ejemplo 8), para complementar la toxina XptA2 de Xenorhabdus nematophilus Xwi (véase la SEQ ID NO:49). Se llevaron a cabo dos experimentos independientes para expresar el operón de TC de DAS 1529 y XptA2 independientemente, o para coexpresar el gen XptA2 y el operón de TC en las mismas células de E. coli. Se ensayaron células enteras que expresan diferentes toxinas/combinaciones de toxinas para determinar la actividad contra los insectos lepidópteros: gusano de la mazorca de maíz (Heliothis zea; CEW) y gusano de la yema del tabaco (Heliothis virescens; TBW). Los datos de ambos experimentos indican que las proteínas TC de DAS 1529 son capaces de potenciar la actividad de XptA2 de la proteína de TC de Xenorhabdus sobre ambas especies de insecto ensayadas.

A. Co-expresión de las TC de DAS1529 y Xenorhabdus XptA2

Expresión del operón de TC se reguló mediante el promotor de T7/operador de lac en el vector de expresión pET101.D que lleva un origen de replicación de ColE1 y un marcador de selección de resistencia a ampicilina (Invitrogen). La descripción exhaustiva de la clonación y expresión del operón tc se puede encontrar en la sección C del Ejemplo 8. El gen XptA2 se clonó en el vector de expresión pCot-3, que lleva un marcador de selección de resistencia a cloramfenicol y un origen de replicación compatible con el ColE1. El sistema de expresión del vector pCot-3 también está regulado por el promotor de T7/operador de lac. Por lo tanto, los orígenes de replicación compatibles y los marcadores de selección diferentes forman la base para la co-expresión del operón de TC y XptA2 en las mismas células de E. coli. Los ADN de plásmido que llevan el operón de TC y XptA2 se transformaron en E. coli, BL21 Star^{TM} (DE3) o bien independientemente o en combinación. Los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar LB que contienen 50 mg/ml de carbenicilina para el operón pET101.D-TC, 50 mg/ml de cloramfenicol para pCot-3-XptA2, y ambos antibióticos para el operón pET101.D-TC/pCot-3-XptA2. para suprimir la expresión de la toxina basal, se incluyó glucosa a un concentración final de 50 mM en tanto agar como medio líquido LB.

Para la producción de toxina, 5 ml y 50 ml de medio LB que contenía antibióticos y 50 mM glucosa se inocularon con cultivos de toda una noche que se desarrollaron sobre placas de agar LB. Los cultivos se desarrollaron a 30ºC sobre un agitador a 300 rpm. Una vez la densidad de cultivo ha alcanzado una D. O de \sim 0,4 a 600 nm, IPTG a una concentración final de 75 mM se añadió al medio de cultivo para inducir la expresión génica. Después de 24 horas, se recogieron las células de E. coli para análisis en gel de proteína mediante el sistema NuPAGE (Invitrogen). Los sedimentos de células de 0,5 ml de caldo de cultivo 1 X se volvió a suspender en 100 ml de 1 X de tampón de muestra NuPAGE LDS. Después de una breve sonicación y ebullición durante 5 min, 5 \mul de la muestra se cargaron en 4 a 12% de gel de gradiente de NuPAGE bis- tris para análisis de perfil de proteína total total. XptA2 expresado a niveles detectables cuando se expresan de manera independiente o en la presencia del operón de TC. Basándose en el análisis de barrido sobre gel mediante un Densitómetro Personal SI (Molecular Dynamics), XptA2 expresado aproximadamente 8 X tan alto por sí mismo como cuando se co-expresa con el operón de TC. Para el experimento de inducción de 5 ml, existe una expresión casi igual de XptA2.

B. Bioensayo para Actividad insecticida

Como se describe en el Ejemplo 8, los ORF de tc de DAS 1529 cuando se expresan de manera independiente o como un operón, no parecían que fueran activos contra TBW y CEW. Los siguientes experimentos de bioensayo se centraron en determinar si las proteínas TC de Paenibacillus (DAS1529) (de ORFs 3-6; proteínas de tipo TcaA-, TcaB-, TcaC-, y TccC-) pueden complementar la actividad de la toxina de proteína TC de Xenorhabdus TC (XptA2 se ejemplifica). Se prepararon muestras de bioensayo como células enteras de E. coli en 4 X de concentrado de células para el experimento de inducción de 5 ml, tanto las células del operón de XptA2 como XptA2/TC contenían muy baja pero casi igual cantidad de la toxina de XptA2. Los datos en la Tabla 13 mostraron que a la concentración de células 4 X ensayadas, las proteínas TC + Xenorhabdus XptA2 eran activas contra CEW. Esto proporcionó la primera evidencia de un efecto de complementación de las proteínas TC de DAS 1529 de Paenibacillus sobre Xenorhabdus XptA2.

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TABLA 13 Bioensayo de complementación de TC de DAS1529 de Xeno. XptA2 sobre H. Zea

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Para el segundo experimento de bioensayo, la cantidad de proteína de XptA2 en las células de XptA2 y las células de XptA2 + operón de TC se normalizaron basándose en el análisis de barrido en gel de densitómetro. Como se muestra en la Tabla 14, XptA2 per se tenía una actividad moderada a 40 X sobre TBW (H. virescens), pero la actividad caía hasta un nivel indetectable a y por debajo de 20 X. Sin embargo, cuando se co-expresaba con las TC, eran muy evidentes altos niveles de actividad en la presencia de 10 X y 5 X de XptA2, y todavía era detectable baja actividad a 1,25 X de XptA2. Estas observaciones indican que existe un efecto de potenciación significativo de las 1529 proteínas de TC sobre Xenorhabdus XptA2 contra H. virescens. A las mayores dosis ensayadas, ni el control negativo ni el operón tc per se tenían una actividad contra esta plaga.

