ES2311745T3 - Bioensayo de arn. - Google Patents
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Abstract
Un método para evaluar si un agente causa daño celular que comprende: tratar una o más células de mamífero con un agente; y medir el efecto de dicho agente sobre la cantidad de ARN liberado por dichas células.
Description
Bioensayo de ARN.
La presente invención se refiere a métodos para
evaluar el potencial dañino para las células de un agente
determinando la capacidad del agente para aumentar la liberación de
ARN mensajero en las células.
En el campo farmacéutico, se están haciendo
grandes esfuerzos para minimizar el potencial toxicológico de los
agentes farmacéuticos. Entre los riesgos asociados con la exposición
a agentes tóxicos está la posibilidad de causar lesiones o la
muerte a las células del cuerpo, que puede provocar el daño de
órganos vitales.
Mandel y Metais (1948) publicaron el
descubrimiento de ácidos nucleicos extracelulares en el plasma
humano.
Lo, K.W. et al. (1999) y Kopreski, M.
et al. (1999) han publicado la detección de ARN procedente de
tumor en el plasma de pacientes con cáncer.
Chen, X.Q. et al. (2000) han propuesto el
uso de ARN de telomerasa como marcador de detección en el suero de
pacientes con cáncer de mama.
Poon, L.L. et al. (2000) han publicado la
presencia de ARN fetal en el plasma materno.
La Patente de los EE.UU. Nº 6.329.179 describe
el uso de ARN extracelular procedente o asociado a un tumor
encontrado en circulación en el plasma o fracción sérica de la
sangre para la detección, monitorización, o evaluación de cáncer o
afecciones pre-malignas.
La Patente de los EE.UU. Nº 6.156.504 describe
la detección, identificación, o monitorización de la existencia,
progresión o estado clínico de neoplasmas benignos,
pre-malignos o malignos en humanos o animales que
contienen una mutación asociada con el neoplasma mediante la
detección del ácido nucleico mutado del neoplasma en el plasma o
fracciones séricas.
La Patente de los EE.UU. Nº 6.020.124 describe
la detección de ADN soluble que codifica genes mutados y oncogenes
en fluidos biológicos.
Como se considera que el ARN es lábil, los
investigadores han examinado posibles mecanismos por los que el ARN
en plasma humano se protege de la degradación. Hasselmann, D.O.
et al. (2001) han publicado que en un modelo in
vitro, el mARN integrado en cuerpos apoptósicos liberados por
células de melanoma estaba protegido de la degradación cuando se
incubaba en suero humano.
Ng, E.K.O. et al. (2002) han publicado
que una parte sustancial del mARN en plasma está asociado a
partículas.
Tsui, N.B.Y., et al. (2002) han examinado
la estabilidad de ARN endógeno y añadido en sangre, suero y
plasma.
El documento GB 2364244 A describe un método
para ensayar agentes eficaces frente a la hepatitis C que implica
los pasos de exponer titíes infectados con GBV-B a
un agente objeto de ensayo y determinar la cantidad de ARN de GBV
presente por RT-PCR.
El documento US 6.329.179 B1 describe un método
para la detección de ARN extracelular procedente de tumor o
asociado a tumor en sangre o plasma por RT-PCR y su
uso en, por ejemplo, la detección de enfermedad neoplásica o la
evaluación de los efectos del tratamiento de, por ejemplo,
quimioterapia.
Los métodos convencionales disponibles para
determinar si un agente causa daño tisular y celular incluyen
métodos bioquímicos que miden marcadores del daño celular. Por
ejemplo, las enzimas, ALT, AST y 5'NT pueden usarse como
indicadores del daño a las células del hígado (Duncan, J.R. et
al. (1994)). Estas enzimas, que se encuentran normalmente en
células del hígado, se liberan cuando las células del hígado se
dañan y pueden entonces detectarse en la sangre. Sin embargo, la
capacidad para usar tales indicadores para la detección temprana
depende de varios factores, incluyendo la rapidez de liberación de
las enzimas y la sensibilidad de detección. Los métodos
tradicionales son por tanto relativamente insensibles e
inespecíficos. Por consiguiente, existe un interés creciente por
descubrir indicadores biológicos tempranos adicionales o
biomarcadores de toxicidad.
Un aspecto de esta invención proporciona métodos
para evaluar un agente que comprende tratar una o más células con
un agente y medir el efecto del agente en la cantidad de ARN
liberado por las células. En una realización de este aspecto, el
método comprende además la caracterización del agente como un agente
que probablemente va a causar lesión celular, en el que la lesión
se caracteriza por un aumento en la liberación de ARN, siempre que
haya aumentado la cantidad de ARN liberado por las células. En otra
realización de este aspecto de la invención, las células comprenden
una o más células de origen mamífero, preferiblemente de origen
humano.
Otro aspecto de esta invención proporciona
métodos para evaluar las características protectoras para la célula
de un agente que comprenden: tratar una o más células con un primer
agente que causa lesión celular, en la que la lesión se caracteriza
por un aumento en la liberación de ARN por las células lesionadas;
tratar la célula con un segundo agente; y medir el efecto del
segundo agente en la reducción de la cantidad de ARN liberado por
las células que es causada por el primer agente. En una realización
de este aspecto de la invención, el método comprende además la
caracterización del segundo agente como un agente que probablemente
va a proteger las células de la lesión celular por un agente que
cause lesión celular, en el que la lesión celular se caracteriza
por un aumento en la liberación de ARN, siempre que haya aumentado
la cantidad de ARN liberado por las células. En otra realización de
este aspecto de la invención, las células comprenden una o más
células de origen mamífero, preferiblemente de origen humano.
La descripción enumera también métodos para
evaluar el efecto de un agente en un sujeto que comprende tratar un
sujeto con un agente; y medir el efecto del tratamiento en el
aumento de la liberación a la sangre de uno o más marcadores de
ARN.
En una realización de los métodos de esta
invención, la medición de los efectos sobre la liberación de ARN
comprende medir el efecto del agente sobre la cantidad de uno o más
marcadores de ARN.
Se describe también la medición de los niveles
de liberación de ARN que comprende RT-PCR.
En una realización adicional de los métodos de
la invención, los marcadores de ARN se seleccionan entre albúmina,
actina cardiaca, troponina T, SM22, actina de músculo liso, proteína
específica de andrógenos de riñón, proteína de
Tamm-Horsfall y acuaporina-2.
En otra realización más de los métodos de esta
invención que comprende tratar una o más células con un agente, las
células son originarias de hígado, corazón, músculo liso o riñón de
mamífero.
Los términos y expresiones utilizados en la
presente memoria tienen su significado habitual en la técnica. Sin
embargo, para aclarar aún más la presente invención y por
conveniencia, a continuación se proporciona el significado de
ciertos términos y frases empleados en la memoria descriptiva,
incluyendo los ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
"Agente" significa medios químicos,
biológicos o físicos para producir un efecto. Un agente puede ser
uno o una combinación de dos o más sustancias químicas o
bioquímicas, patógenos biológicos o perturbaciones físicas.