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TABLA 14 Bioensayo de complementación de TC de IDAS1529 de XptA2 sobre H. virescens

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Ejemplo 11

Estabilización de la proteína Cry1529 contra la digestión por tripsina

Este ejemplo enseña para las modificaciones de la secuencia de ADN descrita como la SEQ ID NO:14, que codifica la proteína Cry1529 (descrita como la SEQ ID NO:15) de manera que las nuevas proteínas codificadas son más resistentes a la digestión proteolítica por tripsina que es la proteína nativa. La digestión de proteínas en el intestino de insectos limita el tiempo de exposición del insecto a una toxina de la proteína. Por lo tanto, se pueden usar procedimientos para disminuir la susceptibilidad de una toxina de proteína a la digestión por proteasa para incrementar la potencia de la proteína.

Para estos ensayos, la enzima tripsina (por ejemplo, Sigma Chemical nº T1426) e inhibidores de tripsina (por ejemplo, Sigma Chemical nº T9008) se prepararon como soluciones madre de 4 mg/ml o 10 mg/ml en 50 mM tampón Tris HCl, pH 8,0. Las incubaciones de ensayo con diversas concentraciones de tripsina y proteína Cry1529 se realizaron a 37ºC durante 1 hora, y se terminaron mediante la adición de un volumen igual de una concentración igual de inhibidores de tripsina (por ejemplo, una digestión que recibió 35 ml de 4 mg/ml de solución de tripsina se terminó mediante la adición de 35 ml de 4 mg/ml de inhibidores de tripsina). Para un experimento típico, la proteína Cry1529 se produjo mediante la modificación de manera apropiada por ingeniería genética de células de E. coli y se purificó mediante las etapas descritas anteriormente, que incluían la separación de otras proteínas mediante pasaje a través de una columna de exclusión por tamaño. Después de la digestión, se analizaron los productos de proteasa mediante electroforesis en gel de archilamida estándar seguido de análisis de inmunotransferencia usando anticuerpo preparado contra la Cry1529. Los resultados de tal experimento se muestran en la Figura 9.

La digestión por Tripsina produce dos productos de proteína principales, el más pequeño es de aproximadamente 50 kDa de tamaño molecular. Se indica que este patrón de digestión es el mismo que el producido a partir de la digestión por tripsina de una proteína Cry1529-His6, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa Cry1529 SEQ ID NO:15 excepto para la adición de aminoácidos

KGELNSKLEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH al extremo carboxi. La región de codificación para Cry1529-His6 se produjo ligandos la región de codificación para la proteína nativa Cry1529 en el vector pET101/D-TOPO® (Invitrogen^{TM}, Carlsbad, CA). Este clon recombinante se realizó para facilitar la purificación de la proteína recombinante Cry1529 mediante la unión a un anticuerpo V5 comercialmente disponible, cuyos epítopes se representan por la secuencia de aminoácidos GKPIPNPLLGLDSTRTG (subrayado anteriormente), o mediante esquemas de purificación que se sirven de los seis restos de histidina (subrayado doble anteriormente). Los procedimientos para estas manipulaciones se realizaron de acuerdo con las recomendaciones proporcionadas con el vector pET101/
DTOPO®.

La digestión con Tripsina de la proteína Cry1529-His6 se encontró que elimina la actividad en bioensayos de insectos contra insectos lepidópteros. Se usó el análisis MALDI-TOF para determinar la secuencia de aminoácidos que componen el extremo N de los péptidos de 50 kDa, y dos sitios de procesamiento de proteasa se determinaron correspondientes a restos de aminoácidos 122 (R, Arginina) y 126 (K, Lisina) de la SEQ ID NO:15.

Las modificaciones el primer sitio de escisión de tripsina en la proteína codificada se realizaron en la secuencia nativa de ADN (SEQ ID NO:14), usando la metodología de mutagénesis de Quick-Change® (Stratagene, La Jolla, CA). Tres tipos diferentes de mutaciones se realizaron en aminoácidos en la región de 120 a 123 de la SEQ ID NO:15: RARA a HANA, RARA a RARS, y RARA a QANA. Los cebadores de oligonucleótidos de ADN (enumerados en dirección 5' a 3' para cada hebra) para estas mutaciones se enumeran en la Tabla 15 a continuación. Las bases que difieren de la secuencia native de ADN están subrayadas.

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TABLA 15

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Comparación de las regiones de codificación de tipo salvaje y mutadas inducidas por estos cebadores se muestran en esta tabla. Los restos de aminoácidos pertinentes se muestran en negrita

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Las regiones codificantes separadas, mutadas se clonaron cada una en el vector pET101/D-TOPO®, que permite la producción inducible de las proteínas variantes Cry1529. Se desarrollaron células de E. coli que contienen las construcciones, y se indujo la expresión de los genes variantes de Cry1529 mediante procedimientos recomendados por el proveedor. Las células enteras recogidas se ensayaron después en ensayos de digestión por tripsina, y se analizaron como antes. Los resultados típicos se muestran en la Figura 10. Para estos experimentos, 10 mg de sedimento de células enteras se suspendieron en 50 mM Tris HCl, pH 8,0, y se digirieron durante 3 horas a 37º en un volumen final de 1 ml, con 100 ml de 10 mg/ml de tripsina. Las reacciones se mezclaron ocasionalmente durante la incubación. La digestión se terminó mediante la adición de 100 \mul de 10 mg/ml de inhibidores de tripsina y los tubos se almacenaron en tubos.

Estos resultados demuestran que tanto las proteínas Cry1529 (RARA) como las Cry1529-His_{6} (RARA) nativas se digirieron por tripsina para producir un producto principal de aproximadamente 50 kDa. Cuando la secuencia RARA correspondiente el sitio de escisión por tripsina se mutó a HANA o QANA, se obtuvo resistencia substancial a la digestión por tripsina. No se produjeron péptidos de 50 kDa, y estaban presentes cantidades fácilmente detectables de las proteínas aparentemente de longitud completa de Cry1529-His_{6}. La mutación del sitio RARA para RARS no eliminaron la producción de péptidos de 50 kDa, pero sustancialmente reducen la tasa de escisión de proteasa. De este modo, Es evidente que los sitios de procesamiento de proteasa en la proteína Cry1529 disminuye sustancialmente su susceptibilidad a la digestión por proteasa. Esto permite que las proteínas residan períodos más largos de tiempo en el intestino de insecto después de la ingestión, dando como resultado un incremento de potencia para eliminar los insectos susceptibles.

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Ejemplo 12

Diseño cebadores de la PCR para la detección de homólogos de IDAS 1529 tcORFs en otras cepas de Paenibacillus

Como se ha mostrado anteriormente, la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus produce una proteína extracelular que es tóxica para diversos insectos Lepidópteros. La filogenia molecular del gen ribosómico de 16S de esta cepa indica que está lo más estrechamente relacionada con los miembros del grupo P. thiaminolyticus-P. lentimorbus-P. popilliae. También se ha mostrado que la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus con tiene tanto los genes del complejo de toxina (de aquí en adelante denominados genes tc) y un gen de proteína de inclusión cristalina insecticida novedosos denominado cry1529. En otro intento para determinar si los homólogos de tc están presentes miembros del género Paenibacillus, una colección de cepas Paenibacillus se seleccionó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y análisis de hibridación. Para los análisis de la PCR, ADN total aislado de cepas de Paenibacillus se usó como molde y se seleccionó usando cebadores de oligonucleótidos específicos para los genes tc encontrados en la Cepa IDAS 1529 de las especies de Paenibacillus, Photorhabdus, y especies de Xenorhabdus. Los productos amplificados obtenidos con los conjuntos de cebadores tc se clonaron y su secuencia de nucleótidos se determinó y se comparó con las secuencias de tc obtenidas a partir de la Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus. Los siguientes ejemplos ilustran cómo se pueden diseñar oligonucleótidos específicos de tc y uso de la PCR para la investigación del ADN total de aislamientos Paenibacillus para las secuencias de ADN que son homólogas a los genes de tc identificados en la Cepa IDAS 1529 de especies de Paenibacillus, Photorhabdus, y especies de Xenorhabdus. Mediante el uso del análisis de la PCR (como se describe en el presente documento), era (y es) posible identificar los homólogos de tc en una especie de Paenibacillus distinta de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus y el grupo P. thiaminolyticus-P. lentimorbus- P. popilliae.

12.A. - Extracción de ADN total a partir de cepas de Paenibacillus

Cepas de Paenibacillus sobre placas de agar nutriente (8 g/l de caldo nutriente, 15 g/l de Bacto agar; Laboratorios Difco, Detroit, MI) durante 3 - 5 días a 30ºC. Se recogió una única colonia y inocuó en un matraz de 500 ml con tres deflectores que contenía 100 ml de caldo nutriente estéril (8 g/l de caldo nutriente; Laboratorios Difco, Detroit, MI). Después de 24 - 72 horas de incubación a 30ºC sobre un agitador rotatorio a 150 rpm, los cultivos se dispensaron en botellas de polietileno de 500 ml estériles y se centrifugaron a 6.500 x g durante 1 hr a 4ºC. Después de la centrifugación, el fluido sobrenadante se decantó y el sedimento de células bacterianas se retuvo. Se extrajo el ADN total a partir de sedimento de células que usan el sistema QIAGEN Genomic-tip 100/G y conjunto de de tampón de ADN Geonómico (QIAGEN Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) siguiendo el Protocolo de Muestra y Lisis para las bacterias exactamente como se describe por el fabricante. El ADN extraído total se solubilizó en 0,5 ml de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0).

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12.B. - Selección de cebadores de oligonucleótidos específicos de tc para la PCR

Para seleccionar los cebadores de oligonucleótidos específicos de los genes de tc identificados previamente a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus, las secuencias de nucleótidos de tcaA, tcaB, tcdB y tccC obtenidas a partir de la Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus, cepa W14 de Photorhabdus, y la cepaXwi de Xenorhabdus se alinearon usando el programa Align en el paquete de software Vector NTI (Informax, Inc., Frederick, MD). Las secuencias de nucleótidos usados para este análisis se enumeran en la Tabla 17.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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12.B.i. - Selección de cebador específico de tcaA

La alineación de secuencias de nucleótidos de tcaA1-1529, tcaA2-1529, y tcaA-W14 identificó dos regiones de identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima (mostrado como regiones en casilla en la Figura 10.). Estas dos regiones se seleccionaron para la síntesis de cebadores específicos de tcaA, que se denominaron SB 105 y SB 106 (Tablas 18 y 19).

12.B.ii. - Selección de cebador específico de tcaB

La alineación de secuencias de nucleótidos de tcaB1-1529, tcaB2-1529, y tcaB-W14 identificó cuatro regiones de identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima (Figura 11.). Estas cuatro regiones se seleccionaron para la síntesis de cebadores específicos de tcaB, que se denominaron SB101, SB102, SB 103, y SB104 (Tablas 18 y 19).

12.B.iii. - Selección de cebador específico de tcaC

La alineación de secuencias de nucleótidos de tcdB1-W14, tcdB2-W14, xptC1-Xwi y tcaC-1529 identificó dos regiones de identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima (Figura 12.). Estas dos regiones se seleccionaron para la síntesis de cebadores específicos de tcaC, que se denominaron SB215 y SB217 (Tablas 18 y 19).