"Albúmina" significa una proteína expresada
en el hígado, o cuyo mARN correspondiente se expresa en el hígado,
que está codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una
identidad nucleotídica del 70% o más con la secuencia de
nucleótidos con número de entrada BC034026, y que incluye las
secuencias de nucleótidos de albúmina que tienen los números de
entrada proporcionados más abajo.
"Acuaporina-2" significa
una proteína expresada en el riñón, o cuyo mARN correspondiente se
expresa en el riñón, que está codificada por una secuencia de
nucleótidos que tiene una identidad nucleotídica del 70% o más con
la secuencia de nucleótidos con número de entrada HS2AQP2, y que
incluye las secuencias de nucleótidos de
acuaporina-2 que tienen los números de entrada
proporcionados más abajo.
"Actina cardiaca" significa una proteína
expresada en el corazón, o cuyo mARN correspondiente se expresa en
el corazón, que está codificada por una secuencia de nucleótidos que
tiene una identidad nucleotídica del 70% o más con la secuencia de
nucleótidos con número de entrada HUMACTCA2, y que incluye las
secuencias de nucleótidos de actina cardiaca que tienen los números
de entrada proporcionados más abajo.
"Proteína específica de andrógenos de
riñón" significa una proteína expresada en el riñón, o cuyo mARN
correspondiente se expresa en el riñón, que está codificada por una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad nucleotídica del
70% o más con la secuencia de nucleótidos con número de entrada
RNU25808.
"Identidiad nucleotídica" significa el
alineamiento de secuencia de una secuencia de nucleótidos calculado
frente a otra secuencia de nucleótidos, p. ej. la secuencia de
nucleótidos de la megalina human. Específicamente, la expresión se
refiere al porcentaje de emparejamientos de restos entre al menos
dos secuencias de nucleótidos alineadas usando el algoritmo CLUSTAL
W estandarizado. Este algoritmo puede insertar espacios en las
secuencias que se están comparando de manera estandarizada y
reproducible para optimizar el alineamiento entre las secuencias,
consiguiéndose así una comparación con más sentido. El porcentaje de
identidad entre las secuencias de nucleótidos se determina
preferiblemente usando los parámetros por defecto del algoritmo
CLUSTAL W tal como se incorpora en la versión 5 del programa de
alineamiento de secuencias MEGALIGN^{TM}. Este programa forma
parte del juego de programas de análisis de biología molecular
LASERGENE^{TM} (DNASTAR, Madison WI). CLUSTAL W se describe en
Thompson (1994).
"Secuencia de nucleótidos" y
"polinucleótido" significa ADN o ARN, tanto si está en forma de
cadena sencilla como de cadena doble. La expresión "secuencia de
nucleótidos complementaria" significa una secuencia de
nucleótidos que se hibrida (se une) con otra secuencia de
nucleótidos según el emparejamiento de un nucleótido de guanidina
(G) con un nucleótido de citidina (C) y un nucleótido de adenosina
(A) con un nucleótido de timidina (T), excepto en el ARN en que una
T se sustituye con un nucleótido de uridina (U) de manera que U se
une con A.
"Estado patológico" significa un estado de
anomalía biológica e incluye estados anómalos de un órgano, tipo de
tejido o tipo celular. La expresión incluye anomalía sea cual sea
la causa, y puede incluir enfermedades, que surgen, por ejemplo, de
anomalías fisiológicas, anomalías genéticas o agentes patogénicos,
lesiones físicas, o toxicidades causadas por agentes
xenobióticos.
"Liberación" significa permitir escapar,
excretar o expulsar, ya sea por medios activos o pasivos.
"Marcador de ARN" significa un
polinucleótido de ARN, o un fragmento del mismo, que tiene una
secuencia específica que se transcribe de la información genética
del ADN de una célula. La expresión marcador de ARN incluye
polinucleótidos de mARN , o fragmentos de los mismos, que han sido
procesados por una célula, por ejemplo, por protección terminal en
5', corte y empalme del ARN y poliadenilación en 3', después de
haberse copiado la secuencia de ADN correspondiente. Cuando el
"marcador de ARN" va precedido del nombre de un órgano, tipo de
tejido o tipo celular (p. ej., "marcador de ARN de hígado"),
la expresión significa que el marcador de ARN se transcribe en ese
órgano, tipo de tejido o tipo celular. A los efectos de esta
invención, tal uso de la expresión se referirá preferiblemente a
marcadores de ARN que se transcriben sólo en el órgano, tipo de
tejido o tipo celular designado. Sin embargo, la expresión incluye
también un marcador de ARN que puede usarse para identificar el
órgano, tipo de tejido o tipo celular en particular que sea de
interés en el contexto de la invención. Por ejemplo, en los métodos
de ésta que impliquen caracterizar un estado patológico del hígado
midiendo un marcador de ARN de hígado en la sangre, el marcador de
ARN en particular no tiene que ser uno expresado exclusivamente en
el hígado, siempre que no sea probable detectar en la sangre
expresión alguna, por ejemplo, en un segundo órgano o tejido, como
resultado de una patología en ese segundo órgano o tejido.
"SM22" significa una proteína expresada en
el músculo liso, o cuyo mARN correspondiente se expresa en el
músculo liso, que está codificada por una secuencia de nucleótidos
que tiene una identidad nucleotídica del 70% o más con la secuencia
de nucleótidos con número de entrada D17409, y que incluye las
secuencias de nucleótidos de SM22 que tienen los números de entrada
proporcionados más abajo.
"Troponina T" significa una proteína
expresada en el corazón, o cuyo mARN correspondiente se expresa en
el corazón, que está codificada por una secuencia de nucleótidos
que tiene una identidad nucleotídica del 70% o más con la secuencia
de nucleótidos con número de entrada HSCTNTAI1, y que incluye las
secuencias de nucleótidos de troponina T que tienen los números de
entrada proporcionados más abajo.
"Proteína de Tamm-Horsfall"
significa una proteína expresada en el riñón, o cuyo mARN
correspondiente se expresa en el riñón, que está codificada por una
secuencia de nucleótidos que tiene una identidad nucleotídica del
70% o más con la secuencia de nucleótidos con número de entrada
HUMUMOD, y que incluye las secuencias de nucleótidos de proteína de
Tamm-Horsfall que tienen los números de entrada
proporcionados más abajo.