12.B.iv. - Selección de cebador específico de tccC

La alineación de secuencias de nucleótidos de tccC1-W14, tccC2-W14, tccC3-W14, tccC4-W14, tccC5-W14, xptB1-Xwi y tccC-1529 identificó dos regiones de identidad de secuencias de nucleótidos de suficiente longitud para la selección de los cebadores de la PCR con una degeneración mínima (Figura 13.). Estas dos regiones se seleccionaron para la síntesis de cebadores específicos de tccC, que se denominaron SB212 y SB213 (Tablas 18 y 19).

TABLA 18 Cebadores específicos de tc

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TABLA 19 Combinaciones de cebador de tc

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Ejemplo 13

Amplificación mediante PCR de ADN de Paenibacillus

Para la amplificación por PCR que usa conjuntos de cebadores específicos de tcaA- y tcaB-, 3-5 ul de ADN total de cada una de las cepas de Paenibacillus se mezclaron con 50 pmoles de cada cebador y 1 X Eppendorf MasterMix (Eppendorf AG; Hamburgo, Alemania) en un volumen de reacción de 20 ul. Las condiciones de amplificación se desnaturalizaron a 94ºC durante 3 minutos seguido de 30 ciclos de desnaturalizaron a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 52ºC durante 1,5 minutos, y extensión a 72ºC durante 1,5 minutos, seguido de una extensión final a 72ºC durante 5 minutos.

Para la amplificación por PCR usando conjuntos de cebadores específicos de de tcaC- y tccC, aproximadamente 375 ng de ADN total obtenido a partir de cada una de las cepas de Paenibacillus se mezcló con 50 pmoles de cada cebador y 12,5 ul de tampón Epicentre® FailSafe^{TM} Dand 2,5 U de Epicentre® FailSafe^{TM}Polimerasa (Epicentre; Madison, WI) en un volumen de reacción de 25 ul. Las condiciones de amplificación serán desnaturalización a 96ºC durante 4 minutos seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 64ºC durante 30 segundos, y extensión a 70ºC durante 30 segundos. Cada ciclo, la temperatura de hibridación se redujo en 0,5ºC y el tiempo de extensión se incrementó en 5 segundos.

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13. A. - Electroforesis en Gel, clonación, y determinación de la secuencia de nucleótidos de los productos amplificados por la PCR

Las reacciones de amplificación por la PCR se examinaron mediante electroforesis de gel usando 0,8 a 1% de Seakem LE agarosa (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, ME) en 1 X de tampón TAE. Los productos amplificados se clonaron en el vector pCR 2.1-TOPO® usando el TOPO TA® Cloning Kit (Invitrogen^{TM} Life Technologies, Carlsbad, CA) exactamente como se describe por el fabricante. Las secuencias de nucleótidos de los productos amplificados totales se determinaron usando M13 directo, M13 inverso, y cebadores de secuenciación específicos de secuencia tc como se necesita para obtener la secuencia de cadena doble de cada producto amplificado. La secuenciación de nucleótidos se realizó usando el kit CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Quick Start (Beckman Coulter, Fullerton, CA, Estados unidos) y el Sistema CEQ 2000 XL ADN Analysis (Beckman Coulter) exactamente como se describe por el fabricante. El paquete de software Sequencher (v. 4.1.4) (Gene Codes, Ann Arbor, MI) se usó para construir contiguos de los datos de secuenciación y determinar una secuencia de consenso para cada producto amplificado.

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13. B. - Análisis de secuencias de nucleótidos de los productos amplificados por la PCR 13.B.i. - tcaA

Cuando se usa la PCR el tcaA- (combinación de cebador SB105 y SB106) se realizó usando ADN total obtenido a partir de la recogida de cepas de Paenibacillus, se observó que el ADN total de una cepa de Paenibacillus apiarius (NRRL NRS 1438; de aquí en adelante denominada DB482) produjo un producto amplificado de los tamaños esperados. El producto amplificado se clonó y se secuenció.

El producto amplificado obtenido usando la combinación de cebadores de SB105 y SB106 se denominó tcaA2- DB482. Cuando la secuencia de tcaA2-DB482 (SEQ ID NO:32) se compara con las secuencias de tcaA obtenidas a partir de la cepaIDAS 1529 de Paenibacillus y CepaW14de Photorhabdus, se observó que tcaA2-DB482 tenía la mayor identidad de secuencia de nucleótidos (90,5% sobre 1.239 nucleótidos) a tcaA2-1529 (Tabla 20). La secuencia de aminoácidos deducida codificada por tcaA2-DB482 (denominada TcaA2-DB482; SEQ ID NO:33) erá un 89,1% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente de tcaA2-1529 (denominada TcaA2-1529; SEQ ID
NO:7).

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34

13.B.ii. - tcaB

Los productos amplificados obtenidos usando la combinación de cebadores de SB 101 y SB 102 y la combinación de cebadores de SB103 y SB104 se denominan tcaB2a-DB482 y tcaB2b-DB482, respectivamente. Cuando las secuencias de tcaB2a- DB482 (SEQ ID NO:34) y tcaB2b-DB482 (SEQ ID NO:35) se compararon con las secuencias de tcaB obtenidas a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus y cepaW14de Photorhabdus, se observó que ambas secuencias tenían la mayor identidad de secuencias de nucleótidos con tcaB1-1529 y tcaB2-1529 (Tabla 21). La identidad de secuencias de nucleótidos de tcaB2a-DB482 y tcaB2b-DB482 a tcaB2-1529 era 92,6% y 89,8%, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducida codificadas por tcaB2a-DB482 (denominada TcaB2a-DB482; SEQ ID NO:36) tcaB2b-DB482 (denominada TcaB2b-DB482; SEQ ID NO:37) eran 91,2% y 91,1% idénticas, respectivamente, con la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente de tcaB2-1529 (denominada TcaB2-1529; SEQ ID NO:9).

35

13. B.iii. - tcdB

Cuando la PCR que usa la combinación de cebadores específicos de tcaC (SB215 y SB217) se realizó usando el ADN total obtenido a partir de DB482 se produjo un producto amplificado del tamaño esperado. El producto amplificado se clonó y se secuenció.

El producto amplificado obtenido usando la combinación de cebadores de SB215 y SB217 se denominó
tcaCDB482. Cuando la secuencia de tcaC- DB482 (SEQ ID NO:38) se comparó con las secuencias de tcaC obtenidas a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus, cepa Xwi de Xenorhabdus y cepa W14 de Photorhabdus, se observó que tcaCDB482 tenía la identidad de secuencias de nucleótido mayor (93,5% sobre 2.091 nucleótidos) a tcaC-1529 (Tabla 22). La secuencia de aminoácidos deducida codificada por tcaC-DB482 (denominada TcaC-DB482; SEQ ID NO:39) era 91,1% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de tcaC-1529 (denominada TcaC- 1529; SEQ ID NO: 11).

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36

13. B.iv. - tccC

Cuando la PCR que usa la combinación de cebadores específicos de tccC (SB212 y SB212) se realizó usando el ADN total obtenido a partir de la colección de cepas de Paenibacillus, se observó que el ADN total de DB482 producía un producto amplificado del tamaño esperado. El producto amplificado se clonó y se secuenció.

El producto amplificado obtenido usando la combinación de cebadores de SB212 y SB213 se denominó tccC-DB482. Cuando la secuencia de tccC - DB482 (SEQ ID NO:40) se comparó con las secuencias de tccC obtenidas a partir de la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus, cepa Xwi de Xenorhabdus y cepa W14 de Photorhabdus, se observó que tccCDB482 tenía la identidad de secuencias de nucleótido mayor (93,7% sobre 858 nucleótidos) a tccC-1529 (Tabla 23). La secuencia de aminoácidos deducida codificada por tccC-DB482 (denominada TccC-DB482; SEQ ID NO: 41) era 95,5% idéntica a la secuencia de aminoácidos correspondiente deducida de tccC-1529 (denominada TccC- 1529; SEQ ID NO: 13).

TABLA 23 Identidad de secuencia de aminoácidos de nucleótidos y deducida de las regiones correspondientes de tccC-DB482 de xptB1- Xwi, tc-W14, tccC-1529, y genes tcc de la Cepa W14 de Photorhabdus

37

13.C. - Resumen de los análisis de la PCR

Este ejemplo (y otros ejemplos en el presente documento) ilustran procedimientos para diseñar cebadores de oligonucleótidos basados en los genes de tc de los tres géneros de bacterias, y que el uso de estos cebadores para la selección por la PCR de las cepas de Paenibacillus pueden identificar homólogos de tc presentes en aquellas cepas. DB482, que es un aislamiento de Paenibacillus apiarius (depositada como NRRL B-30670) que se aisló a partir de larvas de abeja de miel, se mostró que contenía homólogos de tcaA, tcaB, tcaC, y tccC. El hallazgo de estos homólogos de tc confirma que la cepa IDAS 1529 de Paenibacillus no es única dentro de del género de Paenibacillus con relación a la posesión de los genes de tc. Por lo tanto, los expertos en la técnica pueden ahora usar estos y otros procedimientos para identificar otros homólogos de tc en otras especies de Paenibacillus tales como P. chondroitinus, P. alginolyticus, P. larvae, P. validus, P. gordonae, P. alvei, P. lentimorbus, P. popilliae, P. thiaminolyticus, P. curdlanolyticus, P. kobensis, P. glucanolyticus, P. lautus, P. chibensis, P. macquariensis, P. azotofizans, P. peoriae, P. polymyxa, P. illinoisensis, P. amylolyticus, P. pabuli, y P. macerans.

Ejemplo 14

Detección de homólogos de los ORF de tc de IDAS 1529 en otras cepas de Paenibacillus mediante Hibridación de Southern

Este ejemplo ilustra cómo se puede marcar de manera radiactiva los fragmentos de ADN como sondas para investigar el ADN genómico de aislamientos de Paenibacillus para las secuencias de ADN (teniendo preferiblemente alguna homología con los ORF de tc detectados primero en IDAS 1529). Los resultados demuestran que las secuencias homólogas a a dos de los ROF de tc se detectan en un aislamiento de Paenibacillus apairius, DB482.

El ADN genómico de diversas cepas de Paenibacillus (o de E. coli que sirven como control negativo) se preparó como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 12, y se digirió con enzimas de restricción para producir fragmentos múltiples. Una digestión típica contenía 8 mg de ADN en un volumen total de 400 ml de tampón de reacción como se suministra por el fabricante de la enzima EcoR I (New England Biolabs, Beverly, MA). La reacción, que contiene 200 unidades de enzyma, se incubó durante toda una noche 37ºC, después se colocó sobre hielo. El ADN digerido se purificó adicionalmente y se concentró mediante la adición de 30 \muL of 3M de acetato de sodio (pH 5,2) y 750 ml de ice cold etanol al 100% enfriado en hielo, seguido de centrifugación. El sedimento de ADN se lavó dos veces con etanol al 70%, se secó a vacío, y se volvió a suspender en 50 ml de tampón TE [10 mM Tris HCl, pH 8,0; 1 mM Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)]. Después se analizó una alícuota mediante electroforesis de gel de agarosa para la seguridad visual de la digestión límite. De una manera similar, ADN del cósmido SB 12 de IDAS 1529 se digirió con EcoR I, y y se usó como un control positivo para los experimentos de hibridación.