Las abreviaturas utilizadas en la presente
memoria tienen su significado habitual en la técnica. Sin embargo,
para aclarar aún más la presente invención, por conveniencia, a
continuación se proporciona el significado de ciertas abreviaturas:
"ºC" significa grados centígrados; "5'NT" significa
5-nucleotidasa; "\mul" significa microlitro;
"ALT" significa alanina aminotransferasa; "AST" significa
aspartato transferasa; "ATCC" significa American Type Tissue
Culture Collection de Manassas, VA (página web, www.atcc.org);
"cADN" significa ADN complementario; "dL" significa
decilitro, "ADN" significa ácido desoxirribonucleico;
"EDTA" significa ácido etilendiaminotetraacético; "EGTA"
significa ácido
etilenglicol-bis(b-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético
"FBS" significa suero bovino fetal; "g" significa gramo;
"H_{2}O_{2}" significa peróxido de hidrógeno; "LDH"
significa lactato deshidrogenasa; "kg" significa kilogramo;
"NaOH" significa hidróxido de sodio; "MEM" significa Medio
de Eagle Modificado; "mARN" significa ARN mensajero; "mg"
significa miligramo; "ml" significa mililitro; "ng"
significa nanogramo; "PCR" significa reacción en cadena de la
polimerasa; "PBS" significa solución salina tamponada con
fosfato; "ARN" significa ácido ribonucleico; "RPM"
significa revoluciones por minuto; y "RT-PCR"
significa reacción en cadena de la polimerasa y la transcriptasa
inversa.
Durante la renovación celular normal, las
células de mamíferos liberan ARN que es detectable en el plasma.
Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la
liberación de ARN por las células se agrava por la lesión celular
causada por agentes químicos, y que este efecto es un indicador útil
de que hay lesión celular. Un aspecto de esta invención hace uso de
la naturaleza específica de tipo de tejido y específica de tipo
celular de la transcripción génica (esto es, que algunos genes
pueden transcribirse y otros no) y la disposición del corte y
empalme específica de tipo de tejido y de tipo celular de ciertos
productos de transcripción génica. Los ARNs que son distintivos de
un tipo de tejido o un tipo celular en particular pueden usarse
como biomarcadores de lesión biológica, fisiológica o toxicológica
para órganos, tejidos o tipos celulares específicos.
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La invención proporciona el ensayo in
vitro de agentes potencialmente toxicológicos, la identificación
de agentes terapéuticos, y el ensayo de la eficacia de los agentes
terapéuticos, basándose en la liberación de ARN por las células
como un indicador de lesión celular o muerte celular. Las técnicas
de detección de ARN conocidas por los expertos en la técnica o que
resulten evidentes basándose en esta memoria descriptiva son útiles
en la práctica de esta invención.
Una realización proporciona métodos in
vitro para evaluar el potencial dañino para las células de un
agente. Según estos métodos, las células o cultivos tisulares se
exponen a uno o más agentes objeto de ensayo potencialmente
tóxicos. Se detecta a continuación la liberación de ARN en el medio
líquido que rodea las células. La toxicidad de un agente objeto de
ensayo se evalúa según su capacidad para aumentar la liberación de
ARN por las células.
Otra realización proporciona métodos in
vitro para identificar agentes terapéuticos. Por ejemplo, pueden
tratarse células o cultivos celulares inducidos a sufrir apoptosis
(esto es, muerte celular programada) con un agente objeto de
ensayo. Si el nivel de ARN liberado de las células viables disminuye
a lo largo del tiempo, sería una indicación de que el agente objeto
de ensayo inhibe la progresión de la apoptosis.
La descripción enumera también métodos in
vivo para evaluar la toxicidad de un agente y determinar qué
órgano o tejido se ve afectado negativamente por el agente. Según
tales métodos, la sangre de un sujeto se ensaya para determinar el
nivel de ARN específico para un tejido o tipo celular en particular.
La toxicidad del agente se evalúa basándose en su capacidad para
causar la liberación celular de ARN según se mide en la sangre del
sujeto objeto de ensayo. Tales métodos serían útiles como pruebas
in vivo para la evaluación de la toxicidad de los agentes
objeto de ensayo, usando, por ejemplo, animales de ensayo. Los
métodos pueden usarse también clínicamente para monitorizar de
forma no invasiva a pacientes tras el tratamiento con fármacos como
una advertencia temprana de posible toxicidad.
La descripción enumera también métodos
diagnósticos no invasivos para detectar daños en tejidos u órganos.
Tales métodos son útiles en el entorno clínico para la
identificación o diagnóstico de enfermedades y otras afecciones
patológicas. Los métodos pueden usarse también para seguir el
progreso de la enfermedad. Según tales métodos, la sangre de un
sujeto se ensaya para detectar la presencia de un ARN específico de
un tipo de tejido. Un aumento en el nivel de ARN a lo largo del
tiempo para un tejido específico es indicativo del agravamiento de
la enfermedad en él. Similarmente, una disminución en los niveles de
ARN indicaría una mitigación de la enfermedad.
Además, la presente invención proporciona
métodos diagnósticos no invasivos para evaluar la eficacia de
agentes o métodos terapéuticos en un sujeto. Según tales métodos,
un retorno a los niveles normales de ARN liberado por las células
previamente lesionadas de un tipo de tejido elegido como diana
indicará que un agente terapéutico está teniendo el efecto deseado
sobre el tejido elegido como diana.
Se apreciará por parte de aquéllos que poseen
experiencia en la técnica, basándose en la presente memoria
descriptiva, que puede usarse cualquier célula animal o línea
celular viable para evaluar la toxicidad de los agentes mediante
los métodos in vitro de esta invención. Por ejemplo, tales
células pueden ser procedentes de mamífero, de ave, de reptil, de
anfibio, de pez o de insecto. Resultará evidente para aquéllos que
poseen experiencia en la técnica que las células para usar en los
métodos de la invención tendrán, preferiblemente, un gran parecido
con las células del organismo frente a las que se está evaluando la
toxicidad. Por ejemplo, si se está evaluando un agente para
determinar su posible toxicidad en humanos, es preferible ensayar el
agente usando células procedentes de mamífero, más preferiblemente,
células procedentes de humano. Además, resultará evidente para
aquéllos que poseen experiencia en la técnica que se preferirán
células procedentes de un tipo de tejido u órgano en particular
cuando se evalúe la toxicidad de ese tipo de tejido u órgano. Por
ejemplo, si se está evaluando un agente para determinar su posible
toxicidad en el hígado, es preferible ensayar el agente usando
células procedentes de hígado.
Las células que se usan en los métodos in
vitro pueden proceder de cualquiera entre varios órganos y/o
tejidos de un animal. Por ejemplo con respecto a las células de
mamífero, tales células pueden proceder del endotelio, timo, bazo,
médula ósea, linfocitos, hígado, riñón, corazón, testículo, ovario,
corazón y músculo estriado.
Pueden prepararse hepatocitos viables intactos,
por ejemplo, a partir de tejido hepático de animales de laboratorio
o hígados humanos donados, por métodos conocidos en la técnica,
incluyendo los descritos en Maines et al. (1998). Los
hepatocitos pueden prepararse por una digestión con colagenasa en
dos pasos. En el primer paso, el tejido se perfunde con un tampón
que contiene EGTA para retirar del tejido el calcio intersticial y
para debilitar la adhesión entre células epiteliales. En un segundo
paso, se usa un segundo tampón de perfusión que contiene
colagenasa, que digiere el colágeno intersticial, conduciendo
finalmente a la digestión completa de los contactos
célula-célula.