Los fragmentos de ADN genómico digeridos con EcoR I para transferir para análisis de Southern se separaron por electroforesis mediante 0,7% o 1,2% de geles de agarosa en tampón TEA (40 mM Tris-acetato, 2 mM EDTA, pH 8,0) (1 mg de ADN/pocillo). En cada gel, las calles que contenían 1 kb de Escala de Peso Molecular de ADN de 1 kb (Invitrogen^{TM}, Carlsbad, CA) se usaron para proporcionar patrones de tamaño de peso molecular. Los 15 tamaños de fragmentos mayores que 500 pares de bases en esta escala (en kilobases) son: 12,2, 11,2, 10,1, 9,2, 8,1, 7,1, 6,1, 5,1, 4,1, 3,1, 2,0, 1,6, 1,0, 0,52, y 0,50. El ADN en el gel se tiñó con 50 \mug/ml de bromuro de etidio, el gel se fotografió, y después el ADN en el gel se despurinó (5 min en 0,2 M HCl), se desnaturalizó (15 min en 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl), se neutralizó (5 min en 0,2 M HCl) y se transfirió a membrana de transferencia de nylon MAGNA de 0,45 micrones (Osmonics, Westborough, MA) en 2 X SSC (20X SSC contiene 3 M NaCl, 0,3 M citrato de sodio, pH 7,0). El ADN se entrecruzó con la membrana mediante luz ultravioleta (Stratalinker®; Stratagene, La Jolla, CA) y se preparó para hibridación mediante incubación a 60ºC o 65ºC durante 1 a 3 horas en solución de "Hibridación Mínima" [contiene 10% p/v de polietilen glicol (Peso Molecular approx. 8000), 7% p/v dodecil sulfato de sodio; 0,6 X SSC, 5 mM EDTA, 100 mg/ml AND de esperma de salmón desnaturalizado, y 10 mM tampón fosfato de sodio (de un 1M de solución madre que contiene 95 g/l NaH_{2}PO_{4}\cdot1H_{2}O y 84,5 g/l de Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O)].

Los fragmentos de ADN de los ROF de tc para uso como sondas de hibridación se prepararon primero mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) usando el ADN del cósmido SB12 como molde (véanse los ejemplos previos). Los cebadores directo e inverso para estas amplificaciones se enumeran (direcciones 5' a 3' de las hebras de ADN respectivas) en la Tabla 24, más adelante (las bases en letras mayúsculas corresponden a regiones de codificación de proteína). Se diseña el Conjunto Uno de Cebadores para amplificar, a partir de ADN del cósmido SB 12, un fragmento de ADN que incluye todos los ORF de tc que se describe como la SEQ ID NO:10, y que tiene alguna similitud con el gen tcaC de Photorhabdus (Tabla 6). El Conjunto Dos de Cebadores se diseñaron para amplificar, a partir de un fragmento del cósmido SB 12, un fragmento de ADN que codifica la proteína descrita como la SEQ ID NO:19. Este fragmento de ADN y la proteína codificada son algo más largos que la secuencia de ADN de ORF6 de tc descrito como la SEQ ID NO:12, y la proteína codificada descrita como la SEQ ID NO:13. Las proteínas descritas como las SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:19 ambas tenían alguna similitud con la proteína codificada por el gen tccC de Photorhabdus (Tabla 6). Los productos de PCR amplificados se clonaron en el vector de clonación pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen^{TM}, Carlsbad, CA), y los fragmentos que contenían los ORF de tc se liberaron de los clones resultantes mediante digestión con enzimas de restricción (enumerados en la Tabla más adelante), seguido de purificación a partir de geles de agarosa usando las columnas GenElute^{TM} Agarose Spin (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). Los fragmentos recuperados se concentraron mediante precipitación usando la Solución Quick-Precip^{TM} Plus de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD).

TABLA 24

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38

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Los fragmentos de ADN marcados radiactivamente que usan el kit High Prime Radioactive Labeling (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante paso a través de una columna QIAquick® PCR Purification (Qiagen, Inc. Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El marcado de aproximadamente 100 ng de fragmentos de ADN mediante estos procedimientos dieron como resultado actividades específicas de aproximadamente 0.1 \muCi/ng. Estos fragmentos de AND se desnaturalizaron mediante ebullición durante 5 minutos, después se añadieron a la mancha de hibridación en solución de Hibridación mínima y se incubaron durante toda una noche a 60ºC o 65ºC. La radiactividad emitida se eliminó de la mancha enjuagando a temperatura ambiente en 2 X SSC, después se eliminó la radiactividad unida más estrechamente mediante lavado de la mancha durante al menos una hora a 60ºC o 65ºC en 0,3 X SSC + 0,1% de dodecil sulfato sódico. Se realizaron al menos dos lavados. La mancha se colocó sobre una película de rayos X a -80ºC con dos pantallas de intensificación, y la película expuesta se se desarrolló después de 1 a 3 días de exposición. Las manchas se despojaron de los fragmentos de ADN hibridados mediante ebullición durante 10 minutos en 0,3 X SSC + 0,1% de SDS, y se reutilizaron una vez o dos para hibridaciones posteriores.

Los fragmentos distintos que se hibridaron a las sondas derivadas de los Conjuntos Uno de los Cebadores y Dos se observaron en el ADN genómico que se obtuvieron a partir de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius. La sonda derivada del Conjunto Uno de Cebadores (cebadores SB126 y SB127), que detecta las secuencias homólogas al ORF5 de tc de IDAS 1529, se hibridaron a los fragmentos de tamaños estimados (en kilobases) de 20, 10.2, y 8.4. Dentro de este intervalo de tamaños moleculares, las movilidades de los fragmentos de ADN pueden proporcionar solamente las estimaciones de los tamaños moleculares. La intensidad de señal para los fragmentos estimados eran de 20 kb y 8,4 kb eran mucho más intensas que la intensidad de señal para los fragmentos estimados que eran 10,2 kb. Ya que cada uno de estos fragmentos es al menos dos veces el tamaño del fragmento de sonda (aproximadamente 4,4 kb), una explicación de estos resultados es que copias múltiples de los genes que son similares a las sondas de ORF5de tc de IDAS 1529, y de este modo, son similares al gen tcaC de Photorhabdus, están presentes en el genoma de la cepa DB482 de Paenibacillus apairius. Sin embargo, otras explicaciones para este resultado son posibles.