En una realización preferida que utiliza una
línea celular de mamífero, las células se preparan antes del
tratamiento con un agente objeto de ensayo haciendo crecer un
cultivo de las células. Como es bien conocido por aquéllos que
poseen experiencia en la técnica, las condiciones del cultivo
variarán dependiendo de los tipos de células utilizados. Por
ejemplo, cuando se usa una línea celular, rutinariamente se dejan
crecer las células hasta que alcanzan una densidad del
50-100% de confluencia. La confluencia se mide
estimando visualmente el número de células que están en contacto
unas con otras. Por ejemplo, si las células han alcanzado una
densidad en la que no hay espacio entre ellas, esto se considera
una confluencia del 100%.
Como resultará evidente para aquéllos que poseen
experiencia en la técnica, basándose en la presente descripción, la
densidad deseada dependerá de muchos factores, incluyendo los tipos
de células y condiciones de crecimiento utilizadas y tratadas con
concentraciones variables del agente objeto de ensayo. Como
apreciarán aquéllos que poseen experiencia en la técnica basándose
en la presente memoria descriptiva, para cualquier agente objeto de
ensayo determinado, el intervalo de concentraciones variará
dependiendo del tipo de célula y agente objeto de ensayo utilizado,
pero debería estar entre cero y aquella concentración que provoque
la muerte celular. El periodo de exposición estará generalmente en
el intervalo de entre aproximadamente cinco minutos a
aproximadamente 48 horas, preferiblemente aproximadamente dos horas
a aproximadamente 32 horas. Como resultará evidente para aquéllos
que poseen experiencia en la técnica, basándose en la presente
descripción, el periodo óptimo de exposición dependerá de muchos
factores, incluyendo los tipos de células y las características
físicas y químicas del agente objeto de ensayo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los métodos y técnicas adicionales para cultivar
células de mamíferos son bien conocidos por aquéllos que poseen
experiencia en la técnica. Los métodos generales de preparación y
manejo de cultivos celulares se describen en Bonfacino et
al. (1998). Véase también Freshney, R.I. (1993).
En la práctica de los métodos in vitro de
esta invención, la liberación de ARN por las células se detecta por
métodos conocidos por aquéllos que poseen experiencia en la técnica,
basándose en la presente descripción. Generalmente, la detección de
ARN implica un procedimiento en múltiples pasos que incluye
extracción, amplificación y detección, como se describe más
abajo.
Los métodos in vivo descritos en la
presente memoria pueden utilizarse con cualquier sujeto vertebrado,
incluyendo, por ejemplo, un sujeto mamífero, ave, reptil, anfibio o
pez. Preferiblemente se usa un sujeto mamífero, incluyendo, por
ejemplo, un perro, gato, res bovina, caballo, conejo, ratón, rata o
primate.
En la práctica de los métodos in vivo
descritos en la presente memoria, se saca sangre de un sujeto por
métodos estándar conocidos por aquéllos que poseen experiencia en la
técnica, en un tubo de recogida de muestras, preferiblemente de
vidrio siliconizado, con o sin anticoagulantes. Para la preparación
del plasma, la sangre se almacena preferiblemente con EDTA, citrato
de sodio, heparina, o anticoagulantes similares. Preferiblemente,
la sangre se recoge en tubos que contienen EDTA y se almacena sin
fraccionar a 4ºC. Alternativamente, la sangre no procesada
coagulada sin anticoagulante para la preparación de suero debe
almacenarse a 4ºC y procesarse en las seis horas siguientes. Sea
cual sea el método usado, es mejor procesar la sangre para analizar
el contenido en ARN lo antes posible, preferiblemente en las seis
horas siguientes con el fin de evitar la degradación o liberación
adicional de ARN, afectando con ello a la precisión de los
resultados.
Para el almacenamiento a largo plazo, el plasma
o el suero se obtiene preferiblemente por fraccionamiento de la
sangre entera y a continuación se congela. Esto reduce la
posibilidad de que haya ARN intracelular extraño liberado de la
lisis de células congeladas y descongeladas, o, con respecto al uso
de la amplificación por PCR, la liberación de inhibidores para la
PCR tales como porfirinas y hematina, que pueden reducir la
sensibilidad de la cuantificación del ARN. El plasma o el suero
puede obtenerse por fraccionamiento de la sangre entera mediante
centrifugación, usando preferiblemente centrifugación suave a
aproximadamente 300 a 800 veces la fuerza de la gravedad durante
aproximadamente cinco a diez minutos, o por fraccionamiento mediante
otros métodos estándar. Como la heparina puede interferir con la
RT-PCR, el uso de sangre heparinizada puede requerir
la inactivación de la heparinasa por métodos conocidos por los
expertos en la técnica.
Generalmente, la detección de ARN para la
práctica de los métodos in vitro de esta invención implica un
procedimiento en múltiples pasos: (1) extracción del ARN; (2)
amplificación, que puede implicar la transcripción inversa del ARN
a su cADN; y (3) detección. Sin pretender comprometerse con ninguna
teoría o mecanismo en particular, se cree que el ARN extracelular
está presente extracelularmente como proteína-ARN,
complejos lipoproteína-ARN,
lípido-ARN o complejo ADN-ARN, y que
tal formación de complejos puede interferir con la amplificación y
detección de los niveles de ARN. Por tanto, es preferible según
esta teoría usar un paso de extracción para disociar el ARN de sus
complejos asociados, antes de la amplificación y detección.
Puede usarse cualquiera de los diversos métodos
de extracción de ácidos nucleicos conocidos por aquéllos que poseen
experiencia en la técnica en la práctica de la invención. Aunque
muchos de los métodos publicados están destinados a la extracción
de ARN intracelular, pueden usarse como se describe en la
bibliografía o con una modificación que resultará evidente para
aquéllos que poseen experiencia en la técnica, basándose en la
presente memoria descriptiva. Por ejemplo, el ARN extracelular
puede extraerse usando partículas de sílice, perlas de vidrio, o
diatomeas, como en los métodos descritos en Boom et al.
(1990) o Cheung et al. (1994).
En un método ilustrativo para extraer ARN de los
medios de crecimiento celular para los métodos in vitro de
la invención, los medios que se han separado de las células por
métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, por
centrifugación o filtración) se tratan con un agente estabilizante
de ARN, tal como una sustancia caotrópica, por ejemplo,
(iso)tiocianato de guanidinio como se describe en la Patente
de los EE.UU. Nº 5.234.809. El ARN se une a continuación a un
agente de unión sólido, tal como las partículas de sílice. La fase
sólida con el ARN puede separarse entonces de la fase líquida por
filtración. El ARN puede eluirse a continuación de las partículas
de sílice usando un tampón que consiste en Tris-HCl
10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).