La sonda derivada del Conjunto Dos de Cebadores (cebadores SB128 y SB129), que detecta las secuencias homólogas al ORF6 de tc de IDAS 1529 y sus secuencias flanqueantes del extremo 5', se hibridaron a los fragmentes de tamaños estimados (en kilobases) de 7.8 y 4,5. La intensidad de señal para el fragmento se estimaba que era de 7,8 kb era mucho más intensa que la intensidad de señal observada para el fragmento estimado que era 4,5 kb. Una explicación para este resultado es que la cepa DB482 de Paenibacillus apairius tenía un único gen similar al RFF6 de tc de IDAS 1529 y sus secuencias flanqueantes en 5' y de este modo, es similar al gen tccC de Photorhabdus, y que EcoR I escinde el gen en dos fragmentos que tienen partes desiguales de las secuencias de ADN que comprenden el gen. Sin embargo, otras explicaciones para este resultado son posibles, incluyendo la presencia de genes múltiples con diferencias cantidades de homología absoluta con la sonda.

Estos resultados (detección mediante amplificación por la PCR seguido de análisis de secuencias de ADN) confirman la presencia de parientes de los genes tcaC y tccC de Photorhabdus en la cepa de DB482 Paenibacillus apairius.

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Ejemplo 15

Actividad insecticida de DB482

La cepaDAS 1529 de Paenibacillus cepa se ha mostrado que produce una proteína extracelular que es tóxica para los insectos Lepidópteros y también se ha mostrado que contiene un gen cry, denominado cry1529. Ya que esta cepa produce una proteína extracelular activa de manera insecticida y proteínas intracelulares activas de manera insecticida, la invención presente incluye la selección de otras cepas de Paenibacillus para los agentes activos de manera insecticida extracelulares (liberados en el fluido sobrenadante del cultivo) y/o intracelular (asociado a células). Este ejemplo ilustra cómo se pueden producir caldos de fermentación de cepas de Paenibacillus, cómo procesar estos caldos, y cómo ensayar las muestras derivadas de estos caldos para determinar la actividad insecticida.

15.A. Producción y procesamiento de caldos de fermentación de Paenibacillus

Cepas de Paenibacillus se desarrollaron sobre placas de agar nutriente (8 g/l de caldo nutriente, 15 g/l de Bacto agar; Laboratorios Difco, Detroit, MI) durante 3 - 5 días a 30ºC. se recogió una única colonia y se inoculó en un matraz de 500 ml con tres deflectores que contenía 100 ml caldo de tristona soja modificado estéril (triptona 10-g/l, peptona 7 g/l, proteína hidrolizada de soja 3 g/l, KCl 5 g/l, K_{2}PO_{4} 2,5 g/l; Laboratorios Disco, Detroit, MI). Después de 72 horas de incubación a 28ºC en un agitador rotatorio 150 rpm, se dispensaron los cultivos en botellas de 500 ml de polietileno y se centrifugaron a 4.000 x g durante 45 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación, the se decantó el fluido sobrenadante y se filtró a través de una membrana filtrante de 0,22 um (Millipore Corporation, Bedford, MA). Después se concentró el cultivo filtrado 20 X usando un dispositivo de filtro de centrifugación Centricon Plus-20 con una membrana de corte de peso molecular de 5.000 mediante centrifugación a 4.000 x g. El sedimento de células bacterianas se volvió a suspender en tampón de fosfato de potasio 10 mM (pH = 8). Estas muestras después se ensayaron en bioensayo de insectos para determinar las actividades insecticidas contenidas en el sobrenadante procesado y muestras de sedimento de células.

15. B. Bioensayo de insectos de sobrenadante procesado y sedimentos de células

Las especies de insectos incluidas en estos ensayos fueron Diabrotica undecimpunctata howardi (gusano de la raíz del maíz del Sur, SCR), Helicoverpa zea (gusano de la mazorca de maíz, CEW), y Heliothis virescens (gusano de la yema del tabaco, TBW). La dieta usada artificial para la cría y bioensayo SCR se ha descrito previamente (Rose, R.L. y McCabe, J.M. 1973. J. Econ. Entomol. 66, 398 - 400). Dieta artificial de lepidópteros estándar (dieta Stoneville Yellow) se usó para la cría y bioensayo de ECB, CEW, y TBW. Alícuotas de 40 ul de muestras del sobrenadante concentrado o de sedimentos celulares se aplicaron directamente a la superficie de los pocillos (\sim 1,5 cm^{2}) que contiene la dieta artificial. A los pocillos de dieta tratados se les dejó secar al aire en una caperuza de flujo estéril y cada pocillo se infestó con un único insecto neonato incubado a partir de huevos esterilizados en la superficie. Después se sellaron las bandejas de ensayo, se colocaron en una cámara de crecimiento humidificada y se mantuvieron a 28ºC durante 3 - 5 días. Las determinaciones de la mortalidad y peso de larvas se puntuaron después. Se usaron ocho insectos por tratamiento.