En un método ilustrativo de extracción de la
sangre, se mezclan aproximadamente 100 a 250 ml de plasma o suero
libre de células con 40 microlitros de una suspensión acuosa de
sílice, preparada como se describe más abajo, y aproximadamente 900
microlitros de tampón de lisis, preparado como se describe más
abajo, y se mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente
10 minutos. La mezcla se centrifuga a continuación a 12.000 x g
durante un minuto y se retira el sobrenadante. El sedimento de
sílice-ARN resultante se lava seguidamente dos
veces con aproximadamente 450 microlitros de un tampón de lavado,
preparado como se describe más abajo, y a continuación con
aproximadamente 1 ml de etanol al 70% (vol/vol). Finalmente, el
sedimento se lava con 1 ml de acetona y se seca a aproximadamente
56ºC durante aproximadamente 10 minutos. El ARN se eluye
seguidamente del sedimento de sílice resuspendiéndolo en
aproximadamente 20 a 50 microlitros de agua tratada con
pirocarbonato de dietilo a 56ºC durante aproximadamente 10 minutos
y centrifugando a continuación a aproximadamente 12.000 veces la
fuerza de la gravedad durante aproximadamente tres minutos.
Alternativamente, el ARN puede eluirse usando un tampón que
consiste en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0) y un
inhibidor de RNasa (p. ej., RNAsin®, Promega, Madison WI),
con o sin una proteinasa, tal como proteinasa K, según el método
descrito en Boom et al. (1991). El sobrenadante resultante
que contiene el ARN se recupera para la amplificación y
detección.
Antes de la amplificación y detección, puede ser
deseable purificar adicionalmente el ARN eliminado las trazas de
ADN. La purificación adicional puede llevarse a cabo usando DNasa
según los métodos descritos en Rashtchian, A. (1994).
La suspensión acuosa de sílice descrita
anteriormente puede prepararse resuspendiendo 60 gramos de dióxido
de silicio (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) en
500 ml de agua estéril desmineralizada doblemente destilada. La
suspensión se deja sedimentar a continuación durante aproximadamente
24 horas a temperatura ambiente. Se retira el sobrenadante y las
partículas se resuspenden en agua estéril desmineralizada doblemente
destilada añadida hasta igualar un volumen de 500 mililitros. Una
vez que la suspensión ha sedimentado, se retiran aproximadamente
440 mililitros del sobrenadante y se ajusta el pH de la suspensión a
aproximadamente pH 2 usando ácido clorhídrico.
El tampón de lisis descrito anteriormente se
prepara disolviendo 120 gramos de tiocianato de guanidina en 100 ml
de Tris hidrocloruro (Tris-HCl) 0,1 M (pH 6,4), y 22
mililitros de EDTA 0,2 M, ajustado a pH 8,0 con NaOH, y 2,6 gramos
de Triton X-100 (Sigma-Aldrich
Corp.).
El tampón de lavado descrito anteriormente se
prepara disolviendo 120 gramos de tiocianato de guanidina en 100
mililitros de Tris-HCl 0,1 M (pH 6,4).
En un método preferido de extracción de ARN de
la sangre, se usa un "kit" (estuche) PAXgene^{TM} Blood RNA
(nº cat. 762132, Qiagen Inc., Valencia, CA) para extraer el ARN
usando un sistema de membrana de gel de sílice. En este método, las
muestras de sangre se centrifugan para sedimentar los ácidos
nucleicos y el sedimento se lava y se trata con proteinasa K. Se
añade etanol y la muestra se aplica a una columna de centrifugación
que contiene una membrana de gel de sílice que une selectivamente
ARN. Después de centrifugar para retirar impurezas, el ARN se eluye
con un tampón optimizado. En un método preferido de extracción de
ARN de los sobrenadantes procedentes de los métodos in vitro
de esta invención, se usa un "kit" RNeasy^{TM} (nº cat.
74124, Qiagen Inc., Valencia, CA) para extraer el ARN usando un
sistema de membrana de gel de sílice similar al "kit"
PAXgene^{TM} Blood RNA descrito anteriormente.
Pueden usarse métodos alternativos para extraer
el ARN, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, centrifugación a
través de un gradiente de cloruro de cesio, por ejemplo, como se
describe en Chirgwin et al. (1979), y
co-precipitación del ARN extracelular del plasma o
suero con gelatina, por ejemplo, como se describe de manera general
en Fournie et al. (1986). Otros métodos de extracción de ARN
resultarán evidentes para los expertos en la técnica basándose en
la presente memoria descriptiva.
El ARN que se ha extraído, como se describe
anteriormente, puede amplificarse usando un ensayo de amplificación
de ácidos nucleicos. Cualquier ensayo de amplificación de ácidos
nucleicos capaz de permitir la detección de cantidades pequeñas de
moléculas de ARN puede usarse en la práctica de la invención. Los
ensayos aplicables incluyen, pero sin limitarse a ellos, la
reacción en cadena de la polimerasa y la transcriptasa inversa
(RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa
(véase, por ejemplo, Abravaya, K. et al. (1995)),
amplificación de señales de ADN ramificado (véase, por
ejemplo, Jrdea, M.S. et al. (1993)), amplificación
isoterma basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA, del
inglés "nucleic acid sequence based amplification")
(véase, por ejemplo, Kievits, T. et al.
(1991)), y otros ensayos de replicación de secuencias
autosostenidos.
La realización preferida para la amplificación
de ARN para esta invención es a través del uso de la
RT-PCR. Los métodos para la amplificación de ARN
usando RT-PCR son bien conocidos por aquéllos que
poseen experiencia en la técnica y están bien descritos en la
bibliografía (véanse, por ejemplo, Ausubel et al.
(1994) e Innis et al. (1990)).
La elección de los cebadores que se van a usar
para la amplificación y las sondas para la detección del producto
de amplificación, por ejemplo, por RT-PCR, dependerá
de los tipos de células que se evalúen a través de los métodos de
la invención. Para los métodos in vitro de esta invención,
tal evaluación implica el uso de cultivos celulares que comprenden
uno o más tipos de células. Para los métodos in vivo, la
evaluación puede implicar un gran número de tipos de células
diferentes en el cuerpo de un sujeto.
Por consiguiente, los juegos de sondas y
cebadores deberán dirigirse a uno o más genes transcritos de tales
células de tal forma que la transcripción de los mismos pueda usarse
para identificar esas células. Preferiblemente, tales sondas y
cebadores se dirigirán a ARNs que sean únicos para el tipo de
células en particular. Es también preferible que tales genes se
transcriban a un nivel relativamente alto, y preferiblemente
continuamente, sea cual sea el estado de la célula o las afecciones
que afectan a la célula.
Puede usarse cualquier gen transcrito adecuado
para construir tales sondas y cebadores. Por ejemplo, para
dirigirse al hígado, puede usarse el gen de la albúmina. Las
secuencias génicas representativas de albúmina incluyen los genes
con números de entrada: V01222 y J00698 (rata); BC034026 (humano);
ABBOS (bovino); CAB64867 (canino); ABCHS (pollo); X78598 y S59517
(cobra); P49064 y X84842 (felino); ABXL68, ABXL72, P21847 y AAD09358
(rana); JC5838 (gerbo); X74045 (lamprea); Q28522 (macaco); P07724
(ratón); M36787 (cerdo); P49065 (conejo); M90463 (mono rhesus);
AAL56646 (salamandra); ABONS1 y ABONS2 (salmón); y X17055
(oveja).
Para dirigirse al corazón, puede usarse el gen
de la troponina T. Las secuencias génicas representativas de
troponina T incluyen los genes con números de entrada: RATCTTG
(rata); HSCTNTAI1 (humano); AB085600 (bovino); U84037 (trucha
marrón); AY005140 (canino); K02263 (pollo); AF020946 (ratón); y
L40178 (conejo).
Un gen alternativo que puede usarse para
dirigirse al corazón es la actina cardiaca. Las secuencias génicas
representativas de actina cardiaca incluyen los genes con números de
entrada: RRALPHAAC (rata); y HUMACTCA2 (humano).
Para dirigirse al músculo liso, puede usarse el
gen de la SM22. Las secuencias génicas representativas de SM22
incluyen los genes con números de entrada: RATARSM22C (rata); D17409
(humano); M83105 (pollo); Z68618 (ratón); y AF053629 (cerdo).
Un gen alternativo que puede usarse para
dirigirse al músculo liso es la actina de músculo liso. Las
secuencias génicas representativas de actina de músculo liso
incluyen los genes con números de entrada: RATACTASM (rata); y
BC017554 (humano).
Para dirigirse al riñón, puede usarse el gen de
la proteína de Tamm-Horsfall. Las secuencias génicas
representativas de la proteína de Tamm-Horsfall
incluyen los genes con números de entrada: RATUROMOD (rata); y
HUMUMOD (humano).
Un gen alternativo que puede usarse para
dirigirse al riñón es la acuaporina-2. Las
secuencias génicas representativas de acuaporina-2
incluyen los genes con números de entrada: AQP2_RAT (rata); HS2AQP2
(humano); AF028005 (bovino); AY055468 (ratón); y AF050152
(oveja).
Otro gen alternativo más que puede usarse para
dirigirse al riñón es la proteína específica de andrógenos de
riñón. Una secuencia génica representativa de la proteína específica
de andrógenos de riñón es el gen con número de entrada RNU25808
(rata).
Los genes mencionados anteriormente son sólo a
efectos ilustrativos. Estas listas no pretenden incluir todos los
genes diana para tipos de tejidos o de células determinados. Otras
dianas génicas adecuadas resultarán evidentes para aquéllos que
poseen experiencia en la técnica basándose en la presente memoria
descriptiva.
Los métodos para la preparación y uso de sondas
y cebadores son bien conocidos en la técnica, y se describen, por
ejemplo, en Sambrook et al. (1989), Ausubel et al.
(1994) e Innis et al. (1990). Los pares de cebadores para la
PCR pueden proceder de secuencias conocidas, por ejemplo, utilizando
programas informáticos pensados con esta finalidad tal como Primer
(Versión 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research,
Cambridge MA).
Los oligonucleótidos para utilizar como
cebadores se seleccionan utilizando programas informáticos conocidos
en la técnica para tal fin. Por ejemplo, el programa informático
OLIGO® versión 6 (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO,
www.oligo.net) sirve para la selección de pares de cebadores
para PCR de hasta 100 nucleótidos cada uno, y para el análisis de
oligonucleótidos y polinucleótidos más grandes, de hasta 5.000
nucleótidos a partir de una secuencia polinucleotídica de entrada
de hasta 32 kilobases. Programas similares de selección de
cebadores han incorporado características adicionales para tener
capacidades ampliadas. Por ejemplo, el programa para la selección
de cebadores PrimOU (disponible para el público en el Genome Center
de la Universidad de Texas, South West Medical Center, Dallas TX,
ftp://ftp.genome.ou.edu/pub/programs/primou src.tar) es capaz
de seleccionar cebadores específicos a partir de secuencias de
megabases y sirve por tanto para diseñar cebadores en un ámbito
amplio del genoma. El programa para la selección de cebadores
Primer3, versión 0.9 (disponible para el público en el Whitehead
Institute/MIT Center for Genome Research, Cambridge MA,
http://www-genome.wi.mit.edu/genome
software/other/primer3.html) permite al usuario introducir una
"mispriming Iibrary" ("genoteca deficiente en cebado") en
la que las secuencias que se deben evitar como sitios de unión de
los cebadores son especificadas por el usuario. Primer3 sirve, en
particular, para la selección de oligonucleótidos para microchips
genéticos. (El código original para los dos últimos programas de
selección de cebadores puede obtenerse también a partir de sus
respectivas fuentes y modificarse para satisfacer las necesidades
específicas del usuario). El programa PrimeGen (disponible para el
público en el UK Human Genome Mapping Project Resource Centre,
Cambridge UK,
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Registered/Option/primegen.html)
diseña cebadores basados en alineaciones múltiples de secuencias,
permitiendo de este modo la selección de cebadores que se hibridan
con las zonas más conservadas o menos conservadas de las secuencias
de ácido nucleico alineadas. Por consiguiente, este programa sirve
para la identificación de fragmentos de oligonucleótidos y
polinucleótidos tanto únicos como conservados. Otros métodos de
selección de oligonucleótidos resultarán evidentes para aquéllos que
poseen experiencia en la técnica basándose en la presente
descripción.
\newpage
El ARN que se ha extraído y/o amplificado, como
se describe anteriormente, puede detectarse usando un método de
detección. Los métodos para la detección de ARN son bien conocidos
por aquéllos que poseen experiencia en la técnica, y se describen,
por ejemplo, en Sambrook et al. (1989), Ausubel et al.
(1994) e Innis et al. (1990).
Un sistema de detección preferido utiliza la
detección de ARN en tiempo real durante los ciclos de PCR usando un
ciclador térmico integrado, una fuente de luz que induce
fluorescencia y un detector. Un instrumento ilustrativo para
realizar tal detección es el Sistema de Detección de Secuencias ABI
PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Los métodos alternativos para la detección de
ARN resultarán evidentes para aquéllos que poseen experiencia en la
técnica basándose en la presente descripción. Tal método puede
incluir, por ejemplo, una electroforesis en gel y a continuación el
análisis mediante hibridación de southern (véase, por
ejemplo, Nguyen, T.D. (1989)), métodos de detección mediante
ELISA (véanse, por ejemplo, Landgraf, A. et al.
(1991), Coutlee, F. et al. (1989) y Bobo, L. et al.
(1990)) y métodos que usan la detección de
electroquimioluminiscencia (véanse, por ejemplo, Biackbum,
G.F. (1991) y DiCesare, J. et al. (1993)). Los métodos de
detección por electroforesis pueden implicar una comparación de
bandas de dos o más poblaciones de ARN. Las bandas presentes en una
autorradiografía de un gel de una población de ARN, y que no están
presentes en otra, corresponden a la presencia de un ARN particular
en una población y no en la otra, e indica por tanto un gen que
probablemente se expresa de manera diferencial (véanse, por
ejemplo, Williams, J.G. (1990), Welsh, J. et al. (1990),
Woodward, S.R. (1992), Nadeau, J. H. (1992), Liang, P. et
al. (1992), Welsh, J. et al. (1992) y Liang, P. et
al. (1993)).