15. C. Actividad insecticida de DB482

El sobrenadante concentrado y sedimentos de células de la cepa DB482 tenía actividad insecticida contra SCR, TBW, y CEW con relación a los tratamientos de control (Tabla 25.) Es posible que la actividad insecticida asociada a los sobrenadantes concentrados y sedimentos de células de DB482 son el resultado de dos factores insecticidas diferentes, uno que está asociado a células (es decir, de tipo Cry) y otro que se libera de las células (es decir, de ipo TC). Sin embargo, también es posible que las actividades insecticidas de tanto el sobrenadante concentrado como los sedimentos celulares de DB482 son el resultado de los mismos factores insecticidas presentes en ambas fracciones celulares.

TABLA 25 Actividad insecticida de DB482

40

15.D. Sumario de la selección de la actividad Insecticida

Este ejemplo ilustra un procedimiento para seleccionar sobrenadantes de cultivos concentrados y sedimentos de células a partir de cepas de Paenibacillus para identificar cepas que poseen actividad insecticida contra insectos Coleópteros y Lepidópteros. DB482, que es un aislamiento de Paenibacillus apiarius se mostró en el presente documento que contenía homólogos de tcaA, tcaB, tcaC, y tccC. El hallazgo de actividad insecticida en DB482 confirma que la cepa DAS1529 de Paenibacillus no es única dentro del género Paenibacillus con relación a la producción de actividades insecticidas contra insectos Lepidópteros. Por lo tanto, la invención presente incluye procedimientos usados para identificar otras cepas de Paenibacillus con actividades insecticidas contra insectos Lepidópteros en otras especies de Paenibacillus tales como P. chondroitinus, P. alginolyticus, P. larvae, P. validus, P. gordonae, P. alvei, P. lentimorbus, P. popilliae, P. thiaminolyticus, P. curdlanolyticus, P. kobensis, P. glucanolyticus, P. lautus, P. chibensis, P. macquariensis, P. azotofixans, P. peoriae, P. polymyxa, P. illinoisensis, P. amylolyticus, P. pabuli, P. macerans.

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<110> Dow AgroSciences LLC

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<120> Proteínas de acción pesticida y polinucleótidos que se pueden obtener a partir de especies de Paenibacillus

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<130> DAS-101XC2

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<150> US 60/392,633

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<151> 2002-06-28

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<150> US 60/441,647

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<151> 2003-01-21

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<160> 49

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 33521

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de ácido nucleicos de la inserción entera de SB12.

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<400> 1

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41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

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<210> 2

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<211> 3264

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<212> ADN

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<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

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<400> 2

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60

61

62

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<210> 3

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<211> 1087

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<212> PRT

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<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

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<400> 3

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63

64

65

66

67

68

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<210> 4

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<211> 3618

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<212> ADN

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<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

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<400> 4

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69

70

71

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<210> 5

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<211> 1205

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<212> PRT

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<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

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<400> 5

72

73

74

75

76

77

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<210> 6

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<211> 3300

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<212> ADN

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<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

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<400> 6

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78

79

80

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<210> 7

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<211> 1099

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<212> PRT

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<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

81

82

83

84

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3627

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1208

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

90

91

92

93

94

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4335

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

96

97

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1444

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

100

101

102

103

104

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2793

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 930

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

109

110

111

\hskip0,8cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1791

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de ácido nucleico de ORF7, que codifica una proteína de tipo Cry.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

113

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 596

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos codificada por ORF7.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

115

116

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1547

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia deácidos nucleicos del ADNr de 16S de IDAS1529.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

118

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos N-terminal para la toxina purificada de la fracción de caldo de IDAS1529.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 379

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácidos de tiaminasa I a partir de Bacillus thiaminolyticus.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

120

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 953

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa IDAS 1529 de Paenibacillus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

122

123

124

125

\hskip0,8cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4482

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa Xwi de Xenorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

127

128

129

\hskip0,8cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3051

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cepa Xwi de Xenorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

131

132

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB212

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = i (iosina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB213

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = i (iosina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB215

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = i (iosina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador SB217

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_característica

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = i (iosina)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,9cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cepa DB482 de Paenibacillus apairus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

145

146

147

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

148

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

149

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

151

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2091

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

152

\hskip0,9cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 697

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

154

155

156

\hskip0,8cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 858

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa DB482 de Paenibacillus apairius

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

159

\hskip0,7cm

160

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4434

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

161

162

163

\hskip0,7cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

165

166

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3132

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

168

169

\hskip0,7cm

170

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2748

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

171

172

\hskip0,7cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2883

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

174

175

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2850

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

176

\hskip0,7cm

177

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2817

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa W14 de Photorhabdus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

178

179

\hskip0,7cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2538

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenorhabdus nematophilus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,7cm

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

Claims (3)

1. Un procedimiento de selección de un cultivo de aislamiento de Paenibacillus para un gen que codifica una proteína seleccionada entre el grupo constituido por una proteína de complejo de toxina, en el que dicho procedimiento comprende al menos una de las siguientes etapas:

(a) obtener ADN a partir de dicho cultivo y ensayar dicho ADN para evaluar la presencia de dicho gen; y

(b) obtener proteína producida por dicho cultivo y ensayar dicha proteína para evaluar la presencia de una proteína que indica la presencia de una proteína que indica la presencia de dicho gen en dicho aislamiento,

y al menos una de las siguientes etapas:

(c) realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con al menos un cebador que se hibrida en condiciones de PCR con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41,

(d) inmunorreacción de un anticuerpo con dicha proteína en la que dicho anticuerpo se une a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41, e

(e) hibridar una sonda de ácido nucleico con dicho ADN en el que dicha sonda se hibrida en condiciones de rigurosidad moderada a alta con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41.

2. Una proteína que tiene actividad de toxina contra un insecto en el que una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha proteína se hibrida en condiciones se rigurosidad moderada a alta con el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 41.

3. Un procedimiento de control de un insecto en el que dicho procedimiento comprende la etapa de poner en contacto dicho insecto con una proteína que tiene al menos 90% de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID números: 13, y 41.