Finalmente, los métodos de detección para la
presente invención pueden implicar el uso de chips o microchips
genéticos. Los chips o microchips genéticos son juegos de
polinucleótidos u oligonucleótidos distintos sintetizados sobre un
sustrato, tal como papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro,
chip, portaobjetos, o cualquier otro soporte sólido adecuado. En
una realización preferida, los chips y microchips genéticos pueden
prepararse y usarse según los métodos descritos en la Patente de
los EE.UU. Nº 5.837.832, Publicación de Solicitud de Patente PCT
Número W0 95/11995, Lockhart et al. (1996) y Schena, M. et
al. (1996). En otras realizaciones, tales chips genéticos se
producen por los métodos descritos en la Patente de los EE.UU. Nº
5.807.522.
Se cree que un experto en la técnica, utilizando
la presente descripción, incluyendo los ejemplos, dibujos, listados
de secuencias y reivindicaciones adjuntas, puede utilizar la
presente invención en su alcance más completo. Los siguientes
ejemplos deben considerarse sólo ilustrativos de la práctica de la
invención, y no limitativos del resto de la memoria descriptiva de
ninguna manera.
Se crecieron células endoteliales de rata
inmortalizadas (Nº de Catálogo CRL-2222, ATCC,
Manassas, VA) en MEM de Dulbecco Vitacell® (Nº de Catálogo
30-2002, ATCC) suplementado con 64,8 mg/dl de
heparina (Nº de Catálogo H3393, Sigma-Aldrich
Corp., St. Louis, MO) y FBS de Gibco^{TM} al 5% (Invitrogen
Corporation, Carlsbad, CA) hasta que se alcanzó una confluencia de
aproximadamente el 80%. Se retiró el medio de las células y se
reemplazó con MEM sin suplemento. Las células se incubaron con
H_{2}O_{2} a concentraciones finales de 0,0003%, 0,003%, 0,01%,
0,03%, y 0,1% durante cuatro horas. Las células del control se
trataron sólo con una solución de reserva de PBS 10x (pH 7,4)
(Invitrogen Corporation). Al final del periodo de tratamiento, se
retiró el sobrenadante y se centrifugó a 16.000 RPM a temperatura
ambiente. El sobrenadante resultante se separó de las células y
desechos celulares. El sobrenadante se analizó mediante análisis de
LDH, para medir la integridad de la membrana como una función de la
cantidad de LDH liberado (véanse, Maines et al. (1998);
Putnam et al. (2002)). El análisis de LDH se realizó según
las instrucciones del fabricante usando un Analizador Boehringer
Mannheim/Hitachi 917 automatizado (Roche Diagnostics Corporation,
Indianapolis, IN). Una porción del sobrenadante (650 \mul) se usó
también para extraer el ARN usando el "mini kit" RNeasy^{TM}
(Qiagen Inc., Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.
El sobrenadante se analizó usando RT-PCR para
detectar la presencia de mARN específico de beta actina de rata
(números de entrada V01217 y J00691) usando
5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3' como
cebador directo,
5'-ATGCCACAGATTCCATACCA-3' como
cebador inverso y
5'-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-3' como
sonda. La RT-PCR se realizó en un Sistema de
Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystem). Las
reacciones sin molde sirvieron como control negativo y el ARN de
células endoteliales de rata (100 ng/\mul) sirve como control
positivo.
Los resultados de este Ejemplo 1 aparecen en la
Tabla 1 más abajo. La Tabla 1 muestra que el daño celular es
detectable a concentraciones mucho más bajas de H_{2}O_{2}
basándose en el nivel de mARN de beta actina liberado que en el
nivel de LDH.
\hskip0.3cm*Cada ciclo de PCR es equivalente a una amplificación de mARN por un factor de dos.
\vskip1.000000\baselineskip
El Ejemplo 1 ilustra los métodos in vitro
de esta invención para evaluar el efecto dañino para la células de
un agente en un sujeto. Además, el Ejemplo 1 muestra la ventaja de
los métodos de esta invención frente a los métodos tradicionales
para evaluar el efecto dañino para las células de un agente medido
como la liberación de LDH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se administraron por vía oral (por sonda) 1400
mg/kg de acetaminofeno (Sigma-Aldrich Corp.) en
vehículo de metilcelulosa al 0,5% a cuatro ratas macho
Sprague_Dawley/Crl:CD® (SD)IGS BR (Charles River
Laboratories, Wilmington, MA) con un peso entre
250-450 g. Se administró una cantidad de vehículo de
metilcelulosa (sin acetaminofeno) con un volumen aproximadamente
igual al recibido por las ratas tratadas a cuatro ratas de control.
Después de 24 horas, se practicó la eutanasia a todas las ratas y se
recogieron los hígados por necropsia. En la necropsia, se
recogieron muestras de sangre a través de la vena cava
(aproximadamente 0,5 ml) en tubos microtainer. Todos los hígados se
fijaron seguidamente en formalina tamponada neutra al 10% y se
procesaron para la histopatología mediante corte y tallado,
deshidratación, inclusión en parafina, corte de las secciones,
montaje en portaobjetos, y tinción con pigmentos de hematoxilina y
eosina.
La sangre se analizó para detectar marcadores de
daño a hepatocitos (ALT, AST y 5'NT) según las instrucciones del
fabricante usando un analizador Boehringer Mannheim/Hitachi 917
automatizado (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)
(véase, Duncan, J.R. et al. (1994)).
Para la extracción del ARN, se recogieron
aproximadamente 2,5 ml de sangre por rata en tubos PAXgene^{TM}
Blood RNA (Qiagen Inc., Valencia, CA). El ARN se extrajo según las
instrucciones del fabricante proporcionadas con el "kit"
PAXgene^{TM} Blood RNA. El ARN extraído se analizó usando
RT-PCR para medir el nivel de albúmina (números de
entrada V01222 y J00698) usando un primer juego de cebadores con
5'-AGAAGCTTGGAGAGTATGGATTCC-3' como
cebador directo,
5'-CTTGCTGCCTCCACGAGAGT-3' como
cebador inverso y 5'-TTCGATACACCCA
GAAAGCACCTCAGGT-3' como sonda. La RT-PCR se realizó en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
GAAAGCACCTCAGGT-3' como sonda. La RT-PCR se realizó en un Sistema de Detección de Secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Los resultados aparecen en la Tabla 2 más abajo.
La Tabla 2 muestra que el daño celular es detectable con un mayor
nivel de sensibilidad midiendo el ARN de albúmina en la sangre en
comparación con los marcadores ALT, AST y 5'NT para detectar daño a
hepatocitos. El análisis histopatológico de las ratas indicó niveles
moderados de daño. Microscópicamente, había una degeneración
centrilobular moderada que era multifocal en dos de los animales y
se caracterizaba por degeneración hepatocelular y necrosis, fluido
de edema, hemorragias, e infiltración de células mononucleares y
neutrófilos ocasionales en los otros dos animales. La gravedad y
distribución de las lesiones microscópicas se correlacionaba bien
con los aumentos medidos de ALT, AST, 5'NT, y albúmina por
RT-PCR.
- \quad
- \text{*} Factores de cambio respecto a los valores medios del control .
- \quad
- \text{**} Factor de cambio respecto a los valores medios del control calculado suponiendo una amplificación del mARN por un factor de dos durante cada ciclo.
\vskip1.000000\baselineskip
El Ejemplo 2 ilustra los métodos in vivo
de esta invención para evaluar el efecto dañino para las células de
un agente usando hepatocitos. Además, el Ejemplo 2 muestra la
ventaja de los métodos de esta invención frente a los métodos
tradicionales que miden los marcadores ALT, AST y 5'NT del daño a
hepatocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Abravaya, K. et al. (1995)
Nucleic Acids Research 23, 675-682;
Ausubel et al. (1994) Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ;
Blackburn, G.F. (1991) et al. Olin Chem 37,
1534-1539; Bobo, L. et al.
(1990) J. din Micra 28, 1968-1973;
Boom, R. et al. (1990) J. Clin.
Microbiology 28, 495-503; Boom, R. et
al. (1991) J. Clin. Microbiology 29,
180-1811; Bonfacino et al.
(1998) Current Protocols in Cell Biology, John Wiley
& Sons, Inc., Hoboken, NJ; Chen, X.Q. et al.
(2000) Clin. Cancer Res. 6, 3823-3826;
Cheung et al. (1994) J Clin.
Microbiology 32, 2593-2597; Chirgwin,
J.M. et al. (1979) Biochemistry 18,
5294-5299; Coutlee, F. et al.
(1989) Analytical Biochemistry 181,
96-105; DiCesare, J. et al.
(1993) BioTechniques 15, 152-157;
Fournie, G.J. et al. (1986) Analytical
Biochemistry 158, 250-256; Diehn, M.
et al. (1993) Nat. Genet. 25,
58-62; Duncan, J.R. et al.
(1994) Veterinary Laboratory Medicine, Clinical
Pathology. Tercera edición. Iowa State Press, Ames, Iowa;
Freshney, R.I. (1993) Culture of Animal Cells. A
Manual of Basic Techniques, 3rd ed. Wiley-Liss,
New York, NY; Hasselmann, D.O. (2001) Clin.
Chem. 47, 1488-1489; Hayward R.E. et
al. (1993) Mol. Microbiol. 35,
6-14; Innis et al. (1990)
PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic
Press, San Diego CA; Jrdea, M.S. et al.
(1993) AIDS 7 (supp. 2), S11-514;
Johannes G. et al. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 96, 13118-23; Kievits, T. et
al. (1991), J. Virological. Methods 35,
273-286; Kopreski, M. et al.
(1999) Clin. Cancer Res. 5, 1961-1965;
Landgraf, A. et al. (1991) Analytical
Biochemistry 198, 86-91; Liang, P. et
al., (1992) Science 257, 967, Liang, P.
et al. (1993) Nucl. Acids Res. 3269; Lo,
K.W. et al. (1999) Clin. Chem. 45,
1292-1294; Lockhart et al.
(1996) Nat. Biotech. 14, 1675-1680;
Mandel y Metais (1948) C.R. Acad. Sci.
Paris 142, 241-243; Maines et al.
(1998) Current Protocols In Toxicology, John Wiley
& Sons, Inc., Hoboken, NJ; Nadeau, J. H. (1992)
Mamm. Genome 3, 55; Nguyen, T.D. (1989)
BioTechniques 7, 238-240; Ng, E.K.O.
(2002) Clin. Chem. 48, 1212-1217;
Poon, L.L. et al. (2000) Clin. Chem. 46,
1832-1834; Putnam, K.P. et al.
(2002) Toxicol. In Vitro 16, 599-607;
Rashtchian, A. (1994) PCR Methods Applic. 4,
S83-S91; Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press, Plainview NY; Schena, M. et al.
(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93,
10614-10619; Scherf, U. et al.
(1993) Nat. Genet. 24, 236-44;
Schmidt, D.M. y Ernst, J.D. (1995) Anal.
Biochem. 232, 144-146; Tsui, N.Y.B.
(2002) Clin. Chem. 48, 1647-1653;
Welsh, J. et al., (1990) Nucl. Acids
Res., 18, 7213; Welsh, J. et al. (1992)
Nucl. Acid Res. 20, 4965; Williams, J.G. (1990)
Nucl. Acids Res. 18, 6531; Woodward, S.R.,
(1992) Mamm. Genome, 3, 73.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Pfizer Products, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> BIOENSAYO DE ARN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PC25313A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/437.533
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
31-12-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
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\hskip-.1em\dddseqskipttcgatacac ccagaaagca cctcaggt
\hfill28
Claims (9)
1. Un método para evaluar si un agente causa
daño celular que comprende: tratar una o más células de mamífero
con un agente; y medir el efecto de dicho agente sobre la cantidad
de ARN liberado por dichas células.
2. Un método de la reivindicación 1, en el que
dichas células comprenden una o más células de origen humano.
3. Un método de la reivindicación 1, en el que
dicha medición comprende medir el efecto de dicho agente sobre la
cantidad de uno o más marcadores de ARN liberados por dichas
células.
4. Un método de la reivindicación 3, en el que
dichas células son originarias de hígado de mamífero y dichos uno o
más marcadores de ARN comprenden albúmina.
5. Un método de la reivindicación 3 en el que
dichas células son originarias de corazón de mamífero y dichos uno
o más marcadores de ARN comprenden una o más entre la troponina T y
la actina cardiaca.
6. Un método de la reivindicación 3 en el que
dichas células son originarias de músculo liso de mamífero y dichos
uno o más marcadores de ARN comprenden una o más entre SM22 y actina
de músculo liso.
7. Un método de la reivindicación 3, en el que
dichas células son originarias de riñón de mamífero y dichos uno o
más marcadores de ARN comprenden uno o más entre la proteína
específica de andrógenos de riñón, proteína de
Tamm-Horsfall y Acuaporina-2.
8. Un método de la reivindicación 1 que
comprende además la caracterización de dicho agente como un agente
que probablemente va a causar lesión celular, en el que dicha lesión
se caracteriza por un aumento en la liberación de ARN,
siempre que haya aumentado la cantidad de ARN liberado por dichas
células al menos por un factor de dos.
9. Un método para evaluar las características
protectoras para la célula de un agente que comprende: tratar una o
más células con un primer agente que causa lesión celular, en la que
dicha lesión se caracteriza por un aumento en la liberación
de ARN por las células lesionadas; tratar dicha célula con un
segundo agente; y medir el efecto de dicho segundo agente en la
reducción de la cantidad de ARN liberado por dichas células que es
causada por dicho primer agente.
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